ES2242376T3

ES2242376T3 - Administracion de particulas inmunogenas mediante particulas de agshb.

Info

Publication number: ES2242376T3
Application number: ES99902800T
Authority: ES
Inventors: Jorg Reimann; Yechezkel Barenholz; Dvorah Diminsky; Reinhold Schirmbeck
Original assignee: Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Current assignee: Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Priority date: 1998-02-03
Filing date: 1999-01-29
Publication date: 2005-11-01
Anticipated expiration: 2019-01-29
Also published as: DK1053018T3; EP1053018B1; JP4480267B2; EP1053018A2; WO1999039736A2; DE69926342T2; AU755957B2; AU2297399A; DE69926342D1; ATE300312T1; CA2319599C; JP2002502828A; WO1999039736A3; CA2319599A1

Abstract

Uso de una molécula antigénica encapsulada en un antígeno de superficie de la hepatitis B (AgsHB) para la preparación de una composición farmacéutica para estimular o modular una respuesta mediada por LTC frente a la molécula antigénica, en el que dicha molécula antigénica no está unida covalentemente a dicha partícula de AgsHB, y la molécula antigénica es un péptido o proteína antigénica.

Description

Administración de partículas inmunógenas mediante partículas de AgsHB.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al uso de una molécula antigénica, como un péptido antigénico o una citocina, contenida en una partícula de AgsHB, para la preparación de composiciones farmacéuticas, particularmente para potenciar la actividad inmunógena de los componentes.

Bibliografía

Aspinall, G.O. y col., Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 51:169-242 (1995).

Clarke, B.E. y col., Nature 330(26):381-384 (1987).

Delpeyroux, F. y col., Science 233:472-81 (1986).

Diminsky, D. y col., Vaccine 15(6/7):637-647 (1997).

Felgner, P.L. y col., Biochemistry 20(8):2168-2172 (1981).

Francis, M.J. y col., Proc. Natl. Acad. Sci USA 87:2545-2549 (1990).

Geissler. M. y col., J. Immunol. 158(3):1231-1237 (1997).

Lowry, O.H. y col., J. Biol. Chem. 293:265-275 (1951).

Nguyen, T.D. y col., Cancer. Immunol Immunother. 43(6):345-354 (1997).

Perin, F. y col., Nucl. Med. Biol. 21(8):1093-1100 (1994).

Puzo, G., Crit. Rev. Microbiol. 17(4):305-327 (1990).

Shirmbeck, R. y col., J. Immunol. 15(3):1110-1119 (1994).

Talmon, Y., Ber. Bunsenges. Phys. Chem. 100(3):364-372 (1996).

Weiner, G.J. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94(20):10833-10837 (1997).

Wong, M. y col., Biochemistry 23:6498-6505 (1984).

Wooldridge, J.E. y col., Blood 89(8):2994-2998 (1997).

Yachi, K. y col., J. Microencapsul. 12(4):377-388 (1995).

Yamamoto, S. y col., J. Immunol. 143(12):4072-4076 (1992).

Yamamoto, T. y col., Antisense Res. Dev. 4(2):119-122 (1994).

Antecedentes de la invención

Las vacunas convencionales frente a virus u otros microorganismos infecciosos emplean con frecuencia patógenos inactivados o vivos atenuados. Las desventajas de estas preparaciones de vacunas incluyen la dificultad de su producción a gran escala, consideraciones de seguridad en su manejo, y los riesgos implicados en la inmunización de ancianos o personas inmunodeprimidas con vacunas vivas atenuadas.

Las vacunas de subunidades, que utilizan componentes aislados de una partícula vírica, son una alternativa más segura a las vacunas convencionales. Los componentes son típicamente proteínas recombinantes o péptidos sintéticos cortos. Sin embargo, la mayor parte de las vacunas de subunidades, al igual que la mayor parte de los antígenos solubles, generalmente desencadenan sólo una respuesta inmunitaria humoral, que estimula los linfocitos B para producir anticuerpos. Tal respuesta es eficaz en el ataque de bacterias y virus en el medio extracelular, pero no para la eliminación de bacterias intracelulares, parásitos ni células infectadas por virus. Para una eficacia máxima, una vacuna también debe ser capaz de desencadenar una respuesta mediada por LTC (linfocitos T citotóxicos). La respuesta mediada por LTC estimula la producción de linfocitos T citotóxicos, que atacan a las células que perciben como anormales, incluyendo las células infectadas por virus.

