ES2242997T3 - Metodo para integrar genes en sitios especificos en celulas de mamifero por medio de recombinacion homologa y vectores para realizar el mismo. - Google Patents

Abstract

Se presenta un procedimiento para conseguir la integración específica en una posición de un ADN deseado en una posición de objetivo en una célula de mamífero por medio de recombinación homologa. El procedimiento comprende la selección reproducible de líneas celulares en la que se integra un ADN deseado en una posición transcripcionalmente activa predeterminada, previamente marcada con un plásmido marcador. El procedimiento es particularmente adecuado para la producción de líneas celulares de mamífero que puedan secretar proteínas de mamífero con altos niveles de producción, en particular inmunoglobulinas. También se suministran vectores y combinaciones de vectores para su uso en el procedimiento de clonación presentado.

Description

Método para integrar genes en sitios específicos en células de mamífero por medio de recombinación homóloga y vectores para realizar el mismo.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un proceso para dirigir la integración de un ADN exógeno deseado en una localización específica dentro del genoma de una célula de mamífero. Más específicamente, la invención describe un nuevo método para identificar un sitio diana transcripcionalmente activo ("punto caliente") en el genoma de mamíferos, e insertar un ADN deseado en este sitio por medio de recombinación homóloga. La invención también proporciona de forma opcional la capacidad para amplificación génica del ADN deseado en esta localización integrando conjuntamente un marcador seleccionable amplificable, por ejemplo, DHFR, en combinación con el ADN exógeno. Adicionalmente, la invención describe la construcción de nuevos vectores adecuados para lograr lo anterior, y además proporciona líneas celulares de mamíferos producidas por estos métodos que contiene un ADN exógeno deseado integrado en un punto caliente diana.

Antecedentes de la invención

La tecnología para expresar proteínas recombinantes tanto en organismos procariotas como en eucariotas está bien establecida. Las células de mamífero a menudo ofrecen ventajas significativas sobre bacterias o levaduras parar la producción de proteínas, como resultado de sus capacidad para ensamblar, glucosilar y modificar posttranscripcionalmente de forma correcta proteínas expresadas de forma recombinante. Tras la transfección en las células hospedadoras, las construcciones de expresión recombinante pueden mantenerse como elementos extracromosómicos o pueden integrarse en el genoma de la célula hospedadora. La generación de líneas celulares de mamífero transfectadas estables normalmente implica lo segundo; una construcción de ADN que codifica un gen de interés junto con un gen de resistencia a un fármaco (marcador seleccionable dominante) se introduce en la célula hospedadora y, posteriormente se crece en presencia del fármaco permitiendo la selección de células que han integrado con éxito el ADN exógeno. En muchos casos, el gen de interés está unido a un marcador seleccionable de resistencia a fármacos que puede someterse después a amplificación génica. El gen que codifica la dihidrofolato reductasa (DHFR) es el más comúnmente usado para este fin. El crecimiento de células en presencia metotrexato, un inhibidor competitivo de DHFR, lleva a una producción de DHFR aumentada por medio de la amplificación del gen de DHFR. Como las regiones flanqueantes del ADN también resultarán amplificadas, la coamplificación resultante de un gen unido a DHFR en la línea celular transfectada puede llevar a una producción de proteína aumentada, dando como resultado por tanto la expresión a alto nivel del gen de interés.

Mientras que se ha comprobado que este enfoque es eficaz, hay muchos problemas con el sistema debido a la naturaleza aleatoria del suceso de integración. Estos problemas existen debido a que los niveles de expresión están altamente influenciados por los efectos del entorno genético local en el locus del gen, un fenómeno bien documentado en la bibliografía y generalmente referido como "efectos de posición" (por ejemplo, véase Al-Shawi et al., Mol. Cell Biol., 10:1192-1198 (1990); Yoshimura et al., Mol. Cell. Biol. 7: 1296-1299 (1987)). Como la gran mayoría del ADN de mamíferos está en un estado transcripcionalmente inactivo, los métodos de integración aleatoria no ofrecer control sobre la suerte transcripcional del ADN integrado. Por tanto, pueden darse grandes variaciones en el nivel de expresión de los genes integrados, dependiendo del sitio de integración. Por ejemplo, la integración de ADN exógeno en regiones inactivas o transcripcionalmente "mudas" del genoma tendrá como resultado una expresión muy pequeña o nula. Por el contrario, la integración en un sitio transcripcionalmente activo puede tener como resultado una expresión elevada.

Por tanto, cuando el objetivo del trabajo es obtener un alto nivel de expresión génica, como típicamente es el resultado deseado de los métodos de ingeniería genética, generalmente se necesita analizar grandes cantidades de transfectantes para encontrar un clon altamente productivo.

Adicionalmente, la integración aleatoria de ADN exógeno en el genoma en algunos casos puede interrumpir genes celulares importantes, lo que tiene como resultado un fenotipo alterado. Estos factores pueden hacer de la generación de líneas celulares de mamíferos estables de expresión elevada, un proceso complicado y laborioso.

"Pueden usarse en la expresión de genes de mamíferos vectores de ADN que contiene marcadores seleccionables dominantes transcripcionalmente alterados, por ejemplo como los descritos en la patente de Estados Unidos Nº 5.648.267".

Estos vectores contienen un gen de neomicina fosfotransferasa (neo) transcripcionalmente alterado como el marcador seleccionable dominante, modificado artificialmente por ingeniería genética para contener un intrón dentro del cual se inserta un gen DHFR junto con un gen o genes de interés. Se ha encontrado que el uso de estos vectores como construcciones de expresión reduce significativamente el número total de colonias resistentes al fármaco producidas, facilitando así el proceso de selección en relación con vectores de expresión de mamíferos. Además, un porcentaje considerable de los clones obtenidos usando este sistema son clones de expresión elevada. Estos resultados aparentemente se atribuyen a las modificaciones hechas en el marcador seleccionable neo. Debido a la alteración traduccional del gen neo, las células transfectadas no producirán proteína neo suficiente para sobrevivir a la selección del fármaco, disminuyendo así el número total de colonias resistentes al fármaco. De forma adicional, un porcentaje mayor de los clones supervivientes contendrán el vector de expresión integrado en sitios del genoma donde los niveles de transcripción son más altos, dando como resultado la sobreproducción de neo, permitiendo así a las células superar la alteración del gen neo. En consecuencia, los genes de interés unidos a neo estarán sujetos a niveles elevados de transcripción similares. Esta misma ventaja también es real como resultado del intrón artificial creado dentro de neo, la supervivencia depende de la síntesis de un gene neo funcional, que depende sucesivamente del ayuste correcto y eficaz de los intrones neo. Además, es más probable reunir estos criterios si el vector de ADN se integra en una región es ya es altamente activa desde el punto de vista de la transcripción.

Tras la integración del vector en una región transcripcionalmente activa, la amplificación génica se realiza por selección del gene DHRF. Usando este sistema, ha sido posible obtener clones seleccionados usando bajos niveles de metotrexato (50 nM), que contenían pocas copias del vector (<10) que secretaba altos niveles de proteína (>55 pg/célula/día). Además, esto puede obtenerse en un período de tiempo relativamente corto. Sin embargo, el éxito en la amplificación es variable. Algunos sitios transcripcionalmente activos no pueden amplificarse y, por tanto, no se puede predecir la frecuencia y extensión de la amplificación a partir de un sitio en particular

En general, el uso de estos vectores transcripcionalmente alterados representa una mejora significativa sobre otros métodos de integración aleatoria. Sin embargo, según se discute, el problema de la falta de control sobre el sitio de integración sigue siendo una preocupación importante.

Una estrategia para superar los problemas de la integración aleatoria es por medio del reconocimiento génico, por lo cual el ADN exógeno se dirige a un locus específico dentro del genoma del hospedador. El ADN exógeno se inserta por medio de recombinación homóloga que tiene lugar entre las secuencias de ADN en el vector de expresión y la correspondiente secuencia homóloga en el genoma. Sin embargo, mientras que este tipo de recombinación tiene lugar a una frecuencia naturalmente alta en levaduras y en otros organismos fúngicos, en organismos eucariotas superiores es un suceso sumamente raro. En las células de mamífero, se informa que la frecuencia de recombinación homóloga frente a recombinación no homóloga (integración aleatoria) oscila de 1/100 a 1/5000 (por ejemplo, véase Capecchi, Science, 244: 1288-1291 (1989); Morrow y Kucherlapati, Curr. Op. Biotech., 4:577-582 (1993)).

Uno de los informes que más pronto describe recombinaciones homólogas en células de mamífero comprende un sistema artificial creado en fibroblastos de ratón (Thomas et al., Cell, 44:419-428 (1986)). Se creó una línea celular que contenía una versión mutada no funcional del gene neo integrado en el genoma hospedador, y posteriormente dirigido con una segunda copia no funcional de neo que contiene una mutación diferente. La reconstrucción de un gen neo funcional puede tener lugar sólo por reconocimiento genético. Los recombinantes homólogos se identificaron por selección de células resistentes a G418, y se confirmaron por análisis de ADN genómico aislado a partir de los clones resistentes.

