ES2244540T3 - Metodo para teñir, detectar y contar bacterias, y un diluyente para la tincion bacteriana. - Google Patents
Metodo para teñir, detectar y contar bacterias, y un diluyente para la tincion bacteriana.Info
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Abstract
Un método de tinción de bacterias que comprende: actuación de un colorante de polimetino sobre una muestra en la presencia de una sustancia capaz de reducir los iones nitrito para teñir las bacterias en la muestra.
Description
Método para teñir, detectar y contar bacterias, y
un diluyente para la tinción bacteriana.
Esta invención se refiere a un método de tinción
y detección y recuento de bacterias en muestras clínicas, en
particular, bacterias en muestras de orina, y a un diluyente para la
tinción bacteriana.
El número de bacterias en orina es un importante
parámetro en el diagnóstico clínico para juzgar la presencia de
infección. En general, la presencia de bacterias de 10^{5} o
más/ml en orina se reconoce como criterio de infección positiva del
tracto urinario. Si la orina contiene bacterias en cantidad de
10^{3} o más/ml, se diagnostica como orina contaminada (flora
bacteriana normal), es decir, infección del tracto urinario
negativa. Si se observa aproximadamente 10^{4}/ml bacterias, el
diagnóstico es reservado pero la muestra a menudo se vuelve a
examinar.
Convencionalmente, la observación de bacterias en
orina se ha realizado por examen microscópico de bacterias teñidas
por Gram, bacterias no teñidas sin tratamiento de tinción Gram o
bacterias teñidas con fluorescencia.
La orina a menudo contiene contaminantes como
hebras de moco, cristales, sales amorfas y fragmentos de células que
son clínicamente insignificantes. Estas sustancias perturban la
medición de partículas significativas (en particular bacterias) así
que ha sido difícil el recuento exacto del número de bacterias.
Realmente, no ha habido un método de recuento de bacterias de
aproximadamente 10^{4}/ml con exactitud.
En el caso de tinción Gram, las bacterias y los
contaminantes se tiñen simultáneamente así que la pérdida de
recuento de bacterias en pequeño número ocurre frecuentemente en el
examen microscópico. Además, la tinción Gram incluye un número de
etapas de tinción y requiere tiempo (aproximadamente 15 minutos) de
modo que la eficacia del trabajo es escasa.
El examen microscópico de bacterias sin
tratamiento de tinción puede realizarse rápidamente, pero no puede
discriminar bacterias, particularmente cundo cocos
contaminantes.
El examen microscópico de bacterias teñidas con
fluorescencia muestra mejor detectabilidad que los dos método
mencionados antes. Sin embargo, no se ha establecido cómo eliminar
otros contaminantes distintos de las bacterias y teñir las bacterias
rápidamente.
El método en medio agar, que es un método
estándar, requiere 16 horas o más para determinar el número de
bacterias, así que no puede considerarse un método rápido.
La Patente de EE.UU. 4.622.298, y la Publicación
de Patente Japonesa no examinada Nº Hei 9
(1997)-119926 y Nº Hei 9
(1997)-329596 propone un método de detección de
bacterias en una muestra de orina teñida con fluorescencia con un
citómetro de flujo.
Un colorante de polimetino se utiliza para
tinción con fluorescencia en las referencias de más arriba, pero
algunas bacterias no se tiñen suficientemente con el colorante de
polimetino. Por ejemplo, en el caso de una muestra en la que
proliferan bacterias que reducen los nitratos y producen una gran
cantidad de nitrito, los iones nitrito descomponen el colorante de
polimetino de modo que el colorante no trabaja efectivamente en la
tinción de las bacterias.
Usualmente, las bacterias se tiñen bien a pH
ácido. Además, una muestra de orina que contiene hebras de moco es
efectiva en la tinción de bacterias. Sin embargo, el efecto de los
iones nitrito se promueve a pH ácido.
Un objeto de esta invención es proporcionar un
método de tinción y detección y recuento de bacterias que permite la
detección rápida y eficaz de bacterias incluso si una muestra
contiene iones nitrito a alta concentración.
Esta invención proporciona un método de tinción
de bacterias que comprende: actuación de un colorante de polimetino
sobre una muestra en la presencia de una sustancia capaz de reducir
iones nitrito para teñir bacterias en la muestra.
Además, esta invención proporciona un método de
detección y recuento de bacterias que comprende las siguientes
etapas de :
(1) actuación de un colorante de polimetino sobre
una muestra para teñir bacterias en la muestra,
(2) introducir la muestra así tratada en una
parte de detección de un citómetro de flujo e irradiar células de
las bacterias teñidas una a una con luz para medir la luz dispersada
y la luz fluorescente emitida desde cada una de las células; y
(3) discriminar las bacterias de otros
componentes de acuerdo con una intensidad de una señal de luz
dispersada y una intensidad de una señal de luz fluorescente o una
anchura de impulso que refleja la longitud de las partículas para
contar el número de bacterias.
