ES2242387T3 - Lipopeptidos induxtores de citotoxicidad t linfocitaria que presentan por lo menos un epitopo t auxiliar, y sus usos parra la vacunacion. - Google Patents
Lipopeptidos induxtores de citotoxicidad t linfocitaria que presentan por lo menos un epitopo t auxiliar, y sus usos parra la vacunacion.Info
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Abstract
Lipopéptido que comprende al menos un epítopo T auxiliar, al menos un epítopo de CTL y al menos un resto lipídico, caracterizado porque los epítopos y la parte lipídica, por una parte, y los epítopos por otra parte, se separan independientemente mediante secuencias de aminoácidos, denominadas espaciadores, comprendiendo al menos uno de los espaciadores unos encadenamientos de 1 a 10 aminoácidos seleccionados de entre los aminoácidos de glicina, arginina, ácido glutámico y ácido aspártico.
Description
Lipopéptidos inductores de citotoxicidad T
linfocitaria que presentan por lo menos un epítopo T auxiliar, y
sus usos para la vacunación.
La presente invención se refiere a lipopéptidos
inductores de citotoxicidad T linfocitaria, y que comprenden al
menos un epítopo T auxiliar. Se refiere asimismo al uso de estos
lipopéptidos como vacuna.
Existen dos tipos de respuestas inmunitarias: la
respuesta humoral debida a los anticuerpos, y la respuesta
citotóxica debida a los linfocitos T CD8^{+}.
Una respuesta citotóxica eficaz requiere la
presentación de los antígenos a los linfocitos T citotóxicos
CD8^{+} (CTL), en asociación con las moléculas de clase I del
Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC), pero también a los
linfocitos T auxiliares CD4^{+} (HTL) en asociación con las
moléculas de clase II del MHC.
Ya se ha descrito el uso de lipopéptidos para la
inducción de una respuesta citotóxica, es decir, la generación in
vivo de linfocitos T citotóxicos. En particular, la solicitud
FR-90.15.870 (publicación 2.670.787) (Instituto
Pasteur de Lille, Institut Pasteur, INSERM) describe lipopéptidos
constituidos por una parte peptídica, que comprende de 10 a 40
aminoácidos, y por una parte lipídica, que puede derivar de ácidos
grasos o de agrupamientos esteroideos.
Estos lipopéptidos muestran una buena capacidad
para inducir una respuesta citotóxica. Sin embargo, era conveniente
que fueran capaces de inducir igualmente una respuesta T auxiliar,
de la que se conoce la importancia para la inducción y el
mantenimiento de la respuesta citotóxica.
Según el conocimiento de los solicitantes, sólo
un artículo a nombre de VITIELLO et al. (1995, J. Clin.
Invest., 95, 341-349) ha evocado la posibilidad de
combinar, sobre una misma molécula lipopeptídica, un epítopo CTL y
un epítopo que induce una respuesta auxiliar (epítopo
T-HELPER o HTL).
En este artículo se describe la síntesis de dos
lipopéptidos. El primero está constituido por la parte
18-27 de la envoltura vírica del virus de la
hepatitis B, como epítopo CTL, por la parte 830-843
de la toxina tetánica, como epítopo T auxiliar, y por dos cadenas
palmitoílicas. Se observa la inducción de una citotoxicidad T
linfocitaria.
El segundo lipopéptido está constituido por el
epítopo NP 147-155 del virus de la influenza
murina, por un epítopo T auxiliar y por cadenas lipídicas.
Sin embargo, los lipopéptidos descritos en este
artículo presentan una baja solubilidad, debido a la presencia, por
un lado, de la parte lipídica y, por otra parte, de motivos
peptídicos hidrófobos. Se observará que los productos descritos por
estos autores están almacenados en disoluciones madres en un DMSO
concentrado, y se diluyen extemporáneamente en una disolución acuosa
tamponada para inyección.
Esta fuerte hidrofobia hace difícil la
fabricación de disoluciones de estos lipopéptidos, y por ello
limita considerablemente las posibilidades de esterilización
mediante filtración, que es el método generalmente utilizado por su
facilidad de realización. Además, limita fuertemente cualquier
posibilidad de caracterización.
El problema a resolver consistía, por lo tanto,
en reducir la hidrofobia de los lipopéptidos de múltiples epítopos,
manteniendo la accesibilidad al tratamiento necesario para
encaminar el motivo del epítopo CTL hacia el CMH de clase I.
La presente invención tiene por objetivo resolver
este problema.
Los inventores han descubierto ahora que es
posible no sólo aumentar la hidrofilia de las moléculas
lipopeptídicas, sino también limitar interacciones entre los
diferentes epítopos, introduciendo secuencias hidrófilas de
aminoácidos, denominadas espaciadores, en el seno de estas
moléculas.
Por lo tanto, la presente invención tiene por
objeto unos lipopéptidos que comprenden al menos un epítopo T
auxiliar, al un menos un epítopo de CTL y al menos un resto
lipídico, caracterizados porque los epítopos y la parte lipídica
por una parte, y los epítopos por otra parte, están separados
independientemente por secuencias de aminoácidos, denominadas
espaciadores, comprendiendo al menos uno de estos espaciadores
enlaces de 1 a 10 aminoácidos seleccionados de entre los
aminoácidos glicina, arginina, ácido glutámico y ácido aspártico.
Estos enlaces de aminoácidos globalmente cargados en medio neutro,
aseguran la hidrofilia del lipopéptido.
Preferentemente, los espaciadores son accesibles
a un tratamiento proteolítico mediante proteasoma, anterior a la
liberación del motivo del epítopo de CTL. Esta accesibilidad se
puede poner en evidencia como se describe por OSSENDORP et
al. (1996, Immunity, 5, 115-124).
Preferentemente, los espaciadores comprenden
entre 2 y 4 aminoácidos, siendo el número de aminoácidos suficiente
para obtener espaciadores globalmente cargados en medio neutro.
Preferentemente, al menos uno de los espaciadores comprende
argininas y/o glicinas. Las argininas presentan la ventaja de estar
cargadas a los pH fisiológicos, y de crear sitios de sensibilidad
particular a la ruptura proteolítica durante el tratamiento de los
epítopos.
Las glicinas presentan la ventaja de permitir la
introducción, en el seno de la parte peptídica del lipopéptido, de
un eventual sitio para una síntesis convergente por acoplamiento de
fragmento.
Según un modo de realización particularmente
ventajoso de la invención, al menos uno de los espaciadores presenta
una de las siguientes secuencias:
GLY ARG o ARG GLY
ARG.
El ácido glutámico y/o el ácido aspártico
presentan igualmente propiedades interesantes, aplicables para la
realización de espaciadores según la presente invención (acceso a
la degradación proteolítica natural, e introducción de funciones
carboxilato ionizadas en medio fisiológico a pH neutro).
Estos aminoácidos, que entran en la secuencia de
los espaciadores, se pueden sustituir ventajosamente por sus
derivados, o por otros aminoácidos funcionalmente equivalentes.
Estos aminoácidos se pueden separar, en el seno
de los espaciadores, mediante aminoácidos poco voluminosos desde el
punto de vista químico, es decir, que presentan cadenas laterales
cortas, que pueden ser, además de la glicina, la alanina. La
presencia de estos aminoácidos de cadena corta facilita la
proteolisis.
También, en el espaciador se puede introducir una
cisteína, o una cadena de alquilo funcionalizada por un grupo tiol,
capaz de preparar un posible sitio de unión química sencilla entre
dos fragmentos peptídicos, gracias a la formación de uniones
covalentes no peptídicas. Así, es posible realizar una unión
disulfuro entre dos péptidos diferentes, que comprenden cada uno una
función tiol, o una unión tioéter (en este caso, uno de los dos
péptidos debe estar funcionalizado mediante un halogenuro de
alquilo).
Los dos péptidos también se pueden unir mediante
formación de un heterociclo tiazolidínico, portando uno de los
péptidos una función aldehído. Esta función aldehído se puede
generar fácil y selectivamente en forma de un agrupamiento
alfa-oxoacilo, obtenido mediante oxidación peryódica
de una serina, de una treonina o de una cisteína, introducida en
posición N-terminal de un fragmento peptídico.