Recientemente, se ha informado del uso de recombinación homóloga para sustituir los genes de las cadenas ligera y pesada de la inmunoglobulina en los loci endógenos de células secretoras de anticuerpos (Patente de Estados Unidos Nº. 5.202.238, Fell et al, (1993)). Sin embargo, este enfoque en particular no puede aplicarse ampliamente, ya que la producción de inmunoglobulinas está limitada a células que expresan inmunoglobulinas de forma endógena, por ejemplo, células B y células de mieloma. También, la expresión se limita a niveles de genes de copia única ya que no se incluye la coamplificación tras la recombinación homóloga. Además, el método es complicado por el hecho de que se requieren dos sucesos de integración separados para producir una inmunoglobulina funcional: uno para el gen de la cadena ligera seguido de otro para el gen de la cadena pesada.

Se ha informado de un ejemplo adicional de este tipo de sistema en células NS/O, donde las inmunoglobulinas recombinantes se expresan por recombinación homóloga en el locus de la inmunoglobulina gamma 2A (Hollis et al., solicitud de patente internacional Nº PCT/IB95 (00014)). Los niveles de expresión obtenidos para este sitio eran extremadamente altos - del orden de 20 pg/célula/día para una única copia integrada. Sin embargo, como en el ejemplo anterior, la expresión se limita a este nivel ya que no se cointegra un gen amplificable en este sistema. Además, otros investigadores han informado de glicosilación anormal de proteínas recombinantes expresadas en células NS/O (por ejemplo, véase Flesher et al., Biotech. and Bioeng., 48:399-407 (1995)), limitando así la aplicabilidad de este enfoque.

Recientemente, se ha adaptado el sistema de recombinación Cre-loxP a partir del bacteriófago P1 y se ha usado como medio de reconocimiento genético en células eucarióticos. Específicamente, se ha descrito la integración específica de sitio de ADN exógeno en el genoma de células de ovario de hámster chino (CHO) usando la recombinasa cre y una serie de vectores que contienen lox (Fukushige y Sauer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:7905-7909 (1992)). Este sistema es atractivo porque proporciona una expresión reproducible en la misma localización del cromosoma. Sin embargo, no se han hecho esfuerzos para identificar un sitio cromosómico a partir del cual la expresión génica es óptima, y como en el ejemplo anterior, en este sistema la expresión se limita a niveles de copia única. También, es complicado por el hecho de la necesidad de proporcionar la expresión de una enzima recombinasa funcional en la célula de mamífero.

También se ha informado de que el uso de recombinación homóloga entre una secuencia de ADN introducida y su locus cromosómico endógeno proporciona un medio útil de manipulación genética en células de mamífero, así como en células de levadura (Véase, por ejemplo, Bradley et al., Meth. Enzymol., 223:855-879 (1993); Capecchi, Science, 244:1288-1292 (1989); Rothstein et al., Meth. Enzymol., 194:281-301 (1991)). Hasta la fecha, la mayoría de los estudios de reconocimiento genético en mamíferos se han dirigido hacia la interrupción génica ("knockout") o a la mutagénesis dirigida a sitio de loci de genes diana seleccionados en células troncales embrionarias (CE) de ratón. La creación de estos modelos de ratón "knockout" ha permitido a los científicos examinar cuestiones de función-estructura específicas y examinar la importancia de muchos miles de genes de ratón. Este campo de investigación también tiene importantes implicaciones en términos de aplicaciones potenciales en terapia génica.

También, Cell-tech (Kent, UK) ha informado recientemente de vectores que supuestamente se dirigen a sitios transcripcionalmente activos en las células NSO, que no requieren amplificación génica (Peakman et al., Hum. Antibod. Hybridomas, 5:65-74 (1994)). Sin embargo, no se ha informado de que los niveles de secreción de inmunoglobulina en estas células no amplificadas superen los 20 pg/célula/día, mientras que en células CHO amplificadas, pueden obtenerse niveles tan altos como 100 pg/célula/día (Id.).

Sería muy deseable desarrollar un sistema de reconocimiento génico que proporcione reproductibilidad para la integración de ADN exógeno en un sitio predeterminado del genoma conocido por ser transcripcionalmente activo. También, seria deseable que éste sistema de reconocimiento genético pudiera además facilitar la coamplificación del ADN insertado tras la integración. El diseño de este sistema permitiría la expresión reproducible y a alto nivel de cualquier gen de interés clonado en una célula de mamífero, e indudablemente sería de considerable interés para muchos investigadores.

En esta solicitud, se proporciona un nuevo sistema de expresión en mamíferos, basado en la recombinación homóloga que tiene lugar entre dos sustratos artificiales contenidos en dos vectores diferentes. Especialmente, este sistema usa una combinación de dos nuevos vectores de expresión de mamíferos, denominados como un vector "marcador" y un vector "diana".

Básicamente, el vector marcador permite la identificación y marcado de un sitio en el genoma de mamífero que es transcripcionalmente activo, es decir, un sitio en el que los niveles de expresión génica son altos. Este sitio puede considerarse como un "punto caliente" del genoma. Tras la integración del vector marcador, el sistema de expresión en cuestión permite a otro ADN integrarse en este sitio, es decir, el vector diana, por medio de recombinación homóloga que tiene lugar entre las secuencias de ADN comunes para ambos vectores. Este sistema permite avances significativos sobre otros sistemas de recombinación homóloga.

A diferencia de la mayoría de los sistemas homólogos empleados en células de mamíferos, este sistema no muestra fondo. Además, las células que sólo han experimentado integración aleatoria del vector no sobreviven a la selección. De esta manera, cualquier gen de interés clonado en el plásmido diana se expresa a niveles altos a partir del punto caliente marcado. Por tanto, el método en cuestión de expresión génica elimina considerablemente o por completo los problemas inherentes de sistemas de integración aleatorios, discutidos en detalle anteriormente. Además, este sistema proporciona expresión reproducible y de alto nivel de cualquier proteína recombinante en el mismo sitio transcripcionalmente activo del genoma de mamíferos. Además, la amplificación génica puede efectuarse en este sitio transcripcionalmente activo en particular incluyendo un marcador dominante seleccionable y amplificable (por ejemplo, DHFR) como parte del vector marcador.

Objetos de la invención

De esta manera, es un objeto de la invención proporcionar un método mejorado para dirigir un ADN deseado a un sitio específico de una célula de mamífero.

Es un objeto más específico de la invención proporcionar un nuevo método para dirigir un ADN deseado a un sitio específico en una célula de mamífero a través de recombinación homóloga.

Es otro objeto específico de la invención proporcionar nuevos vectores para conseguir la integración específica de sitio de un ADN deseado en una célula de mamífero.

Es otro objeto más de la invención proporcionar nuevas líneas celulares de mamíferos que contengan un ADN deseado integrado en un sitio predeterminado el cual proporciona una expresión elevada.

Es un objeto más específico de la invención proporcionar un nuevo método para conseguir la integración específica de sitio de un ADN deseado en una célula de ovario de hámster chino (CHO).

Es otro objeto más específico de la invención proporcionar un nuevo método para la integración de genes de inmunoglobulinas, o cualquier otro gen, en células de mamífero en sitios cromosómicos predeterminados que proporcionan una expresión elevada.

Es otro objeto específico de la invención proporcionar nuevos vectores y combinaciones de vectores adecuadas para integrar genes de inmunoglobulinas en células de mamífero en sitios predeterminados que proporcionan una expresión elevada.

Es otro objeto específico de la invención proporcionar líneas celulares de mamífero que contengan genes de inmunoglobulinas integrados en sitios predeterminados que proporcionan una expresión elevada.

Es un objeto aún más específico de la invención proporcionar un nuevo método para integrar genes de inmunoglobulinas en células CHO que proporcionen una expresión elevada, así como nuevos vectores y combinaciones de vectores que proporcionen tal integración de los genes de inmunoglobulinas en las células CHO.

Además, es un objeto específico de la invención proporcionar nuevas células CHO que contengan genes de inmunoglobulinas en sitios predeterminados que proporcionen expresión elevada y que se amplifiquen por selección con metotrexato para secretar incluso cantidades más altas de inmunoglobulinas funcionales.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra un mapa de un plásmido marcador de acuerdo con la invención, denominado Desmond. El plásmido se muestra en forma circular (1a) así como una versión linearizada usada para la transfección (1b).

La figura 2(a) muestra un mapa de un plásmido diana denominado "Molly". El Molly que se muestra aquí codifica los genes de la inmunoglobulina anti-CD20, cuya expresión se describe en el Ejemplo 1.

La figura 2(b) muestra una versión linearizada de Molly, tras la digestión con las enzimas de restricción Kpn1 y Pac1. Esta forma linearizada se usa para la transfección.

La figura 3 muestra el alineamiento potencial entre las secuencias de Desmond integrado en el genoma de CHO, y las secuencias de entrada dirigida de Molly. También se presente un ordenamiento potencial de Molly integrado en Desmond tras la recombinación homóloga.

La figura 4 muestra un análisis por Southern de clones con una única copia de Desmond. Las muestras son las siguientes:

Línea 1:	marcador de tamaño de ADN \lambdaHIndIII
Línea 2:	clon Desmond 10F3
Línea 3:	clon Desmond 10C12
Línea 4:	clon Desmond 15C9
Línea 5:	clon Desmond 14B5
Línea 6:	clon Desmond 9B2

La figura 5 muestra un análisis por Northern de clones con una única copia de Desmond. Las muestras son las siguientes: Panel A: Northern usando sondas CAD y DHFR, según se indica en la figura. Panel B: Northern duplicado, usando las sondas CAD e HisD, como se indica. Las muestras de ARN cargadas en los paneles A y B son las siguientes:

Línea 1: clon 9B2, línea 2; clon 10C12, línea 3: clon 14B5, línea 4; clon 15C9, línea 5; control de ARN de CHO transfectadas con un plásmido que contiene HisD y DHFR; línea 6; CHO no transfectadas.

