ES2242329T3

ES2242329T3 - Agentes y composiciones de los mismos para el tratamiento capilar, que contienen sulfatos de fucano despolimerizados.

Info

Publication number: ES2242329T3
Application number: ES99111116T
Authority: ES
Inventors: Pia Alberico; Armando Cedro; Danilo Moltrasio; Roberto Porta
Original assignee: SIRTON PHARMACEUTICALS SpA
Current assignee: SIRTON PHARMACEUTICALS SpA
Priority date: 1998-06-16
Filing date: 1999-06-08
Publication date: 2005-11-01
Anticipated expiration: 2019-06-08
Also published as: TR199901334A2; EP0965323A3; ATE293426T1; PT965323E; TR199901334A3; IT1301720B1; IL130462A0; US6232302B1; EP0965323B1; EP0965323A2; ITMI981367A1

Abstract

SE PRESENTAN COMPOSICIONES QUE CONTIENEN SULFATOS DE FUCANO DESPOLIMERIZADOS QUE SE CARACTERIZAN POR LOS SIGUIENTES PARAMETROS (PORCENTAJES DEL PESO EN BASE AL PRODUCTO SECO): - PESO MOLECULAR : 5.000 - 30.000 DALTONS; - AZUFRE: 5% - 16%; - FUCOSA: 25% - 60%; - ACIDOS URONICOS: 2% - 25%; LAS COMPOSICIONES INCREMENTAN EL PORCENTAJE DE CRECIMIENTO DEL CABELLO E INHIBEN EL CRECIMIENTO DEL PYTIROSPORUN SOBRE LA PIEL.

Description

Agentes y composiciones de los mismos para el tratamiento capilar, que contienen sulfatos de fucano despolimerizados.

La presente invención se refiere a productos para ser empleados como agentes tricógenos para ser aplicados tópicamente sobre el cuero cabelludo, para normalizar el ciclo de crecimiento del cabello, y como agente antimicótico de la microflora de la piel, por lo tanto capaces de reducir la caspa.

Más específicamente se refiere a agentes tricógenos o composiciones del mismo que tienen una eficacia mejorada en el aumento del porcentaje de pelo en la fase de crecimiento y al mismo tiempo son activos como agentes antimicrobianos de la piel, careciendo de los efectos secundarios de los antimicóticos de la técnica anterior y teniendo una alta tolerabilidad de la piel.

El ciclo del crecimiento del cabello se subdivide en tres fases sucesivas que periódicamente se repiten en la vida del hombre: la fase anagénica, en la cual tiene lugar el alargamiento del tallo del cabello, la fase catagénica, en la cual tiene lugar la progresiva queratinización del bulbo del cabello y no hay ningún crecimiento del tallo, y la fase telogénica en la cual no hay ningún cambio, ni del bulbo del cabello ni del tallo del cabello.

La fase anagénica comprende normalmente muchos meses o años, y es mucho más larga que la fase catagénica (3 semanas) y que la fase telogénica (3 meses). En condiciones normales alrededor del 85% del cabello está en la fase anagénica, 1% en la fase catagénica y un 14% en la fase telogénica (C.E. Orfanos, R.H. Happle "Hair and hair disease" ("Cabello y enfermedad del cabello"), editorial Springer 1990). En individuos que tienen una alopecia androgénica, tanto la fase anagénica como el porcentaje de cabello que crece, es reducido.

Como agente tricógeno se entiende, de acuerdo con la presente invención, una substancia capaz de aumentar el porcentaje de crecimiento del cabello. Por lo tanto un agente tricógeno puede contribuir a normalizar el ciclo de crecimiento, prolongando de nuevo la fase anagénica. Las substancias empleadas como agentes tricógenos deben permanecer en contacto con la piel durante períodos más bien largos y por lo tanto no deben causar problemas de tolerabilidad con la piel.

Sobre la superficie cutánea y sobre el cuero cabelludo existe una microflora entre los principales componentes, entre los cuales se cuentan las levaduras lipofílicas del tipo Pityrosporum, que crecen en zonas ricas en lípidos. El Pityrosporum oval es la levadura más difundida sobre el cuero cabelludo.

El crecimiento excesivo del Pityrosporum oval tiene el aspecto de una caspa. En algunos individuos con una secreción sebácea aumentada, la proliferación de este hongo puede causar también la dermatitis seborreica, caracterizada por la seborrea, exfoliación e inflamación.

De todo lo mencionado está claro que, con el fin de preservar la integridad morfológica y funcional de la piel y del cuero cabelludo, es importante mantener la microflora huésped a niveles fisiológicos.

Con el fin de alcanzar este objetivo, de acuerdo con la técnica anterior, la piel se trata con preparaciones que contienen compuestos que tienen actividad antimicótica como el cetoconazol, succinato de litio, zinc piritiona, sulfuro de selenio. Estos compuestos pueden causar efectos no deseados sobre la piel y sobre el cuero cabelludo. Por ejemplo, el cetoconazol causa una inflamación local, la dermatitis; el succinato de litio está contraindicado en pacientes afectados de psoriasis puesto que es un agente potencialmente inflamatorio, el zinc piritiona puede causar neuritis periférica y el sulfuro de selenio puede causar una inflamación del cuero cabelludo, de la conjuntiva y de la parte interna de las arrugas de la piel. En consecuencia, los tiempos de contacto con la piel de las preparaciones que contienen estos compuestos, deben reducirse.

De lo antedicho se deduce que de acuerdo con la técnica anterior no es posible efectuar un único tratamiento para normalizar el ciclo de crecimiento del cabello y para prevenir o reducir la caspa.

