ES2242664T3 - Agregacion y aglutinacion inducidas de plaquetas. - Google Patents
Agregacion y aglutinacion inducidas de plaquetas.Info
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Abstract
Procedimiento para la medición de la agregación de plaquetas de la sangre, en el que se emplean métodos turbidimétricos, nefelométricos o electromagnéticos para la medición de la formación de agregados y en una primera fase de reacción se procede al batido de una mezcla reactiva, y en una segunda fase de reacción que sigue a la primera no se bate dicha mezcla, teniendo lugar la medición de modo preferente en la segunda fase de reacción.
Description
Agregación y aglutinación inducidas de
plaquetas.
El objeto de la invención es un procedimiento
para medir la agregación o aglutinación de plaquetas, en el que en
una primera fase de reacción se agita bien la mezcla reactiva y en
la segunda fase de reacción que sigue a la primera se agita con
menor intensidad o no se agita nada en absoluto y la medición tiene
lugar de modo preferente en la segunda fase de reacción.
La sangre está compuesta sustancialmente del
plasma sanguíneo, de una solución de sustancias y proteínas de bajo
peso molecular, y de componentes celulares de los cuales los
eritrocitos (glóbulos rojos), los leucocitos (glóbulos blancos) y
los trombocitos (plaquetas sanguíneas) significan la mayor
parte.
Los trombocitos tienen principalmente la función
de reaccionar con rapidez in vivo ante una herida y dar los primeros
pasos para el cierre de la misma. Se activan mediante diversos
factores y mientras dura la activación son "pegajosos", como de
modo acertado se decía antes. Entonces se adhieren tanto sobre las
superficies dañadas como también unos con otros entre sí. La
adhesión de unos con otros se denomina agregación cuando se produce
de forma activa, y aglutinación cuando es pasiva, es decir, se
desarrolla sin actividad fisiológica.
En lo que sigue, y en particular también en las
reivindicaciones, el término "agregación" se utiliza tanto para
la agregación como también para la aglutinación de las
plaquetas.
La capacidad de agregación es por tanto
importante para el cierre de una herida. Es posible reforzarla o
reducirla mediante un gran número de factores. Entre ellos están por
ejemplo enfermedades, operaciones, ingesta de medicamentos, y el
número de trombocitos. Un incremento en la tendencia a la agregación
puede conducir a trombosis y una reducción de la tendencia a la
agregación puede conducir a hemorragias.
Para el ensayo de las características de la
agregación plaquetaria O'Brian ( J. Clin. Path., 1962, 15,
452-455) y Born (J. Physiol., 1963, 168,
178-195) han desarrollado un método para la
medición de la agregación plaquetaria que en las décadas siguientes
se ha impuesto en el diagnóstico clínico (Bick RL, Clinics in
Laboratory Medicine, Thrombosis and Hemostatis for the clinical
laboratory: Part II, Volume 15, 1, 1-38). En el
método, en primer lugar se elabora un plasma rico en plaquetas. A la
preparación se añade en la mayoría de los casos un activador y bajo
una permanente agitación se hace un seguimiento de la extinción. La
formación de agregados se puede seguir cuantitativamente mediante el
control de la extinción. Para medir se utilizan instrumentos
especiales, los llamados "agregómetros", ya que los fotómetros
habituales no disponen de un mecanismo de agitación controlado ni de
modos de evaluación adecuados.
La ventaja del método consiste en la medición
cuantitativa y cinética de la agregación y en la posibilidad
relativamente sencilla de su automatización. El inconveniente es que
durante la medición se necesitan instrumentos especializados con un
mecanismo de agitación. Estos instrumentos, los agregómetros, son
caros y su adquisición no es rentable para todos los laboratorios.
Puesto que con frecuencia el número de mediciones es limitado,
tampoco han tenido éxito los instrumentos completamente
automatizados y el procesamiento resulta correspondientemente
farragoso. Por otra parte existe un gran número de máquinas
automáticas de análisis con un alto grado de automatización que
basándose en la unidad de medida fotométrica en principio podrían
medir el descenso de la extinción, pero que no disponen de la
posibilidad de una agitación permanente.
