ES2244104T3 - Antioxidantes orientados mitocondrialmente. - Google Patents

Antioxidantes orientados mitocondrialmente.

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ES2244104T3 ES98961702T ES98961702T ES2244104T3 ES 2244104 T3 ES2244104 T3 ES 2244104T3 ES 98961702 T ES98961702 T ES 98961702T ES 98961702 T ES98961702 T ES 98961702T ES 2244104 T3 ES2244104 T3 ES 2244104T3
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Robin A. J. Smith
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Abstract

Un compuesto antioxidante orientado mitocondrialmente, en donde dicho compuesto tiene la fórmula en la que X es un grupo de conexión, Z es un anión y R es un resto antioxidante seleccionado de un derivado de vitamina E, quinoles, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, un fulereno derivado o derivados de N-óxido de 5, 5-dimetilpirrolina, terc- butilnitrosobenceno, nitrosobenceno y -fenil-terc- butilnitrona.

Description

Antioxidantes orientados mitocondrialmente.
Campo técnico
La invención se refiere a antioxidantes que tienen un grupo catiónico lipófilo y a usos de estos antioxidantes, por ejemplo como productos farmacéuticos.
Antecedentes de la invención
El estrés oxidativo contribuye a un número de enfermedades degenerativas humanas asociadas con el envejecimiento, tales como la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Alzheimer, así como el corea de Huntington y la ataxia de Friedreich, y a un daño no específico que se acumula con el envejecimiento. También contribuye a la inflamación y la lesión tisular por reperfusión isquémica en la apoplejía y el ataque cardíaco, y también durante el trasplante de órganos y la cirugía. Para prevenir el daño provocado por el estrés oxidativo, se ha desarrollado un número de terapias antioxidantes. Sin embargo, la mayoría de estas no están orientadas dentro de las células y por lo tanto no llegan a ser óptimamente eficaces.
Las mitocondrias son orgánulos intracelulares responsables del metabolismo energético. Por consiguiente, los defectos mitocondriales son dañinos, particularmente para tejidos neurales y musculares que tienen altas demandas de energía. También son la principal fuente de los radicales libres y las especies de oxígeno reactivas que provocan estrés oxidativo dentro de la mayoría de las células. Por lo tanto, los solicitantes creen que aportar antioxidantes selectivamente a las mitocondrias será más eficaz que usar antioxidantes no orientados. De acuerdo con esto, es hacia el suministro de antioxidantes que pueden orientarse a las mitocondrias a lo que se dirige la presente invención.
Los cationes lipófilos pueden acumularse en la matriz mitocondrial debido a su carga positiva (Rottenberg, (1979) Methods Enzymol, 55, 547-560; Chen, (1988) Annu Rev Cell Biol 4, 155-181). Tales iones se acumulan con tal de que sean suficientemente lipófilos para ocultar la carga positiva o deslocalizarla a lo largo de una gran área superficial, también con tal de que de no haya un camino de aflujo activo y el catión no sea metabolizado o sea inmediatamente tóxico para una célula.
Mckittrick y Stevenson (1984) J. Chem. Soc. Perkin Trans, 709-721 describe bromuro de hidroxibenciltrifenilfosfonio y su uso en la síntesis de análogos de benzofurano.
Masaki y otros (1989) Archives of Biochemistry and Biophysics 270 672-680 describe tetrafenilborato de trifenilmetilfosfonio.
US 3.537.667 describe bromuro de metiltrifenilfosfonio, bromuro, cloruro, tetrafluoroborato o tetrafenilborato de benciltrifenilfosfonio.
Burns y otros (1997) Archives of Biochemistry and Biophysics 339 33-39 se refiere a bromuro de tiobutiltrifenilfosfonio y a la evaluación del mismo en la reducción del estrés oxidativo en células eucarióticas. También se describen el yoduro de metiltrifenilfosfonio y el bromuro de acetiltiobutiltrifenilfosfonio.
El centro de atención de la invención es por lo tanto un sistema por el que sea posible usar la capacidad de las mitocondrias para concentrar cationes lipófilos específicos para recoger antioxidantes conectados a fin de orientar el antioxidante hacia la fuente principal de radicales libres y especies de oxígeno reactivas que provocan el estrés oxidativo.
Sumario de la invención
En un primer aspecto, la invención proporciona un antioxidante orientado mitocondrialmente de la fórmula
1
en la que Z es un anión, X es un grupo de conexión y R es un resto antioxidante seleccionado de un derivado de vitamina E, quinoles, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, un fulereno derivado o derivados de N-óxido de 5,5-dimetilpirrolina, terc-butilnitrosobenceno, nitrosobenceno y \alpha-fenil-terc-butilnitrona.