Es conocido también que los compuestos que hay que emplear para el suministro percutáneo deben tener un peso molecular bajo, con el fin de ser fácilmente absorbidos a través de la piel. También es conocido que para obtener la absorción tópica de los polímeros naturales es necesario disminuir el peso molecular de los mismos, generalmente alto, del orden de varios centenares de Kilodaltons, mediante un procedimiento de despolimerización.

La solicitud de la patente europea EP 730.867 se refiere al empleo en la piel y el cabello, de un tratamiento dermatológico y cosmético, y en la alopecia del cuero cabelludo, de polímeros obtenidos por despolimerización de polianiones de origen vegetal. Los productos despolimerizados tienen un margen de peso molecular entre 5.000 y 100.000, y un contenido de azufre en el margen de 5 - 20% en peso. No se facilitan ejemplos mostrando la actividad tricógena de estos productos, ni se describen ni se hace referencia a métodos que permitan obtener estos compuestos. No se hace ninguna mención al hecho de que los compuestos de los que se informa en dicha solicitud de patente son agentes activos para la inhibición del crecimiento del Pytirosporum. Los ensayos efectuados por el solicitante han mostrado que entre los polímeros que tienen las especificaciones de los fucanos despolimerizados mencionados en la solicitud de patente EP 730.867, obtenidos de acuerdo con los procedimientos de la técnica anterior (ver el ejemplo comparativo), no se obtiene ningún producto capaz de inhibir el crecimiento del Pityrosporum y por lo tanto que tenga actividad anti-caspa, y además, la actividad de crecimiento no es significativa.

Existe por lo tanto la necesidad de emplear compuestos que sean agentes efectivos para aumentar el porcentaje de cabello en la fase de crecimiento y al mismo tiempo agentes antimicrobianos de la piel, específicamente activos en la reducción de la caspa y sin los efectos secundarios de los antimicóticos de la técnica anterior y que tengan una alta tolerabilidad cutánea.

Se ha descubierto inesperada y sorprendentemente que es posible satisfacer todos estos requisitos empleando un tipo particular de sulfatos de fucano despolimerizados que tienen características específicas, las cuales resultan efectivas para aumentar el porcentaje de cabello en la fase de crecimiento, son capaces de inhibir el crecimiento del Pityrosporum tanto sobre la piel como sobre el cuero cabelludo, y además carecen de efectos secundarios.

Un objeto de la presente invención son los sulfatos de fucano despolimerizados y su empleo como agentes tricógenos caracterizados por los siguientes parámetros (los porcentajes son en peso sobre el producto seco):

- Peso promedio de los pesos moleculares: superior a 5.000 - 30.000 daltons, de preferencia 5.500 - 30.000 daltons.

- Azufre: 5 - 16%;

- Fucosa: 25 - 60%;

- Ácidos urónicos: 2 - 25%;

Específicamente los fucanos como se han definido más arriba, son capaces de inhibir el crecimiento del Pytirosporum oval.

Los fucanos despolimerizados obtenidos del Fucus vesiculosus, Ascophyllum nodosum, Ecklonia kurome, Eisenis bicyclis, Laminaria digitata, laminaria japónica, Padina pavonia, Pelvetia canaliculata, Sargassum linifolium, Undaria pinnatifida son particularmente preferidos.

Los métodos para la determinación de estos parámetros están descritos en la solicitud publicada de la patente europea nº 849.280 a nombre del solicitante, incorporada a la presente como referencia.

Los fucanos despolimerizados a partir de algas pardas, con un peso molecular de 14.000 - 30.000 daltons para ser empleados en la presente invención, pueden obtenerse mediante el procedimiento descrito en la solicitud publicada de la patente europea nº 849.280.

Los polímeros que tienen un peso molecular inferior a 14.000 daltons con las siguientes características químicas y químico-físicas:

-: Peso promedio de los pesos moleculares: superior a 5.000 - 14.000 daltons

-: Azufre: 5 - 12,5%

-: Fucosa: 25 - 43%

-: Ácidos urónicos: 9 - 25%

pueden obtenerse con el siguiente procedimiento:

a): dispersión en agua con agitación, de las algas secas y molidas en polvo, o el material vegetal como tal, en agua, de forma que se obtenga una concentración en seco de 12,5% p/p, a una temperatura en el margen de 92 - 100ºC, extrayendo el material vegetal en estas condiciones durante 16 horas;

b): filtrado de la suspensión y corrección del pH del filtrado a un valor en el margen de 2,0 - 2,5, eliminación del precipitado formado con la filtración, corrección del pH del sobrenadante a un valor en el margen de 6,5 - 7,5;

c): ultrafiltración con membrana con una separación de 100.000 daltons para reducir el volumen de la solución a 1/4 - 1/5 del inicial, subsiguiente diálisis en el mismo equipo frente a 3 volúmenes de agua destilada, seguida opcionalmente por una etapa de concentración;

d): salificado de la solución, adición de dos volúmenes de un disolvente precipitador, de preferencia etanol o acetona, y recuperación del extracto crudo;

e): despolimerización a la temperatura de 55ºC del extracto crudo en solución acuosa en presencia de una sal inorgánica de Cu (II) en un ratio en % en peso con el extracto en el margen de 0,12 - 0,14%, y de peróxido de hidrógeno al 8% en tal cantidad que el ratio entre el peso del extracto crudo y el volumen en ml de peróxido de hidrógeno al 8% está en el margen de 1/4 - 1/10, durante el tiempo necesario, determinado mediante ensayos de laboratorio, para reducir el peso molecular en un margen superior a 5.000 y 14.000;

f): filtrado de la solución, salificación y precipitación de las sales de Cu (II) de los fucanos despolimerizados, mediante la adición de 2-3 volúmenes de un disolvente precipitante, de preferencia, de etanol o acetona;

g): disolución del precipitado en agua a una concentración entre 5 y 7% p/v y tratamiento con una resina de intercambio iónico en la forma Na^{+} durante aproximadamente diez horas agitando lentamente; eliminación de la resina y corrección del pH a un valor en el margen 6,0 -7,0; salificación y precipitación de los fucanos despolimerizados en forma de sus correspondientes sales sódicas mediante la adición de 2-3 volúmenes de un disolvente precipitante, de preferencia etanol o acetona.