La figura 6 muestra un análisis por Southern de clones resultado de la integración homóloga de Molly en Desmond. Las muestras son las siguientes:

Línea 1: marcadores de tamaño de ADN \lambdaHIndIII, línea 2: 20F4, línea 3, 5F9, línea 4; 21C7, línea 5; 24G2, línea 6; 25E1, línea 7; 28C9, línea 8; 29F9, línea 9; 39G11, línea 10; 42F9, línea 11; 50G10, línea 12; ADN del plásmido Molly linearizado con BglII (banda superior) y cortado con BglII y KpnI (banda inferior), línea 12; Desmond no transferido.

Las figuras 7A hasta 7G contiene el listado de secuencias de Desmond.

Las figuras 8A hasta 8I contiene el listado de secuencias de Molly que contiene anti-CD20.

La figura 9 contiene un mapa del plásmido diana, El "Mandy" mostrado aquí contiene los genes que codifican anti-CD23, cuya expresión se describe en el ejemplo 5.

Las figuras 10A hasta 10N contienen el listado de secuencias de los genes de anti-CD23 como se describe en el ejemplo 5.

Descripción detallada de la invención

La invención proporciona un nuevo método para integrar un ADN exógeno deseado en un sitio diana dentro del genoma de una célula de mamífero a través de recombinación homóloga. También, la invención proporciona nuevos vectores para alcanzar la integración específica de sitio de un ADN en un sitio diana de una célula de mamífero.

Más específicamente, el método de clonación en cuestión proporciona la integración específica de sitio de un ADN deseada en una célula de mamífero por transfección de esta célula con un "plásmido marcador" que contiene una secuencia única que es extraña para el genoma de la célula de mamífero y que proporciona un sustrato para recombinación homóloga, seguida de la transfección con un "plásmido diana" que contiene una secuencia que proporciona recombinación homóloga con la secuencia única contenida en el plásmido marcador, y además comprende un ADN deseado que se integrará en la célula de mamífero. Típicamente, el ADN integrado codificará una proteína de interés, tal como una inmunoglobulina u otra glicoproteina de mamífero secretada.

Los ejemplos de sistema de recombinación homóloga usan el gen de la neomicina fosfotransferasa como un marcador seleccionable dominante. Este marcador en particular se ha utilizado en base a las siguientes observaciones previamente publicadas;

(i) la capacidad demostrada para una función de diana y de restablecimiento de una versión mutada del gen neo (citada anteriormente) y

(ii) el desarrollo de vectores de expresión traduccionalmente alterados en los que se ha creado artificialmente el gen neo como dos exones con un gen de interés insertado en el intrón interpuesto; los exones de neo se ayustan y se traducen correctamente in vivo, produciendo una proteína funcional y por tanto confiriendo resistencia a G418 en la población celular resultante. En esta población, el gen neo se ayusta en tres exones. El tercer exón de neo está presente en el plásmido "marcador" y resulta integrado en el genoma de la célula hospedadora tras la integración del plásmido marcador en las células de mamíferos. Los exones 1 y 2 están presentes en el plásmido diana y están separados por un intrón interpuesto en el que se ha clonado al menos un gen de interés. La recombinación homóloga del vector diana con el vector marcador integrado tiene como resultado el correcto ayuste de los tres exones del gen neo y, por tanto, la expresión de una proteína neo funcional (como se determina por la selección de colonias G418 resistentes). Antes de diseñar el actual sistema de expresión, se ha ensayado experimentalmente la funcionabilidad de esta construcción de neo de triple ayuste en células de mamíferos. Los resultados de este experimento control indicaron que los tres exones de neo se ayustaban correctamente y sugería, además, a viabilidad de la invención en cuestión.

Sin embargo, mientras que la presente invención tiene como ejemplo el gen neo, y más específicamente un gen neo de triple ayuste, la metodología general puede ser eficaz con otros marcadores seleccionables dominantes.

Como se discute en más detalle a continuación, la presente invención proporciona numerosas ventajas sobre los métodos de expresión génica convencionales, incluyendo tanto métodos de integración aleatoria como de reconocimiento génico. Específicamente, la invención en cuestión proporciona un método que permite la reproducibilidad para la integración específica de sitio de un ADN deseado en un dominio transcripcionalmente activo en una célula de mamífero. Además, puesto que el método en cuestión produce una región artificial de "homología" que actúa como sustrato único para la recombinación homóloga y la inserción de un ADN deseado, la eficacia de la invención en cuestión no requiere que las células contengan de forma endógena o expresen un ADN específico. De esta manera, el método es aplicable genéricamente a todas las células de mamífero, y puede usarse para expresar cualquier tipo de proteína recombinante.

El uso de un marcador seleccionable de triple ayuste, por ejemplo, la construcción neo de triple ayuste del ejemplo, garantiza que todas las colonias resistentes a G418 producidas surgirán de un suceso de recombinación homólogo (las integraciones aleatorias no producirán un gen neo funcional y en consecuencia, no sobrevivirán a la selección con G418), De esta manera, la invención en cuestión hace fácil la selección del suceso homólogo deseado, Además, la frecuencia de integraciones aleatorias adicionales en una célula que se somete a un proceso de recombinación homóloga parece ser muy baja.

En base a lo anterior, está claro que una ventaja significativa de la invención es que reduce sustancialmente el número de colonias necesarias que se necesita seleccionar para identificar clones altamente productores, es decir, líneas celulares que contienen un ADN deseado que secreta la correspondiente proteína a niveles elevados. Como promedio, los clones que contienen el ADN deseado e integrado pueden identificarse seleccionando aproximadamente de 5 a 20 colonias (en comparación con los varios miles que han de seleccionarse cuando se usan técnicas de integración aleatoria convencionales, o de los varios cientos usando los vectores de inserción intrónica previamente descritos). Adicionalmente, como se había preselecciona el sitio de integración y comprendía un dominio transcripcionalmente activo, todo el ADN exógeno expresado en este sitio se podría producir de forma comparable, es decir, altos niveles de la proteína de interés.

Además, la invención en cuestión es ventajosa adicionalmente porque permite que un gel amplificable se inserte en la integración de un vector marcador. De esta manera, cuando se dirige a este sitio un gen deseado por medio de recombinación homóloga, la invención en cuestión permite que la expresión del gen se potencie adicionalmente por amplificación génica. A este respecto, se han informado en la bibliografía de que diferentes sitios genómicos tienen diferentes capacidades para la amplificación génica (Meinkoth et al, Mol. Cell Biol., 7:1415-1424 (1987)). Por tanto, esta técnica también es ventajosa porque permite la colocación de un gen deseado de interés en un sitio específico que es tanto activo transcripcionalmente como fácilmente amplificable. Por tanto, esto reducirá significativamente la cantidad de tiempo requerida para aislar estos altos productores.

Específicamente, mientras que los métodos convencionales para la construcción de líneas celulares de mamífero altamente expresoras puede llevar de 6 a 9 meses, la presente invención permite aislar estos clones sólo en una media de aproximadamente entre 3 y 6 meses. Esto es debido a que los genes aislados de forma convencional han de someterse a al menos tres ciclos de amplificación génica de resistencia a fármacos para alcanzar niveles satisfactorios de expresión génica. Como los clones producidos de forma homóloga se generan a partir de un sitio preseleccionado que es un sitio de alta expresión, se requerirán pocos ciclos de amplificación antes de alcanzar un nivel de producción satisfactorio.

Aún más, la invención en cuestión permite la selección reproducible de clones altamente productores en los que el vector se integra en un numero de copias bajo, típicamente en copia única. Esto es una ventaja porque aumenta la estabilidad de los clones y evita otros efectos laterales potencialmente adversos asociados con alto número de copias. Como se describe anteriormente, el sistema de recombinación homólogo en cuestión usa la combinación de un "plásmido marcador" y un "plásmido diana" como se describe más en detalle a continuación.

El "plásmido marcador" que se usa para marcar e identificar un punto transcripcionalmente caliente comprenderá al menos las siguientes secuencias:

(i) una región de ADN que es heteróloga o única para el genoma de la célula de mamífero, que funciona como una fuente de homología y permite la recombinación homóloga (con un ADN contenido en un plásmido diana secundario). Más específicamente, la región única de ADN (i) generalmente comprenderá un ADN de bacteria vírico, sintético de levadura u otro que normalmente no está presente en el genoma de la célula de mamífero y que además no comprende homología significativa o identidad de secuencia con el ADN contenido en el genoma de la célula de mamífero. Esencialmente, esta secuencia puede ser sustancialmente diferente al ADN de mamífero de manera que no recombinará significativamente con el genoma de la célula hospedadora por medio de recombinación homóloga. El tamaño de este ADN único generalmente será de al menos aproximadamente 2 a 10 kilobases de longitud o mayor, más preferiblemente al menos de aproximadamente 10 kb. Como han hecho notar otros investigadores, se aumenta la frecuencia de recombinación dirigida cuando aumenta el tamaño de la región de homología (Capecchi, Science, 224:1288-1292 (1989)).