Es posible también asociar los dos péptidos
utilizando la reactividad de los aldehídos con bases débiles, o
métodos de unión vía la formación de una oxima (mediante reacción
entre una función aldehído y una función
amino-oxiacetilo), de una hidrazona (mediante
reacción entre una función aldehído y una hidrazida o una
aril-hidrazina). Estas reacciones básicas se repasan
en la revista de James Tam y Jane Spetzler (Biomed. Pep., Prot. And
Nucleic Acids (1995), 1, 123-132).
Recientemente, se ha desarrollado un método de
unión que consiste en generar una unión de hidrazona a partir de una
alquil-hidrazina (generada mediante
N-aminación de un precursor de amina) y de una
pareja funcionalizada mediante agrupamiento
alfa-oxoacilo.
Los hidrazinopéptidos se sintetizan mediante
N-aminación según Klinguer et al. (Tet.
Lett. (1996), 37, 7259-7262). Esta metodología
permite transformar cualquier función amina del péptido en una
función hidrazina. Así, la función hidrazina se puede situar en
posición N-terminal, o en la cadena lateral de un
aminoácido situado en cualquier sitio de la secuencia. La función
amina transformada puede ser una función amina alfa-épsilon de una
lisina o del ácido aminocaproico, una función delta amino de una
ornitina, o cualquier otra función amina primaria o
secundaria.
secundaria.
Los péptidos aldehídicos se generan como se ha
descrito por Tam y Spetzler (Biomed. Pep., Prot. And Nucleic Acids
(1995), 1, 123-132). Los restos de serina, treonina
o cisteína, precursores del agrupamiento
alfa-oxoacilo, se pueden situar en posición
N-terminal o en cualquier función amina de una
cadena lateral desde el momento en el que estos restos no estén
presentes en posición N-terminal, en los epítopos
considerados.
El agrupamiento lipídico se puede portar
indiferentemente por el hidrazinopéptido o el péptido
aldehídico.
Por epítopo T auxiliar se entiende, para la
comprensión de la presente invención, una secuencia de aminoácidos
capaz de asociarse a al menos un receptor HLA de clase II.
Por epítopo de CTL se entiende una secuencia de
aminoácidos capaz de asociarse a al menos un receptor HLA de clase
I.
Los epítopos T auxiliares capaces de asociarse a
varios receptores HLA de clase II diferentes se denominan epítopos
auxiliares multivalentes (HTL multivalentes).
Los lipopéptidos según la presente invención
comprenden preferentemente el encadenamiento de:
- -
- una parte lipídica;
- -
- un primer espaciador;
- -
- un epítopo T auxiliar;
- -
- un segundo espaciador; y
- -
- un epítopo CTL.
También pueden comprender:
- -
- una parte lipídica;
- -
- un primer espaciador;
- -
- un epítopo T auxiliar;
- -
- un segundo espaciador;
- -
- un epítopo CTL;
- -
- un tercer espaciador; y
- -
- un segundo epítopo CTL.
Los diversos epítopos auxiliares y de CTL pueden
estar presentes en distintos órdenes, en el encadenamiento de los
aminoácidos. Así, un epítopo auxiliar puede estar comprendido entre
dos epítopos de CTL, de los cuales estará separado mediante dos
espaciadores.
La parte lipídica del lipopéptido se obtiene
ventajosamente mediante adición de un motivo lipídico sobre una
función alfa aminada de un péptido, o sobre una función reactiva de
la cadena lateral de un aminoácido de la parte peptídica, tal como
una función épsilon-amina o tiol. Puede comprender
una o varias cadenas derivadas de ácidos grasos de C_{10} a
C_{20}, eventualmente ramificadas o insaturadas, o un derivado de
un esteroide.
De manera ventajosa, la parte lipídica comprende
al menos dos cadenas derivadas de ácidos grasos o de alcoholes
grasos de C_{10} a C_{20}, unidas también entre sí mediante uno
o varios aminoácidos. Así, la parte lipídica puede estar
constituida de dos cadenas de ácido palmítico unidas a los
agrupamientos NH_{2}, en alfa y épsilon, de una lisina.
La parte lipídica puede también estar constituida
de, o comprender, un resto de ácido palmítico, de ácido oleico, de
ácido linoleico, de ácido linolénico, de ácido
2-aminohexadecanoico, de pimelautida o de
trimexautida.
La parte no lipídica comprende entre 15 y 100,
preferentemente entre 15 y 50, aminoácidos. El número de aminoácidos
depende del número de epítopos que constituyen la parte no lipídica
del lipopéptido, y de sus tamaños.
De manera ventajosa, el epítopo T auxiliar es un
epítopo capaz de asociarse a varios receptores HLA de clase II
distintos, es decir, un epítopo multivalente. El epítopo auxiliar
está preferentemente constituido por el péptido
830-843 de la toxina tetánica, que presenta la
secuencia siguiente:
QYIKANSKFIGITE
La glutamina (Q) de esta secuencia puede estar
eventualmente acetilada.
Otros epítopos HTL multivalentes pueden ser el
epítopo multivalente de la hemaglutinina
(PREVOST-BLONDEL et al., 1995, J. Virol.,
vol. 62, nº 12, páginas 8046-8055), o también el
epítopo PADRE (ALEXANDER et al., 1994, Immunity, 1,
751).
En cuanto al epítopo CTL, puede ser cualquier
epítopo capaz de activar linfocitos T citotóxicos CD8^{+}.
Preferentemente, es un epítopo de CTL de una
proteína presentada por una célula tumoral y, particularmente, por
un melanoma, de una proteína del virus del VIH, del virus de la
hepatitis B (VHB) o del papilomavirus, o también de la proteína
p53.
En particular, puede ser uno de los epítopos
siguientes:
- epítopos de la proteína
BCR-ABL, que resulta de la translocación
BCR-Abelson (leucemia mieloide crónica), tales como
se mencionan en la tabla 1;
- epítopos de la proteína p53, tales como los
mencionados en la tabla 2.
Además, los epítopos de la proteína p53 pueden
estar recogidos en las secuencias 25-35,
63-73, 129-156,
149-156, 187-205,
187-234, 226-264 ó
249-264 de esta proteína.
- epítopos de las proteínas E_{6} o E_{7} del
papilomavirus humano (VPH), tales como los mencionados en la tabla
3,
- epítopos de proteínas del virus del
VIH-1, tales como los mencionados en la tabla 4,
- epítopos del melanoma o de otros tumores, tales
como los mencionados en las tablas 5, 6 y 7, y en particular
epítopos del antígeno melan-A/mart-1
del melanoma.
Otros epítopos de CTL plurivalentes que presentan
una capacidad de asociación con HLA de clase I pueden ser los
comprendidos en el péptido 43-57 de HPV
(GQAEPDRAHNIVTF) que contiene epítopos HLA A2, A24, B7 y B18.
Los epítopos de CTL pueden ser también los de
antígenos parasitarios, y en particular los de una proteína del
estado intra-hepatocítico de Plasmodium
falciparum.
La unión entre la parte lipídica y la parte no
lipídica se efectúa preferentemente por medio del agrupamiento
\varepsilon-NH_{2} del primer aminoácido de la
parte no lipídica. Sin embargo, se puede efectuar por cualquier
otro medio, y particularmente mediante el agrupamiento
\alpha-NH_{2} de una lisina.
Los lipopéptidos según la presente invención se
pueden administrar a los pacientes a tratar, en particular a las
personas a vacunar, diluidos en un disolvente adecuado, tal como,
por ejemplo, un tampón fisiológicamente aceptable. Sin embargo, se
pueden hacer en forma galénica, compatible con una administración
por vía parenteral, sublingual, intrapulmonar o transdérmica.
Se pueden administrar mediante cualquier modo de
administración que permita una acción eficaz. Este modo se elegirá
en función de la enfermedad a tratar. A título no limitativo, los
lipopéptidos se pueden administrar, particularmente, por inyección
o por vía sublingual.
Por lo tanto, otro objeto de la presente
invención es el uso de estos lipopéptidos para la fabricación de un
medicamento o de una vacuna, preventivo o curativo, para la
inducción de una respuesta inmunitaria específica y,
particularmente, para la inducción de una respuesta inmunitaria
contra los cánceres tales como el melanoma, los virus del VIH y del
VHB, los papilomavirus, la p53 o la malaria.
