ITMI20011969A1

ITMI20011969A1 - Additivo per composizioni di latte per l'infanzia

Info

Publication number: ITMI20011969A1
Application number: IT2001MI001969A
Authority: IT
Inventors: Fabrizio Michetti; Diego Gazzolo
Original assignee: Istituto Giannina Gaslini; Fabrizio Michetti
Priority date: 2001-09-21
Filing date: 2001-09-21
Publication date: 2003-03-21
Also published as: EP1295534A1; EP1295534B1; DE60204269T2; US20040086617A1; ITMI20011969A0; DE60204269D1; US7273632B2; ES2243641T3; ATE296039T1

Description

Descrizione del brevetto per invenzione industriale avente per titolo:

“ADDITIVO PER COMPOSIZIONI DI LATTE PER L’INFANZIA”

La presente invenzione si riferisce all’uso della proteina S100B come additivo per composizioni di latte per l’infanzia.

E noto che il latte materno costituisce il miglior nutrimento per i neonati o i bambini nei primi mesi di vita. Tuttavia, esistono diverse situazioni in cui è necessario ricorrere a preparazioni sintetiche, per lo più ottenute a partire da latte bovino, cui si aggiungono diversi ingredienti tipicamente presenti nel latte umano. Tra le sostanze o additivi che vengono solitamente utilizzati per integrare la composizione del latte artificiale (o sintetico) vi sono proteine, quali caseina, lattoalbumina, lattoferrina, lisozima, peptidi o singoli amminoacidi, anticorpi, in particolare immunoglobulina-A, vitamine, quali vitamine C e D, acidi grassi, sali minerali ed altro. Lo scopo dell’integrazione o additivazione dei preparati sintetici è di riprodurre la composizione quali-quantitativa del latte umano. Si cita ad esempio il brevetto US4303692, dove è descritto un preparato di latte sintetico per l’infanzia che contiene taurina a livelli sostanzialmente equivalenti a quelli trovati nel latte umano. Poiché nella produzione di latte artificiale per l’infanzia basato su latte bovino, il contenuto di taurina si riduce notevolmente causando una diminuita efficacia nutrizionale dei preparati stessi, nel citato brevetto si propone di aggiungere taurina alla composizione del latte sintetico in modo da riprodurre i valori di concentrazione riscontrati nel latte umano. In W096/26647 viene invece proposto di integrare il latte per l’infanzia con miscele di acidi grassi poiinsaturi, in modo da riprodurre la composizione del latte umano e migliorare le risposte neurologiche visive evocate nei neonati.

Tra le sostanze che compongono il latte umano, sono presenti anche diverse proteine leganti il calcio (“calcium-binding proteine”), quali alfalattalbumina, calmodulina, osteocalcina

Gli autori della presente invenzione hanno sorprendentemente scoperto che una particolare proteina legante il calcio, nota come S100B, è contenuta nel latte umano in concentrazioni notevolmente superiori a quelle riscontrate in altri fluidi biologici, quali sangue e liquido cerebrospinale.

S100B è una proteina calcio-legante acida, omodimero di due subunità beta, inizialmente isolata da tessuto nervoso, dove si trova in alte concentrazioni nelle cellule gliali, e successivamente rinvenuta anche in altri tessuti, quale il tessuto adiposo dove è particolarmente concentrata La funzione biologica di S100B rimane tuttora incerta, nonostante si siano formulate diverse ipotesi a riguardo. In modelli animali e in colture cellulari si è visto che tale proteina può agire come una citochina avente effetto neurotrofico

È interessante notare che il modo in cui la proteina si accumula a livello caudo-rostrale, può essere correlato allo sviluppo biochimico, morfologico ed elettrofisiologico del sistema nervoso umano

Recentemente, l’attività neurotrofica di S100B ha trovato conferma in uno studio clinico in cui si è dimostrata la correlazione tra i livelli della proteina nel sangue ombelicale ed eventi fisiologici collegati alla maturazione del cervello

Esistono d’altra parte diverse evidenze a dimostrazione del fatto che il latte umano contiene sostanze, tra cui ormoni, fattori di crescita e citochine, coinvolte nello sviluppo cerebrale di neonati

Date queste premesse, è evidente l’importanza di riprodurre il contenuto di proteina S100B del latte umano nelle composizioni di latte artificiale per l’infanzia, dove detta proteina è presente, in conseguenza dell’effetto distruttivo causato dal procedimento di produzione, in concentrazioni insufficienti a garantire un apporto adeguato alle esigenze di crescita e sviluppo cerebrale nella prima infanzia.