El límite del tamaño superior del ADN único que actúa como un sitio para recombinación homóloga con una secuencia en el vector diana secundario está principalmente dictado por las restricciones potenciales de la estabilidad (si el ADN es demasiado largo puede que la integración dentro de un cromosoma no sea fácil y que las dificultades para trabajar con ADNs en demasiado largos).

(ii) un ADN que incluye un fragmento subrayado de un ADN marcador seleccionable, típicamente un exómero de un gen marcador seleccionable dominante. La única característica esencial de este ADN es que no codifique una proteína marcadora seleccionable funcional a no ser que se exprese en asociación con una secuencia contenida en el plásmido diana. Típicamente el plásmido diana comprenderá los exones restantes del gen marcador seleccionable dominante (aquellos no comprendidos en el plásmido "diana"). Esencialmente, un marcador seleccionable funcional no sólo debe producirse si ocurre recombinación homóloga (teniendo como resultado la asociación y expresión de esta secuencia de ADN marcador (i) junto con la porción o porciones del fragmento de ADN marcador seleccionable que está o están contenidos en el plásmido diana).

Como se indica, la invención en cuestión pone como ejemplo el uso del gen de la neomicina fosfotransferasa como marcador seleccionable dominante que se "ayusta" en los dos vectores. Sin embargo, otros marcadores seleccionables también pueden ser adecuados, por ejemplo, el gen de la histirinol desidrogenasa de salmonela, el gen de la higromicina fosfottansferasa, el gen de la timidina quinasa del virus del herpes simples, el gen de la adenosina de saminasa, el gen de la glutamina sintetasa, y el gen de la hiposantina-guanina fosforibosiltransferasa.

(iii) un ADN que codifica una proteína marcadora seleccionable funcional, cuyo marcador seleccionable es diferente del ADN marcador seleccionable (ii). Este marcador seleccionable proporciona la selección eficaz de células de mamífero en las que el plásmido marcador se integra de forma eficaz en el ADN celular. Más preferiblemente, es deseable que el plásmido marcador comprenda dos de estos ADNs marcadores seleccionables dominantes, situados en los extremos opuestos del vector. Esto es ventajoso porque permite a los integrados seleccionarse usando diferentes agentes de selección y adicionalmente permite seleccionar a las células que contienen el vector completo. Adicionalmente, un marcador puede ser un marcador amplificable para facilitar la amplificación génica como se ha discutido previamente. Cualquiera de los marcadores seleccionables dominantes recogidos en (ii) puede usarse así como otros generalmente conocidos en la técnica. Además, el plásmido marcador opcionalmente puede comprender un sitio de restricción para una endonucleasa rara. Esto es potencialmente deseable si puede facilitar la excisión. Si está presente, este sitio de restricción poco frecuente puede situarse próximo a la mitad de la región única que actúa como sustrato para recombinación homóloga. Preferiblemente esta secuencia será de al menos aproximadamente 12 nucleótidos. Se ha informado de que la introducción de una rotura en la doble cadena por metodología similar potencia la potencia de recombinación homóloga (Choulika et al, Mol. Cell. Biol., 15:1968-1973 (1995)). Sin embargo, la presencia de esta secuencia no es esencial.

El "plásmido diana" comprenderá al menos las siguientes secuencias.

(1) La misma región única de ADN contenida en el plásmido marcador o una que tenga homología suficiente o identidad de secuencia con dicho ADN de manera que sea capaz de combinarse por medio de recombinación homóloga con la región única (i) del plásmido marcador. Los tipos de ADN adecuados se describen anteriormente en la descripción del ADN de región única (1) del plásmido de marcado

(2) Los exones restantes del marcado seleccionable dominante, uno de los cuales se incluye como (ii) en el plásmido de marcado recogido anteriormente. Las características esenciales de este fragmento de ADN son que tiene como resultado una proteína marcadora (seleccionable funcional) sólo si el plásmido marcador se integra por medio de recombinación homóloga (en el que esta recombinación tiene como resultado la asociación de ADN con otro fragmento del ADN marcador seleccionable contenido en el plásmido de marcado) y además que permite la inserción de un ADN exógeno deseado. Típicamente, este ADN comprenderá los exones restantes del ADN marcador seleccionable que están separados por un intrón. Por ejemplo, este ADN puede comprender los dos primeros exones del gen neo y el plásmido de marcado puede contener el tercer exón el tercer último de neo.

(3) El plásmido diana también comprenderá un ADN deseado, por ejemplo, uno que codifique un polipéptido deseado, preferiblemente insertado con el fragmento de ADN marcador seleccionable contenido en el plásmido. Típicamente el ADN se insertará en un intrón que está comprendido entre los exones del ADN marcador seleccionable. Esto asegura que también se integra el ADN deseado si tiene lugar la recombinación homóloga del plásmido diana y el plásmido de marcado. Este intrón puede ser de origen natural o puede ser incorporado por ingeniería genética en el fragmento de ADN marcador seleccionable dominante.

Este ADN codificará cualquier proteína deseada, preferiblemente una que tenga propiedades farmacéuticas u otras propiedades deseadas. Típicamente el ADN codificará una proteína de mamífero y en los ejemplos actuales proporcionará una inmunoglobulina o una inmunoadhesina. Sin embargo, la invención no está limitada de ninguna manera a la producción de inmunoglobulinas.

Como se ha discutido previamente, el método de clonación actual es adecuado para cualquier célula de mamífero y para su eficacia no requiere que esté presente en ninguna secuencia o secuencias específicas de mamíferos. En general, estas células de mamífero comprenderán aquellas típicamente usadas para la expresión de proteínas, por ejemplo células CHO, células de mieloma, células COS, células BHK, células Sp2/0, células NHI 3T3 y HeLa. En los ejemplos que siguen a continuación, se han utilizado células CHO. La ventaja de estas incluye la disponibilidad de un medio de cultivo adecuado, su capacidad para crecer de forma eficaz y en alta densidad en cultivo, y su capacidad para expresar proteínas humanas tales como inmunoglobulinas en forma biológicamente activas.

Adicionalmente, las células CHO se han seleccionado en gran medida debido a que los inventores han usado previamente estas células para la expresión de inmunoglobulinas (usando los vectores que contienen marcadores seleccionables dominantes traduccionalmente alterados descritos previamente). De esta manera, el laboratorio actual tiene considerable experiencia en el uso de estas células para la expresión. Sin embargo, en base a los ejemplos que se recogen a continuación, es razonable esperar resultados similares con otras células de mamífero.

En general, la transformación o transfección de células de mamífero de acuerdo con la presente invención se efectuará de acuerdo con métodos convencionales. De modo que la invención puede entenderse mejor, la construcción de ejemplos de vectores y su uso para producir integrantes se describe en los ejemplos siguientes.

Ejemplo 1 Diseño y Preparación de Vectores de ADN de Plásmido de Marcado y Diana

El plásmido de marcado de este documento denominado como "Desmond" se ensambló a partir de los siguientes elementos de ADN:

(a) El gen de la dihidrofolato reductasa murina (DHFR), incorporado en un casete de trascripción, que comprende el promotor 5' de la beta globina para el sitio de inicio de DHFR y la señal 3' de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovino para el codón de terminación. El casete transcripcional de DHFR se aisló a partir de TCAE6, un vector de expresión creado previamente en este laboratorio (Newman et al, 1992, Biolechnology, 10:1455-1460).

(b) Gen de la \beta-galactosidasa de E. coli - disponible en el mercado, obtenido de Promega como vector de control Pbsv-b-galactosidasa, número de catálogo E1081.

(c) ADN de baculovirus, disponible en el mercado, obtenido de Clontech como pBAKPAK8, Nº de catálogo 6145-1.

(d) Casete que comprende los elementos promotor y potenciador de Citomegalovirus y del virus SV40. El casete se generó por PCR usando un derivado del vector de expresión TCAE8 (Reff et al, Blood, 83:435-445 (1994)). El casete potenciador se insertó dentro del genoma de baculovirus, que primero se había modificado por la inserción de un sitio de clonación múltiple

(e) Gen GUS (glucuronidasa) de E. coli , disponible en el mercado, obtenido de Clontech como pB101, Nº de catálogo 6017-1.

(f) Gen de la luciferasa de luciernaga, disponible en el mercado, obtenido de Promega como pGEM-Luc (Nº de catálogo E 1541).

(g) Gen de la histidinol deshidrogenasa de S. typhimurim (HisD). Este gen originalmente fue un regalo (Donahue et al, Gene, 18:47-59 (1982)), y posteriormente se incorporó en un casete de trascripción que comprendía el promotor de la beta globulina principal de ratón en el extremo 5' del gen y la señal de poliadenilación de SV40 en el extremo 3' del gen.

Los elementos de ADN descritos entre (a) - (g) se combinaron en la estructura básica del plásmido derivado de pBR para producir un fragmento de ADN adjunto de 7,7 kb referido en las figuras adjuntas como "homología". Homología en este sentido se refiere a secuencias de ADN que no son partes del genoma de mamífero y que se usan para promover la recombinación homóloga entre los plásmidos transfectados que comparten las secuencias de ADN de la misma homología.