El modo de procesamiento y presentación de un antígeno determina qué subtipo de linfocitos T (cooperadores o citotóxicos) se activa durante la respuesta inmunitaria. En la ruta exógena (clase II) los antígenos exógenos entran en una célula presentadora de antígeno (APC) mediante endocitosis o por un mecanismo relacionado. Después las proteínas experimentan proteólisis, proporcionando péptidos que tienen 10-20 aminoácidos, que se unen a las moléculas del CPH-II. Los complejos resultantes estimulan los linfocitos T CD4+ (cooperadores), que regulan las respuestas inmunitarias humorales. En la ruta endógena (clase I), las proteínas presentes en el citoplasma, como las proteínas víricas, se degradan a péptidos de 8-10 aminoácidos de longitud, que se unen a las moléculas del CPH-I. Los complejos resultantes interactúan con los linfocitos T CD8+ (citotóxicos) (LTC). Como se ha señalado anteriormente, esta respuesta es especialmente importante para la protección frente a las células infectadas por virus y a los microorganismos intracelulares.

Por tanto, es deseable proporcionar composiciones inmunógenas que produzcan una respuesta inmunitaria eficaz mediada por LTC, particularmente para su uso con antígenos solubles.

Resumen de la invención

La presente invención incluye el uso de una molécula antigénica según se define en la reivindicación 1. La respuesta inmunitaria es una respuesta mediada por LTC, y está potenciada preferentemente en un factor de dos o más en relación con la que desencadenan las moléculas cuando se administran sin AgsHB. Las composiciones también son eficaces para producir una respuesta mediada por LTC cuando la molécula antigénica, administrada sin AgsHB, es sustancialmente ineficaz en la producción de esa respuesta.

La partícula de AgsHB es preferentemente una partícula recombinante, derivada de una levadura o producida en una célula de mamífero, tal como una célula CHO (ovario de hámster chino). La molécula encapsulada es preferentemente una proteína o péptido antigénico. Las formas de realización específicas incluyen aquellas en las que la molécula es ovoalbúmina o el péptido VIHenv/V3. En formas de realización adicionales, la composición incluye además una molécula inmunoestimuladora, tal como una citocina contenida en la partícula de AgsHB.

Preferentemente la molécula inmunoestimuladora es una citocina, tal como IL-12, IL-10 o IFN-\gamma; se prefieren particularmente IL-12 y IFN-\gamma. Otras moléculas inmunoestimuladores incluyen la proteína de la toxina colérica (TC) y la proteína de la enterotoxina B de estafilococo.

La composición farmacéutica se prepara preferentemente incubando las partículas en un medio acuoso en presencia de la molécula. En una forma de realización preferida, la molécula es un antígeno, por ejemplo el péptido VIHenv/K^{d}. En otras formas de realización preferidas, la molécula es un compuesto inmunoestimulador, o la partícula puede contener tanto un antígeno como una molécula inmunoestimuladora.

La composición también puede incluir un glucolípido incorporado a la cara externa de la bicapa lipídica de la partícula de AgsHB, donde el glucolípido preferentemente incluye al menos un residuo de manosa.

Con el fin de incorporar una molécula antigénica a una partícula de AgsHB, las partículas se incuban en un medio acuoso en presencia de la molécula. La temperatura de incubación está preferentemente entre aproximadamente 35ºC y aproximadamente 60ºC, y más preferentemente entre aproximadamente 55ºC y aproximadamente 60ºC. El procedimiento también puede incluir la incorporación de un glucolípido a la superficie exterior de la partícula de AgsHB, preferentemente incubando el glucolípido con partículas de AgsHB y la molécula biológicamente ac-
tiva.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra una imagen generada por ordenador de una micrografía electrónica de criotransmisión de una partícula de AgsHB, que muestra la estructura de la vesícula lipídica porosa que tiene poros proteicos definidos;

La Figura 2 es una imagen topográfica de un AgsHB obtenida a partir del análisis de imagen de una micrografía electrónica de criotransmisión de la partícula;