La presente invención tiene también por objeto
una composición farmacéutica caracterizada porque contiene una
cantidad farmacológicamente activa de uno o varios de los
lipopéptidos descritos aquí arriba, así como de los excipientes
farmacéuticamente compatibles.
Por último, se observará que los epítopos de CTL
descritos en la presente solicitud constituyen en sí objetos de la
presente invención.
La presente invención se ilustra, sin por lo
tanto estar limitada, mediante los siguientes ejemplos.
La figura 1 ilustra el reconocimiento de los
lipopéptidos monopalmitoílico y dipalmitoílico según la invención,
que comprenden el epítopo Mart 27-35, por medio de
una línea de linfocitos T citotóxicos específicos de dicho epítopo,
en un ensayo Elispot-interferon gamma
(IFN-\gamma).
Las figuras 2A y 2B ilustran el reconocimiento de
los lipopéptidos mencionados en la figura 1, por medio de dos
clones de linfocitos infiltrantes de melanomas, LT8 y LT12
respectivamente, específicos del epítopo Mart
27-35.
La figura 3 ilustra la inducción de una actividad
T auxiliar por el péptido TT 830-843 constitutivo
de los lipopéptidos según la invención.
- Figura 3a: Secreción de
interferón-\gamma por células de ganglios
linfáticos de ratones transgénicos HLA-A2 a los
cuales se les ha inyectado:
- (A)
- Tampón NaCl;
- (B)
- Lipopéptido Mp-MART;
- (C)
- Lipopéptido Dp-MART.
- Figura 3b: proliferación de las células de los
ganglios linfáticos de ratones transgénicos HLA-A2
en respuesta a los mismos antígenos.
\newpage
La figura 4 ilustra la inducción de la secreción
de interferón-\gamma por células de los ganglios
linfáticos de ratones transgénicos HLA-A2 en
respuesta a:
- (a)
- mezcla de los péptidos MART 27-35 y TT 830-845;
- (b)
- lipopéptido Mp-MART;
- (c)
- lipopéptido Dp-MART.
La figura 5 representa la fórmula de un
lipopéptido que comprende una unión hidrazona.
La figura 6 ilustra la antigenicidad de los
epítopos de VIH y de sus lipopéptidos correspondientes.
Se incubaron PBMC de pacientes seropositivos por
HIV con los péptidos seleccionados (barras llenas) o con los
lipopéptidos correspondientes (barras discontinuas). Se siguió la
activación de los CTL específicos utilizando el ensayo ELISPOT
específico del Interferón-\gamma. Se indican los
códigos asignados a cada paciente y su tipo de HLA. Los datos son
representativos de dos experimentos independientes.
La figura 7 ilustra la inmunogenicidad de los
epítopos restringidos al HLA-A2 y al
HLA-A3, y los lipopéptidos correspondientes.
- (a)
- Los péptidos o lipopéptidos indicados se inyectaron a ratones transgénicos HLA-A2. Antes de la inyección en la base de la cola, los péptidos se mezclaron con el epítopo T auxiliar TT 830-843, y se emulsionaron en un adyuvante incompleto de Freund; simultáneamente, los lipopéptidos se diluyeron en un tampón fisiológico. La producción de CTL específicos se determinó con la ayuda del ensayo ELISPOT específico de Interferón-\gamma, tras incubación de las células de los ganglios linfáticos con células diana de tipo Jurkat-A2 K^{B} preincubadas en presencia (barra discontinua) o en ausencia (barra llena) del epítopo de CTL indicado.
- (b)
- Los péptidos o los polipéptidos indicados se inyectaron en la base de la cola de ratones transgénicos HLA-A3. La producción de CTL específicos se determinó mediante el ensayo ELISPOT específico de Interferón-\gamma, tras incubación de las células de los ganglios linfáticos con células diana EBV que expresan HLA-A3 preincubadas en presencia (barra discontinua) o en ausencia (barra llena) del epítopo NEF 73-81 del VIH.
Los resultados presentados son representativos de
tres experimentos independientes.
La figura 8 ilustra la necesidad de un epítopo T
auxiliar de tipo TT-830-843 para la
inducción de CTL.
- (a)
- Lipopéptidos monopalmitoílicos, que comprenden el epítopo de CTL POL 476-484 de VIH, desprovistos (lipo POL 1) o no (lipo TT-POL 1) del epítopo T auxiliar TT 830-843, se diluyeron en un tampón fisiológico, y se inyectaron en la base de la cola de ratones transgénicos HLA-A2. Los resultados son representativos de dos experimentos independientes.
- (b)
- Células de los ganglios linfáticos de ratones inmunizados con el lipopéptido monopalmitoílico TT-POL 1, o el lipopéptido monopalmitoílico TT 830-843 emulsionado en un adyuvante incompleto de Freund, o inyectadas en el adyuvante incompleto de Freund solo, se cocultivaron durante 72 horas en presencia (barra discontinua) o en ausencia (barra llena) de 30 \mug/ml del epítopo T auxiliar TT 830-843.
La proliferación celular se siguió mediante la
medida de la incorporación de
^{3}H-timidina. Los resultados se expresan como la
media de la radioactividad (cpm) de los cultivos (3 pocillos por
punto) de al menos tres experimentos.
Se sintetizó la serie de los tres lipopéptidos
siguientes.
Lipopéptido nº
1
- Pam-K(Pam)-SS-QYIKANSKFIGITE-AAA-AAGIGILTV
Lipopéptido nº
2
- Pam-K(Pam)-SS-QYIKANSFKIGITE-RGR-AAGIGILTV
Lipopéptido nº
3
- Pam-K(Pam)-GR-QYIKANSKFIGITE-RGR-AAGIGILTV
Estos lipopéptidos comprenden un extremo
lipídico, constituido por dos restos palmitoílicos (Pam) unidos al
agrupamiento NH_{2} de una lisina, el epítopo auxiliar de la
toxina tetánica (peptido 830-843), y un epítopo CTL
reconocido en mart-1 por el receptor HLA A2.1. El
epítopo Hbc 18-27 descrito por VITIELLO et
al. (citado anteriormente) también es reconocido por HLA A2.1, y
presenta una hidrofobia similar al motivo elegido en la serie de
lipopéptidos citada anteriormente.
La diferencia reside en las secuencias de
aminoácidos comprendidas, por una parte, entre la parte lipídica y
el epítopo auxiliar, y, por otra parte, entre el epítopo auxiliar y
el epítopo de CTL. Esta serie se realizó para evaluar la
posibilidad de obtener, en forma purificada y caracterizable,
productos definidos por referencia al producto según
VITIELLO, y que comprenden, como éste, dos cadenas
palmitoílicas; los dos espaciadores de VITIELLO se
reproducen o se modifican para uno o los dos espaciadores según la
presente invención.
En el lipopéptido nº 1, estas secuencias son
idénticas a las del lipopéptido descrito por VITIELLO et al.
Se insertan dos serinas entre la parte lipídica y el epítopo
auxiliar. Se disponen tres alaninas entre el epítopo auxiliar y el
epítopo de CTL.
El lipopéptido nº 2 comprende las secuencias SS
(serilo-serilo) y
ARG-GLY-ARG.
El lipopéptido nº 3 se construye según la
presente invención, y comprende espaciadores hidrófilos que
presentan las secuencias GLY-ARG y
ARG-GLY-ARG, respectivamente.
La síntesis se realizó según procedimientos
"estándares" utilizados en fase sólida, según la estrategia
Boc-bencilo descrita por Merrifield (1963 J.
Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154; 1986 Science 232,
341-347). La introducción en posición
N-terminal de una
di-Boc-Lisina permite, tras
desproteger la resina peptidílica, la introducción simultánea de
las dos cadenas palmitoílicas, para obtener el derivado
esperado.