(h) El gen de la Neomicina fosfotransferasa a partir de TN5 (Davis y Smith, Ann. Rev. Micro., 32:469-518 (1978)). El gen neo completo se subclonó en pBluescript SK-(Stratagene Nº de catálogo 212205) para facilitar la manipulación genética. Después se insertó un enlazador sintético dentro del sitio único de Pst1 que aparece entre los codones de los aminoácidos 51 y 52 de neo. Este enlazador codifica los elementos de ADN necesarios para crear un sitio dador de ayuste artificial, en el exoma intermedio y un sitio aceptor de ayuste dentro del gen neo, de manera que se crean los exones separados, actualmente denominados como exón neo 1 y 2. El exón neo 1 codifica los primeros aminoácidos de neo, mientas que el exón 2 codifica los 203 aminoácidos restantes más el codon de terminación de la proteína. También se creó dentro del intrón un sitio de clonación Not1.

El exón 2 de neo se subdividió además para producir los exones 2 y 3 de neo. Esto se obtuvo como sigue: se diseñó un par de cebadores por PCR para amplificar una región de ADN que codifica el exón 1 de neo, el intrón y los primeros aminoácidos 111 2/3 del exón 2. El cebador de PCR 3' tuvo como resultado la introducción de un nuevo sitio de ayuste en 5' inmediatamente después del segundo nucleótido del codon para el aminoácido 111 en el exón 2, generando de esta forma un nuevo exón 2 más pequeño. El fragmento de ADN ahora que codifica para el exón 1 original, el intrón y el nuevo exón 2 se subclonó después y se propagó en un vector basado en pBR. El resto del exón 2 original se usó como molde para otro ciclo de amplificación por PCR, que generó el "exón 3". El cebador 5' de esta ronda de amplificación introduce un nuevo sitio aceptor de ayuste en el sitio 5' del exón 3 creado de nuevo, es decir, antes del nucleótido final del codón para el aminoácido 111. El exón 3 resultante de neo codifica la siguiente información: Exón 1 - los primeros 51 aminoácidos de neo; exón 2 - los siguientes 2/3 de aminoácidos más el nuevo 111, y el exón 3 el tercio de aminoácidos final que son 91 aminoácidos más el codón de final de la traducción del gen neo.

El exón 3 de neo se incorporó junto con los elementos de ADN mencionados anteriormente en el plásmido marcador "Desmond". Los exones 1 y 2 de neo se incorporaron en el plásmido diana "Molly". El sitio de clonación NotI creado dentro del intrón entre los exones 1 y 2 se usó para las posteriores etapas de clonación para insertar los genes de interés en el plásmido diana.

También se generó un segundo plásmido diana "Mandy". Este plásmido era prácticamente idéntico a "Molly" (se han cambiado algunos sitios de restricción en el vector) excepto en que los genes originales HisD y DHFR contenidos en "Molly" estaban inactivos. Estos cambios se incorporaron porque la línea celular Desmond no se podía cultivar en presencia de histidinol, por lo que parecía innecesario incluir una segunda copia del gen HisD. Adicionalmente, el gen DHFR se inactivó para asegurarse de que sólo un único gen de DHFR, concretamente el presente en el sitio de marcado Desmond, podría amplificarse en cualquier línea celular resultante. "Mandy" se derivó a partir de "Molly" mediante las modificaciones siguientes:

(i) Se insertó un enlazador sintético en el medio de la región que codifica DHFR. Este enlazador creaba un codón de terminación y desplazaba el resto de la región codificadora de DHFR fuera de fase, por lo que el gen resultaba no funcional.

(ii) Se eliminó una porción del gen HisD y se reemplazó por un fragmento de HisD generado por PCR carente del promotor y del codón de inicio del gen.

La figura 1 representa el reordenamiento de estos elementos de ADN en el plásmido marcador "Desmond". La Figura 2 representa el ordenamiento de estos elementos en el primer plásmido diana "Molly". La Figura 3 ilustra el posible reordenamiento en el genoma de CHO, de los diversos elementos de ADN tras el reconocimiento y la integración del ADN de Molly en las células CHO marcadas con Desmond. La Figura 9 describe el plásmido diana "Mandy".

La construcción de los plásmidos de marcado y diana a partir de los elementos de ADN mencionados anteriormente se realizó siguiendo técnicas de clonación convencionales (véase, por ejemplo Molecular Cloning, A Laboratory Manual, J. Sambrook et al, eds., 1987, John Cold Spring Harbor Laboratory Press, y Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al, eds., 1987, John Wiley and Sons). Todos los plásmidos se mantuvieron en E. coli XLI blue (Stratagene, Nº de catálogo 200236). Se hicieron preparaciones de plásmido a gran escala usando Promega Wizard Maxiprep DNA Purification System® de acuerdo con las direcciones del fabricante.

Ejemplo 2 Construcción de una línea Celular CHO Marcada 1. Cultivo Celular y Procedimientos de Transfección para Producir la línea Celular CHO Marcada

El plásmido de ADN de marcado se linealizó por digestión durante una noche a 37ºC con Bst11007l. El vector linealizado se precipitó con etanol y se resuspendió en TE estéril a una concentración de 1 mg/ml. El vector linealizado se introdujo en células DG44 que son células DHFR-ovario de hámster chino (células CHO) (Urlaub et al, Som. Cell and Mol. Gen., 12:555-566 (1986)) por electroporación como sigue.

Las células en crecimiento exponencial se recogieron por centrifugación, se lavaron una vez en SBS mantenido en hielo (solución tamponada de sacarosa, sacarosa 272 mM, fosfato sódico 7 mM, pH 7,4, cloruro de magnesio 1 mM). Después se resuspendieron en SBS a una concentración de 10^{7} células/ml. Tras una incubación de durante 15 minutos en hielo, se mezclaron 0,4 ml de la suspensión celular con 40 \mug de ADN linearizado en una cubeta de electroporación desechable. Las células se sometieron a choque usando un manipulador electrocelular BTX (San Diego, CA) dispuesto a 230 voltios, con una capacitancia de 400 microfaradios, y una resistencia de 13 ohms, las células sometidas a choque se mezclaron después con 20 ml de medio de cultivo CHO precalentado (CHO-S-SFMII, Gibco/BRL, Nº de Catálogo 31033-012) y se dispusieron en placas de cultivo celular de 96 pocillos. 48 horas después de la electroporación, las placas se nutrieron con medios de selección (en el caso de transfección con Desmond, el medio de selección es CHO-S-SFMII sin hipoxantina o timidina, suplementados con histidinol 2 mM (Nº de Catálogo de Sigma H6647)). Las placas se mantuvieron en medio de selección hasta 30 días o hasta que algunos de los pocillos mostraron crecimiento celular. Estas células después se retiraron de las placas de 96 pocillos y se expandieron a la larga en botellas giratorias de 220 ml donde se mantuvieron en medio selectivo todo el tiempo.

Ejemplo 3 Caracterización de las Líneas Celulares CHO Marcadas (a) Análisis por Southern

El ADN genómico se aisló a partir de células de todas las células CHO marcadas con Desmond que crecían de forma estable. El ADN se aisló usando el kit para ADN de Invitrogen Easy®, de acuerdo con las indicaciones del fabricante. El ADN genómico se digirió entonces con HindIII durante una noche a 37ºC y se sometió a análisis por Southern usando una sonda marcada con dogoxigenina generada por PCR específica del gen DHFR. Las hibridaciones y los lavados se realizaron usando Boehringer Mannhem's DIG easy hyb (Nº de catálogo 1603 558) y el Set de Tampón de Labado y Bloqueo DIG (Nº de Catálogo 1585 762) de acuerdo con las indicaciones del fabricante. Las muestras de ADN que contenían una única banda que hibridaba con la sonda DHFR se asumieron como clones Desmond crecidos a partir de una única célula en las que se había integrado una única copia del plásmido. Estos clones se mantuvieron para un análisis posterior. A partir de un total de 45 líneas celulares resistentes aisladas, sólo 5 habían integrado una única copia. La Figura 4 muestra una transferencia de Southern que contiene los 5 clones con una sola copia Desmond. Los nombres de los clones se proporcionan en la leyenda de la Figura.

(b) Análisis por Northern

El ARN total se aisló a partir de todos los clones Desmond de copia única usando el reactivo Trizol (Nº de Catálogo de Gibco/BRL 15596-026) de acuerdo con las indicaciones del fabricante. Se analizaron de 10 a 20 \mug de ARN para cada clón por duplicado en geles de formaldehído. Las transferencias resultantes se incubaron con sondas de ADN marcadas con digoxigenina generadas por PCR para (i) el mensajero de DHFR, (ii) el mensajero de HisD y (iii) el mensajero de CAD. CAD es una proteína trifuncional implicada en la biosíntesis de uridina (Wahl et al, J. Biol. Chem., 254, 17:8679-8689 (1979)), y se expresa de forma equitativa en todas las líneas celulares. Se usa aquí como un control interno para ayudar a la cuantificación del ARN cargado. Las hipidaciones y los lavados se realizaron usando los reactivos de Boehringer Mannheim mencionados anteriormente. Los resultados del análisis de Norhern se muestran en la Figura 5. El clon Desmond de copia única que muestra los niveles más altos tanto del mensajero de HisD como de DHFR es el clón 15C9, que se muestra en la línea 4 de ambos paneles de la figura. Este clón se denominó como la "línea celular marcada" y se usó en los experimentos siguientes de reconocimiento en CHO, ejemplo de los cuales se presentan en las siguientes secciones.