Pertanto, oggetto dell’invenzione è l’uso della proteina S100B come additivo/integratore per composizioni di latte per l’infanzia. Con il termine “composizione di latte per l’infanzia” s’intende una qualsiasi composizione “artificiale”, ottenuta cioè per miscelazione di sostanze derivate dal latte, quali proteine, zuccheri, sali minerali, vitamine, lipidi ed altri, eventualmente con l’aggiunta di sostanze di origine diversa, per esempio proteine di soia od altro, oppure una composizione “semi-artificiale”, ottenuta cioè da una base di latte di origine animale, quale latte bovino, opportunamente trattato e integrato. Esempi di composizioni di latte artificiale sono riportati in Friend

Le composizioni secondo l’invenzione sono principalmente destinate all’alimentazione dei neonati o dei bambini nei primi anni di vita, ma possono anche essere assunte dalle gestanti per migliorare la formazione e lo sviluppo cerebrale del nascituro.

Tali composizioni possono essere già pronte all’uso oppure in forma concentrata, essiccata o in polvere, da diluire con acqua al momento dell’uso.

Secondo una realizzazione preferita, la proteina S100B verrà aggiunta alla composizione in modo da ottenere una concentrazione finale (calcolata al momento dell’uso) variabile tra 1 e 1000 pg/L, preferibilmente tra 60 pg/l e 200 pg/l.

La proteina S100B può essere acquistata (Sigma- Al drich) oppure purificata da cervello bovino o di altro animale sotto forma di mistura delle isoforme SI 00 Al e S100B come descritto da Moore (

B F

Commun 10, 1992, 37-43). S1OObeta ricombinante può essere espressa in Escherichia coli e purificata come descritto da

9694), e la forma dimerica “disulfide-linked”, ritenuta biologicamente attiva, può essere prodotta come descritto da

2 Per gli scopi della presente invenzione potrà essere utilizzata una qualsiasi variante di specie (inclusa la variante umana) o isoforma della proteina S100B dotata di attività nell’uomo. È noto, infatti, che la sequenza aminoacidica della proteina è fortemente conservata nella filogenesi, variando di meno del 5% fra uomo, bue, ratto, topo, maiale (

È altresì nota la sequenza nucleotidica del gene per l’SlOOB umana (A

ESEMPIO 1

La misurazione della proteina S 100B è stata effettuata in campioni di latte donati da 16 donne con singole gravidanze fisiologiche consecutive, a distanza di 5 giorni dal parto, avvenuto tra la 37° e 42° settimana di gestazione. I criteri di esclusione sono stati: gravidanze multiple, ipertensione e diabete in gravidanza, infezioni e febbre materna, anomalie cromosomiche, disturbi metabolici, malattia al seno o al sistema nervoso centrale, malnutrizione, patologie cardiache.

Misurazione di S100B

Dopo la raccolta del latte, i campioni sono stati immediatamente centrifugati a 900g per 10 min, e i sumatanti conservati a -70°C prima della misurazione. La concentrazione della proteina S100B è stata misurata in tutti i campioni, usando un saggio immunoluminometrico disponibile in commercio (Liamat Sangtec 100, AB Sangtec Medicai, Bromma, Svezia). Il saggio è specifico per la subunità beta della proteina. Ciascuna misurazione è stata condotta in doppio seguendo le istruzioni del produttore e sono state riportate le medie. Il limite di sensibilità del saggio era di 0,02 μg/L. La precisione (cv) “intra-saggio” era <5%, mentre quella “inter-saggio” <10%. I livelli di S100B nel latte sono espressi come media SD.

