ES2338987T3 - Derivados de moleculas lipofilicas de cadena ramificada y usos de los mismos. - Google Patents
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Abstract
Un compuesto de fórmula general I: **(Ver fórmula)** o una de sus sales farmacéuticamente aceptable, en la que: R1 y R2 son cadenas alifáticas saturadas o insaturadas diferentes, que comprenden de 2 a 30 átomos de carbono; R3 es A-[CH2]m-B-[CH2]n-C-[CH2]p-D, en el que m, n y p son cada uno independientemente 0 o un número entero de 1 a 12, y A, B, C y D se selecciona cada uno independientemente de un enlace covalente, grupo amino, amido, oxígeno, tio, carbonilo, carboxilo, oxicarbonilo, tiocarbonilo, fosfato, aminofosfato, mono, di y triaminofosfato, con la condición de que 2 átomos de oxígeno no estén conectados directamente entre sí, en el que -R3-O- comprende un resto monoetilenglicol o dietilenglicol. Z1 y Z2 son iguales o diferentes, cada uno puede estar ausente o se selecciona independientemente de a) hidrógeno, sodio, litio, potasio, amonio, mono, di, tri y tetraalquilamonio, o b) junto con el grupo fosfo forman un fosfoéster de glicerol, colina, etanolamina, inositol, serina, mono u oligosacárido.
Description
Derivados de moléculas lipofílicas de cadena
ramificada y usos de los mismos.
La presente invención se refiere a nuevos
derivados fosforados de moléculas lipófilas de cadena ramificada, a
composiciones farmacéuticas de las mismas y a su uso para aumentar
la permeabilidad de barreras biológicas de una forma reversible y
selectiva y para inhibir el crecimiento tumoral.
Una limitación importante en el uso de muchos
fármacos y agentes terapéuticos es su capacidad inadecuada para
pasar a través de barreras biológicas. Esto supone un problema
grave, en especial para el tratamiento de enfermedades y trastornos
en sitios privilegiados como el sistema nervioso central (SNC).
La barrera hematoencefálica (BHE), compuesta de
células endoteliales microvasculares especializadas conectadas por
estrechas uniones, normalmente es responsable de mantener el entorno
hemostático del cerebro y protegerlo de agentes tóxicos y productos
de degradación presentes en el sistema circulatorio. Sin embargo, en
algunas situaciones patológicas, la presencia de la BHE puede
interferir con el transporte de sustancias terapéuticas al cerebro,
impidiendo así el tratamiento de lesiones del sistema nervioso
central, incluyendo tumores, infecciones, abscesos y enfermedades
degenerativas.
De una forma similar, la presencia de la barrera
hematotumoral (BHT) interfiere con el suministro de agentes
quimioterapéuticos al tumor, disminuyendo así la biodisponibilidad
del fármaco y previniendo el efecto terapéutico eficaz donde se
necesita. El problema de acceso insuficiente del agente terapéutico
al objetivo enfermo es especialmente grave en el caso de tumores
del SNC, y los pacientes que tienen tumores cerebrales malignos
tienen un pronóstico malo.
Con el fin de alcanzar concentraciones
clínicamente útiles de determinados fármacos en sitios restringidos,
a menudo se requiere administrar estos compuestos como
dosificaciones sistémicas altas. Las concentraciones sistémicas
altas, a su vez, están asociadas con efectos secundarios adversos y
niveles altos de toxicidad.
Una estrategia para atacar el problema implica
alterar las características biofísicas de las moléculas de fármaco
hidrófilas, por ejemplo, mediante la unión de estos fármacos a un
vehículo lipófilo. Puesto que la permeabilidad de los fármacos a
través de dichas membranas biológicas depende de su lipofilia, el
aumento de la naturaleza lipófila del compuesto debería,
teóricamente, mejorar su biodisponibilidad y aumentar los efectos
terapéuticos. Dichos conjugados lipídicos polares covalentes con
compuestos neurológicamente activos dirigidos se describen en la
patente de EE.UU. 5.827.819 de Yatvin et al.
Otro enfoque para superar la impermeabilidad de
la BHE es usando agentes que abran transitoriamente la BHE y
faciliten la entrada de un fármaco o agente particular en el
cerebro. Se ha mostrado que agentes tales como el manitol ejercen
este efecto deseable y se han usado para el suministro de agentes
quimioterapéuticos en tumores cerebrales malignos (Hiesinger et
al. (1986), Annals of Neurology,
19:50-59). Sin embargo, el uso de este tipo de
alteración hiperosmolar de la BHE en la terapia de tumores
cerebrales ha sido controvertido, puesto que además del fármaco que
cruza la BHE, también se permite que entren otras moléculas tales
como neurotoxinas. Esto puede dar cuenta de la incidencia alta de
accidentes cerebrovasculares, ataques epilépticos, reacciones
inmunológicas y toxicidad ocular asociada con tratamientos que usan
métodos de apertura osmótica.
Se han descrito una variedad de tratamientos
distintos para aumentar la permeabilidad de la barrera
hematoencefálica, que incluyen: el uso de agonistas de la
bradiquinina (documento WO 91/16355 de Alkermes) y algunos otros
péptidos (documento WO 92/18529 de Alkermes); uso de fragmentos de
pared celular bacteriana (documento WO 91/16064 de Rockefeller
Univ.) o el uso de anticuerpo contra hemaglutinina filamentosa de
Bordetella pertussis o molécula endotelial x cerebral (WO
92/19269 de Rockefeller Univ.). También se ha publicado que algunos
ácidos grasos, como el ácido oleico, abren de forma reversible la
BHE (Sztriha y Betz (1991), Brain Res. 336:
257-262).
Se ha descrito la utilidad de métodos para el
aumento reversible de la permeabilidad de la barrera
hematoencefálica antes de la administración de reactivos de
diagnóstico (patente de EE.UU. 5.059.415 de la Oregon Health Sci.
U.) o de reactivos terapéuticos (WO 89/11299 de la Oregon
Health'Sci. U.).
Los autores de la presente invención han
descrito previamente, en la publicación de solicitud de patente
internacional número WO 99/02120, que ácidos grasos ramificados y
determinados derivados lipófilos de los mismos, son útiles para la
permeabilización reversible de biomembranas. Sin embargo, no se han
descrito compuestos que comprenden un resto fosfato. Además, no se
ha descrito que mediante la modificación de los ácidos grasos
ramificados por adición de un resto fosfato, se puede modular la
apertura de barreras biológicas de una forma específica y
diferencial.
Claramente, las composiciones desarrolladas
hasta ahora para permeabilizar membranas y barreras biológicas
producen efectos secundarios graves. Por lo tanto, hay una necesidad
no satisfecha de proporcionar medios eficaces y seguros para
suministrar cantidades adecuadas de agentes terapéuticos y de
diagnóstico en sitios restringidos.
Se han propuesto numerosas composiciones para
usar en el tratamiento de diferentes cánceres, y están incluidos
entre ellos los compuestos que comprenden una cadena hidrocarbonada
y un resto de fosfocolina. Las patentes de EE.UU. 4.837.023 y
5.049.552, ambas de Eibl, describen composiciones y métodos útiles
para tratar el cáncer. El material activo en estos casos es la
sustancia conocida hexadecilfosfocolina (HePC). Sin embargo, de
acuerdo con la descripción en estas patentes, de todos los
compuestos ensayados solo la HePC tiene una acción antitumoral útil
en la práctica, mientras que homólogos con radicales alquilo más
cortos no tienen o tienen una acción antitumoral demasiado baja y
los homólogos con radicales alquilo más largos eran demasiado
tóxicos. La técnica anterior no describe ni sugiere ninguno de los
compuestos que son el objeto de la presente invención.
El documento DE 3609492 A1 describe un
procedimiento para preparar una sal de metal alcalino de un éster
fosfónico, haciendo reaccionar una sal de metal monoalcalina de un
monoéster fosfónico y un compuesto epoxídico.
La presente invención proporciona, en un
aspecto, un compuesto de fórmula general I:
o una de sus sales
farmacéuticamente aceptable, en la
que:
R1 y R2 son cadenas alifáticas saturadas o
insaturadas diferentes, que comprenden de 2 a 30 átomos de
carbono;
R3 es
A-[CH_{2}]_{m}-B-[CH_{2}]_{n}C-[CH_{2}]_{p}-D,
en el que m, n y p son cada uno independientemente cero o un número
entero de 1 a 12, y A, B, C y D se selecciona cada uno
independientemente de un enlace covalente, grupo amino, amido,
oxígeno, tio, carbonilo, carboxilo, oxicarbonilo, tiocarbonilo,
fosfato, aminofosfato, mono, di y triaminofosfato, con la condición
de que 2 átomos de oxígeno no estén conectados directamente entre
sí, en el que -R3-O- comprende un resto mono o
dietilenglicol;
Z_{1} y Z_{2} son iguales o diferentes, cada
uno puede estar ausente o se selecciona independientemente de a)
hidrógeno, sodio, litio, potasio, amonio, mono, di, tri y
tetraalquilamonio, o b) junto con el grupo fosfo forman un
fosfoéster de glicerol, colina, etanolamina, inositol, serina, mono
u oligosacárido.
En una realización preferida, el compuesto de
fórmula general I es una molécula grasa
\alpha-ramificada en la que R2 y R2 son cadenas
hidrocarbonadas que tienen, respectivamente 3 y de 12 a 16 átomos de
carbono.
Los compuestos actualmente preferidos de acuerdo
con la invención son:
Fosfato de
2-(4-hexadecilcarboxil)etilo
(3,12-MEG-PO_{4}),
Fosfato de
2-[2-(4-Hexadecilcarboxil)etoxiletil
(3,12-DEG-PO_{4}),
Fosfato de
2-(4-hexadeciloxi)etilo
(3,12-(éter)-MEG-PO_{4}),
Fosfato de
2-[2-(4-hexadeciloxi)etoxi]etilo
(3,12-(éter)-DEG-PO_{4}),
2-(4-Hexadecilcarboxil)etilfosfocolina
(3,12-MEG-PC),
2-[2-(4-Hexadecilcarboxil)etoxi]etilfosfocolina
(3,12-DEG-PC),
Fosfato de
2-{2-[10-(4-hexadeciloxi)deciloxi]etoxi}etilo
(3,12-O-C_{10}-DEG-PO_{4}),
2-{2-[10-(4-Hexadeciloxi)deciloxi]etboxi}etilfosfocolina
(3,12-O-C_{10}DEG-PC),
Fosfato de
2-(4-octadeciloxi)etilo
(3,14-MEG-PO_{4}),
Fosfato de
2-[2-(4-octadecilcarboxil)etoxi]etilo
(3,14-DEG-PO_{4}),
Fosfato de
2-(4-octadeciloxi)etilo
(3,14-(éter)-MEG-PO_{4}),
Fosfato de
2-[2-(4-octadeciloxi)etoxi]etilo
(3,14-(éter)-DEG-PO_{4}),
2-(4-Octadecilcarboxil)etilfosfocolina
(3,14-MEG-PC),
2-[2-(4-Octadecilcarboxil)etoxi]etilfosfocolina
(3,14-DEG-PG),
Fosfato de
2-(4-icosilcarboxil)etilo
(3,16-MEG-PO_{4}),
Fosfato de
2-[2-(4-icosilcarboxil)etoxi]etilo
(3,16-DEG-PO_{4}),
Fosfato de 4-icosaniloxietilo
(3,16-(éter)-MEG-PO_{4}),
Fosfato de
2-[2-(4-icosiloxi)etoxi]etilo
(3,16-(éter)-DEG-PO_{4}),
2-(4-Icosilcarboxil)etilfosfocolina
(3,16-MEG-PC),
2-[2-(4-Icosilcarboxil)etoxi]etilfosfocolina
(3,16-DEG-PC),
Fosfato de
2-[2-(2-propilicosilcarboxil)etoxi]etilo
(3,18-DEG-PO_{4}) y
2-[2-(2-Propilicosilcarboxil)etoxi]etilfosfocolina
(3,18-DEG-PC).
Actualmente, los compuestos más preferidos
son:
Fosfato de
2-[2-(4-hexadecilcarboxil)etoxi]etilo,
sal monosódica,
Fosfato de
2-[2-(4-hexadecilcarboxil)etoxi]etilo,
sal disódica,
Fosfato de
2-[2-(4-hexadeciloxi)etoxi]etilo,
2-(4-Hexadecilcarboxil)etilfosfocolina,
y
2-[2-(4-Hexadecilcarboxil)etoxi]etilfosfocolina.
Los compuestos de la invención son útiles para
aumentar la permeabilidad de barreras biológicas. Así pues, en otro
aspecto, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que
comprenden una cantidad eficaz de un compuesto de la fórmula
general I representada antes, o una de sus sales farmacéuticamente
aceptable, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Las composiciones farmacéuticas de la invención
pueden comprender además una cantidad farmacéuticamente eficaz de
un agente biológicamente activo. En una realización preferida, el
agente biológicamente activo es un agente terapéutico. El agente
terapéutico se puede seleccionar de, pero sin limitación, agentes
antitumorales, antivíricos, antimicrobianos, antifúngicos,
antiinflamatorios, neuroprotectores y péptidos y proteínas
bioactivos.
En otra realización preferida, las composiciones
farmacéuticas de la invención comprenden además un agente de
diagnóstico.
Las composiciones farmacéuticas son útiles para
facilitar la administración de moléculas biológicamente activas,
por ejemplo agentes terapéuticos y de diagnóstico, a tejidos y
órganos, en particular sitios privilegiados que están protegidos
por barreras biológicas.