El modelo experimental que se ha empleado en la presente solicitud de patente para mostrar que los fucanos despolimerizados de la invención tienen una eficacia mejorada en el aumento del porcentaje de cabello que crece, está descrito en la solicitud por M.P. Philpott et al. "Human hair growth in vitro" ("crecimiento in vitro del cabello humano") J. Cell. Sci. 1990, 97 463-471, modificado por G.E. Westgate "Prolonged maintenance of human hair follicles in vitro in a serum free médium" ("Mantenimiento prolongado de folículos de cabello humano in vitro en un medio exento de suero") J. Cell. Sci. 1993, 129 372-379. El solicitante ha empleado en este experimento folículos pilosos sanos, separados por tiras de cuero cabelludo humano tomado de la zona occipital de individuos varones durante las operaciones de autoinjerto. Los folículos pilosos han sido cultivados en un medio adecuado de cultivo, que contiene las substancias bajo examen, como está especificado en los ejemplos.

Este modelo reproduce los siguientes aspectos principales del ciclo fisiológico normal del folículo piloso:

1): La velocidad de crecimiento del tallo o tronco del cabello (C.S. Harmon et al, J. Invest. Dermatol. 1994, 103, 318-322).

2): La misma transición anagénica/catagénica: la queratinización próxima al tallo y la condensación de las papilas dérmicas al final de la fase anagénica, los cuales son los mismos cambios morfológicos observados in vivo en el paso de la fase anagénica a la catagénica (M. Taylor et al, J. Invest. Dermatol. 1993, 100 237-239).

3): La inhibición mediante testosterona o el factor de crecimiento epidérmico (C. S. Harmon, ver más arriba) del crecimiento de los folículos en cultivo, con disminución de la cantidad de folículos de crecimiento.

En la técnica antigua se ha verificado que la ciclosporina A (M. Taylor, ver más arriba), la cual causa el efecto secundario de crecimiento de los cabellos en los hombres, en el mismo modelo empleado por el solicitante, ha prolongado el período de crecimiento de los cabellos de los folículos pilosos humanos. Por lo tanto el modelo empleado en la presente invención pronostica la actividad in vivo.

Los fucanos despolimerizados con las características químicas y químico-físicas descritas más arriba, se han mostrado ellos mismos activos, aumentando de una manera estadísticamente significativa (w<0,01) el porcentaje de los folículos que crecen, con respecto a los controles sin tratar, durante el tiempo total del experimento (28 días) a la concentración empleada.

Estos compuestos son por lo tanto agentes efectivos para la administración tópica sobre el cuero cabelludo, para normalizar la duración de la fase anagénica en los casos en los cuales ésta se reduce, como por ejemplo, en la alopecia.

Sorprendentemente, los compuestos despolimerizados de la invención se han mostrado ellos mismos como agentes efectivos en la inhibición del crecimiento del Pytirosporum oval a muy bajas concentraciones, inferiores a 0,1% p/v.

Por lo tanto, es posible el empleo de los fucanos despolimerizados de la invención, como agentes antimicóticos.

El producto de despolimerización ácida del ejemplo comparativo no tiene por el contrario, ninguna propiedad antimicótica sobre el Pytirosporum oval.

La tolerabilidad de las preparaciones que contienen los sulfatos de fucano de la invención ha resultado ser muy buena.

Los fucanos de acuerdo con la presente invención, tópicamente aplicados en formulaciones cosméticas preparadas de acuerdo con la técnica anterior, resultan efectivos también para mantener los niveles fisiológicos de hidratación cutánea. En consecuencia, la aplicación tópica sobre la piel de estas substancias permite obtener varias ventajas.

Las aplicaciones previstas de la presente invención se logran empleando los sulfatos de fucano en preparaciones para empleo tópico a concentraciones en el margen 0,01 - 20%. Para composiciones en forma de lociones y champús, que de preferencia se utilizan para el cuero cabelludo, las concentraciones de sulfato de fucano empleadas preferentemente están en el margen de 0,01 - 1%. En las formulaciones de cremas y geles, se emplean de preferencia concentraciones de 1 a 20% p/v.

Las preparaciones que contienen el sulfato de fucano despolimerizado de la presente invención se aplican tópicamente, localmente sobre la piel o en el cuero cabelludo, frotando para facilitar la absorción de las mismas u opcionalmente mediante dispositivos ya conocidos en la técnica anterior (p. ej., parches).

Las preparaciones que contienen sulfatos de fucano despolimerizados de la presente invención, se preparan de acuerdo con los métodos ya conocidos por los expertos en la técnica. Véase por ejemplo en Remington's Pharmaceuticals Sciences ("Ciencias farmacéuticas de Remington") 15ª edición.

Los siguientes ejemplos se facilitan con el único propósito de ilustrar la invención sin limitarla.

