ES2243994T3 - Procedimiento para la inactivacion virica de proteinas de la sangre liofilizadas. - Google Patents
Procedimiento para la inactivacion virica de proteinas de la sangre liofilizadas.Info
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Abstract
SE PRESENTA UN PROCESO PARA LA INACTIVACION VIRAL DE PROTEINAS LIOFILIZADAS DE LA SANGRE, PARTICULARMENTE DEL FACTOR VIII, MEDIANTE CALOR, QUE COMPRENDE LA FORMACION DE UN COMPLEJO ESTABLE ENTRE LA PROTEINA DE LA SANGRE Y UNA CICLODEXTRINA EN UNA SOLUCION ACUOSA. LA SOLUCION SE LIOFILIZA ENTONCES Y SE RECUPERA EL COMPLEJO DE PROTEINA/CICLODEXTRINA DE LA SANGRE. LA PROTEINA/CICLODEXTRINA LIOFILIZADAS DE LA SANGRE SE CALIENTAN ENTONCES, POR EJEMPLO HASTA 80 C DURANTE 72 HORAS, PARA INACTIVAR CUALQUIER VIRUS PRESENTE. EL MATERIAL PUEDE RECONSTITUIRSE ENTONCES ANTES DE SU ADMINISTRACION A UN PACIENTE.
Description
Procedimiento para la inactivación vírica de
proteínas de la sangre liofilizadas.
La presente invención se refiere a la
inactivación de contaminantes víricos de preparados farmacéuticos.
De manera más específica, la presente invención está dirigida a un
proceso para la inactivación de contaminantes víricos de proteínas
de la sangre liofilizadas, particularmente factor VIII, por la
acción del calor.
La utilización terapéutica primaria del factor
VIII ha sido su administración intravenosa a pacientes de hemofilia
A. En casos graves, se requieren concentraciones relativamente
elevadas de factor VIII. Estas elevadas concentraciones se obtienen
por purificación y concentración de factor VIII. El factor VIII se
encuentra a disposición comercialmente en forma de polvo seco,
estéril, liofilizado, que es reconstituido con agua destilada
estéril o con una solución salina fisiológica estéril para infusión
en un paciente de hemofilia A.
En la técnica conocida se describen varios
métodos referentes al factor VIII. El documento
WO-A-9 526 750 da a conocer
formulaciones que comprenden el factor de coagulación VIII o IX para
administración subcutánea, intramuscular o intradérmica, de forma
que aditivos de ciclodextrinas incrementan la biodisponibilidad del
factor VIII (ver página 8, líneas 19-28). Además,
dichas formulaciones se encuentran en forma liofilizada y son
reconstituidas con una solución acuosa (ver página 11, segundo
párrafo). No obstante, no se hace mención en el documento
WO-A-9 526 750 de un complejo
liofilizado de proteína/ciclodextrina que es calentado, como mínimo,
a 60ºC.
El documento WO-A 9 003 784 da a
conocer complejos de ciclodextrina-péptido,
incluyendo factores VIII y IX (ver resumen página 21, líneas
15-25, página 27, líneas 4-7). No
obstante, el documento WO-A-9 003
784 no indica nada sobre una etapa de calentamiento de dicho
complejo de ciclodextrina-péptido a un mínimo de
60ºC.
La patente US-A-5
334 382 da a conocer compuestos de proteínas liofilizados,
incluyendo sustancias de proteínas biológicamente activas combinadas
con ciclodextrina (ver abstracto, columna 3, líneas
26-37, columna 4, línea 51 pasando a columna 5,
líneas 1-37).
La patente US-A-5
304 546 se refiere a complejos de ciclodextrina con compuestos
lipofílicos, en los que la presencia de compuestos biológicos, tales
como sangre, huevo y leche son también contemplados (ver abstracto,
columna 1, líneas 8-18).
El documento
WO-A-9 309 790 da a conocer la
combinación de derivados poliiónicos de ciclodextrina con un factor
de crecimiento (ver abstracto, página 12, líneas
10-27, página 22, línea 30 con página 31, líneas
1-8). Ninguna referencia se hace en el documento
WO-A-9 309 790 al calentamiento de
un complejo liofilizado de una proteína y ciclodextrina.
El documento
EP-A-614 666 da a conocer complejos
de polipéptidos liofilizados con ciclodextrina a utilizar en
soluciones parenterales (ver abstracto, página 3, líneas
9-12, reivindicaciones 1-13).
