ES2244004T3

ES2244004T3 - Agentes antiparasitarios.

Info

Publication number: ES2244004T3
Application number: ES97938625T
Authority: ES
Inventors: Kevin M. Byrne; Arlene M. Dahl; Anne W. Dombrowski; Joyce A. Greene; John G. Ondeyka; Dan A. Ostlind; Sheo B. Singh; Diane M. Vesey
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1996-08-30
Filing date: 1997-08-26
Publication date: 2005-12-01
Anticipated expiration: 2017-08-26
Also published as: ZA977738B; PT938308E; DK0938308T3; EP0938308B1; WO1998008507A1; EP0938308A4; US5834260A; EP0938308A1; JP2001501176A; DE69733715T2; US5945317A; JP3755898B2; AU4091297A; NZ333979A; AU713634B2; ATE299372T1; CA2264066A1; DE69733715D1; CA2264066C

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A NUEVOS COMPUESTOS, AISLADOS A PARTIR DE LA FERMENTACION DE CULTIVOS PRODUCTORES DE NODULISPORIUM SP., QUE RESULTAN SER AGENTES ANTIPARASITARIOS E INSECTICIDAS.

Description

Agentes antiparasitarios.

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

Esta solicitud está basada en, y reivindica prioridad de, la solicitud provisional número 60/024.911, presentada el 30 de agosto de 1996.

Antecedentes de la invención

La patente de EE.UU. 5.399.582 describe nuevos compuestos antiparásitos que tienen las fórmulas estructurales:

1

2

3

Los compuestos anteriores se aíslan del medio de fermentación de Nodulisporium sp., ATCC 74245, y son potentes agentes ectoparasiticidas, antiparásitos e insecticidas.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a nuevos agentes antiparásitos y a agentes ectoparasiticidas. Por tanto, es un objetivo de esta invención dar a conocer dichos nuevos compuestos. Es un objetivo adicional proporcionar un nuevo procedimiento para la preparación de dichos compuestos. Es un objetivo adicional describir el microorganismo utilizado para preparar dichos compuestos y las condiciones de fermentación aplicables a dicha producción. Es un objetivo adicional más describir composiciones y procedimientos que utilizan los presentes compuestos como agentes antiparásitos. Resultarán evidentes objetivos adicionales a partir de la lectura de la siguiente descripción.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona nuevos compuestos que tienen las siguientes estructuras, y sus sales y ésteres farmacéuticamente aceptables:

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

\vskip1.000000\baselineskip

15

Las fórmulas estructurales anteriores se muestran sin una estereoquímica definitiva en ciertas posiciones y con una estereoquímica definida en otras posiciones, y debe considerarse que la presente invención abarca todos dichos estereoisómeros. En particular, los estereoisómeros de los diversos centros asimétricos pueden estar orientados en a o b, lo que representa que dichos grupos están por debajo o por encima del plano general de la molécula, respectivamente.

Los nuevos compuestos de la presente invención están estructuralmente relacionados con los compuestos 1, 2 y 3, y se preparan mediante la fermentación de una cepa del género fúngico Nodulisporium designada MF5954 en la colección de cultivos de Merck & Co., Inc., Rahway, New Jersey, o mutantes derivados de la misma. MF5954 se ha depositado en la colección permanente de la American Type Culture Collection en 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, y se le ha dado el número de acceso 74245. El depósito se realizó el 21 de septiembre de 1993 según el Tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos con fines de procedimientos de patente. Se describen las características morfológicas y culturales de Nodulisporium sp. MF5954 en la patente de EE.UU. 5.399.582.

Se ha mostrado que los mutantes derivados de ATCC 74245 producen nuevos compuestos de la presente invención. Aunque la mutación puede inducirse mediante diversas técnicas conocidas generalmente en la técnica, tales como exposición a mutágeno químico, radiación gamma, irradiación ultravioleta y similares, los mutantes particulares de la presente invención se producen mediante exposición a un mutágeno químico, específicamente N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG). Por tanto, se trata MF5954 (ATCC 74245) de tipo salvaje o un mutante derivado del mismo con NTG a una concentración que se encuentra en el intervalo de aproximadamente 10 a aproximadamente 2.000 \mug/ml, y se incuba el cultivo a la temperatura de crecimiento preferida. Se retiran alícuotas del cultivo en diferentes momentos después de la exposición y se siembran en agar para crecimiento, directamente o después de crecer primero en un medio líquido. Se comprueban aleatoriamente los supervivientes del tratamiento con NTG y se fermentan, y se comprueba periódicamente en el caldo de fermentación la producción de compuestos que están estructuralmente relacionados con los compuestos 1-3 utilizando cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa con detección UV a 270 nm. Los cultivos que parecen producir nuevos compuestos que están estructuralmente relacionados con los compuestos 1, 2 y 3 se fermentan a mayor escala para permitir el aislamiento de suficiente cantidad para la determinación de la estructura.

El tratamiento con NTG de MF5954 de tipo salvaje o un mutante cuya estirpe puede rastrearse hasta MF5954 proporcionaba los siguientes cultivos mutantes identificados por los números de colección de cultivos de Merck. Cada uno de los cultivos mutantes se ha depositado en la colección permanente de la American Type Culture Collection en 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, y se le ha asignado el número de acceso como se indica a continuación. Los depósitos se realizaron el 8 de agosto de 1996 según el Tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos con fines de procedimiento de patente. Se describen las características de los mutantes en la sección de ejemplos.

N^{o} Merck	N^{o} ATCC
MF6047	74380
MF6087	74381
MF6206	74382
MF6222	74383

En otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para la preparación de un compuesto seleccionado de los compuestos 4, 5, 6, 7, 8, 12, 13, 14, 15, 16, 17 y 18, que comprende fermentar una cepa de Nodulisporium sp. capaz de producir dicho compuesto en un medio que contiene fuentes asimilables de carbono, nitrógeno y oligoelementos, y aislar dicho compuesto.

Los presentes compuestos se producen durante la fermentación aeróbica de medios nutrientes sólidos o acuosos adecuados en condiciones descritas a continuación en la presente memoria con una cepa productora de Nodulisporium sp. Son adecuados medios acuosos y sólidos, tales como los utilizados para la producción de muchas sustancias antibióticas, para la producción de estos compuestos policíclicos.

Dichos medios nutrientes contienen fuentes de carbono y nitrógeno asimilables por el microorganismo y, generalmente, bajos niveles de sales inorgánicas. Además, los medios de fermentación pueden contener trazas de metales necesarios para el crecimiento de los microorganismos y la producción de los compuestos deseados. Éstos están presentes habitualmente en concentraciones suficientes en las fuentes complejas de carbono y nitrógeno, que pueden utilizarse como fuentes de nutriente pero, por supuesto, pueden añadirse separadamente al medio si se desea.

En general, los carbohidratos tales como azúcares, por ejemplo, glucosa, sacarosa, maltosa, lactosa, dextrina, cerelosa, harina de maíz, harina de avena y similares y almidones, son fuentes adecuadas de carbono asimilable en los medios nutrientes. Otras fuentes de carbono incluyen alcoholes polihidroxílicos tales como manitol, sorbitol o glicerol, y ácidos orgánicos tales como ácido succínico, ácido cítrico, ácido láctico y ácido propiónico. La cantidad exacta de fuente de carbono que se utiliza en el medio dependerá, en parte, de los otros ingredientes en el medio, pero se encuentra habitualmente que es satisfactoria una cantidad de carbohidrato de entre 1 y 150 g/l en el medio. Estas fuentes de carbono pueden utilizarse individualmente o pueden combinarse varias de dichas fuentes de carbono en el mismo medio.

Son fácilmente asimilables por Nodulisporium sp. en la producción de los presentes compuestos diversas fuentes de nitrógeno tales como nitrato o sales de amonio, aminoácidos, hidrolizados de proteína, hidrolizados de levadura, autolizados de levadura, células de levadura, pasta de tomate, harina de maíz, harina de avena, harina de soja, hidrolizados de caseína, extractos de levadura, licores de maíz fermentado, destilados solubles, harina de semilla de algodón, extracto de carne y similares.

Entre las sales inorgánicas nutrientes que pueden incorporarse a los medios de cultivo están las sales acostumbradas capaces de proporcionar sodio, potasio, magnesio, amonio, calcio, fosfato, sulfato, cloruro, carbonato e iones similares. Se incluyen también oligoelementos tales como hierro, cinc, manganeso, cobre, boro, molibdeno y similares.

La fermentación que emplea Nodulisporium sp. puede realizarse a temperaturas en el intervalo de aproximadamente 20 a aproximadamente 40ºC. Para resultados óptimos, lo más conveniente es realizar estas fermentaciones a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 22 a aproximadamente 36ºC. Las temperaturas de aproximadamente 22 a aproximadamente 30ºC son las más preferidas. El pH del medio nutriente adecuado para producir los presentes compuestos puede variar de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 8,0, con un intervalo preferido de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 7,3. Se ha encontrado también que la producción de los presentes compuestos está favorecida en ausencia de luz.