Para la medición de la agregación plaquetaria
según el actual estado de la técnica es necesaria una agitación
permanente. Como ya mostraba el trabajo de Born (1963), la velocidad
de agregación depende fuertemente de la velocidad de agitación. Las
publicaciones más actuales y metódicas dan por supuesta como
evidente la necesidad de la agitación. (Yardumian DA, J Clin
Pathol, 39, 1986, 701-712. Bick RL, Thrombosis and
Hemostasis for the Clinical Laboratory: Part II, 15, 1995,
1-38).
La agitación se supone que debido a la elevación
de la frecuencia de colisiones ocasiona la formación de grandes
agregados, los llamados macroagregados. Los macroagregados son
agregados de plaquetas que conducen a un descenso de la extinción en
el agregómetro. Son claramente mayores que los microagregados cuya
formación se registra por la ausencia de cambios en la extinción o
incluso por un incremento de la extinción (Kitek A. und Bredding
K., 1980, Thromb & Haemost, 44, 1980, 3,
154-158). Los microagregados compuestos de
2-3 plaquetas, también se originan sin agitación
(Longmire K. and Frojmovic M., Biophys J, 1990,
58(2):299-307). Estos microagregados sin
embargo no son visibles en los agregómetros habituales (Toghi et
al., Thromb Haemost, 1996,
75(5):38-43).
También la formación de los macroagregados en la
prueba del cofactor de la ristocetina de Willebrand discurre de
forma muy parecida a la agregación de plaquetas en un plasma fresco
rico en plaquetas. En la prueba del cofactor de la ristocetina,
mediante la adición de plasma que contiene la proteína de
Willebrand, se aglutinan los trombocitos fijados y la ristocetina
(Weiss HJ et al., J Clin Invest, 1973, 52,
2708-2716.). También en la prueba del cofactor
de la ristocetina la medición turbidimétrica bajo agitación muestra
principalmente la formación de macroagregados (Kitek A. und
Breddin K., 1980, Thromb & Haemost, 44, 1980, 3,
154-158. Toghi et al., Thromb Haemost, 1996,
75(5):38-43).
La invención presente tenía por tanto como tarea
principal encontrar un procedimiento de medida mediante el cual
pudiera medirse una agregación plaquetaria incluso sin agitación
permanente.
Esta tarea queda resuelta mediante el
procedimiento de medición de la agregación de plaquetas sanguíneas
(plaquetas), en el que en una primera fase de reacción se agita bien
la mezcla reactiva de plaquetas, preferentemente plaquetas
fisiológicamente activas o plaquetas fijadas, con otros componentes
de la preparación que se va a someter a prueba, y en la segunda fase
de reacción que sigue a la primera se agita con menor intensidad o
no se agita nada en absoluto. La medición de la agregación o
aglutinación plaquetaria tiene lugar de modo preferente en la
segunda fase de reacción. Otras formas favoritas de ejecución de la
invención se describen con mayor detalle en las reivindicaciones
2-17.
De modo sorprendente se descubrió que la
formación de macroagregados no necesitaba forzosamente la agitación
sino que bastaba con un breve tiempo de agitación tras la añadidura
del activador de plaquetas para inducir la formación de los
macroagregados. La formación de los macroagregados tras la fase de
inducción se produce únicamente bajo la influencia de la difusión
por movimiento browniano.
La inducción de la formación de los
macroagregados es posible utilizando diversos activadores (Gráfico
1). Esos activadores como por ejemplo la ristocetina, el colágeno,
el ADP o la epinefrina son conocidos desde hace mucho tiempo por el
especialista en el ámbito de la agregación de los trombocitos. Un
compendio del modo de funcionamiento de diversos activadores y sus
receptores se puede encontrar, por ejemplo, en Blockmans D. et
al., Blood Review, 9, 1995, 143-1556. La
cinética de la reacción química de formación de los macroagregados
mediante la difusión por movimiento browniano es muy diferente con
los diversos activadores. Para la formación de los macroagregados,
por una parte resulta decisiva la frecuencia de las colisiones de
unos microagregados con otros microagregados o de plaquetas sueltas.