El documento
WO-A-820 387 da a conocer un método
de inactivación de virus en compuestos que contienen factores
coagulantes de la sangre VII, IX y X por calentamiento de los
compuestos en estado seco (ver abstracto, página 15, líneas
9-24, página 17, líneas 6-14).
Además, en la página 6, líneas 11-15 se menciona la
presencia de estabilizantes, tales como monosacáridos reductores,
oligosacáridos y alcoholes de azúcar.
La publicación Pharmaceutical Research,
9(2), 1992, pp. 266-270, M.E. Ressing y
otros, llega al resultado que la
hidroxipropil-beta-ciclodextrina
(HPbetaCD) es el estabilizante más efectivo del anticuerpo
monoclonal liofilizado (MN12). Ressing y otros hacen referencia a la
estabilidad de tortas de MN12 liofilizadas que contienen HPbetaCD,
con respecto a alteraciones de carga inducidas por calor y pérdida
de capacidad de unión a antígenos, con lo que los correspondientes
preparados de MN12 son tratados a una temperatura de 56ºC. Ressing y
otros no mencionan otras gamas de temperatura.
El problema que subyace en estos compuestos es
que cualesquiera contaminantes víricos del factor VIII deben ser
inactivados antes de que el preparado del factor VIII pueda ser
utilizado clínicamente, evitando, de esta manera, la propagación de
HIV, hepatitis, etc. Existen una serie de enfoques diferentes para
inactivar virus en el factor VIII. Un enfoque consiste en calentar
el producto liofilizado a un mínimo de 60ºC durante un mínimo de 10
horas. Habitualmente, los productos liofilizados son calentados a
60ºC o, incluso, a 80ºC durante 72 horas.
Se ha descubierto que un producto de factor VIII
tratado térmicamente, liofilizado, requiere más tiempo de lo deseado
en ser reconstituido, y, adicionalmente, el producto de factor VIII
puede perder una parte sustancial de su actividad durante el proceso
de liofilización y calentamiento. De acuerdo con ello, el
calentamiento del factor VIII liofilizado durante períodos de tiempo
prolongados, por ejemplo, 80ºC durante 72 horas, para conseguir la
inactivación vírica, no es un enfoque preferente.
La presente invención da a conocer un
procedimiento para la estabilización de proteínas de la sangre
liofilizadas, particularmente factor VIII liofilizado, durante la
inactivación vírica por la acción del calor. El proceso comprende el
disponer una solución acuosa de proteína de la sangre. Se añade
ciclodextrina a una solución en una cantidad suficiente para formar
un complejo, como mínimo, con una parte de la proteína de la sangre
y preferentemente la totalidad de la misma. La solución es
liofilizada a continuación para conseguir un complejo seco de
proteína de la sangre/ciclodextrina.
El complejo liofilizado de proteína de la
sangre/ciclodextrina es calentado a continuación a una temperatura
mínima de 60ºC, durante un tiempo suficiente para inactivar
cualquier contaminante vírico y, más preferentemente, a un mínimo de
unos 80ºC durante un tiempo mínimo de unas 10 horas y,
preferentemente, un mínimo de 72 horas. El complejo víricamente
inactivado de proteína de la sangre/ciclodextrina puede ser
reconstituido posteriormente para conseguir una solución de la
proteína de la sangre administrable a un paciente.
Se ha descubierto que la estabilización de una
proteína de la sangre con ciclodextrina antes de liofilización
resulta en una notable reducción de la desnaturalización de la
proteína durante la inactivación vírica por acción de calor, en
seco. De forma adicional, el tiempo de reconstitución para la
proteína de la sangre liofilizada, estabilizada de acuerdo con la
práctica de la presente invención, se reduce sustancialmente, con
una reducción correspondiente de precipitados insolubles.
Los objetivos de la presente invención se
consiguen mediante las reivindicaciones que se adjuntan.
Estas y otras características, aspectos y
ventajas de la presente invención se comprenderán mejor haciendo
referencia a la siguiente descripción, reivindicaciones adjuntas y
dibujos, en los que:
las figuras 1A-1C muestran,
respectivamente, \alpha-ciclodextrina,
\beta-ciclodextrina, y
\gamma-ciclodextrina;
la figura 2 es un gráfico de barras, que indica
la actividad residual del factor VIII como función de la
concentración de hidroxi propil
\beta-ciclodextrina; y
la figura 3 es un gráfico de barras que indica la
actividad residual del factor VIII como función de la concentración
de ciclodextrina.