En una realización particular, las composiciones
farmacéuticas son útiles para aumentar el suministro de fármacos a
través de la barrera hematorretiniana (BHR), barrera
hematoencefálica (BHE) y barrera hematotumoral (BHT). Las
composiciones farmacéuticas, de acuerdo con la invención, también
pueden ser útiles para aumentar la permeabilidad de otras barreras
biológicas, así, por ejemplo, facilitar la absorción a través de la
piel, córnea, epitelio conjuntival, nasal, bronquial, bucal,
vaginal y gastrointestinal, y a través de la barrera
hematotesticular y la interfase hematorrenal.
Las composiciones farmacéuticas se pueden
administrar por administración oral, parenteral o tópica o por
perfusión regional, enema o lavado intra-órgano. Preferiblemente,
las composiciones farmacéuticas de la invención se administran por
vía intraarterial o intratecal.
En otro aspecto más, la presente invención
proporciona el uso de un compuesto de fórmula I para la fabricación
de un medicamento para aumentar la permeabilidad de barreras
biológicas. Preferiblemente, el medicamento comprende exponer
dichas barreras a una cantidad eficaz de un compuesto de fórmula
general I, o una de sus sales farmacéuticamente aceptable,
permitiendo o aumentando así la permeabilidad de la barrera
biológica.
En otro aspecto más, la presente invención
proporciona el uso de un compuesto de fórmula I para fabricar un
medicamento para la administración de un agente biológicamente
activo en un sitio u órgano privilegiado, en el que la
administración comprende exponer dicho sitio u órgano a dicho agente
biológicamente activo, en presencia de una cantidad eficaz de un
compuesto de acuerdo con la invención, permitiendo o aumentando así
la penetración y/o acumulación del agente biológicamente activo en
el sitio u órgano privilegiado. El sitio u órgano privilegiado se
puede seleccionar, pero sin limitación, de la médula espinal,
cerebro, ojo, testículos, glándulas y tumores.
En otro aspecto más, la presente invención
proporciona el uso de un compuesto de fórmula I para fabricar un
medicamento para el tratamiento de un tumor, en el que el
tratamiento comprende administrar a un paciente que lo necesite,
una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica
que comprende como principio activo un compuesto de la fórmula
general I de acuerdo con la invención. Dicho tumor se puede
seleccionar, pero sin limitación, de carcinoma (p. ej., carcinomas
de mama, colon, rectal y vejiga), glioma (p. ej., astrocitoma),
neuroblastoma, retinoblastoma, tumor maligno intraocular, linfoma,
leucemia, sarcoma y melanoma. El tumor puede ser un tumor primario
o secundario.
La invención proporciona además el uso de un
compuesto de fórmula I para fabricar un medicamento para el
tratamiento de una enfermedad o trastorno del sistema nervioso
central, en el que el tratamiento comprende administrar a un
paciente que lo necesite, una cantidad terapéuticamente eficaz de
una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula
general I, o una de sus sales farmacéuticamente aceptable, en
combinación con un agente terapéutico. El agente terapéutico puede
estar incluido en la misma composición farmacéutica que comprende
el compuesto de fórmula general I, o en una composición
separada.
En una realización preferida, la enfermedad
tratada en el sistema nervioso central es un tumor cerebral y el
agente terapéutico es un fármaco anticancerígeno. En otra
realización preferida, la enfermedad tratada es una enfermedad o
trastorno oftalmológico, por ejemplo, edema macular cistoide (EMC),
degeneración macular relacionada con la edad (DMRE), infecciones
intraoculares, inflamaciones intraoculares y tumores malignos
intraoculares.
En otro aspecto más, la presente invención
proporciona el uso de un compuesto de fórmula I para fabricar un
medicamento para aumentar la acumulación de un agente de diagnóstico
en un órgano protegido por una barrera biológica, administrando a
un individuo dicho agente de diagnóstico en combinación con una
cantidad eficaz de un compuesto de la fórmula general I como se ha
definido antes, aumentando así la acumulación del agente de
diagnóstico en el órgano protegido por una barrera biológica. El
agente de diagnóstico puede estar incluido en la misma composición
que comprende el compuesto de fórmula general I, o en una
composición separada.
En una realización preferida, dicho órgano
protegido por una barrera biológica es el sistema nervioso
central.
La figura 1 representa una gráfica que
correlaciona diferentes longitudes de cadena de ácidos grasos
\alpha-ramificados del tipo 3,n, con la potencia
de estos compuestos en la extravasación del complejo de
albúmina-azul de Evans en cerebro de rata.
Las figuras 2A-C representan la
acumulación de azul de Evans en secciones de cerebro de ratas que
llevan gliomas bilaterales después de administración unilateral de
un compuesto como sigue:
3,12-DEG-HPO_{4}Na 10 \muM
(Fig. 2A), 3,12-Na 40 \muM (Fig. 2B) o manitol al
25% (Fig. 2C).
Las figuras 3A-C representan la
angiografía con sal sódica de fluoresceína (F-Na) de
la parte posterior de un ojo de rata registrado a los 30 segundos y
10 minutos después de la administración de F-Na solo
(Fig. 3A) o en combinación con 3,12-DEG-
HPO_{4}Na (Fig. 3B) o vehículo (Fig. 3C).
Las figuras 4A-B representan la
acumulación de F-Na en la parte anterior del ojo,
registrado 10 minutos después de la administración de
F-Na acompañada de
3,12-DEG-HPO_{4}Na (Fig. 4A) o
vehículo (Fig. 4B), siguiendo el procedimiento descrito en el
ejemplo 26.
La presente invención se refiere a compuestos y
composiciones para aumentar la permeabilidad de barreras biológicas
y para inhibir el crecimiento tumoral.
Un agente deseable para facilitar el suministro
de agentes terapéuticos o de diagnóstico en sitios restringidos (p.
ej., el cerebro, ojo, testículos, etc.) es uno que sea capaz de
permeabilizar la barrera biológica limitante. Sin embargo, la
permeabilización preferida debe llevarse a cabo de una forma
diferente sin producir un grado inaceptable de efectos secundarios.
Por ejemplo, en el caso de tratar un tumor cerebral, sería ventajoso
usar un agente que permeabilice la BHT en mucha mayor medida que la
BHE en el tejido cerebral vecino intacto. En este caso, la
permeabilización específica, permite la acumulación preferencial de
fármacos tóxicos en el tejido patológico produciendo daño mínimo o
no produciendo daño en el tejido cerebral sano que lo rodea. Se
aplican consideraciones similares para otras barreras biológicas.
Por ejemplo, es conveniente tener un agente que sea capaz de
aumentar el suministro de fármacos u otras moléculas beneficiosas a
través de la piel y las barreras intestinales de una forma
transitoria y específica.
La presente invención se refiere a nuevos
compuestos y se basa en el descubrimiento inesperado de que estos
compuestos pueden aumentar la permeabilidad de las barreras
biológicas en una forma reversible y selectiva. De acuerdo con las
enseñanzas de la presente invención, los nuevos compuestos tienen la
fórmula general I como se ha definido en lo que antecede o sus
sales farmacéuticamente aceptables.
En la memoria descriptiva, los compuestos de
fórmula general I se denominarán de forma colectiva
"DP-BFA" o de forma intercambiable por el
nombre más general derivados fosforados de moléculas lipófilas de
cadena ramificada, y abreviado "P-BFA". Las
moléculas lipófilas de cadena ramificada que no llevan un resto
fosfato se denominarán "BFA" o
"carbo-BFA".
En una realización preferida, los
P-BFA son derivados fosforados de moléculas
lipófilas \alpha-ramificadas de la estructura
general R1(R2)-CH-. En otras realizaciones de
acuerdo con la presente invención, los P-BFA son
derivados fosforados de moléculas lipófilas ramificadas de
estructura general
R1(R2)-CH-[CH_{2}]_{m} en el que
m es de 1 a 12, denominándose así moléculas lipófilas
\omega-ramificadas, por ejemplo, en la posición
\beta (m=1), \gamma (m=2) etc.
Los DP-BFA específicos en lo
sucesivo se denominarán con sus R1 y R2 particulares que
representan, respectivamente, el número de átomos de carbono en la
cadena lateral y principal de la molécula lipófila de cadena
ramificada.
Los compuestos de la fórmula general I, en la
que -R3-O- comprende un resto monoetilenglicol o
dietilenglicol se denominarán
R1,R2-MEG-PO_{4} y
R1,R2-DEG-PO_{4}, respectivamente.
En algunos casos, el enlace que une el resto de cadena ramificada y
el grupo químico adyacente se indica específicamente como, por
ejemplo, en
3,12-O-C_{10}-DEG-PO_{4},
3,12-(éter)-DEG-PO_{4} etc. Los
compuestos de fórmula general I en la que Z_{1} es colina se
denominarán R1,
R2-PC.
R2-PC.
De acuerdo con la enseñanza de la presente
invención, variando los distintos componentes en la estructura de
los compuestos de fórmula general I, se puede lograr un ajuste fino
en la estabilidad de las moléculas y su efecto de permeabilización
en barreras biológicas. Por ejemplo, la variación del número de
átomos de carbono en los grupos alquilo R1 y R2, y el nivel de
saturación afectan a la hidrofobicidad general de la molécula,
permitiendo así la optimización de su capacidad para cruzar
membranas biológicas específicas.
Los compuestos actualmente preferidos de acuerdo
con la invención, son moléculas DP-BFA en las que la
longitud de la cadena de carbonos en R1 es de 2 a 14, y el número
total de átomos de carbono en R1 y R3 juntos es de 6 a 26. Los
compuestos actualmente más preferidos son los compuestos de cadena
\alpha-ramificada en los que R1 tiene 3 átomos de
carbono y R2 tiene de 12 a 16 átomos de carbono. Los compuestos
preferidos de la fórmula general I comprenden una cadena alifática
que tiene hasta 20 átomos de carbono de longitud contado desde el
grupo fosfato hasta el punto de ramificación de la molécula lipófila
ramificada. Este número de átomos de carbono calculado en el resto
R3 de la fórmula general I como se ha definido antes, es el más
adecuado para la alteración eficaz de la membrana por la molécula
de DP-BFA y por lo tanto para provocar el efecto de
permeabilización deseable. Debe indicarse que la cadena alifática
mencionada antes, puede ser una cadena hidrocarbonada continua, o
puede estar interrumpida por uno o más heteroátomos seleccionados
del grupo de átomos de oxígeno, azufre, nitrógeno y fósforo,
incluido en la definición de R3.
En una realización preferida de acuerdo con la
invención, el R3 de la molécula de fórmula general I incluye un
grupo carbonilo que une el resto de cadena ramificada y al menos un
reto de glicol por un enlace éster. En otra realización preferida,
R3 incluye un enlace covalente que une el resto de cadena ramificada
y al menos un resto glicol por un enlace éter. En condiciones
fisiológicas, en general los enlaces éter son menos susceptibles de
escisión enzimática, y por lo tanto se espera que sean más estables
que otros enlaces éster.
Otro factor que puede afectar a la capacidad de
los compuestos DP-BFA para permeabilizar diferentes
barreras biológicas es la polaridad de diferentes grupos químicos
en la molécula. Esto también puede contribuir al ajuste fino del
diferente efecto de permeabilización.
Los compuestos preferidos de la invención están
en forma de sales, siendo compuestos mono o disales de la fórmula
general I. Las sales adecuadas pueden incluir cualquier sal
farmacéuticamente aceptable que comprende un contraión monovalente
o divalente que se puede seleccionar de, pero sin limitar, Na^{+},
Li^{+}, K^{+}, NH_{4}^{+}, Ca^{++}, Mg^{++}, Mn^{++},
mono, di, tri y tetra-alquilamonio. Los compuestos
más preferidos comprenden una sal monovalente. Son particularmente
preferidas las moléculas DP-BFA en la forma de sal
de sodio, siendo sales de monosodio o disodio.
Los compuestos de la invención se pueden
preparar por métodos sintéticos químicos conocidos en la técnica.
Algunos de estos métodos se ilustran en lo sucesivo en los ejemplos.
También se pueden aplicar procedimientos alternativos conocidos
para los expertos en la técnica.
Se encontró que los compuestos de la invención
eran útiles para alterar las estrechas uniones celulares in
vitro y aumentar la permeabilización de las barreras in
vivo. Además, la presente invención se basa en el
descubrimiento inesperado, de que determinados derivados de fósforo
de moléculas lipófilas de cadena ramificada, tienen efectos
diferenciales en la apertura de las barreras BHE y BHT. Por
consiguiente, los diferentes compuestos P-BFA de la
invención pueden ser útiles para ejercer la permeabilización de
barreras biológicas produciendo una toxicidad y efectos secundarios
mínimos.
Algunos compuestos de DP-BFA son
selectivos en términos de que son capaces de permeabilizar de forma
diferencial las barreras biológicas para moléculas de diferentes
tamaños. Esta característica se puede atribuir a niveles de
seguridad más altos de los agentes fosfo-BFA.
Algunos DP-BFA difieren en la duración de su efecto,
lo cual puede demostrar ser otro factor beneficioso en determinadas
circunstancias terapéuticas en las que es deseable la
permeabilización selectiva transitoria de una barrera limitante.
Los compuestos de la invención y las
composiciones farmacéuticas que los comprenden pueden permitir o
facilitar el suministro de agentes biológicamente activos a través
de barreras biológicas.