Preferiblemente, X es (CH_{2})_{n} donde n es un número entero de 1 a 6.
Más preferiblemente, X es un grupo etileno, propileno o butileno.
Preferiblemente, Z es un anión farmacéuticamente aceptable.
Lo más preferiblemente, el antioxidante orientado mitocondrialmente de la invención tiene la fórmula:
2
Preferiblemente, R se selecciona de los restos antioxidantes mencionados previamente y es capaz de ser transportado a través de la membrana mitocondrial y acumularse dentro de las mitocondrias de células intactas.
En una modalidad particularmente preferida, el antioxidante orientado mitocondrialmente de la invención tiene la fórmula
3 
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en la que Z es un anión.
Preferiblemente, Z es Br.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una composición farmacéutica adecuada para el tratamiento de un paciente que se beneficiará de un estrés oxidativo reducido, que comprende una cantidad eficaz de un antioxidante orientado mitocondrialmente de la presente invención en combinación con uno o más portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables.
En un aspecto adicional, la invención proporciona un método in vitro para reducir el estrés oxidativo en una célula, que comprende la etapa de administrar a dicha célula un antioxidante orientado mitocondrialmente según se define previamente.
En un aspecto adicional más, la invención proporciona el uso de un compuesto de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la profilaxis de estrés oxidativo, por ejemplo en la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer, el corea de Huntington y la ataxia de Friedreich, la inflamación, la lesión tisular por reperfusión isquémica en la apoplejía y el ataque cardíaco, y en el trasplante de órganos y la
cirugía.
Aunque se define ampliamente previamente, la invención no se limita a esto sino que además consiste en modalidades de las que la siguiente descripción proporciona ejemplos.
Descripción de los dibujos
En particular, se obtendrá una mejor comprensión de la invención con referencia a los dibujos adjuntos, en los que:
la Figura 1 es una gráfica que muestra la captación por mitocondrias aisladas de compuesto 1, un antioxidante orientado mitocondrialmente de acuerdo con la presente invención;
la Figura 2 es una gráfica que muestra la acumulación de compuesto 1 por mitocondrias aisladas;
la Figura 3 es una gráfica que muestra una comparación de una captación de compuesto 1 con la del catión trifenilfosfonio (TMPM);
la Figura 4 es una gráfica que muestra que el compuesto 1 protege a las mitocondrias contra el daño oxidativo;
la Figura 5 es una gráfica que compara el compuesto 1 con la vitamina E y el efecto del desacoplador y otros cationes lipófilos;
la Figura 6 es una gráfica que muestra que el compuesto 1 protege a la función mitocondrial del daño oxidativo;
la Figura 7 es una gráfica que muestra el efecto del compuesto 1 sobre la función mitocondrial;
la Figura 8 es una gráfica que muestra la captación de compuesto 1 por células;
la Figura 9 es una gráfica que muestra la captación sensible a la energización de compuesto 1 por células; y
la Figura 10 es una gráfica que muestra el efecto del compuesto 1 sobre la viabilidad celular.
Descripción de la invención
Según se indica previamente, el centro de atención de esta invención está puesto sobre la orientación mitocondrial de compuestos, principalmente con el propósito de la terapia y/o la profilaxis para reducir el estrés oxidativo.
Las mitocondrias tienen un potencial de membrana substancial de hasta 180 mV a través de su membrana interna (interior negativo). Debido a este potencial, cationes lipófilos que penetran en la membrana se acumulan varios cientos de veces dentro de la matriz mitocondrial.
Los solicitantes han encontrado ahora que acoplando covalentemente cationes lipófilos (preferiblemente el catión trifenilfosfonio lipófilo) a un antioxidante, el compuesto puede aportarse a la matriz mitocondrial dentro de células intactas. El antioxidante se orienta a continuación a un sitio de producción primario de radicales libres de especies de oxígeno reactivas dentro de la célula, en lugar de dispersarse aleatoriamente.
En principio, pueden emplearse cualquier catión lipófilo y cualquier antioxidante para formar los compuestos de la invención. Sin embargo, se prefiere que el catión lipófilo sea el catión trifenilfosfonio aquí ejemplificado y que el catión lipófilo se conecte al resto antioxidante mediante un grupo alquileno de cadena lineal que tenga de 1 a 6 átomos de carbono; más preferiblemente un grupo etileno, propileno o butileno. Otros cationes lipófilos que pueden acoplarse covalentemente a antioxidantes de acuerdo con la presente invención incluyen los cationes tribencilamonio y
fosfonio.