Ejemplo 1 Extracción del sulfato de fucano crudo, preparación nº VO246.B

En un reactor de 300 litros se vierten 175 litros de agua destilada. Se añaden 25 kg de polvo seco de Fucus Vesiculosus, y se calienta con una camisa de vapor a 92ºC durante 16 horas. Al final se enfría el contenido a 30ºC, se añaden 5 kg de Clarcel FLO/MA®, a continuación, se filtra el contenido sobre un filtro prensa empleando filtros Seitz K 800®, recogiendo el filtrado y dispersando la capa sólida en agua (20 litros) manteniendo una agitación durante 1 hora a 60ºC. Se filtra sobre filtros Seitz K 800®, los líquidos se reúnen (220 litros) y se vierten en un reactor equipado con una camisa de enfriamiento. Se añaden 5,5 kg de Clarcel CBR® (polvo de diatomeas molidas y calcinadas). Manteniendo la temperatura interna del reactor entre 25 y 30ºC, se añaden 1,5 litros aproximadamente de HCl al 37%, agitando. El pH de la solución desciende hasta 2. Se continúa la agitación durante 15 minutos después de la adición del ácido y se filtra el contenido sobre filtros Seitz K 800®. Las capas de sólido se dispersan en 20 litros de ácido clorhídrico diluido a pH 2 y se filtra de nuevo. Las fases de líquido se reúnen. La solución se alimenta a una instalación de ultrafiltración Alfa Laval® equipada con un cartucho Millipore® de ultra-filtración con una separación = 100.000. La solución se concentra para reducir el volumen a 50 litros, a continuación se dializa a volumen constante frente a 3 volúmenes de agua destilada. Cuando se ha terminado la diálisis, el volumen de la solución se reduce de nuevo a 25-30 litros. Se retira el líquido, se salifica añadiendo NaCl hasta una concentración de sal del 2% p/v y el extracto crudo se precipita añadiendo 2 volúmenes de acetona. Después de la decantación, se recupera el sólido y se deshidrata, se seca y se muele. El extracto crudo obtenido, VO246.B, pesa 1665 g (rendimiento 6,7%). Los datos analíticos del producto seco son los siguientes: azufre: 7,1%, fucosa 32,0%, ácidos urónicos 25,0%, peso molecular 800.000.

Ejemplo 2 Extracción del sulfato de fucano crudo, preparación VO246.C

Se repite el ejemplo anterior, partiendo de 25 kg de una partida nueva de Fucus Vesiculosus. El pH intermedio de precipitación es de 2,5. Se obtienen 2100 g (rendimiento 8,4%) del producto partida VO246.C. Determinaciones analíticas: azufre 7,6%, fucosium 35,8%, ácidos urónicos 26,1%, peso molecular 470.000.

Ejemplo 3 Extracción del sulfato de fucano crudo, preparación VO246.D

Se repite el ejemplo 1, partiendo de 25 kg de una partida nueva de Fucus Vesiculosus. Se obtienen 2470 g (rendimiento 9,9%) de producto VO246.D. Determinaciones analíticas: azufre 6,2%, fucosa 36,3%, ácidos urónicos 22,1%, peso molecular 1.007.000.

Ejemplo 4 Despolimerización del material crudo VO246.C con sales de cobre y obtención del sulfato de fucano despolimerizado, prep. nº 0195/97086-A

Se disuelven 20 g de VO246.C en 400 ml de agua destilada (concentración 5% p/v). La solución se calienta a 55ºC y se añaden 80 mg de acetato cúprico monohidratado, corrigiendo el pH a 7,5 con una solución 1N de NaOH. Con una bomba peristáltica regulada a un caudal de 18,5 ml/hora, se añade una solución de peróxido de hidrógeno 8% p/v, manteniendo el pH de la solución a un valor 6 añadiendo gradualmente una solución de NaOH al 30%. Sobre la base de las determinaciones del peso molecular, después de 6 horas se interrumpe la despolimerización (volumen total de peróxido de hidrógeno empleado: 110 ml). El contenido se enfría a temperatura ambiente, se salifica con acetato de sodio hasta tener un 7% p/v de concentración de sal y se añaden tres volúmenes de etanol. Se deshidrata y se seca. El precipitado (9,1 g) se redisuelve en 140 ml de agua desionizada y se añaden 95 ml de resina de intercambio iónico Amberlite IRC 718® (forma Na^{+}). Se deja con una ligera agitación durante una noche. Se recupera la solución, la resina se lava con dos volúmenes de agua destilada y se filtra por un embudo buchner a través de una capa de Clarcel CBR® que tiene el mismo peso que el del polvo recuperado después de la despolimerización. La solución se salifica con acetato de sodio anhidro hasta que resulta un 7% p/v de concentración. La solución se precipita con 3 volúmenes de etanol. Después de la deshidratación y secaje se obtienen 7,1 g de sulfato de fucano despolimerizado prep. nº 0195/97086-A. Determinaciones analíticas: azufre: 8,6, fucosa 30,0%, ácidos urónicos 16,1%, peso molecular
5.600.