La expresión "agentes biológicamente
activos" se pretende que abarque todos los compuestos naturales y
sintéticos capaces de provocar una respuesta biológica, que tienen
un efecto en los sistemas biológicos o que sirven como herramienta
indicativa. Los agentes biológicamente activos pueden ser agentes
terapéuticos o de diagnóstico.
Los agentes terapéuticos pueden incluir, pero
sin limitar, agentes antineoplásicos, antiproliferativos,
antiinflamatorios, neurológicos, antibacterianos, antimicóticos y
antivíricos. Estos compuestos en combinación con los compuestos de
la invención son particularmente útiles en el tratamiento de
afecciones patológicas, enfermedades y trastornos en sitios
restringidos. Por ejemplo, en el tratamiento del sistema nervioso
central y lesiones que incluyen tumores, infecciones, abscesos y
trastornos degenerativos.
Los agentes de diagnóstico pueden incluir, pero
sin limitar, agentes de marcaje, agentes de contraste y colorantes.
Los ejemplos de agentes de diagnóstico incluyen sustancias con
marcadores radiactivos (p. ej., agentes basados en
tecnecio-99m y fluoruro-18) y
agentes de contraste tales como compuestos basados en gadolinio. Los
compuestos de la invención pueden ser útiles, por ejemplo, en
métodos para el diagnóstico y caracterización de lesiones
cerebrales. En este caso, un compuesto de la invención usado para
aumentar la permeabilidad de la BHE, se puede introducir
conjuntamente (en la misma composición o separada) con un agente
químico que está marcado de forma que se puede seguir.
El agente químico que se va a seguir puede ser,
por ejemplo, un indicador general para las células o estructuras
cerebrales, o uno que se une o acumula específica y exclusivamente
en determinadas regiones del cerebro o lesiones cerebrales.
Después, se puede analizar el cerebro para determinar la presencia
del agente de marcaje. El análisis se puede realizar usando medios
de barrido y formación de imágenes conocidos en la materia (p. ej.,
técnicas de imágenes por resonancia magnética (MRI), tomografía de
emisión de positrones (PET) y tomografía computerizada
(CT)).
(CT)).
En otras realizaciones de la invención, los
compuestos DP-BFA pueden ser útiles para potenciar
la absorción de fármacos en los intestinos o a través de la piel.
Las barreras biológicas en los intestinos y la piel evitan la
difusión pasiva de una serie de sustancias a través del epitelio
gastrointestinal o la piel, previniendo así la absorción eficaz de
determinados productos químicos, nutrientes y fármacos útiles. Este
obstáculo se puede superar aplicando los productos químicos,
nutrientes y fármacos útiles en combinación con un compuesto
DP-BFA.
Será fácilmente evidente para los expertos en la
técnica que son adecuados una amplia variedad de compuestos
biológicamente activos para usar en combinación con las moléculas
lipófilas ramificadas de fórmula general I, y por lo tanto son
útiles en composiciones farmacéuticas o tratamiento o
diagnóstico.
Para el compuesto P-BFA de
acuerdo con la invención que se va a administrar en combinación con
el agente biológicamente activo deseable, debe aclararse que el
agente biológicamente activo deseable puede estar incluido en la
misma composición farmacéutica del compuesto de fórmula general I,
o se puede administrar en una composición separada.
Preferiblemente, tanto los agentes activos, es decir el compuesto de
fórmula general I, como el o los agentes biológicamente activos
deseables, se administran simultáneamente o en un periodo de tiempo
corto entre uno y otro. El o los agentes biológicamente activos se
pueden administrar antes o después de la administración del
compuesto de P-BFA, con la condición de que sea en
una ventana de tiempo de modo que el efecto del
p-BFA en la barrera biológica sea suficiente para
facilitar el paso de los agente pertinentes al sitio
restringido.
También es posible que el agente biológicamente
deseable no se administre entorno al mismo tiempo de la
administración de P-BFA, sino que ya esté presente
en la sangre (siendo generado de forma natural en el cuerpo o
producido como un fármaco de liberación lenta). Algunos ejemplos
incluyen péptidos y proteínas bioactivos tales como
neurotransmisores, factores de crecimiento, hormonas, antibióticos
etc. En este caso el requisito es que ocurre el efecto de
permeabilización de la barrera diana mientras esté presente
suficiente cantidad del agente biológicamente activo deseable para
ejercer su efecto biológico.
La actividad mejorada de los compuestos de la
invención en la permeabilización de barreras biológicas da como
resultado una mayor biodisponibilidad de los fármacos administrados,
extendiendo así la utilidad terapéutica de estos fármacos a
afecciones que no responden a dosis de los fármacos más bajas. Esto
es especialmente relevante en el tratamiento de enfermedades y
trastornos en sitios restringidos, p. ej., el cerebro y el ojo.
Además, los compuestos de la invención son
ventajosos en cuanto que permiten la disminución de la dosificación
útil de fármacos y por consiguiente la reducción de efectos
secundarios sistémicos indeseables. Además, puesto que las
moléculas de la invención permiten la permeabilización selectiva de
barreras, pueden aumentar de forma preferencial la absorción de
fármaco en un sitio específico (p. ej., tumor) y no en las células y
tejidos vecinos.
Al examinar el efecto de permeabilización de los
P-BFA in vivo en ratas portadoras de tumores,
se encontró sorprendentemente que algunos de los compuestos
ensayados presentaban efectos citotóxicos notables en el tumor,
demostrado por su capacidad para inhibir significativamente el
crecimiento del tumor tratado. Por lo tanto, se ha establecido que
determinados compuestos de la invención pueden ser útiles como
agentes anticancerígenos. Además, algunos de los compuestos de la
invención han demostrado una actividad citotóxica diferencial cuando
se ensaya su efecto en diferentes células normales y tumorales
in vitro.
De acuerdo con los principios de la presente
invención, las diferentes moléculas de DP-BFA se
pueden diseñar específicamente para que sean adecuadas para sitios
diana específicos e indicaciones específicas. Por ejemplo, se ha
encontrado que las moléculas de la invención actúan de una forma
diferencial en la apertura de las barreras BHE y BHT. En este caso
la permeabilización de la BHT por determinados
DP-BFA es mucho mayor comparado con el efecto en la
BHE. Otras características ventajosas del efecto de algunas
moléculas de DP-BFA, es el mantenimiento de algunos
niveles de discriminación de los compuestos permitidos para cruzar.
Por lo tanto, los DP-BFA afectan a la
permeabilización de las barreras de una forma más selectiva
comparado con los carbo-BFA o agentes
hiperosmóticos, tales como el manitol. Como resultado, se espera
que los compuestos P-BFA produzcan menos efectos
secundarios tóxicos en comparación con otros agentes de
permeabilización conocidos en la técnica. Además, puesto que se
encontró que el efecto de permeabilización era reversible, los
compuestos de la invención también pueden ser útiles para la
administración crónica de fármacos.
Como se menciona en la memoria descriptiva y
reivindicaciones, una "cantidad eficaz" de
P-BFA se refiere a la cantidad de un compuesto de
la invención que ejerce el efecto beneficioso deseado de acuerdo con
la invención. De acuerdo con un aspecto de la invención, es la
cantidad de P-BFA que aumenta significativamente la
permeabilidad de una barrera relevante a una molécula de interés.
En particular, es la cantidad de P-BFA que aumenta
la permeabilidad de la barrera pertinente para permitir que crucen
suficientes cantidades de una molécula de interés a través de la
barrera biológica para ejercer así su efecto terapéutico o
profiláctico o permitir procedimientos de diagnóstico. De acuerdo
con otro aspecto de la invención, es la cantidad de
P-BFA que es terapéuticamente eficaz como agente
anticancerígeno. En concreto, es la cantidad de
P-BFA que inhibe el crecimiento celular
incontrolado.
La cantidad eficaz se determinará
individualmente y se basará, al menos en parte, en consideraciones
del tamaño del individuo, la enfermedad específica, la gravedad de
los síntomas que se van a tratar, etc. Por lo tanto, el experto en
la técnica podrá valorar fácilmente la cantidad eficaz usando dichos
factores y usando solo la experimentación rutinaria.
El intervalo de la dosis y el régimen usado
dependerán de la vía de administración, la edad, sexo, salud y peso
del receptor y de la potencia del DP-BFA particular
y el fármaco o agente útil pertinente administrado. El experto en
la técnica podrá ajustar las composiciones de DP-BFA
y la dosificación con el fin de obtener la duración y el grado de
acción deseados.
Las composiciones farmacéuticas pueden estar en
forma de dosificación líquida, aerosol o sólida, y se pueden
formular en cualquier formulación adecuada incluyendo, pero sin
limitar, disoluciones, suspensiones, micelas, emulsiones,
microemulsiones, aerosoles, pomadas, geles, supositorios, cápsulas,
comprimidos y similares, según sea necesario para la vía de
administración adecuada.
La invención abarca cualquier vía de
administración adecuada incluyendo, pero sin limitar, las vías oral,
intravenosa, intramuscular, subcutánea, inhalación, intranasal,
tópica, rectal u otras vías conocidas. En realizaciones preferidas
para el efecto de permeabilización en el SNC, la composición
farmacéutica de la invención se administra por vía intraarterial o
intratecal. Para usar como una medicación anticancerígena, la
composición farmacéutica pertinente de la invención se administra
preferiblemente por vía oral o intravenosa o se aplica por vía
tópica o por perfusión regional, enema o lavado intraórgano.
La invención ahora se ilustrará mediante los
siguientes ejemplos no limitantes.
Para mayor claridad, se ilustran a continuación
procedimientos para la síntesis de moléculas de
P-BFA particulares y sus sales. Sin embargo, debe
entenderse que también se pueden aplicar procedimientos similares
para la síntesis de otras moléculas de P-BFa de la
invención incluyendo, pero sin limitar, moléculas de cadena
ramificada saturadas e insaturadas y compuestos en los que R1 y/o
R2 son cadenas alifáticas que comprenden un grupo o grupos alquilo
cíclicos. También se pueden obtener diferentes sales
farmacéuticamente aceptables de las moléculas de
P-BFA incluyendo, pero sin limitar, sales de sodio,
potasio, amonio y alquilamonio y sales con contraiones
divalentes.
Se prepararon fosfatos de fórmula general
RO-P(O)(OH)_{2}. R representa un
resto alquilo de cadena ramificada de estructura
R_{1}(R_{2})-CH en la que R_{1} indica
el número de carbonos en la cadena de alquilo lateral y R_{2}
indica el número de carbonos en la cadena de alquilo principal.
La síntesis de las moléculas de
RO-P(O)(OH)_{2} es un procedimiento
en 3 etapas. En la primera etapa, se preparó el correspondiente
alcohol (R-OH) a partir de aldehído y bromuro de
alquilo usando la reacción de Grignard (Vogel, "Textbook of
practical organic chemistry", Wiley, New York, pg. 531,
(1996)).
\global\parskip0.900000\baselineskip
En la segunda etapa se preparó el éster fosfato
de difenilo a partir del alcohol y fosforocloridato de difenilo:
- \quad
- ROH + ClP(O)(OC_{6}H_{5})_{2} + C_{5}H_{5}N \rightarrow RO-P(O)(OC_{6}H_{5})_{2} + C_{5}H_{5}N\cdotHCl
\vskip1.000000\baselineskip
En la tercera etapa se obtuvo el
dihidrogenofosfato de alcanilo por hidrogenación del éster de
difenilo.
- \quad
- RO-P(O)(OC_{6}H_{5})_{2} + 2H_{2} \rightarrow RO-P(O)(OH)_{2} + 2C_{6}H_{6}
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió lentamente fosforocloridato de
difenilo (4,0 g, 0,015 mole) con agitación a una disolución de
hexadecan-4-ol (2,4 g, 0,01 mol) en
piridina seca (5 ml) a temperatura ambiente. El matraz se tapó y se
dejó durante 48 h, después el contenido se vertió en ácido
clorhídrico 1 N enfriado con hielo (100 ml). El aceite pesado que
se separó se extrajo con éter dietílico. La capa de éter se lavó con
ácido clorhídrico 1 N (3 veces), hidrogenocarbonato de sodio al 5%
(5 veces), y agua (5 veces). Después de secado (MgSO_{4}), se
separó el éter, y el residuo se purificó por cromatografía en
columna (éter de petróleo (p. e. 30-60ºC): éter
dietílico, 10:1). Después de evaporar el disolvente, se obtuvieron
3,5 g de líquido. Rendimiento 74%.
\vskip1.000000\baselineskip
Una suspensión de óxido de platino (catalizador
de Admas) (0,32 g) en ácido acético glacial (20 ml) se agitó en
atmósfera de hidrógeno hasta que cesó la absorción. Después se lavó
bien el catalizador de Adams con ácido clorhídrico 2 N, agua y
finalmente ácido acético glacial, por decantación. La disolución de
fosfato de difenilo y 4-hexadecanilo (3,2 g) en
ácido acético glacial (40 ml) se añadió al catalizador y la
disolución se agitó en hidrógeno hasta que cesó la absorción. El
catalizador se filtró y se lavó con cloroformo. Los disolventes
separaron del filtrado a vacío. El residuo se cristalizó en éter de
petróleo (p. e. 30-60ºC) y se secó a 65ºC. Se
obtuvieron 2,01 g del producto final. Rendimiento 92%.
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvió fosfato de
4-hexadecanilo (1 g, 0,0031 mol) en etanol (100 ml).