Las fermentaciones a pequeña escala se llevan a cabo convenientemente disponiendo cantidades adecuadas del medio nutriente en un matraz empleando técnicas estériles conocidas, inoculando el medio con crecimiento celular vegetativo de Nodulisporium sp., tapando ligeramente el matraz con algodón y permitiendo que proceda la reacción a una temperatura ambiente constante de aproximadamente 22 a aproximadamente 30ºC en un agitador giratorio a 95 a 300 rpm durante aproximadamente 7 a 35 días. Para trabajo a mayor escala, es preferible realizar la fermentación en tanques adecuados equipados con un agitador y un medio de aireación del medio de fermentación. El medio nutriente se constituye en el tanque y, después de la esterilización, se inocula con una fuente de crecimiento celular vegetativo de Nodulisporium sp. Se permite continuar la fermentación durante 7 a 30 días con agitación y/o aireamiento del medio nutriente a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 22 a 30ºC. El grado de aireamiento depende de varios factores tales como el tamaño del fermentador, la velocidad de agitación y similares. Generalmente, las fermentaciones a mayor escala se agitan aproximadamente a 95 a 300 rpm y/o se airean con aproximadamente 50 a 500 litros por minuto (lpm) de aire.

La separación de los presentes compuestos del caldo de fermentación completo y la recuperación del compuesto se llevan a cabo mediante extracción de disolvente y aplicación de fraccionamientos cromatográficos con diversas técnicas cromatográficas y sistemas de disolvente.

Los presentes compuestos tienen una baja solubilidad en agua, pero son solubles en disolventes orgánicos. Esta propiedad puede emplearse convenientemente para recuperar el compuesto a partir del caldo de fermentación. Por tanto, en un procedimiento de recuperación, se combina el caldo de fermentación completo con un volumen aproximadamente igual de un disolvente orgánico. Aunque puede emplearse cualquier disolvente orgánico, es preferible utilizar un disolvente inmiscible con agua tal como acetato de etilo, cloruro de metileno, metiletilcetona, cloroformo y similares en la primera extracción. Generalmente, son deseables varias extracciones que utilizan el mismo o diferentes disolventes para conseguir la máxima recuperación. El disolvente retira los presentes compuestos así como otras sustancias que carecen de la actividad antiparásitos del presente compuesto. Si el disolvente es inmiscible con agua, las fases se separan y se concentra el disolvente orgánico a presión reducida. Se dispone el residuo en una columna de cromatografía, que contiene preferiblemente gel de sílice. La columna retiene el producto deseado y algunas impurezas, pero deja pasar muchas de las impurezas, particularmente las impurezas no polares. Se lava la columna con disolventes orgánicos o una combinación de los mismos de polaridad creciente para efectuar la separación de los compuestos deseados. Se evapora el disolvente y se purifica por cromatografía adicionalmente el residuo utilizando cromatografía en columna, cromatografía en capa fina, cromatografía en capa fina preparativa, cromatografía líquida a alta presión y similares, con gel de sílice, óxido de aluminio, resinas de intercambio iónico, geles de dextrano y similares como medio cromatográfico, con diversos disolventes y combinaciones de disolventes como eluyente. Puede emplearse cromatografía de capa fina, a alta presión, líquida y de capa preparativa para detectar la presencia y aislar los presentes compuestos.

El uso de las técnicas anteriores, así de como otras conocidas por los expertos en la técnica, proporcionará fracciones purificadas que contienen los presentes compuestos. La presencia del compuesto deseado se determina analizando en las diversas fracciones cromatográficas la actividad biológica o las características fisicoquímicas. Se han determinado las estructuras de los compuestos mediante análisis detallado de las diversas características espectrales de los compuestos, en particular, su resonancia magnética nuclear, masa, espectros ultravioleta e infrarrojo.

Los compuestos de la presente invención poseen un resto ácido carboxílico, y son por lo tanto capaces de formar sales farmacéuticamente aceptables con bases. El término "farmacéutico" incluye tanto medicamentos humanos como veterinarios. El término "sales farmacéuticamente aceptables" designa sales preparadas a partir de bases no tóxicas farmacéuticamente aceptables, incluyendo bases inorgánicas y bases orgánicas. Las sales derivadas de bases inorgánicas incluyen sales de aluminio, amonio, calcio, cobre, férrica, ferrosa, de litio, magnesio, mangánica, manganosa, de potasio, sodio, cinc y similares. Se prefieren particularmente las sales de amonio, calcio, magnesio, potasio y sodio. Las sales derivadas de bases no tóxicas orgánicas farmacéuticamente aceptables incluyen sales de aminas primarias, secundarias y terciarias, aminas sustituidas incluyendo aminas sustituidas de origen natural, aminas cíclicas y resinas básicas de intercambio iónico, tales como arginina, betaína, cafeína, colina, N,N'-dibenciletilendiamina, dietilamina, 2-dietilaminoetanol, 2-dimetilaminoetanol, etanolamina, etilendiamina, N-etilmorfolina, N-etilpiperidina, glucamina, glucosamina, histidina, hidrabamina, isopropilamina, lisina, metilglucamina, morfolina, piperazina, piperidina, resinas de poliamina, procaína, purinas, teobromina, trietilamina, trimetilamina, tripropilamina, trometamina y similares.

Los ácidos de la presente invención pueden convertirse en los correspondientes ésteres utilizando procedimientos bien conocidos en la técnica. Los ácidos aislados y purificados pueden utilizarse como material de partida; como alternativa, se trata directamente el extracto de fermentación, o fracciones de pureza variable, con un agente esterificante para convertir los ácidos en sus correspondientes ésteres. Por ejemplo, la adición de trimetilsilildiazometano al extracto de fermentación proporciona el correspondiente éster metílico, y el éster resultante se aísla después a partir del extracto de fermentación. El éster así aislado puede hidrolizarse por supuesto al ácido original si se desea.

Los compuestos de esta invención encuentran su uso principal como agentes antiparásitos en el tratamiento y/o la prevención y el tratamiento de enfermedades causadas por parásitos, por ejemplo, parásitos artrópodos tales como garrapatas, piojos, pulgas y otros insectos picadores en animales domesticados y aves de corral, tales como Tenophalides, Ixodes, Psoroptes, Lucilia y Hemotobia. Son también eficaces en el tratamiento o la prevención de enfermedades parasíticas tales como helmintiasis, que aparecen en otros animales incluyendo seres humanos. La cantidad óptima a emplear para mejores resultados dependerá, por supuesto, de la especie animal a tratar y del tipo y gravedad de la infección o infestación parasítica. Generalmente, se obtienen buenos resultados con los nuevos compuestos mediante la administración oral de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 100 mg por kg de peso corporal animal, estando administrada dicha dosis total de una vez o en dosis divididas durante un periodo relativamente corto de tiempo tal como 1-5 días. Con el nuevo compuesto de la presente invención, se obtiene un excelente control de dichos parásitos en animales mediante la administración de aproximadamente 0,025 a aproximadamente 50 mg por kg de peso corporal en una dosis única. Se administran tratamientos repetidos cuando sea necesario para combatir reinfecciones, y dependen de la especie de parásito y de las técnicas de cultivo que se estén empleando. Las técnicas para administrar estos materiales a animales son conocidas por los expertos en el campo veterinario.

Los presentes compuestos son también activos contra plagas domésticas tales como cucarachas, Blatella sp, hormigas, polillas de la ropa Solenopsis, Tineola sp., escarabajos de las alfombras, Attagenus sp. y la mosca doméstica Musca domestica.

Lo compuestos de la presente invención son también útiles contra plagas de insectos en granos almacenados tales como Tribolium sp., Tenebrio sp. y en plantas agrícolas tales como arañas garrapatas (Tetranychus sp.), áfidos, Acyrthiosiphon, ortópteros migratorios tales como langostas y fases inmaduras de insectos que viven en tejido de planta. Los compuestos son útiles como nematocidas para el control de nemátodos del suelo y parásitos de plantas tales como Meloidogyne sp., que pueden ser importantes en la agricultura.

Los compuestos de la presente invención se utilizan preferiblemente en forma de una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la presente invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se utiliza en la presente memoria, la composición farmacéutica incluye medicamentos para usos humano y veterinario. El término "composición", como en composición farmacéutica, se pretende que abarque un producto que comprende el(los) ingrediente(s) activo(s) y el(los) ingrediente(s) inerte(s) que constituyen el vehículo, así como cualquier producto que sea el resultado, directo o indirecto, de la combinación, complejación o agregación de cualesquiera dos o más de los ingredientes, o de la disociación de uno o más de los ingredientes, o de otros tipos de reacciones de uno o más de los ingredientes. En consecuencia, las composiciones farmacéuticas de la presente invención abarcan cualquier composición realizada mezclando un compuesto de la presente invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Los compuestos de la presente invención pueden administrarse por vía oral en una forma de dosificación unitaria tal como una cápsula, bolo o comprimido, o en forma de una poción líquida que es normalmente una solución, suspensión o dispersión del ingrediente activo, habitualmente en agua, junto con un agente de suspensión tal como bentonita y un agente humectante o excipiente similar.