Además, esta invención proporciona el uso de un
diluyente para tinción bacteriana que comprende: un tampón para
mantener la acidez; y una cantidad efectiva de una sustancia capaz
de reducir los iones nitrito.
La Fig. 1 es un diagrama de dispersión de una
intensidad de luz fluorescente- una intensidad de luz dispersada
hacia adelante obtenida en el caso en que el ácido ascórbico se usa
como agente reductor en el Ejemplo 1 de esta invención;
La Fig. 2 es un diagrama de dispersión de una
intensidad de luz fluorescente- una intensidad de luz dispersada
hacia adelante obtenida en el caso en que el agente reductor no se
usa en el Ejemplo 1 de esta invención;
La Fig. 3 es un diagrama de dispersión de una
intensidad de luz fluorescente- una intensidad de luz dispersada
hacia adelante obtenida en el caso en el que se usa ácido sulfámico
como agente reductor en el Ejemplo 2 de esta invención; y
La Fig. 4 es una representación que ilustra el
desarrollo del método de detección de bacterias según esta
invención
En esta invención, la muestra no está
particularmente limitada mientras sea una muestra a examinar para la
presencia o ausencia de bacterias y para contar el número de
bacterias si la muestra contiene bacterias. Las bacterias a las que
se refiere la invención incluyen bacterias que reducen nitritos y
producen ácido nitroso, por ejemplo, bacterias intestinales como
Staphilococcus aureus, bacilos facultativos
Gram-negativos como E. coli, Klebsiella
sp., así como Staphirococcus sp., Pseudomonas sp., Serratia
sp., Enterobacter sp., Enterococcus sp., Streptococcus sp, y
Citrobacter sp. Por ejemplo, la muestra puede ser una muestra
clínica como orna, líquido espinal o similar. La muestra puede
diluirse con agua purificada o similar dos o más veces,
preferiblemente 4 a 15 veces, más preferiblemente 5 a 10 veces. Esta
invención es particularmente efectiva para una muestra de orina.
La sustancia capaz de reducir iones nitrito puede
ser una o más clases seleccionadas del grupo que comprende: ácido
ascórbico, ácido isoascórbico, ácido aminometanosulfónico, ácido
aminoetanosulfónico, ácido glutámico, ácido aspártico, ácido
mercaptoacético, ácido 3-mercaptopropiónico, ácido
sulfámico, ácido sulfanílico, ácido sulfuroso, ácido pirosulfuroso,
ácido fosfínico, glicina, glutamina, asparagina, metionina,
glutatión, cisteína, hidroxilamina y sus sales; sulfanilamida;
aminometano; mercaptoetanol, tiofenol; urea y similares. Ejemplos de
las sales pueden ser generalmente una sal alcalina (por ejemplo,
ascorbato sódico, isoascorbatosódico, sulfito sódico, pirosulfito
sódico, fosfinato sódico, ascorbato potásico, isoascorbato potásico,
etc.) y sales de hidroxilamina pueden ser hidrocloruro de
hidroxilamina, sulfato de hidroxilamina, fosfato de hidroxilamina,
etc.) Con respecto a su concentración puede estar contenido como 10
mM o más en la muestra (concentración final). Preferiblemente el
ácido ascórbico puede estar contenido como 85 a 115 mM, el ácido
sulfámico puede estar contenido como 40 a 200 mM, la cisteína, el
glutatión y el sulfito sódico pueden estar contenidos como 10 a 50
mM respectivamente. La urea puede estar contenida como 0,5 M o más,
preferiblemente en una extensión en la que no pueda causar
desnaturalización de las células. En general, se considera que se
producen 0,06 mg/ml de iones nitrito en la presencia de bacterias
reductoras de nitrato de 10^{5}/ml. Además la proliferación de
bacterias se considera limitada hasta 10^{8} a 10^{9}/ml y no es
más alta (no puede). Por consiguiente, la sustancia puede usarse en
tal cantidad que pueda reducir los iones nitrito producidos por
bacterias de 10^{5} a 10^{6}/ml.
En particular, donde ocurre proliferación de
bacterias reductoras de nitrato para producir una gran cantidad de
nitrito en la muestra, la sustancia capaz de reducir iones nitrito
se usa para prevenir descomposición del colorante causado por los
iones nitrito. Como consecuencia, aumenta la transmisividad del
colorante de las bacterias.
