ES2243641T3 - Aditivo para formulado de leche infantil. - Google Patents

Aditivo para formulado de leche infantil.

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Abstract

Formulado de leche infantil artificial añadida con la proteína S100B, listas para usarse o reconstituirse en el momento del uso.

Description

Aditivo para formulado de leche infantil.
Esta invención se refiere al uso de la proteína S100B como aditivo para formulados de leche infantil.
Se sabe que la leche materna constituye el mejor alimento para los recién nacidos y los niños. Sin embargo, existen diversas situaciones en las que tienen que usarse preparaciones sintéticas; estas preparaciones se basan principalmente en leche de vaca, a la que se le añaden diversos ingredientes que están típicamente presentes en la leche humana. Las sustancias o aditivos generalmente usados para suplementar formulados de leche artificial (o sintética) incluyen proteínas tales como caseína, lactalbúmina, lactoferrina, lisozima, péptidos o aminoácidos individuales, anticuerpos, en particular inmunoglobulina A, vitaminas, tales como vitaminas C y D, ácidos grasos, sales minerales y similares. El propósito de la suplementación con o adición de preparaciones sintéticas es reproducir la composición cualitativa y cuantitativa de la leche humana. Por ejemplo, la Patente US4303692 describe una formulado de leche infantil sintética que contiene taurina a niveles sustancialmente equivalentes a los que se encuentran en la leche humana. Como el contenido de taurina se reduce considerablemente en la fabricación de formulados de leche infantil artificial basadas en la leche de vaca, reducción de la eficacia nutricional de formulados, dicha patente recomienda la adición de taurina a formulado de leche sintética para reproducir la concentración que se encuentra en la leche humana. La patente WO 96/26647 recomienda suplementar formulados de leche infantil con mezclas de ácidos grasos poliinsaturados para reproducir la composición de leche humana y mejorar las respuestas neurológicas visuales provocadas en los
niños.
El artículo "Geowth and Plasma Amino Acid Concentrations in Very Low Birthweight Infants Fed Either Human Milk Protein Fortified Human Milk or a Whey-Predominant Formula" de G. Moro. y col. publicado en "Acta Paediatrica Scandinavica" (vol. 78, Nº 1, 1989, págs 18-22) describe la leche humana fortalecida con proteína de leche humana ultrafiltrada.
Las sustancias que constituyen la leche humana incluyen diversas proteínas de unión a calcio tales como alpha-lactalbúmina, calmodulina y osteocalcina (Lonnerdal B, Glazier C. Calcium binding by alpha-lactalbumin in human milk and bovine milk. J Nutr 1985; 115:1209-16; Pit-tard WB 3^{rd}, Goddis KM, Hollis BW. Osteocalcin and human milk. Biol Neonate 1993; 63: 61-3). Sorprendentemente, los autores de la presente invención han descubierto que una proteína de unión a calcio particular conocida como S100B está contenida en la leche humana en concentraciones mucho mayores que las encontradas en otros líquidos biológicos, tales como sangre y líquido encefalorraquídeo. Además, la leche humana contiene ARNm para S100B.