Ejemplo 4 Expresión del Anticuerpo Anti-CD20 en Células CHO Marcadas con Desmond

C2B8, un anticuerpo quimérico que reconoce el antígeno de la superficie de las células B de CD20, había sido clonado y expresado previamente en el laboratorio (Reff et al, Blood, 83:434-45 (2994)). Un fragmento de ADN de 4,1 kb que comprende los genes de las cadenas ligera y pesada de C2B8 junto con los elementos reguladores necesarios (señal promotora y de poliadenilación eucariótica) se insertó en el intrón artificial creado entre los exones 1 y 2 del gen neo contenidos en el vector de clonación derivado de pBR. Este fragmento de ADN de 5 kb generado de nuevo (que comprendía el exón 1 de neo, C2B8 y el exón 2 de neo) se extinguió y se usó para ensamblar el plásmido diana Molly. Los otros elementos de ADN usados en la construcción de Molly son idénticos a los usados en la construcción del plásmido de marcaje Desmond, identificados previamente. Un mapa completo de Molly se muestra en la Figura 2.

El vector diana Molly se linealizó previamente a transfección por digestión con Kpn 1 y Pac1, se precipitó con etanol y se resuspendió en TE estéril a una concentración de 1,5 mg/ml. El plásmido linearizado se introdujo en células marcadas con Desmond en crecimiento exponencial esencialmente como se ha descrito, excepto porque se usaron 80 \mug de ADN en cada electroporación. Cuarenta y ocho horas después de la electroporación, las placas de 96 pocillos se suplementaron con medio de suspensión de CHO-SSFMII suplementado con Geneticina a 400 \mug/ml (G418, Nº de Catálogo de Gibco/BRL 10131-019). Las placas se mantuvieron en medio de selección hasta los 30 días o hasta que tuvo lugar el crecimiento celular en algunos de los pocillos. Este crecimiento se asumió como el resultado de una expansión clonal de una única célula resistente a G418. Se ensayó la producción de C2B8 en todos los sobrenadantes de las células resistentes a G418 por técnicas de ELISA convencional y todos los clones productores se expandieron finalmente en botellas rotatorias de 120 ml y se analizaron posteriormente.

Caracterización del Anticuerpo Spor las Células Diana

Se realizaron un total de 50 electroporaciones con el plásmido diana Molly en este experimento. Cada una de las cuales se dispuso separadamente en placas de 96 pocillos. Se obtuvieron un total de 10 clones viables secretores de anticuerpo antiCD20 y se expandieron en botellas rotatorias de 120 ml. Se aisló el ADN genómico de todos los genes y posteriormente se realizaron los análisis por Southern para determinar si los clones representaban sucesos de recombinación homóloga única o bien habían tenido lugar integraciones adicionales aleatorias en las mismas células. Los métodos para el aislamiento del ADN y para la hibridación en el Southern fueron los descritos en la sección previa. El ADN genómico se digirió con EcoRI y se incubó con una sonda marcada con digoxigenina generada por PCR frente a un segmento de la región constante de la cadena pesada de CD20. Los resultados de estos análisis por Southern se presentan en la Figura 6. Como puede verse en la Figura, 8 de los 10 clones muestran una banda única que hibrida con la sonda CD20, lo que indica que ha tenido lugar en estas células un suceso único de recombinación homóloga. Dos de los 10, los clones 24G2 y 28C9, muestran la presencia de banda o bandas adicionales, lo que indica una integración aleatoria adicional en otra parte del genoma.

Se examinaron los niveles de expresión de anticuerpo anti-CD20 en estos 10 clones, cuyos datos se muestran en la Tabla 1, a continuación.

TABLA 1

Nivel de expresión de integrantes homólogos secretores de anti-CD20
Clon	Anti-CD20, pg/c/d
20F4	3,5
25E1	2,4
42F9	1,8
39G11	1,5
21C7	1,3
50G10	0,9
29F9	0,8
5F9	0,3
28C9*	4,5
24G2*	2,1
* \begin{minipage}[t]{120mm} Estos clones contienen copias adicionales integradas de forma aleatoria de anti-CD20. Los niveles de expresión de estos clones reflejan una contribución tanto de los sitios homólogos como aleatorios. \end{minipage}

Los niveles de expresión se indican como picogramos por célula por día (pg/c/d) secretado por los clones individuales y representan los valores medios obtenidos a partir de tres ELISA separados en muestras tomadas a partir de botellas de cultivo rotatorias de 120 ml.

Como puede deducirse a partir de los datos, hay una variación en la secreción de anticuerpo de aproximadamente 10 veces entre los clones de mayor y menor expresión. Esto era de alguna forma inesperado ya que se anticiparon niveles de expresión similares para todos los clones debido al hecho de que los genes anti-CD20 se habían integrado en el mismo sitio del marcador Desmond. Sin embargo, este intervalo observado en la expresión es extremadamente pequeño en comparación con los observados usando cualquier método de integración aleatoria convencional o con el sistema de vector traduccionalmente alterado.

El clon 20F4, el de única copia integrada de producción más alta, se seleccionó para estudio posterior. La Tabla 2 (a continuación) presenta los datos del ELISA y de cultivos celulares a partir de ciclos de producción de 7 días de este clón.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 2

1

\vskip1.000000\baselineskip

Este clon secreta con una media de 3 a 5 pg de anticuerpo/célula/día en base a estos datos de ELISA. Este es el mismo nivel que el obtenido a partir de otros clones de copia única de expresión alta obtenidos previamente en el laboratorio usando los vectores de integración aleatoria traduccionalmente alterados desarrollados previamente. Este resultado indica lo siguiente:

(1) que el sitio en el genoma de CHO marcado por el vector de marcado Desmond es altamente activo desde el punto de vista transcripcional y por tanto representa un sitio excelente a partir del cual expresar proteínas recombinantes, y

(2) que el reconocimiento por medio de recombinación homóloga puede obtenerse usando los vectores anteriores y tiene lugar con una frecuencia suficientemente alta como para hacer de este un sistema viable y una alternativa deseada a los métodos de integración aleatoria.

Para demostrar de forma adicional la eficacia de este sistema, también se ha demostrado que este sitio es amplificable, dando como resultado incluso niveles más alto de expresión génica y de secreción de proteína. La amplificación se obtuvo por diluciones seriales en placa de células de 20F4, empezando a una densidad de 2,5 x 10^{4} células/ml, en placas de cultivo tisular de 96 pocillos y cultivando estas células (CHO-SSFM2) suplementado con metotrexato 5, 10, 15 ó 20 nm. Los clones secretores de anticuerpo se seleccionaron usando técnicas convencionales de ELISA y los clones de mayor producción se expandieron y se analizaron posteriormente. Un resumen de estos experimentos y ampliciación se presenta en la Tabla 3 a continuación.

TABLA 3

3

Los datos claramente demuestran que este sitio puede amplificarse en presencia de metatrexato. Se encontró que los clones a partir de las amplificaciones de 10 y 15 mM producen del orden de 10-20 pg/célula/día. Se seleccionó un clón de 15 nM denominado 20F4-15A5, como la línea celular con la mayor expresión. Este clón se originó a partir de una placa de 96 pocillos en la cual sólo crecieron 22 pocillos y se asumió por tanto que habían crecido a partir de una única célula. Se seleccionó un clón de 15 nM denominado 20F4-15A5 como la línea celular de mayor expresión. Después el clón se sometió a un ciclo adicional con metotrexato. Como se describe anteriormente, las diluciones seriadas del cultivo se dispusieron en placas de 96 pocillos y se cultivaron en medio CHO-SSFMII suplementado con metotrexato 200, 300 ó 400 nM. Los clones supervivientes se seleccionaron por ELISA y varios clones altamente productores se expandieron en cultivos rotatorios y se examinaron posteriormente. Un resumen de este experimento de segunda ampliación se presenta en la Tabla 4.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 4

4

El clon de producción más alta surgió de la amplificación con metotrexato a 250 nM. El clón de 250 nM, 20F4-15A5-250A6, originado a partir de una placa de 96 pocillos en la que sólo crecieron estos pocillos, y por tanto se asumió que crecía a partir de una célula única. Tomados conjuntamente los datos de las Tablas 3 y 4, indican firmemente que dos ciclos de amplificación con metotrexato son suficientes para alcanzar niveles de expresión de 60 pg/célula/día, lo que es aproximadamente la capacidad de secreción máxima de inmunoglobulinas en células de mamífero (Reff, M.E., Curr. Opin. Biotech., 4:457-576 (1993)). La capacidad para alcanzar esta capacidad de secreción sólo con dos etapas de amplificación aumenta adicionalmente la utilidad de estos sistemas de recombinación homóloga. Típicamente, los métodos de integración aleatoria requieren más de 2 etapas de amplificación para alcanzar este nivel de expresión y generalmente son menos fiables en términos de facilidad de amplificación. De esta manera, el sistema homólogo ofrece un método más eficaz y de ahorro de tiempo para alcanzar altos niveles de expresión génica en células de mamíferos.