La Figura 3 muestra el cociente del área proteica total respecto al área de las proteínas 24kd+27kd, según se determina mediante electroforesis en gel, del AgsHB sólo y del AgsHB incubado con ovoalbúmina a una serie de temperaturas crecientes;

La Figura 4A muestra el nivel de respuesta anti-AgsHB mediada por LTC inducida por células estimuladas sólo con AgsHB, sólo con OVA, y con OVA encapsulada en AgsHB, frente a células específicas para AgsHB (P815/S) y células no específicas (P815);

La Figura 4B muestra del nivel de respuesta anti-OVA mediada por LTC inducida por células estimuladas como en la Figura 4A, frente a células específicas para OVA (EG7) y células no específicas (EL4);

La Figura 4C muestra el nivel de respuesta anti-AgsHB mediada por anticuerpos inducida por AgsHB solo, OVA sola y OVA encapsulada en AgsHB;

La Figura 4D muestra el nivel de respuesta anti-OVA mediada por anticuerpos inducida por las composiciones que se muestran en la Figura 4C;

La Figura 5A muestra el nivel de respuesta anti-AgsHB mediada por LTC inducida por células estimuladas con AgsHB solo, con el péptido VIHenvV3 solo, y con el péptido VIHenvV3 encapsulado en el AgsHB, frente a células específicas para el AgsHB (P815/S) y células no específicas (P815);

La Figura 5B muestra del nivel de respuesta anti-péptido VIHenvV3 mediada por LTC inducida por células estimuladas como en la Figura 5A, frente a células específicas para el péptido VIHenvV3 (P815/péptido VIHenvV3) y células no específicas (P815); y

Las Figuras 6A-H muestran el nivel de respuesta anti-AgsHB mediada por LTC inducida en células de ratones "no respondedores" (C57BL/6 H2-b) por el AgsHB solo (A), por el AgsHB que contiene diversas citocinas (B-F) y por IL-12 sola (G), y por AgsHB/IL-12 en un experimento de control (H) en el que se estimularon de nuevo las células efectoras con células no portadoras de antígeno.

Descripción detallada de la invención I. Antígeno de superficie de hepatitis B (AgsHB) A. Antecedentes

El virus de la hepatitis B (VHB) es una causa importante de hepatitis aguda y crónica en seres humanos. Durante la replicación del VHB se produce un gran exceso (1000:1) de partículas de superficie "vacías", que no contienen cápsides ni ADN/ARN vírico. Estas partículas de AgsHB (antígeno de superficie de la hepatitis B) son inmunógenos potentes en seres humanos y en muchas especies animales.

Las vacunas de subunidades del VHB de primera generación incluían partículas de AgsHB purificadas a partir del plasma de portadores crónicos humanos. Debido al aporte limitado de plasma de portadores y a importantes problemas de seguridad, se introdujeron las vacunas basadas en partículas recombinantes de AgsHB derivadas de levadura (Sacchromyces cerevisiae). Más recientemente se ha introducido una tercera generación de vacuna recombinante de VHB, que es más similar a las partículas derivadas de seres humanos. Estas partículas de AgsHB proceden de células de ovario de hámster chino (CHO) en cultivo, y en el presente documento se denominan partículas CHO-AgsHB.

B. Estructura

Se ha descrito la composición, estructura e inmunogenia de las partículas de AgsHB derivadas de levadura y derivadas de CHO (Diminsky y col.). Las partículas miden aproximadamente 20-33 nm de tamaño y están compuestas por aproximadamente un 60% de proteínas y un 40% de lípidos en peso. Los fosfolípidos son los lípidos predominantes. La partícula derivada de CHO difiere principalmente de la partícula derivada de levadura en que incluye tres proteínas de superficie del AgsHB (cada una de ellas en dos formas de glucosilación) denominadas grande (L), mediana (M) y pequeña (S), mientras que esta última incluye sólo el péptido S no glucosilado.

El análisis bioquímico reveló que casi todos los fosfolípidos de las partículas de AgsHB (aproximadamente el 85%) son hidrolizados por las fosfolipasas A2 y C, y que todos los aminofosfolípidos reaccionan con sulfonato de trinitrobenceno (Diminsky). Estas observaciones sugerían que la partícula no es una vesícula sellada, sino que existe en forma de (a) una lipoproteína, que tiene una monocapa de lípidos polares que recubre un núcleo de lípidos neutros y parte de la proteína, o (b) una vesícula porosa cuyos poros son permeables a los reactivos mencionados anteriormente. La microscopia electrónica de criotransmisión (Figura 1) confirmó esta última posibilidad, que muestran, a una resolución de 1 nm, una vesícula porosa.