Se añadió NaOH (0,25 g, 0,0062 mol) y la mezcla se agitó durante 1
h y después se evaporó. Se añadió etanol (2 x 100 ml) y se evaporó.
Se añadió éter dietílico (100 ml) y se evaporó. El residuo se
cristalizó en acetona (30 ml) y se secó 65ºC (15 mm de Hg). Se
obtuvieron 0,9 g del producto final. Rendimiento 79%.
RMN ^{1}H (CD_{3}OD): \delta 0,89 (m, 6H),
1,27 (s, 22H), 1,58 (m, 4H), 4,22 (m, 1H). EM (FAB): m/z 367,06 (M
+ H)^{+}.
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvió fosfato de
4-hexadecanilo (3,13 g, 0,0097 mol) en etanol (150
ml). Se añadió NaOH (0,37 g, 0,0092 mol) y la mezcla se agitó
durante 48 h y después se evaporó. Se añadió etanol (2 x 150 ml) y
se evaporó. Se añadió éter dietílico (2 x 100 ml) y se evaporó. El
sólido obtenido se trituró con acetona (100 ml) y se secó a 1 mm de
Hg durante la noche. Se obtuvieron 2,98 g del producto final.
Rendimiento 87%.
RMN ^{1}H (CD_{3}OD): \delta 0,87 (m, 6H),
1,25 (s, 22H), 1,51 (m, 4H), 4,12 (m, 1H). EM (FAB): m/z 345,11 (M
+ H)^{+}.
\vskip1.000000\baselineskip
RMN ^{1}H (CD_{3}OD): \delta 0,89 (m, 6H),
1,27 (s, 26H), 1,58 (m, 4H), 4,17 (m, 1H). EM (FAB): m/z 395,20 (M
+ H)^{+}.
\vskip1.000000\baselineskip
RMN ^{1}H (CD_{3}OD): \delta 0,90 (m, 6H),
1,28 (s, 26H), 1,56 (m, 4H), 4,14 (m, 1H). EM (FAB): m/z 373,29 (M
+ H)^{+}.
\vskip1.000000\baselineskip
RMN ^{1}H (CD_{3}OD): \delta 0,90 (m, 6H),
1,30 (s, 20H), 1,60 (m, 4H), 4,12 (m, 1H). EM (FAB): m/z 352,93 (M
+ H)^{+}.
\vskip1.000000\baselineskip
RMN ^{1}H (CD_{3}OD): \delta 0,90 (m, 6H),
1,30 (s, 20H), 1,60 (m, 4H), 4,12 (m, 1H). EM (FAB): m/z 353,05 (M
+ Na)^{+}.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Este compuesto se preparó por los mismos
procedimientos descritos antes en el Ejemplo 1 usando el alcohol:
C_{3}H_{7}-C(C_{12}H_{25})H-C(O)-O-CH_{2}-CH_{2}-O-.
Este alcohol se obtuvo a partir del cloruro de anhídrido del ácido
2-propil-pentanoico y etilenglicol
(Vogel's, "Textbook of practical organic chemistry", Wiley,
New York, pág. 698, (1996)).
\vskip1.000000\baselineskip
RMN ^{1}H (CDCl_{3}): \delta 0,87 (m, 6H),
1,24 (s, 22H), 1,54 (m, 4H), 2,33 (m, 1H), 3,87 (m, 2H), 4,26 (m,
2H). EM (FAB): m/z 439,19 (M + H)^{+}.
\vskip1.000000\baselineskip
RMN ^{1}H (CDCl_{3}): \delta 0,87 (t, 6H),
1,24 (s, 20H), 1,42 (m,2H), 1,56 (m, 2H), 2,34 (m, 1H), 4,02 (m,
2H), 4,28 (m, 2H). EM (FAB): m/z 417,19 (M + H)^{+}.
\vskip1.000000\baselineskip
Este compuesto se preparó por los mismos
procedimientos descritos antes en el Ejemplo 1 usando el alcohol:
C_{3}H_{7}-C(C_{12}H_{25})H-C(O)-O-CH_{2}CH_{2}O-CH_{2}-CH_{2}-O-.
Este alcohol se obtuvo a partir del cloruro de anhídrido del ácido
2-propil-pentanoico y
dietilenglicol (Vogel's, "Textbook of practical organic
chemistry", Wiley, New York, pág. 698, (1996)).
\vskip1.000000\baselineskip
RMN ^{1}H (CD_{3}OD): \delta 0,90 (m, 6H),
1,30 (s, 20H), 1,44 (m, 2H), 1,59 (m, 2H) 2,39 (m, 1H), 3,72 (m,
4H), 4,09 (m, 2H), 4,24 (m, 2H). EM (FAB): m/z 483,03 (M +
H)^{+}.
\vskip1.000000\baselineskip
RMN ^{1}H (CD_{3}OD): \delta 0,90 (m, 6H),
1,30 (s, 20H), 1,44 (m, 2H), 1,59 (m, 2H), 2,39 (m, 1H), 3,72 (m,
4H), 4,09 (m, 2H), 4,24 (m, 2H). EM (FAB): m/z 461,31 (M +
H)^{+}.
Se prepararon compuestos adicionales de una
forma análoga. Por ejemplo, el compuesto fosfato de
2-[2'-(2''-Propilicosanoiloxi)-etoxi]etilo
se preparó usando el alcohol:
C_{3}H_{7}-C(C_{18}H_{37})H-C(O)-O-CH_{2}CH_{2}-O-CH_{2}CH_{2}-O-.
Este alcohol se obtuvo a partir del cloruro de anhídrido del ácido
2-propilicosanoico y dietilenglicol.
\vskip1.000000\baselineskip
RMN ^{1}H (CD_{3}OD): \delta 0,90 (m, 6H),
1,30 (s, 34H), 1,44 (m, 2H), 1,59 (m, 2H) 2,39 (m, 1H), 3,72 (m,
4H), 4,09 (m, 2H), 4,24 (m, 2H). EM (FAB): m/z 544,31 (M +
H)^{+}.
\vskip1.000000\baselineskip
Este compuesto se preparó por los mismos
procedimientos descritos antes en el Ejemplo 1 usando el alcohol:
C_{3}H_{7}-C(C_{12}H_{25})H-O-(CH_{2})_{10}-O-CH_{2}CH_{2}-O-CH_{2}-CH_{2}-OH-.
Este alcohol se obtuvo por un procedimiento en 2 etapas: primero,
haciendo reaccionar el tosilato de 4-hexadecanol
(Vogel's, "Textbook of practical organic chemistry", Wiley,
New York, pág. 698, (1996)) con 1,10-decanodiol
monosódico para generar el
10-(hexadecil-4-oxi)decanol.
En una segunda etapa el alcohol
2'-[10''-(hexadecil-4-oxi)decil-etiloxietanol
se preparó haciendo reaccionar el tosilato de
10-(hexadecil-4-oxi)decanol
(generado como en la etapa 1) con
2-(2-hidroxietiloxi)etilato de sodio.
RMN ^{1}H (CD_{3}OD): \delta 0,90 (m, 6H),
1,30 (s, 38H), 1,44 (m, 2H), 1,59 (m, 2H), 3,15 (m, 1H), 3,37 (m,
4H), 3,45-3,62 (6H), 3,95 (m, 2H). EM (FAB): m/z
565,45 (M + H)^{+}.
\vskip1.000000\baselineskip
Este compuesto se preparó por los mismos
procedimientos descritos antes en el Ejemplo 1 usando el alcohol:
C_{3}H_{7}-C(C_{12}H_{25})H-O-CH_{2}-CH_{2}-O-CH_{2}-CH_{2}-O-.
Este alcohol se obtuvo a partir del
2-(2-hidroxietiloxi)etilato de sodio y
tosilato de 4-hexadecanol. (Vogel's, "Textbook of
practical organic chemistry", Wiley, New York, pág. 698,
(1996)).
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvieron 4-hexadecanol
(12,29 g 0,051 mol) y cloruro de p-toluenosulfonilo
(12 g 0,063 mol) en piridina (100 ml) y se agitaron durante la
noche a temperatura ambiente. Se añadió diclorometano (400 ml).
Después, la disolución de diclorometano se lavó bien con agua,
H_{2}SO_{4} (3%), agua, NaHCO_{3} (3%) y agua, y se secó con
sulfato magnésico anhidro (10 g). Después de evaporar el disolvente,
se obtuvieron 20 g de cloruro de
4-hexadecanosulfonilo bruto.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió sodio (3,5 g 0,15 mol) en trozos
pequeños a dietilenglicol (140 ml, 1,5 mol) a 60ºC. A la disolución
obtenida se añadió tosilato de 4-hexadecanol (bruto
20 g) en THF (300 ml) a la misma temperatura. La disolución se
agitó a reflujo durante 6 h. Se añadió agua (100 ml) a la mezcla a
temperatura ambiente. La mezcla se extrajo con acetato de etilo
(300 ml). Después de evaporar el disolvente, el residuo se purificó
por cromatografía en columna (éter de petróleo (p.e.
30-60ºC): éter dietílico, 1:1). Se obtuvieron 4 g de
cloruro de 2-(4-hexadecanoil)etoxietilo.
Rendimiento 24% partiendo del 4-hexadecanol.
\vskip1.000000\baselineskip
RMN ^{1}H (CD_{3}OD): \delta 0,9 (m, 6H),
1,28 (s, 22H), 1,43 (m, 4H), 3,30 (m, 1H), 3,60 (m, 4H), 3,69 (m,
2H), 4,07 (m, 2H). EM (FAB): m/z 455,45(M +
H)^{+}.
\vskip1.000000\baselineskip
La fosfocolina de fórmula
C_{3}H_{7}-C(C_{12}H_{25})H-C(O)-O-CH_{2}CH_{2}O-CH_{2}-CH_{2}-PO^{-}(O)-O-CH_{2}CH_{2}N^{+}(CH_{3})_{3}
se preparó como sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
A una disolución enfriada (0ºC) de
2-(2'-propiltetradecanoiloxi)etoxietanol
(15,8 g, 0,044 mol) y trietilamina (10 ml, 0,075 mol) en éter
dietílico seco (250 ml) se añadió
2-cloro-2-oxo-1,3,2-dioxafosfolano
(7 ml, 0,075 mol) en 200 ml de éter dietílico seco. La mezcla se
agitó a temperatura ambiente durante 2 h. El
(C_{2}H_{5})_{3}N.HCl cristalino que precipitó se
filtró, y el disolvente se separó a vacío. El residuo se disolvió en
500 ml de disolución de trimetilamina (0,27 M) en acetonitrilo
anhidro y se transfirió a una botella de presión. La botella de
presión se mantuvo durante 48 h en un baño de aceite a
60-65ºC. Después la botella se enfrió y se abrió.
El disolvente se separó y el residuo se purificó por cromatografía
en columna (CHCl_{3}: CH_{3}OH: H_{2}O, 1:9:1). El aceite
obtenido tras evaporación del disolvente se liofilizó durante 72 h a
65ºC. Se obtuvieron 17,4 g de cera ligeramente amarilla.
Rendimiento 75%.
RMN ^{1}H (CD_{3}OD): \delta 0,9 (t, 6H),
1,29 (s, 22H), 1,46 (m, 2H), 1,59 (m, 2H), 2,38 (m, 1H), 3,25 (S,
9H), 3,69 (m, 6H), 3,99 (m, 2H), 4,29 (m, 4H). EM (FAB): m/z 524,6
(M + H)^{+}.
Los siguientes compuestos se sintetizaron por un
procedimiento análogo al procedimiento descrito antes.
\vskip1.000000\baselineskip
RMN ^{1}H (CD_{3}OD): \delta 0,9 (t, 6H),
1,29 (s, 34H), 1,46 (m, 2H), 1,59 (m, 2H), 2,38 (m, 1H), 3,25 (s,
9H), 3,69 (m, 6H), 3,99 (m, 2H), 4,29 (m, 4H). EM (FAB): m/z 608,6
(M + H)^{+}.
\vskip1.000000\baselineskip
RMN ^{1}H (CD_{3}OD): \delta 0,9 (t, 6H),
1,29 (s, 34H), 1,46 (m, 2H), 1,59 (m, 2H), 2,38 (m, 1H), 3,25 (S,
9H), 3,69 (m, 6H), 3,99 (m, 2H), 4,29 (m, 4H). EM (FAB): m/z 608,6
(M + H)^{+}.
\vskip1.000000\baselineskip
La fosfocolina de fórmula
C_{3}H_{7}-C(C_{12}H_{25})H-C(O)-CH_{2}-CH_{2}-O-PO^{-}(O)-O-CH_{2}CH_{2}N^{+}(CH_{3})_{3}
se preparó por el mismo procedimiento descrito antes en el ejemplo
6, excepto que se usó el correspondiente alcohol, es decir
2-(2'-propiltetradecanoiloxi)etanol, en lugar
de
2-(2'-propiltetradecanoiloxi)etoxietanol.
\vskip1.000000\baselineskip
RMN ^{1}H (CD_{3}OD): \delta 0,9 (t, 6H),
1,29 (s, 22H), 1,46 (m, 2H), 1,59 (m, 2H), 2,39 (m, 1H), 3,24 (S,
9H), 3,66 (m, 2H), 4,07 (m, 2H), 4,28 (m, 4H). EM (FAB): m/z 480,7
(M + H)^{+}.