Para teñir efectivamente las bacterias, las
membranas celulares (paredes celulares) de las bacterias pueden
deteriorarse, así que un colorante se introduce fácilmente en las
bacterias. Por ejemplo, un tensioactivo catiónico, un tensioactivo
aniónico, un tensioactivo anfolítico, un tensioactivo no iónico, o
similar puede usarse para conseguir este propósito. El mismo
propósito se puede conseguir usando un agente
antibacteriano/antiséptico (agente antibacteriano), un disolvente
orgánico como alcohol además del tensioactivo. Además, puede
obtenerse suficiente capacidad de tinción por deterioro térmico o
deterioro causado por un microondas (horno de microondas, etc.).
Entre los mencionados más arriba, el tensioactivo catiónico puede
ser usado convenientemente ya que el tensioactivo catiónico no sólo
mejora la capacidad de tinción de la bacteria sino que también
disuelve/contrae las fibras mucosas, eritrocitos, fracturas
celulares y otras que están presentes en una muestra y por eso
reduce su efecto sobre la detección de las bacterias.
No se da particular limitación al tensioactivo
catiónico, sino que preferiblemente se usa una sal de amonio
cuaternaria representada por la fórmula siguiente:
R^{11} ---
\melm{\delm{\para}{R ^{12} }}{N}{\uelm{\para}{R ^{10} }}^{+}
--- R^{13} \hskip02cmY^{-}
en que R^{10} es un grupo alquilo
o (C_{6}H_{5})-CH_{2}; R^{11}, R^{12} y
R^{13}, los mismos o diferentes, son un grupo alquilo
C_{1-3} o un grupo bencilo; Y^{-} es un ion
halógeno.
El grupo alquilo C_{1-3} puede
ser metilo, etilo, propilo. El grupo alquilo
C_{6-18} puede ser hexilo, heptilo, octilo,
decilo, dodecilo, tetradecilo o similar. El halógeno puede ser
flúor, bromo, yodo y cloro.
Por ejemplo, se usan convenientemente sales de
hexiltrimetilamonio, sales de octiltrimetilamonio, sales de
deciltrimetilaonio, sales de dodeciltrimetilmonio, sales de
tetradeciltrimetilamonio, sales de hexadeciltrimetil amonio, sales
de octadeciltrimetilamonio, sales de benciltrimetilamonio y
similares.
Otros ejemplos de tensioactivo catiónico pueden
ser sales de piridinio de la fórmula siguiente:
[(C_{5}H_{5})N^{+} - (CH_{2})n -
CH_{3}]
Y^{-}
en que n es desde 7 a 17 e Y^{-}
es un ion halógeno. Por ejemplo, se usan convenientemente sales de
octilpiridinio, sales de decilpiridinio, sales de
dodeciltrimetilpiridinio, sales de tetradeciltrimetilpiridinio,
sales de tetradeciltrimetilpiridinio, sales de hexadecil
trimetilpiridinio y
similares.
La concentración de tensioactivo catiónico puede
ser 10 a 50000 mg/ml, preferiblemente 100 a 3000 mg/ml.
No se da particular limitación al tensioactivo
aniónico, pero se usan convenientemente sales del ácido
N-acilaminoacético como lauroil sarcosinato, cocoil
sarcosinato, miristoil sarcosinato y oleil sarcosinato.
La concentración del tensioactivo aniónico puede
ser 0,1 a 10 mg/ml, preferiblemente 0,5 a 5 mg/ml.
No se da particular limitación al tensioactivo
anfolítico, pero se usan convenientemente carboxibetaína de la
fórmula siguiente:
R^{15} ---
\melm{\delm{\para}{R ^{16} }}{N}{\uelm{\para}{R ^{14} }}^{+}
---
CH_{2}COO^{-}
en que R^{14} es un grupo alquilo
C_{8-20}; R^{15} y R^{16}, los mismos o
diferentes, son un grupo alquilo C_{1-3}, un grupo
alquenilo o alquinilo
C_{2-3}.
El grupo alquilo C_{1-3} puede
ser el mismo que se ha mencionado antes. El grupo alquenilo
C_{2-3} puede ser acetilenilo, propinilo. El grupo
alquilo C_{8-20} puede ser octilo, decilo,
dodecilo, tetradecilo o similar.
Por ejemplo, puede mencionarse dodecildimetil
betaína, hexadecildimetil betaína, decildimetil betaína y
similares.
La concentración del tensioactivo anfolítico
puede ser 1 a 100 mg/ml, preferiblemente 5 a 20 mg/ml.