S100B es una proteína de unión a calcio ácida, el homodímero de dos sub-unidades beta, que se aisló inicialmente del tejido nervioso, donde se produce en concentraciones altas en las células gliales, y posteriormente también se encontró en otros tejidos, tales como tejido adiposo, donde se concentra particularmente (Heizmann CW. Ca^{2+}-binding S100 proteins in the central nervous system. Neurochem Res 1999; 24: 1097-1100; Michetti F, Dell'Anna E, Tiberio G, Cocchia D. Immunochemical and immunocytochemical study of S-100 protein in rat adipocytes. Brain Res 1983; 262: 352-6). Todavía no se conoce la función biológica de S-100B, aunque se han formulado diversas hipótesis. En modelos y cultivos celulares de animales se ha descubierto que esta proteína puede actuar como una citoquina con un efecto neutrófico (Heizmann CW. Ca^{2+}-binding S100 proteins in the central nervous system. Neurochem Res 1999; 24: 1097-1100). Es interesante observar que la forma en la que la proteína se acumula a nivel caudo-rostral puede estar correlacionada con el desarrollo bioquímico, morfológico y electrofisiológico del sistema nervioso humano (Zuckerman JE, Herschman HR, Levine L. Appearance of a brain specific antigen (th S-100 protein) during human foetal development. J Neurochem 1970; 17: 247-51). La actividad neurotrófica de S100B se confirmó recientemente mediante un ensayo clínico que demostró la correlación entre los niveles proteicos en el cordón umbilical y los eventos fisiológicos asociados con la madurez del cerebro (Gazzolo D, Vinesi P, Marinoni E, Di lorio R, Marras M, Lituania M, Bruschettini P, Michetti F. S100B protein concentrations in cord blood: correlations with gestational age in term and preterm deliveries. Clin Chem 2000; 46: 889-1000). Igualmente, una serie de evidencias demuestran que la leche humana contiene sustancias implicadas en el desarrollo cerebral de los recién nacidos, incluyendo hormonas, factores de crecimiento y citoquinas (Gordon N. Nutrition and cognitive function. Brain Dev 1997; 19:
165-70).
Por lo tanto es importante reproducir el contenido de la proteína S100B de la leche humana en formulados de leche infantil artificial en las que la proteína está presente en concentraciones insuficientes para asegurar un consumo suficiente para las necesidades de desarrollo y crecimiento del cerebro de los niños debido al efecto destructivo del proceso de producción.
Por lo tanto, esta invención se refiere al uso de la proteína S100B como aditivo/suplemento en formulados de leche infantil. La expresión "formulas de leche infantil" significa cualquier formulado "artificial" obtenida mezclando derivados de leche tales como proteínas, azúcares, sales minerales, vitaminas y grasas, posiblemente con la adición de sustancias de diversos orígenes tales como proteína de soja y similares, o una formulado "semi-artificial" basada en la leche de origen animal, tal como leche de vaca adecuadamente tratada y suplementada. Los ejemplos de formulados de leche artificiales se presentan en Friend B. A. y col., Journal of Applied Nutrition, vol 35 N. 2 (1983), págs 88-115 y en las Patentes de Estados Unidos 2694640, 3542560, 3798339 y 3415655.
Formulados de acuerdo con la presente invención se diseñan principalmente para recién nacidos y niños, aunque también las pueden usar mujeres embarazadas para mejorar la formación y desarrollo del cerebro de bebes que todavía no han nacido.
Estas formulados pueden estar listas para uso o en forma concentrada, seca o en polvo para dilución con agua en el momento del uso.
De acuerdo con una realización preferida la proteína S100B se añade a formulado para obtener una concentración final (calculada en el memento del uso) que varía entre 0,1 y 1000 \mug/litros, preferiblemente entre 1 y 500 \mug/l, incluso mas preferiblemente entre 60 \mug/l y 200 \mug/l.
La proteína S100B puede adquirirse (Sigma Aldrich) o purificarse del cerebro bovino o del de otro animal en forma de una mezcla de isoformas de S100A1 y S100B, descritas por Moore (Moore BW, Biochem Biophys Res Commun 19, 1965, 739-744) o Fulle y col (Fulle S, Mariggiò MA, Fanò G, Salvatore AM, Mercanti D, Petrelli C, Calissano P, Neurosci Res Commun 10, 1992, 37-43). S100beta recombiante puede expresarse en Escherichia coli y purificarse como se describe por Van Eldik y col (Van Eldik LJ, Staecker JL, Winningham-Major F, J biol Chem 263, 1988, 7830-7837) y Barger y Van Eldik (Barger SW, Van Eldik LJ J biol Chem 267, 1992, 9689-9694), y la forma dímera "unida a disulfuro" considerada biológicamente activa, puede producirse como se describe por Barger y col (Barger SW, Wolchock SR, Van Eldik LJ, Biochim Biophys Acta 1160, 1992, 105-112) o Scotto y col (Scotto C, Mèly Y, Ohshima H, Garin J, Cochet C, Chambaz E, Baudier J, J biol Chem 273, 1998, 3901-3908). Para los propósitos de la presente invención, puede usarse cualquier variante de especie (incluyendo la variante humana) o isoforma de la proteína S100B con actividad en seres humanos. Se sabe que la secuencia de aminoácidos de la proteína se conserva altamente en filogénesis, variando en menos del 5% entre seres humanos, bueyes, ratas, ratones y cerdos (Moore BW, The S100 protein, in Marangos PJ, Campbell IC, Cohen RM, eds, "Neuronal and glial proteins", Academic Press, San Diego, págs 137-167, 1984). También se conoce la secuencia de nucleótidos del gen humano de S100B (Allore RJ, Friend WC, O'Hanlon D, Neilson KM, Baumal R, Dunn RJ, Marks A, Cloning and expression of the human S100-beta gene, J Biol Chem 265: 15537-15542, 1990).