Tales compuestos antioxidantes preferidos pueden prepararse fácilmente, por ejemplo, mediante la siguiente reacción:
4 
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La estrategia de síntesis general es calentar un precursor halogenado, preferiblemente un precursor bromado o yodado (RBr o RI), en un disolvente apropiado, con 2-3 equivalentes de trifenilfosfina bajo argón durante varias horas. El compuesto de fosfonio se aísla a continuación como su sal de bromuro o yoduro. Para hacer esto, el disolvente se retira, el producto se tritura a continuación repetidamente con éter dietílico hasta que queda un sólido blanquecino. Este se disuelve a continuación en cloroformo y se precipita con éter dietílico para retirar la trifenilfosfina en exceso. Esto se repite hasta que el sólido ya no se disuelve en cloroformo. En este punto, el producto se recristaliza varias veces en cloruro de metileno/éter dietílico.
También se apreciará que el anión del compuesto antioxidante así preparado, que será un halógeno cuando se usa este procedimiento sintético, puede intercambiarse fácilmente por otro anión farmacéuticamente o farmacológicamente aceptable, si esto es deseable o necesario, usando técnicas de intercambio iónico, cromatografía u otras conocidas en la especialidad.
El mismo procedimiento general puede usarse para elaborar una amplia gama de compuestos orientados mitocondrialmente con diferentes restos antioxidantes R unidos a la sal de trifenilfosfonio (u otra catiónica lipófila). Estos incluirán una serie de derivados de vitamina E, en los que la longitud del puente que conecta la función vitamina E con la sal de trifenilfosfonio se varía. Otros antioxidantes que pueden usarse como R incluyen antioxidantes de ruptura de cadena, tales como hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, quinoles y eliminadores de radicales generales tales como fulerenos derivados. Además, también pueden sintetizarse atrapadores de espín, que reaccionan con radicales libres para generar radicales libres estables. Estas incluirán derivados de N-óxido de 5,5-dimetilpirrolina, terc-butilnitrosobenceno, terc-nitrosobenceno, \alpha-fenil-terc-butilnitrona y compuestos relacionados.
Una vez preparado, el compuesto antioxidante de la invención, en cualquier forma farmacéuticamente apropiada e incluyendo opcionalmente portadores o aditivos farmacéuticamente aceptables, se administrará al paciente que requiere terapia y/o profilaxis. Una vez administrado, el compuesto se orientará a la mitocondria dentro de la
célula.
Se indican más adelante esquemas sintéticos que pueden usarse para preparar algunos otros compuestos antioxidantes orientados mitocondrialmente específicos de la presente invención, a saber (1) una versión mitocondrialmente orientada de buckministerfulereno; (2) un compuesto atrapador de espín orientado mitocondrialmente; y (3) una ruta sintética adicional para un compuesto atrapador de espín orientado mitocondrialmente.
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(Esquema pasa a página siguiente)
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Síntesis de Buckministerfulereno
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Síntesis de Atrapador de Espín I
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Síntesis de Atrapador de Espín II
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La invención se describirá ahora con más detalle con referencia a la siguiente sección experimental no limitativa.
Parte experimental 1. Síntesis de un derivado de vitamina E orientado mitocondrialmente (Compuesto 1)
La estrategia de síntesis para un derivado de vitamina E orientado mitocondrialmente (compuesto 1) es como sigue. El precursor bromado (compuesto 2) 2-(2-bromoetil)-3,4-dihidro-6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametil-2H-1-benzopirano se sintetizó mediante la bromación del alcohol correspondiente según se describe por Grisar y otros, (1995) (J Med Chem 38, 2880-2886). El alcohol se sintetizó mediante la reducción del ácido carboxílico correspondiente según se describe por Cohen y otros, (1979) (J Amer Chem Soc 101, 6710-6716). El derivado de ácido carboxílico se sintetizó como se describe por Cohen y otros, (1982) (Syn Commun 12, 57-65) a partir de 2,6-dihidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano, sintetizado como se describe por Scott y otros, (1974) (J. Amer. Oil Chem. Soc. 101, 6710-6716).
8
Para la síntesis del compuesto 1, 1 g de compuesto 2 se añadió a 8 ml de butanona que contenía 2,5 equivalentes molares de trifenilfosfina y se calentó a 100ºC en un tubo de Kimax cerrado herméticamente bajo argón durante 7-8 días. El disolvente se retiró bajo vacío a temperatura ambiente, el aceite amarillo se trituró con éter dietílico hasta que quedaba un sólido blanquecino. Este se disolvió a continuación en cloroformo y se precipitó con éter dietílico. Esto se repitió hasta que el sólido era insoluble en cloroformo y a continuación se recristalizó varias veces en cloruro de metileno/éter dietílico y se secó bajo vacío para dar un polvo higroscópico blanco.
