ES2201182T3 - Composiciones y procedimientos de analisis rapido de reticulocitos. - Google Patents

Composiciones y procedimientos de analisis rapido de reticulocitos.

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Abstract

SE DESCRIBE UN PROCEDIMIENTO Y UN REACTIVO PARA LA ENUMERACION SIMULTANEA O INDEPENDIENTE DE RETICULOCITOS EN UNA MUESTRA DE SANGRE COMPLETA, SIN LA NECESIDAD DE INCUBAR DE FORMA SEPARADA LA MUESTRA Y EL REACTIVO. EL REACTIVO CONTIENE UNA CANTIDAD QUE TIÑE RETICULOCITOS DE UN TINTE DE CIANINA ASIMETRICO, DESDE APROXIMADAMENTE 40 MM A APROXIMADAMENTE 60 MM DE UN TAMPON SELECCIONADO ENTRE EL GRUPO FORMADO POR IMIDAZOL, TRIS Y BIS TRIS, Y UNA CANTIDAD ESTABILIZANTE DEL TINTE DE UN TENSIOACTIVO NO IONICO SELECCIONADO ENTRE EL GRUPO FORMADO POR N,N [3-D-POLIOXIPROPILENO DESDE APROXIMADAMENTE 6,8 A APROXIMADAMENTE 7,2 Y UNA OSMOLARIDAD AJUSTADA DESDE APROXIMADAMENTE 280 A APROXIMDAMENTE 310 MOSM/L CON UNA SAL ALCALINA MONO EL GRUPO FORMADO POR NACL, KCL, LICL, CACL2, MGCL2 Y ZNCL2. EL PROCEDIMIENTO UTILIZA EL REACTIVO EN UN PROCEDIMIENTO SIN INCUBACION QUE TAMBIEN PERMITE LA DETERMINACION SIMULTANEA DE CBC, ASI COMO EL RECUENTO DE RETICULOCITOS Y LOS INDICES DE MADUREZ.

Description

Composiciones y procedimientos de análisis rápido de reticulocitos.
La presente invención tiene que ver con un método y composiciones acuosas estables de reactivos para el rápido análisis de reticulocitos. Más concretamente, la presente invención se refiere a métodos automatizables y a composiciones acuosas estables de reactivos para el análisis rápido de reticulocitos utilizando dispersión de luz y técnicas citométricas de flujo por fluorescencia. Los métodos y composiciones acuosas estables de reactivos permiten el análisis rápido de reticulocitos, reportable mediante el recuento y madurez, en instrumentos de hematología multiparámetro de alto rendimiento. El método también permite el análisis en tiempo real de reticulocitos y recuentos de células sanguíneas completos ("CSC"), incluyendo recuentos de glóbulos rojos nucleados ("GRN"), sin una etapa de incubación independiente.
Antecedentes
Normalmente, los glóbulos rojos ("GR") ingresan en la corriente sanguínea como reticulocitos. La eritropoyesis empieza con el eritroblasto y continúa a través de unas cinco generaciones de células nucleadas intermedias en la médula ósea, y termina con el reticulocito. El reticulocito es un glóbulo rojo inmaduro que todavía contiene materia reticular (ARN ribosomal y mensajero), incluso aunque en esta fase de su desarrollo la célula haya expelido el núcleo.
Bajo estados anémicos o hipóxicos, este proceso puede ser acortado. Los reticulocitos de una fase más temprana de lo normal pueden ingresar en la corriente sanguínea bajo estas condiciones. Estos reticulocitos tempranos son identificados por la cantidad extra de ARN que contienen, así como por su mayor tamaño, menor contenido de hemoglobina, y por la mayor duración de tiempo que persisten como reticulocitos en la corriente sanguínea.
En los primeros años 1930, L. Heilmeyer (Ztschr. Klin. Ned. 121: 361-379, 1932) diferenció los reticulocitos en cuatro grupos de edad según la cantidad de retículo (substancia teñible de suma importancia contenida dentro de los reticulocitos) que contienen. Tradicionalmente, el Grupo I contiene 30 o más retículos, el Grupo II contiene 15-30, el Grupo III contiene 3-15, y el Grupo IV contiene 1-2 retículos. El recuento normal de reticulocitos es desde un 0'5 hasta un 2'5% del recuento de GR para adultos, y desde un 2'0 hasta un 6'0% del recuento de GR para niños recién nacidos. En términos de grupos de edad, un adulto normal tendrá la mayor parte de los reticulocitos en el Grupo IV, y ninguno en el Grupo I.