Ejemplo 1
La proteína S100B se midió en muestras de leche donadas por 16 mujeres con embarazos normales sencillos consecutivos 5 días después del nacimiento, que tuvo lugar entre la semana de gestación 37 y 42. Se realizaron mediciones similares en 16 muestras de diferentes tipos de leche artificial usadas normalmente en la práctica pediátrica. Los criterios de exclusión fueron embarazos múltiples, hipertensión y diabetes en el embarazo, infecciones maternas y fiebre, anomalías cromosómicas, trastornos metabólicos, enfermedad del las mamas, o del sistema nervioso central, malnutrición y enfermedad cardíaca.
Medición de S100B
Después de recoger la leche, las muestra se centrifugaron inmediatamente a 900 rpm durante 10 minutos y los sobrenadantes se almacenaron a -70ºC antes de la medición. La concentración de la proteína S100B se midió en todas las muestras usando un ensayo inmunoluminométrico comercial (Liamat Sangtec 100, AB Sangtec Medical, Bromma, Suecia). El ensayo es específico para la sub-unidad beta de la proteína. Cada medición se realizó por duplicado, siguiendo las instrucciones del fabricante y se registraron las medias. El límite de sensibilidad del ensayo fue de 0,02 \mug/l. La precisión "intra-ensayo" (CV) fue <5% y la precisión "inter-ensayo" fue <10%. Los niveles de S100B en la leche se expresaron como la media \pm SD.
Análisis por transferencia de Western
El procedimiento descrito anteriormente (8) se usó después de electroforesis en minigel de poliacrilamida al 15%-SDS (p/v) usando un aparato Bio-Rad Miniprotean II (Hercules, CA) como se describe por Laemmli (1970). Este procedimiento, que se diseñó especialmente para reducir el riesgo de dispersión de la proteína, incluye fijación con glutaraldehido para aumentar la retención proteica en la membrana. Los reactivos PAGE se suministraron por BioRad, SDS PAGE y patrones de peso molecular de Pharmacia (Uppsala, Suecia). Se añadieron 20 \mul de muestras de leche humana a los geles y se transfirieron electroforéticamente a una lámina de nitrocelulosa (0,45 \muM) en tampón de transferencia (Tris 25 mM, glicina 192 Mm, metanol al 20% v/v) usando un aparato Bio-Rad Mini-transblot. La transferencia se realizó a 100 W durante 60 minutos a 4ºC. Después de la transferencia, la nitrocelulosa se lavó brevemente con PBS y se incubó en glutaraldehido al 0,2% (v/v) en PBS durante 45 minutos a temperatura ambiente para aumentar la retención proteica en la nitrocelulosa. La nitrocelulosa se lavó rápidamente con PBS, y los sitios sin reaccionar se bloquearon con PBS que contenía BSA al 2% (p/v) gelatina al 0,1% (p/v) y Tween 20 al 0,1% (v/v) durante 60 minutos a temperatura ambiente. Después de 5 lavados con PBS que contenía Tween-20 al 0,1% (v/v) (5 minutos para cada lavado a temperatura ambiente) la lámina se incubó durante 60 minutos a temperatura ambiente con el anticuerpo primario (antisuero anti-S100B de conejo 1:2000, Dako, Glostrup, Dinamarca) o suero de conejo pre-inmune en la misma concentración proteica que el suero específico correspondiente) en PBS que contenía BSA y gelatina como se ha indicado anteriormente. La lámina de nitrocelulosa se lavó como se ha descrito anteriormente y