\vskip1.000000\baselineskip
Los compuestos de fosfocolina de fórmula
RO-PO-(O)-O-CH_{2}CH_{2}N^{+}CH_{3})_{3}
se prepararon por el mismo procedimiento descrito antes en el
Ejemplo 6, excepto que se usó R-OH como el alcohol
en la etapa inicial. R representa alquilos de cadena ramificada de
tipo R_{1}C(R_{2})H-.
\vskip1.000000\baselineskip
RMN ^{1}H (CD_{3}OD): \delta 0,91 (t, 6H),
1,28 (s, 22H), 1,57 (m, 4H), 3,21 (s, 9H), 3,62 (m, 2H), 4,25 (m,
3H). EM (FAB): m/z 408,68 (M+ H)^{+}.
\vskip1.000000\baselineskip
RMN ^{1}H (CD_{3}OD): \delta 0,9 (t, 6H),
1,28 (s, 26H), 1,57 (m, 4), 3,21 (s, 9H), 3,61 (m, 2H), 4,23 (m,
3H). EM (FAB): m/z 436,91 (M + H).
\vskip1.000000\baselineskip
RMN ^{1}H (CD_{3}OD): \delta 0,92 (t, 6H),
1,32 (s, 20H), 1,59 (m, 4H), 3,23 (s, 9H), 3,63 (m, 2H), 4,26 (m,
3H). EM (FAB): m/z 394,35 (M + H)^{+}.
\vskip1.000000\baselineskip
Los compuestos de P-BFA
\omega-ramificados se preparan por los mismos
procedimientos descritos antes en los Ejemplos 1 y 6 usando los
\omega-alcoholes pertinentes.
La preparación de BFA
\omega-ramificado es una síntesis en 6 etapas. Los
reactivos iniciales son
1-bromo-\omega-alcohol
y
n-alquil-m-alquilcerona.
La primera etapa es la protección del grupo
hidroxi del
1-bromo-\omega-alcohol
con dihidropirano (DHP) seguido del procedimiento descrito por
Kocienski ("Protecting Group"; Georg. Thieme Verlag Stuttgart.
N-Y. pg. 83-84 (1994)).
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
THP indica un éter de tetrahidropiranilo.
La segunda y tercera etapas son síntesis de
Grignard de alcohol terciario (Vogel's, "Textbook of practical
organic chemistry", Wiley, New York, págs. 475, 538, (1996)) como
siguen:
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Etapa
2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
R, R' - indican grupos alquilo.
La cuarta etapa es la reducción del grupo
hidroxi terciario del compuesto (IV) por reacción de hidrogenación
iónica, siguiendo el procedimiento descrito por Carey y Tremper
(JACS, v. 91, p. 2967, (1969))
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La quina etapa es la escisión del grupo
protector para obtener el alcohol
\omega-ramificado (V) ("Protecting Group";
Georg. Thieme Verlag Stuttgart. N-Y. pg.
83-84 (1994)).
La etapa final, etapa 6, es la oxidación del
alcohol \omega-ramificado al correspondiente BFA
\omega-ramificado. Esto se llevó a cabo siguiendo
el procedimiento descrito por Manger y Lee (Tetraehedron
letters, v. 22, N. 18, p. 1655, (1981)).
\vskip1.000000\baselineskip
Etapa
6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los valores de lipofilia de diferentes derivados
de ácidos grasos ramificados se calcularon comparando la
solubilidad de estos compuestos en disoluciones orgánicas frente a
acuosas. Se usaron octanol y disolución salina fisiológica,
respectivamente, como disoluciones orgánica y acuosa. El valor del
coeficiente de partición (P_{c}), es decir la distribución
octanol/disolución salina, se midió por la técnica del matraz de
agitación. Los resultados, es decir la solubilidad en mg/ml en
octanol y agua y el LogP_{c} calculado se muestran en la Tabla
1.
En este estudio se evaluó una correlación entre
las propiedades fisicoquímicas de las moléculas de cadena
ramificada y sus efectos biológicos. El estudio se dirigía a
descubrir si había una correlación entre la longitud de cadena de
las moléculas de cadena ramificada y sus potencias en la
extravasación de azul de Evans (EB) en el cerebro de rata (véase el
Ejemplo 18 para el procedimiento usado en la medición de los valores
de CE_{50}). Se usaron diferentes ácidos grasos ramificados del
tipo 3,n, en el que una cadena ramificada es de 3 átomos de carbono
y la segunda cadena hidrocarbonada, n es de 7 a 16 átomos de
carbono. Los resultados se representan gráficamente en la figura
1.
Como puede verse en la figura 1, se encontró que
los BFA 3,12, 3,14 y 3,16 eran activos en la permeabilización de
las BHE. En las condiciones experimentales usadas, el compuesto más
potente entre las moléculas ensayadas es el
BFA-3,12.
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Se seleccionaron diferentes moléculas de
DP-BFA en la línea celular AA8 de ovario de hámster
chino (CHO) con el fin de establecer su toxicidad. Los valores de
CL_{50}, es decir las concentraciones que causan la muerte en el
50% de la población de células, se calcularon a partir de las curvas
de dosis-respuesta. Los valores de CL_{50} de los
fosfo-BFA se compararon con los de los
correspondientes ácidos grasos ramificados (=
carbo-BFA).
\vskip1.000000\baselineskip
Se usó la liberación de lactato deshidrogenasa
(LDH) como un ensayo de la integridad de la membrana de las células
y, por lo tanto, para calcular la toxicidad. Las células
(2x10^{5}/ml) se sembraron (150 \mul/pocillo) en placas de 96
pocillos en medio RPMI-1640 que contenía FCS al 10%.
Después de dos días, se añadieron los compuestos
DP-BFA de ensayo o el compuesto de control, ácido
mirístico, a las placas en concentraciones decrecientes en el
intervalo de 500 a 1 \mug/ml. Las células se recogieron después de
1 hora. 45 minutos antes de recogerlas, se añadieron 16,5 \mul de
disolución de lisis a los 6 primeros pocillos con el fin de
demostrar la lisis completa y la liberación máxima de lactato
deshidrogenasa que indica la muerte celular. Otros controles
incluían 2 pocillos de blanco y 5 pocillos que contenían células
sin fármacos adicionales. Después de centrifugación (1500 rpm, 5
min), se transfirieron 75 \mul del líquido sobrenadante a una
placa nueva con 45 \mul de una mezcla de ensayo LDH (kit
Tox-7, Sigma). Después de 10-20
minutos a temperatura ambiente, se midió la absorbancia usando un
lector Elisa a 490 nm.
Los datos de toxicidad obtenidos después de 1
hora de incubación con diferentes DP-BFA se resumen
en la Tabla 2. Cada experimento se realizó por triplicado.
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En general, se encontró que las células eran más
sensibles a los carbo-BFA y menos sensibles a los
derivados de fosfo-BFA ensayados. Las dosis
subtóxicas de los carbo-BFA se calcularon entre
30-100 \muM después de incubación durante 1 hora.
En las mismas condiciones, las dosis subtóxicas para los derivados
de fosfo-BFA ensayados se calcularon en el
intervalo de 160 \muM a más de 640 \muM. Conclusión: En general,
se encontró que los fosfo-BFA eran aproximadamente
2 a 5 veces menos tóxicos que las correspondientes moléculas de
carbo-BFA.
\vskip1.000000\baselineskip
Se investigaron los efectos de diferentes
derivados de BFA en uniones célula-célula, usando la
línea celular de adenocarcinoma humano (A431). Estas células tienen
una estructura polarizada característica de las células
intes-
tinales.
tinales.
En este estudio, se siguieron los cambios
cuantitativos en la distribución subcelular de ZO_{2}, una
proteína asociada con los complejos de unión estrecha (Anderson
et al. (1993) Current Opinion in Cell Biology 5:
771-778).
Se incubaron células A431, cultivadas en DMEM
con suero en cubreobjetos de vidrio, durante 1 h en presencia o
ausencia de dosis subtóxicas de DP-BFA. Las células
se fijaron y se permeabilizaron durante 2 minutos con una mezcla de
paraformaldehído al 3% y
Triton-X-100 al 0,5%, y después se
fijaron además durante 20 min con paraformaldehído al 3% solo. Las
células fijadas se aclararon y se incubaron durante 45 minutos a
temperatura ambiente con anticuerpo policlonal de conejo ZO_{2}
(Zymed Laboratories, inc. EE.UU.), se lavaron 3 veces con PBS y se
incubaron durante 45 min con anticuerpos secundarios con marcadores
fluorescentes. Los cubreobjetos teñidos se montaron en Elvanol
(Mowiol 4-88, Hoechst, Frankfurt, Alemania) antes
del examen por microscopio. Se siguió la distribución de la
proteína ZO_{2} con marcaje inmunofluorescente.
Las células A431 que se incubaron durante 1 hora
con pervanadato, que inhibe las fosfotirosina fosfatasas, y por lo
tanto altera las uniones celulares, se usaron como un control
positivo.
Las imágenes de fluorescencia de ZO_{2}
indicaban que DP-BFA tiene efectos claros en la
alteración de las uniones estrechas de células A431.
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El objetivo de este estudio era evaluar la
cinética y el efecto general de los compuestos
DP-BFA en la modificación de la permeabilidad en
una monocapa de células epiteliales, que servía como sistema de
modelo in vitro para las barreras biológicas y en particular
para la barrera intestinal.
Se hicieron dos enfoques con el fin de
determinar el efecto de DP-BFA en la
permeabilización de barreras biológicas. Un enfoque era seguir el
transporte de un compuesto marcado radiactivo a través de la
monocapa de células epiteliales. Un segundo enfoque era seguir los
cambios en la resistencia eléctrica como una medida que indica el
nivel de permeabilidad de la capa celular.
Las células epiteliales se cultivan en un filtro
de membrana (0,4 micrómetros, 1 cm^{2}). La membrana con la
monocapa de células epiteliales se coloca entre dos compartimentos,
una cámara dadora y una receptora. Se añaden el compuesto
P-BFA ensayado, en una concentración predeterminada
no tóxica, y trazador radiactivo ^{14}C-sacarosa
(1 Ci en 0,5 ml de tampón) en el lado apical (donador). Se recogen
muestras de 0,5 ml cada una del lado basolateral (receptor) a
intervalos de 10 minutos durante la duración de 90 minutos del
experimento. La incubación se lleva a cabo en medio de cultivo
tisular que contiene FCS al 1%, mientras se agita a 70 rpm. La
cámara apical y la membrana se transfieren a una nueva cámara
receptora en cada punto de tiempo de toma de muestra. Esto se hace
con el fin de mantener la concentración constante del trazador en la
cámara apical y volúmenes de líquido invariables en ambas cámaras.
La concentración de trazador radiactivo en las muestras recogidas
se calcula usando un contador microbeta Trilux (Wallac,
Finlandia). La velocidad de transporte del trazador se calcula y se expresa como coeficiente de permeabilidad.
Finlandia). La velocidad de transporte del trazador se calcula y se expresa como coeficiente de permeabilidad.
La integridad de la monocapa epitelial usada en
el experimento se sigue al principio y al final de la incubación,
midiendo la resistencia eléctrica transepitelial (TEER) usando
millicell-ERC (Millipore).
Se lleva a cabo un grupo de experimentos
paralelos usando el mismo sistema experimental descrito antes pero
sin la adición del trazador radiactivo. Se siguió la resistencia
eléctrica transepitelial (TEER) cada 10 minutos durante un periodo
de 90 minutos.
Conclusión: el hecho de que i) los
P-BFA aumenten significativamente el paso de
sacarosa a través de la monocapa de células epiteliales, y ii) la
disminución de la TEER de la monocapa, apoyan la conclusión de que
los compuestos P-BFA permeabilizan la barrera
biológica.
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La actividad citotóxica de diferentes derivados
fosforados de ácidos grasos de cadena ramificada
(DP-BFA) se ensayó in vitro en cultivos de
células que incluían tipos de células normales y malignas. Se usaron
los siguientes sistemas celulares:
Fibroblastos primarios (ser humano)
Células de la médula ósea (MO) normales
(ratón)
Células epiteliales bronquiales primarias (ser
humano, de Clonetics, nº de cat. CC-2541)
Caco-2 - línea celular de cáncer
de colon (ser humano, ATTC, HTB-37)
Línea de células de glioma C6 (rata, ATCC,
CRL-2199)
Neuro2a - línea celular de neuroblastoma (ratón,
ATCC, CCL-131)
SKBR-3 - línea celular de cáncer
de mama (ser humano, ATTC, HTB-30)
HL60- línea celular de leucemia mieloide (ser
humano, ATCC, CCL-240)
U937- línea celular de leucemia mieloide (ser
humano).
Las células se sembraron en una placa de
microvaloración en MEM que contenía L-glutamina 2
mM, penicilina 100 unidades/ml, estreptomicina 100 \mug/ml y FCS
al 10% a 37ºC. Las células cultivadas se incubaron, durante su fase
de crecimiento lineal en ausencia (grupo de control) o presencia de
diferentes DP-DBA como se indica. Las
concentraciones finales de los DP-BFA ensayados
estaban en el intervalo de 1,5 a 200 \muM. Al final del periodo
de incubación, que fue de 5 días para las células de la médula ósea
y 3 días para las otras líneas celulares, se calculó el efecto
citotóxico del P-BFA añadido en las células usando
el ensayo colorimétrico de MTT. El ensayo (Mosmann (1983) J.