2. Captación mitocondrial de compuesto 1
Para demostrar que esta orientación es eficaz, el compuesto 1 de vitamina E ejemplar se probó con relación tanto a mitocondrias aisladas como a células aisladas. Para hacer esto, se sintetizó una versión [^{3}H] del compuesto 1 usando [^{3}H]-trifenilfosfina y la acumulación mitocondrial de compuesto 1 se cuantificó mediante conteo por centelleo (Fig. 1) (Burns y otros, 1995; Arch Biochem Biophys 332, 60-68; Burns y Murphy, 1997, Arch Biochem Biophys 339, 33-39). Para hacer esto, mitocondrias de hígado de rata se incubaron bajo condiciones que se sabe que generan un potencial de membrana mitocondrial de aproximadamente 180 mV (Burns y otros, 1995; Burns y Murphy, 1997). Bajo estas condiciones, el compuesto 1 se recogió rápidamente (< 10 s) en las mitocondrias con una relación de acumulación de aproximadamente 6.000. Esta acumulación de compuesto 1 en las mitocondrias se bloqueó mediante la adición del desacoplador FCCP (cianuro de carbonilo-p-trifluorometoxifenilhidrazona) que evita que las mitocondrias establezcan un potencial de membrana (Figs. 1 y 2) (Burns y otros, 1995). Por lo tanto, el compuesto 1 se acumula rápidamente y selectivamente en mitocondrias activadas por el potencial de membrana mitocondrial y esta acumulación da como resultado una concentración del compuesto dentro de las mitocondrias varias miles de veces superior que en el medio externo. Esta acumulación se invierte rápidamente (< 10 s) mediante la adición del desacoplador FCCP para disipar el potencial de membrana mitocondrial después de la acumulación de compuesto 1 dentro de las mitocondrias. Por lo tanto, la acumulación específica mitocondrial solo se debe al potencial de membrana mitocondrial y no se debe a unión específica o interacción covalente.
La acumulación específica mitocondrial de compuesto 1 también se produce en células intactas. Esto se midió según se describe por Burns y Murphy, 1997, y la acumulación se evitó disipando los potenciales de membrana tanto mitocondrial como plasmática. Además, el compuesto 1 no fue acumulado por células que contenían mitocondrias defectuosas, que por consiguiente no tienen un potencial de membrana mitocondrial. Por lo tanto, la acumulación de compuesto 1 en células está conducida por el potencial de membrana mitocondrial.
La relación de acumulación era similar a través de un intervalo de concentraciones de compuesto 1 y la cantidad de compuesto 1 recogida dentro de la mitocondria corresponde a una concentración intramitocondrial de 4-8 mM (Fig. 2). Esta captación se debía totalmente al potencial de membrana y era paralela a la del catión trifenilfosfonio TPMP simple a lo largo de un intervalo de potenciales de membrana (Fig. 3). A partir de la comparación de la captación de TPMP y compuesto 1 al mismo potencial de membrana, se infirió que dentro de la mitocondria aproximadamente 84% de compuesto 1 está unido a la membrana (cfr. aproximadamente 60% para el compuesto menos hidrófobo TPMP).
Detalles adicionales de los procedimientos experimentales y los resultados se dan más adelante.
La Figura 1 muestra la captación de compuesto 1 [^{3}H] 10 \muM por mitocondrias de hígado de rata energizadas (línea continua y símbolos rellenos). La línea punteada y los símbolos abiertos muestran el efecto de la adición de FCCP 333 nM a los 3 minutos. La incubación con FCCP desde el comienzo de la incubación conducía a la misma captación que para añadir FCCP a los 3 minutos (datos no mostrados). Las mitocondrias de hígado se prepararon a partir de ratas Wistar hembra mediante homogeneización seguido por centrifugación diferencial en medio que contenía sacarosa 250 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 7,4) y EGTA 1 mM y la concentración de proteína se determinó mediante el ensayo con biuret usando BSA como un patrón. Para medir la captación de compuesto 1 [^{3}H], las mitocondrias (2 mg de proteína/ml) se suspendieron a 25ºC en 0,5-1 ml de KCl 110 mM, Hepes 40 mM-KOH, pH 7,2, EDTA 0,1 mM complementado con nigericina (1 \mug/ml), succinato 10 mM, 1,33 \mug/ml de rotenona y 60 nCi/ml de compuesto 1 [^{3}H] y compuesto 1 10 \muM. Después de la incubación, las mitocondrias se nodulizaron mediante centrifugación y el compuesto 1 [^{3}H] en el sobrenadante y el nódulo se cuantificó mediante conteo por centelleo.