Ejemplo 5 Expresión de Anticuerpo anti-CD23 humano en Células CHO Marcadas con Desmond

CD23 es un receptor de IgE de baja afinidad que media en la unión de IgE a linfocitos B y T (Sutton, B.J. y Gould, H.J., Nature, 266:421-428 (1993)). El anticuerpo monoclonal 5E8 antiCD23 humano es un anticuerpo monoclonal humano gamma-1 clonado recientemente y expresado en el laboratorio. Este anticuerpo se describe en el documento de cesión común con la presente Nº de Serie 08/803.085, presentada el 20 de Febrero de 1997.

Los genes de la cadena pesada y ligera de 5E8 se clonaron en el vector de expresión de mamíferos N5KG1, un derivado del vector NEOSPLA (Barnett et al, en Antibody Expression and Engineering, H.Y. Yang y T. Imanaka, eds., pág. 27-40 (1995)) y después se hicieron dos modificaciones en los genes. Recientemente se ha observado la secreción algo más alta de cadenas ligeras de inmunoglobulina en comparación con las cadenas pesadas en otras construcciones de expresión en el laboratorio (Reff et al, 1997, observaciones no publicadas). En un intento por compensar este déficit, se alteró el gen de la cadena pesada de 5E8 por la adición de un elemento promotor/potenciador más fuerte inmediatamente secuencia arriba del sitio de inicio. En las etapas siguientes, se aisló un fragmento de ADN de 2,9 kb que comprendía los genes de la cadena ligera y pesada de 5E8 codificada, a partir del vector N5KG1 y se insertó en el vector diana Mandy. La preparación del Molly que contenía 5E8 y la electroporación dentro de las células CHO 15CD9 Desmond se realizó esencialmente como se ha descrito en la sección precedente.

Una modificación del protocolo descrito previamente fue el tipo de medio de cultivo usado. Las células CHO marcadas con Desmond se cultivaron en medio CD-CHO sin proteína (Gibco/BRL, Nº de Catálogo AS21206), suplementado con insulina recombinante a 3 mg/l (patrón de 3 mg/ml, Gibco/BRL, Nº de Catálogo AS22057) y L-glutamina 8 mM (solución de reserva 200 mg, Gibco/BRL, Nº de Catálogo 25030-081). Posteriormente, las células transfectadas se seleccionaron en el medio anterior suplementado con geneticina a 400 \mug/ml. En este experimento, se realizaron 20 electroporaciones y se dispusieron en placas de cultivo tisular de 96 pocillos. Las células se crecieron y secretaron anti-CD23 en un total de 68 pocillos, los cuales se asumió que eran clones originados a partir de una única célula G418. Doce de esos pocillos se expandieron en botellas giratorias de 120 ml para análisis posterior. Se cree que el número incrementado de clones aislados en este experimento (68 en comparación con los 10 para anti-CD20 descritos en el ejemplo 4) es debido a una eficacia de clonación mayor y a una tasa de supervivencia de las células en cultivo en el medio CD-CHO en comparación con el medio CHO-SS- FFMII. Los niveles de expresión de estos clones analizados en los cultivos rotatorios osciló de 0,5-3 pg/c/d. Bastante de acuerdo con los niveles vistos en los clones de anti-CD20. El clón anti-CD23 de producción más alta, denominado 4H12, se sometió a amplificación con metotrexato para incrementar sus niveles de expresión. Esta amplificación se realizó de forma similar a la descrita para el clón de anti-CD20 del ejemplo 4. Las diluciones seriadas de células 4H12 en crecimiento exponencial se dispusieron en placas de cultivo tisular de 96 pocillos y se crecieron en medio CD-CHO suplementado con insulina a 3 mg/l, glutamina 80 mM, y metrotexato 30, 35 ó 40 nM. Un resumen de este experimento de amplificación se presenta en la Tabla 5.

TABLA 5

5

Ejemplo 6 Expresión de Inmunoadhesina en Células CHO Marcadas con Desmond

CTLA-4, un miembro de la superfamilia Ig, se encuentra en la superficie de linfocitos T y se piensa que tiene una función importante en la activación de las células T específica de antígeno (Dariavach et al, Eur. J. Immuol., 18:1901-1905 (1988); y Linsley et al, J. Exp. Med., 174:561-569 (1991)). Para un estudio adicional del papel en concreto de la molécula CTLA-4 en la ruta de activación, se creó una proteína de fusión soluble que comprendía el dominio extracelular de CTLA-4 unido a una forma truncada de la región constante de la IgG1 humana (Linsley et al (Id.). Recientemente se ha expresado esta proteína de fusión CTLA-4 Ig en el vector de expresión de mamíferos BLECHI, un derivado del plásmido NEOPLA (Barnett et al, en Antibody Expression and Engineering, H.Y. Yand y T. Imanaka, eds., pág. 27-40 (1995)). Se aisló un fragmento de 800 pb que codifica la CTLA-4 Ig a partir de este vector y se insertó entre los sitios SacII y BglII de Molly.

La preparación de CTLA-4Ig-Molly y la electoporación dentro de las células CHO del clón Desmond 15C9 se realizó como se ha descrito previamente en el ejemplo anterior relativo anti-CD20. Se realizaron 20 electroporaciones y se dispusieron en placas de cultivo celular de 96 pocillos como se ha descrito previamente. Se aislaron 18 pocillos que expresaban CTLA-4 a partir de las placas de 96 pocillos y se llevaron posteriormente a la etapa de cultivo giratorio en 120 ml. Después se realizaron los análisis de Southern del ADN genómico aislado a partir de cada uno de estos clones para determinar cuantos de los clones homólogos contenían integrantes aleatorios adicionales. El ADN genómico se digirió con BglII y se incubó con una sonda marcada con digoxigenina generada por PCR contra la región constante de la inmunoglobulina IgG1 humana. Los resultados de este análisis indican que el 85% de los clones de CTLA-4 son sólo integrantes homólogos. El 15% restante contienen un integrante adicional aleatorio. Este resultado corrobora los hallazgos para la expresión de anti-CD20 discutidos anteriormente, donde el 80% de los clones eran integrantes homólogos únicos. Por lo tanto, se puede concluir que este sistema de expresión rinde de forma reproducible integrantes homólogos dirigidos únicos en al menos el 80% de los clones producidos.

Los niveles de expresión de los clones homólogos CTLA4-Ig oscilan entre 8-12 pg/célula/día. Esto es un poco mayor que el intervalo obtenido para el anticuerpo anti-CD20 y para los clones del anticuerpo anti-CD23 discutidos anteriormente. Sin embargo, se ha observado previamente que la expresión de esta molécula usando el sistema de vector de inserción intrónico también tiene como resultado niveles de expresión significativamente altos que los obtenidos para inmunoglobulinas. Actualmente es imposible proporcionar una explicación a esta observación.

Ejemplo 7 Localización de Anti-CD20 en una línea celular CH_{2} marcada con Desmond Alterno

Como se ha descrito en una sección anterior, se obtuvieron 5 líneas celulares CHO marcadas con una única copia de Desmond (vease las Figuras 4 y 5). Para demostrar que el éxito de esta estrategia de reconocimiento no es debido a cualquier propiedad exclusiva del clón Desmond 15C9 y que se limita sólo a este clón, se introdujo un Molly anti-CD20 en el clón 9B2 Desmond (línea 6 de la Figura 4, línea 1 de la Figura 5). La preparación del ADN de Molly y la electroporación en Desmond 9B2 fue exactamente como se ha descrito en el ejemplo anterior, perteneciente a anti-CD20. Se obtuvo un integrante homólogo para este experimento. Este clón se expandió en una botella giratoria de 120 ml, donde producía una media de 1,2 pg de anti-CD20/célula/día. Esta es una expresión considerablemente menor que la observada con Molly dirigida dentro de 15C9 Desmond. Sin embargo, este fue un resultado anticipado, en base al análisis por northern de los clones Desmond. Como puede observarse en la Figura 5, los niveles de ARN mensajero para el clón 9B2 son considerablemente menores que aquellos de 15C9, lo que indica que el sitio de este clón no es tan activo transcripcionalmente como el de 15C9. Por tanto, este experimento no sólo demuestra la reproductividad del sistema- presumiblemente cualquier sitio marcado por Desmond puede ser reconocido por Molly - sino que también confirma los datos de northern de que el sitio en Desmond 15C9 es transcripcionalmente el más activo.

Claims (41)

1. Un método in vitro para la inserción de un ADN deseado en un sitio diana del genoma de una célula de mamífero que comprende las siguientes etapas:

(i) transfectar o transformar una célula de mamífero con un primer plásmido ("plásmido de marcado") que contiene las siguientes secuencias:

(a)

una región de ADN que es heteróloga con el genoma de la célula de mamífero, la cual cuando se integra en el genoma de la célula de mamífero proporciona un sitio único para recombinación homóloga;

(b)

un fragmento de ADN que codifica una porción de una primera proteína marcadora seleccionable; y

(c)

al menos otro ADN marcador seleccionable que proporciona la selección de células de mamíferos que han integrado de forma apropiada el plásmido de marcado.