Los fosfolípidos cubren grandes zonas del componente proteico externo e interno de la partícula, aunque algunos dominios proteicos forman un bucle en el exterior de la capa lipídica y son accesibles a anticuerpos o proteasas. Las partículas son huecas y encapsulan un espacio de aproximadamente 900-8200 nm cúbicos por partícula. El acceso al interior de las partículas está mediado por los poros, que tienen un diámetro medio de aproximadamente 1-2 nm.

Las Figuras 2A y 2B muestran imágenes topográficas de las partículas de AgsHB, cada una de ellas de aproximadamente 22 nm de diámetro, obtenidas mediante análisis por imagen de micrografía electrónicas de criotransmisión de las partículas. (Si se desea una revisión de los procedimientos de MET, véase Talmon, 1996). Este análisis por imagen se puede realizar usando un programa informático proporcionado por NIH o Adobe Systems Inc. A las regiones de mayor densidad de la imagen se les asignaron mayores valores a lo largo del eje vertical (fuera de plano), como se muestra en las Figuras 2A-2H. Como se representa en las Figuras, el centro de cada vesícula contiene una fase acuosa (regiones más claras, que tienen valores numéricos menores). Las proteínas (regiones más oscuras, que tienen los valores numéricos más elevado) están embebidas en la bicapa lipídica (regiones de tono medio). Se pueden ver claramente poros en la bicapa, como se indica con flechas en las figuras.

II. Encapsulación de los antígenos en las partículas de AgsHB

Se ha encontrado que moléculas biológicamente activas, tales como proteínas y péptidos antigénicos o citocinas, se pueden encapsular en las partículas huecas de AgsHB, en virtud de los poros que se han descrito anteriormente. Como se usan en el presente documento, los términos "encapsulado en" o "contenido en" indican una contención o atrapamiento físico de las moléculas, y no una unión covalente, como se encuentra en las proteínas de fusión, analizados más adelante. Esta contención se refiere tanto a moléculas que están encapsuladas en el interior de las partículas de AgsHB como a moléculas atrapadas que están expuestas o presentes en la superficie de la partícula, en virtud de su estructura porosa.

Las composiciones resultantes producen estimulación de las respuestas inmunitarias frente a las moléculas antigénicas encapsuladas. En particular, las composiciones pueden estimular una respuesta mediada por LTC que está potenciada, hasta factores de 5, 10 o más, en relación con la que desencadenan las moléculas antigénicas cuando se administran sin AgsHB. Tal potenciación se puede evaluar, por ejemplo, mediante la lisis porcentual de células específicas en relación con células de control no específicas, utilizando ensayos estándar, como se describe a continuación. Las composiciones pueden ser eficaces en la producción de una respuesta mediada por LTC incluso cuando la molécula, sin AgsHB, es sustancialmente ineficaz en la producción de esa respuesta (es decir, se observa una respuesta mediada por LTC escasa o nula en las células diana en relación con las células controles). Como se describe más adelante en la Sección III, la encapsulación de moléculas inmunoestimuladoras, tales como citocinas, en partículas de AgsHB, potencia mucho la inmunogenia de las propias partículas de AgsHB.

En los experimentos que se describen a continuación se demuestran estos efectos para una proteína que tiene varios cientos de aminoácidos (ovoalbúmina), para un péptido antigénico pequeño (VIH/V3, el tercer dominio variable de la proteína de la cubierta gp120 del VIH) y varios inmunoestimuladores (citocinas).

No se pretende que estos ejemplos sean limitantes, y la invención incluye el uso de composiciones de AgsHB que incorporan otras moléculas antigénicamente activas. Como se demuestra en el presente documento son particularmente útiles las composiciones que incorporan antígenos o compuestos inmunoestimuladores con el fin de desencadenar una respuesta inmunitaria humoral y celular potenciada. Ejemplos específicos de las moléculas útiles en las composiciones incluyen citocinas IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-18, GM-CSF y IFN-\gamma, moléculas de toxinas modificadas genéticamente de tétanos, difteria, tos ferina y enterobacterias, proteína CS del paludismo, transcriptasa inversa del VIH, nucleoproteínas y proteínas en la matriz de muchos virus, y proteínas víricas oncógenas.

