ES2243209T3

ES2243209T3 - Polinucleotido codante para auto-antigenos asociados con la endometrosis.

Info

Publication number: ES2243209T3
Application number: ES00310408T
Authority: ES
Inventors: A. Said El Shami; Surendra Nath Menon; Cynthia K. French
Original assignee: Diagnostic Products Corp
Current assignee: Siemens Medical Solutions Diagnostics Inc Canada
Priority date: 1999-11-23
Filing date: 2000-11-23
Publication date: 2005-12-01
Anticipated expiration: 2020-11-23
Also published as: DE60020499T2; WO2001007616A1; EP1106690A2; DK1106690T3; PT1106690E; AU3746000A; EP1106690B1; EP1106690A3; US7368533B2; DE60020499D1; US20030083253A1; ATE296884T1; US6525187B1

Abstract

Un polinucleótido recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido Repro-EN-1.0 de SEC ID Nº:2, donde el polipéptido se une específicamente a anticuerpos procedentes de sujetos diagnosticados de endometriosis.

Description

Polinucleótido codante para auto-antígenos asociados con la endometrosis.

Campo de la invención

Esta invención está dirigida al campo de la biología molecular en general y, más específicamente, a un polipéptido asociado con la endometriosis, a un polinucleótido aislado que codifica el polipéptido y a métodos para utilizar estas moléculas.

Antecedentes de la invención

La endometriosis es una enfermedad dolorosa que se caracteriza por la implantación ectópica de tejido endometrial funcional en la pared abdominal y en la superficie externa de varios órganos incluyendo, muy frecuentemente, el intestino inferior, los ovarios y las trompas de Falopio. P. Vigano y col. (1991) Fertility and Sterility 56:894. Actualmente, no se han identificado genes específicos de la endometriosis y los acontecimientos relativos al desarrollo de la endometriosis son poco conocidos. Sin embargo, varios informes sugieren que la menstruación retrógrada ligada a una función inmune anormal puede desempeñar un papel en el establecimiento de las lesiones endometriales ectópicas. T. Ishimaru y H. Masuzaki (1991) Am. J. Obstet. Gynecol. 165:210-214. Muchos intentos para aislar antígenos de lesiones endometriales ectópicas han fracasado debido a la naturaleza necrótica de las lesiones. WO 94/28021 describe el aislamiento de un antígeno endometrial de pacientes femeninos con endometriosis.

Se reconoce también que la endometriosis tiene un componente autoinmune. Autoanticuerpos IgG e IgA que reaccionan con múltiples antígenos endometriales han sido documentados en pacientes con endometriosis. Sin embargo, los intentos para desarrollar ensayos basados en IgG o en IgA para el diagnóstico de la endometriosis han sido infructuosos. S. Fernandez-Shaw y col. (1996) Hum. Reprod. 11:180-1184; R.A. Wild y col. (1991) Obstetrics and Gynecology 77:927. Hay estudios que han demostrado que pueden detectarse anticuerpos IgG circulantes que se unen a múltiples proteínas endometriales en mujeres con endometriosis en grados variables. Del 35% al 74% de las pacientes tienen sueros reactivos con proteínas endometriales. O. Odukoya y col. (1996) Acta Obstet. Gynecol. Scand. 75:927-931; J.G. Kim y col. (1995) Am. J. Reprod. Immunol. 34:80-87; O.A. Odukoya y col. (1995) Hum. Reprod. 10:1214-1219. Se ha demostrado también que los títulos de anticuerpos endometriales en pacientes que respondían bien al danazol son significativamente menores (7/18 (39%) de las pacientes tratadas tenían títulos elevados) que los de las pacientes con endometriosis no tratada o los de las pacientes que respondían mal al tratamiento (17/23 (74%) de las pacientes no tratadas tenían títulos elevados). A. El-Roeiy y col. (1988) Fertility and Sterility 50:864-871; H.J. Chihal y col. (1996) Fertility and Sterility 46:408-411. Además, se ha informado recientemente que mujeres con endometriosis tenían niveles elevados de IL-4, una citoquina mediadora de Th2, y que el tratamiento con danazol reducía los niveles de IL-4 en las mujeres que respondían bien al tratamiento. C.-C. Hsu y col. (1997) Fertility and Sterility 67:1059-1064.

Resumen de la invención

Esta invención proporciona una molécula de ADNc aislada y una variante ayustada de manera alternativa que codifican autoantígenos asociados con la endometriosis. El autoantígeno es denominado Repro-EN-1.0. La variante ayustada alternativamente es denominada IB1. Se ha encontrado que sujetos diagnosticados de endometriosis tenían anticuerpos que se unían específicamente al polipéptido Repro-EN-1.0 y/o a un polipéptido IB1. Estos anticuerpos representan un marcador para el diagnóstico de la endometriosis altamente sensible y específico. La proteína Repro-EN-1.0 recombinante y la proteína IB1 recombinante son útiles para detectar tales anticuerpos en inmunoensayos.

En un aspecto, esta invención proporciona un polinucleótido recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido Repro-EN-1.0 de la SEC ID Nº:2 o IB1 de la SEC ID Nº:4, donde el polipéptido se une específicamente a anticuerpos de sujetos diagnosticados de endometriosis. En una realización, la secuencia de nucleótidos es seleccionada de la secuencia de Repro-EN-1.0 de la SEC ID Nº:1 o de la secuencia de IB1 de la SEC ID Nº:3. En otra realización, la secuencia de nucleótidos es idéntica a los nucleótidos 176 a 2755 de la SEC ID Nº:1 o a los nucleótidos 176 a 2986 de la SEC ID Nº:3. En otra realización, el polinucleótido comprende además una secuencia para el control de la expresión unida operativamente a la secuencia de nucleótidos.

En otro aspecto, esta invención proporciona un par de cebadores polinucleotídicos que amplifica una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido Repro-EN-1.0 o IB1, donde el polipéptido se une específicamente a anticuerpos procedentes de sujetos diagnosticados de endometriosis. El par comprende: 1) un cebador 3' de al menos 7 nucleótidos que hibrida específicamente con el extremo 3' de la secuencia de nucleótidos o corriente abajo de la secuencia, y 2) un cebador 5' de al menos 7 nucleótidos que hibrida específicamente con el extremo 3' del complemento de la secuencia de nucleótidos o corriente abajo del complemento de la secuencia.

En otro aspecto, esta invención proporciona una célula recombinante que comprende un polinucleótido recombinante que contiene una secuencia para el control de la expresión unida operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido Repro-EN-1.0 de la SEC ID Nº:2 o IB1 de la SEC ID Nº:4, donde el polipéptido se une específicamente a anticuerpos procedentes de sujetos diagnosticados de endometriosis.

En otro aspecto, esta invención proporciona un polipéptido Repro-EN-1.0 recombinante purificado cuya secuencia de aminoácidos es idéntica a la de la SEC ID Nº:2 o a una variante alélica de la SEC ID Nº:2, o un polipéptido IB1 cuya secuencia de aminoácidos es idéntica a la de la SEC ID Nº:4 o a una variante alélica de la SEC ID
Nº:4.

En otro aspecto, esta invención proporciona un polipéptido purificado que comprende el Repro-EN-1.0 de la SEC ID Nº:2 o el IB1 de la SEC ID Nº:4, donde el polipéptido se une específicamente a anticuerpos procedentes de sujetos diagnosticados de endometriosis.

En otro aspecto, esta invención proporciona una composición que consta esencialmente de un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido Repro-EN-1.0 de la SEC ID Nº:2 o al polipéptido IB1 de la SEC ID Nº4.

En otro aspecto, esta invención proporciona un método para diagnosticar endometriosis en un sujeto. El método comprende las etapas de: (a) la detección en una muestra del sujeto de una cantidad de ensayo de un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido Repro-EN-1.0 cuya secuencia de aminoácidos es idéntica a la SEC ID Nº:2 o a una variante alélica de la SEC ID Nº:2, o al polipéptido IB1 cuya secuencia de aminoácidos es idéntica a la SEC ID Nº:4 o a una variante alélica de la SEC ID Nº:4; y (b) la comparación de la cantidad de ensayo con un rango normal del anticuerpo en una muestra control procedente de un sujeto que no padezca endometriosis. Una cantidad de ensayo por encima del rango normal proporciona una indicación positiva en el diagnóstico de endometriosis. La muestra puede ser un producto sanguíneo, por ejemplo suero, fluido peritoneal, fluido menstrual, secreción vaginal u orina. En una realización el anticuerpo es una inmunoglobulina IgE, IgG o IgG_{4}. En otra realización, la etapa de detección comprende la captura del anticuerpo de la muestra con Repro-EN-1.0 inmovilizado o con IB1 inmovilizado y la detección del anticuerpo capturado. La etapa de detección del anticuerpo capturado puede comprender la puesta en contacto del anticuerpo capturado con un anticuerpo detectable que se una específicamente a inmunoglobulinas y la detección de la unión entre el anticuerpo capturado y el anticuerpo detectable. En otra realización, la etapa de detección puede comprender la captura del anticuerpo de la muestra con un anticuerpo anti-inmunoglobulina inmovilizado y la detección del anticuerpo capturado. La etapa de detección del anticuerpo capturado puede comprender la puesta en contacto del anticuerpo capturado con Repro-EN-1.0 o IB1 y la detección de la unión entre el anticuerpo capturado y Repro-EN-1.0 o IB1.

En otro aspecto, esta invención proporciona un método para ser utilizado en el seguimiento del progreso de la endometriosis en un sujeto. El método comprende las etapas de: (a) la detección de una primera y una segunda cantidad de un anticuerpo que se una específicamente al polipéptido Repro-EN-1.0 cuya secuencia de aminoácidos es idéntica a la de la SEC ID Nº:2 o a una variante alélica de la SEC ID Nº:2, o al polipéptido IB1 cuya secuencia de aminoácidos es idéntica a la de la SEC ID Nº:4 o a una variante alélica de la SEC ID Nº:4 en muestras del sujeto una primera y una segunda vez, respectivamente; y (b) la comparación de la primera y la segunda cantidad. Un incremento entre la primera y la segunda cantidad indica una progresión de la endometriosis y una disminución entre la primera y la segunda cantidad indica remisión de la endometriosis.

En otro aspecto, esta invención proporciona un método de selección para determinar si un compuesto incrementa o disminuye la expresión de Repro-EN-1.0 de SEC ID Nº:2 o de IB1 de SEC ID Nº:4 en una célula, que comprende la puesta en contacto de la célula con el compuesto y la determinación de si incrementa o disminuye la producción de ARNm de Repro-EN-1.0 o del polipéptido Repro-EN-1.0 o del ARNm de IB1 o del polipéptido IB1.

En otro aspecto, esta invención proporciona un método para detectar formas polimórficas del Repro-EN-1.0 de SEC ID Nº:1 ó 2 o del IB1 de SEC ID Nº:3 ó 4, que comprende las etapas de: a) determinación de la identidad de un nucleótido o de un aminoácido en una posición seleccionada dentro de la secuencia de un gen o polipéptido Repro-EN-1.0 de ensayo o de un gen o polipéptido IB1 de ensayo; b) la determinación de la identidad del nucleótido o del aminoácido en la posición correspondiente del gen o del polipéptido Repro-EN-1.0 de SEC ID Nº:1 ó 2 nativo o del gen o polipéptido IB1 nativo de SEC ID Nº:3 ó 4; y c) la comparación de la identidad del gen o del polipéptido de ensayo con la identidad del gen o el polipéptido nativo, según la cual una diferencia de la identidad indica que el gen o el polipéptido de ensayo es una forma polimórfica de Repro-EN-1.0 o de
IB1.

Breve descripción de las figuras

La Fig. 1 es un análisis de Transferencia Northern de la expresión de Repro-EN-1.0 en varios tejidos.

La Fig. 2 es un análisis de Transferencia Northern de la expresión de Repro-EN-1.0 comparando varios tejidos normales frente a cancerosos.

La Fig. 3 es un análisis de Transferencia Northern de la expresión de Repro-EN-1.0 en diferentes células de cultivos de tejidos.

Descripción detallada de la invención I. Definiciones

A no ser que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el significado conocido comúnmente por las personas expertas en la técnica a la que pertenece esta invención. Las referencias siguientes proporcionan a una persona experta una definición general de muchos de los términos utilizados en esta invención: Singleton y col., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY (2ª ed. 1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY (Walker ed., 1988); THE GLOSSARY OF GENETICS, 5ª ED., R. Rieger y col. (eds.), Springer Verlag (1991); y Hale y Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY (1991). Según son utilizados en la presente, los términos siguientes tienen los significados atribuidos a los mismos a no ser que se especifique de otro modo.

"Polinucleótido" se refiere a un polímero compuesto por unidades de nucleótidos. Los polinucleótidos incluyen los ácidos nucleicos que existen en la naturaleza, tales como el ácido desoxirribonucleico ("ADN") y el ácido ribonucleico ("ARN"), así como análogos de los ácidos nucleicos. Los análogos de los ácidos nucleicos incluyen los que tienen bases que no existen de manera natural, nucleótidos que participan en enlaces con otros nucleótidos distintos del enlace fosfodiéster que tiene lugar en la naturaleza o que incluyen bases unidas mediante enlaces distintos de los enlaces fosfodiéster. De este modo, los análogos de nucleótidos incluyen, por ejemplo y sin limitación, fosforotioatos, fosforoditioatos, fosforotriésteres, fosforamiditas, boranofosfatos, metilfosfonatos, metilfosfonatos quirales, 2-O-metil ribonucleótidos, ácidos nucleicos peptídicos (PNAs) y similares. Tales polinucleótidos pueden ser sintetizados, por ejemplo, utilizando un sintetizador de ADN automatizado. El término "ácido nucleico" se refiere típicamente a polinucleótidos grandes. El término "oligonucleótido" se refiere típicamente a polinucleótidos cortos, generalmente no mayores de 50 nucleótidos aproximadamente. Se comprenderá que cuando una secuencia de nucleótidos esté representada por una secuencia de ADN (esto es, A, T, G, C), ésta incluye también una secuencia de ARN (esto es, A, U, G, C) en la que "U" sustituye a "T".