Analisi di Western Blot

Si è utilizzata la procedura precedentemente descritta (8) dopo elettroforesi in mini-gel di poliacrilammide-SDS al 15% (p/v) usando un apparato Bio-Rad (Hercules, CA) Miniprotean II come descritto da Laemmli (1970). Questa procedura, che è stata elaborata appositamente per ridurre il rischio di dispersione della proteina, comprende la fissazione con glutaraldeide per aumentare la ritenzione di proteina sulla membrana. I reagenti PAGE sono stati forniti da Bio-Rad, SDS PAGE e gli standard di peso molecolare da Pharmacia (Uppsala, Svezia). 20 pL di latte umano sono stati aggiunti ai gel e trasferiti elettroforeticamente ad un foglio di nitrocellulosa (0,45 pm) in tampone tranfer (25mM Tris, 192 mM glieina, 20% v/v metanolo) usando un apparato Bio-Rad Mini-transblot. Il trasferimento è stato effettuato a 100W per 60’ a 4°C. Dopo il trasferimento, la nitrocellulosa è stata lavata brevemente con PBS e incubata in 0,2% (v/v) glutaraldeide in PBS per 45 min. a temperatura ambiente per aumentare la ritenzione delle proteine sulla nitrocellulosa. Quest’ultima è stata quindi lavata velocemente con PBS, e i siti non reagiti sono stati bloccati con PBS contenente BSA 2% (p/v), gelatina 0,1% (p/v) e 0,1% (v/v) Tween 20 per 60 min. a temperatura ambiente. Dopo 5 lavaggi con PBS contenente 0,1% (v/v) Tween-20 (5 min. per ciascun lavaggio a temperatura ambiente), il foglio è stato incubato per 60 min. a temperatura ambiente con l’anticorpo primario (antisiero di coniglio anti-S100B 1:2000 Dako (Glostrup, Danimarca) o siero di coniglio pre-immune alla stessa concentrazione proteica del corrispondente siero specifico) in PBS contenente BSA e gelatina come sopra indicato. Il foglio di nitrocellulosa è stato lavato come sopra e successivamente incubato per 60 min. a temperatura ambiente con IgG di capra anticoniglio, biotinilate e purificate per affinità (Vector Laboratories) diluite 1:300 in PBS contenente BSA e gelatina. Dopo 5 lavaggi, il foglio è stato incubato a temperatura ambiente al buio con diaminobenzidina (Peroxidase substrate kit DAB; Vector Laboratories) per visualizzare la reattività anticorpale. Non si è osservata immunocolorazione con i sieri di controllo. In alcuni esperimenti, e per gli standardad di peso mol., dopo fissazione con glutaraldeide il foglio è stato colorato con 0,1% (p/v) nero amido in 45% (v/v) acido acetico e decolorato in 90% (v/v) metanolo e 2% (v/v) acido acetico per rivelare le proteine trasferite.

Risultati

Tutte le madri, al momento del campionamento o della dimissione dall’ospedale, mostravano condizioni cliniche normali e non presentavano evidenza di patologie a carico del sistema nervoso e/o di carattere infettivo. Tutti i campioni analizzati mostravano livelli misurabili di S100B, variabili da 62 pg/L a 212 pg/L (114.6 ± 52 pg/L media ± SD). L’analisi di Western Blot dei campioni di latte usando un antisiero di coniglio anti-S100B mostrava una banda maggioritaria che migrava con un peso molecolare apparente paragonabile a quello di S100B purificata da cervello bovino (minore di 14,400 kD). Non si è osservata reattività con siero di coniglio di controllo.

ESEMPIO 2

La valutazione neurologica a breve termine in 14 neonati trattati con latte materno (LM) (ad alta concentrazione di S100B variabile da 62 pg/L a 212 pg/L) è stata comparata a quella di 14 neonati pretermine che avevano assunto latte artificiale (LA) (a bassa concentrazione di S100B variabile da 12 pg/L a 36 pg/L) confrontati per peso, età gestazionale alla nascita ed incidenza di difficoltà respiratoria neonatale.

I criteri di esclusione sono stati: gravidanze multiple, infezione e febbre materna, anomalie cromosomiche, disturbi metabolici, malattia al seno o del sistema nervoso centrale, patrologie congenite cardiache.

La valutazione neurologica è stata eseguita mediante metodica quantitativa in accordo al test NNOS (

and Huisjes HJ. Apgar score, meconium and acidaemia at birth in relation to neonatal neurological morbidity in term infante. Br J Obstet Gynaecol 93:217-221, 1986) e qualitativa in accordo a Prechtl et al.

Risultati

I risultati ottenuti mostrano che malgrado le problematiche post-natali a carattere respiratorio e cardiovascolare siano pressoché simili nei 2 gruppi la maturazione neurologica quantitativa (LM: 59 ± 4 vs LA: 49 ± 2) (p<0.05) e qualitativa (LM normali/sospetti/patologici: 11/2/1 vs LA normali/ sospetti/patologici: 6/3/5) risultavano migliori nei gruppi trattati con latte materno.

I livelli ematici di S100B risultavano più elevati nei casi alimentati con latte artificiale (LA: 3.14 ± 0.52 pg/L vs LM: 1.11 ± 0.32 pg/L; p<0.05) a significare la presenza di danno cerebrale come evidenziato dalla valutazione neurologica.

Claims

RIVENDICAZIONI 1. Composizione di latte per l’infanzia addizionata con la proteina S100B.
2. Composizione secondo la rivendicazione 1, pronta all’uso oppure da ricostituire al momento dell’uso.
3. Composizione secondo la rivendicazione 2, da ricostituire al momento dell’uso, in forma di soluzione concentrata, essiccata o in polvere.
4. Uso della proteina S100B come additivo/integratore per composizioni di latte per l’infanzia.
5. Uso secondo la rivendicazione 4, per l’alimentazione dei neonati, dei bambini nei primi anni di vita e delle gestanti.