Generalmente, las pociones contienen también un agente antiespumante. Las formulaciones de poción contienen generalmente de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 1,0% en peso de los compuestos activos. Las formulaciones de poción preferidas pueden contener de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 0,1% en peso. Las cápsulas y bolos comprenden el ingrediente activo mezclado con un vehículo portador tal como almidón, talco, estearato de magnesio o fosfato de dicalcio.

Cuando se desea administrar los compuestos de la presente invención en una forma de dosificación unitaria sólida seca, se emplean habitualmente cápsulas, bolos o comprimidos que contienen la cantidad deseada de los presentes compuestos. Estas formas de dosificación se preparan mezclando íntima y uniformemente el ingrediente activo con diluyentes, cargas, agentes disgregantes y/o aglutinantes finamente divididos adecuados tales como almidón, lactosa, talco, estearato de magnesio, gomas vegetales y similares. Dichas formulaciones de dosificación unitaria pueden variar ampliamente con respecto a su peso total y al contenido de agente antiparásitos dependiendo de factores tales como el tipo de animal hospedador a tratar, la gravedad y el tipo de infección y el peso del hospedador.

Cuando los compuestos de la presente invención han de administrarse mediante un pienso animal, se dispersan íntimamente en el alimento o se utilizan como aderezo superior o en forma de aglomerados, que pueden añadirse después al alimento finalizado o alimentarse opcionalmente por separado. Como alternativa, los compuestos antiparásitos de esta invención pueden administrarse a animales por vía parenteral, por ejemplo, mediante inyección intrarruminal, intramuscular, intratraqueal o subcutánea, en cuyo caso se disuelve o dispersa el ingrediente activo en un vehículo portador líquido. Para administración parenteral, el material activo se mezcla adecuadamente con un vehículo aceptable, preferiblemente de la variedad aceite vegetal tal como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón y similares. Se utilizan también otros vehículos parenterales tales como una preparación orgánica que utiliza solcetal, glicerol, formal y formulaciones parenterales acuosas. Los compuestos de la presente invención se disuelven o suspenden en la formulación parenteral para administración; dichas formulaciones contienen generalmente de aproximadamente 0,55% a aproximadamente 5% en peso del presente compuesto.

Cuando los compuestos descritos en la presente memoria se administran como componentes del alimento de animales, o se disuelven o suspenden en el agua de bebida, se proporcionan composiciones en las que los compuestos activos se dispersan íntimamente en un vehículo o diluyente inerte. Por vehículo inerte se entiende aquel que no reaccionará con el agente antiparásitos y aquel que puede administrarse con seguridad a animales. Preferiblemente, un vehículo para administración animal es aquel que es, o puede ser, un ingrediente de la ración animal.

Las composiciones adecuadas incluyen premezclas o suplementos alimentarios en los que los presentes compuestos están presentes en cantidades relativamente grandes, y que son adecuados para alimentación directa al animal o para adición al alimento directamente o después de una etapa intermedia de dilución o combinación. Los vehículos o diluyentes típicos adecuados para dichas composiciones incluyen, por ejemplo, granos secados de destilador, harina de maíz, harina cítrica, residuos de fermentación, cáscaras de ostras molidas, salvado de trigo, melazas solubles, harina de mazorca de maíz, alimento comestible de judías molidas, sémola de soja, caliza triturada y similares. Los compuestos de la presente invención se dispersan íntimamente por el vehículo mediante procedimientos tales como molturación, agitación, molienda o tamboreación. Las composiciones que contienen de aproximadamente 0,005% a aproximadamente 2,0% en peso del presente compuesto son particularmente adecuadas como premezclas alimentarias. Los suplementos alimentarios, que se alimentan directamente al animal, contienen de aproximadamente 0,0002% a aproximadamente 0,3% en peso del presente compuesto.

Dichos suplementos se añaden al alimento animal en una cantidad para dar al alimento finalizado la concentración de compuesto activo deseada para el tratamiento y control de enfermedades parasíticas. Aunque la concentración deseada de los compuestos de la presente invención variará dependiendo de los factores citados anteriormente, así como del compuesto particular empleado, los compuestos de esta invención se alimentan habitualmente a concentraciones de entre aproximadamente 0,001% a aproximadamente 0,2% en la alimentación para conseguir el resultado antiparásitos deseado.

Además, cuando el compuesto ha de añadirse a un alimento animal, es posible utilizar la torta micélica secada del caldo de fermentación. Los micelios contienen la mayoría de la actividad, y puesto que el nivel de actividad de los micelios puede determinarse, puede añadirse directamente al alimento animal.

Los compuestos de esta invención son también útiles para combatir plagas agrícolas que producen daño a cosechas mientras éstas crecen o en están en almacenamiento. Los compuestos se aplican utilizando técnicas conocidas como pulverizaciones, polvos, emulsiones y similares, a las cosechas en crecimiento o almacenadas para efectuar la protección de dichas plagas agrícolas.

Los compuestos de esta invención pueden coadministrarse con agentes antihelmínticos. Estos agentes antihelmínticos se pretende que incluyan, pero sin limitación, compuestos seleccionados de la clase de compuestos de avermectina y milbemicina tales como ivermectina, avermectina, abamectina, emamectina, eprinamectina, doramectina, fuladectina, moxidectina, Interceptor y nemadecina. Los agentes antihelmínticos adicionales incluyen bencimidazoles tales como tiabendazol, cambendazol, parbendazol, oxibendazol, mebendazol, flubendazol, fenbendazol, oxfendazol, albendazol, ciclobendazol, febantel, tiofanato y similares. Los agentes antihelmínticos adicionales incluyen imidazotiazoles y tetrahidropirimidinas tales como tetramisol-levamisol, butamisol, pirantel, pamoato, aoxantel o morantel.

Los compuestos de esta invención pueden coadministrarse con fipronil.

Los compuestos de esta invención pueden coadministrarse con un regulador del crecimiento de insectos con actividad inhibidora de la muda tal como lufenurón y similares.

Los compuestos de esta invención pueden coadministrarse con agonistas de ecdisona tales como tebufenozida y similares, que inducen una muda prematura y causan la terminación de la alimentación.

Los compuestos coadministrados se administran mediante las vías y dosis que se utilizan acostumbradamente para esos compuestos.

Se incluyen también en la presente invención composiciones farmacéuticas que contienen un compuesto de la presente invención en combinación con un agente antihelmíntico, fipronil, un regulador del crecimiento de insectos o un agonista de ecdisona.

La actividad antiparásitos de los presentes compuestos puede determinarse administrando por vía oral el alimento, una muestra del compuesto individual, una mezcla de dichos compuestos, un extracto concentrado y similares a un ratón que se había infectado 3 días antes con un parásito apropiado. A los 11, 12 y 13 días después de la iniciación de la medicación, se examinan en las heces del ratón los huevos, y al día siguiente se sacrifica el ratón y se determina el número de gusanos presentes en la porción proximal del intestino delgado. Se observa actividad cuando hay una reducción significativa del recuento de huevos y gusanos cuando se compara con controles infectados no medicados.

Pueden utilizarse algunos compuestos de la presente invención, en particular los compuestos 12, 13 y 14, como intermedios o precursores para la preparación de los compuestos 1, 2 y 3. Por tanto, los compuestos 12, 13 y 14 pueden convertirse en el compuesto 1, 3 y 2, respectivamente, utilizando metodologías de oxidación bencílica convencionales, o alimentando los primeros a una cepa de Nodulisporium sp. capaz de convertirlos en los últimos, tal como MF5954.

En los siguientes ejemplos, los medios utilizados tienen las siguientes composiciones:

TABLA 1 Medios de siembra

Ingredientes (g/l)	SM1	SM2
Glucosa	10	10
Harina de avena	10	10
Licor de maíz fermentado	5	-
Polvo de maíz fermentado*	-	2,5
Pasta de tomate**	40	40
FeSO_{4}\cdot7 H_{2}O	10 (mg)	10 (mg)
MnSO_{4}\cdotH_{2}O	10 (mg)	10 (mg)
ZnSO_{4}\cdot7 H_{2}O	2 (mg)	2 (mg)
CaCl_{2}	1 (mg)	1 (mg)
H_{3}BO_{3}	0,56 (mg)	0,56 (mg)
CuCl_{2}\cdot3 H_{2}O	0,25 (mg)	0,25 (mg)
(NH_{4})_{6}Mo_{7}O_{24}\cdot4 H_{2}O	0,19 (mg)	0,19 (mg)
*Marcor
**Contadina
\hskip1cm Ajustado el pH a 6,8 antes de autoclave.