Es importante distinguir las composiciones, que comprenden moléculas encapsuladas en partículas de AgsHB, de los péptidos de fusión AgsHB-antígeno que se han descrito previamente (por ejemplo, Clarke y col., Francis y col., y Delpeyroux y col.). Tales composiciones se preparan uniendo covalentemente los péptidos o, más típicamente, mediante construcciones de ADN quimérico. Este último abordaje precisa la preparación de un ADN quimérico que contenga genes que expresen el antígeno y las proteínas deseadas del VHB, la introducción de la construcción fusionada en un vehículo de expresión adecuado, la expresión de las proteínas de fusión y el aislamiento de la proteína. Delpeyroux y col. publicaron que los títulos obtenidos mediante la inmunización de ratones con la proteína de fusión AgsHB-polio eran "bajos según patrones de poliovirus". También se observó una pérdida de la respuesta inmunitaria frente al VHB nativo, probablemente debida a distorsión de los epítopos del AgsHB en la proteína de fusión. Clarke y col. publicaron títulos significativos anti-VG (virus de la glosopeda) para una proteína de fusión VG-AgsHB, aunque no describieron una respuesta mediada por LTC.

Por el contrario, las composiciones usados en el presente documento se preparan mediante incubación simple de los componentes, sin que haya modificación covalente. Se encontró que estimulan respuestas significativas mediadas por anticuerpos y por LTC, como se detalla más abajo.

A. Encapsulación de la OVA (ovoalbúmina) en el AgsHB

Se incubaron partículas de AgsHB en presencia de la proteína OVA (100 \mug de cada uno en 100 \mul de H_{2}O) a 4ºC (sobre hielo), 37ºC y 56ºC. Al cabo de 10 minutos se enfriaron las muestras a 4ºC y se aislaron las partículas mediante ultrafiltración. En experimentos de control se incubó la OVA en condiciones idénticas en tampón de STF, sin partículas de AgsHB presentes, y se incubaron partículas de AgsHB en condiciones idénticas sin OVA. El OVA/AgsHB que se había recogido se analizó mediante electroforesis en gel, y se cuantificó la proteína en cada banda (Diminsky, Lowry). Como la OVA se solapa con la banda de PRE S1 (proteína grande) del AgsHB, los dos con un PM de aproximadamente 42 kDa, se realizó el análisis comparando la densidad total (39 kDa + 42 kDa + 45 kDa) con la de los dos péptidos S (24 kDa + 27 kDa).

Como se muestra en la Figura 3, el cociente de densidades, y por lo tanto la presencia de OVA, aumentaba con el aumento de la temperatura de incubación. Este efecto se podía deber a una expansión eficaz o a un aumento de flexibilidad de los poros de la superficie de las partículas a temperatura creciente. El análisis cuantitativo reveló una encapsulación de la OVA de aproximadamente 6% a 56ºC. Se deberían evitar temperaturas de incubación muy superiores a ésta, por ejemplo próximas a 80ºC, porque las composiciones son inestables a estas temperaturas.

B1. Inducción de una respuesta mediada por LTC frente a moléculas encapsuladas en partículas de AgsHB: OVA

Las partículas de OVA/AgsHB, preparadas como se ha descrito anteriormente, se aislaron, lavaron y ajustaron a la concentración adecuada para la inmunización. Se inyectaron las siguientes composiciones en ratones F1 (H-2d/b), cada una de ellas en 50 \mul de PBS (solución salina tamponada con fosfato): (a) 1 \mug de partículas de AgsHB (sin adyuvantes), (b) 100 \mug de OVA nativa, y (c) 1 \mug de AgsHB/OVA, según se describe en la Sección A, más arriba.