No se da particular limitación al tensioactivo no
iónico, pero se usan convenientemente
polixietilen(n)alquil éteres en que el grupo alquilo
tiene un número de carbonos de 10 a 20 y n es desde 10 a 20 y
polioxietilen(n)alquilfenil éteres en que el grupo
alquilo tiene un número de carbonos de 8 a 10 y n es desde 2 a 20
como el POE(10)octilfenil éter.
Otros tensioactivos catiónicos que se considera
tienen la característica de solubilizar la proteína de membrana
incluyen Trtiton X-100 (polietilenglicol
mono[p-(1,1,3,3-tetrametilbutil)fenil]éter),
CHAPS (ácido
(3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-propanosulfónico),
CHAPSO (ácido
(3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-2-hidroxi-propanosulfónico),
BIGCHAP
(N,N-bis(3-D-gluconamidopropil)colamida),
desoxi-BIGCHAP
(N,N-bis(3-D-gluconamiopropil)desoxi-olamida),
sacarosa monocaprato, sacarosa monocolato,
n-octil-\alpha-D-glucopiranosido,
n-heptil-\alpha-D-tioglucopiranosido,
n-octil-\alpha-D-tioglucopiranosido,
n-dodecil-\alpha-D-maltopiranosido,
n-nonil-\alpha-D-tiomaltopiranosido
y similares.
La concentración de estos tensioactivos puede ser
0,5 a 50 mg/ml, preferiblemente 1,0 a 10 mg/ml.
Además de los tensioactivos, pueden mencionarse
agentes antibacterianos/antisépticos (agentes antibacterianos) y
similares. Como ejemplos de los agentes, se usan convenientemente
isotiazolina que contiene agentes antibacterianos y biguanidina que
contiene agentes antisépticos. La concentración del agente puede
convenientemente ser 1,0 a 30 mg/ml.
El disolvente orgánico como alcohol, puede ser
metanol, etanol, alcohol isobutílico, fenoxietanol, metoxietanol,
etoxietanol, butoxietanol o similares. La concentración de estos
alcoholes puede convenientemente ser 1,0 a 100 mg/ml.
El colorante no está particularmente limitado
mientras pueda teñir las bacterias. Cuando se examina una muestra de
orina, se usa preferiblemente un colorante capaz de teñir bacterias
bajo un estado ácido. Su concentración puede determinarse
convenientemente dependiendo de la clase de colorante, por ejemplo,
en el intervalo de 0,1 a 100 ppm (concentración final). Para la
detectabilidad de las bacterias, se usa ventajosamente un colorante
fluorescente que esté al menos unido a uno de los componentes que
constituyen las bacterias y emita luz fluorescente. Desde este punto
de vista, son preferibles los colorantes de polimetino. Por ejemplo,
se usan los siguientes colorantes (1) a (11):
(1) Naranja de tiazol;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
(10); un compuesto representado por la fórmula
general siguiente:
en que R_{1} es un átomo de
hidrógeno o un grupo alquilo C_{1-3}; R_{2} y
R_{3} son un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo
C_{1-3} o un grupo alcoxi
C_{1-3}; R_{4} es un átomo de hidrógeno, un
grupo acilo o un grupo alquilo C_{1-3}; R_{5} es
un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C_{1-3}
que puede estar sustituido; Z es un átomo de azufre, un átomo de
oxígeno o un átomo de carbono sustituido con un grupo alquilo
C_{1-3}; n es 1 o 2; X^{-} es un anión;
y
(11) un compuesto representado por la fórmula
general siguiente:
en que R^{6} es un átomo de
hidrógeno o un grupo alquilo C_{1-18}, R^{7} y
R^{8} son un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo
C_{1-3} o un grupo alcoxi
C_{1-3}; R^{9} es un átomo de hidrógeno, un
grupo acilo o un grupo alquilo C_{1-18}; Z es
azufre, oxígeno o un átomo de carbono sustituido con un grupo
alquilo C_{1-3}; n es 0, 1 0 2; X^{-} es un
anión.
El grupo alquilo C_{1-3} puede
ser metilo, etilo, propilo y similares. El grupo alquilo
C_{1-18} puede ser metilo, etilo propilo y
similares. El grupo alquilo C_{1-18} puede ser
metilo, etilo, propilo, octilo, decilo, dodecilo, tetradecilo y
similares. El grupo alcoxi C_{1-3} puede ser
metoxi, etoxi, propoxi y similares. Sustituyentes en el grupo
alquilo C_{1-3} pueden ser un grupo hidroxilo, un
átomo de halógeno y similares.