(ii) seleccionar una célula que contiene el plásmido de marcado integrado en el genoma;

(iii) transfectar o transformar dicha célula seleccionada con un segundo plásmido ("plásmido diana") que contiene las siguientes secuencias:

(a)

una región de ADN que es idéntica o es suficientemente homóloga con la región única del plásmido de marcado de modo que esta región de ADN pueda recombinar con dicho ADN a través de recombinación homóloga;

(b)

un fragmento de ADN que codifica una porción del mismo marcador seleccionable contenido en el plásmido de marcado en el que la proteína marcadora seleccionable activa codificada por dicho ADN sólo se produce si dicho fragmento se expresa en asociación con el fragmento de dicho ADN marcador seleccionable contenido en el plásmido de marcado;

(c)

el ADN deseado; y

(iv) seleccionar células que contienen el plásmido diana integrado en el sitio diana para selección de la expresión de la proteína primera marcadora seleccionable.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el primer ADN marcador seleccionable se ayusta en al menos 3 exones.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 ó con la reivindicación 2, en el que el primer marcador seleccionable es un marcador seleccionable dominante seleccionado entre el grupo compuesto por neomicina fosfotransferasa, histidinol deshidrogenasa, dihidrofolato reductasa, higromicina fosfotransferasa, timidina quinasa del virus del herpes simple, adenosina desaminasa, glutamina sintetasa, e hipoxantina-guanina fosforibosil transferasa.

4. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 3, en el que el fragmento de ADN codifica una porción de un primer marcador seleccionable contenido en el plásmido de marcado es un exón de un marcador seleccionable dominante.

5. Un método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el plásmido diana contiene los exones restantes de dicho marcador seleccionable dominante.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el plásmido de marcado contiene el tercer exón del gen de la neomicina fosfotransferasa y el plásmido diana contiene los dos primeros exones del gen de la neomicina fosfotransferasa.

7. Un método de acuerdo con la reivindicación 5, en el que al menos un ADN que codifica una proteína deseada se inserta entre dichos exones de dicho primer marcador seleccionable contenido en el plásmido diana.

8. Un método de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la proteína deseada es una proteína de mamífero.

9. Un método de acuerdo con la reivindicación 8, en el que la proteína deseada es una inmunoglobulina.

10. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicación 7 a 9, en el que un ADN que codifica un marcador seleccionable dominante adicionalmente se inserta entre los exones de dicho primer marcador seleccionable contenido en el plásmido diana, para proporcionar la coamplificación del ADN codificado que codifica la proteína deseada.

\newpage

11. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que adicionalmente comprende determinar los niveles de ARN del marcador seleccionable (c) contenido en el plásmido de marcado antes de la integración en el vector diana.

12. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que otro marcador seleccionable contenido en el plásmido de marcado es un marcador seleccionable dominante seleccionado entre el grupo compuesto por histidinol deshidrogenasa, timidina quinasa del virus del herpes simple, higromicina fosfotransferasa, adenosina desaminasa y glutamina sintetasa.

13. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la región única de ADN que proporciona recombinación homóloga es un ADN bacteriano, un ADN de insecto, un ADN vírico o un ADN sintético.

14. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la región única de ADN que proporciona recombinación homóloga no contiene ningún gen funcional.

15. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la región única de ADN que proporciona recombinación homóloga es de al menos 300 nucleótidos.

16. Un método de acuerdo con la reivindicación 15, en el que la región única de ADN oscila de aproximadamente 300 nucleótidos a 20 kb de tamaño.

17. Un método de acuerdo con la reivindicación 16, en el que la región única de ADN preferiblemente oscila de 2 a 6 kb de tamaño.

18. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el plásmido de marcado adicionalmente contiene una secuencia para endonucleasa de restricción poco frecuente que se inserta dentro de la región de homología.

19. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la célula de mamífero se selecciona entre el grupo compuesto por células de ovario de hámster chino (CHO), células de mieloma, células de riñón de cría de hámster, células COS, células NSO, células HeLa y células NIH 3T3.

20. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la célula es una célula CHO.

21. Un sistema vector para la inserción de un ADN deseado en un sitio diana en el genoma de una célula de mamífero que comprende al menos lo siguiente:

(i) un primer plásmido ("plásmido de marcado") que contiene las siguientes secuencias:

(a)

una región de ADN que es heteróloga con el genoma de la célula de mamífero de modo que cuando se integra en el genoma de la célula de mamífero proporciona un sitio único para recombinación homóloga;

(b)

un fragmento de ADN que codifica una región de una primera marcadora seleccionable; y

(c)

al menos otro ADN marcador seleccionable que proporciona la selección de la célula de mamífero que se ha integrado de forma apropiada el plásmido de marcado.

(ii) un segundo plásmido ("plásmido diana") que contiene al menos las siguientes secuencias:

(a)

una región de ADN que es idéntica o es suficientemente homóloga con la región única del plásmido de marcado de modo que esta región de ADN se pueda recombinar con dicho ADN a través de recombinación homóloga;

(b)

un fragmento de ADN que codifica una porción del mismo marcador seleccionable contenido en el plásmido de marcado en el que la proteína marcadora seleccionable activa codificada por dicho ADN sólo se produce si dicho fragmento se expresa en asociación con el fragmento de dicho ADN marcador seleccionable contenido en el plásmido de marcado;

(c)

el ADN deseado;

22. Un sistema vector de acuerdo con la reivindicación 21, en el que el primer marcador seleccionable se ayusta en al menos 3 exones.

23. Un sistema vector de acuerdo con la reivindicación 21 ó con la reivindicación 22, en el que el primer marcador seleccionable es un marcador seleccionable dominante seleccionado entre el grupo compuesto por neomicina fosfotransferasa, histidinol deshidrogenasa, dihidrofolato reductasa, higromicina fosfotransferasa, timidina quinasa del virus del herpes simple, adenosina desaminasa, glutamina sintetasa, e hipoxantina-guanina fosforibosil transferasa.

24. Un sistema vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21, 22 ó 23, en el que el fragmento de ADN que codifica una porción de un primer marcador seleccionable contenido en el plásmido de marcado es un exón de un marcador seleccionable dominante.

25. Un sistema vector de acuerdo con la reivindicación 24, en el que el plásmido diana contiene los exones restantes de dicho marcador seleccionable dominante.

26. Un sistema vector de acuerdo con la reivindicación 25, en el que el plásmido de marcado contiene el tercer exón del gen de la neomicina fosfotransferasa y el plásmido diana contiene los otros dos primeros exones del gen de la neomicina fosfotransferasa.

27. Un sistema vector de acuerdo con la reivindicación 25, en el que al menos un ADN que codifica una proteína deseada se inserta entre dichos exones de dicho primer marcador seleccionable contenidos en el plásmido diana.

28. Un sistema vector de acuerdo con la reivindicación 27, en el que la proteína deseada es una proteína de mamífero.

29. Un sistema vector de acuerdo con la reivindicación 28, en el que la proteína deseada es una inmunoglobulina.

30. Un sistema vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 27 a 29, en el que un ADN que codifica un marcador seleccionable dominante adicionalmente se inserta dentro de los exones de dicho primer marcador seleccionable contenido en el plásmido diana, para proporcionar la coamplificación del ADN codificador de la proteína deseada.

31. Un sistema vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 30, en el que el otro vector seleccionable contenido en el plásmido de marcado es un marcador seleccionable dominante seleccionado entre el grupo compuesto por histidinol deshidrogenasa, timidina quinasa del virus del herpes simple, higromicina fosfotransferasa, adenosina desaminasa y glutamina sintetasa.

32. Un sistema vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 31, en el que la región única de ADN que proporciona la recombinación homóloga es un ADN de bacteria, un ADN de insecto, un ADN viral o un ADN sintético.

33. Un sistema vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 32, en el que la región única de ADN que proporciona recombinación homóloga no contiene ningún gen funcional.

34. Un sistema vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 33, en el que la región única de ADN (a) contenida en el sistema del vector del plásmido de marcado que proporciona la recombinación homóloga es al menos de 300 nucleótidos.

35. Un sistema vector de acuerdo con la reivindicación 34, en el que la región única de ADN oscila de aproximadamente 300 nucleótidos a 20 kb de tamaño.

36. Un sistema vector de acuerdo con la reivindicación 35, en el que la región única de ADN preferiblemente oscila de 2 a 10 kb de tamaño.

37. Un sistema vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 36, en el que el plásmido de marcado adicionalmente contiene una secuencia de endonucleasa de restricción poco frecuente que se inserta dentro de la región de homología.

38. Un sistema vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 37, que proporciona la inserción de un ADN deseado en un sitio dirigido en el genoma de una célula de mamífero seleccionado entre el grupo compuesto por células de ovario de hámster chino (CHO), células de mieloma, células de riñón de cría de hámster, células COS, células NSO, células HeLa y células NIH 3T3.

39. Un sistema vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 38, en el que la célula es una célula CHO.

40. Un sistema vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 39, en un método in vitro para la inserción de un ADN deseado en un sitio diana en el genoma de una célula de mamífero, comprendiendo el método comprende las siguientes etapas:

(i) transfectar o transformar una célula de mamífero con el primer plásmido ("plásmido de marcado");

(ii) seleccionar una célula que contiene el plásmido de marcado integrado en su genoma;

(iii) transfectar o transformar dicha célula seleccionada con el segundo plásmido (plásmido diana); y

(iv) seleccionar las células que contienen el plásmido diana integrado en el sitio diana por selección de la expresión de la proteína primera marcadora seleccionable.

41. Uso de acuerdo con la reivindicación 40, en el que el método además comprende la etapa de determinar los niveles de ARN de al menos uno de los marcadores seleccionados contenidos en el plásmido de marcado, antes de la integración en el plásmido diana.