Las Figuras 4A y 4B muestran la respuesta humoral (anticuerpos séricos) y la respuesta mediada por LTC, respectivamente, desencadenada por cada una de estas composiciones, frente al AgsHB y frente a la OVA. Para la evaluación de la respuesta mediada por LTC, células del bazo o de los ganglios linfáticos que se habían obtenido a partir de ratones inmunizados entre siete días y cinco semanas después de la vacunación, se volvieron a estimular específicamente in vitro durante cinco días con células tumorales singénicas irradiadas, incubadas brevemente con péptidos de OVA o de AgsHB. (Estas últimas células se habían cultivado in vitro con las partículas de AgsHB recombinante durante dos horas a 37ºC). Se recogieron las células y se probaron en un ensayo citolítico de liberación de ^{51}Cr de cuatro horas, frente a día nos singénicas portadoras de antígeno y no portadoras de antígeno. La lisis de células específicas para la proteína S del AgsHB (P815/S) o para la OVA (EG7) se comparó con la de células no específicas (P815 y EL4, respectivamente). Las células EG7 son células EL4 que han sido transfectadas de manera estable con un plásmido de expresión que codifica OVA.

Como se muestra en las figuras, la composición (a), AgsHB solo, indujo una respuesta mediada por LTC y una respuesta humoral frente al AgsHB. La OVA sola desencadenó una respuesta humoral pero no una respuesta mediada por LTC.

La OVA encapsulada en AgsHB, composición (c), desencadenó una intensa respuesta anti-AgsHB tanto humoral como mediada por LTC, y una respuesta anti-OVA humoral débil. De forma más significativa, la composición también desencadenó una intensa respuesta anti-OVA mediada por LTC, que no se observó con OVA sola.

B2. Inducción de respuesta mediada por LTC frente a moléculas encapsuladas en AgsHB: péptido VIHenv/V3

En un conjunto similar de experimentos se inmunizó a ratones BALB/c (H-2d) con las siguientes composiciones: (a) 1 \mug de partículas de AgsHB (sin adyuvantes), (b) 100 \mug de péptido antigénico VIHenv/V3, y (c) 1 \mug de AgsHB que contenía el péptido antigénico HNenv/V3. Esta composición se formó mediante coincubación de los componentes, en general como se ha descrito para la OVA, anteriormente. Se estimó que se incorporaban aproximadamente 20 ng de péptido por cada \mug de partículas de AgsHB.

La respuesta mediada por LTC se midió en células específicas (P815/S, como se ha descrito anteriormente para AgsHB, y el péptido P815/V3 para el péptido VIHenv/V3) frente a la que se observó en células P815 no específicas. Los resultados se muestran en la Figura 5.

Como se muestra en la Figura, tanto AgsHB solo como AgsHB/VIHenv/V3 desencadenaron una intensa respuesta anti-AgsHB mediada por LTC. Además, mientras que el péptido VIHenv/V3 solo (composición (b)) no desencadenó ninguna respuesta específica mediada por LTC, se observó una intensa respuesta anti-VIHenv/V3 mediada por LTC para el péptido administrado en AgsHB (composición (c)).

Estos resultados muestran que se pueden administrar proteínas y péptidos a las células presentadoras de antígeno (APC) in vivo por partículas de AgsHB para su procesamiento y para la presentación inmunógena a través de la ruta de clase I, estimulando de esta manera los precursores de los LTC. Esta respuesta mediada por LTC se desencadena incluso para antígenos que no son inmunógenos para los LTC cuando se inyectan como proteínas nativas.

En una forma de realización relacionada de este procedimiento se puede emplear la coadministración de un antígeno y una citocina en un AgsHB para modular el tipo de respuesta inmunitaria que ceba o potencia una formulación de AgsHB/antígeno. Por ejemplo, la IL-12 dirige la polarización de la respuesta de los linfocitos T CD4+ hacia el fenotipo Th 1 y suprime el fenotipo Th2. Por el contrario, la IL-10 suprime la respuesta de tipo Th-1 y potencia la respuesta de tipo Th-2. Estas composiciones son útiles cuando se desea modular el fenotipo patógeno de una respuesta autoinmunitaria o alérgica mediada por linfocitos T. Por ejemplo, en el tratamiento de las enfermedades autoinmunitarias con frecuencia es deseable modificar el fenotipo de la respuesta inmunitaria, en lugar de suprimir totalmente la respuesta.