La Figura 2 muestra las relaciones de acumulación mitocondrial [(compuesto 1/mg de proteína)/(compuesto 1/\mul)] obtenidas después de una incubación de 3 minutos de mitocondrias de hígado de rata energizadas con diferentes concentraciones de compuesto 1 (barras rellenas) y el efecto de FCCP 333 nM sobre estas (barras abiertas). La línea punteada y los círculos abiertos muestran la captación de compuesto 1 por mitocondrias, corregida para la unión insensible a FCCP. Para medir la relación de acumulación de compuesto 1 [^{3}H], las mitocondrias (2 mg de proteína/ml) se suspendieron a 25ºC en 0,5-1 ml de KCl 110 mM, Hepes 40 mM-KOH, pH 7,2, EDTA 0,1 mM complementado con nigericina (1 \mug/ml), succinato 10 mM, 1,33 \mug/ml de rotenona y 6-60 nCi/ml de compuesto 1 [^{3}H] y compuesto 1 1-50 \muM. Después de la incubación, las mitocondrias se nodulizaron mediante centrifugación y el compuesto 1 [^{3}H] en el sobrenadante y el nódulo se cuantificó mediante conteo por centelleo.
La Figura 3 muestra una comparación de la captación de compuesto 1 con la de TPMP a un intervalo de potenciales de membrana mitocondrial. Mitocondrias de hígado de rata energizadas se incubaron durante 3 minutos con compuesto 1 10 \muM y TPMP 1 \muM y se establecieron diferentes potenciales de membrana con malonato 0-8 mM o FCCP 333 nM. Las relaciones de acumulación de incubaciones paralelas con 60 nCi/ml de compuesto 1 [^{3}H] o 50 nCi/ml de TPMP [^{3}H] se determinaron y la relación de acumulación para el compuesto 1 se representa con relación a la de TPMP al mismo potencial de membrana (pendiente = 2,472, intersección y = 329, r = 0,97). Las mitocondrias (2 mg de proteína/ml) se suspendieron a 25ºC en 0,5-1 ml de KCl 110 mM, Hepes 40 mM-KOH, pH 7,2, EDTA 0,1 mM complementado con nigericina (1 \mug/ml), succinato 10 mM, 1,33 \mug/ml de rotenona.
3. Eficacia antioxidante del compuesto 1
Los compuestos de la invención también son altamente eficaces contra el estrés oxidativo. Para demostrar esto, el compuesto 1 ejemplar se probó adicionalmente usando homogenados de cerebro de rata. Los homogenados de cerebro de rata se incubaron con o sin diversas concentraciones de los compuestos de prueba (compuesto 1; vitamina E natural (\alpha-tocoferol), bromuro de bromobutiltrifenilfosfonio, Trolox (una forma soluble en agua de vitamina E) y compuesto 2, es decir 2-(2-bromoetil)-3,4-dihidro-2,5,7,8-tetrametil-2H-1-benzopiran-6-ol, el precursor del compuesto 1 ("Vitamina E Bromada")) y el daño oxidativo que se produce durante la incubación se cuantificó usando el ensayo TBARS (Stocks y otros, 1974, Clin Sci Mol Med 47, 215-222). A partir de esto, se determinó la concentración de compuesto requerida para inhibir el daño oxidativo en 50%. En este sistema, compuesto 1 210 nM inhibía el estrés oxidativo en 50% mientras que el valor correspondiente para la vitamina E natural era 36 nM. El valor del bromuro de bromobutiltrifenilfosfonio, que contiene el resto trifenilfosfonio pero no el resto de vitamina E antioxidante, era 47 \muM. Estos datos muestran que el compuesto 1 es un antioxidante extremadamente eficaz, dentro de un orden de magnitud tan eficaz como la vitamina E. La comparación con el bromuro de bromobutiltrifenilfosfonio muestra que la capacidad antioxidante se debe a la función de la vitamina E y no a la sal de fosfonio. Detalles adicionales de los procedimientos experimentales y los resultados se indican más adelante.