Por otra parte, es importante que una colisión "tenga éxito",
jugando de nuevo aquí un papel el estado de activación, las
proporciones de carga, la magnitud y el número de pseudópodos y
muchos otros parámetros. Puesto que los activadores, en lo sucesivo
también llamados agonistas, producen un transcurso muy diverso de la
activación, se puede comprender que justamente la formación de los
macroagregados tras el cese de la agitación resulta muy diferente
con los diversos agonistas. El estado de activación en el momento en
que se para la agitación es con seguridad un parámetro importante
para la intensidad de la reacción que allí está teniendo lugar.
La medición clásica de la agregación (agitación
permanente) y la medición inducida de la agregación (agitación
solamente al principio) son ambas adecuadas para registrar la
actividad de los trombocitos. A modo de ejemplo, se han investigado
además tanto la dependencia de la concentración de agonistas como
también el envejecimiento del plasma rico en plaquetas. La velocidad
de agregación sin agitación permanente se sitúa en un nivel bajo.
Pero reacciona de un modo muy parecido al modificar la concentración
(a la temperatura ambiente) de los agonistas ADP y con el
envejecimiento del plasma rico en plaquetas (Gráfico 7).
De forma sorprendente también se encontró que la
agitación no solamente hace posible la formación de macroagregados
sino que también puede ser responsable de la reacción inversa, la
destrucción de los macroagregados. El final aparente de una reacción
de agregación, de forma típica tras 5-10 minutos,
puede ser en realidad un estado de equilibrio entre la formación y
la destrucción de los macroagregados. Esto se hace evidente cuando
en una típica prueba "vWF:RCo" (abreviatura para "del
cofactor de ristocetina de Willebrand") tras la terminación de
una gran parte de la reacción se somete a agitación. Poco tiempo
después, comienza un fuerte descenso de la extinción, lo cual indica
la formación de macroagregados especialmente grandes, que en lo
sucesivo llamaremos super-agregados (Gráfico 2). El
descenso de la extinción es aproximadamente igual de grande con una
agitación muy débil de 50 RPM (revoluciones por minuto), con lo cual
queda claro que la sedimentación de los agregados no produce el
descenso de la extinción. Puesto que en la prueba vWF:RCo los
trombocitos están fijados con formol, también queda excluido que una
reacción bioquímica que se inicie posteriormente origine la
formación de los agregados.
Bajo el concepto de agitación en relación con la
presente invención también se comprenden los otros métodos de batido
de líquidos bien conocidos por el especialista, como por ejemplo el
batido por agitación, sacudida, ultrasonidos o vibración. El batido
también se puede producir mediante movimiento en un analizador
centrífugo o mediante bombeo de la mezcla reactiva a través de una
pipeta, o la adición forzada de los reactivos en el recipiente
de
reacción.
reacción.
La velocidad de agitación preferida para el
procedimiento acorde con la invención se sitúa entre 200 y 2000 RPM,
con especial preferencia entre 400 y 1200 RPM, y muy particularmente
favorita entre 400 y 800 RPM.
La formación de super-agregados
ya se induce tras un tiempo relativamente corto (por ejemplo 30
segundos) (Gráfico 3).
La formación de super-agregados,
realizada mediante difusión pura, al igual que la formación de
agregados originada por agitación, depende en su velocidad y su
punto final de la concentración de Willebrand (Gráfico 4, diluciones
de plasma humano estándar). Debido a ello también se puede realizar
una medición metódica de la agregación de tal manera que la mezcla
reactiva se agite durante un corto tiempo (o dicho de otro modo, se
entremezcle) y solo entonces tiene lugar la medición de la
extinción. Periodos muy cortos de agitación de unos pocos segundos
ya pueden inducir la formación de super-agregados
(Gráfico 5). Incluso con estos breves periodos se produce una
dependencia de la concentración en la prueba del cofactor de la
ristocetina y la precisión de las mediciones se puede comparar con
las obtenidas en periodos largos de agitación (Gráfico 6).