TABLA 2 Medios de producción

\vskip1.000000\baselineskip

Ingredientes (g/l)	PM1	PM2	PM3
Glucosa	60	70	82
Glicerol	60	100	80
NH_{4}Cl	3	3	5
Glutamato (MSG)	10	10	14
Amicasa*	-	8	-
L-triptófano	0,7	0,7	0,3
K_{2}HPO_{4}	1	1	1
CaCO_{3}	1	1	1
MgSO_{4}\cdot7 H_{2}O	0,5	0,5	0,5
Tampón MES**	20	20	20
FeSO_{4}\cdot7 H_{2}O	10 (mg)	10 (mg)	10 (mg)
ZnSO_{4}\cdot7 H_{2}O	10 (mg)	10 (mg)	10 (mg)
MnSO_{4}\cdotH_{2}O	2 (mg)	2 (mg)	2 (mg)
CuSO_{4}\cdot5 H_{2}O	1 (mg)	1 (mg)	1 (mg)
CoCl_{2}\cdot6 H_{2}O	0,8 (mg)	0,8 (mg)	0,8 mg
*Quest International
** ácido 2-[N-morfolino]etanosulfónico
\hskip1cm Ajustado a pH 6,0 antes de autoclave.

Ejemplo 1 Procedimiento general para la producción por fermentación de compuestos de la presente invención

Las producciones por fermentación de los compuestos de la presente invención en matraces y/o tubos se llevan a cabo según los siguientes procedimientos. Todas las fermentaciones en matraz se llevan a cabo en la oscuridad.

Cultivo de siembra. Se inocula una porción de 50 ml del medio de siembra en matraces Erlenmeyer de 250 ml sin deflectores con 1-2 ml de una suspensión miceliar (tal como la que se había congelado en glicerol) de Nodulisporium sp., y se incuba el cultivo con agitación a 220 rpm durante 2 días a 29ºC. Como alternativa, se inoculan 10 ml de medio de siembra en matraces Erlenmeyer de 50 ml con tapones de colonia (triturados) y se incuban a 220 rpm durante 3 días a 29ºC, y se utiliza el cultivo de siembra resultante para inocular el medio de producción.

Cultivo de producción. Se inocula una porción de 50 ml de medio de producción con 2 ml de un cultivo de siembra, y se incuba el cultivo resultante con agitación a 220 rpm durante 14-21 días a 29ºC. Se ajusta el pH de una alícuota de 2,0 ml de matraces agitados a <7,0 con HCl 6 N y se añaden 10 ml de metanol en un tubo de centrífuga de polipropileno de 15 ml. Se agita la mezcla durante 30 minutos, se centrifuga para retirar las partículas grandes, y se filtra el extracto en un vial de HPLC.

Se cuantifican los compuestos de la presente invención mediante cromatografía en fase inversa, preferiblemente en una columna Symmetry Waters C-18 (4,6 mm DI x 100 mm de longitud de columna, 3,5 \mum de tamaño de partícula). Se eluye isocráticamente la columna con una fase móvil constituida por agua de pureza HPLC que contiene 0,1% de ácido trifluoroacético/acetonitrilo (35:65) a 50ºC, y a un caudal de 0,9 ml/min, Se controla la absorbancia del eluído a 270 nm.

Ejemplo 2 Producción por fermentación de los compuestos 4 y 5

Se dejó crecer el inóculo a 25ºC en tres etapas de siembra secuenciales utilizando cultivo MF5954 (ATCC 74245) y medio de siembra de la siguiente composición por litro: extracto de levadura, 4 g; extracto de malta, 8 g; glucosa, 8 g. Se realizó la fermentación de producción en un recipiente de 800 l o de 1.900 l que contenía medio de producción de la siguiente composición por litro: glicerol, 40 g; glucosa, 20 g; extracto de levadura, 5 g; harina de soja, 5 g; pasta de tomate, 5 g; citrato trisódico, 2 g; sulfato de amonio, 2 g. El volumen de inóculo fue un 3-4% del volumen de medio final. La fermentación se realizó a 25ºC, ajustando la presión, flujo de aire y velocidad de agitador para mantener una concentración mínima de oxígeno disuelto de 50% de la saturación atmosférica. Se añadió glicerol intermitentemente para mantener la fermentación durante 640 horas, después de lo cual se recogió el lote para el aislamiento de los compuestos deseados.

Ejemplo 3 Producción por fermentación de los compuestos 6 y 7

Se dejó crecer el inóculo a 25ºC en tres etapas de siembra secuenciales utilizando cultivo MF 6047 (ATCC 74380) y medio de siembra SM1. Se realizó la fermentación de producción en un recipiente a 1.900 l que contenía medio de producción PM1. El volumen de inóculo fue un 3-4% del volumen de medio final. La fermentación se realizó a 25ºC, ajustando la presión, flujo de aire y velocidad de agitador para mantener una concentración mínima de oxígeno disuelto de 50% de la saturación atmosférica. Se recogió cada lote para el aislamiento de los compuestos deseados después de 550-600 horas.

Ejemplo 4 Producción por fermentación de los compuestos 8, 17 y 18

Cultivo de siembra. Se inoculó una porción de 10 ml de medio SM2 en matraces Erlenmeyer de 50 ml sin deflectores con un tapón de colonia (aplastado) de cultivo MF6222 (ATCC 74383), y se incubó el cultivo con agitación a 220 rpm durante 4 días a 29ºC.

Cultivo de producción. Se inoculó una porción de 10 ml de medio de producción PM3 con 0,6 ml de un cultivo de siembra, y se incubó el cultivo resultante con agitación a 220 rpm durante 14-15 días a 29ºC. Se extrajo una alícuota de 2,0 ml del matraz agitado, y se analizó el extracto mediante HPLC utilizando el procedimiento descrito en el ejemplo 1. Se observó el compuesto 8 a un tiempo de retención de 7,8 minutos. Se observó un pico a un tiempo de retención de 6,8, el compuesto 18. Se observó otro pico a un tiempo de retención de 11,2, el compuesto 17.

Para obtener una cantidad suficiente de compuestos 17 y 18 para la determinación de la estructura, se prepararon 2 l (40 matraces) de medio de producción de la siguiente manera: se inoculó una porción de 50 ml de medio de siembra SM2 en matraces Erlenmeyer de 250 ml sin deflectores con 1-2 ml de una suspensión miceliar (conservada con 10% de glicerol y congelada a -85ºC) de cultivo MF6222 (ATCC 74383). Se incubó el cultivo con agitación a 220 rpm durante 3 días a 29ºC. Se inoculó una porción de 50 ml de medio de producción PM2 con 1 ml de cultivo de siembra, y se incubó el cultivo resultante con agitación a 220 rpm durante 22 días a 29ºC. Se combinaron los contenidos del matraz, proporcionando 1,8 l, y se extrajeron con metiletilcetona.

Ejemplo 5 Producción por fermentación de los compuestos 12, 13 y 14

Cultivo de siembra. Se utilizó un tapón de agar aplastado que porta una colonia de MF6206 (ATCC 74382) para inocular una porción de 10 m de medio de siembra SM1 en un matraz Erlenmeyer de 50 ml sin deflectores. Se incubó el cultivo con agitación a 220 rpm durante 3 días a 29ºC.

Cultivo de producción. Se inoculó una porción de 50 ml de medio de producción PM1 con 2 ml del cultivo de siembra, y se incubó el cultivo resultante con agitación a 220 rpm durante 15 días a 29ºC en la oscuridad. Se añadió un volumen de 10 ml de metanol a una porción de 2 ml de la fermentación, y se agitó la mezcla durante 30 minutos. Después de la centrifugación para retirar las partículas grandes, se filtró el extracto en viales de HPLC.

Se realizó el ensayo de HPLC en una columna Zorbax SB-C8 inversa (3 mm x 25 mm). Se eluyó isocráticamente la columna con una fase móvil constituida por agua que contenía 0,1% de ácido trifluoroacético/acetonitrilo (42:58) a 50ºC y a un caudal de 1,0 ml/min. Se controló la absorbancia a 270 nm del eluído. Los tiempos de retención de los compuestos preparados por MF6206 (ATCC 74382) son ligeramente menores que los de los compuestos preparados por el cultivo parenteral. El examen de sus espectros reveló que no eran los compuestos 1, 2 ó 3; cada pico carecía de la absorción característica a 400 nm.

Para obtener cantidades suficientes de los nuevos compuestos para la determinación de la estructura, se inocularon 2 l (40 matraces) de medio de producción PM3 como se describe en el procedimiento de fermentación. En este caso, se inoculó el medio de siembra SM1 con 2 ml de una suspensión miceliar que se había conservado congelada en glicerol al 10% a -70ºC. Se recogió la fermentación de producción a los 21 días.

Ejemplo 6 Producción por fermentación del compuesto 15

Cultivo de siembra. Se inoculó una porción de 50 ml de medio de siembra SM1 en un matraz Erlenmeyer de 250 ml sin deflectores con 1-2 ml de una suspensión miceliar (conservada con glicerol al 10% y congelada a -85ºC) de cultivo MF6087 (ATCC 74381). Se incubó el cultivo con agitación a 220 rpm durante 2 días a 25ºC.

Cultivo de producción. Se inocularon 40 matraces, que contenían cada uno 50 ml de medio de producción PM1, con 2 ml del cultivo de siembra, y se incubó el cultivo resultante con agitación a 220 rpm durante 30 días a 29ºC. Se confirmó la aparición del compuesto 15 mediante HPLC en una columna Zorbax SB-C8 en fase inversa eluída isocráticamente con una fase móvil constituida por agua de pureza HPLC que contenía 0,1% de ácido trifluoroacético/acetonitrilo (46:54) a 50ºC y a un caudal de 1,0 ml/min. Se controló a 270 nm la absorbancia del eluído. Se combinaron los contenidos del matraz, proporcionando 1,5 l, y se extrajeron con metiletilcetona.