El recuento de reticulocitos es una medida de la producción de glóbulos rojos. Por lo tanto, es útil en el diagnóstico y tratamiento de la anemia. Históricamente, los recuentos de reticulocitos han estado muy estrechamente asociados con la etiología y clasificación de las anemias. El recuento de reticulocitos aumenta en anemias hemolíticas, deficiencia de piruvato quinasa, anemia de células falciformes, talasemias, y disminuye en la anemia megaloblástica, anemia aplástica, y disfunción general de la médula ósea. Recientemente, el recuento de reticulocitos se ha utilizado también para valorar los efectos tóxicos de los agentes quimioterapéuticos en la médula. Por lo tanto, los hematólogos han apoyado unánimemente el recuento de reticulocitos y el índice de madurez de los reticulocitos como información muy valiosa.
El método más frecuentemente utilizado para recontar reticulocitos es el procedimiento microscópico manual. Predominantemente se utilizaba azul de cresilo brillante hasta que fue introducido el Nuevo Azul de Metileno ("NAM") en 1947 por G. Brecher (Am. J. Clin. Pathol. 19: 895-896, 1949). La publicación más reciente del National Committee for Clinical Laboratory Standards ("NCCLS") (NCCLS DOC. H44-P) aprueba la tinción con NAM en la que un volumen igual de sangre es mezclado con tintura de NAM, e incubado durante aproximadamente quince minutos, para permitir que precipite el ARN. Luego, se fabrican frotis de sangre, y se recuentan microscópicamente los reticulocitos teñidos. En un ocular se inserta un disco ocular Miller. El área del cuadrado más pequeño visto dentro del ocular es 1/9 del cuadrado más grande. Se enumeran los GR en el cuadrado más pequeño, mientras que los reticulocitos son enumerados en el cuadrado más grande. Se recuentan veinte campos sucesivos, y se calcula el % de reticulocitos dividiendo los reticulocitos totales en los cuadrados grandes por los glóbulos rojos totales en los cuadrados pequeños después de multiplicar por 9. El inconveniente del método manual es que es de mucha mano de obra, impreciso, exige mucho tiempo y subjetivo.
Se han hecho muchos intentos para corregir estos defectos mediante la tecnología citométrica de flujo. En los años 1980, se utilizaron pironina Y ("PY") y Naranja de Acridinio ("NA") para teñir y contar reticulocitos en citómetros de flujo. Ahora están disponibles varios métodos citométricos de flujo semiautomáticos para enumerar reticulocitos a partir de una muestra de sangre completa. En cada uno de los métodos existentes, se utiliza un diluyente conteniendo un colorante catiónico orgánico, tal como Auramina O ("AO") o Naranja de Tiazol ("NT"), para teñir el ARN dentro de los reticulocitos. Durante el periodo de incubación, el colorante penetra lentamente la membrana celular y se une al ARN dentro de cada reticulocito. La cantidad de señal generada por los reticulocitos teñidos, a medida que la muestra pasa a través de la zona de detección, es groseramente proporcional al contenido de ARN dentro de cada reticulocito. Por lo tanto, se puede utilizar un citómetro de flujo equipado con la adecuada fuente de luz de excitación y sistema de emisión y detección para determinar el porcentaje de reticulocitos en una muestra de sangre completa.
Sin embargo, hay muchos orígenes de problemas que complican la automatización de las metodologías para reticulocitos, especialmente cuando el instrumento es un sistema de hematología multiparámetro. El más importante de los cuales es la necesidad de preparar una muestra teñida fuera de línea. Esta etapa de preparación de la muestra requiere un largo periodo de incubación de varios minutos, o más tiempo, antes de que el colorante haya penetrado la célula para teñir suficientemente el ARN de los reticulocitos, para permitir que la muestra sea procesada mediante un citómetro de flujo. Además, la mayoría de los colorantes actualmente en uso para teñir ARN en los reticulocitos no son estables en soluciones acuosas, y se unen no solamente al ARN y ADN sino también se unen a la tubería de plástico del instrumento, a las superficies de vidrio, incluyendo la celda del flujo. Esto requiere la larga y ardua tarea de limpiar el sistema completo después de aplicar el ensayo.