"ADNc" se refiere a un ADN que es complementario o idéntico a un ARNm, en forma de hebra sencilla o de doble hebra.

En la presente se utiliza la notación convencional para describir secuencias de polinucleótidos: el extremo izquierdo de una secuencia polinucleotídica de hebra sencilla es el extremo 5'; la dirección hacia la izquierda de una secuencia polinucleotídica de doble hebra es referida como dirección 5'. La dirección 5' a 3' de la adición de nucleótidos a transcritos de ARN nacientes es referida como dirección de transcripción. La hebra de ADN que tiene la misma secuencia que un ARNm es referida como "hebra codificadora"; las secuencias en la hebra de ADN que tiene la misma secuencia que un ARNm transcrito a partir de ese ADN y que están situadas 5' respecto al extremo 5' del transcrito de ARN son referidas como "secuencias corriente arriba"; las secuencias en la hebra de ADN que tiene la misma secuencia que el ARN y que están 3' respecto al extremo 3' del transcrito de ARN codificador son referidas como "secuencias corriente abajo".

"Complementaria" se refiere a la compatibilidad topológica o al apareamiento de superficies que interactúan de dos polinucleótidos. De este modo, las dos moléculas pueden ser descritas como complementarias y, además, las características de las superficies de contacto son complementarias entre sí. Un primer polinucleótido es complementario a un segundo polinucleótido si la secuencia de nucleótidos del primer polinucleótido es idéntica a la secuencia de nucleótidos del polinucleótido pareja de unión del segundo polinucleótido. Así, el polinucleótido cuya secuencia es 5'-TATAC-3' es complementario a un polinucleótido cuya secuencia sea 5'-GTATA-3'.

Una secuencia de nucleótidos es "sustancialmente complementaria" a una secuencia de nucleótidos de referencia, si la secuencia complementaria al nucleótido de interés es sustancialmente idéntica a la secuencia de nucleótidos de referencia.

"Codificación" se refiere a la propiedad inherente de secuencias específicas de nucleótidos en un polinucleótido, tal como un gen, un ADNc o un ARNm, de servir como moldes para la síntesis de otros polímeros y macromoléculas en procesos biológicos que tienen una secuencia de nucleótidos definida (esto es, ARNr, ARNt y ARNm) o una secuencia de aminoácidos definida y las propiedades biológicas resultantes de las mismas. Por tanto, un gen codifica una proteína si la transcripción y la traducción del ARNm producido por ese gen produce la proteína en una célula o en otro sistema biológico. La hebra codificadora, cuya secuencia de nucleótidos es idéntica a la secuencia del ARNm y se proporciona normalmente en los listados de secuencias, y la hebra no codificadora, utilizada como molde para la transcripción, de un gen o de un ADNc pueden ser referidas ambas como codificadoras de la proteína o de otro producto de ese gen o de ese ADNc. A no ser que se especifique de otro modo, una "secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos" incluye todas las secuencias de nucleótidos que son versiones degeneradas de cada una de las otras y que codifican la misma secuencia de aminoácidos. Las secuencias de nucleótidos que codifican proteínas y ARN pueden incluir intrones.

"Polinucleótido recombinante" se refiere a un polinucleótido que tiene secuencias que no están unidas de manera natural. Un polinucleótido recombinante amplificado o ensamblado puede ser incluido en un vector adecuado, y el vector puede ser utilizado para transformar una célula huésped adecuada. Una célula huésped que contenga el polinucleótido recombinante es referida como "célula huésped recombinante". El gen es posteriormente expresado en la célula huésped recombinante para producir, por ejemplo, un "polipéptido recombinante". Un polinucleótido recombinante puede tener también una función no codificadora (por ejemplo, promotor, origen de replicación, sitio de unión de ribosomas, etc.).

"Secuencia para el control de la expresión" se refiere a una secuencia de nucleótidos dentro de un polinucleótido que regula la expresión (transcripción y/o traducción) de una secuencia de nucleótidos unida operativamente a la misma. "Unida operativamente" se refiere a una relación funcional entre dos partes en la que la actividad de una parte (por ejemplo, la capacidad para regular la transcripción) tiene como resultado una acción sobre la otra parte (por ejemplo, la transcripción de la secuencia). Las secuencias para el control de la expresión pueden incluir, por ejemplo y sin limitación, secuencias de promotores (por ejemplo, inducibles o constitutivos), intensificadores, terminadores de la transcripción, un codón de inicio (esto es, ATG), señales de ayuste para intrones y codones de pa-
rada.

"Vector de expresión" se refiere a un vector que comprende un polinucleótido recombinante conteniendo secuencias para el control de la expresión unidas operativamente a una secuencia de nucleótidos que va a ser expresada. Un vector de expresión contiene suficientes elementos para la expresión que actúan en cis; otros elementos para la expresión pueden ser proporcionados por la célula huésped o por un sistema de expresión in vitro. Los vectores de expresión incluyen todos aquellos conocidos en la técnica tales como cósmidos, plásmidos (por ejemplo, desnudos o contenidos en liposomas) y virus que incorporan el polinucleótido recombinante.

"Amplificación" se refiere a cualquier medio mediante el cual una secuencia polinucleotídica es copiada y expandida por tanto para dar un mayor número de moléculas de polinucleótido, por ejemplo, mediante transcripción inversa, reacción en cadena de la polimerasa y reacción en cadena de la ligasa.

"Cebador" se refiere a un polinucleótido que es capaz de hibridar específicamente con un molde polinucleotídico designado y proporcionar un punto de inicio para la síntesis de un polinucleótido complementario. Tal síntesis tiene lugar cuando el cebador polinucleotídico es colocado bajo condiciones en las que se induce la síntesis, esto es, en presencia de nucleótidos, de un molde polinucleotídico complementario y de un agente para polimerización tal como una ADN polimerasa. Un cebador es típicamente de hebra sencilla, pero puede ser de doble hebra. Los cebadores son típicamente ácidos desoxirribonucleicos, pero una amplia variedad de cebadores sintéticos y existentes en la naturaleza son útiles para muchas aplicaciones. Un cebador es complementario al molde para el que está diseñado que hibride con el fin de servir como sitio de inicio de la síntesis, pero no necesita reflejar la secuencia exacta del molde. En tal caso, la hibridación específica del cebador al molde depende de la severidad de las condiciones de hibridación. Los cebadores pueden ser marcados con, por ejemplo, restos cromogénicos, radioactivos o fluorescentes y ser utilizados como restos detectables.

"Sonda", cuando se utiliza con referencia a un polinucleótido, se refiere a un polinucleótido que es capaz de hibridar específicamente con una secuencia designada de otro polinucleótido. Una sonda hibrida específicamente con un polinucleótido complementario diana, pero no necesita reflejar la secuencia complementaria exacta del molde. En tal caso, la hibridación específica de la sonda a la diana depende de la severidad de las condiciones de hibridación. Las sondas pueden ser marcadas con, por ejemplo, restos cromogénicos, radioactivos o fluorescentes y ser utilizadas como restos detectables.

Una primera secuencia es una "secuencia antisentido" con respecto a una segunda secuencia, si un polinucleótido cuya secuencia es la primera secuencia hibrida específicamente con un polinucleótido cuya secuencia es la segunda secuencia.

"Hibridar específicamente con" o "hibridación específica" o "hibridar selectivamente con", se refieren a la unión, formación de moléculas de doble hebra o hibridación de una molécula de ácido nucleico preferencialmente con una secuencia de nucleótidos particular bajo condiciones rigurosas cuando esa secuencia está presente en una mezcla compleja de ADN o ARN (por ejemplo, celular total).

El término "condiciones rigurosas" se refiere a las condiciones bajo las cuales una sonda hibridará preferencialmente con su subsecuencia diana, y en menor grado con, o en absoluto con, otras secuencias. "Hibridación rigurosa" y "condiciones de lavado de una hibridación rigurosa" en el contexto de los experimentos de hibridación de ácidos nucleicos, tales como hibridación Southern y Northern, dependen de la secuencia y son diferentes bajo diferentes parámetros ambientales. Una extensa guía de la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acids Probes parte I, capítulo 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, New York. Generalmente, las condiciones de hibridación y lavado muy rigurosas son seleccionadas para que sean 5ºC aproximadamente por debajo del punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a una fuerza iónica y a un pH definidos. La Tm es la temperatura (bajo una fuerza iónica y un pH definidos) a la cual el 50% de la secuencia diana hibrida con una sonda perfectamente acoplada. Se seleccionan condiciones muy rigurosas que equivalgan a la Tm para una sonda particular.

Un ejemplo de condiciones de hibridación rigurosas para la hibridación de ácidos nucleicos complementarios que tengan más de 100 residuos complementarios sobre un filtro en una transferencia Southern o Northern son formalina al 50% con 1 mg de heparina a 42ºC, llevándose a cabo la hibridación durante una noche. Un ejemplo de condiciones de lavado muy rigurosas es NaCl 0,15 M a 72ºC durante 15 minutos aproximadamente. Un ejemplo de condiciones de lavado rigurosas es un lavado con SSC 0,2X a 65ºC durante 15 minutos (ver, Sambrook y col. para una descripción del tampón SSC). A menudo, un lavado muy riguroso está precedido por un lavado poco riguroso para eliminar la señal de fondo de la sonda. Un ejemplo de lavado de rigurosidad media para un dúplice de, por ejemplo más de 100 nucleótidos, es SSC 1X a 45ºC durante 15 minutos. Un ejemplo de un lavado de baja rigurosidad para un dúplice de, por ejemplo, más de 100 nucleótidos, es SSC 4-6X a 40ºC durante 15 minutos. En general, una proporción de la señal respecto al de ruido de 2X (o superior) de la observada para una sonda no relacionada en el ensayo de hibridación particular, indica la detección de una hibridación específica.

"Polipéptido" se refiere a un polímero compuesto por residuos de aminoácidos, variantes estructurales relacionadas que existen en la naturaleza y análogos sintéticos de los mismos no existentes en la naturaleza unidos mediante enlaces peptídicos, variantes estructurales relacionadas existentes en la naturaleza y análogos sintéticos de los mismos no existentes en la naturaleza. Los polipéptidos sintéticos pueden ser sintetizados, por ejemplo, utilizando un sintetizador de polipéptidos automatizado. El término "proteína" se refiere típicamente a polipéptidos grandes. El término "péptido" se refiere típicamente a polipéptidos cortos.

En la presente se utiliza la notación convencional para representar secuencias de polipéptidos: el extremo izquierdo de una secuencia polipeptídica es el extremo amino; el extremo derecho de una secuencia polipeptídica es el extremo carboxilo.

"Variante alélica" se refiere a cualquiera de dos o más formas polimórficas de un gen que ocupan el mismo locus genético. Las variaciones alélicas se producen de manera natural mediante mutación y pueden tener como resultado un polimorfismo fenotípico en las poblaciones. Las mutaciones génicas pueden ser silentes (no hay cambio en el polipéptido codificado) o pueden condificar polipéptidos con secuencias de aminoácidos alteradas. "Variantes alélicas" se refieren también a ADNcs derivados de transcritos de ARNm de variantes alélicas genéticas, así como a las proteínas codificadas por los mismos.

Los términos "idénticas" o porcentaje de "identidad" en el contexto de dos o más secuencias polinucleotídicas o polipeptídicas, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son las mismas o que tienen un porcentaje especificado de nucleótidos o de residuos de aminoácidos que son los mismos, cuando se comparan y alinean para determinar la correspondencia máxima, según se mide utilizando uno de los algoritmos siguientes para comparación de secuencias o mediante inspección visual.

"Anticuerpo" se refiere a un ligando polipeptídico codificado sustancialmente por un gen de inmunoglobulina o por genes de inmunoglobulina, o a fragmentos del mismo, que se une específicamente a, y reconoce, un epítopo (por ejemplo, un antígeno). Los genes de inmunoglobulina reconocidos incluyen genes de la región constante de las cadenas ligeras kappa y lambda, los genes de la región constante de las cadenas pesadas alfa, gamma, delta, epsilon y mu, y la miríada de genes de la región variable de las inmunoglobulinas. Los anticuerpos existen, por ejemplo, como inmunoglobulinas intactas o como varios fragmentos bien caracterizados producidos por la digestión con varias peptidasas. Éstos incluyen, por ejemplo, los fragmentos Fab' y F(ab)'2. El término "anticuerpo", según se utiliza en la presente, incluye también fragmentos de anticuerpo producidos por la modificación de anticuerpos completos o los sintetizados de novo utilizando metodologías de ADN recombinante. Incluye también anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados. La porción "Fc" de un anticuerpo se refiere a aquella porción de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene uno o más dominios de la región constante de la cadena pesada, CH1, CH2 y CH3, pero no incluye la región variable de la cadena pe-
sada.

Un ligando o un receptor (por ejemplo, un anticuerpo) "se une específicamente a" o "es específicamente inmunorreactivo con" un compuesto analito cuando el ligando o el receptor funciona en una reacción de unión que es determinativa de la presencia del analito en una muestra de compuestos heterogéneos. De este modo, bajo condiciones de ensayo designadas (por ejemplo un inmunoensayo), el ligando o el receptor se une preferencialmente a un analito particular y no se une en una cantidad significativa a otros compuestos presentes en la muestra. Por ejemplo, un polinucleótido se une específicamente bajo condiciones de hibridación a un analito polinucleotídico que contenga una secuencia complementaria; un anticuerpo se une específicamente bajo condiciones de inmunoensayo a un analito antigénico portador de un epítopo contra el cual se produjo el anticuerpo; y un adsorbente se une específicamente a un analito bajo condiciones apropiadas de elución.