Entre los colorantes mencionados más arriba, (1)
está disponible en el comercio. (2) y (3) los suministran Nippon
Photosensitive Dye Laboratory Ltd., y (5) a (9) los suministran
Molecular Probes, Inc. Los métodos de fabricación de (10) y (11) se
describen en las Publicaciones de Patente Japonesa no examinadas Nº
Hei 9(1997)-104683 y Hei
10(1998)-319010, respectivamente.
Entre los colorantes (10), un colorante
representado por la fórmula:
es particularmente
conveniente.
Además, entre los colorantes (11), un colorante
representado por la fórmula:
es particularmente
conveniente.
En esta invención, el pH en la etapa de tinción
no está específicamente limitado mientras permita la tinción de las
bacterias. Cuando una muestra de orina se tiñe a un pH ácido, (1)
las bacterias se tiñen mejor que en un estado neutro o alcalino y
(2) se previene la tinción no específica de hebras de moco y las
hebras de moco se destruyen en cierta extensión. Así, el estado
ácido es ventajoso para la tinción de las bacterias.
Un tampón de pKa 1 a 5,5 se usa para mantener el
estado ácido. El tampón no está particularmente limitado, pero puede
usarse un ácido o un compuesto capaz de mantener el pH a
2,0-3,0. Como tampón, puede utilizarse una o más
clases de compuestos seleccionados del grupo que comprende: ácido
cítrico o sus sales, ácido fosfórico o sus sales, ácido láctico o
sus sales, ácido \varepsilon-aminocaproico o sus
sales, ácido fumárico o sus sales, \beta-alanina,
glicina y similares. Las sales descritas más arriba incluyen sales
alcalinas o alcalinotérreas. Ejemplos convenientes de estas son al
menos una seleccionada del grupo que consiste en : ácido
cítrico-NaOH, dihidrógeno fosfato de potasio-
hidrógeno fosfato disódico, dihidrógeno fosfato de
potasio-NaOH, ácido
cítrico-hidrógeno fosfato disódico, hidrógeno
ftalato de potasio-NaOH, ácido
succínico-NaOH, ácido láctico-NnaOH,
ácido
\varepsilon-aminocaproico-HCl,
ácido fumárico-HCl,
\beta-alanina-NaOH;
glicina-NaOH y similares. Su cantidad de uso
apropiada es tal que se mantenga el intervalo de pH mencionado
antes, preferiblemente aproximadamente 10 a 500 mM en la
muestra.
Además cuando se examina una muestra de orina, la
tinción se lleva a cabo utilizando una sal inorgánica de sulfato o
nitrato. Esto es preferible ya que aumenta la transmisividad de
colorante fluorescente de las bacterias y se previene la tinción no
específica de contaminantes. La sal inorgánica puede usarse en una
concentración de aproximadamente 10 a 500 mM, preferiblemente
aproximadamente 50 a 200 mM en la muestra.
En esta invención, la actuación de un colorante
sobre una muestra (tinción) puede llevarse a cabo mezclando la
muestra, una por una o simultáneamente, una solución acuosa que
contiene la sustancia capaz de reducir iones nitrito y/o el
tensioactivo catiónico y una solución que contenga el colorante. El
colorante puede estar contenido en la solución acuosa que contiene
la sustancia capaz de reducir los iones nitrito y/o el tensioactivo
catiónico. Sin embargo, cuando el colorante a utilizar es inestable
en la solución acuosa, puede disolverse en un disolvente orgánico
soluble en agua, como metanol, etanol, o etilenglicol y después
mezclarlo para el uso con la solución acuosa que contiene la
sustancia capaz de reducir iones nitrito y/o el tensioactivo
catiónico. Esto mejora la estabilidad en almacenamiento del
colorante.
La temperatura y el tiempo para la tinción no
están particularmente limitados, pero la tinción puede realizarse a
aproximadamente 15 a 50ºC durante 20 minutos o menos,
preferiblemente aproximadamente 15 minutos o menos, más
preferiblemente aproximadamente 15 minutos inmediatamente después de
la mezcla.
La muestra teñida por el método de esta invención
puede observarse con un microscopio o un aparato reproductor de
imágenes para detectar las bacterias. Alternativamente, las
bacterias pueden detectarse y contarse utilizando un citómetro de
flujo de alta precisión. El citómetro de flujo empleado aquí puede
ser un aparato disponible en el comercio generalmente utilizado en
la técnica.