Con ello se ofrece la posibilidad de adaptar la
prueba del cofactor de la ristocetina y la agregación plaquetaria a
todos los autómatas analizadores en los que puede tener lugar un
batido suficiente y reproducible de la preparación y a continuación
llevar a cabo una medición de la formación de agregados, por ejemplo
mediante turbidimetría o nefelometría. La evaluación puede hacerse
tanto de modo cinético como mediante otros métodos, (por ejemplo al
comienzo o en el punto final) o también mediante métodos
combinados.
La estabilidad de los agregados plaquetarios
también se puede establecer en el procedimiento acorde con la
invención mediante la comparación de la agregación con una medición
análoga durante la agitación permanente. En los agregados
inestables, la formación de agregados sin agitación continua es
relativamente intensa en comparación con la formación de agregados
durante la agitación permanente. Igualmente puede ser significativa
la proporción entre la formación de agregados sin agitación en
absoluto, y la formación de agregados con agitación durante un corto
tiempo o con agitación continua. Con ello se pueden obtener
importantes informaciones adicionales para el diagnóstico, qué
importancia tiene la magnitud de los flujos sobre la activación y la
formación de agregados bajo diversas condiciones fisiológicas, así
como sobre la estabilidad de los agregados de trombocitos.
En la prueba del cofactor de la ristocetina se
puede investigar de esta forma la capacidad del factor de Willebrand
u otros componentes del plasma para formar agregados.
Además, mediante fases alternantes con agitación
y sin agitación se puede medir la aparición y desaparición de
agregados. Con ello se pueden acumular importantes informaciones
acerca de la dinámica de tales reacciones.
La duración del batido activo depende
sustancialmente del tipo de ensayo, por ejemplo para la
determinación de la agregación plaquetaria debe alcanzar
10-60 segundos, en la prueba del cofactor de la
ristocetina 5-60 segundos, de modo general se puede
decir que no debe durar más del 50% del tiempo total de medición,
con preferencia entre 1 y 40%, y de un modo absolutamente preferente
entre 2 y 25% del tiempo total de la medición.
La formación de agregados durante la prueba del
cofactor de la ristocetina tiene lugar con plaquetas
fisiológicamente inactivas. Por consiguiente, en el procedimiento
acorde con la invención también se pueden utilizar otras partículas
sobre cuya superficie las moléculas receptoras faciliten la
formación de agregados con plaquetas, o con otras partículas en las
que esa formación se facilite directa o indirectamente a través de
ligandos.
Los ejemplos siguientes son meramente para la
ilustración de la invención pero de ninguna forma son limitadores de
la misma.
Ejemplo
1)
135 \mul de plasma rico en plaquetas se
mezclaron con 15 \mul de solución de ristocetina (15 mg/ml) y se
agitaron durante 20 o 40 segundos a 600 RPM. La evaluación tuvo
lugar después de la parada de la agitación. Para la evaluación se
determinó la máxima velocidad de agregación (Vmax del descenso de la
extinción) después de la parada de la agitación. (Schreiner, W.
et al. Comput. Biol.. Med., Vol. 21, No. 6, 435-441,
1991).
Ejemplo
2)
135 \mul de plasma rico en plaquetas se
mezclaron con 15 \mul de solución de colágeno (2000 \mug/ml) y
se agitaron durante 20 o 40 segundos a 600 RPM. La evaluación tuvo
lugar después de la parada de la agitación. Para la evaluación se
determinó la máxima velocidad de agregación (Vmax del descenso de la
extinción) después de la parada de la agitación.
Ejemplo
3)
135 \mul de plasma rico en plaquetas se
mezclaron con 15 \mul de solución de epinefrina (100 \muM) y se
agitaron durante 20 o 40 segundos a 600 RPM. La evaluación tuvo
lugar después de la parada de la agitación. Para la evaluación se
determinó la máxima velocidad de agregación (Vmax del descenso de la
extinción) después de la parada de la agitación.