La presente invención está dirigida a un
procedimiento que incorpora la utilización de diferentes
ciclodextrinas para estabilizar proteínas liofilizadas, durante la
inactivación vírica por calor en seco, y para ayudar a reconstituir
estas proteínas después de la inactivación vírica. Entre las
proteínas de la sangre con las que se puede utilizar el presente
proceso se incluyen albúmina, Factor II, Factor VII, Factor VIII,
Factor IX, Factor X y X_{a}, fibrinógeno, antitrombina III,
transferrina, haptoglobina, gama globulinas, fibronectina, proteína
C, proteína S y trom-
bina.
bina.
Las ciclodextrinas son un grupo de oligosacáridos
homólogos, que son obtenidos a partir del almidón por la acción de
enzimas procedentes de Bacillus macerans. Son moléculas
cíclicas que contienen seis o más unidades
\alpha-D-glucopiranosa ligadas
entre sí en las posiciones 1, 4, tal como en la amilosa. Esta
estructura cíclica puede ser indicada también como toro.
Las ciclodextrinas útiles en la práctica de la
presente invención son las \alpha-, \beta- y
\gamma-ciclodextrinas, que están compuestas,
respectivamente, de seis, siete y ocho unidades de
\alpha-D-glucopiranosa, así como
derivados, tales como
hidroxipropil-\beta-ciclodextrina.
Las figuras 1a, 1b y 1c muestran la estructura de
tres de las ciclodextrinas más habituales. La
\alpha-ciclodextrina tiene seis unidades de
glucopiranosa, la \beta-ciclodextrina tiene siete
unidades de glucopiranosa, y la
\gamma-ciclodextrina tiene ocho unidades de
glucopiranosa. Se incluyen mezclas de estos materiales en el término
"ciclodextrina" que se utiliza en esta descripción.
La ciclodextrina puede ser añadida a una solución
acuosa, que contiene la proteína de la sangre antes de liofilización
en cualquier punto adecuado del proceso de purificación.
Preferentemente, la ciclodextrina es añadida a una solución acuosa
de la proteína de la sangre después de que se han completado todas
las etapas de purificación. Esto se lleva a cabo para impedir que la
ciclodextrina forme un complejo con impurezas, haciendo más difícil
la eliminación de las impurezas.
La ciclodextrina se añade en una cantidad
suficiente para asegurar la formación de un complejo con todas las
proteínas de la sangre deseadas. Es adecuada para la mayor parte de
aplicaciones una cantidad de ciclodextrina que proporcione una
solución acuosa con una concentración de ciclodextrina mínima de
0,1%, preferentemente de
aproximadamente 0,8% a aproximadamente 5% en peso/volumen (peso/volumen), y, más preferentemente, 3% peso/volumen aproximadamente.
aproximadamente 0,8% a aproximadamente 5% en peso/volumen (peso/volumen), y, más preferentemente, 3% peso/volumen aproximadamente.
Se ha descubierto que la presencia de
ciclodextrina durante inactivación vírica por acción del calor de la
proteína de la sangre liofilizada reduce sustancialmente la
desnaturalización de la proteína de la sangre. La actividad residual
de la proteína de la sangre, después de la inactivación vírica por
calor, en seco, a 80ºC durante 72 horas y reconstitución es, como
mínimo, de 90% y, preferentemente, como mínimo de 95%, e incluso de
modo más preferente, como mínimo, de 98% aproximadamente de la
actividad de la proteína de la sangre antes de inactivación
vírica.
También se ha descubierto que el tiempo de
reconstitución se reduce sustancialmente por la presencia de
ciclodextrina durante la liofilización y la activación por calor, en
seco.
En una realización a título de ejemplo, el
material inicial para el liofilizado de factor VIII es plasma,
congelado a una temperatura aproximada de -20ºC. El plasma es
descongelado a una temperatura de 0º a 5ºC, durante cuyo tiempo se
forma un precipitado (crioprecipitado) que se retira por
centrifugación y se recupera para purificación y concentración
adicionales.
El crioprecipitado es suspendido en agua
destilada heparinizada (250 unidades de heparina o menos por mL) y
es mezclada a 25 \pm 10ºC hasta que queda bien suspendida y el pH
de la solución se ajusta a 7,0 \pm 1,0 con HCl diluido. El volumen
de agua destilada de heparinizado utilizada es de 6 \pm 4 litros
por kilo de crioprecipitado.