"Inmunoensayo" se refiere a un método para detectar un analito en una muestra en la cual la especificidad por el analito es conferida por la unión específica entre un anticuerpo y un ligando. Esto incluye la detección de un analito anticuerpo a través de la unión específica entre el anticuerpo y un ligando. Ver Harlow y Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York, para una descripción de formatos y condiciones de inmunoensayo que pueden utilizarse para determinar inmunorreactividad específica.

"Sustancialmente pura" o "aislada" indica que una especie de interés es la especie predominante presente (esto es, molarmente, más abundante que cualquier otra especie macromolecular individual de la composición), y una fracción sustancialmente purificada es una composición en la que la especie de interés comprende al menos un 50% aproximadamente (molarmente) de todas las especies macromoleculares presentes. Generalmente, una composición sustancialmente pura significa que del 80% al 90% aproximadamente o más de la especie macromolecular presente en la composición es la especie purificada de interés. La especie de interés es purificada hasta una homogeneidad esencial (las especies contaminantes no pueden ser detectadas en la composición mediante métodos de detección convencionales) si la composición consta esencialmente de una única especie macromolecular. Las especies disolventes, las moléculas pequeñas (<500 Daltons), los estabilizantes (por ejemplo, BSA) y las especies iónicas elementales no son consideradas especies macromoleculares para los fines de esta definición.

"Existente de forma natural", aplicado a un objeto, se refiere al hecho de que el objeto puede ser encontrado en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia polipeptídica o polinucleotídica que esté presente en un organismo (incluyendo virus) y que pueda ser aislada de una fuente de la naturaleza y que no haya sido modificada intencionadamente por el hombre en el laboratorio, existe de forma natural.

"Detección" se refiere a la determinación de la presencia, la ausencia o la cantidad de una analito en una muestra y puede incluir la cuantificación de la cantidad del analito en una muestra o por célula en una muestra.

"Resto detectable" o "marca" se refiere a una composición detectable por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos o químicos. Por ejemplo, marcas útiles incluyen ^{32}P, ^{35}S, colorantes fluorescentes, reactivos densos a los electrones, enzimas (por ejemplo, como los utilizados comúnmente en un ELISA), biotina-estreptavidina, dioxigenina, haptenos y proteínas para los que están disponibles antisueros o anticuerpos monoclonales, o moléculas de ácido nucleico con una secuencia complementaria a una diana. El resto detectable genera a menudo una señal medible, tal como una señal radioactiva, cromogénica o fluorescente, que puede ser utilizada para cuantificar la cantidad de resto detectable unido en una muestra. El resto detectable puede ser incorporado o unido a un cebador o a una sonda covalentemente o mediante enlaces iónicos, de van der Waals o de hidrógeno, por ejemplo la incorporación de nucleótidos radioactivos o de nucleótidos biotinilados que son reconocidos por estreptavidina. El resto detectable puede ser detectable directamente o indirectamente. La detección indirecta puede implicar la unión de un segundo resto detectable directamente o indirectamente al resto detectable. Por ejemplo, el resto detectable puede ser el ligando de una pareja de unión, tal como biotina que es una pareja de unión de estreptavidina, o una secuencia de nucleótidos que es la pareja de unión de una secuencia complementaria, con la cual puede hibridar específicamente. La pareja de unión puede ser ella misma directamente detectable, por ejemplo un anticuerpo puede estar marcado con una molécula fluorescente. La pareja de unión puede ser también detectable de manera indirecta, por ejemplo un ácido nucleico que tenga una secuencia de nucleótidos complementaria puede ser parte de una molécula de ADN ramificada que es a su vez detectable mediante la hibridación con otras moléculas de ácido nucleico marcadas. (Ver, por ejemplo, P.D. Fahrlander y A. Klausner, Bio/Technology (1988) 6:1165). La cuantificación de la señal se lleva a cabo mediante, por ejemplo, contaje de centelleo, densitometría o citometría de
flujo.

Un "sujeto" para diagnóstico o tratamiento es un mamífero humano o no humano. El sujeto mamífero no humano para diagnóstico o tratamiento incluye, por ejemplo, primates, ungulados, caninos y felinos.

"Diagnóstico" significa identificar la presencia o la naturaleza de una condición patológica. Los métodos de diagnóstico difieren en su sensibilidad y su especificidad. La "sensibilidad" de un ensayo de diagnóstico es el porcentaje de individuos enfermos que dan positivo en el ensayo (porcentaje de positivos auténticos). La "especificidad" de un ensayo de diagnóstico es 1 menos la tasa de falsos positivos, donde la tasa de falsos positivos se define como la proporción de aquellos individuos sin enfermedad que dan positivo en el ensayo. Aunque un método de diagnóstico particular puede no proporcionar un diagnóstico definitivo de una condición, es suficiente si el método proporciona una indicación positiva que ayuda al diagnóstico.

"Pronóstico" significa predecir el desarrollo probable de una condición patológica (por ejemplo, la gravedad).

"Cantidad de ensayo" se refiere a la cantidad de un analito en una muestra de interés, que es comparada posteriormente con una cantidad normal del analito en una muestra (por ejemplo, de un individuo sano), de tal manera que la comparación relativa de los valores proporciona un valor de referencia para el diagnóstico de una enfermedad designada. Dependiendo del método de detección, la cantidad de ensayo puede ser una determinación de la cantidad del analito, pero no es necesariamente una cantidad. La cantidad de ensayo puede ser también un valor relativo, tal como una puntuación más o menos, e incluye también una cantidad que indica la presencia o ausencia del analito en una muestra.

"Cantidad normal" se refiere a una cantidad o a un rango de un analito en una muestra biológica que indica salud o ausencia de patología.

"Cantidad diagnóstica" se refiere a una cantidad de un analito en una muestra de interés que es consistente con un diagnóstico particular de una enfermedad designada.

"Cantidad pronóstica" se refiere a una cantidad o a un rango de un analito en una muestra de interés que es consistente con un pronóstico particular de una enfermedad designada.

"Pluralidad" significa al menos dos.

Un "epítopo" es una porción de una molécula que se une específicamente a un anticuerpo o un receptor de células T. Un epítopo peptídico comprende generalmente una secuencia de al menos 6 aminoácidos de un polipéptido, aunque péptidos más largos y más cortos pueden constituir epítopos.

II. ADNc que codifica Repro-EN-1.0 e IB1

Hemos aislado una molécula de ADNc que codifica un autoantígeno asociado con endometriosis. El autoantígeno es denominado Repro-EN-1.0. La presencia de anticuerpos que se unan específicamente a un epítopo del polipéptido Repro-EN-1.0 es un marcador altamente sensible y específico para el diagnóstico de endometriosis.

Los polinucleótidos que codifican Repro-EN-1.0 de longitud completa son útiles para la producción recombinante de Repro-EN-1.0.

El polipéptido Repro-EN-1.0 es útil como control positivo en ensayos de diagnóstico para detectar anticuerpos que se unan específicamente a Repro-EN-1.0 en muestras de suero de pacientes. El polipéptido es también útil como inmunógeno para inducir la producción de anticuerpos contra epítopos de la proteína.

Siguen a continuación la secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº:1) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEC ID Nº:2) de Repro-EN-1.0:

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Esta secuencia de nucleótidos de 3164 bases contiene un marco de lectura abierto de 2580 nucleótidos que codifica Repro-EN-1.0 desde el nucleótido 176 hasta el nucleótido 2755. La secuencia de aminoácidos deducida de Repro-EN-1.0 tiene 860 aminoácidos. Repro-EN-1.0 tiene una masa molecular calculada de 96,4 kD y un pI de 5,08.

El gen de Repro-EN-1.0 codifica un ARNm de 3,4 kb. Este ARNm es expresado primariamente en músculo esquelético, corazón y testículo, y en menor grado en otros tejidos. Sin embargo, no se detecta en pulmón ni en células mononucleares de sangre periférica (PBMC).

El análisis de la secuencia de aminoácidos deducida de Repro-EN-1.0 no muestra identidad de secuencias significativa con ninguna otra proteína.

Existe una variante ayustada alternativamente que fue aislada de una biblioteca de ADNc de corazón humano. Esta variante es denominada IB1 y es útil de la misma manera que la secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº:1) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEC ID Nº:2) de Repro-EN-1.0. La secuencia de IB1 fue aislada de una biblioteca de ADNc de corazón mediante selección con una sonda de ácido nucleico obtenida de la secuencia de Repro-EN-1.0. La secuencia de IB1 es diferente de la secuencia de Repro-EN-1.0 en cuanto a que contiene un exón adicional de 231 pb insertado en la secuencia de ADNc en la posición 1555. Por tanto, la secuencia de IB1 tiene propiedades similares pero es ligeramente mayor.

Siguen a continuación la secuencia de nucleótidos (SEC ID Nº:3) y la secuencia de aminoácidos deducida (SEC ID Nº:4) de IB1:

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(Secuencia pasa a página siguiente)

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Variante Ayustada Alternativamente, IB1, de una Biblioteca de Corazón

: El ADNc de IB1 tiene 3.395 pares de bases

: El marco de lectura abierto de IB1 tiene 2.811 nucleótidos

: El marco de lectura abierto de IB1 mapea desde el nucleótido 176 al 2.986

: La secuencia de aminoácidos deducida de IB1 tiene 937 aminoácidos

: La masa molecular calculada de la proteína IB1 es de 104.969 Daltons (105 kD)

: El pI calculado de la proteína IB1 es 5,17.

El análisis de la secuencia de aminoácidos identificó varios motivos de aminoácidos que serán obvios para los expertos en la técnica, incluyendo un dominio de unión a ADN de myb 1, un sitio de WD40, una secuencia de adhesión celular RGD, un sitio de N-miristolilación y varios sitios de fosforilación y glucosilación. El análisis muestra también que la proteína es en gran parte hidrofílica. Esto implica que la mayoría de la secuencia de aminoácidos está expuesta al sistema inmune y puede ser reconocida como epítopo.

El análisis de los marcadores de secuencias expresadas (ESTs) de una base de datos pública (Genbank) identificó muchas ESTs solapantes que, juntas, cubrían la mayor parte de la secuencia del ADNc de Repro-EN-1.0.

III. Ácidos nucleicos de Repro-EN-1.0 e IB1

Esta invención proporciona polinucleótidos recombinantes que contienen una secuencia de nucleótidos que codifica las proteínas Repro-EN-1.0 e IB1 según se describe en la presente. Los polinucleótidos son útiles para expresar el ARNm o los polipéptidos que codifican y para la preparación de sondas o cebadores, entre otras cosas.

En una realización, la molécula polinucleotídica recombinante comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido Repro-EN-1.0 de SEC ID Nº:2 o IB1 de SEC ID Nº:4.

La secuencia de nucleótidos puede ser idéntica a una secuencia del ADNc de Repro-EN-1.0 o su complemento, o a una secuencia de ADNc de IB1 o su complemento, o puede incluir codones degenerados. En una realización de una secuencia de nucleótidos que codifica Repro-EN-1.0 o IB1 de longitud completa, la secuencia es idéntica a la secuencia codificadora de Repro-EN-1.0 de SEC ID Nº:1 o de IB1 de SEC ID Nº:3.

En otra realización, el polinucleótido codifica una proteína de fusión entre el polipéptido Repro-EN-1.0 o IB1 o secuencias de aminoácidos análogas a Repro-EN-1.0 o a IB1 y una segunda secuencia de aminoácidos. La segunda secuencia de aminoácidos puede ser, por ejemplo, una marca detectable tal como una proteína fluorescente, un marcador enzimático o una proteína de un sistema de dos híbridos.

Los polinucleótidos de la presente invención son clonados o amplificados mediante métodos in vitro tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la reacción en cadena de la ligasa (LCR), el sistema de amplificación basado en la transcripción (TAS), el sistema de replicación de secuencias autosostenidas (3SR) y el sistema de amplificación de la replicasa Q\beta (QB). Por ejemplo, un polinucleótido que codifica la proteína puede ser aislado mediante la reacción en cadena de la polimerasa de ADNc procedente de una línea celular de carcinoma endometrial humano utilizando cebadores basados en la secuencia de ADN de Repro-EN-1.0 de SEC ID Nº:1. Un par de cebadores útil para amplificar el ADN de Repro-EN-1.0, incluyendo variantes alélicas, es:

Sentido corriente arriba: 5'-caggacacagatgacagtgat-3' (SEC ID Nº:5)

Antisentido corriente abajo: 5'-agagccttctgatctgtcac-3' (SEC ID Nº:6).

Una amplia variedad de metodologías de clonaje y de amplificación in vitro son bien conocidas por las personas con experiencia. Los métodos de PCR están descritos en, por ejemplo, la Patente de EE.UU. Nº 4.683.195; Mullis y col. (1987) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263; y Erlich, ed., PCR Technology (Stockton Press, NY, 1989). Un formato útil es la PCR en tiempo real. Ver, por ejemplo, Luch y col. (1997) J. Molec. Endocrinol. 18:77-85 y Arold y col. (1997) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 94:2438-43. Los polinucleótidos pueden ser aislados también mediante un proceso de selección de bibliotecas de ADN genómico o de ADNc con sondas seleccionadas de las secuencias de SEC ID Nº:1 bajo condiciones de hibridación rigurosas.

Pueden producirse versiones mutantes de las proteínas mediante mutagénesis específica de un sitio de otros polinucleótidos que codifican las proteínas, o mediante mutagénesis aleatoria producida mediante el incremento de la tasa de error de la PCR del polinucleótido original con MnCl_{2} 0,1 mM y concentraciones de nucleótidos no equilibradas.

Esta invención proporciona también vectores de expresión, por ejemplo moléculas de polinucleótidos recombinantes que contienen secuencias para el control de la expresión unidas operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido diana. Los vectores de expresión pueden ser adaptados para que funcionen en procariotas o eucariotas mediante la inclusión de promotores apropiados, de secuencias de replicación, marcadores, etc., para la transcripción y la traducción del ARNm. La construcción de vectores de expresión y la expresión de genes en células transfectadas implica la utilización de técnicas de clonaje molecular bien conocidas también en el oficio. Sambrook y col., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) y Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel y col., eds. (Current Protocols, una compañía conjunta entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc.). Promotores útiles para tales fines incluyen un promotor de la metalotioneína, un promotor tardío principal constitutivo de adenovirus, un promotor de MMTV inducible por dexametasona, un promotor de SV40, un promotor polIII de MRP, un promotor constitutivo de MPSV, un promotor de CMV inducible por tetraciclina (tal como el promotor temprano inmediato humano de CMV) y un promotor constitutivo de CMV.