Ejemplo 5 Despolimerización del material crudo VO246.C con sales de cobre y obtención del sulfato de fucano despolimerizado, prep. nº VO268.B

Se disuelven 300 g de VO246.C en 6 litros de agua destilada. La solución se calienta a 55ºC y se añaden 1,2 g de acetato cúprico monohidratado, corrigiendo el pH a 7,5 con una solución 1N de NaOH. Con una bomba peristáltica regulada a un caudal de 18,3 ml/hora, se añade una solución de peróxido de hidrógeno al 8% p/v, manteniendo el pH de la solución a un valor de 6,5 añadiendo gradualmente una solución de NaOH al 30%. Sobre la base de las determinaciones del peso molecular, después de 1,5 horas se interrumpe la despolimerización (volumen total de peróxido de hidrógeno empleado: 1,65 litros). Se procede a recuperar el producto despolimerizado como se describe en el ejemplo 4. Se deshidrata y se seca. El precipitado (173 g) se redisuelve en 2,6 litros de agua desionizada y se añaden 1,73 litros de resina de intercambio iónico Amberlite IRC 718® (forma Na^{+}), dejando con una ligera agitación durante una noche. Se procede como se ha descrito en el ejemplo 4. Después de la deshidratación y secaje se obtienen 139,5 g de sulfato de fucano despolimerizado (rendimiento 46%) prep. nº VO268.B. Determinaciones analíticas: azufre: 7,0, fucosa 28,5%, ácidos urónicos 15,4%, peso molecular 10.700.

Ejemplo 6 Despolimerización del material crudo VO246.B con sales de cobre y obtención del sulfato de fucano despolimerizado, prep. nº VO264.B

Se disuelven 100 g de VO246.B en 2 litros de agua destilada. La solución se calienta a 55ºC y se añaden 4 g de acetato cúprico monohidratado, corrigiendo el pH a 7,5 con una solución 1N de NaOH. Con una bomba peristáltica regulada a un caudal de 108,3 ml/hora, se añade una solución de peróxido de hidrógeno al 8% p/v, manteniendo el pH de la solución a un valor comprendido entre 6,0 y 6,5 añadiendo gradualmente NaOH al 30%. Sobre la base de las determinaciones del peso molecular, después de 24 horas se interrumpe la despolimerización (volumen total de peróxido de hidrógeno empleado: 2,600 litros). Se procede como se describe en el ejemplo 4. Se deshidrata y se seca. El precipitado (23,2 g) se redisuelve en 400 ml de agua desionizada y se añaden 260 ml de resina de intercambio iónico Amberlite IRC 718® (forma Na^{+}), dejando con una ligera agitación durante una noche. Se procede como se ha descrito en el ejemplo 4. Después de la deshidratación y secaje se obtienen 16,4 g de sulfato de fucano despolimerizado (rendimiento 16,4%) prep. nº VO264.B. Determinaciones analíticas: azufre: 14,3%, fucosa 44,2%, ácidos urónicos 3,4%, peso molecular 17.500.

Ejemplo 7 Despolimerización del material crudo VO246.C con sales de cobre y obtención del sulfato de fucano despolimerizado, prep. nº VO260.C

Se disuelven 20 g de VO246.C en 4 litros de agua destilada. La solución se calienta a 55ºC y se añaden 8 g de acetato cúprico monohidratado, corrigiendo el pH a 7,5 con una solución 1N de NaOH. Con una bomba peristáltica regulada a un caudal de 183,3 ml/hora, se añade una solución de peróxido de hidrógeno al 8% p/v, manteniendo el pH de la solución a un valor comprendido entre 6,0 y 6,5 añadiendo gradualmente NaOH al 30%. Sobre la base de las determinaciones del peso molecular, después de 6 horas se interrumpe la despolimerización (volumen total de peróxido de hidrógeno: 1,100 litros). Se añade una solución de acetato de sodio trihidratado hasta que se obtiene una concentración de la solución del 11% p/v, y se precipita con dos volúmenes de etanol. Se deshidrata y se seca. El precipitado (79 g) se redisuelve en 1,2 litros de agua desionizada. Se centrífuga a 3000 rpm y se añaden 800 ml de resina de intercambio iónico Amberlite IRC 718® (forma Na^{+}), dejando con una ligera agitación durante una noche. Se procede como se ha descrito en el ejemplo 4 filtrando por un buchner con una capa de 15 g de Clarcel CBR®. El pH se corrige a 6,5 y se procede como en el ejemplo 4, precipitando con dos volúmenes de etanol. Se obtienen 60,1 g de sulfato de fucano despolimerizado (rendimiento 30,1%) prep. nº VO260.C. Determinaciones analíticas: azufre: 12,6, fucosa 47%, ácidos urónicos 8,1%, peso molecular 29.000.

Ejemplo 8 Despolimerización en ambiente ácido del sulfato de fucano crudo VO246.B

Se disuelven 5 g del extracto crudo en 500 ml de agua destilada y se añaden 10 ml de HCl 1N. De esta manera disminuye el pH de la solución hasta aproximadamente 2,2, es decir, a un valor débilmente ácido suficiente para permitir que el compuesto se hidrolice suavemente. La solución se calienta a 60ºC durante 12 horas. La solución se enfría y se neutraliza añadiendo unos pocos ml de NaOH 30% p/v. El líquido se dializa en un equipo de ultrafiltración Amicon® CH2-A, a volumen constante, en pasos consecutivos, cada vez frente a 5 volúmenes de agua destilada. En el primer paso se emplea una membrana con una separación de 3.000 Da, en el segundo paso una de 10.000 Da y en el tercero, una de 100.000 Da. El permeato de la última diálisis se salifica con NaCl hasta un 2% p/v de concentración y se añaden 2 volúmenes de acetona. Se obtienen 0,5 g de la preparación 0195/95026-D que tiene las siguientes características analíticas: peso molecular 65.000, azufre 5,2%, ácidos urónicos 20,1%, fucosa 21,2%. Esta preparación ha sido utilizada para los ensayos biológicos y microbiológicos comparativos de los ejemplos 11B y 12B.