A continuación, se añadió PEG a la solución hasta
una concentración final de 3 \pm 2% y se mezcló a 25 \pm 10ºC.
El pH de la suspensión se ajustó a continuación de 6,5 \pm 1,0 con
ácido acético diluido. La suspensión se mezcló a una temperatura de
25 \pm 10ºC durante un tiempo no inferior a 15 minutos. El
precipitado formado se retiró por centrifugación.
El sobrenadante recuperado de la centrifugación
fue filtrado para eliminar cualesquiera partículas sólidas,
formando, de esta manera, una solución filtrada de factor VIII. Se
añadieron Tri(n-butyl) fosfato (TNBP) y
Polisorbato 80 a la solución de factor VIII filtrada hasta una
concentración final de 0,30 \pm 0,02% TNBP volumen/peso y 1,00
\pm 0,05% de polisorbato 80 peso/peso. El pH de la mezcla fue
ajustado a 6,5 \pm 1,0 con ácido acético diluido e hidróxido
sódico. El producto fue transferido, a continuación, a un área de
control vírico siguiendo 1 hora de incubación a 27ºC \pm 3ºC. La
suspensión fue mezclada a 27ºC \pm 3ºC durante un tiempo no
inferior a 6 horas y no superior a 12 horas para formar una solución
de disolvente detergente (SD) de factor VIII.
La solución SD de factor VIII fue cargada en una
columna cromatográfica de intercambio aniónico
QAE-55OC con un tampón de unión que comprendía NaCl
0,35 M e histidina 0,025 M con un pH de 6,8. La columna fue lavada
con un tampón de lavado que comprendía NaCl 0,35 M e histidina 0,025
M, con un pH de 6,8 y, a continuación, se lavó nuevamente con un
tampón de lavado, comprendiendo CaCl_{2} a 0,1 M e histidina 0,025
M a un pH de 6,8. El factor VIII fue eluido con un tampón de
elución, comprendiendo CaCl_{2} 0,2 M e histidina 0,025 M, con un
pH de 6,8. El factor VIII fue entonces purificado adicionalmente,
utilizando glicina y NaCl para precipitar el factor VIII. Se añadió
la glicina al eluído hasta una concentración final de 2 M y, a
continuación, se añadió NaCl hasta una concentración final de 1,6 M.
La mezcla fue incubada a continuación durante 2 horas a temperatura
ambiente. La mezcla fue centrifugada y el factor VIII precipitado
fue recuperado. El precipitado de complejo de factor VIII fue
reconstituido en una solución de arginina 0,1 M e histidina 0,025 M,
con un pH de 7,3. Esta solución se indica también como "masa
purificada". La actividad del factor VIII en la solución fue
medida, y esta solución fue utilizada, a continuación, para otros
pro-
cesos.
cesos.
En este ejemplo, una solución estéril de masa de
factor VIII, según el Ejemplo 1, con la actividad específica de 370
unidades por miligramo, fue llenada en viales con diferentes
aditivos y, a continuación, fue liofilizada. El producto liofilizado
de factor VIII fue sometido, a continuación, a
secado-calentamiento (DH) (80ºC durante 72 horas).
Los preparados finales fueron reconstituidos con agua para
inyección. El tiempo de reconstitución y la actividad residual del
factor VIII se midieron durante un ensayo de coagulación de una
etapa. Los resultados de las pruebas, que se indican en la siguiente
tabla 1, muestran que el factor VIII que fue liofilizado a partir de
la solución que comprendía 3% de ciclodextrina
(hidroxipropil-\beta-ciclodextrina)
era más estable que el factor VIII preparado utilizando diferentes
cantidades de otros materiales, tales como albúmina, Tween 80®, PEG,
glicina, citrato sódico, dextrina e histi-
dina.
dina.