Los métodos para transfectar genes en células de mamífero y obtener su expresión para utilización in vitro o para terapia génica son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Methods in Enzymology, vol. 185, Academic Press, Inc., San Diego, CA (D.V. Goeddel, ed.) (1990) o M. Krieger, Gene Transfer and Expression - A Laboratory Manual, Stockton Press, New York, NY (1990).

Los vectores de expresión útiles en esta invención dependen de su uso deseado. Tales vectores de expresión deben contener, por supuesto, señales de expresión y replicación compatibles con la célula huésped. Los vectores de expresión útiles para expresar la proteína de esta invención incluyen vectores víricos tales como virus alfa, retrovirus, adenovirus y virus adenoasociados, vectores plasmídicos, cósmidos, liposomas y similares. Se prefieren los vectores víricos y plasmídicos para transfectar células de mamífero. El vector de expresión pcDNA1 (Invitrogen, San Diego, CA), en el que la secuencia para el control de la expresión comprende el promotor de CMV, proporciona buenas tasas de transfección y expresión. Los vectores víricos adenoasociados son útiles en los métodos de terapia génica de esta invención.

La construcción puede contener también una marca con el fin de simplificar el aislamiento de la proteína. Por ejemplo, puede incorporarse al extremo aminoterminal de la proteína una marca de polihistidina de, por ejemplo, seis residuos de histidina. La marca de polihistidina permite el aislamiento idóneo de la proteína en una única etapa mediante cromatografía en quelato de níquel.

En otra realización, los genes endógenos son transcritos mediante la unión operativa de los mismos a secuencias para el control de la expresión suministradas endógenamente que se recombinan con el ADN genómico. En un método, se proporciona a la célula un polinucleótido recombinante que contiene una secuencia diana, que permite la recombinación homóloga en el genoma corriente arriba del sitio de inicio de la transcripción del gen diana; las secuencias para el control de la expresión; un exón del gen diana y un sitio donante de ayuste no apareado que se aparea con un aceptor de ayuste en el gen diana. Tales métodos están discutidos en Treco y col., WO 94/12650; Treco y col., WO 95/31560 y Treco y col., WO 96/29411.

La invención proporciona también células recombinantes que contienen un vector de expresión para la expresión de las secuencias de nucleótidos que codifican un polinucleótido de esta invención. Las células huésped pueden ser seleccionadas por niveles elevados de expresión con el fin de purificar la proteína. Para este fin se prefieren células de mamífero, pero son también útiles células procarióticas tales como E. coli. La célula puede ser, por ejemplo, una célula recombinante en cultivo o una célula in vivo.

IV. Sondas y cebadores polinucleotídicos

Esta invención proporciona sondas y cebadores polinucleotídicos que hibridan específicamente con una subsecuencia del ADNc de Repro-EN-1.0 o su complemento o con una subsecuencia del ADNc de IB1 o su complemento, bajo condiciones de hibridación rigurosas. Las sondas y cebadores de esta invención son polinucleótidos de al menos 7 nucleótidos, al menos 10 nucleótidos, al menos 15 nucleótidos, al menos 20 nucleótidos o al menos 25 nucleótidos. En una realización, la secuencia del polinucleótido es una secuencia contigua de la SEC ID Nº:1 o su complemento. Cualquier región adecuada del gen de Repro-EN-1.0 o del gen de IB1 puede ser elegida como diana para la hibridación de polinucleótidos. Pueden incorporarse a los polinucleótidos sustituciones, deleciones y adiciones de nucleótidos, siempre que conserve la capacidad característica para hibridar específicamente con la secuencia diana o su complemento. La variación de la secuencia de nucleótidos puede ser el resultado de polimorfismos de secuencia de varios alelos, de pequeños errores de secuenciación y similares.

Las sondas y cebadores de la invención son útiles como sondas en ensayos de hibridación tales como las transferencias Southern y Northern, para identificar polinucleótidos que tengan una secuencia de nucleótidos que codifique un polipéptido Repro-EN-1.0 o IB1, y como cebadores para procedimientos de amplificación. Las sondas y cebadores de la invención son también útiles para detectar la presencia, ausencia o cantidad de Repro-EN-1.0 o de IB1 en biopsias y secciones histológicas de tejidos, en las que el método de detección es llevado a cabo in situ, típicamente después de la amplificación de secuencias de Repro-EN-1.0 o IB1 utilizando un conjunto de cebadores.

Las sondas y cebadores de esta invención son también útiles para identificar formas alélicas de Repro-EN-1.0 y genes cognados de animales o de IB1 y genes cognados de animales. Las sondas y cebadores pueden ser utilizados para someter a selección bibliotecas de ADN genómico o de ADNc humano o de animales bajo, por ejemplo, condiciones rigurosas. Las moléculas de ADN que hibridan específicamente con la sonda son posteriormente examinadas de manera adicional para determinar si son variantes alélicas de Repro-EN-1.0 o cognados de animales, o variantes alélicas de IB1 o cognados de animales.

Las sondas son también útiles en matrices de oligonucleótidos. Tales matrices son utilizadas en ensayos de hibridación para comprobar la identidad de las bases en un polinucleótido diana. En esencia, cuando una diana hibrida perfectamente con una sonda de la matriz, la diana contiene la secuencia de nucleótidos de la sonda. Cuando la diana hibrida menos bien, o no hibrida en absoluto, entonces la diana y la sonda difieren en sus secuencias en uno o más nucleótidos. Mediante una correcta selección de sondas, pueden comprobarse las bases de una molécula diana. Ver, por ejemplo, Chee y col., WO 95/11995. La utilización de la secuencia de Repro-EN-1.0 o de IB1 en genómica se describe adicionalmente más adelante.

En una realización, el polinucleótido es detectable directamente o indirectamente a través de un resto detectable. Un resto detectable unido a un cebador o a una sonda oligonucleotídicos es utilizado posteriormente para detectar la hibridación de un cebador oligonucleotídico al componente ARN. La detección de material marcado unido a un polinucleótido Repro-EN-1.0 o IB1 en una muestra proporciona un medio para determinar un valor diagnóstico o pronóstico.

Aunque los cebadores y las sondas pueden diferir en secuencia y longitud, el factor primario de diferenciación es la función: los cebadores sirven como punto de inicio para la síntesis de ADN de un polinucleótido diana, como ocurre en las reacciones de RT y PCR, mientras que las sondas son utilizadas típicamente para la hibridación a, y la detección de, un polinucleótido diana. Las longitudes típicas de los cebadores o sondas pueden variar de 7-50 nucleótidos, preferiblemente de 10-40 nucleótidos y muy preferiblemente de 15-35 nucleótidos. Un cebador o una sonda pueden ser marcados también con un resto detectable para detectar la hibridación del cebador o de la sonda al polinucleótido diana.

En general, los expertos en la técnica reconocerán que los polinucleótidos utilizados en la invención incluyen moléculas de ADN y ARN y modificaciones de las mismas existentes en la naturaleza, así como análogos sintéticos de las mismas que no existen en la naturaleza y heteropolímeros de desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos y/o análogos de los mismos. La composición particular de un polinucleótido o de un análogo de polinucleótido dependerá del fin para el cual se utilizará el material y del entorno en el que se será situado el material. Se han diseñado nucleótidos modificados o sintéticos, no existentes en la naturaleza, con el fin de que sirvan para una variedad de objetivos y para que permanezcan estables en una variedad de entornos ambientales, tales como aquéllos en los que están presentes nucleasas.

Los oligonucleótidos son sintetizados preferiblemente, por ejemplo, en un sintetizador de oligonucleótidos de Applied Biosystems o en otro sintetizador de oligonucleótidos comercialmente disponible, de acuerdo con las especificaciones proporcionadas por el fabricante. Los oligonucleótidos pueden ser preparados utilizando cualquier método adecuado, tal como el método de los fosfotriésteres y el método de los fosfodiésteres, o realizaciones automatizadas de los mismos. En una de tales realizaciones automatizadas, se utilizan como materiales de partida dietilfosforamidatos y pueden ser sintetizados según está descrito por Beaucage y col., Tetrahedron Letters 22:1859 (1981) y Patente de EE.UU. Nº 4.458.066.

Los polinucleótidos, por ejemplo sondas, pueden ser también producidos recombinantemente mediante la utilización de plásmidos u otros vectores.

En un aspecto, esta invención proporciona una sonda que hibrida específicamente con la región 5' no traducida de Repro-EN-1.0 o IB1, con la región codificadora de Repro-EN-1.0 o IB1 o con una región de Repro-EN-1.0 o IB1 que codifique un epítopo del polipéptido Repro-EN-1.0 o IB1.

En otro aspecto, esta invención proporciona un par de cebadores que amplifica una secuencia de nucleótidos que codifica un epítopo polipeptídico de Repro-EN-1.0 o IB1 reconocido por un anticuerpo procedente de un individuo diagnosticado de endometriosis. Un par de cebadores que amplifica una secuencia de nucleótidos particular (dada en la orientación 5' a 3') incluye un cebador 5' y un cebador 3'. El cebador 3' hibrida con el extremo 3' de la secuencia de nucleótidos o corriente abajo del mismo. El cebador 5' hibrida con el extremo 3' del complemento de la secuencia de nucleótidos o corriente abajo del mismo. De esta forma, los cebadores pueden amplificar un polinucleótido que comprenda la secuencia de nucleótidos. Se ha identificado una secuencia de nucleótidos que codifica un epítopo polipeptídico de Repro-EN-1.0 dentro de los 2,2 kb aproximadamente desde el extremo 3' de la secuencia codificadora de Repro-EN-1.0 (SEC ID Nº:1).

V. Polipéptidos Repro-EN-1.0 e IB1

Esta invención proporciona también polipéptidos Repro-EN-1.0 e IB1 recombinantes purificados. La invención proporciona polipéptidos Repro-EN-1.0 recombinantes que incluyen el polipéptido cuya secuencia de aminoácidos está presentada en la SEC ID Nº:2, así como variantes alélicas de la misma.

Un polipéptido Repro-EN-1.0 se refiere al Repro-EN-1.0 nativo, el polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº:2, y a variantes alélicas del mismo. Las moléculas de polinucleótidos que codifican variantes alélicas de Repro-EN-1.0 son aislables de ADNc o de ADN genómico de células de cáncer endometrial e hibridan típicamente bajo condiciones rigurosas con la secuencia de nucleótidos que codifica Repro-EN-1.0 (SEC ID Nº:1). Pueden ser obtenidas mediante amplificación utilizando, por ejemplo, cebadores de PCR tomados de la secuencia de Repro-EN-1.0 descrita en la presente.

Los polipéptidos Repro-EN-1.0 son útiles como inmunógenos para inducir la producción de anticuerpos anti-Repro-EN-1.0, como moléculas para captura por afinidad con el fin de aislar tales anticuerpos de una mezcla y como controles en métodos de diagnóstico dirigidos a detectar Repro-EN-1.0 en una muestra.

El ADNc que codifica Repro-EN-1.0 de SEC ID Nº:1 fue descubierto en un proceso de selección de una biblioteca de expresión de ADNc procedente de una línea celular de carcinoma endometrial con suero agrupado de sujetos diagnosticados de endometriosis. Por tanto, polipéptidos que contengan un epítopo de Repro-EN-1.0 pueden ser identificados mediante un proceso de selección con tal suero. Preferiblemente, el suero de ensayo es un suero agrupado de varios sujetos diagnosticados positivamente de endometriosis. Al menos un epítopo de Repro-EN-1.0 existe en un fragmento de 567 aminoácidos del extremo carboxi de la molécula (aminoácidos 293-860 de la SEC ID Nº:2). Al menos un epítopo de IB1 existe en un fragmento de 644 aminoácidos del extremo carboxi de la molécula (aminoácidos 293-937 de la SEC ID Nº:4) para detectar la presencia de anticuerpos contra Repro-EN-1.0 o IB1 en muestras de suero de pacientes. Este análisis es útil en diagnóstico porque la presencia de tales anticuerpos es un marcador de diagnóstico.

Repro-EN-1.0 o IB1 son producidos muy fácilmente de manera recombinante, según se describe en la presente. El Repro-EN-1.0 o el IB1 recombinantes pueden ser purificados mediante purificación por afinidad. En un método, Repro-EN-1.0 o IB1 recombinantes contienen una marca de polihistidina. La proteína es purificada en una matriz de afinidad de un quelato de níquel. En otro método, Repro-EN-1.0 o IB1 es purificado utilizando una matriz de afinidad que lleva anticuerpos anti-Repro-EN-1.0 o anti-IB1.

VI. Anticuerpos e hibridomas

En un aspecto, esta invención proporciona una composición que comprende un anticuerpo que se une específicamente a polipéptidos Repro-EN-1.0 o IB1. Los anticuerpos tienen preferiblemente una afinidad de al menos 10^{6} M^{-1}, 10^{7} M^{-1}, 10^{8} M^{-1} ó 10^{9} M^{-1}. Esta invención contempla composiciones de anticuerpos policlonales y monoclonales.