Ejemplo
4)
135 \mul de plasma rico en plaquetas se
mezclaron con 15 \mul de solución ADP (200 \muM) y se agitaron
durante 20 o 40 segundos a 600 RPM. La evaluación tuvo lugar después
de la parada de la agitación. Para la evaluación se determinó la
máxima velocidad de agregación (Vmax del descenso de la extinción)
después de la parada de la agitación.
Ejemplo
5)
135 \mul de plasma rico en plaquetas se
mezclaron con 15 \mul de solución de ácido araquidónico (5000
\mug/ml) y se agitaron durante 20 o 40 segundos a 600 RPM. La
evaluación tuvo lugar después de la parada de la agitación. Para la
evaluación se determinó la máxima velocidad de agregación (Vmax del
descenso de la extinción) después de la parada de la agita-
ción.
ción.
Ejemplo
6)
20 \mul de plasma se mezclaron con 20 \mul de
polvo de imidazol y 150 \mul de reactivo de Willebrand (Dade
Behring, Marburg, aprox. 1,2 millones de trombocitos/\mul
fijados con formol, 1,2 mg/ml de ristocetina) y se agitaron durante
200 segundos a 600 RPM. La evaluación se produjo después de la
parada de la agitación. Para la evaluación se determinó la máxima
velocidad de agregación (Vmax del descenso de la extinción) después
de la parada de la agitación.
Ejemplo
7)
20 \mul de plasma se mezclaron con 20 \mul
polvo de imidazol y 150 \mul de reactivo de Willebrand (Dade
Behring, Marburg, aprox. 1,2 millones de trombocitos/\mul
fijados con formol, 1,2 mg/ml de ristocetina) y se agitaron durante
30 segundos a 600 RPM. La evaluación tuvo lugar después de la parada
del agitador. Para la evaluación se determinó la máxima velocidad de
agregación (Vmax del descenso de la extinción) después de la parada
del agitador.
Ejemplo
8)
20 \mul de plasma se mezclaron con polvo de
imidazol diluido en diversos grados (100% = no diluido), con otros
20 \mul de polvo de imidazol y 150 \mul de reactivo de
Willebrand (Dade Behring, Marburg, aprox. 1,2 millones de
trombocitos/\mul fijados con formol, 1,2 mg/ml de ristocetina) y
se agitaron durante 30 segundos a 600 RPM. La evaluación tuvo lugar
después de la parada del agitador. Para la evaluación se determinó
la máxima velocidad de agregación (Vmax del descenso de la
extinción) después de la parada del agitador.
Ejemplo
9)
40 \mul de plasma se mezclaron con 100 \mul
de reactivo de Willebrand (Dade Behring, Marburg, aprox. 2,4
millones de trombocitos/\mul fijados con formol, 2,4 mg/ml de
ristocetina) y se agitaron durante 5, 10, 20, 45 o 60 segundos a 600
RPM. La evaluación tuvo lugar después de la parada del agitador.
Para la evaluación se determinó la máxima velocidad de agregación
(Vmax del descenso de la extinción) después de la parada del
agitador.
Ejemplo
10)
40 \mul de plasma humano estándar (aprox. 100%
vWF) fue diluido con polvo de imidazol (grados de concentración 50,
25, 10, 5, 1%) y mezclados con 100 \mul de reactivo de Willebrand
(Dade Behring, Marburg, aprox. 2,4 millones de
trombocitos/\mul fijados con formol, 2,4 mg/ml de ristocetina) y
se agitaron durante 5, 10, 20, 45 o 60 segundos a 600 RPM. La
evaluación tuvo lugar después de la parada del agitador. Para la
evaluación se determinó la máxima velocidad de agregación (Vmax del
descenso de la extinción) después de la parada del agitador.
Ejemplo
11)
135 \mul de plasma rico en plaquetas fueron
mezclados con 15 \mul de solución ADP (10 o 25 \muM) y se
agitaron continuamente o durante 20 segundos a 600 RPM. La
evaluación tuvo lugar directamente después de la mezcla (agitación
permanente) o después de la parada del agitador durante 20 segundos.