| Aditivo | F.VIII: U/ml | Tiempo de reconstitución | |
| antes de DH | después de DH | (seg.) después de DH | |
| Sin aditivo | 77,5 (100%) | 45,1 (58%) | 20 |
| 0,1% Tween 80® | 71,8 ('') | 18,4 (26%) | 12 |
| 0,1% PEG | 83,2 ('') | 13,8 (17%) | >10 min |
| 0,2M glicina | 78,8 ('') | 42,1 (53%) | 15 |
| 0,2M Na citrato | 92,8 ('') | 26,1 (28%) | 60 |
| 3% ciclodextrina | 75,8 ('') | 74,5 (98%) | <10 |
| 3% dextrina | 79,2 ('') | 43,1 (54%) | 22 |
| 0,1M histidina | 70,9 ('') | 51,0 (72%) | 10 |
\vskip1.000000\baselineskip
En un experimento similar, se prepararon
soluciones de control y de prueba utilizando 0,5% de albúmina y 3%
de ciclodextrina como aditivos. Las soluciones fueron liofilizadas,
y las muestras liofilizadas fueron sometidas a continuación a secado
térmico a 80ºC durante 72 horas. Los resultados de la prueba se
muestran en la siguiente tabla II. Se muestra que el factor VIII
asociado con ciclodextrina al 3% era sustancialmente más estable
cuando se calentaba en seco que con el factor VIII estabilizado con
0,5% de albúmina solamente.
| Aditivo | Calentamiento en seco (80ºC, 72 horas) | F.VIII:C. U/ml (%) |
| Sin aditivo | antes DH | 132 (100) |
| después DH | 86 (65) | |
| 0,5%-albúmina | antes DH | 128 (100) |
| después DH | 98 (77) | |
| 3%-ciclodextrina (HPB) | antes DH | 127 (100) |
| después DH | 114 (90) |
\vskip1.000000\baselineskip
En otra prueba, la concentración óptima de
ciclodextrina utilizada para estabilizar el factor VIII fue
estudiada midiendo la actividad residual del factor VIII como
función de la concentración de la ciclodextrina utilizada en la
solución antes de liofilización y calentamiento en seco. Los
resultados, que se indican en la figura 2, muestran que, para la
concentración de 0,2% de ciclodextrina, la actividad residual del
factor VIII era aproximadamente del 62%; para una concentración de
3% de ciclodextrina, la actividad de factor VIII era aproximadamente
de 98-99%, mientras que para una concentración de 5%
de ciclodextrina, la actividad residual descendió aproximadamente a
88%-
90%.
90%.
En otra prueba el factor VIII fue estabilizado
con tres ciclodextrinas distintas, a saber,
hidroxipropil-\beta-ciclodextrina
al 3%,
metiléter-\beta-ciclodextrina al
3%, y \gamma-ciclodextrina al 3%. Los resultados
de esta prueba se indican en la siguiente tabla III, mostrando que
cada una de las tres diferentes ciclodextrinas utilizadas era eficaz
en la estabilización del factor VIII.
| Aditivo | Calentamiento en seco (80ºC, 72 horas) | F.VIII:C U/ml (%) |
| 3% hidroxipropil-\beta-ciclodextrina (HPB) | antes DH | 58 (100) |
| después DH | 52 (90) | |
| 3% metil éteres-\beta-ciclodextrina | antes DH | 68 (100) |
| después DH | 69 (101) | |
| 3% \gamma-ciclodextrina | antes DH | 54 (100) |
| después DH | 61 (113) |
Las descripciones anteriores de realizaciones de
procesos a título de ejemplo para la preparación de productos de
Factor VIII estabilizados tienen objetivo ilustrativo. El ámbito de
la invención es el que se define en las siguientes
reivindicaciones.
Claims (20)
1. Procedimiento para la inactivación de
contaminantes víricos de proteínas, que comprende las siguientes
etapas:
(a) disponer una solución acuosa de proteína;
(b) añadir a la solución una ciclodextrina en una
cantidad suficiente para formar un complejo estable con la
proteína;
(c) liofilizar la solución de la etapa (b) y
recuperar el complejo de proteína liofilizada/ciclodextrina; y
(d) calentar el complejo de proteína
liofilizada/ciclodextrina a un mínimo de 60ºC durante un tiempo
suficiente para inactivar cualesquiera virus presentes en el
complejo de proteína/ciclodextrina.
2. Procedimiento, según la reivindicación 1, en
el que la ciclodextrina es seleccionada del grupo que consiste en
\alpha-ciclodextrina,
\beta-ciclodextrina y
\gamma-ciclodextrina, y mezclas de las
mismas.
3. Procedimiento, según la reivindicación 1, en
el que la ciclodextrina es añadida en una cantidad suficiente para
conseguir una concentración de ciclodextrina mínima de 0,1%
(peso/volumen).