Es decir, el método de detección y recuento de
bacterias según esta invención se lleva a cabo en las etapas de
(1) actuación de un colorante para tinción de
bacterias sobre una muestra por el método descrito más arriba,
(2) introducir la muestra así tratada en una
parte de detección de un citómetro de flujo e irradiar las células
de las bacterias teñidas una por una con luz para medir la luz
dispersada y la luz fluorescente emitida desde cada una de las
células; y
(3) discriminar las bacterias de otros
componentes de acuerdo con una intensidad de una señal de luz
dispersada y una intensidad de una señal de luz fluorescente o una
anchura de impulso que refleja la longitud de las partículas para
contar las bacterias.
El método de actuación del colorante sobre la
muestra se puede realizar como se ha descrito más arriba, por
ejemplo, mezclando una muestra con una solución acuosa que contiene
una sustancia capaz de reducir los iones nitrito y/o un tensioactivo
catiónico para acelerar la transmisividad del colorante de las
bacterias y después (o simultáneamente) teñir la muestra durante un
cierto período con un colorante.
La discriminación de las bacterias de otros
componentes y el recuento de las bacterias se realizan de acuerdo
con una combinación de señales obtenidas usando un citómetro de
flujo. Ejemplo de la combinación incluye, por ejemplo, una
intensidad de luz dispersada hacia adelante y una anchura de impulso
de luz dispersada hacia adelante, una intensidad de luz dispersada
hacia adelante y una intensidad de luz fluorescente, una anchura de
impulso de luz dispersada hacia adelante y una intensidad de luz
fluorescente, y similares. De manera conveniente, por ejemplo,
primeramente, se forma un diagrama de dispersión a partir de la
combinación de la intensidad de luz dispersada hacia adelante y la
anchura de impulso de luz dispersada hacia delante, y después se
encierra una masa que incluye bacterias especificadas en el diagrama
de dispersión para separar hebras de moco principalmente. Además se
forma otro diagrama de dispersión a partir de la intensidad de luz
dispersada hacia adelante y la intensidad de luz fluorescente de la
masa retenida para separar las bacterias de otros componentes
(cristales, fragmentos de células y similares)basado en la
diferencia en la intensidad de la luz fluorescente. El desarrollo
del método se muestra en la Fig. 4. Cuando la muestra contiene solo
bacterias, se forma un diagrama de dispersión a partir de la
intensidad de luz dispersada hacia adelante y la intensidad de la
luz fluorescente para hacer el recuento de las bacterias.
A continuación, se describen ejemplos preferidos
del método de tinción y detección de bacterias según esta invención,
pero esta invención no se limita a esto.
| Ácido cítrico | 92,3 mM |
| Hidróxido sódico | 0,75 g/l (hasta pH de 2,5) |
| Bromuro de tetradeciltrimetilamonio | 0,1% (p/v) |
| Sulfato sódico | 90 mM |
| Ácido ascórbico | 85 mM |
El colorante A (de la fórmula estructural
siguiente) 40 ppm (en etilenglicol)
A 140 \mul de una muestra que contiene una gran
cantidad de iones nitrito (concentración de bacterias de
5,0x10^{6}/ml; orina de hospital), se añadieron 952 \mul del
diluyente mencionado más arriba y la solución de tinción se añadió
hasta que la concentración final del colorante A era de 1 ppm. La
tinción se realizó a 40ºC durante 20 segundos y después se midieron
la luz dispersada y la luz fluorescente con un citómetro de flujo
provisto de un láser semiconductor como fuente de luz (cantidad de
orina examinada: 8,0 \mul). Después, como se muestra en la Fig. 1,
se formó un diagrama de dispersión con una intensidad de luz
fluorescente (FLI) como eje horizontal y una intensidad de luz
dispersada (FSLI)como eje vertical. Como control, la medida
se realizó utilizando un reactivo que no contiene ácido ascórbico
(Fig.2).
En el caso en que se usó el reactivo sin ácido
ascórbico, las bacterias no se tiñeron y la intensidad de luz
fluorescente fue cero. En contraste, las bacterias se tiñeron y
detectaron cuando se añadió ácido ascórbico.
La medición se realizó de la misma manera que en
el Ejemplo 1, excepto que se usó ácido sulfámico como 100 mM en
lugar de ácido ascórbico en el diluyente. La Fig. 3 muestra los
resultados. Las bacterias se tiñeron y detectaron como en el Ejemplo
1.
Según el método de tinción de las bacterias de
esta invención, se añadieron la sustancia capaz de reducir los iones
nitrito y/o el tensioactivo catiónico. Por consiguiente, la
transmisividad del colorante en las células de las bacterias aumenta
aún cuando las bacterias reductoras de nitratos produzcan iones
nitrito en la muestra, así que las bacterias pueden detectarse
rápidamente con elevada precisión. Además, ya que las bacterias se
tiñen en un estado acuoso, la fijación en seco, como la tinción Gram
no se requiere necesariamente. Por consiguiente, el período de
tinción se puede reducir notablemente y así se puede preparar una
muestra para medición en un corto espacio de tiempo, incluyendo la
etapa de tinción.