Se describen también en la presente inmunotoxinas contra células que expresen Repro-EN-1.0 o IB1. Las inmunotoxinas son anticuerpos y similares, según se describe en la presente, acoplados a un compuesto, por ejemplo una toxina, que es tóxico para una célula diana. Las toxinas pueden incluir, por ejemplo, isótopos radiactivos, ricino, cisplatino, moléculas antisentido, toxina de Diphtheria, exotoxina A de Pseudomonas o antígeno protector de Bacillus anthraces. Las inmunotoxinas se unen a células cancerosas que expresan Repro-EN-1.0 o IB1 y las destruyen. Son útiles en los métodos terapéuticos de esta invención. Los anticuerpos de la invención tienen muchas utilizaciones. Por ejemplo, tales anticuerpos son útiles para detectar polipéptidos Repro-EN-1.0 o IB1 en inmunoensayos. Los anticuerpos pueden ser utilizados también para someter a selección bibliotecas de expresión por productos de expresión particulares tales como Repro-EN-1.0 o IB1 de mamífero. Éstos son útiles para detectar o diagnosticar diferentes condiciones patológicas relacionadas con la presencia de los antígenos respectivos. Normalmente, en tal procedimiento los anticuerpos están marcados con un resto que permite la fácil detección de la presencia del antígeno por la unión al anticuerpo. Pueden utilizarse también los anticuerpos producidos contra Repro-EN-1.0 o IB1 para producir anticuerpos anti-idiotípicos.

A. Producción de Anticuerpos

Se utilizan varios inmunogénos para producir anticuerpos que se unan específicamente a los polipéptidos Repro-EN-1.0 o IB1. El Repro-EN-1.0 o el IB1 de longitud completa son inmunógenos adecuados. Típicamente, el inmunógeno de interés es un péptido de al menos 3 aminoácidos aproximadamente, más típicamente el péptido tiene 5 aminoácidos de longitud, preferiblemente el fragmento tiene 10 aminoácidos de longitud y, más preferiblemente, el fragmento tiene 15 aminoácidos de longitud o más. Los péptidos pueden ser acoplados a una proteína transportadora (por ejemplo, como una proteína de fusión), o son expresados recombinantemente en un vector de inmunización. Los determinantes antigénicos en los péptidos a los que se unen los anticuerpos tienen típicamente de 3 a 10 aminoácidos de longitud. Los polipéptidos que existen de forma natural son también utilizados en forma pura o impura.

Los polipéptidos recombinantes son expresados en células eucarióticas o procarióticas y purificados utilizando técnicas estándar. El polipéptido, o una versión sintética del mismo, es inyectado posteriormente a un animal capaz de producir anticuerpos. Pueden generarse anticuerpos monoclonales o policlonales para su uso posterior en inmunoensayos para medir la presencia y la cantidad del polipéptido.

Los métodos para producir anticuerpos policlonales son conocidos por los expertos en la técnica. Brevemente, un inmunógeno, preferiblemente un polipéptido purificado, un polipéptido acoplado a un transportador apropiado (por ejemplo, GST, hemocianina de la lapa ojo de cerradura, etc.), o un polipéptido incorporado en un vector de inmunización tal como un virus vaccinia recombinante (ver, la Patente de EE.UU. Nº 4.722.848) es mezclado con un adyuvante y se inmunizan animales con la mezcla. La respuesta inmune del animal a la preparación del inmunógeno es monitorizada tomando muestras de sangre de ensayo y determinando el título de la reactividad hacia el polipéptido de interés. Cuando se obtienen títulos de anticuerpo hacia el inmunógeno apropiadamente elevados, se recoge sangre del animal y se preparan antisueros. Cuando se desea, se realiza un fraccionamiento posterior de los antisueros con el fin de enriquecerlos en anticuerpos reactivos hacia el polipéptido. Ver, por ejemplo, Coligan (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene, NY; y Harlow y Lane (1989) Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press, NY.

Los anticuerpos, incluyendo fragmentos de unión y versiones recombinantes de una sola cadena de los mismos, contra fragmentos predeterminados de las proteínas Repro-EN-1.0 o IB1 son producidos mediante la inmunización de animales con, por ejemplo, conjugados de los fragmentos con proteínas transportadoras según se describió anteriormente.

Los anticuerpos monoclonales son preparados a partir de células secretoras del anticuerpo deseado. Estos anticuerpos son sometidos a selección por su unión a polipéptidos normales o modificados, o bien son sometidos a selección por su actividad agonista o antagonista, por ejemplo una actividad mediada a través de Repro-EN-1.0 o IB1. En algunos casos, es deseable preparar anticuerpos monoclonales a partir de varios huéspedes mamífero tales como ratones, roedores, primates, humanos, etc. Una descripción de las técnicas para preparar tales anticuerpos monoclonales se encuentra en, por ejemplo, Stites y col. (eds.) Basic and Clinical Immunology (4ª ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, CA, y las referencias citadas en el mismo; Harlow y Lane, Supra; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2ª ed.) Academic Press, New York, NY; y Kohler y Milstein (1975) Nature 256:495-497.

Otras técnicas adecuadas implican la selección de bibliotecas de anticuerpos recombinantes en fagos o vectores similares. Ver, Huse y col. (1989) Science 246:1275-1281 y Ward y col. (1989) Nature 341:544-546.

Pueden producirse también inmunoglobulinas recombinantes. Ver, Cabilly, Patente de EE.UU. Nº 4.816.567 y Queen y col. (1989) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 86:10029-10033.

Frecuentemente, los polipéptidos y los anticuerpos serán marcados mediante la unión, covalente o no covalente, de una sustancia que proporcione una señal detectable. Se conoce una amplia variedad de marcas y de técnicas de conjugación y están descritas extensamente en la literatura científica y en la literatura de patentes. Por tanto, un anticuerpo utilizado para detectar un analito puede ser marcado directamente con un resto detectable, o puede ser marcado indirectamente mediante, por ejemplo, la unión al anticuerpo de un anticuerpo secundario que esté él mismo marcado directamente o indirectamente.

Los anticuerpos de esta invención son también utilizados para cromatografía de afinidad en el aislamiento de las proteínas Repro-EN-1.0 o IB1. Se preparan columnas, por ejemplo con los anticuerpos unidos a un soporte sólido, por ejemplo partículas tales como agarosa, Sephadex o similares, se pasa un lisado celular a través de la columna, se lava y se trata con concentraciones crecientes de un desnaturalizante suave, mediante lo cual se liberan los polipéptidos Repro-EN-1.0 o IB1 purificados.

Un procedimiento alternativo es la producción de inmunoglobulinas humanizadas mediante la unión de las regiones CDR de anticuerpos no humanos a regiones constantes humanas mediante técnicas de ADN recombinante. Ver, Queen y col., Patente de Estados Unidos 5.585.089.

Un procedimiento más para aislar secuencias de ADN que codifican un anticuerpo monoclonal humano o un fragmento de unión del mismo es mediante un proceso de selección de una biblioteca de ADN de células B humanas de acuerdo con el protocolo general descrito por Huse y col. Science 246:1275-1281 (1989) y el clonaje y la amplificación posteriores de las secuencias que codifican el anticuerpo (o el fragmento de unión) con la especificidad deseada. El protocolo descrito por Huse es más eficaz en combinación con la tecnología de presentación en fagos. Ver, por ejemplo, Dower y col., WO 91/17271 y McCafferty y col., WO 92/01047. La tecnología de presentación en fagos puede ser también utilizada para mutagenizar regiones CDR de anticuerpos que han mostrado previamente tener afinidad por los receptores de las proteínas Repro-EN-1.0 o IB1 o por sus ligandos. Se seleccionan los anticuerpos que tienen una afinidad de unión mejorada.

Se describen también en la presente fragmentos de anticuerpos contra las proteínas Repro-EN-1.0 o IB1 o contra análogos de las proteínas. Típicamente, estos fragmentos presentan una unión específica al receptor de la proteína Repro-EN-1.0 similar a la de una inmunoglobulina completa. Los fragmentos de anticuerpo incluyen cadenas pesadas separadas, Fab de cadenas ligeras, Fab', F(ab')_{2} y Fv. Los fragmentos son producidos mediante técnicas de ADN recombinante o mediante separación enzimática o química de inmunoglobulinas intactas.

VII. Métodos para detectar los polipéptidos Repro-EN-1.0 e IB1

Los polipéptidos Repro-EN-1.0 o IB1 pueden ser identificados mediante cualquiera de los métodos conocidos en la técnica. En una realización, los métodos implican la detección del polipéptido con un ligando que reconoce específicamente al polipéptido (por ejemplo, un inmunoensayo). Los anticuerpos de la invención son particularmente útiles para la detección específica de los polipéptidos Repro-EN-1.0 o IB1. Se conocen en la técnica una variedad de métodos de detección basados en anticuerpos. Éstos incluyen, por ejemplo, radioinmunoensayo, inmunoensayo de sándwich (incluyendo ELISA), ensayos inmunofluorescentes, transferencia Western, cromatografía de afinidad (un ligando de afinidad unido a una fase sólida) y detección in situ con anticuerpos marcados. Otro método para detectar los polipéptidos Repro-EN-1.0 o IB1 implica la identificación del polipéptido de acuerdo con su masa mediante, por ejemplo, electroforesis en gel, espectrometría de masas o HPLC. Las muestras de interés pueden ser tomadas de cualquiera de varias fuentes apropiadas tales como saliva, fluido peritoneal, sangre o un producto de la sangre (por ejemplo, suero), orina, biopsia de un tejido (por ejemplo, tejido de nódulos linfáticos), etc.

a. Inmunoensayos

Los métodos para la detección de los polipéptidos Repro-EN-1.0 o IB1 pueden emplear uno o más reactivos que son anticuerpos anti-Repro-EN-1.0 o anti-IB1 (esto es, inmunoensayos). Se conocen varios formatos de ensayos de unión inmunológica bien establecidos adecuados para la práctica de la invención (ver, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. 4.366.241; 4.376.110; 4.517.288 y 4.837.168). Ver, por ejemplo, METHODS IN CELL BIOLOGY VOLUMEN 37: ANTIBODIES IN CELL BIOLOGY, Asai, ed. Academic Press, Inc., New York (1993); BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY 7ª Edición, Stites & Terry, eds. (1991); Harlow and Lane, supra [por ejemplo, Capítulo 14] y Ausubel y col., supra [por ejemplo, Capítulo 11]. Típicamente, los ensayos de unión inmunológica (o inmunoensayos) utilizan un "agente de captura" para que se una específicamente, y a menudo inmovilice, al analito en una fase sólida. En una realización, el agente de captura es un resto que se une específicamente a un polipéptido Repro-EN-1.0 o IB1 o a una subsecuencia de Repro-EN-1.0 o IB1, tal como un anticuerpo anti-Repro-EN-1.0 o anti-
IB1.

Normalmente el polipéptido Repro-EN-1.0 o IB1 que está siendo analizado es detectado directamente o indirectamente utilizando una marca detectable. La marca o el grupo detectable particular utilizado en el ensayo no es normalmente un aspecto crítico de la invención, siempre que no interfiera significativamente con la unión específica del anticuerpo o de los anticuerpos utilizados en el ensayo. La marca puede estar unida covalentemente al agente de captura (por ejemplo, un anticuerpo anti-Repro-EN-1.0 o anti-IB1), o puede estar unida a un tercer resto, tal como otro anticuerpo, que se una específicamente al polipéptido Repro-EN-1.0.

Los métodos emplean inmunoensayos competitivos y no competitivos para detectar los polipéptidos Repro-EN-1.0 o IB1. Los inmunoensayos no competitivos son ensayos en los que se mide directamente la cantidad de analito capturado (en este caso Repro-EN-1.0 o IB1). Uno de tales ensayos es un inmunoensayo de dos sitios, basado en anticuerpos monoclonales, que utiliza anticuerpos monoclonales reactivos con dos epítopos que no interfieren de la proteína Repro-EN-1.0 o IB1. Ver, por ejemplo, Maddox y col., 1983, J. Exp. Med. 158:1211 para una información secundaria. En un ensayo de "sándwich" preferido, el agente de captura (por ejemplo, un anticuerpo anti-Repro-EN-1.0 o anti-IB1) es unido directamente a un sustrato sólido en el cual es inmovilizado. Estos anticuerpos inmovilizados capturan posteriormente cualquier proteína Repro-EN-1.0 o IB1 presente en la muestra de ensayo. El polipéptido Repro-EN-1.0 o IB1 así inmovilizado puede ser marcado posteriormente, esto es, mediante la unión a un segundo anticuerpo anti-Repro-EN-1.0 o anti-IB1 portador de una marca. Alternativamente, el segundo anticuerpo anti-Repro-EN-1.0 o anti-IB1 puede carecer de marca, pero estar unido a un tercer anticuerpo marcado específico para anticuerpos de la especie de la que deriva el segundo anticuerpo. El segundo anticuerpo puede ser modificado alternativamente con un resto detectable, tal como biotina, al cual puede unirse específicamente una tercera molécula marcada tal como estreptavidina marcada con un enzima.

En los ensayos competitivos, la cantidad de proteína Repro-EN-1.0 o IB1 presente en la muestra es medida indirectamente midiendo la cantidad de una Repro-EN-1.0 o una IB1 añadida (exógena) desplazada (o retirada por competición) de un agente de captura (por ejemplo, un anticuerpo anti-Repro-EN-1.0 o anti-IB1) por la proteína Repro-EN-1.0 o IB1 presente en la muestra.