Immunol. Methods 65: 55-63) mide la actividad de
la reductasa mitocondrial y sirve para la evaluación cuantitativa
de la viabilidad celular. La concentración de fármaco que produce
50% de reducción en la viabilidad celular en comparación con el
grupo de control, se define como CE_{50}. Los valores de
CE_{50} de los compuestos DP-BFA ensayados se
calcularon a partir de las curvas de dosis-respuesta
establecidas para cada una de las diferentes líneas celulares
ensayadas.
Los resultados se resumen en la Tabla 3. Cada
valor de CE_{50} es una media de los valores de CE_{50}
obtenidos de 1-5 experimentos independientes.
Como puede verse a partir de los resultados de
la Tabla 3, las diferentes moléculas de DP-BFA eran
activas en diferentes grados en su efecto citotóxico en las
diferentes células. Entre los compuestos ensayados, los agentes
citotóxicos más potentes para las células malignas eran
3,12-DEG-PO_{4},
3,12-(éter)-DEG-PO_{4},
3,12-MEG-PC,
3,12-DEG-PC,
3,18-DEG-PC y
3,14-PC. Se encontró que 2 de estos compuestos,
3,12-DEG-PO_{4} y
3,12-(éter)-DEG-PO_{4}, tenían la
actividad citotóxica más baja en células epiteliales normales. Se
encontró que otro compuesto,
3,12-DEG-PC, tenía la actividad
citotóxica más baja en los fibroblastos normales y células de la
médula ósea
normales.
normales.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Conclusiones: Los compuestos
fosfo-BFA han demostrado efectos de citotoxicidad
específicos del tipo de célula. Algunos de estos compuestos
mostraron ser los agentes citotóxicos más potentes cuando se
ensayaron en líneas celulares malignas, aunque eran mucho menos
tóxicos cuando se ensayaban en células normales de diferentes
tejidos. Estos datos sugieren que estos compuestos pueden ser
agentes anticancerígenos eficaces con efectos secundarios
citotóxicos bajos.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de explorar mejor el posible
mecanismo subyacente, se estudiaron el efecto citotóxico ejercido
por diferentes DP-BFA, dos marcadores para la
apoptosis establecidos, actividad de la caspasa-3 y
fragmentación de ADN (Lincz (1998) Immunol. Ceil Biol.
76:1-19).
Se sembraron células de neuroblastoma Neuro2a
(ATCC, CCL-131) en MEM que contenía
L-glutamina 2 mM, penicilina 100 unidades/ml,
estreptomicina 100 \mug/ml y FCS al 10% a 37ºC. 24 horas después,
cuando las células estaban en la fase logarítmica de crecimiento,
se añadió 3,12-DEG-PC hasta una
concentración final de 25 \muM, 50 \muM o 100 \muM. Las
células cultivadas en presencia de vehículo solo sirvieron como
grupo de control.
Los ensayos para la actividad de la
caspasa-3 y fragmentación de ADN se llevaron a cabo
en lisatos celulares obtenidos después de 6 y 24 horas de
incubación con el fármaco, respectivamente. Se ensayó la actividad
de la caspasa-3 usando el sustrato fluorogénico
Ac-DEVD-AMC (Pharmingen, Becton
Dickinson, nº cat. 66081U) y siguiendo las instrucciones del
fabricante. La fragmentación del ADN se cuantificó usando el kit de
Elisa plus de detección de muerte celular (Roche, nº cat. 1774 425)
y siguiendo las instrucciones del fabricante.
Los resultados se resumen en la Tabla 4. La
actividad de caspasa medida se expresa como porcentaje de la
actividad en las placas de control normalizadas respecto al
contenido de proteína. La fragmentación de ADN se expresa como
valores de DO a \lambda=405 nm y es una media de las lecturas por
duplicado, de los lisatos de los cultivos celulares.
Como puede verse a partir de los resultados en
la Tabla 4, la incubación de células Neuro2A con el compuesto
3,12-DEG-PC, causó un aumento de la
actividad de caspasa-3 de aproximadamente 5 veces, y
un aumento significativo de la fragmentación de ADN. Se obtuvieron
resultados similares cuando se ensayó el compuesto en otra línea
celular maligna, caco-2, derivada de carcinoma de
colon.
Conclusión: La apoptosis puede ser un mecanismo
posible para ejercer el efecto citotóxico de derivados de
fosfocolina de BFA en determinadas células malignas.
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La permeabilización de la BHE por
DP-BFA se investigó en el sistema de modelo de rata
por seguimiento de la acumulación en el cerebro de 2 marcadores: a)
colorante azul de Evans (EB), que se une rápidamente con la
albúmina (PM 70 kD) in vivo, y es un indicador para el
transporte paracelular; y b) la sal sódica de la fluoresceína
(F-Na), PM 376 D, que es transportada por el especio
celular y permite el seguimiento del transporte transcelular. Tras
la alteración de la BHE el complejo de azul de
Evans-albúmina se acumula de forma irreversible en
el espacio intercelular del cerebro. El trazador mucho más pequeño
fluoresceína puede ser transportado por vía intracelular para
ocupar tanto el espacio inter como intracelular en el cerebro.
La permeabilización de la barrera
hematoencefálica en ratas Sprgue-Dawley se indujo
por exposición breve a DP-BFA. Los animales se
anestesiaron con Rampun-Imalgen y los compuestos de
ensayo DP-BFA se administraron por la arteria
carótida externa retrógrada al cerebro (Smith, Q.R. Methods of
study. In: Physiology and Pharmacology of the
Blood-Brain Barrier. Ed. Bradbury M W.B.
Spinger-Veriag.
Berlin-Heidelberg-NY; 1992:
24-52). La arteria pterigopalatina se ligó para
evitar el escape de las disoluciones administradas por infusión
hacia la vasculatura externa de la cabeza. Las disoluciones de
DP-BFA se administraron por infusión a lo largo de
un periodo de 30 segundos o media hora, usando una bomba de jeringa
Harvard Apparatus. El flujo de sangre a través de la arteria
carótida común se interrumpió solo en el momento de la infusión.
Todas las moléculas de DP-BFA
ensayadas se prepararon a partir de disoluciones madre en agua o
etanol, por dilución 200-1000 veces en disolución
isoosmótica de manitol (5%) en tampón de trometamina (Sigma) o PBS
(pH 7,4).
Se inyectaron los marcadores, azul de Evans (EB,
25 mg/ml) y fluoresceína (F-Na, 12,5 mg/ml), en 1 ml
de disolución, por vía intravenosa, inmediatamente después de la
administración de los DP-BFA ensayados, o después de
un intervalo de tiempo específico si se investigaba la
reversibilidad de la acción. Se llevó a cabo la infusión i.v. de
apoyo de F-Na (12,5 mg/ml -100 \mul/min) durante
8 minutos. Se lavaron los cerebros con disolución salina (60 ml) 10
min después del "suministro rápido" intracarotideo. Los
hemisferios cerebrales ipsilateral y contralateral y tumores,
cuando sea aplicable, se homogeneizaron por separado con ácido
tricloroacético al 50% (TCA). Las concentraciones de los marcadores
en la corteza y en los tumores, cuando sea aplicable, se
determinaron por espectrofluorometría (Uyama, O. et al.,
(1988) J. Cereb. Blood Flow Metab. 8,
282-284; Abraham et al., (1996) Neurosci.
Lett. 208, 85-88). El contenido de marcadores se
calculó como \mug de marcador por gramo de tejido cerebral. Se
usaron el error típico y el ensayo de Student para la significancia
estadística.
En la primera etapa del estudio, se
seleccionaron moléculas de BFA de diferentes longitudes de cadena
por su efecto en la permeabilización de la barrera hematoencefálica
(BHE).
El experimento se llevó a cabo en ratas
Sprague-Dawley macho que pesaban
250-320 g. Se siguió el procedimiento descrito
antes en el Ejemplo 17.
El efecto de los compuestos ensayados en la
apertura de la BHE se evaluó por 2 parámetros:
a) eficacia - El grado de apertura de la BHE
calculada en términos de acumulación de azul de
Evans-albúmina (\mug EB/g de tejido cerebral);
y
b) potencia - medida en términos de valores de
CE_{50} y concentración mínima eficaz (CME). La CE_{50} es la
concentración de un compuesto ensayado que produce 50% del efecto
máximo de la extravasación de azul de Evans. La CME se define como
la concentración que permite la acumulación de 3 veces la cantidad
de azul de Evans acumulada en los animales de control, en este caso
un total de 3 \mug de EB/g de cerebro. Cuanto menores son los
valores de CE_{50} y CME, mayor es la potencia del compuesto
ensayado.
Los resultados de la evaluación de los efectos
de diferentes DP-BFA en la permeabilidad de la BHE
se presentan en la Tabla 5.
Como puede verse a partir de los resultados en
la Tabla 5, hay una variación sustancial en el grado de
extravasación de azul de Evans dependiendo de la longitud de cadena
del DP-BFA. Las moléculas con la longitud de cadena
más corta son casi completamente ineficaces en este sistema modelo.
Las moléculas con la eficacia más alta eran los BFA
3,12-Na y 3,16-Na, cada uno provoca
una acumulación de más de 30 \mug de EB/g de cerebro. En el
sistema experimental usado, 3,12-Na es el agente de
permeabilización más potente que tiene la CE_{50} y valores de
CME más bajos entre los compuestos ensayados.
Conclusión: En las condiciones del sistema
experimental usado, se encontró que el BFA 3,12-Na
era el potenciador de la permeabilidad más eficaz en términos tanto
de potencia como de eficacia. Por lo tanto, los derivados de
DP-BFA basados en BFA-3,12 se
estudiaron con más detalle.
El efecto de diferentes DP-BFA
en la permeabilidad de la BHE se ensayó en el sistema modelo de
cerebros de rata, descrito antes en el ejemplo 17. La eficacia, en
particular el nivel de la apertura de la BHE se expresó como la
cantidad de azul de Evans acumulada en el cerebro (\mug de EB/g de
cerebro). La potencia de las moléculas ensayadas se calculó por sus
valores de CE_{50} y concentración mínima eficaz (CME)
calculados.
Como puede verse en la Tabla 6, diferentes
moléculas de DP-BFA promueven el paso de la albúmina
unida al trazador azul de Evans a través de la BHE. Los compuestos
ensayados difieren en su potencia y eficacia.
En las condiciones de este experimento, el
derivado más potente de 3,12-BFA era
3,12-DEG-PO_{4}Na_{2} que tiene
un valor de DE_{50} de 20 \muM y una concentración mínima eficaz
(CME) de 3,3 \muM. Los compuestos más eficaces para aumentar la
permeabilidad de la BHE eran
3,12-(éter)-DEG-PO_{4}Na_{2},
3,12-PO_{4}Na_{2} y
3,12-DEG-PO_{4}Na_{2}. Los
niveles de acumulación del colorante azul de Evans en el cerebro de
rata después de tratamiento con concentraciones CE_{50} de los
compuestos
3,12-(éter)-DEG-PO_{4}Na_{2},
3,12-PO_{4}Na_{2} y
3,12-DEG-PO_{4}Na_{2} eran,
respectivamente, 26, 20 y 18 \mug de EB/g de cerebro.
Se examinó el efecto de diferentes
DP-BFA en la permeabilización de la BHE a moléculas
de diferentes tamaños, in vivo en el sistema modelo de
cerebros de rata normales.
Se siguió el transporte de 2 marcadores: a) azul
de Evans (EB) unido a albúmina (PM 70 kD) como un indicador para el
transporte paracelular; y b) sal sódica de la fluoresceína (PM 376
D), que representa moléculas de tamaño pequeño.
El colorante azul de Evans (EB) y la sal sódica
de fluoresceína (F-Na) se administraron por infusión
a la arteria carótida externa a lo largo de 30 segundos de acuerdo
con el protocolo descrito antes en el ejemplo 17. Los compuestos de
ensayo se usaron a sus concentraciones CE_{50}. Los animales de
control se trataron con disolución vehículo.
La extravasación de azul de Evans se expresa
como el porcentaje de la cantidad total de EB acumulada por gramo
de tejido cerebral. El transporte de la fluoresceína en el cerebro,
que depende de la concentración de esta molécula en el suero, se
presenta como el porcentaje del nivel de F-Na en el
suero.
Se calculó la relación de acumulación en el
cerebro de F-Na a EB y los resultados se presentan
en la Tabla 7.
Como puede verse en la Tabla 7, la BHE normal
(=control) es aproximadamente 10 veces más permeable a la
fluoresceína que el complejo de EB-albúmina. El
permeabilizador hiperosmótico, manitol, aumentó la permeabilidad de
la BHE al EB en mayor medida que a la F-Na
(relación F-Na/EB = 4). Igualmente, los ácidos
grasos ramificados ensayados 3,14-Na y
3,12-Na mostraron relaciones de
F-Na/EB de 4,7 y 4,9, respectivamente.