Los valores de IC_{50} para la inhibición de la peroxidación de lípidos se determinaron en homogenados de cerebro de rata y son medias \pm SEM o un intervalo de determinaciones sobre 2-3 preparaciones de cerebro. Los coeficientes de reparto de octan-1-ol/PBS son medias \pm SEM para tres determinaciones independientes. N.D. no determinado. Los coeficientes de reparto se determinaron mezclando 200 \muM del compuesto en 2 ml de octan-1-ol saturado con agua con 2 ml de PBS saturado con octanol a temperatura ambiente durante 1 h, a continuación las dos capas se separaron mediante centrifugación breve y sus concentraciones de determinaron espectrofotométricamente a partir de curvas estándar preparadas en PBS u octanol. Para medir la eficacia antioxidante cuatro cerebros de rata se homogeneizaron en 15 ml de fosfato potásico 40 mM (pH 7,4), NaCl 140 mM, a 4ºC, la materia en partículas se nodulizó (1.000 x g a 4ºC durante 15 minutos) y se lavó una vez y los sobrenadantes combinados se almacenaron congelados. Partes alícuotas se descongelaron rápidamente y 5 mg de proteína se suspendieron en 800 \mul de PBS que contenía antioxidante o portador de etanol y se incubaron a 37ºC durante 30 minutos. Las especies reactivas con ácido tiobarbitúrico (TBARS) se cuantificaron a 532 nm añadiendo 200 \mul de HClO_{4} concentrado y 200 \mul de ácido tiobarbitúrico al 1% a la incubación, calentando a 100ºC durante 15 minutos y a continuación enfriando y clarificando mediante centrifugación (10.000 x g durante 2 minutos). Los resultados se muestran en la Tabla 1 a continuación.
TABLA 1 Coeficientes de reparto y eficacia antioxidante del compuesto 1 y compuestos relacionados 
\vskip1.000000\baselineskip
Compuesto IC_{50} para la inhibición de Coeficiente de reparto
la peroxidación de lípidos (nM) de octanol:PBS
Compuesto 1 210 \pm 58 7,37 \pm 1,56
Vitamina E Bromada 45 \pm 26 33,1 \pm 4,4
\alpha-Tocoferol 36 \pm 22 27,4 \pm 1,0
Trolox 18500 \pm 5900 N.D.
BrBTP 47000 \pm 13000 3,83 \pm 0,22
Cuando las mitocondrias se exponían a estrés oxidativo, el compuesto 1 las protegía contra el daño oxidativo, medido mediante peroxidación de lípidos y formación de carbonilo proteínico (Fig. 4). Esta protección antioxidante se evitaba incubando las mitocondrias con el desacoplador FCCP para evitar la captación de compuesto 1, y los cationes lipófilos solos no protegían a las mitocondrias (Fig. 5). De la forma más importante, la captación de compuesto 1 protegía la función mitocondrial, medida mediante la capacidad para generar un potencial de membrana, mucho más eficazmente que la propia vitamina E (Fig. 6). Esto muestra que la acumulación de compuesto 1 en mitocondrias protege selectivamente su función del daño oxidativo. Además, se observó que el compuesto 1 no es dañino para las mitocondrias a las concentraciones que producen protección (Fig. 7).
La siguiente etapa era determinar si el compuesto 1 era acumulado por células intactas. El compuesto 1 era acumulado rápidamente por células 143B intactas, y la cantidad acumulada era mayor que por células \rhoº derivadas de células 143B. Esto es importante debido a que las células \rhoº carecen de DNA mitocondrial y por consiguiente tienen un potencial de membrana mitocondrial mucho menor que las células 143B, pero son idénticas de cualquier otro modo, incluyendo el potencial de la membrana plasmática, el volumen celular y el contenido de proteína (Fig. 8); esto sugiere que la mayoría del compuesto 1 dentro de las células es mitocondrial. Una proporción de esta captación de compuesto 1 en las células se inhibía bloqueando los potenciales de las membranas plasmática y mitocondrial (Fig. 9). Esta captación sensible a la energización corresponde a una concentración intramitocondrial de compuesto 1 de aproximadamente 2-4 mM, que es suficiente para proteger a las mitocondrias del daño oxidativo. Estas concentraciones de compuesto 1 son atóxicas para las células (Fig. 10).
Detalles adicionales de los procedimientos experimentales y los resultados se analizan a continuación.
La figura 4 muestra la protección de mitocondrias contra el daño oxidativo por el compuesto 1. Las mitocondrias se expusieron a estrés oxidativo mediante incubación con hierro/ascorbato y el efecto del compuesto 1 sobre el daño oxidativo se determinó midiendo TBARS (barras rellenas) y carbonilos proteínicos (barras abiertas). Mitocondrias de hígado de rata (10 mg de proteína) se incubaron a 25ºC en un baño de agua removido en 2 ml de medio que contenía KCl 100 mM, Tris 10 mM, pH 7,7, complementado con rotenona (1,33 \mug/ml), succinato 10 mM, ascorbato 500 \muM y otras adiciones. Después de la preincubación durante 5 minutos, se añadió FeSO_{4} 100 \muM y 45-55 minutos más tarde muestras duplicadas se retiraron y se ensayaron con respecto a TBARS o carbonilos proteínicos.