Un ensayo de inhibición de un hapteno es otro ejemplo de ensayo competitivo. En este ensayo, la proteína Repro-EN-1.0 o IB1 es inmovilizada en un sustrato sólido. Se añade a la muestra una cantidad conocida de anticuerpo anti-Repro-EN-1.0 o anti-IB1 y posteriormente la muestra se pone en contacto con la proteína Repro-EN-1.0 o IB1 inmovilizada. En este caso, la cantidad de anticuerpo anti-Repro-EN-1.0 o anti-IB1 unida a la proteína Repro-EN-1.0 o IB1 inmovilizada es inversamente proporcional a la cantidad de proteína Repro-EN-1.0 presente en la muestra. La cantidad de anticuerpo inmovilizado puede ser detectada mediante la detección de la fracción de anticuerpo inmovilizado o mediante la detección de la fracción de anticuerpo que permanece en solución. En este aspecto, la detección puede ser directa, cuando el anticuerpo está marcado, o indirecta cuando la marca está unida a una molécula que se une específicamente al anticuerpo según se describió anteriormente.

b. Otros Formatos de Ensayo Basados en Anticuerpos

Los métodos detectan y cuantifican la presencia del polipéptido Repro-EN-1.0 o IB1 en la muestra mediante la utilización de un formato de inmunotransferencia (transferencia Western). Otro inmunoensayo es el denominado "cromatografía de flujo lateral". En una versión no competitiva de la cromatografía de flujo lateral, una muestra se mueve a través de un sustrato mediante, por ejemplo, acción capilar y se encuentra con un anticuerpo marcado móvil que se une al analito formando un conjugado. El conjugado se mueve luego a través del sustrato y se encuentra con un segundo anticuerpo inmovilizado que se une al analito. De este modo, el analito inmovilizado es detectado mediante la detección del anticuerpo marcado. En una versión competitiva de la cromatografía de flujo lateral, una versión marcada del analito se mueve a través del transportador y compite con el analito no marcado para unirse al anticuerpo inmovilizado. Cuanto mayor es la cantidad de analito en la muestra, menor es la unión del analito marcado y, por tanto, más débil es la señal. Ver, por ejemplo, May y col., Patente de EE.UU. 5.622.871 y Rosenstein, Patente de EE.UU. 5.591.645.

c. Fases Sólidas: Sustratos, Soportes Sólidos, Membranas, Filtros

Según se indicó supra, dependiendo del ensayo, varios componentes, incluyendo el antígeno, el anticuerpo diana o el anticuerpo anti-Repro-EN-1.0 o anti-IB1, pueden ser unidos a una superficie o soporte sólido (esto es, un sustrato, una membrana o un papel de filtro). Se conocen en la técnica muchos métodos para inmovilizar biomoléculas en una variedad de superficies sólidas. Por ejemplo, la superficie sólida puede ser una membrana (por ejemplo, nitrocelulosa), una placa de microvaloración (por ejemplo, PVC, polipropileno o poliestireno), un tubo de ensayo (vidrio o plástico), una varilla de inmersión (por ejemplo, de vidrio, PVC, polipropileno, poliestireno, látex y similares), un tubo de microcentrífuga o una esfera de vidrio o plástico. El componente deseado puede ser unido covalentemente o fijado no covalentemente mediante un enlace no específico.

Puede emplearse una amplia variedad de polímeros orgánicos e inorgánicos, naturales y sintéticos, como material para la superficie sólida. Polímeros ilustrativos incluyen polietileno, polipropileno, poli(4-metilbuteno), poliestireno, polimetacrilato, poli(etilén tereftalato), rayón, nailon, poli(vinil butirato), difluoruro de polivinilideno (PVDF), siliconas, poliformaldehído, celulosa, acetato de celulosa, nitrocelulosa y similares. Otros materiales que pueden ser empleados incluyen papel, vidrios, cerámica, metales, metaloides, materiales semiconductores, cementos o similares. Además, pueden utilizarse sustancias que forman geles tales como proteínas (por ejemplo, gelatinas), lipopolisacáridos, silicatos, agarosa y poliacrilamidas. Son también adecuados polímeros que forman varias fases acuosas tales como dextranos, polialquilén glicoles o surfactantes, tales como fosfolípidos, sales de alquilamonio de cadena larga (12-24 átomos de carbono) y similares. Cuando la superficie sólida es porosa, pueden emplearse diferentes tamaños de poro dependiendo de la naturaleza del sistema.

d. Espectrometría de Masas

La masa de una molécula puede ser utilizada frecuentemente como identificador de la molécula. Por tanto, pueden utilizarse métodos de espectrometría de masas para identificar un analito proteico. Los espectrómetros de masas pueden medir masa mediante la determinación del tiempo requerido para que un analito ionizado viaje a través de un tubo de vuelo y sea detectado por un detector de iones.

Un método de espectrometría de masas para proteínas es la espectrometría de masas con desorción/ionización mediante láser asistida por matriz ("MALDI"). En el MALDI el analito es mezclado con un material que es una matriz absorbente de energía que absorbe energía de la longitud de onda de un láser y está colocado en la superficie de una sonda. Después de pulsar la matriz con el láser, se produce la desorción del analito desde la superficie de la sonda, se ioniza y es detectado por el detector de iones. Ver, por ejemplo, Hillenkamp y col., Patente de Estados Unidos 5.118.937.

Otros métodos de espectrometría de masas para proteínas están descritos en Hutchens y Yip, Patente de Estados Unidos 5.719.060. En uno de tales métodos, referido como Superficies Intensificadas para Captura de Afinidad ("SEAC"), se utiliza un reactivo de afinidad de fase sólida que se une al analito específicamente o no específicamente, tal como un anticuerpo o un ión metálico, para separar el analito de los demás materiales de una muestra. Posteriormente, se produce la desorción del analito capturado desde la fase sólida mediante, por ejemplo, energía de láser, se ioniza y es detectado por el detector.

e. Combinaciones de Ensayos

Los ensayos de diagnóstico y pronóstico descritos en la presente pueden ser llevados a cabo en varias combinaciones y pueden ser llevados a cabo también junto con otros análisis de diagnóstico o pronóstico. Por ejemplo, cuando se utilizan los presentes métodos para diagnosticar endometriosis, la presencia de un polipéptido Repro-EN-1.0 o IB1 puede ser utilizada para determinar la etapa de la enfermedad. Los análisis que pueden proporcionar una información adicional incluyen el análisis microscópico de muestras de biopsia, la detección de antígenos (por ejemplo, marcadores de la superficie celular) asociados con endometriosis (por ejemplo, utilizando histocitoquímica, FACS o simi-
lares).

VIII. Métodos de diagnóstico, monitorización y pronóstico A. Métodos para Diagnosticar Endometriosis

Nosotros hemos detectado anticuerpos circulantes contra Repro-EN-1.0 o IB1 en la sangre de mujeres diagnosticadas de endometriosis. Esto apoya la idea de que la endometriosis tiene un componente autoinmune. Además, Repro-EN-1.0 o IB1 y los autoanticuerpos contra Repro-EN-1.0 o IB1 representan dos dianas en el diagnóstico de endometriosis.

La proteína Repro-EN-1.0 o IB1 que se desprende en el fluido peritoneal de mujeres con endometriosis es útil en los métodos para diagnosticar endometriosis. Estos métodos incluyen la detección de Repro-EN-1.0 o IB1 en una muestra biológica de un sujeto. Las muestras adecuadas incluyen, sin limitación, saliva, sangre o un producto sanguíneo (por ejemplo, suero), orina, fluido menstrual, secreción vaginal y, en particular, fluido peritoneal. Repro-EN-1.0 o IB1 pueden ser detectadas mediante cualquiera de los métodos descritos en la presente. Cualquier detección de Repro-EN-1.0 o IB1 por encima de un rango normal es un signo positivo en el diagnóstico de endometriosis.

En otro aspecto, esta invención proporciona métodos para diagnosticar endometriosis en un sujeto mediante la detección, en una muestra del sujeto, de una cantidad diagnóstica de un anticuerpo que se una específicamente al polipéptido Repro-EN-1.0 o IB1. Las muestras adecuadas de pacientes incluyen, sin limitación, saliva, sangre o un producto sanguíneo (por ejemplo, suero), fluido peritoneal, orina, fluido menstrual, secreción vaginal. Los anticuerpos pueden ser detectados mediante cualquiera de los métodos para detectar proteínas descritos en la presente. Sin embargo, los ensayos de tipo sándwich son particularmente útiles. En una versión, todos los anticuerpos son capturados en una fase sólida, utilizando por ejemplo proteína A, y los anticuerpos específicos para Repro-EN-1.0 o IB1 son detectados utilizando Repro-EN-1.0 o IB1 marcado directamente o indirectamente o un fragmento polipeptídico de los mismos que tenga un epítopo de Repro-EN-1.0 o de IB1. En otra versión del ensayo, Repro-EN-1.0 o IB1, o un fragmento antigénico de los mismos, pueden ser utilizados como molécula de captura y pueden detectarse los anticuerpos capturados.

Aunque la detección de anticuerpos contra Repro-EN-1.0 o IB1 es, en general, un signo positivo de endometriosis, los anticuerpos de clase IgE e IgG_{4} son particularmente específicos y sensibles para el diagnóstico de endometriosis. Por tanto, en una realización, el método de diagnóstico implica la detección específica de anticuerpos IgE o IgG_{4} que reconozcan específicamente Repro-EN-1.0 o IB1. Los anticuerpos anti-IgE humana y los anticuerpos anti-IgG_{4} humana pueden ser fácilmente comprados o producidos.

IX. Métodos para seleccionar compuestos que regulen la expresión de Repro-EN-1.0 o IB1

Los compuestos que regulan la expresión de Repro-EN-1.0 e IB1 son candidatos como agentes terapéuticos. Esta invención proporciona métodos para determinar si un compuesto regula (por ejemplo, activa o inhibe) la expresión de Repro-EN-1.0 o de IB1.

Los métodos para determinar si un compuesto regula la expresión de Repro-EN-1.0 o de IB1 implican la administración del compuesto a una célula o a un animal de ensayo que tenga un gen de Repro-EN-1.0 o de IB1 expresable, y la determinación de si se produce una alteración de la expresión de Repro-EN-1.0 o de IB1. En una realización, los métodos implican la administración del compuesto a un cultivo que contenga la célula o a un animal de ensayo que tenga células que expresen Repro-EN-1.0 o IB1, la medida de la cantidad de polinucleótido o polipéptido Repro-EN-1.0 o IB1 en una muestra del cultivo o del animal y la determinación de si la cantidad medida es diferente de la cantidad en una muestra del cultivo o del animal bajo condiciones control (por ejemplo, a los que no se ha administrado compuesto). Se registran las diferencias estadísticamente significativas (p < 0,05) entre la cantidad medida en la muestra de ensayo y en la muestra control e indican que el compuesto altera la cantidad de Repro-EN-1.0 o IB1 producida por la célula.

El compuesto a ensayar puede ser seleccionado de varias fuentes. Por ejemplo, bibliotecas combinatorias de moléculas están disponibles para experimentos de selección. Utilizando tales bibliotecas, pueden ser sometidas a selección miles de moléculas por su actividad reguladora. En una realización preferida, los métodos de selección automatizada de alto rendimiento implican la provisión de una biblioteca que contenga un gran número de compuestos terapéuticos potenciales (compuestos candidatos). Tales "bibliotecas químicas combinatorias" son posteriormente sometidas a selección en uno o más ensayos, según se describe en la presente, con el fin de identificar a aquellos miembros de la biblioteca (especies o subclases químicas particulares) que presentan una actividad característica deseada. Los compuestos así identificados pueden servir como "compuestos líder" convencionales o pueden ser utilizados ellos mismos como agentes terapéuticos potenciales o reales.

La preparación y la selección de bibliotecas químicas combinatorias son bien conocidas por los expertos en la técnica. Tales bibliotecas químicas combinatorias incluyen, pero no se limitan a, bibliotecas peptídicas (ver, por ejemplo, la Patente de EE.UU. 5.010.175, Furka (1991) Int. J. Pept. Prot. Res. 37:487-493, Houghton y col. (1991) Nature 354:84-88). La síntesis peptídica no es de ninguna manera el único procedimiento previsto y deseado para ser utilizado con la presente invención. Pueden utilizarse también otras químicas para generar bibliotecas de diversidad química. Tales químicas incluyen, pero no se limitan a: peptoides (Publicación PCT Nº WO 91/19735, 26 de Diciembre de 1991), péptidos codificados (Publicación PCT Nº WO 93/20242, 14 de Octubre de 1993), bio-oligómeros aleatorios (Publicación PCT Nº WO 92/00091, 9 de Enero de 1992), benzodiazepinas (Patente de EE.UU. Nº 5.288.514), diversómeros tales como hidantoínas, benzodiazepinas y dipéptidos (Hobbs y col. (1993) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90:6909-6913), polipéptidos vinílogos (Hagihara y col. (1992) J. Amer. Chem. Soc. 114:6568), peptidomiméticos no peptídicos con un andamiaje de la Beta-D-glucosa (Hirschmann y col. (1992) J. Amer. Chem. Soc. 114:9217-9218), síntesis orgánicas análogas de bibliotecas de compuestos pequeños (Chen y col. (1994) J. Amer. Chem. Soc. 116:2661), oligocarbamatos (Cho y col. (1993) Science 261:1303) y/o peptidilfosfonatos (Campbell y col. (1994) J. Org. Chem. 59:658). Ver, de manera general, Gordon y col. (1994) J. Med. Chem. 37:1385, bibliotecas de ácidos nucleicos, bibliotecas de ácidos nucleicos peptídicos (ver, por ejemplo, la Patente de EE.UU. 5.539.083), bibliotecas de anticuerpos (ver, por ejemplo, Vaughn y col. (1996) Nature Biotechnology 14(3):309-314 y PCT/US96/10287), bibliotecas de carbohidratos (ver, por ejemplo, Liang y col. (1996) Science 274:1520-1522 y la Patente de EE.UU. 5.593.853) y bibliotecas de moléculas orgánicas pequeñas (ver, por ejemplo, benzodiazepinas, Baum (1993) C&EN, 18 de Enero, página 33, isoprenoides, Patente de EE.UU. 5.569.588, tiazolidinonas y metatiazanonas, Patente de EE.UU. 5.549.974, pirrolidinas, Patentes de EE.UU. 5.525.735 y 5.519.134, compuestos de morfolino, Patente de EE.UU. 5.506.337, benzodiazepinas, 5.288.514 y similares).

Hay dispositivos comercialmente disponibles para la preparación de bibliotecas combinatorias (ver, por ejemplo, 357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem. Tech., Louisville KY, Symphony, Rainin, Woburn, MA, 433A Applied Biosystems, Foster City, CA, 9050 Plus, Millipore, Bedford, MA).