Se observó el compuesto 15 en forma de un hombro en el compuesto 2. Los tiempos de retención fueron de 17,4 minutos para el compuesto 2 frente a 18,3 minutos para el compuesto 15.

Ejemplo 7 Purificación y caracterización preliminar de los compuestos 4 y 5

Se secó el extracto de fermentación a gran escala de MF5954, se extrajo con alcohol isopropílico y se pasó a través de una columna SP-207 (Tosohaus). Se eluyó el material con metanol y se repartió con hexano. Se concentró la solución de metanol, se redisolvió en cloruro de metileno, se cargó en una columna de gel de sílice (70 l) y se eluyó con acetato de isopropilo, seguido de 10%, 20%, 30%, 50% y 100% de metanol en acetato de isopropilo (1 vol. col. cada uno). Se llevó a sequedad una porción de la fracción de metanol al 50% y se encontró que contenía un pico grande a 270 nm (HPLC) que podría estar relacionado con los compuestos previamente aislados 1, 2 y 3 (patente de EE.UU. 5.399.582). Se fraccionó este material dos veces mediante un embudo Sephadex LH20 de 2 l y se eluyó con cloruro de metileno-acetona-ácido acético al 0,2% 70:30:1. Los cortes 13-18 (de 400 ml cada uno) contenían el compuesto deseado. Se secaron estos cortes, se redisolvieron en cloruro de metileno y se cargó una porción en una columna HPLC semipreparativa (Zorbax RX-C8 (9,6 por 250 nm)) a temperatura ambiente controlada a 270 nm con un caudal de 8 ml/min. El sistema de disolventes utilizados fue acetonitrilo-agua 65:35 con 0,1% de TFA, y se encontró el compuesto en los cortes 17-19. Ésta fue la etapa cromatográfica final utilizada para purificación, proporcionando 3 mg del compuesto 4. El máximo de UV estaba sólo a 270 nm, y no se parecía a los espectros UV de los compuestos 1-3.

Se volvió a purificar por cromatografía una fracción posterior de la etapa Sephadex LH20 en una columna LH20 de 1 l, y las fracciones 52 a 56 contenían el compuesto 5 (5 mg). Se determinó la pureza mediante columna de HPLC analítica (Zorbax RX C8 4,6 por 250 nm) a 40ºC controlada a 270 nm. El sistema de disolventes fue acetonitrilo-agua 72-28 con 0,1% de TFA a un caudal de 1 ml/min. El máximo de UV estaba a 225 nm. Ambos compuestos 4 y 5 se caracterizaron como análogos de los compuestos 1-3 mediante estudios de RMN y EM.

Se registraron los espectros de masas en espectrómetros de masas Jeol SX-102A (impacto electrónico, EI, 90 eV) y JEOL HX110 (bombardeo de átomos rápidos, BAR) y TSQ70B (CL-EM-IEP, cromatografía líquida-ionización por electropulverización). Se realizaron las medidas de masa exacta a alta resolución (IE-AR) utilizando perfluoroqueroseno (PFK) como patrón interno. Se corrió el patrón de BAR en una matriz de ditiotreitol-ditioeritritol (20/80). Se realizaron las medidas de masa exacta a alta resolución con Ultramark 1960 (Fomblin) como compuesto de referencia. Los datos de IEP-AR se obtuvieron en un FTMS Finnigan NewStar. Los datos críticos de alta resolución se indican a continuación:

Encontrado	Calculado	Fórmula	Asignación
Compuesto 4
583,3677	583,3661	C_{38}H_{49}NO_{4}	M+
Compuesto 5
435,2751	435,2773	C_{28}H_{37}NO_{3}	M+

Datos de ^{13}C- y ^{1}H-RMN

Los datos de ^{13}C-RMN se registraron en CD_{2}Cl_{2} a 75 y 100 MHz en espectrómetros de RMN Varian 300 y Varian Unity 400, respectivamente a 25ºC. Los desplazamientos químicos se dan en ppm respecto al tetrametilsilano (TMS) a cero ppm, utilizando el pico de disolvente a 53,8 ppm como patrón interno.

Compuesto 4 (100 MHz): 172,3, 155,26, 152,68, 143,67, 141,34, 140,67, 138,43, 132,68, 126,29, 126,2, 126,12, 118,96, 118,12, 110,17, 108,55, 77,90, 76,30, 74,37, 54,37, 50,30, 50,14, 48,0, 45,63, 40,04, 34,21, 33,63, 32,18, 30,52, 30,19, 28,31, 27,86, 26,41, 25,75, 22,60, 19,35, 14,74, 12,86, 11,9 ppm.

El recuento de carbono está de acuerdo con la fórmula molecular C_{38}H_{49}NO_{4} derivada por EM-AR.

Compuesto 5 (75 MHz): 172,15, 152,20, 144,0, 142,10, 128,90, 126,26, 120,70, 119,70, 118,71, 117,98, 112,63, 73,94, 54,33, 50,27, 42,57, 41,38, 40,43, 37,05, 33,75, 28,37, 28,29, 26,34, 24,05, 23,46, 19,45, 17,28, 14,90, 12,53 ppm.

El recuento de carbono está de acuerdo con la fórmula molecular C_{28}H_{39}NO_{3} derivada por EM-AR.

Los espectros de ^{1}H-RMN se registraron en espectrómetros a 300 o 400 MHz. Los desplazamientos químicos se indican en ppm respecto al TMS a cero ppm, utilizando los picos de disolvente como patrones internos.

Compuesto 4 (400 MHz): d 0,99 (3H, s), 1,06 (3H, s), 1,08 (3H, s), 1,095 (3H, s), 1,29 (3H, s), 1,31 (3H, s), 1,35 (3H, s), 1,35 (1H, m), 1,45 (1H, m), 1,7 (1H, m), 1,8 (1H, m), 1,75 (1H, m), 1,80 (2H, m), 1,55 (1H, m), 1,70 (1H, m), 1,92 (3H, d, J= 1,6 Hz), 2,25 (1H, dd, J= 110, 12,4 Hz), 2,59 (1H, dd, J= 12,4, 16,0 Hz), 2,65 (1H, dd, J= 7,2, 15,6 Hz), 2,85 (1H, dc, J= 2,8, 7,6, 9,2 Hz), 3,05 (1H, dd, J= 9,2, 16,4 Hz), 3,45 (1H, m), 5,9 (1H, d, J= 3,2 Hz), 5,91 (1H, d, J= 15,2 Hz), 6,36 (1H, dd, J= 11,2, 15,6 Hz), 7,14 (1H, d, J= 0,8 Hz), 7,25 (1H, d, J= 11,2 Hz), 7,37 (1H, d, J= 0,8 Hz).

Compuesto 5 (300 MHz): d 0,85 (3H, s), 1,0 (3H, s), 1,12 (3H, s), 1,3-1,7 (11H, m), 1,85 (3H, d, J= 0,8 Hz), 2,15 (2H, m), 2,3 (1H, dd, J= 10,8, 13,2 Hz), 2,6 (1H, d, J= 6,3, 13,2 Hz), 2,8 (1H, m), 3,52 (1H, m), 6,8 (1H, dd, J= 9,0, 10,2 Hz), 6,92 (1H, dc, J= 2,1, 7,8, 13,2 Hz), 6,95 (1H, dc, J= 2,1, 7,8, 13,2 Hz), 7,27 (1H, d, J= 2,1 Hz), 7,29 (1H, d, J= 2,1 Hz).

Abreviaturas: s= singlete, d= doblete, c= cuartete, a= ancho, m= multiplete, J= constante de acoplamiento ^{1}H-^{1}H en hercios (\pm0,5 Hz, \sim = aproximadamente).

Ejemplo 8 Purificación y caracterización de los compuestos 6 y 7

Se desecó una fermentación a gran escala de MF6047 (ATCC 74380), se extrajo con isopropanol y se pasó a través de una columna SP-207. Se eluyó el material capturado con metanol y se repartió con hexano. Se secó una pequeña porción del extracto de metanol (4,6 g) y se cargó en una columna de gel de sílice (1 litro), se recogieron los cortes 13-16 y se secaron (800 mg). Se disolvió este material en metanol y se cargó en una columna Sephadex LH20 (400 ml) en metanol, y se encontraron los compuestos de interés en los cortes 71-76 (50 mg), como se determinó mediante TLC y HPLC como se describe anteriormente en el ejemplo. Se identificaron tres compuestos, siendo uno el compuesto 4 y teniendo los otros dos un UV similar al compuesto 4. Se disolvió esta muestra en cloruro de metileno, se cargó en una columna pequeña de gel de sílice (60 ml) en cloruro de metileno:metanol 9:1 y se utilizó un volumen de columna de cada uno de 3:1, 1:1 y metanol para elución. Los cortes 21-30 contenían el compuesto 6 (1,5 mg) y los cortes 71-76 contenían el compuesto 7 (1,2 mg). Ambos compuestos se caracterizaron mediante ^{1}H-RMN y EM.