El lipopéptido nº 1 es prácticamente insoluble en
agua, o en una mezcla DMSO/agua 10% v/v. No es purificable, no es
caracterizable mediante HPLC según métodos resolutivos, debido a la
formación de agregados. La identidad de este lipopéptido se ha
podido confirmar por medida de la masa mediante espectrometría
PDMS-TOF, realizada sobre el producto bruto,
inmediatamente tras la ruptura terminal mediante ácido fluorhídrico
y antes de la liofilización. El producto se hace totalmente
insoluble en agua tras la liofilización.
La medida de la masa por espectrometría
PDMS-TOF del lipopéptido nº 2 es posible, y confirma
que se ha obtenido perfectamente el producto esperado. Sin embargo,
este producto adopta en agua un comportamiento parecido al
lipopéptido nº 1, y por lo tanto no se puede analizar
correctamente.
El lipopéptido nº 3 es soluble en ácido acético
al 80%. Se puede esterilizar mediante filtración sobre un
microfiltro de 0,22 \mum. Además, se puede disolver en una
disolución de DMSO/agua al 10% v/v. La medida de la masa por
espectrometría PDMS-TOF confirma la presencia del
producto esperado. El producto se puede purificar tras inyección de
una disolución concentrada de DMSO en columna Vydac C4, a 60ºC,
utilizando un gradiente de acetonitrilo, en presencia del
contra-ión de TFA. El producto se puede caracterizar
por HPLC según varios métodos resolutivos convencionales, sobre
columnas Vydac C4, Zorbax C3, Zorbax CN, Zorbax C1, a 60ºC, con la
ayuda de gradientes de acetonitrilo, en presencia de un
contra-ión de TFA, o utilizando un modificador
orgánico, tal como isopropanol o butanol en modo isocrático.
El trifluoroacetato del lipopéptido nº 3 es
soluble en DMSO (20-25 mg/ml), y sigue siendo
soluble tras la dilución con agua (DMSO 10%). El intercambio del
contra-ión trifluoroacetato por un
contra-ión acetato se puede realizar mediante
RP-HPLC sobre una columna C4; el producto disuelto
en DMSO al 80% se inyecta sobre la columna equilibrada mediante el
disolvente A (ácido acético al 5% en agua). Tras la eliminación de
los productos no retenidos (contra-iones de TFA,
sales), el producto se eluye con la ayuda de un gradiente del
disolvente A hasta el disolvente B (acetonitrilo 80% - ácido
acético 5% - agua 15%).
El acetato presenta una solubilidad comparable a
la del trifluoroacetato. Se ha utilizado para inmunizar ratones
transgénicos que expresan HLA-A2, y se sabe que es
capaz de inducir una respuesta CTL satisfactoria en ausencia de
adyuvante de inmunización.
Por lo tanto, estos resultados muestran que la
inserción de espaciador hidrófilo entre la parte lipídica y el
epítopo auxiliar por una parte, y, por otra parte, entre el epítopo
auxiliar y el epítopo de CTL, permite solubilizar el lipopéptido,
lo que no es el caso cuando las secuencias de aminoácidos son
distintas.
Se realizó una segunda serie de lipopéptidos para
evaluar la posibilidad de obtener, en forma purificada y
caracterizable, productos que comprenden esta vez una sola cadena
palmitoílica; el espaciador utilizado se introduce según la
presente invención (-RGR- por
arginil-glicil-arginil-), mientras
que el espaciador -SS-(seril-seril-) de VITIELLO se
mantiene o se sustituye por uno o los dos espaciadores según la
presente invención.
La introducción en posición
N-terminal de una
alfa-Fmoc-épsilon-Boc-Lisina
permite, tras la desprotección selectiva del grupo Boc, la
introducción de una sola cadena palmitoílica, para obtener el
producto siguiente:
Lipopéptido nº
4
- H-K(Pam)-SS-QYIKANSKFIGITE-RGR-AAGIGILTV
Este producto es difícilmente purificable. Es
soluble en medio acuoso sólo en presencia de DMSO. Se puede obtener
un perfil cromatográfico mediante RP-HPLC únicamente
sobre una columna de tipo C1 utilizando un sistema disolvente
"estándar" (acetonitrilo/agua/ácido trifluoroacético), según un
método poco resolutivo, que no permite garantizar la pureza real
del producto.
Se ha sintetizado el lipopéptido nº 5
siguiente.
Lipopéptido nº
5
- H-K(Pam)-GR-QYIKANSKFIGITE-RGR-AAGIGILTV
Este producto se obtuvo como el lipopéptido nº 4
mediante acilación selectiva de la función
épsilon-NH_{2} de la lisina
N-terminal.
Este lipopéptido nº 5 satisface el criterio de
purificación y de caracterización clásicos.
Esta comparación entre los lipopéptidos nº 4 y nº
5, que son lipopéptidos monopalmitoílicos, confirma los resultados
obtenidos sobre los lipopéptidos dipalmitoílicos.
Los lipopéptidos 3 y 5 han sido los únicos en
responder a los criterios definidos (acceso a un método de
purificación y a criterios analíticos resolutivos). Su estudio se
siguió mediante el estudio de su reconocimiento por diversos tipos
celulares. Los resultados de este estudio figuran en el ejemplo
3.
Se ensayaron el lipopéptido dipalmitoílico nº 3 y
el lipopéptido monopalmitoílico nº 5, sintetizados como se ha
indicado en los ejemplos 1 y 2, respectivamente.
La línea L28.3 de linfocitos T citotóxicos
específicos de MART 27-35 se obtuvo a partir de
células mononucleadas de la sangre periférica (PBMC) de donantes
sanos HLA-A2^{+}. El protocolo de
inducción de estas células efectoras a partir de PBMC de donantes
sin tratamiento previo ha sido descrito por Ostankovitch et
al. (Int. J. Cancer, 1997, 72, 987-994).
En este ensayo, las células diana son PBMC
autólogas no estimuladas (sin tratamiento previo).
Se incuban 50 \mul/pocillo de anticuerpo murino
anti-IFN\gamma humano, diluido en un tampón PBS
con una concentración de 4 \mug/ml, en placas de 96 pocillos con
un fondo de nitrocelulosa, durante la noche a 4ºC en habitación
húmeda.
Las PBMC se descongelan, se mantienen en reposo
durante 1 hora en un medio RPMI que contiene 10% de suero humano AB
(SAB) a 37ºC en una atmósfera que contiene 5% de CO_{2}. Después,
se incuban durante una noche con los péptidos a ensayar, con
concentraciones distintas (10, 5 y 1 \mug/ml).
Los pocillos se lavan con PBS, y después se
saturan con medio RPMI que contiene 10% de SAB, durante 2 horas a
37ºC.
Después, las células efectoras se reparten en las
placas de 96 pocillos anteriormente incubadas con el
anti-IFN\gamma a razón de 20.000 células por
pocillo en 200 \mul final, y en presencia de las PBMC autólogas
estimuladas con una relación efectora : diana (E:T) de 1:1. Como
testigos positivos se utilizan la fitohemaglutinina (PHA), con una
concentración de 4 \mug/ml, y el forbol
12-miristato 13-acetato
(PMA)-ionomicina (150 y 500 ng/ml,
respectivamente).
Tras 20 horas de incubación a 37ºC, en una
atmósfera que contiene 5% de CO_{2}, los pocillos se lavan 5
veces con PBS, y después 1 vez con agua destilada, y después se
incuban toda la noche a 4ºC con 100 \mul/pocillo de anticuerpo de
conejo anti-IFN\gamma humano diluido al 1/250 en
RPMI que contiene 10% de SAB. Después, los pocillos se lavan 5
veces con PBS que contiene 0,05% de Tween 20, y después se incuban
durante 2 horas a 37ºC con 100 \mul de anticuerpos de cabra
anti-inmunoglobulina de conejo biotinilados diluidos
al 1/500 en PBS que contiene 0,05% de Tween 20 y 1% de BSA
(seroalbúmina bovina).
Nuevamente, los pocillos se lavan cinco veces con
PBS-Tween, y después se incuban durante 1 hora a
37ºC con 100 \mul de extravidina-fosfatasa
alcalina diluida al 1/600 en
PBS-Tween-1% de BSA.
Tras cuatro lavados en PBS-Tween,
los pocillos se incuban con 100 \mul de sustrato de revelación
(kit de sustrato de conjugado de fosfatasa alcalina, ref.