X. Genómica

La identificación de formas cognadas o polimórficas del gen de Repro-EN-1.0 o IB1 y el seguimiento de esos polimorfismos en individuos y en familias son importantes en los procesos de selección genética. Por consiguiente, esta invención proporciona métodos útiles para detectar formas polimórficas del gen de Repro-EN-1.0 o del gen de IB1. Los métodos implican la comparación de la identidad de un nucleótido o de un aminoácido en una posición seleccionada dentro de la secuencia de un gen de Repro-EN-1.0 o IB1 de ensayo con el nucleótido o el aminoácido en la posición correspondiente de la secuencia del Repro-EN-1.0 nativo (SEC ID Nº:1) o del IB1 nativo (SEC ID Nº:3). La comparación puede ser llevada a cabo mediante cualquiera de los métodos conocidos en la técnica, incluyendo la comparación directa de las secuencias mediante la secuenciación de nucleótidos, la comparación de las secuencias o la determinación mediante hibridación o identificación de RFLPs.

En una realización, el método implica la secuenciación de nucleótidos o de aminoácidos del polinucleótido o polipéptido de ensayo completo, o de una subsecuencia del mismo, y la comparación de esa secuencia con la secuencia del Repro-EN-1.0 o del IB1 nativos. En otra realización, el método implica la identificación de fragmentos de restricción producidos después de la digestión con enzimas de restricción del polinucleótido de ensayo, y la comparación de esos fragmentos con los fragmentos producidos por la digestión con enzimas de restricción del gen de Repro-EN-1.0 o IB1 nativo. Los fragmentos de restricción del gen nativo pueden ser identificados mediante el análisis de la secuencia para identificar sitios de restricción. Otra realización implica la utilización de matrices de oligonucleótidos (ver, por ejemplo, Fodor y col., Patente de Estados Unidos 5.445.934). El método implica la provisión de una matriz de oligonucleótidos que contiene un conjunto de sondas oligonucleotídicas que definen secuencias seleccionadas de la secuencia del Repro-EN-1.0 o del IB1 nativo, la generación de datos de hibridación mediante la realización de una reacción de hibridación entre las moléculas del polinucleótido diana y las sondas del conjunto, y la detección de la hibridación entre las moléculas diana y cada una de las sondas del conjunto, y el procesamiento de los datos de hibridación para determinar las posiciones de nucleótidos en las cuales la identidad de la molécula diana difiere de la del Repro-EN-1.0 o IB1 nativo. La comparación puede ser realizada manualmente, pero es realizada más cómodamente mediante la utilización de un ordenador digital, programable.

Ejemplos I. Construcción de una biblioteca de expresión de ADNc de una línea celular de carcinoma endometrial humano (RL95-2) A. Materiales y Métodos

Se utilizó ARN poli A+ aislado de RL95-2 como molde para la síntesis de la primera hebra de ADNc. El ARN poli A+ fue analizado mediante electroforesis en gel desnaturalizante y variaba en tamaño de 0,2 a 10 kb (10). Un cebador oligo dT que contenía un sitio de XhoI interno, protegido, fue hibridado en presencia de una mezcla de nucleótidos que contenía 5-metil dCTP, y extendido con transcriptasa inversa de MMTV.

La síntesis de la segunda hebra del híbrido ADNc/ARN de RL95-2 fue completada mediante la adición de ARNasa H, ADN polimerasa 1 y dNTPs a la reacción de síntesis de la primera hebra. Se utilizó ADN polimerasa Pfu para hacer de extremos romos el ADNc de doble hebra de RL95-2, seguido por la ligadura de adaptadores de EcoRI. El ADNc fue sometido a la acción de una quinasa y digerido con XhoI y EcoRI antes del fraccionamiento por tamaño en columnas de Sephacryl S-500. El ADNc fraccionado por tamaño fue recuperado y cuantificado en placas que contenían bromuro de etidio frente a un conjunto de estándares de ADN diluidos de manera seriada. El ADNc contenido en las dos primeras fracciones de la columna fue ligado direccionalmente, en orientación sentido, a los brazos del vector fago uniZAP digerido con XhoI/EcoRI. Inicialmente, 25 ng aproximadamente (por fracción) del ADNc fueron ligados y empaquetados en las partículas del bacteriófago. Posteriormente, los 100 ng aproximadamente del ADNc restante en las fracciones 1 y 2 fueron empaquetados en partículas del bacteriófago utilizando varias reacciones del extracto de empaquetamiento del fago lambda (Stratagene).

Después del empaquetamiento, la biblioteca de RL95-2 humana primaria fue titulada por infección de la cepa huésped XL1 Blue. La proporción de fago recombinante:no recombinante fue determinada sembrando XL1 Blue infectadas en presencia de IPTG y XGal. El número de placas azules (no recombinantes) o blancas (recombinantes) fue cuantificado utilizando un contador de colonias Manostat. Un noventa y ocho y medio por ciento (98,5) de los fagos de la biblioteca de ADNc de RL95-2 humana eran recombinantes y la base de la biblioteca primaria de fagos constaba de 2,2 x 10^{6} clones independientes. La biblioteca de ADNc de RL95-2 humana fue amplificada una vez y titulada de nuevo igual que anteriormente. El título de la biblioteca amplificada fue de 3 x 10^{9} ufp/ml.

El tamaño medio de los insertos de ADNc fue determinado mediante amplificación por PCR. Se extrajeron veinte placas de fago bien aisladas y los insertos de ADNc fueron amplificados utilizando oligonucleótidos específicos T7/T3 que hibridan con los sitios flanqueantes del sitio de inserción del ADNc contenido en el vector fago lambda. Los productos de la PCR fueron analizados mediante electroforesis en gel de agarosa y visualizados mediante tinción con bromuro de etidio. El noventa y cinco por ciento de las placas extraídas contenía insertos que variaban en tamaño de 0,5 a 2,5 kb, con un tamaño medio de 1,5 kb.

II. Selección de Bibliotecas

Con el fin de identificar autoantígenos endometriales que pudieran ser utilizados para desarrollar un inmunoensayo de endometriosis, se utilizó suero agrupado de varias pacientes (n=17) con endometriosis confirmada por laparoscopia, como sonda para someter a selección la biblioteca de expresión de ADNc de RL95-2 utilizando los métodos siguientes.

A. Preadsorción de suero

Los anticuerpos que reaccionaban con las cepas huésped de la biblioteca de expresión fueron inmunoadsorbidos del suero de las pacientes mediante la utilización de esferas de sefarosa conjugadas a un lisado de E. coli BNN97 e Y1090 (5'\rightarrow3') siguiendo los protocolos del fabricante. Brevemente, 2 ml de esferas de sefarosa conjugadas a lisados de la cepa huésped fueron lavados dos veces con solución salina tamponada con Tris (TBS). Las esferas fueron resuspendidas en 4 ml de suero diluido 1/2 en TBS. Después de una incubación de 16 horas a 4ºC, las esferas de sefarosa fueron recogidas por centrifugación a 1.000 x g durante 2 minutos. Se retiró el sobrenadante y las esferas fueron lavadas con 4 ml de TBS estéril. Después de centrifugar a 1.000 x g durante 2 minutos, se recogieron los sobrenadantes, se agruparon y se utilizaron para someter a selección la biblioteca de expresión de ADNc específico de RL95-2.

B. Selección de la biblioteca de ADNc de RL95-2

Aproximadamente 10^{6} partículas de fago infecciosas fueron incubadas con células huésped XL1 Blue y sembradas a una densidad de 50.000 fagos por placa de 150 mm utilizando protocolos estándar (Stratagene). Después de incubar durante 5 horas a 42ºC, las placas de fago fueron cubiertas con membranas de nitrocelulosa (Protan; Schleicher & Schuell) que habían sido empapadas en una solución de isopropil-1-tio-b-D-galactopiranósido (IPTG) 10 mM. Después de una incubación de 4 horas a 37ºC, se retiraron las membranas y se lavaron tres veces durante 15 minutos en TBS con un 0,05% de Tween_{20} (TTBS). Las membranas fueron incubadas con solución bloqueante (seroalbúmina bovina [fracción V] al 1% en TBS) durante 1 hora a temperatura ambiente antes de una incubación de 1 hora con suero de las pacientes preadsorbido diluido 1/10 (dilución final de 1/40) en solución bloqueante. Las membranas fueron lavadas tres veces durante 15 minutos con TTBS antes de la adición de anti-Ig(G, A, M) humana producida en cabra conjugada a fosfatasa alcalina (Pierce) diluida 1/25.000 en solución bloqueante. Después de una incubación de 1 hora a temperatura ambiente, las membranas fueron lavadas tres veces con TTBS según se describió anteriormente y una vez con TBS. Las membranas fueron incubadas con un sustrato del enzima (Western Blue; Promega) durante 30 minutos aproximadamente y la reacción enzimática fue finalizada mediante la incubación breve de las membranas con solución de parada (Tris-HCl pH 2,9; EDTA 1 mM). Varias placas de fagos inmunorreactivas fueron seleccionadas y transferidas a 500 \mul de tampón SM (NaCl 100 mM, MgSO_{4} 8 mM, Tris-HCl 50 mM pH 7,5, gelatina 0,01%) que contenía 20 \mul de cloroformo. Los fagos seleccionados fueron eluidos del agar y sembrados a una densidad de 1.000 fagos por placa de 100 mm aproximadamente y sometidos a selección según se describió anteriormente. Con el fin de asegurar que la placa de fago seleccionada, denominada Repro-EN-1.0, representaba un único clon, se repitió el proceso de selección una tercera vez según se describió anteriormente.

C. Escisión del fagémido con Repro-EN-1.0

El plásmido que contenía el inserto de ADNc para Repro-EN-1.0 fue escindido del clon del fago utilizando los protocolos del fabricante (Stratagene). El tamaño del inserto de Repro-EN-1.0 fue determinado liberando el fragmento de ADNc del plásmido pBluescript/Repro-EN-1.0 rescatado con los enzimas de restricción EcoRI y XhoI. El inserto liberado fue fraccionado por tamaño mediante electroforesis en gel de agarosa y se determinó la longitud aparente del inserto comparando su posición de migración con un ADN estándar (escalera de 1 kb; Gibco BRL). El inserto migraba a aproximadamente 2,0 kb.

D. Identificación del clon de IB1

Una variante ayustada alternativamente de Repro-EN-1.0. Una biblioteca de ADNc de corazón humano comercial (Clontech) fue sometida a selección con una sonda radiomarcada que mapeaba en el extremo amino de la secuencia codificadora de Repro-EN-1.0 (nt 203 a 897). Uno de los dos clones aislados contenía un inserto de ADNc de 3,4 kb que poseía un inserto extra de 231 pares de bases en la secuencia codificadora de Repro-EN-1.0.

III. Caracterización A. Análisis de la secuencia

La secuencia de nucleótidos de Repro-EN-1.0 fue determinada mediante la utilización de un protocolo modificado del método de la terminación de la cadena en didesoxi de Sanger y col. y Sequenase 2.0 de USB (Barker, D.F., 1993, Biotechniques). La secuencia de aminoácidos fue pronosticada utilizando el programa TRANSLATE de Intelligenetic y las homologías de secuencias fueron determinadas con algoritmos de búsqueda en la base de datos BLAST. La secuencia de aminoácidos deducida (en el marco esperado para una proteína de fusión) era nueva.

B. Análisis de la expresión en tejidos

La distribución de la expresión de Repro-EN-1.0 fue determinada mediante análisis de transferencia Northern utilizando ARN poli A+ recogido de bazo, timo, próstata, testículo, ovario, intestino delgado, colon y leucocitos de sangre periférica humanos (transferencia humana MTN 11; Clontech) y de corazón, cerebro, placenta, pulmón, hígado, músculo esquelético, riñón y páncreas humanos (transferencia humana MTN 1; Clontech) y los protocolos sugeridos por el fabricante (Clontech). Las muestras de ARN poli A+ inmovilizado fueron incubadas con una sonda marcada con cebadores aleatorios que representaba el inserto de Repro-EN-1.0. La sonda fue generada mediante la utilización como molde de un fragmento liberado por EcoRI/XhoI de pRepro-EN-1.0 para una reacción marcada con cebadores aleatorios según se describe en el manual del fabricante (kit Megaprime; Amersham). Las membranas para la transferencia Northern fueron prehibridadas con 6 ml de solución ExpressHyb (Clontech) seguido por una incubación de 1 hora a 68ºC con 0,5 ng aproximadamente de sonda radiomarcada (2 x 10^{5} cpm aproximadamente) en 5 ml de solución ExpressHyb. La sonda no unida fue eliminada mediante lavado de las membranas tres veces con SSC 2X, SDS 0,05%, a temperatura ambiente durante 10 minutos para cada lavado, seguido por dos lavados con SSC 0,1X, SDS 0,1% a 50ºC durante 15 minutos para cada lavado. La longitud aparente de la especie de ARN, un ARNm de 3,4 kb, y la distribución tisular fueron determinadas mediante autorradiografía. La expresión fue detectada primariamente en músculo esquelético, corazón y testículo y, en menor grado, en otros tejidos, pero no se detectó ni en pulmón ni en células mononucleares de sangre periférica (PBMC). La expresión de Repro-EN-1.0 estaba regulada por incremento en carcinomas de mama y uterinos con relación a sus equivalentes normales, era altamente expresado en trompas de Falopio normales y en carcinoma de trompas de Falopio, y se expresaba a niveles bajos en ovario normal y en carcinoma de ovario (Fig. 2). La expresión de Repro-EN-1.0 en células RL95-2 (carcinoma de endometrio) es menor que en células LNCaP (adenocarcinoma de próstata humano), PC-12 (línea celular de rata) y BT12 (línea celular de carcinoma de mama humano) y es indetectable en una línea celular de hibridomas de ratón (3E10; control negativo) (Fig. 3). Además, la expresión en endometrio normal es indetectable.