Los datos de barrido de IE-AR se indican a continuación.

Encontrado	Calculado	Fórmula	Asignación
Compuesto 6
599,3538	599,3610	C_{38}H_{49}NO_{5}	M+

Se registraron los datos de ^{1}H-RMN en CDCl_{3} o CD_{3}OD en un espectrómetro Varian a 300 MHz. Los desplazamientos químicos se indican en ppm respecto a TMS a cero ppm, utilizando los picos de disolvente como patrones internos.

Compuesto 6 (300 MHz): d 1,0 (3H, s), 1,07 (3H, s), 1,10 (3H, s), 1,30 (3H, s), 1,32 (3H, s), 1,33 (3H, s), 1,40 (3H, s), 1,87 (3H, s), 2,0 (1H, m), 2,2 (2H, m), 2,3 (1H, m), 2,65 (1H, m), 2,7 (1H, m), 2,8 (1H, m), 2,9 (1H, m), 3,1 (1H, dd, J= 9,6, 15,6 Hz), 3,35 (1H, m), 4,85 (1H, dd, J= 10,2, 16,8 Hz), 5,94 (1H, d, J= 3 Hz), 6,83 (1H, d, J= 8,4 Hz), 7,12 (1H, s), 7,47 (1H, s).

Compuesto 7 (300 MHz): d 0,95 (3H, s), 1,0 (3H, s), 1,1 (3H, d, J= 4 Hz), 1,3 (3H, s), 1,31 (3H, s), 1,32 (3H, s), 1,33 (3H, s), 1,35 (3H, s), 1,7 (2H, m), 2,15 (1H, m), 2,25 (1H, m), 2,4 (1H, m), 2,6 (1H, m), 2,7 (1H, m), 2,8 (1H, m), 5,90 (1H, d, J= 3 Hz), 7,11 (1H, s), 7,37 (1H, s).

Ejemplo 9 Purificación y caracterización del compuesto 8

Se disolvieron en cloruro de metileno/acetona 3 kg de un eluyente secado con metanol de una columna de captura SP207 de la fermentación de MF 6047 (ATCC 74380), se cargó en un embudo de sílice grande y se eluyó con hexano-acetona 3:1, seguido de 1:1; acetona; metanol-acetona 1:3; metanol-acetona 1:1 y metanol. Se combinaron los cortes de interés (75 g), se secaron a vacío y se cargaron en un embudo Sephadex LH-20 grande para eliminar impurezas por lotes. Se secaron los cortes que contenían los compuestos de interés y se cargaron en una columna LH20 grande (4 l). Los cortes 27-36 contenían el compuesto de interés (7,5 g) y se secaron a vacío, se disolvieron en cloruro de metileno y se cargaron en una columna de gel de sílice en cloruro de metileno:acetona:agua 7:3:0,1, 1:1:0,1, 1:3:0,1, acetona y metanol. Los cortes 65-75 contenían el nuevo compuesto (440 mg). Se fraccionó este material en una columna pequeña de gel de sílice (100 cm^{3}) en el disolvente 7:3:0,1 anterior, y los cortes (37-42) contenían el nuevo pico determinado por TLC y HPLC. A continuación, se utilizó una TLC prep. (cloruro de metileno:metanol 9:1, gel de sílice 60) seguida de HPLC semiprep. para la purificación final del compuesto 8 (12 mg). Este compuesto se caracterizó como un análogo de los compuestos 1-3 mediante RMN y EM.

Los datos críticos de alta resolución se indican a continuación:

Encontrado	Calculado	Fórmula	Asignación
Compuesto 8
-	-	C_{43}H_{57}NO_{5}
649,4174	649,4131	C_{43}H_{55}NO_{4}	M-H_{2}O

Datos de ^{1}H y ^{13}C-RMN

Los datos de ^{13}C-RMN se registraron en CD_{3}OD a 100 MHz en un espectrómetro Varian Unity a 400 MHz a 25ºC. Los desplazamientos químicos están en ppm respecto al TMS a cero ppm, utilizando el pico de disolvente a 49,0 ppm como patrón interno.

Compuesto 8 (100 MHz): 176,66, 153,57, 151,6, 142,74, 137,79, 136,97, 136,5, 132,48, 132,43, 131,63, 127,96, 127,0, 124,8, 123,71, 119,64, 119,19, 107,76, 77,9, 76,7, 75,7, 74,17, 60,83, 54,72, 50,34, 47,0, 45,73, 40,16, 33,89, 32,18, 30,37, 30,19, 28,28, 27,7, 27,1, 26,43, 25,93, 25,64, 23,17, 19,46, 18,29, 14,77, 13,93, 11,97.

El recuento de carbono está de acuerdo con la fórmula molecular C_{43}H_{55}NO_{4} derivada de EM-AR.

Los espectros de ^{1}H-RMN se registraron en CD_{3}OD en un espectrómetro a 400 MHz. Los desplazamientos químicos se indican en ppm respecto al TMS a cero ppm, utilizando el pico de disolvente como patrón interno.

Compuesto 8 (400 MHz): d 1,00 (3H, s), 1,04 (3H, s), 1,05 (3H, s), 1,17 (3H, s), 1,31 (6H, s), 1,45 (3H, s), 1,71 (3H, s), 1,85 (3H, s), 1,92 (3H, d, J= 1,2 Hz), 2,25 (1H, dd, J= 10,5, 12,9 Hz), 2,58 (1H, dd, J= 6,6, 13,2 Hz), 2,7 (2H, dd, J= 3,0, 4,5 Hz), 3,4 (1H, dd, J= 4,8, 9,9 Hz), 3,78 (1H, dd, J= 6,0, 15,6 Hz), 3,91 (1H, dd, J= 7,8, 15,6 Hz), 5,02 (1H, d, J= 4,8 Hz), 5,73 (1H, d, J= 15,3 Hz), 5,91 (1H, d, J= 3 Hz), 6,33 (1H, dd, J= 11,1, 15,3 Hz), 7,04 (1H, d, J= 11,1 Hz), 7,28 (1H, s).

Ejemplo 10 Purificación y caracterización de los compuestos 9, 10 y 11, ésteres metílicos de los compuestos 12, 13 y 14, respectivamente

Un nuevo cultivo mutante, MF 6206 (ATCC 74382), produjo 3 nuevos compuestos como componentes mayoritarios. Tras la purificación de los compuestos mediante HPLC utilizando TFA como tampón o incluso a pH neutro, los compuestos se descompusieron lentamente. Por lo tanto, se secó un extracto de fermentación y se disolvió en metanol-cloruro de metileno 1:1 (10 cm^{3}). Se añadió trimetilsilildiazometano/hexano y se completó la reacción en 15 minutos, determinado por HPLC. Se fraccionó el extracto mediante TLC prep. (gel de sílice) en cloruro de metileno-metanol 95:5. Se evaluaron los cortes mediante HPLC y RMN y se determinó que eran el compuesto 9 (éster metílico de 12) y el compuesto 10 (éster metílico de 13). No se aisló suficiente compuesto 11 (éster metílico de 14) para la determinación estructural, pero está presente por inferencia (compuestos 9 y 10, así como 12, 13 y 14) y detección por HPLC.

Se determinó la EM de alta resolución del compuesto 9 y se determinaron por CL-EM los pesos moleculares del compuesto 10 y de la mezcla de los tres compuestos no esterificados (compuestos naturales 12, 13 y 14). Los datos de alta resolución y de espectros de masas se indican a continuación:

Encontrado	Calculado	Fórmula	Asignación
Compuesto 9
679,4165	679,4236	C_{44}H_{57}NO_{5}	M+
Compuesto 12
665	665	Observado en mezcla
Compuesto 13
699	699	Observado en mezcla
Compuesto 14
681	681	Observado en mezcla

Datos de ^{1}H-RMN para los compuestos 9 y 10

Se registraron los espectros de ^{1}H-RMN en CD_{2}Cl_{2} en un espectrómetro a 400 MHz. Los desplazamientos químicos se indican en ppm respecto al TMS a cero ppm, utilizando el pico de disolvente como patrón interno.

Compuesto 9 (400 MHz): d 0,93 (3H, s), 1,05 (3H, s), 1,10 (6H, s), 1,27 (3H, s), 1,29 (3H, s), 1,32 (3H, s), 1,43 (3H, s), 1,96 (3H, d, J= 1,6 Hz), 2,2 (1H, dd, J= 10,8, 14,0 Hz), 2,65 (1H, dd, J= 7,2, 10,4 Hz), 2,65 (1H, dd, J= 7,4, 8,8 Hz), 2,75 (1H, m), 3,4 (1H, d, J= 4,8, 10,8 Hz), 3,5 (1H, d, J= 16,8 Hz), 3,75 (3H, s, OCH_{3}), 4,05 (1H, dd, J= 8,8, 16,8 Hz), 4,7 (1H, s), 4,82 (1H, m), 4,95 (1H, m), 5,25 (1H, d, J= 6,8 Hz), 5,88 (1H, d, J= 15,2 Hz), 5,95 (1H, d, J= 2,8 Hz), 6,4 (1H, dd, J= 11,2, 15,2 Hz), 7,22 (1H, d, J= 11,2 Hz), 7,27 (1H, s).