Ejemplo 9 Extracción del sulfato de fucano crudo, preparación VO271.A

Se suspende 1 kg de Ascophyllum nodosum en polvo seco, agitando en 7 litros de agua destilada en un matraz de 15 litros equipado con refrigerante. Cuando se ha obtenido la suspensión (alrededor de 15 minutos), se calienta en un baño de aceite a 100ºC durante 16 horas. Se enfría a 40ºC, la suspensión se centrifuga a 3.000 revoluciones por 20 minutos empleando cuatro tubos de ensayo de centrífuga de 1 litro. El residuo gelatinoso que se acumula sobre el fondo de los tubos se suspende en 3 litros de agua a la temperatura de 60ºC, con agitación mecánica, manteniendo la agitación durante aproximadamente 15 minutos. Se recentrifuga y el sobrenadante así obtenido se junta con el anterior. A los sobrenadantes reunidos (7,5 litros) se añaden 20 g de Clarcel CBR® (perlita calcinada y molida). Se filtra sobre Seitz K 800® recuperando 6,65 litros de filtrado; el pH se corrige a 2,0 mediante la adición de 330 ml de HCl 2N y se centrífuga de nuevo. El sobrenadante se neutraliza (pH 6,5) con aproximadamente 70 ml de una solución al 30% de NaOH, a continuación se concentra manteniendo el volumen constante a 1,5 litros en un equipo de ultrafiltración Amicon® CH2-A sobre el cual se ha montado una membrana con una separación de 100.000 Da. Cuando la fase de concentración está terminada, la solución se dializa empleando la misma membrana y tres volúmenes de agua destilada.

Al retenido se añaden 945 g (7% p/v) de acetato de sodio anhidro, se agita hasta que se obtiene una solución homogénea y el soluto se precipita con dos volúmenes de etanol al 95%. Se deja decantar durante una noche y el sólido se deshidrata y se seca. Se recuperan 75,46 g (rendimiento 8,4%) de un sólido (preparación VO271.A) que tiene los siguientes datos analíticos: azufre 5,2%, fucosa 25,2%, ácidos urónicos 19,7%, peso molecular 483.000.

Ejemplo 10 Despolimerización del sulfato de fucano VO271.A con sales de cobre y obtención del sulfato de fucano despolimerizado, prep. nº VO272.A

Se disuelven 25 g de VO271.A en 500 ml de agua destilada (concentración 5% p/v). Se calienta a 55ºC y se añaden 100 mg de acetato cúprico monohidratado, corrigiendo el pH a 7,5 con una solución 1N de NaOH. Con una bomba peristáltica regulada a un caudal de 18,5 ml/hora, se añade una solución de peróxido de hidrógeno al 8% p/v (total 137,5 ml), manteniendo el pH de la solución a un valor de 6,50 añadiendo gradualmente una solución de NaOH al 30%. Sobre la base de las determinaciones del peso molecular, después de 24 horas se interrumpe la despolimerización. Se enfría a temperatura ambiente, el sobrenadante se decanta, se salifica con acetato de sodio hasta obtener una concentración de 7% p/v de sal y se añaden dos volúmenes de etanol. Se deshidrata y se seca. El precipitado (9 g) se redisuelve en 130 ml de agua desionizada y se añaden 90 ml de resina de intercambio iónico Amberlite IRC 718® (forma Na^{+}). Se deja con una ligera agitación durante una noche. Se recupera la solución, la resina se lava con dos volúmenes de agua destilada y se filtra por un buchner con una capa de Clarcel CBR® que tiene el mismo peso que la del polvo recuperado después de la despolimerización. La solución límpida se salifica con acetato de sodio anhidro hasta obtener una concentración del 7% p/v. Se precipita con 2 volúmenes de etanol. Después de la deshidratación y secaje se obtienen 7,5 g de sulfato de fucano despolimerizado VO272.A. Determinaciones analíticas: azufre: 9,2%, fucosa 32,7%, ácidos urónicos 17,3%, peso molecular 8.900.

Ejemplo 11

Ejemplo 11A

Método para evaluar la eficacia de la preparación VO268.B de sulfato de fucano de la invención para aumentar el crecimiento del porcentaje de folículo piloso

Se toman los folículos pilosos de la zona occipital de individuos varones, se limpian cuidadosamente y se colocan en cubetas que contienen 1 ml de medio nutritivo de medio de William E (ICN catálogo 1995). Se añaden al medio, 10 ng/ml de hidrocortisona, 10 \mug/ml de insulina, 2 mmoles de glutamina y un complejo antimicrobiano que contiene estreptomicina 100 \mug/ml, penicilina 100 U/ml, anfotericina B 0,25 \mug/ml. Se añadió a los cultivos, una cantidad de sulfato de fucano despolimerizado suficiente para obtener una concentración del compuesto de 80 \mug/ml respectivamente. Los folículos empleados en el experimento han sido obtenidos de 10 diferentes individuos (12 folículos tomados de cada individuo) y subdivididos en 2 grupos (el de control y el grupo tratado con la concentración de sulfato de fucano indicada más arriba). Cada grupo se ha repetido 6 veces. Los cultivos se han incubado a 37ºC en atmósfera humidificada que contenía el 5% de CO_{2}, durante 28 días. En el día diez y el día 21avo, el medio de cultivo se reemplazó con una cantidad recién preparada del mismo medio. La longitud de la porción externa del tallo al folículo ha sido medida inmediatamente después del aislamiento de cada folículo, y a continuación, al tercer, séptimo, décimo, catorceavo, diecisieteavo, vigésimo, veinticuatroavo y veintiochoavo del día de cultivo. El criterio para determinar cuántos folículos habían pasado a la fase de crecimiento fue que el aumento de la longitud del tallo, calculado como la diferencia (1'' - 1') en donde 1'' = longitud actual, 1' = longitud determinada el día de la determinación previa, tenía que ser distinto de cero.