Ya que la tinción según esta invención puede
realizarse fácilmente simplemente mezclando el reactivo y la
muestra, se elimina la especialización requerida en la tinción Gram.
Además, la etapa de tinción puede llevarse a cabo fácilmente, lo que
facilita la automatización a través de la etapa de tinción a la
etapa de medición (como la citometría de flujo y el análisis de
imágenes).
Según el método de detección de bacterias de esta
invención, las bacterias se pueden contar con alta precisión sin ser
afectadas por los contaminantes. Específicamente, pueden contarse
las bacterias en cantidad de 10^{4}/ml.
Además, las bacterias cuyo crecimiento es difícil
en el medio (muestras bacteriostáticas) también se pueden contar
fiablemente.
Claims (23)
1. Un método de tinción de bacterias que
comprende: actuación de un colorante de polimetino sobre una muestra
en la presencia de una sustancia capaz de reducir los iones nitrito
para teñir las bacterias en la muestra.
2. Un método según la reivindicación 1, en que la
sustancia capaz de reducir iones nitrito se selecciona del grupo que
consiste en: ácido ascórbico, ácido isoascórbico, ácido
aminometanosulfónico, ácido aminoetanosulfónico, ácido glutámico,
ácido aspártico, ácido mercaptoacético, ácido
3-mercaptopropiónico, ácido sulfámico, ácido
sulfanílico, ácido sulfuroso, ácido pirosulfuroso, ácido fosfínico,
glicina, glutamina, asparagina, metionina, glutatión, cisteína,
hidroxilamina y sus sales; sulfanilamida; aminometano;
mercaptoetanol, tiofenol y urea.
3. Un método según la reivindicación 1, en que el
colorante polimetino es al menos uno seleccionado del grupo
siguiente que consiste en:
(1) Naranja de tiazol;
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
(10) un compuesto representado por la fórmula
general siguiente:
en que R_{1} es un átomo de
hidrógeno o un grupo alquilo C_{1-3}; R_{2} y
R_{3} son un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo
C_{1-3} o un grupo alcoxi
C_{1-3}; R_{4} es un átomo de hidrógeno, un
grupo acilo o un grupo alquilo C_{1-3}; R_{5} es
un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo C_{1-3}
que puede estar sustituido; Z es un átomo de azufre, un átomo de
oxígeno o un átomo de carbono sustituido con un grupo alquilo
C_{1-3}; n es 1 o 2; X^{-} es un anión;
y
(11) un compuesto representado por la fórmula
general siguiente:
en que R_{6} es un átomo de
hidrógeno o un grupo alquilo C_{1-18}; R_{7} y
R_{8} son un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo
C_{1-3} o un grupo alcoxi
C_{1-3}; R_{9} es un átomo de hidrógeno, un
grupo acilo o un grupo alquilo C_{1-18}; Z es
azufre, oxígeno o carbono que tiene un grupo alquilo
C_{1-3}; n es 0,1 o 2; ; X^{-} es un
anión.
4. Un método según la reivindicación 1, en que la
actuación se lleva a cabo en existencia con un tensioactivo
catiónico.
5. Un método según la reivindicación 4, en que el
tensioactivo catiónico es una sal de amonio cuaternaria representada
por la siguiente fórmula:
R^{11} ---
\melm{\delm{\para}{R ^{12} }}{N}{\uelm{\para}{R ^{10} }}^{+}
---R^{13} \hskip02cmY^{-}
en que R_{10} es un grupo alquilo
C_{6-18} o
(C_{6}H_{5})-Ch_{2}-; R_{11}, R_{12} y
R_{13}, los mismos o diferentes, son un grupo alquilo
C_{1-3} o un grupo bencilo; Y^{-} es un ion
halógeno.
6. Un método según la reivindicación 5, en que la
sal de amonio cuaternaria es al menos una seleccionada del grupo que
consiste en: sal de deciltrimetilamonio, sal de
dodeciltrimetilamonio, sal de tetradeciltimetilamonio, sal de
hexadeciltrimetilamonio y sal de octadeciltrimetilamonio.
7. Un método según la reivindicación 1, en que el
colorante actúa bajo un estado ácido.
8. Un método según la reivindicación 7, en que el
estado ácido se fija a pH 2,0-4,5.
9. Un método según la reivindicación 1, en que
para mantener el pH se usa un tampón de pKa
1-5,5.