La Figura 5 muestra una comparación del compuesto 1 con la vitamina E y se determinó el efecto del desacumulador y otros cationes lipófilos. Mitocondrias de hígado de rata energizadas se expusieron a hidroperóxido de terc-butilo y se determinó el efecto del compuesto 1 (barras rellenas), \alpha-tocoferol (barras abiertas), el compuesto 1 + FCCP 333 nM (barras punteadas) o el catión lipófilo simple bromobutiltrifenilfosfonio (barras con rayas cruzadas) sobre la formación de TBARS. Las mitocondrias de hígado de rata (4 mg de proteína) se incubaron en 2 ml de medio que contenía KCl 120 mM, Hepes 10 mM-HCl, pH 7,2, EGTA 1 mM, a 37ºC, en un baño de agua con remoción, durante 5 minutos, con diversas adiciones, a continuación se añadió hidroperóxido de terc-butilo (5 mM) y las mitocondrias se incubaron durante 45 minutos más y a continuación se determinaron TBARS.
La Figura 6 muestra cómo el compuesto 1 protege a la función mitocondrial del daño oxidativo. Mitocondrias de hígado rata energizadas se incubaron con hierro/ascorbato sin adiciones (barras punteadas), compuesto 1 5 \muM (barras rellenas), \alpha-tocoferol 5 \muM (barras abiertas) o TPMP 5 \muM (barras con rayas cruzadas) y a continuación se aislaron y el potencial de membrana generado por substratos respiratorios se midió con relación a incubación de control en ausencia de hierro/ascorbato. Las mitocondrias de hígado de rata se incubaron a 25ºC en un baño de agua con remoción en 2 ml de medio que contenía KCl 100 mM, Tris 10 mM, pH 7,7, complementado con rotenona (1,33 \mug/ml), succinato 10 mM, ascorbato 500 \muM y otras adiciones. Después de la preincubación durante 5 minutos, se añadió FeSO_{4} 100 \muM y, después de 30 minutos, la incubación se diluyó con 6 ml de STE enfriado con hielo, sacarosa 250 mM, Tris 10 mM-HCl (pH 7,4) y EGTA 1 mM, se nodulizó mediante centrifugación (5 minutos a 5.000 x g) y el nódulo se resuspendió en 200 \mul de STE y 20 \mul (= 1 mg de proteína) se suspendieron en 1 ml de KCl 110 mM, HEPES 40 mM, EDTA 0,1 M, pH 7,2, que contenía TPMP 1 \muM y 50 nCi/ml de TPMP [^{3}H], y bien glutamato y malato 10 mM, succinato y rotenona 10 mM o ascorbato 5 mM/TMPD 100 \muM con rotenona y mixotiazol (2 \mug/ml), se incubó a 25ºC durante 3 minutos y a continuación se nodulizó y el potencial de membrana se determinó como previamente y se comparó con una incubación que no se había expuesto a estrés oxidativo.
La Figura 7 muestra el efecto del compuesto 1 sobre el potencial de membrana (barras rellenas) y la velocidad de respiración de mitocondrias acopladas (barras abiertas), fosforilantes (barras punteadas) y no acopladas (barras con rayas cruzadas), como un porcentaje de los valores en ausencia del compuesto 1. El efecto de diversas concentraciones de compuesto 1 sobre el potencial de membrana de mitocondrias aisladas se determinó a partir de la distribución de TPMP [^{3}H] incubando mitocondrias de hígado de rata (2 mg de proteína/ml) en 0,5 ml de medio como previamente que contiene TPMP 1 \muM y 50 nCi/ml de TPMP [^{3}H], a 25ºC durante 3 minutos. Después de la incubación, las mitocondrias se nodulizaron mediante centrifugación y el TMPM [^{3}H] en el sobrenadante y el nódulo se cuantificó mediante el conteo por centelleo y el potencial de membrana se calculó suponiendo un volumen de 0,5 \mul/mg de proteínas y que 60% de TMPM intramitocondrial está unido a la membrana. Para medir el efecto del compuesto 1 sobre las velocidades de respiración acopladas, fosforilantes y no acopladas, las mitocondrias (2 mg de proteína/ml) se suspendieron en KCl 120 mM, Hepes 10 mM-HCl, pH 7,2, EGTA 1 mM, K Pi 10 mM en un electrodo de oxígeno Clark de 3 ml y a continuación substrato respiratorio, ADP (200 \muM) y FCCP (333 nM) se añadieron secuencialmente al electrodo y las velocidades de respiración se midieron.