En el experimento se ha empleado la preparación VO 268.B y los respectivos resultados están registrados en la tabla I y se hace notar en particular, que el día veintiunavo a partir del comienzo del tratamiento, el porcentaje de los folículos que crecen es más del doble con respecto a los folículos sin tratar.

Ejemplo 11B

(Comparativo)

Determinación de la actividad del ejemplo 8, preparación obtenida mediante la despolimerización ácida

Empleando el método descrito en el ejemplo 11A empleando la preparación obtenida mediante la despolimerización ácida del ejemplo 8 a la dosis de 80 \mug/ml, se han obtenido los resultados registrados en la tabla II. De la tabla se desprende que cada vez, el porcentaje de los folículos pilosos en crecimiento en el medio al que se ha añadido sulfato de fucano con un peso molecular bajo obtenido por la despolarización ácida, se acerca al del grupo de control. Por lo tanto, este sulfato de fucano no es muy activo en comparación con los sulfatos de fucano de la presente inven-
ción.

Ejemplo 11C

Determinación de la actividad de las preparaciones de la invención de los ejemplos 4, 6, 7 y 10

Se repite el experimento del ejemplo 11A con la preparación 195/97086-A (ejemplo 4), VO264.B (ejemplo 6), VO260.C (ejemplo 7) y VO272.A (ejemplo 10). La tabla III registra los porcentajes de los folículos pilosos en crecimiento el día diecisieteavo de observación en medios de cultivo cargados con diferentes preparaciones de sulfato de fucano de acuerdo con la presente invención a la concentración de 80 \mug/ml. Se hace notar que el porcentaje de folículos pilosos en crecimiento es significativamente más alto que el porcentaje de los folículos del grupo de control y los valores obtenidos están comprendidos en un margen más bien pequeño y pueden ser considerados entre sí, como homogéneos.

Ejemplo 12

Ejemplo 12A

Determinación de la actividad antimicótica in vitro de los sulfatos de fucano VO268.B (inhibición in vitro del crecimiento de la levadura Pytirosporum oval) y del producto obtenido mediante despolimerización ácida de acuerdo con el ejemplo 8

El stock empleado es el ATCC 12078, suministrado por el Istituto Sieroterapico de Milano - Italia. El stock se ha suspendido en 100 ml de solución fisiológica (solución madre, M).

1) Contaje microbiano total en el medio líquido

Se han preparado dos porciones de 100 ml de un medio de cultivo genérico, disolviendo en 1000 ml de agua destilada, 5 g de NaCl y 10 g de peptona (medio nutritivo); a cada porción se han añadido 10 ml de la solución madre.

En una de las dos suspensiones, se añade el producto en polvo objeto de examen, hasta obtener una concentración de 1 mg/ml (muestra B); la otra suspensión es la muestra A. Después de una incubación a una temperatura de 36ºC durante 48 horas, se determina el contaje microbiano total (TMC) mediante subsiguientes diluciones y extendiendo 1 ml sobre la placa.

2) Contaje microbiano total en un medio sólido

Al mismo tiempo que el contaje anterior, se determina el TMC referido a la solución madre empleando dos placas diferentes, una como referencia (muestra 1) y la otra a la que se ha añadido la muestra bajo examen (muestra 2). Los resultados obtenidos han sido los siguientes:

1) Contaje microbiano total en el medio sólido

-: Muestra A (blanco): 1,9 x 10^{2} unidades formadoras de colonias (u.f.c.)/1 g de solución madre;

-: Muestra B (con el compuesto bajo examen): < de 1 unidad formadora de colonias/1 g de solución madre

2) Contaje microbiano total en medio líquido

-: Muestra 1 (blanco): 8,2 x 10^{2} unidades formadoras de colonias/1 g de solución madre;

-: Muestra 2 (con el compuesto bajo examen): < de 1 unidad formadora de colonias/1 g de solución madre.

Ejemplo 12B

(Comparativo)

Determinación de la actividad antibacteriana in vitro del producto obtenido mediante la despolimerización ácida de acuerdo con el ejemplo 8

De acuerdo con el método del ejemplo 12A, se determina la actividad antimicrobiana del compuesto obtenido en el ejemplo 8.

Los resultados han sido los siguientes:

1) Contaje microbiano total en el medio sólido

-: Muestra A (blanco): 5 x 10^{7} unidades formadoras de colonias (u.f.c.)/1 g de la solución madre;

-: Muestra B (con el compuesto bajo examen):

: > 5 x 10^{7} unidades formadoras de colonias/1 g de solución madre.

2) Contaje microbiano total en el medio líquido

-: Muestra 1 (blanco): > 5 x 10^{7} unidades formadoras de colonias/1 g de solución madre;

-: Muestra 2 (con el compuesto bajo examen): < 5 x 10^{7} unidades formadoras de colonias/1 g de solución madre.

Por lo tanto el compuesto no tiene actividad antibacteriana.