170-6432, Biorad). A continuación, los pocillos se
lavan con agua destilada, y se secan antes de la lectura de los
resultados en el estereomicroscopio.
La figura 1 ilustra los resultados obtenidos.
Los dos lipopéptidos de MART
27-35 estimulan de manera específica la secreción de
IFN\gamma mediante la línea de los CTL anti-MART
27-35. Por lo tanto, se presentan mediante las PBMC
y se reconocen mediante los CTL de una manera comparable al péptido
nominal MART 27-35.
LT8 y LT12 son dos clones
HLA-A2^{+} obtenidos mediante la
re-estimulación de linfocitos infiltrantes de
melanoma (TILs), que reconocen específicamente el péptido MART
27-35.
Las células diana utilizadas en este ensayo son
células humanas HLA-A2^{+} de tipo T2. Estas
células están desprovistas de transportadores de péptido, y por lo
tanto presentan sólo los péptidos exógenos sobre sus moléculas de
clase I libres.
En este ensayo, las células diana se incuban
durante una noche con el péptido a ensayar, a razón de 4
\mug/10^{6} células, en una atmósfera que contiene 5% de
CO_{2}, a 37ºC. Después, se incuban durante una hora a 37ºC con
100 \muCi de cromato de sodio (^{51}Cr). A continuación, las
células diana se lavan dos veces en un suero fisiológico que
contiene 5% de suero de ternera fetal (SVF), se recogen en medio
RPMI 5% SVF y se reparten en placas de 96 pocillos, a razón de 3000
ó 5000 células por pocillo en 100 \mul.
Después, las células efectoras (LT8 y LT12) se
añaden en 100 \mul del mismo medio, con una relación
efectora:diana de 10:1.
Se ha medido la liberación de cromo, obtenido
durante la incubación de 4 horas a 37ºC, sobre un contador gamma. El
porcentaje de lisis se determina mediante la fórmula siguiente (L =
liberación):
% de lisis =
(L. experimental - L. espontánea/L. total - L. espontánea) x
100
Las figuras 2A y 2B ilustran los resultados
obtenidos.
Los dos lipopéptidos de MART
27-35, mono- y dipalmítico, son reconocidos
mediante células efectoras humanas, que provienen de melanomas y que
son específicas del péptido MART 27-35. Estos dos
tipos de lipopéptidos se reconocen de manera similar, y a un nivel
al menos comparable al péptido original (MART
27-35), teniendo en cuenta que las células diana han
sido expuestas a la misma concentración final de péptidos, mientras
que la masa en peso de los lipopéptidos es aproximadamente 5 veces
más elevada que la del péptido MART 27-35.
Se inmunizaron ratones transgénicos A2/Kb (3 a 4
por grupo) en IFA, por vía subcutánea en la base de la cola y en las
almohadillas plantares, con (A) suero fisiológico, o (B) 200 \mug
de Mp-MART, o (C) 200 \mug de
Dp-MART. Los ratones se sacrificaron 11 días más
tarde.
Se realizó un ensayo de proliferación de las
células de los ganglios de drenaje mediante cultivo durante tres
días en presencia de péptido TT 830-843 (10
\mug/ml), y después 18 horas de incorporación de timidina
tritiada.
El sobrenadante se recolectó tras 36 horas de
cultivo para la medición de IFN-\gamma mediante
el método ELISA.
A fin de definir la capacidad de inducción de una
respuesta T auxiliar aportada por las construcciones de
lipopéptidos según la invención, se ha estudiado la secreción de
Interferón-\gamma así como la proliferación de
linfocitos en respuesta al epítopo T auxiliar TT
830-843 en ratones inmunizados con
Mp-MART o Dp-MART en presencia de
adyuvante incompleto de Freund.
Los resultados se muestran en la figura 3.
Los resultados indican que la construcción
Mp-MART y la construcción Dp-MART
(B, C) inducen ambas una fuerte secreción de
interferón-\gamma mediante las células de los
ganglios linfáticos de los ratones transgénicos de tipo
A2/K^{b}.
Igualmente, los lipopéptidos
Mp-MART y Dp-MART (B, C) provocan
una proliferación linfocítica importante en respuesta al péptido TT
830-843.
Estos resultados demuestran que el epítopo T
auxiliar TT 830-843 es capaz de inducir una
respuesta T auxiliar en los ratones transgénicos A2/K^{b}. Además,
estos resultados muestran igualmente que la unión covalente del
epítopo TT 830- 843, en el seno de la construcción lipopeptídica, no
reduce su capacidad para ser presentada a las células T.
Los ratones transgénicos A2/Kb (3 a 4 por grupo)
se inmunizaron sin adyuvante, por vía subcutánea en la base de la
cola y en las almohadillas plantares, con (A) una mezcla de péptido
MART 27-35 (50 \mug) y de TT
830-843 (140 \mug), o bien con (B) 200 \mug de
Mp-MART (para asegurar la equimolaridad del péptido
MART 27-35 con relación a (A), o bien con (C) 200
\mug de Dp-MART. Los ratones se sacrificaron 11
días más tarde.
El número de células T CD8^{+} específicas de
MART 27-35 se determinó mediante un ensayo ELISPOT
IFN-\gamma, durante el cual las células se
expusieron a células presentadoras de tipo Jurkat A2/Kb, ya sea no
cargadas (como control negativo), o cargadas con el péptido MART
27-35 (30 \mug/ml). Los resultados se expresan en
número de células que segregan IFN-\gamma por
millón de células ensayadas.
A fin de optimizar el uso de las construcciones
colineales de lipopéptidos que comprenden el epítopo T citotóxico
MART 27-35 para la vacunación humana, se ensayó la
capacidad de estas construcciones lipopeptídicas para inducir una
inmunización en ausencia de adyuvante exógeno.
Los resultados se presentan en la figura 4.
Más particularmente, se ensayó la inmunogenicidad
de las dos construcciones colineales lipopeptídicas que comprenden
una o dos cadenas palmitoílicas, respectivamente. Los ratones han
recibido una sola inyección en ausencia de adyuvante, con cada
lipopéptido, o también con la mezcla de epítopo MART
27-35 y TT 830-843 utilizado como
control; después, se midió la secreción de
interferón-\gamma mediante los esplenocitos tras
una re-estimulación in vitro con el péptido
MART 27-35.
Los resultados de la figura 4 indican que las
construcciones colineales Mp-MART y
Dp-MART son ambas capaces de inducir in vivo
una respuesta celular citotóxica CD8^{+} específica del epítopo T
citotóxico MART 27-35, en ausencia de cualquier
adyuvante exógeno.
Se obtuvieron resultados similares con las
células de los ganglios linfáticos.
Estos resultados demuestran que el efecto
adyuvante de las construcciones lipopeptídicas colineales según la
invención es suficiente para inducir una inmunización específica
contra el epítopo T citotóxico, en ausencia de cualquier otro
compuesto adyuvante.
El hidrazinopéptido y el péptido aldehídico
presentan las fórmulas siguientes:
hidrazinopéptido:
K(NH_{2})ILKEPVHGV-OH / epítopo
MHCI-POL VIH-1
péptido aldehídico:
CHOCO-RTPPAYRPPNAPILK(Pam)-NH_{2}/epítopo
MHCII-HBVc
El péptido aldehídico comprende el epítopo
128-140 de la proteína de la envoltura vírica del
virus de la hepatitis B (HBVc), tal como se ha descrito por MILICH
et al. (1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85,
1610-1614).
Se disuelven 16 mg (12 \mumoles) de
hidrazinopéptido y 15 mg (7 \mumoles) de péptido aldehídico en 4
ml de tampón citrato/fosfato 0,01 M, pH 5,4, y 1 ml de DMSO. El pH
se ajusta a 5,4 con Na_{2}HPO_{4} 0,2M.
Tras 24 h, el medio se diluye con 5 ml de ácido
acético, y se purifica sobre una columna C18 (15 x 500 mm). Eluyente
A: TFA 0,05% en H_{2}O; Eluyente B: TFA 0,05% en
CH_{3}CN/H_{2}O (80/20). Gradiente 0-40% de B en
10 min., después 40-100% de B en 60 min. Las
fracciones puras se recolectan y se liofilizan. Se obtienen 4,9 mg
de producto puro (rendimiento 22%).