La Figura 8 muestra la captación de compuesto 1 por células. Aquí, 10^{6} células 143B (símbolos cerrados) o células \rhoº (símbolos abiertos) se incubaron con compuesto 1 [^{3}H] 1 mM y se determinó una relación de acumulación del compuesto 1. Células 143B de osteosarcoma humano y la línea celular \rhoº derivada que carece de DNA mitocondrial se cultivaron en DMEM/FCS (suero de ternero fetal) al 10% complementado con uridina y piruvato bajo una atmósfera de CO_{2} al 5%/aire al 95% a 37ºC, se hicieron crecer hasta la confluencia y se recogieron para los experimentos mediante tratamiento con tripsina. Para medir la acumulación de compuesto 1 [^{3}H], las células (10^{6}) se incubaron en 1 ml de HEPES-DMEM tamponado. Al final de la incubación, las células se nodulizaron mediante centrifugación, el nódulo celular y el sobrenadante se prepararon para el conteo por centelleo y se calculó la relación de acumulación [compuesto 1/mg de proteína/(compuesto 1/\mul)].
La Figura 9 muestra la cantidad de compuesto 1 recogida por 10^{6} células 143B durante una incubación de 1 hora, corregida para la unión insensible a inhibidor. Células 143B de osteosarcoma humano se incubaron en 1 ml de HEPES-DMEM tamponado con compuesto 1 1-50 \muM complementado con 6-60 nCi/ml de compuesto 1 [^{3}H]. Para determinar la captación dependiente de la energización, se llevaron a cabo incubaciones paralelas con oligomicina 12,5 \muM, FCCP 20 \muM, mixatiazol 10 \muM, valinomicina 100 nM y ouabaína 1 mM. Al final de la incubación, las células se nodulizaron mediante centrifugación y se prepararon para el conteo por centelleo y se determinó la captación sensible a la energización.
La Figura 10 muestra el efecto del compuesto 1 sobre la viabilidad celular. Aquí, células 143B confluentes en platos de cultivo tisular de 24 pocillos se incubaron con diversas concentraciones de compuesto 1 durante 24 h y la viabilidad celular se midió mediante liberación de lactato deshidrogenasa.
Aplicación industrial
Los compuestos de la invención tienen aplicación en terapias antioxidantes selectivas para pacientes humanos para prevenir el daño mitocondrial. Esto puede ser para prevenir el estrés oxidativo mitocondrial elevado asociado con enfermedades particulares, tales como la enfermedad de Parkinson, o enfermedades asociadas con mutaciones de DNA mitocondrial. También podrían usarse junto con terapias de trasplante celular para enfermedades neurodegenerativas, para incrementar el grado de supervivencia de células implantadas.
Además, estos compuestos podrían usarse como agentes profilácticos para proteger órganos durante el trasplante, o mejorar la lesión por reperfusión isquémica que se produce durante la cirugía. Los compuestos de la invención también podrían usarse para reducir el daño celular después de apoplejía y ataque cardíaco o administrarse profilácticamente a niños prematuros, que son susceptibles de isquemia cerebral. Los métodos de la invención tienen una ventaja principal sobre terapias antioxidantes actuales - permitirán que los antioxidantes se acumulen selectivamente en las mitocondrias, la parte de la célula bajo mayor estrés oxidativo. Esto incrementará mucho la eficacia de las terapias antioxidantes. Cationes lipófilos relacionados se están probando como fármacos anticancerígenos potenciales y se sabe que son relativamente atóxicos para animales enteros, por lo tanto, es improbable que estos antioxidantes orientados mitocondrialmente tengan efectos secundarios dañinos.

Claims (9)

1. Un compuesto antioxidante orientado mitocondrialmente, en donde dicho compuesto tiene la fórmula
9
en la que X es un grupo de conexión, Z es un anión y R es un resto antioxidante seleccionado de un derivado de vitamina E, quinoles, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, un fulereno derivado o derivados de N-óxido de 5,5-dimetilpirrolina, terc-butilnitrosobenceno, nitrosobenceno y \alpha-fenil-terc-butilnitrona.
2. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en el que X es (CH_{2})_{n} donde n es un número entero de 1 a 6.
3. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 2, en el que X es un grupo etileno, propileno o butileno.
4. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 3, en el que X es un grupo etileno.
5. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, en donde compuesto tiene la fórmula
10
en la que Z es un anión.
6. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 5, en el que Z es Br.
7. Una composición farmacéutica para el tratamiento de un paciente que se beneficia de un estrés oxidativo reducido, que comprende una cantidad eficaz de un antioxidante orientado mitocondrialmente de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en combinación con uno o más portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables.
8. Uso de un antioxidante orientado mitocondrialmente de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la profilaxis del estrés oxidativo, por ejemplo en la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer, el corea de Huntington, la ataxia de Friedreich, la inflamación, la lesión tisular por reperfusión isquémica en la apoplejía y el ataque cardíaco, y en el trasplante de órganos y la cirugía.
9. Un método in vitro para reducir el estrés oxidativo en una célula, que comprende la etapa de administrar a la célula un antioxidante orientado mitocondrialmente de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
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