Para la evaluación se determinó la máxima velocidad de agregación
(Vmax del descenso de la extinción).
Ejemplo
12)
135 \mul de plasma rico en plaquetas se
mezclaron con 15 \mul de solución de ADP (200 \muM) y se
agitaron continuamente o durante 20 segundos a 600 RPM. La
evaluación tuvo lugar directamente después de la mezcla (agitación
permanente) o después de la parada del agitador durante 20 segundos.
Para la evaluación se determinó la máxima velocidad de agregación
(Vmax del descenso de la extinción).
Figura
1a-e)
Determinación de la agregación plaquetaria
inducida con diversos agonistas
Figura
2)
Determinación de la actividad del cofactor de
ristocetina de Willebrand después de 200 segundos de tiempo de
agitación
Figura
3)
Determinación de la actividad del cofactor de
ristocetina de Willebrand después de 30 segundos de tiempo de
agitación
Figura
4)
Determinación de la actividad del cofactor de
ristocetina de Willebrand en diluciones de plasma humano estándar
después de 30 segundos de tiempo de agitación
Figura
5)
Determinación de la actividad del cofactor de
ristocetina de Willebrand después de 5-60 segundos
de tiempo de agitación
Figura
6)
Obtención de las curvas de calibración con
diluciones de plasma humano estándar después de 5-60
segundos de tiempo de agitación
Figura
7a)
Determinación de la dependencia de la
concentración de ADP de la agregación plaquetaria con y sin
agitación permanente
Figura
7b)
Determinación de la pérdida de actividad por
almacenamiento de plasma rico en plaquetas a temperatura ambiente,
midiendo la agregación con ADP como agonista, con y sin agitación
permanente
Claims (14)
1. Procedimiento para la medición de la
agregación de plaquetas de la sangre, en el que se emplean métodos
turbidimétricos, nefelométricos o electromagnéticos para la medición
de la formación de agregados y en una primera fase de reacción se
procede al batido de una mezcla reactiva, y en una segunda fase de
reacción que sigue a la primera no se bate dicha mezcla, teniendo
lugar la medición de modo preferente en la segunda fase de
reacción.
2. Procedimiento según la reivindicación 1 en el
que el batido se produce mediante agitación, sacudida, vibración o
ultrasonido.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2
para la determinación de la agregación de plaquetas de la sangre
fisiológicamente activas.
4. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2
para la determinación de la agregación de plaquetas de la sangre
fijadas, en particular en la prueba del cofactor de la
ristocetina.
5. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que como muestra para la medición se
emplea sangre entera, plasma rico en plaquetas, plasma rico en
plaquetas diluido, o trombocitos purificados.
6. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que se determina el periodo de batido
que es necesario para desencadenar la reacción de agregación.
7. Procedimiento según la reivindicación 6, para
la determinación de la sensibilidad de plaquetas de la sangre frente
a activadores de plaquetas como por ejemplo ristocetina, colágeno,
ADP, epinefrina o ácido araquidónico.
8. Procedimiento para la determinación de la
estabilidad de los agregados de plaquetas, en el que se compara la
agregación en un procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 5 con una medición análoga con agitación
permanente.
9. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que antes de la fase de batido se
intercala una fase de incubación sin batido.
10. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 9, en el que antes de la fase de batido se
determina un valor de medición de partida.
11. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 10, en el que se mide la agregación de
plaquetas de la sangre y de partículas.
12. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 11, en el que en vez de plaquetas de la sangre
se emplean otras células, vesículas con membrana, o partículas
sintéticas.
13. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 12, en el que el batido no se para por completo
sino que se ajusta el batido a una intensidad menor.
14. Procedimiento según una de las
reivindicaciones 1 a 13, en el que se suceden varias fases con
batido y sin batido.
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|---|---|---|---|
| DE10013377 | 2000-03-17 | ||
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|---|---|---|---|
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