Los diferentes derivados fosforados de los BFA
afectan a la permeabilidad de la BHE a los dos marcadores de
diferente forma. Se encontró que 3,12-PO_{4}
aumentó la permeabilidad de la BHE al complejo de
EB-albúmina aproximadamente 1,5 veces más que el
aumento de permeabilidad a la fluoresceína. Por otra parte, se
encontró que 3,12-DEG-PO_{4}
aumentó la permeabilidad de la BHE de una forma más fisiológica, es
decir, aumentó el transporte de F-Na en la misma
medida que la extravasación de EB. La relación de
F-Na/EB en los cerebros de rata expuestos a
3,12-DEG-PO_{4} era
aproximadamente 9. Conclusión: Diferentes compuestos de
DP-BFA afectan a la permeabilidad de la BHE de
diferentes maneras. Algunos DP-BFA, p. ej.,
3,12-(éter)-DEG-PO_{4}Na_{2} y
3,12-PO_{4} (relaciones respectivas de
F-Na/EB de 1,1 y 5,9) indujeron la apertura
selectiva de la BHE que favorece el transporte de moléculas grandes
frente a moléculas con peso molecular bajo. En contraste, otras
moléculas, p. ej. 3,12-DEG-PO_{4},
aumentaron de igual forma el transporte de moléculas tanto pequeñas
como la F-Na como de moléculas más grandes como
EB-albúmina.
Se examinaron los efectos de
DP-BFA en la extravasación de azul de Evans y
fluoresceína en el cerebro de rata, en diferentes tiempos de
medición después de la administración de DP-BFA.
Se administraron por infusión diferentes
DP-BFA, a lo largo de un periodo de 30 segundos, en
la arteria carótida externa de ratas Sprague Dawley, siguiendo el
procedimiento descrito antes en el ejemplo 17. Los compuestos
ensayados se usaron en las concentraciones de sus CE_{50}. La
extravasación de azul de Evans y fluoresceína en el cerebro se
determinaron a los 10, 30, 60, 120 y 240 minutos después de la
administración de DP-BFA. El contenido de azul de
Evans (\mug/g) y fluoresceína (% de suero) en el cerebro de rata
se calculó usando una media de 2-3 animales
individuales por tiempo de medición.
Los resultados obtenidos en el sistema
experimental como se ha descrito antes, demuestran que el efecto de
los DP-BFA en la permeabilización de la BHE es
reversible. Además, se sugiere que los efectos de apertura de la
BHE de los DP-BFA son de vida relativamente corta.
La mayoría de los derivados ensayados de
DP-BFA-3,12 mantienen la
permeabilidad de la BHE durante menos de 1 hora, con una D_{1/2}
de aproximadamente 30 minutos. La D_{1/2} se define como la
duración de al menos 50% de la apertura de la BHE usando las
concentraciones de CE_{50} de los compuestos ensayados. Dos
compuestos, 3,12-PC y
3,12-MEG-PC, ambos comprenden un
resto fosfocolina, han mostrado una D_{1/2} que era 4 veces más
larga que la de los otros derivados 3,12-BFA
ensayados, es decir D_{1/2} de aproximadamente 120 minutos.
Conclusiones: Se mostró que los
DP-BFA afectaban a la apertura de la BHE en el
cerebro de rata de una forma reversible. Diferentes
DP-BFA tienen diferentes duraciones del efecto de
permeabilización.
\vskip1.000000\baselineskip
Se evaluó la seguridad y toxicidad de las
moléculas DP-BFA. Se administraron dosis crecientes
de los compuestos ensayados por vía intraarterial (i.a.) a ratas,
siguiendo el protocolo descrito antes en el ejemplo 17. La
viabilidad animal se siguió durante 24 horas para evaluar las
concentraciones letales (CL). La CL se define como la concentración
mínima que causa la muerte.
\vskip1.000000\baselineskip
El índice de seguridad se define como la
relación entre la dosis letal (CL) y la concentración mínima eficaz
(CME), en la que la CME corresponde a una concentración calculada
del compuesto ensayado que provoca la acumulación de 3 veces la
cantidad de azul de Evans acumulada en animales de control tratados
con vehículo solo, es decir, acumulación total de 3 \mug de EB.
Cuanto mayor es la relación de CL/CME mayor, es el índice de
seguridad.
Conclusiones: la introducción de un grupo
fosfato aumentó el índice de seguridad en 2-3 veces,
sin dificultar la potencia de forma significativa.
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de estudiar la capacidad de los
compuestos DP-BFA de modular la barrera
hematotumoral (BHT), se usó un sistema de modelo de ratas
portadoras de glioma C6.
Se inocularon en ratas Sprague Dawley (SP)
células de gliosarcoma C6 siguiendo el procedimiento descrito por
Bartus et al. (Exp. Neurol. (1996);
142:14-28). Se hizo un pequeño agujero con taladro
en el hueso frontal del cráneo de la rata fijada en un aparato de
estereotaxis. Usando una jeringa de Hamilton, se inocularon 10
\mul o 5 \mul de medio que contenía 2,5x10^{5} células de
gliosarcoma C6 en la corteza frontal. Las coordenadas eran 1 mm
posterior al bregma, 2,5 mm lateral y 3 mm de profundidad. La aguja
permaneció en el sitio durante 5 min. Después de sacar la aguja, se
suturaron la fascia y el cuero cabelludo. Las ratas se comprobaron
6-8 días después de la inoculación, cuando se habían
desarrollado tumores de tamaño suficiente (20-60
mg).
El tumor se pesó después de visualización de la
F-Na y disección. Partes de los cerebros de las
ratas se sometieron a exámenes histológicos y se siguió la
absorción de azul de Evans y fluoresceína en el tejido ipsolateral
del tumor, tejido peritumoral y tejido contralateral.
Los resultados (no se muestran) obtenidos de los
experimentos llevados a cabo en ratas portadoras de tumor de
control (no tratadas con los compuestos de la invención) demostraron
que la permeabilidad de la barrera hematotumoral (BHT) para el EB y
la fluoresceína es aproximadamente 2 veces y 4 veces mayor
respectivamente, que la encontrada para la BHE intacta.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usó el sistema de modelo de tumor bilateral
de ratas portadoras de glioma C6 descrito en el ejemplo 23
anterior, para seleccionar diferentes derivados de
DP-BFA por su capacidad para permeabilizar la
barrera hematoencefálica (BHE) en comparación con su efecto en la
barrera hematotumoral (BHT). Se siguió el procedimiento experimental
descrito en el ejemplo 23, excepto que las ratas portadoras de
tumor se trataron además con DP-BFA. Los compuestos
ensayados, en concentraciones de aproximadamente sus valores de
CE_{50}, se administraron por infusión de forma unilateral en la
arteria carótida externa a lo largo de 30 segundos como se describe
en el ejemplo 17. Los animales tratados con vehículo solo sirven de
grupo de control. El efecto de permeabilización se cuantificó
midiendo la acumulación de colorante azul de Evans unido a albúmina
en el tumor (T) frente a tejidos no tumorales (NT).
Los valores de eficacia y los índices de
especificidad calculados se resumen en la Tabla 9. El índice de
especificidad se define como la relación entre los niveles de EB
acumulados en el tumor y los acumulados en los tejidos cerebrales
no tumorales (T/NT).
\vskip1.000000\baselineskip
Como puede verse en la Tabla 9, la mayoría de
los compuestos ensayados han mostrado niveles similares de
acumulación de EB en el tumor y en tejidos cerebrales no tumorales,
es decir, relaciones de T/NT de aproximadamente 1 a 2. Con manitol
(25%) la acumulación de EB en el tumor era aproximadamente el doble
de la acumulación en el cerebro no tumoral. En el sistema
experimental usado, el compuesto
3,12-DEG-PO_{4}, mostró una
especificidad alta para la apertura de la barrera hematotumoral
(BHT) manifestado como acumulación de EB en el tumor, que era 22
veces más alta que los niveles de EB en el tejido no tumoral
(relación de T/NT = 22).
Conclusión: el
3,12-DEG-PO_{4} mostró el efecto
más específico en la apertura de la BHT en los tumores de glioma
C6. Este compuesto permeabiliza la barrera hematotumoral (BHT) de
gliomas C6 en mayor extensión que la barrera hematoencefálica (BHE)
normal. Por lo tanto, los derivados de DP-BFA pueden
servir como agentes capaces de abrir de forma específica y
selectiva la BHT.
\vskip1.000000\baselineskip
Se examinó la penetración del azul de Evans y la
fluoresceína en tumores glioma después de infusión unilateral en la
arteria carótida externa de
3,12-DEG-HPO_{4}Na 10 \muM (Fig.
2A), 3,12-Na BFA 40 \muM (Fig. 2B) o manitol al
25% (Fig. 2C). El compuesto relevante se administró por infusión en
cerebros de rata 9 a 12 días después de la inoculación de células
de glioma C6 como se describe en el ejemplo 23.
Se puede ver claramente en la figura 2A que la
tinción de azul de Evans después de la administración de
3,12-DEG-PO_{4} a ratas con
gliomas bilaterales es solo en el tejido tumoral en el hemisferio
ipsolateral. Por otra parte, el homólogo de carbonos del
DP-BFA, es decir BFA-3,12, y el
agente hiperosmótico manitol, permeabilizaban igual los tejidos
tumorales y no tumorales del cerebro.
\vskip1.000000\baselineskip
Se investigó la permeabilización de la barrera
hematorretiniana (BHR) por DP-BFA en ratas por
seguimiento de la pérdida del marcador fluorescente, sal sódica de
la fluoresceína (F-Na), de los vasos sanguíneos de
la esclerótica.
Ratas Sprague Dawley (SD) que pesaban 250 a 350
gramos se anestesiaron con una disolución de ketamina (140 mg/ml) y
xilasina (2%) inyectada en 0,1 ml/100 g de peso corporal. A los
animales anestesiados se les inyectaron 0,25 ml de
F-Na (12,5 mg/ml) en la vena yugular). Los vasos
sanguíneos retinales se grabaron con una cámara de color
3-CCD (teli CS5850) unida con una montura C al
microscopio INAMI L-0960 para cirugía oftálmica. El
microscopio está equipado con una fuente de luz y un filtro adecuado
para detectar la F-Na. Después de 10 min la retina
se limpió de F-Na. En este momento, se inyectaron
por vía intraarterial 1,5 ml de
3,12-DEG-HPO_{4}Na (12,5
\mug/ml) a lo largo de un periodo de 30 segundos, acompañada de
una segunda inyección i.v. de F-Na. Se tomaron
fotos de los vasos sanguíneos en t=0 y 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8 y 10
minutos después de la administración del fármaco. Se repitió el
mismo experimento en un segundo grupo de ratas de control, a las que
se inyectaron 1,5 ml de vehículo (Tab-manitol al
5%) por vía intraarterial en lugar de
3,12-DEG-HPO_{4}Na.
Mediante el seguimiento de la distribución de
F-Na en los vasos sanguíneos en la parte posterior
del ojo del animal, a nivel de la retina, se demostró que 10
minutos después de la administración de F-Na sola,
todo el colorante fluorescente se había aclarado de la región que
rodeaba los vasos sanguíneos retinales. Sin embargo, la inyección
i.v. de F-Na en combinación con inyección i.a. de
3,12-DEG-HPO_{4}Na, daba como
resultado la acumulación de F-Na alrededor de los
vasos sanguíneos a nivel retinal. Este escape de
F-Na de los vasos sanguíneos, en presencia de
3,12-DEG-HPO_{4}Na, es un
indicador de la permeabilización de la barrera hematorretiniana. En
los animales de control, en los que se administró solo vehículo en
lugar de fármaco de DP-BFA, los resultados eran
similares a los de los animales a los que se inyectó
F-Na solo, en concreto 10 minutos después de la
administración, no se pudo detectar fluorescencia en los vasos
sanguíneos o en la región que los rodea a nivel retinal. Los
resultados representados en las figuras 3A-C
representan la angiografía del ojo, en particular fotos de la
imagen del suministro de sangre al ojo tomadas a nivel de la retina,
registradas a los 30 segundos y 10 minutos después de la
administración de F-Na sola (Fig. 3A) o en
combinación con 3,12-DEG-HPO_{4}Na
(Fig. 3B) o vehículo (Fig. 3C).
De acuerdo con esta observación, a los 10
minutos después de la administración de F-Na, se
podían detectar cantidades mayores de F-Na en el
vítreo de los animales tratados con
3,12-DEG-HPO_{4}Na que en el
vítreo de los animales de control a los que se inyectó
F-Na y vehículo solo (Figuras 4A-B).
La acumulación de la señal fluorescente en el vítreo se debe a la
permeabilización de la BHR y el escape de F-Na de
los vasos sanguíneos a nivel de la retina. Conclusión: el
3,12-DEG-HPO_{4}Na permite la
permeabilización de la barrera hematorretiniana, y da como
resultado la acumulación de F-Na en la retina y el
vítreo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se estudiaron los efectos antitumorales de
diferentes P-BFA en el sistema de modelo in
vivo descrito antes en el ejemplo 17. Los P-BFA
ensayados se administraron por vía intraarterial en las
concentraciones previamente determinadas como eficaces en la
permeabilización de la BHE y la BHT para la extravasación de azul de
Evans y fluoresceína. Se siguió el procedimiento experimental para
la inoculación de tumor, como se describe en el ejemplo 23.
El día 3-4 después de
inoculación de las células de gliosarcoma C6, la rata se canuló por
la arteria carótida externa y los P-BFA ensayados
se administraron por infusión durante 30 segundos, como se describe
en el ejemplo 17, excepto que en este experimento no se
administraron marcadores. Las ratas tratadas se mantuvieron hasta
el día 7-9 y después se sacrificaron. Se obtuvieron
las secciones coronales, se tiñeron con
eosina-hematoxilina, y se hizo una revisión
histológica para determinar el volumen del tumor. Los animales
tratados con vehículo solo sirven como control. Se usaron el error
típico y el ensayo de Student para la significancia estadística.
Los resultados se resumen en la
Tabla 10.
Tabla 10.