III. Modulación de la respuesta mediada por LTC por inmunoestimuladores encapsulados en las partículas de AgsHB

Las partículas de AgsHB, sin adyuvantes, inducen una respuesta mediada por LTC en ratones H-2^{d}/L^{d+} (BALB/c, C.B-17). Sin embargo, se encontró que otras cepas de ratones, por ejemplo H-2^{d}/L^{d-} (dm2) y H-2^{b} (C57LB/6), no responden (Schirmbeck y col.). Se ha encontrado que la encapsulación de moléculas inmunoestimuladoras, por ejemplo citocinas, en las partículas de AgsHB, puede inducir una respuesta mediada por LTC incluso en las cepas que no responden.

Las partículas de AgsHB también se pueden usar para administrar oligonucleótidos inmunoestimuladores. Estas composiciones potencian la inmunogenia del AgsHB para los linfocitos B (es decir, la respuesta mediada por anticuerpos), así como para los linfocitos T (respuesta mediada por LTC). Por ejemplo, se encontró que oligonucleótidos que contienen ciertas secuencias palindrómicas inducen el IFN y potencian la actividad de los linfocitos NK de las células de bazo de ratón (Yamamoto y col.; 1992, 1994). Otros oligonucleótidos han sido eficaces como adyuvantes para inducir la producción de citocinas, activar linfocitos B, monocitos, células dendríticas y linfocitos NK (Weiner; Woolridge).

Para producir los datos mostrados en la Figura 6 se cargaron varias citocinas en las partículas de AgsHB siguiendo un protocolo tal como el perfilado anteriormente para la OVA, en el que se llevó a cabo la incubación a 45ºC. Se estimó que se incorporaban aproximadamente 10 ng de citocinas por cada \mug de partículas de AgsHB (incorporación de aproximadamente 1%) a esta temperatura. Se inmunizó a grupos de ratones "no respondedores" (H-2^{b} C57BL/6) con partículas de AgsHB, con y sin citocinas desincorporadas, o con citocina sola (Figura 6G), en las cantidades que se muestran a continuación:

A: 1 \mug de partículas de AgsHB "desnudas"

B-F: 1 \mug de AgsHB/citocinas, donde la citocina era:

: (b) IL-12, (c) IFN-\gamma, (d) IL-2, (e) IL-4, (f) péptido \beta de la IL-1

G: 1 \mug de IL-12 (control)

H: 1 \mug de AgsHB/IL-12

Después de 12 días se volvió a estimular in vitro durante cinco días a los esplenocitos de los ratones inmunizados con células de linfoma RBL5 singénicas irradiadas incubadas brevemente con AgsHB. Para el experimento de control, H, los esplenocitos se volvieron a estimular con células RBL5 singénicas no coincubadas brevemente. Los esplenocitos (células efectoras) se cocultivaron posteriormente con células diana marcadas con ^{51}Cr, y la respuesta mediada por LTC se midió mediante un ensayo estándar de liberación de ^{51}Cr. Las células diana eran células EL4 no coincubadas brevemente (círculos vacíos en las Figuras 6A-G) o células EL4 que habían sido incubadas brevemente con AgsHB (círculos llenos).

Los resultados se muestran en las Figuras 6A-H. En los experimentos de control (A y G), en los que se inmunizó a los ratones "no respondedores" con AgsHB solo o con IL-12 sola, no se observó ninguna respuesta mediada por LTC en las células específicas para AgsHB en comparación con las células controles. Tampoco se observaron respuestas en el experimento H, en el que se volvió estimular a los esplenocitos con células RBL5 no portadoras de antígeno.

Las composiciones D-F mostraron una ausencia de respuesta similar. La ausencia de respuesta por la IL-4 encapsulada en AgsHB (E) no es inesperada, ya que se sabe que está citocina suprime la respuesta mediada por LTC (véase, por ejemplo, Nguyen, Geissler).

Sin embargo, se observó una intensa respuesta mediada por LTC para las composiciones B y C, en las que las citocinas eran IL-12 y IFN-\gamma, respectivamente. Estos datos muestran que la encapsulación de ciertas citocinas en partículas de AgsHB puede inducir una respuesta mediada por LTC incluso en cepas "no respondedoras", es decir, en individuos que no muestran una respuesta mediada por LTC frente al AgsHB solo.