La fórmula del producto final se representa en la
figura 5.
Se sintetizaron lipopéptidos sobre una resina
MBHA (Applied Biosystems, Foster City, USA) utilizando la
estrategia clásica de BOC-bencilo (Merrifield, RB,
1986, Science: Volumen 232, páginas 341-343;
Merrifield RB, 1963, J. Am. Chem. Soc., Vol. 85:
2149-2154) y hexafluorofosfato de
2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio
0,33 M (HBTU) en
N-metil-pirrolidinona (NMP), con una
neutralización in situ mediante diisopropiletilamina (DIPEA)
(Schnolzer et al., 1992, Int. J. Pept. Protein Res., Vol.
40, páginas 180-193), en un sintetizador automático
de péptidos de tipo Applied Biosystem 430A (Foster City, USA). Se
efectuó sistemáticamente un doble acoplamiento, utilizando cuatro
equivalentes de aminoácidos protegidos, seguido de una etapa de
acetilación sistemática utilizando anhídrido acético.
Para la síntesis de los péptidos dipalmitoílicos,
se incorporó en el extremo N-terminal
un grupo Boc-Lys(Boc)-OH
(Senn Chemicals AG, Dielsdorf, CH); simultáneamente, los grupos Boc
se eliminaron mediante tratamiento clásico con TFA. Para la
síntesis de los péptidos monopalmitoílicos, se incorporó en el
extremo N-terminal un grupo
Boc-Lys(Fmoc)-OH (Senn
Chemicals AG, Dielsdorf, CH), lo que ofrecía la posibilidad de una
eliminación selectiva del grupo Fmoc mediante piperidina al 20% en
NMP. En cualquier caso, se realizó una palmitoilación sobre resina
utilizando una activación mediante HBTU en presencia de DIEA, como
antes, sobre el péptido (por otra parte, totalmente protegido).
Después, los lipopéptidos se desprotegieron y se separaron de la
resina mediante un tratamiento con fluoruro de hidrógeno (Tam, J.P.
1995, Int. J. Pept. Protein Res., Volumen 26, páginas
262-273) en un aparato Teflon-Kel F
(Asti, Courbevoie, Francia); se utilizó un protocolo "High HF"
para los lipopéptidos TT-POL1 y
TT-GAG, y se utilizó un protocolo de tipo
"Low-High HF" para los lipopéptidos
TT-POL2 y TT-NEF. Los lipopéptidos
se purificaron parcialmente durante una etapa de precipitación
mediante éter dietílico frío en 5 ml de una disolución de ácido
trifluoroacético, y después se liofilizaron. Las purificaciones se
realizaron mediante varios ciclos paralelos de
RP-HPLC; para cada ciclo, se disolvieron 50 a 100
mg de lipopéptido bruto en 2 ml de DMSO, y después se diluyeron en 1
ml de agua antes de la inyección sobre:
- para los monopalmitoilpéptidos, una columna de
dimensión 12,5 mm x 250 mm cargada con una fase estacionaria de tipo
C18 (0,03, 5 \mum) Hyperprep Hypersil, eluida con 5 ml/min.;
- para los dipalmitoilpéptidos, una columna de
12,5 mm x 250 mm cargada con C3 (0,03, 5 \mum) Zorbax, y eluida
con 4 ml/min.
Los compuestos se eluyeron con un sistema
disolvente de acetonitrilo/H2O/0,05% de TFA, a 60ºC. La homogeneidad
se confirmó con la ayuda de una RP-HPLC sobre dos
columnas analíticas distintas (una columna Vydac C18 de 4,6 x 250, y
una columna C3 Zorbax de 4,6 x 150 mm); los lipopéptidos tenían una
pureza mayor del 90%. La caracterización de los péptidos se
verificó determinando la composición de aminoácidos tras la
hidrólisis total y la determinación de la masa molecular mediante
TOF-PDMS (espectrómetro de masas con desorción
mediante plasma, Bio-Ion 20, Uppsala, Suecia). Las
masas moleculares medidas han sido las siguientes: para derivados
monopalmitoílicos TT-GAG: [M+H]^{+} calc.,
3534, obt. 3523; TT-NEF: [M+H]^{+} calc.
4317, obt. 4318, TT-POL1: [M+H]^{+} calc.
3534, obt. 3535; TT-POL2: [M+H]^{+} calc.
4142, obt. 4143. Para los derivados dipalmitoílicos:
TT-GAG: [M+H]^{+} cal. 3763, obt. 3762;
TT-NEF: [M+H]^{+} calc. 4556, obt. 4553;
TT-POL1: [M+H]^{+} calc. 3773, obt. nd;
TT-POL2: [M+H]^{+} calc. 4380, obt. 4378.
Todos los compuestos se obtuvieron en forma de polvo liofilizado.
Los derivados monopalmitoílicos son solubles en agua. Los derivados
dipalmitoílicos son solubles en una mezcla
agua-DMSO. Los rendimientos de la purificación
fueron:
- para los derivados monopalmitoílicos:
TT-GAG: 16%, TT-NEF: 28%;
TT-POL1: 33%; TT-POL2: 12%;
- para los derivados dipalmitoílicos:
TT-GAG: 16%; TT-NEF: 39%;
TT-POL1: 22%; TT-POL2: 4,5%.
Las secuencias de aminoácidos de los péptidos y
lipopéptidos se representan en la tabla 8.
Se utilizaron ratones transgénicos
HLA-A2 que expresan los dominios \alpha1 y
\alpha2 de la molécula HLA-A2 (Vitiello et
al., 1991, J. Exp. Med., Vol. 173, páginas
1007-1015). El dominio \alpha3 de la cadena pesada
corresponde al dominio murino H-2 K^{b}. Esta
característica permite a la molécula de CD8^{+}, expresada por
las células T murinas CD8^{+}, interaccionar con el dominio
\alpha3 singénico de la molécula MHC de clase I híbrida.
Igualmente, se utilizaron ratones transgénicos
HLA-A3.
Todos los péptidos y lipopéptidos se disolvieron
en una disolución salina en presencia de 10% de DMSO. La inducción
de células T citotóxicas en los ratones transgénicos HLA se realizó
como se describe por SETTE et al., (1994) (J. Immunol., Vol.
153, páginas 5586-5592).
En resumen, se mezclaron epítopos de CTL (50
\mumg/ratón) con el epítopo T-auxiliar TT
830-843 (140 \mum/ratón), se emulsionaron en
adyuvante incompleto de Freund (IFA), y se inyectaron en la base de
la cola. Los lipopéptidos se inyectaron solos (150 \mum/ratón),
diluidos en una disolución salina sin adyuvante incompleto de
Freund (IFA). Once días tras la inyección, los ratones se
sacrificaron, y los esplenocitos, así como las células de los
ganglios linfáticos (LNC), se incubaron a razón de 3 x 10^{6}/ml
en un medio completo en presencia de linfoblastos singénicos,
estimulados mediante LPS, irradiados y recubiertos de los péptidos,
utilizados como células estimuladoras. El medio completo comprende
un medio RPMI 1640 (Gibco/BRL, Gaithersburg, MD), 10% de SVF, 2 mM
de glutamina, antibióticos y \beta2-mercaptoetanol
(5 x 10^{-5}M). Después de seis días, los esplenocitos y las
células de los ganglios linfáticos se ensayaron para determinar la
secreción de interferón-\gamma según la técnica
ELISPOT, descrita en el ejemplo 3 para las células de ratones, y la
técnica ELISPOT, más abajo, para las PBMC humanas.
Se seleccionaron donantes seropositivos por VIH
para su expresión en moléculas HLA de clase I según datos bien
conocidos por el experto en la técnica en materia de restricción
frente a péptidos y lipopéptidos.