Como puede verse a partir de los resultados en
la Tabla 10, los compuestos P-BFA presentan efecto
citostático en el crecimiento tumoral del glioma in vivo. En
las condiciones experimentales usadas, el compuesto
3,12-DEG-PO_{4} presentaba el
efecto antitumoral más pronunciado. Otros compuestos, p. ej.,
3,12-MEG-PC, también demostraron
una actividad antitumoral significativa, aunque en menor medida.
Conclusión: los P-BFA
administrados por vía intraarterial en las ratas portadoras de
glioma C6 presentan efecto citotóxico en el tumor.
El efecto antitumoral de DP-BFA
se evaluó por seguimiento del volumen del tumor y aspecto en un
sistema de modelo de ratas portadoras de glioma C6. Se inoculó a
ratas Sprague Dawley (SD) 2,5x10^{5} células de glioma en 5
\mul de PB como sigue. Las ratas se montaron en un soporte de la
cabeza estereostático en una posición con el cráneo plano. Después
de reflexión del periostio se taladró un agujero con un taladro de 1
mm en las siguientes coordenadas: bregma -1,0, 3,50 mm lateral
desde la línea media en el lado izquierdo, y a una profundidad de
3,50 mm. La suspensión de células se inyectó manualmente a una
profundidad de 3,50 mm usando una jeringa de Hamilton de 10 \mul.
Las ratas portadoras de tumor se trataron 72 h después de
inoculación con una sola dosis, en el intervalo de 5 a 20 \muM de
fosfato de 3,12-dietilenglicol
(3,12-DEG-PO_{4}; sal sódica) o
vehículo (tampón isoosmótico, pH 7,4) administrado por infusión en
la arteria carótida externa durante 30 s a una velocidad de 3
ml/min. Se ligó la arteria pterigopalatina, y la arteria carótida
común se sujetó con pinzas en el momento de la infusión.
Cinco días después de la inoculación de células
tumorales C6, las ratas se anestesiaron con ketamina/xilazina (1:1)
0,1 ml/100 g de peso corporal, se perfusionaron con disolución
salina y se fijaron con disolución de formaldehído al 4%. Se
sacaron los cerebros y se crioprotegieron en una disolución de
sacarosa durante 48 h. Después se cortaron los cerebros en láminas
finas en sección coronal, se tiñeron con
hematoxilina-eosina y se sometieron a evaluación
patológica.
Se observó una disminución significativa del
tamaño del tumor en los animales tratados en comparación con los
animales no tratados. El volumen del tumor era 8,1 \pm 2,2
mm^{3} (N=7) en los animales tratados con vehículo y 1,6\pm0,2
mm^{3} (N=12) en los animales tratados con
3,12-DEG-PO_{4}. Además, el
microentorno y la naturaleza del crecimiento del tumor eran
diferentes. Las ratas portadoras de tumor tratadas con vehículo
presentaban una expansión celular local remarcable en la corteza,
materia blanca y meninges. Los gliomas C6 aparecían irregulares y
muy infiltrantes y mostraron una tendencia alta a la invasión por
los espacios linfáticos perivasculares. En contraste, el
tratamiento con DP-BFA, dado una vez el tercer día
después de la inoculación de células, cambió significativamente el
carácter del crecimiento del tumor. La capacidad de invasión del
glioma C6 por los espacios perivasculares disminuyó y se observó un
tumor sólido con borde definido. Se encontró cierta invasión
limitada en las meninges alrededor de la zona de inoculación y
subepéndima. Conclusión, el
3,12-DEG-PO_{4} mostró un efecto
antitumoral significativo inhibiendo la capacidad de invasión del
tumor y la velocidad de crecimiento. Por lo tanto, los compuestos
DP-BFA pueden ser útiles para inhibir la expansión
y la capacidad de invasión de los tumores.
El experto en la técnica apreciará que los
principios de la presente descripción pueden amoldarse a muchas
realizaciones y variaciones o modificaciones, todas las cuales están
dentro del alcance de la invención. Se pretende que los ejemplos
sean interpretados como no limitantes, y el alcance de la invención
está definido por las siguientes reivindicaciones.
Claims (35)
1. Un compuesto de fórmula general I:
o una de sus sales
farmacéuticamente aceptable, en la
que:
R1 y R2 son cadenas alifáticas saturadas o
insaturadas diferentes, que comprenden de 2 a 30 átomos de
carbono;
R3 es
A-[CH_{2}]_{m}-B-[CH_{2}]_{n}-C-[CH_{2}]_{p}-D,
en el que m, n y p son cada uno independientemente 0 o un número
entero de 1 a 12, y A, B, C y D se selecciona cada uno
independientemente de un enlace covalente, grupo amino, amido,
oxígeno, tio, carbonilo, carboxilo, oxicarbonilo, tiocarbonilo,
fosfato, aminofosfato, mono, di y triaminofosfato, con la condición
de que 2 átomos de oxígeno no estén conectados directamente entre
sí, en el que -R3-O- comprende un resto
monoetilenglicol o dietilenglicol.
Z_{1} y Z_{2} son iguales o diferentes, cada
uno puede estar ausente o se selecciona independientemente de a)
hidrógeno, sodio, litio, potasio, amonio, mono, di, tri y
tetraalquilamonio, o b) junto con el grupo fosfo forman un
fosfoéster de glicerol, colina, etanolamina, inositol, serina, mono
u oligosacárido.
2. El compuesto de acuerdo con la reivindicación
1, en el que R1 es de 3 átomos de carbono de longitud y R2 es de 12
a 16 átomos de carbono de longitud.
3. El compuesto de acuerdo con la reivindicación
1 ó 2, en el que R1 es propilo y R2 es dodecilo.
4. El compuesto de acuerdo con la reivindicación
1, en el que el número total de átomos de carbono en R2 y R3 juntos
es de 6 a 26.
5. El compuesto de acuerdo con la reivindicación
1, en el que el número total de átomos de carbono en R2 y R3 juntos
es de 16 a 22.
6. El compuesto de acuerdo con la reivindicación
1, en el que Z_{1} es colina.
7. El compuesto de acuerdo con la reivindicación
1, en el que Z_{1} es sodio y Z_{2} se selecciona de hidrógeno
y sodio.
8. El compuesto de acuerdo con la reivindicación
1, seleccionado del grupo que consiste en:
Fosfato de
2-(4-hexadecilcarboxil)etilo
(3,12-MEG-PO_{4}),
Fosfato de
2-[2-(4-hexadecilcarboxil)etoxi]etilo
(3,12-DEG-PO_{4}),
Fosfato de
2-(4-hexadeciloxi)etilo
(3,12-(éter)-MEG-PO_{4}),
Fosfato de
2-[2-(4-hexadeciloxi)etoxi]etilo
(3,12-(éter)-DEG-PO_{4}),
2-(4-Hexadecilcarboxil)etilfosfocolina
(3,12-MEG-PC),
2-[2-(4-Hexadecilcarboxil)etoxi]etilfosfocolina
(3,12-DEG-PC),
Fosfato de
2-{2-[10-(4-hexadeciloxi)deciloxi]etoxi}etilo
(3,12-O-C_{10}-DEG-PO_{4}),
2-{2-[10-(4-Hexadeciloxi)deciloxi]etoxi}etilfosfocolina
(3,12-O-C_{10}-DEG-PC),
Fosfato de
2-(4-octadeciloxi)etilo
(3,14-MEG-PO_{4}),
Fosfato de
2-[2-(4-octadecilcarboxil)etoxi]etilo
(3,14-DEG-PO_{4}),
Fosfato de
2-(4-octadeciloxi)etilo
(3,14-(éter)-MEG-PO_{4}),
Fosfato de
2-[2-(4-octadeciloxi)etoxi]etilo
(3,14-(éter)-DEG-PO_{4}),
2-(4-Octadecilcarboxil)etilfosfocolina
(3,14-MEG-PC),
2-[2-(4-Octadecilcarboxil)etoxi]etilfosfocolina
(3,14-DEG-PC),
Fosfato de
2-(4-icosilcarboxil)etilo
(3,16-MEG-PO_{4}),
Fosfato de
2-[2-(4-icosilcarboxil)etoxi]etilo
(3,16-DEG-PO_{4}),
Fosfato de 4-icosaniloxietilo
(3,16-(éter)-MEG-PO_{4}),
Fosfato de
2-[2-(4-icosiloxi)etoxi]etilo
(3,16-(éter)-DEG-PO_{4}),
2-(4-Icosilcarboxil)etilfosfocolina
(3,16-MEG-PC),
2-[2-(4-Icosilcarboxil)etoxi]etilfosfocolina
(3,16-DEG-PG),
Fosfato de
2-[2-(2-propilicosilcarboxil)etoxi]etilo
(3,18-DEG-PO_{4}), y
2-[2-(2-
Propilicosilcarboxil)etoxi]etilfosfocolina
(3,18-DEG-PC).
9. El compuesto de acuerdo con la reivindicación
1, que es fosfato de
{2-[2-(4-hexadecilcarboxil)etoxi]etilo},
sal monosódica; fosfato de
{2-[2-(4-hexadecilcarboxil)etoxi]etilo},
sal disódica; fosfato de
2-[2-(4-hexadeciloxi)etoxi]etilo;
2-(4-hexadecilcarboxil)etilfosfocolina; o
2-[2-(4-Hexadecilcarboxil)etoxi]etilfosfocolina.
10. Una composición farmacéutica que comprende
un vehículo farmacéuticamente aceptable y un compuesto de cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 9.
11. La composición farmacéutica de acuerdo con
la reivindicación 10, que además comprende un agente biológicamente
activo.
12. La composición farmacéutica de acuerdo con
la reivindicación 11, en la que el agente biológicamente activo es
un agente terapéutico, un fármaco anticancerígeno o un agente de
diagnóstico.
13. Uso de un compuesto de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, para la fabricación de un medicamento.
14. Uso de acuerdo con la reivindicación 13, en
el que el medicamento es para aumentar la permeabilidad de una
barrera biológica.
15. El uso de acuerdo con la reivindicación 14,
en el que la barrera biológica se selecciona del grupo que consiste
en piel, córnea, epitelio conjuntival, nasal, bronquial, bucal,
vaginal y gastrointestinal, barrera hematorretiniana, barrera
hematoencefálica, barrera hematotesticular, barrera hematotumoral e
interfase hematorrenal.
16. Uso de un agente biológicamente activo y una
cantidad eficaz de una composición farmacéutica de la reivindicación
10, para la fabricación de un medicamento para permitir o aumentar
la penetración y/o acumulación del agente biológicamente activo en
un sitio u órgano privilegiado.
17. El uso de acuerdo con la reivindicación 16,
en el que dicho sitio u órgano privilegiado es la médula espinal,
cerebro, ojo, testículo, una glándula o tumor.
18. Uso de una composición farmacéutica de la
reivindicación 10, en combinación con un agente terapéutico para la
fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad
o trastorno del sistema nervioso central.
19. El uso de acuerdo con la reivindicación 18,
en el que dicho agente terapéutico se selecciona del grupo que
consiste en agentes antitumorales, antivíricos, antimicrobianos,
antifúngicos, antiinflamatorios, neuroprotectores y péptidos y
proteínas bioactivos.
20. Uso de acuerdo con la reivindicación 13, en
el que el medicamento es para el tratamiento de un tumor.
21. El uso de acuerdo con la reivindicación 20,
que además comprende administrar al paciente que lo necesite, una
cantidad eficaz de un agente anticancerígeno.
22. El uso de acuerdo con la reivindicación 21,
en el que dicho fármaco anticancerígeno se administra en una
composición farmacéutica separada.
23. El uso de acuerdo con la reivindicación 20,
en el que el tumor está en el sistema nervioso central.
24. El uso de acuerdo con la reivindicación 20,
en el que el tumor está en el cerebro.
25. El uso de acuerdo con la reivindicación 20,
en el que el tumor se selecciona del grupo que consiste en
carcinoma, glioma, neuroblastoma, retinoblastoma, linfoma, leucemia,
sarcoma y melanoma.
26. El uso de acuerdo con la reivindicación 20,
en el que dicho tumor es un tumor primario o secundario.
27. Uso de acuerdo con la reivindicación 13, en
el que el medicamento es para el tratamiento de una enfermedad o
trastorno oftalmológico.
28. El uso de acuerdo con la reivindicación 27,
que además comprende administrar al sujeto que lo necesite, una
cantidad eficaz de un agente biológicamente activo adicional.
29. El uso de acuerdo con la reivindicación 27,
en el que la enfermedad o trastorno oftalmológico se selecciona de
edema macular cistoide (EMC), degeneración macular relacionada con
la edad (DMRE), infecciones intraoculares, inflamaciones
intraoculares y tumores malignos intraoculares.
30. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 29, en el que el medicamento se administra
por administración oral, parenteral o tópica, o por perfusión
regional, enema o lavado intraórgano.
31. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 29, en el que el medicamento se administra
por vía intraarterial o intratecal.
32. El uso de un agente de diagnóstico en
combinación con una cantidad eficaz de una composición farmacéutica
de la reivindicación 10, para la fabricación de un medicamento para
aumentar la acumulación de un agente de diagnóstico en un órgano
protegido por una barrera biológica.
33. El uso de acuerdo con la reivindicación 32,
en el que dicho órgano protegido por una barrera biológica es el
sistema nervioso central.
34. Un compuesto de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, para usar para aumentar la permeabilidad de
una barrera biológica.
35. Un compuesto de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, para usar en el tratamiento de un tumor.
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