después se incubó durante 60 minutos a temperatura ambiente con IgG de cabra anti-conejo biotinilada y se purificó por afinidad (Vector Laboratories) diluida 1:300 en PBS que contenía BSA y gelatina. Después de 5 lavados, la lámina se incubó a temperatura ambiente en la oscuridad con diaminobencidina (kit de sustrato Peroxidasa DAB; Vector Laboratories) para mostrar la reactividad del anticuerpo. No se observó ninguna inmunotinción con los sueros del control. En algunos experimentos, y para los patrones de peso molecular, después de la fijación con glutaraldehido, la lámina se tiñó con amida al 0,1% (p/v) en ácido acético al 45% (v/v) y se destiñó en metanol al 90% (v/v) y ácido acético al 2% (v/v) para revelar las proteínas transferidas.
Análisis por RT-PCR
Se extrajo el ARN de 10 ml de leche humana usando el sistema de purificación total "micro-a-midi" (Invitrogen-Lifetechnologies). Después de la centrifugación de la muestra 900 rpm durante 10 minutos, el sedimento celular se trató de acuerdo con el protocolo de extracción de ARN indicado por el fabricante. La concentración de ARN en cada muestra se midió por espectrofotometría (espectrofotómetro Hewlett Packard HP UV/VIS 8450) Las muestras de ARN se almacenaron a -20ºC hasta que el análisis por RT-PCR se realizó. La transcripción inversa (RT) se realizó en 2 \mug de ARN de leche humana y 2 \mug de ARN de cerebro humano como control positivo. El volumen de reacción final fue de 40 \mul, en la enzima usada fue transcriptasa inversa SUPERSCRIPT II (invitrogen-Lifetechologies); Las condiciones de RT estaban de acuerdo con el protocolo del fabricante (50 minutos a 42ºC y 15 minutos a 72ºC). El ADNc se almacenó a -20ºC hasta que se realizó el ensayo por PCR. El ensayo por PCR se realizó en 2 \mul de ADNc por muestra en un volumen final de 25 \mul. Las condiciones de reacción para S100B fueron de 10 pmol para cebador, 200 \muM cada dNTP, 2,5 unidades de Taq polimerasa (ampliTaq Gold DNA polimerase, Applied Biosystems), Mg Cl_{2} 2,2 mM y 1X tampón de PCR I (Applied Biosystems).
Los cebadores usados fueron 5'-CATTTCTTAGAGGAAATC-3' (sentido) 5'ATGTTCAAAGAACTCGTG-3'(antisentido). Estos cebadores son específicos para ARNm de S100B humana (Riol H, Tardy M, Rolland B, Levesque G, VenMurthy MR, Detection of the peripheral nervous system (PNS)-type glial fibrillary acidic protein (GFAP) and its mRNA in human lymphocytes, J Neurosci Res 48: 53-62, 1997). Las condiciones de amplificación fueron de 95ºC durante 9 minutos, seguido de 43 ciclos a 95ºC durante 15 segundos y ciclos a 72ºC durante 30 segundos, seguido de una prolongación final a 72ºC durante 5 minutos.
Como se indica, el control positivo para PCR fue ADNc humano obtenido mediante transcripción inversa del ARN extraído mediante el mismo procedimiento de un cerebro humano sometido a autopsia. También se usó un control negativo (ADNc reemplazado con H_{2}O) para detectar la contaminación. Los productos de amplificación se examinaron mediante electroforesis (agarosa al 1,7% teñida con bromuto de etidio). Todas las muestras se examinaron por triplicado. El amplicón esperado fue de una banda de 147 pb y se comparó con marcador pUC Mix 8 (MBI Fermentas).