Se incubaron microplacas de nitrocelulosa
(Millipore, Bedford, MA) durante la noche a 4ºC con 1 \mug/ml de
un anticuerpo de captura
anti-Interferón-\gamma humano,
diluido en un tampón carbonato/bicarbonato con pH 9,6 (100
\mul/pocillo). Después de cinco lavados, las placas se saturaron
durante 2 horas a 37ºC con 200 \mul, y después se lavaron. Para
los cultivos de células humanas, el medio completo estaba compuesto
de RPMI 1640, 10% de seroalbúmina bovina, 2 mM de glutamina,
antibióticos y \beta2-mercaptoetanol (5 x
10^{-5}M). Para el ensayo con el péptido, se añadieron PBMC de
pacientes directamente en las microplacas de nitrocelulosa (2 x
10^{5} células/pocillo), y se incubaron durante 24 horas a 37ºC en
presencia de 10 mg/ml del péptido. Para el ensayo de los
lipopéptidos, las PBMC se incubaron durante la noche a 37ºC con los
lipopéptidos, y después se lavaron y se irradiaron (3000 rads).
Estas células se utilizaron como células estimuladoras en un
cocultivo (2 x 10^{5} células por pocillo) con PBMC singénicas
(relación 1/1), en placas de nitrocelulosa durante 24 horas a 37ºC.
Después de 24 horas, las placas que contenían el cultivo directo
(péptido) o el cocultivo (lipopéptido) se lavaron y se incubaron
durante 2 horas a temperatura del laboratorio en presencia de 100
\mul de un anticuerpo monoclonal
anti-interferón-\gamma de ratón
biotinilado diluido al 1 \mug/ml en un tampón de
PBS-Tween (0,05%) y de seroalbúmina bovina (1%).
Después de 5 lavados en PBS-Tween al 0,05%, las
placas se incubaron durante 1 hora a temperatura del laboratorio en
presencia de extravidina marcada con fosfatasa alcalina (Sigma,
Alemania), diluidas al 1/5000 en un tampón de
PBS-Tween (0,05%) y de suero de ternera fetal (1% de
SVF). Las manchas ("spots") se revelaron añadiendo un sustrato
conjugado cromógeno de la fosfatasa alcalina (Biorad, Hercules, CA),
según las instrucciones del fabricante, y las células que forman
manchas positivas para el Interferón-\gamma se
contaron con la ayuda de una lupa
binocular.
binocular.
Las células de los ganglios linfáticos y los
esplenocitos extraídos se cultivaron en microplacas de 96 pocillos,
a razón de 5x10^{5} células por pocillo, en un volumen final de
200 \mul de medio completo. Las células se estimularon, o no, con
20 \mug/ml de un epítopo de CD4 restringido a las moléculas del
MHC de clase II, el epítopo TT 830-843. Tras 72
horas de cultivo a 37ºC, las células se incubaron durante la noche
con 0,25 \muCi de [^{3}H] timidina (Amersham, Life
Technologie). Las células se recuperaron, y se analizó la
incorporación de [^{3}H] timidina en un aparato
"Microbetaplate" (Wallac, Turku, Finlandia).
Células Jurkat-A2 (J A2/K^{b}),
una línea de células T leucémicas humanas transfectadas con un
plásmido que codifica la molécula híbrida
HLA-A2/H2K^{b} (Irvin et al. 1989.
Los linfoblastos utilizados para estimular las
células efectoras in vitro se prepararon de la manera
siguiente: se cultivaron esplenocitos de ratones transgénicos
HLA-A2 con 25 \mug/ml de LPS (E. coli) y 7
\mug/ml de sulfato de dextrano (Sigma). Después de 72 horas a
37ºC, las células se lavaron y se incubaron con el epítopo de CD8
durante 2 horas a 37ºC. Después, las células se irradiaron (3000
rad), se lavaron tres veces y se cocultivaron con las células
efectoras.
Los anticuerpos monoclonales de captura y de
detección anti-Interferón-\gamma
de ratón (clones R4-6A2 y XMG1.2, respectivamente)
se comercializan por Pharmingen (San Diego, CA). Los anticuerpos
monoclonales de captura y de detección
anti-Interferón-\gamma humano
(clon 1-D1K y
7-B6-1-biotina,
respectivamente) se comercializan por Mabtech (Estocolmo,
Suecia).
Se ensayó la capacidad de los péptidos
seleccionados, que comprenden los epítopos de interés, para
estimular eficazmente los linfocitos T citotóxicos específicos de
donantes seropositivos por VIH. La activación de los CTL,
específicos de epítopos, se siguió midiendo la secreción de
Interferón-\gamma tras la incubación de las PBMC
de pacientes con los péptidos, con la ayuda del ensayo ELISPOT.
Cuando se estableció que los péptidos estimulaban eficazmente los
CTL específicos, se estudió la capacidad de activación de estos
CTL, específicos de epítopos, con los lipopéptidos correspondientes
preincubados con las PBMC singénicas.
Los resultados presentados en la figura 6a
muestran que los CTL del paciente Z77 (de tipo
HLA-2; positivo por VIH) reconocen los péptidos POL
476-484 y GAG 77-85. Igualmente,
los lipopéptidos TT-POL1 y TT-GAG
han estimulado fuertemente estos CTL específicos. No se observó
ninguna diferencia significativa de antigenicidad entre las
construcciones monopalmitoílicas y dipalmitoílicas para estos dos
lipopéptidos. Por otra parte, no hay ninguna activación de los CTL
específicos de POL 346-354 en las PBMC del paciente
Z77, ya sea con el péptido POL 346-354 o con los
lipopéptidos correspondientes TT-POL2 (construcción
monopalmitoílica y dipalmitoílica). Sin embargo, como se indica en
la figura 6a, los CTL del paciente HLA-A2 Z108
reconocen débilmente el epítopo 346-354, y más
fuertemente los lipopéptidos TT-POL2.
Los resultados de la figura 6b demuestran que el
péptido NEF 73-82, un epítopo que se fija a la vez
sobre las moléculas HLA-A11 y
HLA-A3, y que forma complejos estables con estas
moléculas, induce igualmente una fuerte respuesta CTL específica en
las PBMC de los pacientes HLA-A11 y
HLA-A3 (respectivamente, Z129 y P48). Además, el
lipopéptido monopalmitoílico TT-NEF ha inducido
igualmente una fuerte respuesta CTL de estas
PBMC.
PBMC.
Por último, los resultados de la figura 6c
muestran que todos los péptidos seleccionados por su capacidad de
fijación sobre moléculas purificadas de HLA-B35,
así como por su capacidad para formar complejos estables HLA/péptido
(véase figura 6c), eran muy antigénicos en el paciente
HLA-B35 (P3). Los polipéptidos monopalmitoílicos y
dipalmitoílicos TT-NEF, que comprenden los péptidos
NEF 74-81, NEF 71-79 y NEF
68-76, eran igualmente antigénicos en el paciente
P3.
Sin embargo, los lipopéptidos
TT-POL1 (monopalitoílico y dipalmitoílico), aunque
contienen el epítopo POL 342-350 bien reconocido, no
eran antigénicos en los pacientes HLA-B35.
Los resultados de la figura 6c indican igualmente
que el péptido NEF 68-76, un epítopo potencial de
HLA-B7, ha inducido eficazmente una respuesta CTL
específica en las PBMC del paciente HLA-B7 Z118.
Además, los lipopéptidos TT-NEF eran también
antigénicos en los pacientes HLA-B7.
Es importante subrayar que los resultados de las
figuras 6b y 6c muestran que un lipopéptido multiepitópico puede ser
eficazmente reconocido por individuos que expresan diferentes
moléculas HLA de clase I.
El conjunto de estos resultados demuestra
claramente que los lipopéptidos se pueden transformar eficazmente
mediante las PBMC, y pueden activar los CTL específicos de
epítopos.
\newpage
El objetivo de este estudio era determinar si los
lipopéptidos podían inducir la producción de CTL específico en
organismos sin tratamiento previo, que nunca han sido
sensibilizados con un epítopo de VIH, y que no poseen ninguna célula
preexistente de CTL específico de epítopos.
Los lipopéptidos y péptidos que comprenden los
epítopos de interés se inyectaron a ratones transgénicos que
expresan las moléculas HLA-A2 o
HLA-A3. Los péptidos portadores de epítopos T
citotóxicos se coinyectaron con el epítopo T auxiliar TT
830-843, y se emulsionaron en el adyuvante
incompleto de Freund.