La Patente U.S. 3.684.377 según Kaminsky y col., la Patente U.S. 3.883.247 según Adams, y la Patente U.S. 4.336.029 según Natale, revelan todas el empleo de NA para teñir reticulocitos. Aunque el NA tiene excelentes propiedades para teñir reticulocitos (se une a ARN y genera fluorescencia roja), también se une a plasma y genera alta fluorescencia de fondo del flujo de la muestra, haciendo muy difícil obtener una buena relación señal-ruido ("S/N"). Aún más problemático, utilizando NA en un citómetro de flujo, el NA tiene propensión a unirse a las superficies de la tubería de plástico y de la celda de flujo, sumándose a los problemas de detección. Además, los métodos con NA requieren de 5 a 7 minutos para incubar, lo cual es un periodo de tiempo demasiado largo para que sea incorporado en los analizadores de hematología multicanal de alto rendimiento de hoy día.
La Patente U.S. 4.707.451 según Sage Jr. revela una composición de reactivo compuesta de tioflavina T o crisanilina. En este método, la captación de colorante por los reticulocitos tarda unos 7 minutos, y la fluorescencia de fondo es demasiado alta para obtener una buena relación S/N en la detección de reticulocitos del Grupo IV.
La Patente U.S. 4.883.867 según Lee y col. revela un colorante para teñir ARN y ADN. El NT es su colorante preferido para el análisis de reticulocitos, y el método requiere un tiempo de incubación mínimo de 30 minutos. Aunque el NT tiene una afinidad de unión por los ácidos nucleicos y rendimiento cuántico altos, la velocidad de permeación de la membrana por el NT es muy lenta (30 minutos) y, de este modo, no es conveniente para su uso en un instrumento de hematología clínica multiparámetro de alto rendimiento.
La Patente U.S. 4.971.917 según Kuroda enseña una composición de reactivo que contiene AuO y una sal carbonato para reducir la tinción no específica de los eritrocitos maduros. La Patente U.S. 4.985.176 revela otro reactivo para tinción de reticulocitos para uso citométrico de flujo, en el que está incluido AuO como colorante preferido, y el tiempo de incubación de la muestra para tinción es, en todas partes, entre 30 segundos y 20 minutos. Las desventajas de utilizar AuO en un citómetro de flujo es que el colorante, como el NA, tiene una afinidad no únicamente por el ADN y ARN sino también por diversos tipos de superficies plásticas y de vidrio, haciendo extremadamente difícil incorporar los métodos en un instrumento de hematología multiparámetro. TOA Medical Electronics Co., Ltd., ha gestionado el incorporar un método con AuO en sus analizadores autónomos automatizados de reticulocitos Sysmex® R-1000 y R-3000, pero ha sido incapaz de incorporar el método en sus instrumentos de hematología multiparámetro tales como los instrumentos NE8000 o SE9000.
La Patente U.S. 5.284.771 según Colella y col. revela un método y una composición de reactivo que comprende el tratar una muestra de sangre completa con una única solución de reactivo conteniendo un colorante catiónico (Oxazine® 750) para teñir ARN en reticulocitos, y un agente esferonizador zwitteriónico para eliminar el ruido orientacional del glóbulo rojo liso cuando el teñido se sometió a un sistema citométrico de flujo por medición de luz.
Recientemente, Miles Inc. ha incorporado el método anterior en su último instrumento de hematología H*3®. Este instrumento está equipado con un sistema de detección electro-óptico de helio/neón ("HeNe"), y se utiliza el colorante para ácidos nucleicos Oxazine® 750 para teñir reticulocitos, mientras que se utiliza un surfactante zwitteriónico para esferonizar los glóbulos rojos y reticulocitos en la preparación para mediciones volumétricas. El método H*3® para reticulocitos es solamente un método semiautomático que requiere mezclado manual de la sangre con el reactivo para reticulocitos, seguido por una incubación fuera de línea de 15 minutos. La sensibilidad del método es escasa para detectar reticulocitos del Grupo IV.