C. Análisis de homólogos

Con el fin de determinar el nivel de conservación de nucleótidos de Repro-EN-1.0 en diferentes especies, se llevó a cabo un análisis de transferencia Southern utilizando ADN genómico digerido con EcoRI recogido de humano, mono, rata, ratón, perro, vaca, conejo, pollo y levadura, según se describe en el manual del fabricante (ZooBlot; Clontech). Brevemente, las muestras de ADN genómico digerido con EcoRI inmovilizado fueron prehibridadas con 6 ml de ExpressHyb (Clontech) e incubadas durante 1 hora a 68ºC con 1,0 ng (4 x 10^{5} cpm aproximadamente en 5 ml) de una sonda marcada con cebadores aleatorios que representaba el inserto de Repro-EN-1.0. La sonda no unida fue eliminada mediante lavado de las membranas una vez con SSC 2X, SDS 0,05% a temperatura ambiente durante 30 minutos, seguido por un lavado con SSC 0,1X, SDS 0,1% a 50ºC durante 30 minutos. La identificación de homólogos en diferentes especies fue determinada mediante autorradiografía. La secuencia está altamente conservada entre primates humanos y no humanos (mono).

IV. Anticuerpos

Se generaron en conejos anticuerpos hacia péptidos del clon y/o hacia la proteína recombinante. Este antisuero fue utilizado para desarrollar un ELISA de Repro-EN-1.0.

V. Proteína Recombinante

El ORF pronosticado para Repro-EN-1.0 fue subclonado en un vector de expresión y la proteína recombinante fue expresada y purificada mediante cromatografía en quelato de Ni utilizando metodologías estándar.

VI. Elisa

La proteína Repro-EN-1.0 recombinante purificada fue utilizada como antígeno diana en un ELISA (ELISA EndX™) diseñado para detectar autoanticuerpos específicos del antígeno en el suero de pacientes.

<110> Diagnostic Products Corporation

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<120> Polinucleótido Que Codifica Autoantígenos Asociados Con Endometriosis

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<130> N80980

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<160> 20

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

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<211> 3189

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (176)..(2755)

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<400> 1

19

20

21

22

23

24

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<210> 2

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<211> 860

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

25

26

27

28

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29

\newpage

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<210> 3

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<211> 3420

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (176)..(2986)

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<400> 3

30

31

32

33

34

35

\newpage

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<210> 4

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<211> 937

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

36

37

38

39

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<210> 5

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<211> 21

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 5

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caggacacag atgacagtga t

\hfill

21

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 6

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agagccttct gatctgtcac

\hfill

20

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

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\sa{Lys Thr Pro Ser Ala Glu Glu Arg Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

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<211> 8

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<212> PRT

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<213>Homo sapiens

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<400> 8

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\sa{Arg Ala Arg Pro Glu Ser Glu Arg}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

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<211> 7

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

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\sa{Arg Met Ser Asp Met Ser Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

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<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

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\sa{Asn Glu Lys Leu Ser Pro Lys Pro Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

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<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Pro Asn Val Ser Leu Met Gln Arg Met Ser Asp Met Leu Ser Arg Trp}

\sac{Phe Glu Glu Ala Ser Glu Val Ala Gln Ser Asn Arg Gly Arg Gly Arg}

\sac{Ser Arg Pro}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Pro Ser Ser Pro Asp Leu Glu Val Ser Glu Thr Ala Met Glu Val}

\sac{Asp Thr Pro Ala Glu Gln Phe Leu Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Pro Val Leu Ser Leu His Tyr Ser Thr Glu Gly Thr Thr Thr Ser Thr}

\sac{Ile Lys Leu Asn Phe Thr Asp Glu Trp}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

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\sa{Glu Thr Lys Ala Pro Glu Glu Ser Ser Glu Asp Val Thr Lys Tyr Gln}

\sac{Glu Gly Val Ser Ala Glu Asp Pro}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

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<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 15

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\sa{Glu Asn His Ile Asn Ile Thr Gln Ser Asp Lys Phe Thr Ala Lys Pro}

\sac{Leu Asp Ser Asn Ser Gly Glu Arg Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

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\sa{Asn Thr Asn Pro Glu Pro Gln Phe Gln Thr Glu Ala Thr Gly Pro Ser}

\sac{Ala His Glu Glu Thr Ser Thr Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

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<211> 60

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 17

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\sa{Asp Arg Arg Ser Ala Val Ala Arg Ile Gln Glu Phe Phe Arg Arg Arg}

\sac{Lys Glu Arg Lys Glu Met Glu Glu Leu Asp Thr Leu Asn Ile Arg Arg}

\sac{Pro Leu Val Lys Met Val Tyr Lys Gly His Arg Asn Ser Arg Thr Met}

\sac{Ile Lys Glu Ala Asn Phe Trp Gly Ala Asn Phe Val}

\vskip1.000000\baselineskip

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<210> 18

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<211> 37

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 18

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\sa{Glu Cys Gly His Ile Phe Ile Trp Asp Arg His Thr Ala Glu His Leu}

\sac{Met Leu Leu Glu Ala Asp Asn His Val Val Asn Cys Leu Gln Pro His}

\sac{Pro Phe Asp Pro Ile}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

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<211> 60

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

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\sa{Leu Ala Ser Ser Gly Ile Asp Tyr Asp Ile Lys Ile Trp Ser Pro Leu}

\sac{Glu Glu Ser Arg Ile Phe Asn Arg Lys Leu Ala Asp Glu Val Ile Thr}

\sac{Arg Asn Glu Leu Met Leu Glu Glu Thr Arg Asn Thr Ile Thr Val Pro}

\sac{Ala Ser Phe Met Leu Arg Met Leu Ala Ser Leu Asn}

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<210> 20

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<211> 11

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Gly Gln Glu Asn Glu Asn Glu Asp Glu Glu}

Claims

1. Un polinucleótido recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido Repro-EN-1.0 de SEC ID Nº:2, donde el polipéptido se une específicamente a anticuerpos procedentes de sujetos diagnosticados de endometriosis.

2. El polinucleótido de la reivindicación 1, en el que la secuencia de nucleótidos es seleccionada de la secuencia de Repro-EN-1.0 de SEC ID Nº:1.

3. El polinucleótido de la reivindicación 1, en el que la secuencia de nucleótidos es una secuencia de nucleótidos del Repro-EN-1.0 nativo.

4. El polinucleótido de la reivindicación 1, en el que la secuencia de nucleótidos es idéntica a los nucleótidos 176 a 2755 de la SEC ID Nº:1.

5. Un polinucleótido recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido IB1 de SEC ID Nº:4, donde el polipéptido se une específicamente a anticuerpos procedentes de sujetos diagnosticados de endometriosis.

6. El polinucleótido de la reivindicación 5, en el que la secuencia de nucleótidos es seleccionada de la secuencia de IB1 de SEC ID Nº:3.

7. El polinucleótido de la reivindicación 5, en el que la secuencia de nucleótidos es una secuencia de nucleótidos del IB1 nativo.

8. El polinucleótido de la reivindicación 5, en el que la secuencia de nucleótidos es idéntica a los nucleótidos 175 a 2986 de la SEC ID Nº:3.

9. El polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende además una secuencia para el control de la expresión unida operativamente a la secuencia de nucleótidos.

10. Un par de cebadores polinucleotídicos que amplifica una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido Repro-EN-1.0 de SEC ID Nº:2, o el polipéptido IB1 de SEC ID Nº:4, donde el polipéptido se une específicamente a anticuerpos procedentes de sujetos diagnosticados de endometriosis, comprendiendo el par:

(1): un cebador 3' de al menos 7 nucleótidos que hibrida específicamente con el extremo 3' de la secuencia de nucleótidos o corriente abajo de la secuencia, y

(2): un cebador 5' de al menos 7 nucleótidos que hibrida específicamente con el extremo 3' del complemento de la secuencia de nucleótidos o corriente abajo del complemento de la secuencia.

11. El par de cebadores polinucleotídicos de la reivindicación 10, en el que el cebador 3' tiene una secuencia complementaria a una secuencia de nucleótidos seleccionada del ADNc de Repro-EN-1.0 de SEC ID Nº:1, y el cebador 5' tiene una secuencia idéntica a la secuencia de nucleótidos seleccionada del ADNc de Repro-EN-1.0 de SEC ID Nº:1.

12. El par de cebadores polinucleotídicos de la reivindicación 10, en el que el cebador 3' tiene una secuencia complementaria a una secuencia de nucleótidos seleccionada del ADNc de IB1 de SEC ID Nº:3, y el cebador 5' tiene una secuencia idéntica a la secuencia de nucleótidos seleccionada del ADNc de IB1 de SEC ID Nº:3.

13. El par de cebadores polinucleotídicos de la reivindicación 10, en el que el par de polinucleótidos son ácidos nucleicos peptídicos.

14. Una célula recombinante que contiene un polinucleótido recombinante de acuerdo con la reivindicación 9.

15. Un polipéptido Repro-EN-1.0 recombinante purificado, cuya secuencia de aminoácidos es idéntica a la de la SEC ID Nº:2, o a la de una variante alélica de la SEC ID Nº:2.

16. Un polipéptido IB1 recombinante purificado, cuya secuencia de aminoácidos es idéntica a la de la SEC ID Nº:4, o a la de una variante alélica de la SEC ID Nº:4.

17. Un polipéptido purificado que comprende el Repro-EN-1.0 de SEC ID Nº:2 o el IB1 de SEC ID Nº:4, donde el polipéptido se une específicamente a anticuerpos procedentes de sujetos diagnosticados de endometriosis.

18. Una composición que consta esencialmente de un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido Repro-EN-1.0 de SEC ID Nº:2, o un anticuerpo que se une específicamente al polipéptido IB1 de SEC ID Nº:4.

19. La composición de la reivindicación 18, en la que el anticuerpo es monoclonal.

20. Un método para diagnosticar endometriosis en un sujeto que comprende las etapas de:

(a): detección en una muestra del sujeto de una cantidad de ensayo de un anticuerpo que se una específicamente al polipéptido Repro-EN-1.0 cuya secuencia de aminoácidos es idéntica a la de la SEC ID Nº:2, o a la de una variante alélica de la SEC ID Nº:2, o al polipéptido IB1 cuya secuencia de aminoácidos es idéntica a la de la SEC ID Nº:4, o la de una variante alélica de la SEC ID Nº:4; y

(b): comparación de la cantidad de ensayo con un rango normal del anticuerpo en una muestra control procedente de un sujeto que no padece endometriosis,

por lo que una cantidad de ensayo por encima del rango normal proporciona una indicación positiva en el diagnóstico de la endometriosis.

21. El método de la reivindicación 20, en el que la etapa de detección comprende la captura del anticuerpo de la muestra con Repro-EN-1.0 o IB1 inmovilizado, y la detección del anticuerpo capturado.

22. El método de la reivindicación 20, en el que la etapa de detección comprende la captura del anticuerpo de la muestra con un anticuerpo anti-inmunoglobulina inmovilizado y la detección del anticuerpo de captura.

23. El método de la reivindicación 21, en el que la etapa de detección del anticuerpo capturado comprende la puesta en contacto del anticuerpo capturado con un anticuerpo detectable que se una específicamente a las inmunoglobulinas y la detección de la unión entre el anticuerpo capturado y el anticuerpo detectable.

24. El método de la reivindicación 22, en el que la etapa de detección del anticuerpo capturado comprende la puesta en contacto del anticuerpo capturado con Repro-EN-1.0 o con IB1 y la detección de la unión entre el anticuerpo capturado y el Repro-EN-1.0 o el IB1.

25. El método de cualquiera de las reivindicaciones 20 a 24, en el que la muestra comprende suero sanguíneo.

26. El método de cualquiera de las reivindicaciones 20 a 25, en el que el anticuerpo es una inmunoglobulina IgG, una inmunoglobulina IgE o una inmunoglobulina IgG_{4}.

27. Un método para ser utilizado en el seguimiento del progreso de la endometriosis en un sujeto, que comprende las etapas de:

(a): la detección de una primera y una segunda cantidad de un anticuerpo que se una específicamente al polipéptido Repro-EN-1.0 cuya secuencia de aminoácidos es idéntica a la de la SEC ID Nº:2 o a la de una variante alélica de la SEC ID Nº:2, o al polipéptido IB1 cuya secuencia de aminoácidos es idéntica a la de la SEC ID Nº:4 o a la de una variante alélica de la SEC ID Nº:4, en muestras del sujeto una primera y una segunda vez, respectivamente; y

(b): la comparación de la primera y la segunda cantidad,

por lo que un incremento entre la primera y la segunda cantidad indica la progresión de la endometriosis y una disminución entre la primera y la segunda cantidad indica remisión de la endometriosis.

28. Un método de selección para determinar si un compuesto aumenta o disminuye la expresión de Repro-EN-1.0 de SEC ID Nº:2 o de IB1 de SEC ID Nº:4 o de una variante alélica de los mismos en una célula, que comprende la puesta en contacto de la célula con el compuesto y la determinación de si la producción del ARNm de Repro-EN-1.0 o de IB1 o la producción del polipéptido Repro-EN-1.0 o IB1 está aumentada o disminuida.

29. Un método para detectar formas polimórficas de Repro-EN-1.0 de SEC ID Nº:1 ó 2 o de IB1 de SEC ID Nº:3 ó 4, que comprende las etapas de:

(a): determinación de la identidad de un nucleótido o de un aminoácido en una posición seleccionada dentro de la secuencia de un gen o polipéptido Repro-EN-1.0 de ensayo o de un gen o polipéptido IB1 de ensayo;

(b): la determinación de la identidad del nucleótido o del aminoácido en la posición correspondiente del gen o polipéptido Repro-EN-1.0 nativo de SEC ID Nº:1 ó 2 o del gen o polipéptido IB1 nativo de SEC ID Nº:3 ó 4; y

(c): la comparación de la identidad del gen o polipéptido de ensayo con la identidad del gen o polipéptido nativo, con lo que una diferencia de identidad indica que el gen o polipéptido de ensayo es una forma polimórfica de Repro-EN-1.0 o de IB1.