Para confirmar la especificidad del producto de amplificación, los amplicones se digirieron con la enzima HaeIII (MIB Fermentas), que tiene un único sitio de restricción en el fragmento de ADNc de S100B. Los fragmentos digeridos se analizaron en agarosa al 2,5% teñida con bromuro de etidio.
Resultados
En el tiempo de muestreo o alta del hospital, todas las madres presentaban condiciones clínicas normales y no había evidencias de trastornos del sistema nervioso central y/o enfermedades infecciosas. Todas las muestras de leche humana de niveles medibles contenidos analizados de S100B, que variaban de 62 \mug/l a 212 \mug/l (114,6 \pm 52 media \pm SD) fueron significativamente superiores (p< 0,001) a las leches artificiales (24,8 \pm 19,5 \mug/l). El análisis por transferencia de Western de las muestras de leche realizadas con un antisuero anti-S100B de conejo presentó una mayor banda que migró con un peso molecular aparentemente comparable con el de la S100B purificada del cerebro bovino (en 14.400 kD). No se observó ninguna reactividad con el suero del conejo de control. El análisis por RT-PCR produjo el amplicón de S100B 147 pb de tanto el ARN de leche humana como del ARN del cerebro humano. Los productos positivos de PCR, digeridos con la enzima de restricción y sometidos a electroforesis gélica, mostraron las bandas esperadas de 100 pb y 47 pb respectivamente, confirmando la presencia de un sitio de restricción HaIII en los fragmentos amplificados.
Ejemplo 2
La evaluación neurológica a corto plazo de 14 recién nacidos tratados con leche materna (MM) (con una alta concentración de S100B, que variaba de 62 \mug/ml a 212 \mug/l) se comparó con la de 14 recién nacidos prematuros que recibieron leche artificial (AM) / (con una concentración baja de S100B, que variaba de 12 \mug/l a 36 \mug/l); los bebes se compararon con respecto al peso, la edad gestacional en el nacimiento y la incidencia de dificultades respiratorias neonatas.
Los criterios de exclusión fueron embarazos múltiples, infección materna y fiebre, anomalías cromosómicas, trastornos metabólicos, trastornos de las mamas o del sistema nerviosos central y enfermedad cardíaca congénita.
La evaluación neurológica se realizó mediante un procedimiento cuantitativo de acuerdo con el ensayo NNOS (Dijxhoorn MJ, Visser GHA., Fidler VJ, Touwen BCL and Huisjes HJ. Apgar score, meconium and acidaemia at birth in relation to neonatal neurological morbitidy in term infants. Br J Obstet Gynaecol 93: 217-221, 1986) y un ensayo cualitativo de acuerdo con Prechtl y col. (Prechtl HFR. Assessment methods for the newborn infant: a critical evaluation. In: Stratton D, editor. Psychobiology of Human Newborn. Chichester: Wiley, 1982: 21-52).
Resultados
Los resultados demuestran que aunque los problemas respiratorios y cardiovasculares después del nacimiento fueron casi idénticos en los dos grupos, la madurez neurológica cuantitativa (MM: 59 \pm 4 frente a AM 49 \pm 2) (p<0,05) y la madurez neurológica cualitativa (MM normal/dudosa/patológica: 11/2/1 frente a AM normal/dudosa/patológica: 6/3/5) fue mejor en los grupos tratados con la leche materna.

Claims (5)

1. Formulado de leche infantil artificial añadida con la proteína S100B.
2. Formulado de leche infantil artificial de acuerdo con la reivindicación 1, listas para usarse o reconstituirse en el momento del uso.
3. Formulado de leche infantil artificial de acuerdo con la reivindicación 2, en forma seca, en polvo o en forma de una solución concentrada, para reconstituirse en el momento del uso.
4. Uso de la proteína S100B como aditivo/suplemento para formulados de leche infantil artificiales.
5. Uso de acuerdo con la reivindicación 4, para alimentar a los recién nacidos y a los bebés.
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