4. Procedimiento, según la reivindicación 1, en
el que el complejo liofilizado de proteína/ciclodextrina recuperado
en la etapa (c) es calentado a una temperatura mínima de unos 60ºC,
durante un tiempo mínimo de 10 horas.
5. Procedimiento, según la reivindicación 1, en
el que el complejo liofilizado de proteína/ciclodextrina recuperado
en la etapa (c) es calentado a una temperatura, como mínimo, de unos
80ºC durante un mínimo de 72 horas.
6. Procedimiento, según la reivindicación 1, que
comprende, además, la etapa que reconstituye el complejo liofilizado
de proteína/ciclodextrina.
7. Procedimiento, según la reivindicación 1, en
el que se añade ciclodextrina a la solución de la etapa (a) hasta
una concentración comprendida aproximadamente entre 0,8% y 5%
(peso/volumen).
8. Procedimiento, según la reivindicación 1, en
el que la ciclodextrina es añadida a la solución de la etapa (a) a
una concentración aproximada de 3% (peso/volumen).
9. Procedimiento, según la reivindicación 1, en
el que la proteína es seleccionada del grupo que consiste en
albúmina, Factor II, Factor VII, Factor VIII, Factor IX, Factor X y
X_{a}, fibrinógeno, antitrombina III, transferina, haptoglobina,
gama globulinas, fibronectina, proteína C, proteína S, trombina y
inhibidor de C1.
10. Procedimiento, según la reivindicación 9, en
el que la proteína es Factor VIII.
11. Procedimiento, según la reivindicación 6, en
el que la actividad residual de la proteína después de
liofilización, calentamiento y reconstución es, como mínimo, de 90%
de la actividad de la proteína antes de liofilización.
12. Procedimiento, según la reivindicación 6, en
el que la actividad residual de la proteína después de
liofilización, calentamiento y reconstitución es, como mínimo,
aproximadamente 95% de la actividad de la proteína antes de
liofilización.
13. Procedimiento para la inactivación vírica de
contaminantes del factor VIII, que comprende las siguientes
etapas:
(a) disponer una solución acuosa de Factor
VIII;
(b) añadir a la solución una ciclodextrina
seleccionada del grupo que consiste en
\alpha-ciclodextrina,
\beta-ciclodextrina y
\gamma-ciclodextrina, de manera que la solución
tiene una concentración de ciclodextrina comprendida aproximadamente
de 0,1% a 3% (peso/volumen) para formar de esta manera un complejo
Factor VIII/ciclodextrina;
(c) liofilizar la solución de la etapa (b) y
recuperar el complejo liofilizado de Factor VIII/ciclodextrina;
y
(d) calentar el complejo liofilizado de Factor
VIII/ciclodextrina a un mínimo de 60ºC durante un tiempo suficiente
para inactivar cualesquiera virus presentes en el complejo de Factor
VIII/ciclodextrina.
14. Procedimiento, según la reivindicación 13, en
el que el complejo de Factor VIII/ciclodextrina liofilizado
recuperado de la etapa (c) es calentado a una temperatura mínima de
unos 60ºC durante un mínimo de unas 10 horas.
15. Procedimiento, según la reivindicación 13, en
el que el complejo de Factor VIII/ciclodextrina liofilizado
recuperado en la etapa (c) es calentado a una temperatura mínima de
unos 80ºC durante un mínimo de unas 72 horas.
16. Procedimiento, según la reivindicación 13,
que comprende además la etapa de reconstituir el complejo
liofilizado de Factor VIII/ciclodextrina.
17. Procedimiento, según la reivindicación 13, en
el que se añade ciclodextrina a la solución de la etapa (a) a una
concentración aproximadamente comprendida entre 0,8% y 5%
(peso/volumen).
18. Procedimiento, según la reivindicación 13, en
el que la ciclodextrina se añade a la solución de la etapa (a) en
una concentración aproximada de 3% (peso/volumen).
19. Procedimiento, según la reivindicación 16, en
el que la actividad residual del factor VIII después de
liofilización, calentamiento y reconstitución es, como mínimo, 90%
aproximadamente de la actividad de Factor VIII antes de la
liofilización.
20. Procedimiento, según la reivindicación 16, en
el que la actividad residual del Factor VIII después de
liofilización, calentamiento y reconstitución es, como mínimo, 95%
de la actividad del Factor VIII antes de la liofilización.
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