En otros experimentos se incorporaron a las partículas de AgsHB las proteínas inmunoestimuladoras toxina colérica (TC) y enterotoxina estafilocócica B (EEB), que son conocidas como adyuvantes para la estimulación de la respuesta inmunitaria mediada por LTC y humoral, a un nivel de aproximadamente 5-20 ng de proteína por cada \mug de AgsHB. Experimentos preliminares que estudian la inmunogenia de estas composiciones han mostrado una llamativa potenciación de las respuestas mediadas por LTC y por anticuerpos de las partículas de AgsHB.

IV. Incorporación de glucolípidos a la superficie externa de partículas de AgsHB

Los glucolípidos se pueden introducir en la membrana externa de la partícula de AgsHB mediante intercambio de lípidos, utilizando micelas o liposomas, como se describe en Felgner. En Felgner, la coincubación de micelas de gangliósido (que contenían principalmente trisialogangliósido GT1b) con vesículas fusionadas de fosfatidilcolina de aproximadamente 70 nm de diámetro, o de VUP de aproximadamente 20 nm de diámetro, dio lugar a la incorporación del gangliósido a la superficie externa de las vesículas. De manera alternativa, se pueden introducir los glucolípidos mediante el uso de una proteína de intercambio de glucolípidos, como se describe en Wong y col.

Mediante esta inclusión de glucolípidos, particularmente glucolípidos que contienen residuos de manosa disponibles, las partículas se pueden dirigir frente a células presentadoras de antígenos específicos, como células dendríticas o macrófagos. Véase, por ejemplo, en Yachi, donde se encontró que la modificación de la superficie de los liposomas con ésteres de ácidos grasos de manobiosa era útil para dirigir los liposomas frente a las células de Kupffer y otros macrófagos. Perin y col. han empleado un poli-(1,3)-galactósido acilado para el ataque selectivo de los macrófagos.

Los glucolípidos de la superficie de las micobacterias han sido bien caracterizados (véase, por ejemplo, Aspinall, Puzo). Estos glucolípidos, que con frecuencia son específicos de especie, se han usado para la identificación de diversas especies, como M. leprae y M. tuberculosis, y para controlar el tratamiento de la enfermedad producida por estos organismos. De acuerdo con la presente invención, los AgsHB que tienen un glucolípido específico incorporado en la monocapa lipídica se pueden administrar para inducir una respuesta mediada por LTC frente a células singénicas infectadas por micobacterias.

V. Administración

Para su uso en seres humanos, una dosis preferida del antígeno encapsulado está en el intervalo de 0,01 a 20 \mug, más preferentemente entre 0,02 y 2 \mug, incorporados a un nivel de aproximadamente el 1% a 10% en peso en las partículas de AgsHB. La administración puede ser mediante inyección, por ejemplo, intraperitoneal (ip), subcutánea (sc), intravenosa (iv) o intramuscular (im).

Aunque la invención se ha escrito en referencia a procedimientos y formas de realización específicos, se podrá apreciar que se pueden hacer diversas modificaciones sin separarse de la invención, como se define en las reivindicaciones adjuntas.

Claims

1. Uso de una molécula antigénica encapsulada en un antígeno de superficie de la hepatitis B (AgsHB) para la preparación de una composición farmacéutica para estimular o modular una respuesta mediada por LTC frente a la molécula antigénica, en el que dicha molécula antigénica no está unida covalentemente a dicha partícula de AgsHB, y la molécula antigénica es un péptido o proteína antigénica.

2. Uso de la reivindicación 1, en el que dicha respuesta mediada por LTC está potenciada en relación con la producida por la molécula antigénica sola.

3. Uso de la reivindicación 1 ó 2, en el que dicha composición farmacéutica comprende además una molécula inmunoestimuladora encapsulada en dicha partícula de AgsHB.

4. Uso de la reivindicación 3, en el que dicha molécula inmunoestimuladora es una citocina.

5. Uso de la reivindicación 1, en el que dicha proteína o péptido antigénico es ovoalbúmina o el péptido VIHenv/V3.

6. Uso de la reivindicación 1, en el que dicha molécula inmunoestimuladora es la proteína de la toxina colérica (TC) o la proteína de la enterotoxina estafilocócica (EEB).

7. Uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 que además comprende un glucolípido incorporado a la superficie exterior de la bicapa lipídica de dicha partícula de AgsHB.