Coulter Corporation ha incorporado también un método semiautomático para reticulocitos en sus analizadores de hematología STKS® y Maxim®. Coulter denomina a su tecnología: VCS (Volumen, Conductividad y Dispersión). Al practicar la VSC, primero se mezcla una muestra de sangre con colorante Retic de Coulter (el cual contiene NAM). Después, se incuba la mezcla a temperatura ambiente durante 5 minutos. Luego, un volumen pequeño de la muestra de sangre teñida se diluye con una solución depuradora que contiene ácido sulfúrico. La exactitud del método adolece grandemente de escasa sensibilidad y una pobre resolución de los glóbulos rojos. Esto es debido al estroma de reticulocitos (lisado por la solución depuradora), otros detritus celulares y plaquetas que crean ruido, haciendo muy difícil diferenciar las señales propias. Únicamente las plaquetas agregadas generarán señales que sean mayores y las cuales, por lo tanto, no interferirán con las señales generadas por el estroma de GR y de reticulocitos.
La Patente U.S. 4.981.803 según Kuroda revela un reactivo conteniendo AuO para el recuento de reticulocitos mediante métodos citométricos de flujo, el cual consta de dos soluciones, una solución madre para tinción en la que está disuelto un colorante (AuO) en un disolvente no acuoso, y una solución tampón que satisface las condiciones óptimas de tinción para el ARN en los reticulocitos. Kuroda reivindica que, combinado estas dos soluciones inmediatamente antes de teñir, se puede obtener siempre una solución de tinción final estable para el recuento de reticulocitos. Los problemas de este método son muchos. El más importante, el grupo de disolventes no acuosos que se seleccionan (etilenglicol, trietilenglicol, dietilenglicol) tienen un alto índice de refracción. Tales índices de refracción los hacen inapropiados para su uso en un analizador de hematología multiparámetro. Esto es debido a la solución acuosa de revestimiento que es necesaria (tal como salino tamponado con fosfato), y que tiene un índice de refracción de aproximadamente 1'334. Como se describe en la patente de Kuroda, otros disolventes tales como metanol, etanol o propanol (los cuales tienen un índice de refracción cercano al del revestimiento salino) son sumamente volátiles y, de este modo, son también inapropiados. Adicionalmente, es técnicamente muy difícil mezclar en línea tales cantidades pequeñas de soluciones madre con grandes volúmenes de tampón acuoso, como se requiere por esta metodología, para proporcionar un reactivo de reticulocitos estable.
Por lo tanto, ha existido una sentida necesidad de un método rápido y exacto para el análisis de reticulocitos, el cual pueda ser incorporado en un citómetro de flujo o en un analizador de hematología multiparámetro de alto rendimiento, utilizando mientras un reactivo que sea estable en un ambiente acuoso.
Sumario de la invención
Se proporciona un método para la enumeración simultánea de CSC y reticulocitos en una muestra de sangre completa, sin la necesidad de una etapa independiente de incubación para la enumeración de reticulocitos.
Una forma de realización proporciona un reactivo acuoso para tinción de ácidos nucleicos que consta de una cantidad de un colorante de cianina asimétrico para tinción de reticulocitos, desde unos 20 mM hasta unos 60 mM de una solución de tampón seleccionado del grupo que se compone de tampones de imidazol, Hepes, Bis-Tris y Tris, y una cantidad de surfactante no iónico, estabilizador del colorante, seleccionado del grupo que se compone de N,N-bis[3-D-Glucon-amidopropil]colamida, n-Dodecil-D-Maltósido, un copolímero de bloques de polioxipropileno-polioxietileno, n-Tetradecil-D-Maltósido, Decanoíl-N-metil-glucamida, n-Dodecil-D-glucopiranósido y n-Decil-D-glucopiranósido. El reactivo tiene un pH desde aproximadamente 6'0 hasta aproximadamente 8'0, y una osmolaridad ajustada a aproximadamente 230 hasta aproximadamente 340 mOsm/l con sales alcalinas mono o divalentes que no interfieren con el colorante de cianina o precipitan en la solución acuosa de reactivo.
En otra forma de realización se proporciona un método para enumerar reticulocitos. En primer lugar, se mezcla una alícuota de una muestra de sangre completa con el reactivo acuoso para tinción de ácidos nucleicos. Luego, esta alícuota de muestra/reactivo es transportada a una celda de flujo óptico para el análisis, sin incubar aparte la alícuota. Al pasar las celdas a través de una celda de flujo óptico iluminada, esencialmente una celda cada vez, se detectan la dispersión de luz y las características fluorescentes, y de ahí se determina la enumeración de reticulocitos en la muestra.