Los lipopéptidos se diluyeron en una disolución
salina, y se inyectaron sin adyuvante incompleto de Freund. La
producción de células de CTL, específicos de epítopos, en estos
ratones, se siguió como se indica en la parte "Materiales y
métodos".
Los resultados de la figura 7a muestran que los
tres epítopos restringidos al HLA-A2, GAG
77-85, POL 476-484 y POL
346-354, respectivamente, inducían en los ratones
transgénicos HLA-A2 una débil respuesta CTL
específica, pero que los lipopéptidos monopalmitoílicos
correspondientes era capaces de inducir una respuesta CTL más
fuerte. En cualquier caso, los lipopéptidos dipalmitoílicos han
inducido una respuesta CTL más débil que los lipopéptidos
monopalmitoílicos.
Los resultados de la figura 7b indican que el
epítopo NEF-73-82 induce en los
ratones transgénicos HLA-A3 una fuerte respuesta CTL
específica. Además, los lipopéptidos monopalmitoílicos
TT-NEF eran capaces de inducir una respuesta CTL
tan fuerte como el epítopo NEF 73-82.
A fin de determinar la importancia del efecto T
auxiliar en la producción de células de CTL mediante los
lipopéptidos según la invención, se construyeron lipopéptidos
monopalmitoílicos que comprenden un epítopo de VIH, pero
desprovistos del epítopo TT 831-843.
Los resultados de la figura 8a muestran que el
lipopéptido POL1 desprovisto de epítopo T auxiliar no induce ninguna
respuesta CTL específica, mientras que el lipopéptido
TT-POL1 era capaz de inducir una respuesta CTL
específica mucho más fuerte. Este resultado indica que el péptido T
auxiliar es necesario a fin de inducir una fuerte respuesta CTL
cuando los lipopéptidos se inyectan en la base de la cola de
ratones transgénicos HLA-A2. Se realizaron
experimentos de proliferación linfocítica a fin de determinar si el
epítopo T auxiliar TT 831-843, incluido en los
lipopéptidos, era capaz de inducir eficazmente una respuesta T
auxiliar.
Los resultados presentados en la figura 8b
demuestran que las células de los ganglios linfáticos de ratones
inmunizados con el lipopéptido monopalmitoílico
TT-POL1 proliferaban, en respuesta a los péptidos TT
830-843, tan fuertemente como las células de los
ganglios linfáticos de ratones inmunizados con el epítopo T
auxiliar TT 830-843, emulsionadas en el adyuvante
incompleto de Freund.
Estos resultados demuestran que es necesaria una
respuesta de tipo T auxiliar a fin de obtener una fuerte respuesta
CTL específica, y que la respuesta T auxiliar es inducida mediante
el epítopo T auxiliar contenido en las construcciones colineales
lipopeptídicas.
TABLA 1
(continuación)
\newpage
TABLA 1
(continuación)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
TABLA 4
(continuación)
\newpage
TABLA 4
(continuación)
\newpage
TABLA 4
(continuación)
\newpage
TABLA 4
(continuación)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\bulletCULMANN-PENCIOLELLI, B., S.
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T-lymphocyte clones reactive with human
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p9514-8.
Claims (21)
1. Lipopéptido que comprende al menos un epítopo
T auxiliar, al menos un epítopo de CTL y al menos un resto lipídico,
caracterizado porque los epítopos y la parte lipídica, por
una parte, y los epítopos por otra parte, se separan
independientemente mediante secuencias de aminoácidos, denominadas
espaciadores, comprendiendo al menos uno de los espaciadores unos
encadenamientos de 1 a 10 aminoácidos seleccionados de entre los
aminoácidos de glicina, arginina, ácido glutámico y ácido
aspártico.
2. Lipopéptido según la reivindicación 1,
caracterizado porque al menos uno de los espaciadores
comprende entre 1 y 10 glicinas y/o argininas.
3. Lipopéptido según una de las reivindicaciones
1 a 2, caracterizado porque al menos uno de los espaciadores
presenta una de las siguientes secuencias:
GLY ARG o ARG GLY
ARG.
4. Lipopéptido según una de las reivindicaciones
1 a 3, caracterizado porque al menos uno de los espaciadores
comprende uno o varios ácidos glutámico y/o aspártico.
5. Lipopéptido según una de las reivindicaciones
1 a 3, caracterizado porque los espaciadores integran una
cisteína o una cadena alquilo funcionalizada mediante un grupo tiol
y mediante uniones no peptídicas.
6. Lipopéptido según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque los espaciadores
comprenden un grupo seleccionado de entre un grupo tiazolidina,
oxima o hidrazona.
7. Lipopéptido según una de las reivindicaciones
1 a 6, caracterizado porque comprende el encadenamiento:
- -
- de una parte lipídica,
- -
- de un primer espaciador,
- -
- de un epítopo T auxiliar,
- -
- de un segundo espaciador, y
- -
- de un epítopo de CTL.
8. Lipopéptido según una de las reivindicaciones
1 a 6, caracterizado porque comprende el encadenamiento:
- -
- de una parte lipídica,
- -
- de un primer espaciador,
- -
- de un epítopo T auxiliar,
- -
- de un segundo espaciador,
- -
- de un primer epítopo de CTL,
- -
- de un tercer espaciador, y
- -
- de un segundo epítopo de CTL.
9. Lipopéptido según una de las reivindicaciones
1 a 8, caracterizado porque la parte lipídica comprende una
o varias cadenas derivadas de ácidos grasos o de alcoholes grasos
de C_{10} a C_{20}, lineales o ramificadas, saturadas o
insaturadas, o un derivado esteroideo.
10. Lipopéptido según una de las reivindicaciones
1 a 9, caracterizado porque la parte lipídica comprende al
menos dos cadenas derivadas de ácidos grasos o de alcoholes grasos
de C_{10} a C_{20}, unidas entre ellas mediante uno o varios
aminoácidos.
11. Lipopéptido según una de las reivindicaciones
1 a 10, caracterizado porque la parte lipídica está
constituida de dos cadenas de ácido palmítico unidas a los grupos
NH_{2} de una lisina.
12. Lipopéptido según una de las reivindicaciones
1 a 10, caracterizado porque la parte lipídica comprende una
o varias cadenas seleccionadas de entre el ácido palmítico, el
ácido oleico, el ácido linoléico, el ácido linolénico, el ácido
2-aminohexadecanoico, la pilmelautida o la
trimexautida.
13. Lipopéptido según una de las reivindicaciones
1 a 12, caracterizado porque la parte no lipídica comprende
entre 15 y 100 aminoácidos.
14. Lipopéptido según una de las reivindicaciones
1 a 13, caracterizado porque el epítopo T auxiliar es un
epítopo multivalente.
15. Lipopéptido según una de las reivindicaciones
1 a 14, caracterizado porque el epítopo T auxiliar es el
péptido 830-843 de la toxina tetánica que presenta
la siguiente secuencia:
QYIKANSKFIGITE
16. Lipopéptido según una de las reivindicaciones
1 a 14, caracterizado porque el epítopo T auxiliar es el
epítopo de la hemaglutinina del virus de la influenza, o el epítopo
PADRE.
17. Lipopéptido según una de las reivindicaciones
1 a 16, caracterizado porque contiene al menos un epítopo de
CTL de una proteína específica del melanoma, de una proteína del
VIH, del VHB, del papilomavirus, de la proteína
p-53, o de una proteína del estado
intra-hepatocítico de Plasmodium
falciparum.
18. Uso de un lipopéptido según una de las
reivindicaciones 1 a 17, para la fabricación de un medicamento o de
una vacuna para la inducción de una respuesta inmunitaria
específica.
19. Uso de un lipopéptido según una de las
reivindicaciones 1 a 17, para la fabricación de un medicamento para
la inducción de una respuesta inmunitaria contra el VIH, el VHB, el
papilomavirus, la p-53 del melanoma, o de la
malaria.
20. Composición farmacéutica,
caracterizada porque contiene una dosis farmacológicamente
eficaz de uno o varios lipopéptidos según una de las
reivindicaciones 1 a 17, y unos excipientes farmacéuticamente
compatibles.
21. Medicamento o vacuna, caracterizado
porque contiene uno o varios lipopéptidos según una de las
reivindicaciones 1 a 17.
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