Ejemplo 13 Formulaciones de los sulfatos de fucano despolimerizados en solución hidroalcohólica

		A	B
		Loción capilar

Sulfatos de fucano prep. VO268.B	g	0,4	2
Alcohol etílico	ml	10	8
Propilenglicol	g	4	4
Conservantes, perfume, agua
cantidad suficiente para	g	100	100

Ejemplo 14 Ensayos De tolerabilidad cutánea de la preparación VO268.B

Se ha aplicado la formulación del ejemplo 13B a la parte volar del antebrazo de 20 voluntarios mediante un ensayo con un parche oclusivo durante 48 horas. Después de retirar el parche, se han efectuado evaluaciones visuales de la zona de aplicación con los siguientes intervalos: 15 minutos, 24, 48 y 72 horas. En todas las veces de observación no se ha observado ninguna alteración cutánea significativa.

Ejemplo 15 Formulación de los sulfatos de furano despolimerizados en una crema

Sulfatos de furano despolimerizados	g	3,00
Agente gelante (carbómero)	g	0,20
Glicerina	g	5,00
PEG-20 glucosio sesquiestearato de metilo	g	3,09
Alcohol estearílico + Steareth-20® + Steareth-10®	g	2,91
Isononanoato de isononilo	g	9,92
Lanolina hidrogenada	g	2,00
C12-15 benzoato de alquilo	g	3,08
Ciclometicona	g	3,00
p-hidroxibenzoato de metilo	g	0,15
p-hidroxibenzoato de propilo	g	0,15
Agua, cantidad suficiente para	g	100

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(Tabla pasa a página siguiente)

1

2

3

Claims

1. Empleo de sulfatos de fucano despolimerizados para la preparación de formulaciones para aplicación tópica para aumentar el porcentaje de cabello en la fase de crecimiento, y como agentes antimicrobianos capaces de inhibir el crecimiento del Pytirosporum sobre la piel y sobre el cuero cabelludo, caracterizado por los siguientes parámetros, los cuales se expresan en tanto por ciento en peso sobre el producto seco:

-: Peso molecular: mayor de 5.000 - 30.000 daltons;

-: Azufre: 5 - 16%;

-: Fucosa: 25 - 60%;

-: Ácidos urónicos: 2 - 25%.

2. Empleo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el Pytirosporum es el Pytirosporum oval.

3. Empleo de acuerdo con las reivindicaciones 1 - 2, de los sulfatos de fucano despolimerizados obtenibles del Fucus vesiculosus, Ascophyllum nodosum, Ecklonia kurome, Eisenia bicyclis, Laminaria digitata, Laminaria japónica, Padina pavonia, Pelvetia canaliculata, Sargassum linifolium, Undaria pinnatifida.

4. Empleo de acuerdo con las reivindicaciones 1 - 3 de los sulfatos de fucano despolimerizados que tienen las siguientes propiedades químicas y químico-físicas:

-: Peso molecular: mayor de 5.000 - 14.000 daltons

-: Azufre: 5 - 12,5%

-: Fucosa: 25 - 43%

-: Ácidos urónicos: 9 - 25%

5. Empleo de acuerdo con las reivindicaciones 1 - 4, caracterizado porque se efectúa empleando composiciones para uso tópico que contienen sulfatos de fucano a concentraciones en el margen de 0,01 - 20% p/v.

6. Empleo de acuerdo con la reivindicación 5, en donde para lociones y champús, se emplean concentraciones de sulfatos de fucano en el margen de 0,01 - 1% p/v.

7. Empleo de acuerdo con la reivindicación 5, en donde para cremas y geles se emplean concentraciones de sulfatos de fucano en el margen de 0,1 - 20% p/v.

8. Sulfatos de fucano de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el peso molecular de 14.000 daltons está excluido.

9. Procedimiento para obtener los sulfatos de fucano de la reivindicación 8, el cual comprende los siguientes pasos:

a) dispersión en agua con agitación de algas secas y polvo molido, o del material vegetal suficiente para obtener una concentración de producto seco de 12,5% p/p, a una temperatura en el margen de 92 - 100ºC, extrayendo el material vegetal bajo estas condiciones durante 16 horas;

b) filtrado de la suspensión y corrección del pH del filtrado a un valor en el margen de 2,0 - 2,5, retirada del precipitado formado por filtración, corrección del pH del sobrenadante a un valor en el margen de 6,5 - 7,5;

c) ultrafiltración en una membrana con una separación de 100.000 daltons, para reducir el volumen de la solución a 1/4 - 1/5 del volumen inicial, subsiguiente diálisis en el mismo equipo frente a 3 volúmenes de agua destilada, seguido opcionalmente por un paso de concentración;

d) salificado de la solución, adición de dos volúmenes de etanol o acetona y recuperación del extracto crudo;

e) despolimerización a la temperatura de 55ºC del extracto crudo en solución acuosa en presencia de una sal cúprica inorgánica en un ratio en % en peso con el extracto en el margen de 0,12 - 0,14%, y de 8% de peróxido de hidrógeno en cantidad suficiente para que el ratio entre el peso del extracto crudo y el volumen en ml del peróxido de hidrógeno está en el margen de 1/4 - 1/10, durante el tiempo necesario para reducir el peso molecular en un margen mayor de 5.000 y menor de 14.000, excluyendo este último;

f) filtrado de la solución, salificado y precipitación de las sales de cobre de los fucanos despolimerizados mediante la adición de 2-3 volúmenes de etanol o acetona;

g) disolución del precipitado en agua a una concentración entre 5 y 7% p/v y tratamiento con una resina de intercambio iónico en forma de Na^{+} durante una noche con una ligera agitación; eliminación de la resina y corrección del pH a un valor en el margen de 6,0 - 7,0; salificado y precipitación de los fucanos despolimerizados en forma de sus correspondientes sales sódicas mediante la adición de 2-3 volúmenes de etanol o acetona.