Compuesto 10 (400 MHz): d 0,9 (3H, s), 1,04 (3H, s), 1,1 (3H, d, J= 10,8 Hz), 1,28 (9H, s), 1,30 (3H, s), 1,32 (3H, s), 1,4 (3H, s), 2,2 (1H, m), 2,65 (1H, m), 2,8 (1H, m), 3,5 (1H, d, J= 16,4 Hz), 3,7 (3H, s, OCH_{3}), 4,05 (1H, dd, J= 6,8, 13,6), 4,55 (1H, m), 4,76 (1H, s), 4,82 (1H, m), 4,96 (1H, d, J= 5,2), 5,25 (1H, d, J= 6,8 Hz), 5,96 (1H, d, J= 3,2 Hz), 7,27 (1H, s).

Hidrólisis del compuesto 9

Se añadió carbonato de potasio (10 mg) a una solución del compuesto 9 (3 mg) en metanol-agua (9:1, 1,5 ml), y se agitó la reacción a temperatura ambiente durante 24 horas. Se añadió hidróxido de litio (10 mg) y se agitó la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 24 horas adicionales. El examen por HPLC indicó formación de un producto polar. Después de la terminación, se inactivó la reacción con ácido cítrico acuoso al 10% (2 ml) y se extrajo con acetato de etilo (50 ml). Se lavó la fase orgánica con agua, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró, proporcionando un producto que se purificó mediante HPLC en fase inversa en una columna Whatman ODS-3 (9,4 x 250 mm). Se eluyó el producto con un gradiente de 50 minutos de acetonitrilo acuoso al 60% a acetonitrilo al 70%, conteniendo ambos 0,1% de ácido trifluoroacético, a un caudal de 4 ml por minuto. La liofilización de las fracciones que eluyen a entre 26-30 minutos proporcionó el compuesto 12 puro (2 mg) en forma de un polvo amarillo, EM-BAR (m/z): 648 (M-H_{2}O+H).

Ejemplo 11 Purificación y caracterización del compuesto 15 y del compuesto 16

Se secaron 2,0 g de extracto de fermentación de metiletilcetona (cultivo MF 6087 (ATCC 74381)), se disolvieron en metanol, se fraccionaron en una columna Sephadex LH20 (1000 cm^{3}, metanol) y se eluyó con metanol. Los cortes que contenían el nuevo compuesto (1,6 g) con espectros UV similares al compuesto 1 se disolvieron en metanol y se cargaron en una columna de HPLC Water Symmetry semiprep. C-18, y se eluyó con acetonitrilo-agua 65:35 con 0,1% de TFA. Los cortes 26-27 contenían el nuevo compuesto, y cuando se secaron, tenían un peso de 2,8 mg. Tras la reevaluación del compuesto 15 mediante HPLC, se observó otro compuesto (16). Puede haber ocurrido la posible eliminación del grupo hidroxilo (deshidratación) en condiciones ácidas como se observa anteriormente. Este material que contiene 2 compuestos se fraccionó mediante TLC en gel de sílice y se separaron los componentes. Se evaluaron los compuestos 15 (1 mg) y 16 (1,5 mg) mediante HPLC, TLC y RMN, y se determinó que estaban relacionados con los compuestos 1-3.

Se obtuvieron los datos de EM-BAR de alta resolución para el compuesto 15 y los datos de IEP-AR para el compuesto 16.

Encontrado	Calculado	Fórmula	Asignación
Compuesto 15
678,3827	678,3794	C_{43}H_{52}NO_{6}	M+H
Compuesto 16
660,3674	660,3689	C_{43}H_{50}NO_{5}	M+H

Se registraron los espectros de ^{1}H-RMN en CDCl_{3} en un espectrómetro a 400 MHz. Se indican los desplazamientos químicos en ppm respecto al TMS a cero ppm, utilizando el pico de disolvente como patrón interno.

Compuesto 15 (400 MHz): d 0,99 (3H, s), 1,17 (3H, s), 1,28 (3H, s), 1,33 (3H, s), 1,37 (3H, s), 1,38 (3H, s), 1,45 (3H, s), 1,51 (3H, s), 1,99 (3H, s), 2,2 (4H, m), 2,38 (1H, dd, J= 10,4, 14 Hz), 2,53 (1H, dt, J= 15,6 Hz), 2,7 (1H, dc, J= 15,2 Hz), 2,83 (1H, dd, J= 6,4, 14 Hz), 2,91 (1H, dd, J= 3,2, 6,4 Hz), 2,92 (1H, m), 3,2 (1H, m), 5,07 (1H, s a), 5,11 (1H, s), 5,26 (1H, s), 5,27 (1H, d, J= 6,8 Hz), 6,08 (1H, d, J= 15,6 Hz), 6,09 (1H, d, J= 3,2 Hz), 6,37 (1H, dd, J= 11,2, 15,6 Hz), 7,32 (1H, d, J= 11,2 Hz), 7,74 (1H, s).

Compuesto 16 (400 MHz): d 0,99 (3H, s), 1,28 (3H, s), 1,33 (3H, s), 1,46 (3H, s), 1,51 (3H, s), 1,52 (3H, s), 1,59 (3H, s), 1,60 (3H, s), 1,99 (3H, d, J= 0,8 Hz), 2,2 (4H, m), 2,37 (1H, dd, J= 10,4, 14 Hz), 2,53 (1H, dt, J= 15,6 Hz), 2,70 (1H, dc, J= 15,2 Hz), 2,81 (1H, dd, J= 6,8, 14 Hz), 2,9 (1H, m), 5,02 (1H, s), 5,04 (1H, s a), 5,11 (1H, s), 6,1 (1H, d, J= 15,2), 6,36 (1H, dd, J= 11,2, 15,2), 6,8 (1H, d, J= 1,6 Hz), 6,88 (1H, d, J= 1,2 Hz), 7,35 (1H, d, J= 11,6 Hz), 7,81 (1H, s).

Ejemplo 12 Purificación y caracterización del compuesto 17 y del compuesto 18

Se extrajeron 2 litros de un caldo de fermentación (MF 6222) con MEK de la manera habitual, y el peso seco del extracto fue de 4,2 gramos. El análisis por HPLC del extracto utilizando condiciones estándar indicó compuesto 8 como componente mayoritario, con otros dos componentes mayoritarios a 8,1 y 14,7 minutos de tiempo de retención, y con el compuesto 8 a 9,7 minutos. Los perfiles de UV fueron similares para los tres picos en el cromatograma. Se cargaron 40 mg de extracto en cloruro de metileno en una placa TLC de gel de sílice (20 x 20, E-Merck), se eluyeron con cloruro de metileno:metanol 9:1, se eluyeron las fracciones con metanol, se secaron y se pesaron. El corte 3, correspondiente al pico a t.a. de 14,7 min, tenía un peso de 5 mg y el corte 4, correspondiente al pico a t.a. de 8,1 minutos, tenía un peso de 3,8 mg. Según la evaluación por HPLC de estos cortes, el compuesto 17 (corte 3) y el compuesto 18 (corte 4) eran casi puros. Las muestras se evaluaron mediante EM y ^{1}H-RMN.

Se obtuvieron los datos de IEP de alta resolución para el compuesto 18 y los datos de CL-EM para el compuesto 17, y se muestran a continuación:

Encontrado	Calculado	Fórmula	Asignación
Compuesto 17
683	683,4186	C_{43}H_{57}NO_{6}
Compuesto 18
-	-	C_{43}H_{59}NO_{7}
665,4055	665,4080	C_{43}H_{55}NO_{5}	M-2xH_{2}O

^{1}H-RMN

Se registraron los datos de ^{1}H-RMN en CD_{2}Cl_{2} a 400 MHz en un espectrómetro Varian Unity a 400 MHz a 25ºC. Los desplazamientos químicos están en ppm respecto al TMS a cero ppm, utilizando el pico de disolvente como patrón interno.

Compuesto 17 (400 MHz): d 1,0 (3H, s), 1,07 (3H, s), 1,13 (3H, s), 1,30 (6H, s), 1,43 (3H, s), 1,44 (3H, s), 1,50 (3H, s), 1,71 (3H, s), 1,85 (3H, s), 2,3 (1H, m), 2,6 (1H, m), 2,8 (1H, m), 5,1 (1H, m), 5,9 (1H, s), 6,6 (1H, m), 7,37 (1H, s).

Compuesto 18 (400 MHz): d 0,95 (3H, s), 1,0 (3H, s), 1,03 (3H, s), 1,07 (3H, s), 1,13 (3H, s), 1,31 (6H, s), 1,43 (3H, s), 1,58 (3H, s), 1,74 (3H, s), 3,1 (1H, m), 5,03 (1H, m), 5,94 (1H, s), 7,34 (1H, s).