10. Un método según la reivindicación 9, en que
el tampón es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en:
ácido cítrico-NaOH, dihidrógeno fosfato de
potasio-hidrógeno fosfato disódico, dihidrógeno
fosfato de potasio-NaOH, ácido
cítrico-hidrógeno fosfato disódico, hidrógeno
ftalato de potasio-NaOH, ácido
succínico-NaOH, ácido láctico-NnaOH,
ácido
\varepsilon-aminocaproico-HCl,
ácido fumárico-HCl,
\beta-alanina-NaOH y
glicina-NaOH.
11. Un método según la reivindicación 1, en que
la actuación se realiza en existencia con una sal inorgánica de
sulfato o nitrato.
12. Un método según la reivindicación 1, en que
el colorante actúa a 0,1 a 100 ppm en la muestra.
13. Un método según la reivindicación 1, en que
la sustancia capaz de reducir iones nitrito existe en la muestra en
tal cantidad que puede reducir los iones nitrito producidos por
bacterias de 10^{5} a 10^{8}/ml.
14. Un método según la reivindicación 1, en que
el tensioactivo catiónico existe en 10 a 30000 mg/ml en la
muestra.
15. Un método según la reivindicación 10, en que
el ácido o el compuesto que mantiene un pH ácido existe en 10 a 500
mM en la muestra.
16. Un método según la reivindicación 1, en que
la muestra es orina, sangre o líquido espinal.
17. Un método de detección y recuento de
bacterias que comprende las siguientes etapas de:
(1) actuación de un colorante polimetino sobre
una muestra por un método como se describe en una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 16, para teñir las bacterias en la muestra.
(2) introducir la muestra así tratada en una
parte de detección de un citómetro de flujo e irradiar las células
de las bacterias teñidas una por una con luz para medir la luz
dispersada y la luz fluorescente emitida desde cada una de las
células; y
(3) discriminar las bacterias de otros
componentes de acuerdo con una intensidad de una señal de luz
dispersada y una intensidad de una señal de luz fluorescente o una
anchura de impulso que refleja la longitud de las partículas para
contar el número de bacterias.
18. Un método según la reivindicación 17, en que
la etapa (1) se lleva a cabo por las etapas de
(a) mezclar una muestra con una solución acuosa
que contiene una sustancia capaz de reducir iones nitrito y/o un
tensioactivo catiónico para acelerar la transmisividad de colorante
de las bacterias;
(b) teñir las bacterias durante un período
predeterminado con un colorante de polimetino.
19. Un método según la reivindicación 17, en que
la etapa (3) discriminación y recuento de las bacterias se lleva a
cabo de acuerdo con al menos una seleccionada de las combinaciones
siguientes de:
(i) una intensidad de luz dispersada hacia
adelante y una anchura de impulso de luz dispersada hacia
adelante;
(ii) una intensidad de luz dispersada hacia
adelante y una intensidad de luz fluorescente; y
(iii) una anchura de impulso de luz dispersada
hacia delante y una intensidad de luz fluorescente.
20. Uso de un diluyente para teñir bacterias
utilizando un colorante de polimetino, en que el diluyente
comprende:
- un tampón para mantener la acidez; y
- una cantidad efectiva de una sustancia capaz de
reducir iones nitrito.
21. El uso según la reivindicación 20, en que la
sustancia capaz de reducir iones nitrito se selecciona del grupo que
consiste en: ácido ascórbico, ácido isoascórbico, ácido
aminometanosulfónico, ácido aminoetanosulfónico, ácido glutámico,
ácido aspártico, ácido mercaptoacético, ácido
3-mercaptopropiónico, ácido sulfámico, ácido
sulfanílico, ácido sulfuroso, ácido pirosulfuroso, ácido fosfínico,
glicina, glutamina, asparagina, metionina, glutatión, cisteína,
hidroxilamina y sus sales; sulfanilamida; aminometano;
mercaptoetanol, tiofenol y urea.
22. El uso según la reivindicación 20, que
comprende además un tensioactivo catiónico.
23. El uso según la reivindicación 22, en que el
tensioactivo catiónico es una sal de amonio cuaternaria representada
por la siguiente fórmula:
R^{11} ---
\melm{\delm{\para}{R ^{12} }}{N}{\uelm{\para}{R ^{10} }}^{+}
--- R^{13} \hskip02cmY^{-}
en que R^{10} es un grupo alquilo
C_{6-18} o
(C_{6}H_{5})-CH_{2}-; R^{11}, R^{12} y
R^{13}, los mismo o diferentes son un grupo alquilo
C_{1-3} o un grupo bencilo; Y^{-} es un ion
halógeno.
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