Ejemplo 13 Procedimiento general para la mutación de Nodulisporium sp. utilizando NTG

Procedimiento A

Se inoculó una porción de 50 ml de medio de siembra SM1 en un matraz Erlenmeyer de 250 ml sin deflectores con 2 ml de una suspensión miceliar de una cepa de Nodulisporium, y se incubó el cultivo resultante con agitación a 220 rpm durante 3 días en la oscuridad a 29ºC. Se transfirieron porciones (2 ml) de este cultivo de siembra a 2 porciones recientes de 50 ml de medio de siembra KF, y se agitaron los nuevos cultivos a 220 rpm a 29ºC. Después de incubación durante 6 horas, se añadió NTG (N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina, disuelta en metanol) a uno de los cultivos a una concentración final de 10 \mug de mutágeno/ml, siendo el control el cultivo restante. Se incubaron ambos cultivos con agitación a 220 rpm en la oscuridad a 29ºC durante 42 horas adicionales. Se fragmentaron los micelios en el volumen completo de 50 ml del cultivo tratado con NTG en un homogeneizador VERTIS 45; se congelaron las células en hielo y se homogeneizaron durante 4 minutos. Se pasó después la suspensión completa a través de 4 capas de gasa estéril, reteniéndose los fragmentos grandes en la gasa y pasando los fragmentos menores. Después de filtrar, se transfirieron 25 ml de la suspensión a tubos estériles y se centrifugaron a 1000 rpm durante 10 minutos. Se recogió el sobrenadante y se centrifugó adicionalmente a 3000 rpm durante 10 minutos. Se desechó el sobrenadante, y se resuspendió el sedimento celular en 2 ml de agua estéril. Se sembraron diluciones en serie en agua estéril en medio de crecimiento de agar que contenía ciclosporina a 5 \mug/ml para limitar el crecimiento radial. Los medios utilizados para siembra fueron agar de dextrosa de patata [Difco] e YNB:celobiosa (base nitrogenada de levadura sin sulfato de amonio y aminoácidos [Difco], 2% de celobiosa, 0,5% de sulfato de amonio, 2% de agar en tampón MES 50 mM {ácido 2-[N-morfolino]etanosufónico}, pH 6,0. El cultivo control se homogeneizó igualmente, se filtró, se diluyó y se sembró. Se incubaron las placas a 25ºC. A entre 9 y 19 días de incubación, se recogieron los supervivientes del tratamiento con NTG y se propagaron en placas de agar del mismo medio. Uno de los supervivientes fue MF6206.

Procedimiento B

Se recogen los micelios después de 48 horas de crecimiento en caldo YNB suplementado a 9ºC y a 220 rpm mediante filtración a vacío en gasa estéril Mira. Se resuspende la almohadilla miceliar en caldo y se homogeneiza durante 2 minutos. Se utiliza una combinación de centrifugación a baja velocidad y filtración para retirar las piezas miceliares grandes de la suspensión homogeneizada, se sedimentan los fragmentos miceliares pequeños restantes mediante centrifugación y después se resuspenden en 50 ml de caldo reciente y se incuban a 29ºC y 220 rpm durante 6 horas. Se recogen después los fragmentos mediante filtración a vacío sobre la superficie de una unidad de filtrado de 0,2 \mum y se resuspenden en 10 ml de agua. Se añade después NTG disuelta en metanol a una concentración final de 400 \mug/ml, y se incuba la suspensión a 29ºC y 100 rpm. Se retiran las alícuotas, se lavan con TRIS 50 mM, pH 7, y se resuspenden en caldo después de 10, 20, 30 y 40 minutos de exposición a NTG. Se diluyen en serie estas suspensiones y se siembran en agar que contiene ciclosporina a 5 \mug/ml para limitar el crecimiento, y después se incuban a 29ºC hasta que aparecen colonias. Se obtuvo MG6222 mediante este procedimiento.

El medio YNB suplementado tiene la siguiente composición:

Base nitrogenada de levadura (YNB) suplementada

NaNO_{3}	6 g
H_{2}O	900 ml

Se esteriliza mediante autoclave y se añade después de esterilización:

100 ml de la siguiente solución 10x:
Base nitrogenada de levadura	1,7 g
Extracto de levadura	1 g
Peptona	1 g
Casaminoácidos	1 g
H_{2}O	100 ml

Se esteriliza por filtración y se añade a la solución anterior más 20 ml de glucosa al 50% esterilizada por filtración.

Ejemplo 14 Características de MF6047 (ATCC 74380)

MF6047 (ATCC 74380) es un mutante de Nodulisporium sp. (ATCC 74245, MF5954) producido mediante mutagénesis con NTG de micelio vegetativo de esta cepa. La morfología y dimensiones microscópicas de la placa de cultivo de MF6047 son esencialmente similares a las descritas en la patente de Estados Unidos 5.399.582 (21 de marzo de 1995), excepto porque MF6047 (ATCC 74380) produce una titulación mayor de compuesto 1 en las mismas condiciones que ATCC 74245. Además, la placa de cultivo muestra evidencias de sectorización, ya que diferentes áreas de la placa de cultivo pueden exhibir patrones de color y texturas anormales.

Ejemplo 15 Características de MF6087 (ATCC 74381)

MF6087 (ATCC 74381) es un mutante de Nodulisporium sp. (ATCC 74245, MF5954) producido mediante mutagénesis por NTG de micelio vegetativo de esta cepa. La morfología y dimensiones microscópicas de la placa de cultivo de MF6087 son esencialmente similares a las descritas en la patente de Estados Unidos 5.399.582 (21 de marzo de 1995), excepto porque MF6087 (ATCC 74381) produce una titulación mayor de compuesto 1 en las mismas condiciones que ATCC 74245.

Ejemplo 16 Características de MF6206 (ATCC 74382)

MF6206 (ATCC 74382) es un mutante de Nodulisporium sp. (ATCC 74245, MF5954) producido mediante mutagénesis secuencial por NTG de micelio vegetativo de esta cepa. MF6206 (ATCC 74382) exhibe una morfología de placa de cultivo significativamente diferente a la descrita en la patente de Estados Unidos 5.399.582 (21 de marzo de 1995) para ATCC 74245. MF6206 (ATCC 74382) crece a una velocidad menor, en las mismas condiciones ambientales, en agar de harina de maíz: MF6026 crece 11 mm en 6 días, mientras que ATCC 74245 crece 42 mm en 6 días. MF6206 no produce aireación de micelio en agar de harina de avena. También en agar de harina de avena, MF6206 exhibe un color de colonia rosa (rosa de piel de cebolla, canela vinoso claro), mientras que ATCC 74245 tiene un color de colonia marrón amarillento (amarillo marte, siena crudo) a marrón amarillento claro (amarillo anaranjado claro, amarillo antimonio). Además, MF6206 (ATCC 74382) no produce conidióforos ni conidia.

Ejemplo 17 Características de MF6222 (ATCC 74383)

MF6222 (ATCC 74383) es un mutante de Nodulisporium sp. (ATCC 74275, MF5954) producido mediante mutagénesis secuencial con NTG de micelio vegetativo de esta cepa. MF6222 (ATCC 74383) exhibe una morfología de placa de cultivo significativamente diferente de las descritas en la patente de Estados Unidos 5.399.582 (21 de marzo de 1995) para ATCC 74245. MF6222 (ATCC 74383) crece a una velocidad más lenta; en agar de harina de maíz, MF6222 crece 6 mm en 6 días, mientras que ATCC 74245 crece 42 mm en 6 días. MF6222 no produce aireación del micelio en agar de harina de avena. También en agar de harina de avena, y como MF6206, MF6222 exhibe un color de colonia rosa (rosa de piel de cebolla, canela vinosa clara), mientras que ATCC 74245 exhibe un color de colonia marrón amarillento (amarillo marte, siena crudo) a marrón amarillento claro (amarillo anaranjado claro, amarillo de antimonio). Además, MF6222 (ATCC 74383) no produce conidióforos ni conidia.

Claims

1. Un compuesto que tiene la fórmula

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

o una sal o éster del mismo farmacéuticamente aceptable.

2. Un procedimiento para la preparación de un compuesto de la reivindicación 1, que comprende fermentar una cepa de Nodulisporium sp. capaz de producir dicho compuesto en un medio que contiene fuentes asimilables de carbono, nitrógeno y oligoelementos, y aislar dicho compuesto.

3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que la cepa se selecciona de Nodulisporium sp. MF5954 (ATCC 74245), MF6047 (ATCC 74380), MF6087 (ATCC 74381), MF6206 (ATCC 74382) y MF6222 (ATCC 74382).

4. El uso de un compuesto de la reivindicación 1 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de infecciones parasíticas en animales, que comprende tratar un animal infectado con parásitos con una cantidad eficaz de un compuesto de la reivindicación 1.

5. Una composición farmacéutica útil para el tratamiento una de infección parasítica de animales, que comprende un vehículo inerte y un compuesto de la reivindicación 1.

6. Un cultivo biológicamente puro de un Nodulisporium sp. capaz de producir un compuesto de la reivindicación 1, y que tiene las características identificativas de MF6047 (ATCC 74380), MF6087 (ATCC 74381), MF6206 (ATCC 74382) y MF6222 (ATCC 74382).