Una forma de realización adicional proporciona un reactivo acuoso para tinción de ácidos nucleicos que consta de aproximadamente 0'1 \mug/ml hasta aproximadamente 0'3 \mug/ml de un colorante seleccionado del grupo que se compone de Sybr 11, Sybr 14, Sybr 16 y Sybr 12 (obtenibles todos de Molecular Probes, Eugene, OR), de aproximadamente 40 mM hasta aproximadamente 60 mM de tampón de imidazol, y de una cantidad de un surfactante no iónico, estabilizador del colorante, seleccionado del grupo que se compone de N,N-bis[3-D-Glucon-amidopropil]colamida y un copolímero de bloques de polioxipropileno-polioxietileno, en donde el reactivo tiene un pH desde aproximadamente 6'8 hasta aproximadamente 7'2, y una osmolaridad ajustada a aproximadamente 280 hasta aproximadamente 310 mOsm/l con una sal alcalina mono o divalente seleccionada del grupo que se compone de ClNa, ClK, ClLi, Cl_{2}Ca, Cl_{2}Mg y Cl_{2}Zn.
En aún otra forma de realización, se proporciona un método para la enumeración simultánea de reticulocitos y un recuento completo de células sanguíneas. Mientras se está analizando una alícuota de una muestra de sangre completa para una determinación de CSC, está siendo mezclada una segunda alícuota de la muestra con el reactivo acuoso para tinción de ácidos nucleicos, y se analiza el componente reticulocito como se describió antes.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1a es una exposición FACScan® bidimensional (citograma) de señales de Dispersión frontal ("FSC") frente a fluorescencia verde ("FL1") de una muestra clínica con 5'63% de reticulocitos.
La Figura 1b es un histograma FL1 de la población de glóbulos rojos ("GR") seleccionada de la Figura 1a.
La Figura 1c es un citograma FACScan® de señales FSC frente a FL1 de una muestra clínica con 2'63% de reticulocitos y elevada población de glóbulos blancos ("GB").
La Figura 1d es un histograma FL1 de la población seleccionada de GR de la Figura 1c.
Las Figuras 2a y 2b son representaciones gráficas de los resultados de un estudio temporal realizado en un instrumento FACScan®.
La Figura 3a es un citograma FACScan® de señales FSC frente a FL1 de una muestra clínica con elevados reticulocitos.
La Figura 3b es el histograma FL1 de la población seleccionada de GR de la muestra de sangre de la Figura 3a.
La Figura 4a es un citograma de una muestra de sangre normal en un analizador de hematología de Abbott Laboratories que muestra el log de la Dispersión de Luz del Ángulo Intermedio ("IAS") de las cuatro décadas frente al log FL1 de las cuatro décadas.
La Figura 4b es un histograma FL1 de la población de GR y de la población de reticulocitos seleccionadas de la Figura 4a. La exposición a escala x1 del histograma muestra el Pico GR, y la exposición a escala x5 del histograma exhibe la población de reticulocitos.
La Figura 5a es un citograma de IAS frente a FL1, en un analizador de hematología de Abbott Laboratories, de una muestra de sangre clínica como muy bajos reticulocitos pero elevados GB.
La Figura 5b es un histograma FL1 de la población de GR y de reticulocitos seleccionada de la Figura 5a. Se muestran ambas exposiciones del histograma a escala x1 y x5.
La Figura 6a es un citograma de IAS frente a FL1, en un analizador de hematología de Abbott Laboratories, de una muestra de sangre clínica anticoagulada, con elevados niveles de reticulocitos (20'5%) y GB (96'4 k/L).
La Figura 6b es un histograma FL1 de la población de GR y de reticulocitos seleccionada de la Figura 6a. Se muestran ambas exposiciones del histograma a escala x1 y x5.
La Figura 7 es una representación gráfica de la comparación de los resultados de reticulocitos obtenidos practicando el método del National Committee for Clinical Laboratory Standards ("NCCLS") frente a un método automatizado de la presente invención.
La Figura 8 es una representación gráfica que muestra la comparación de los datos de regresión lineal para los resultados de reticulocitos obtenidos practicando un método de tinción con naranja de tiazol frente a un método automatizado de la presente invención para detectar reticulocitos. Para el análisis fueron utilizadas las mismas muestras clínicas presentadas en la Figura 7.
La Figura 9 es una representación gráfica de la linealidad del % de reticulocitos medidos practicando un método automatizado de la presente invención.
La Figura 10 son espectros de emisión del estudio de la vida media del colorante de cianina Sybr 11 patentado (Molecular Probes, Eugene, OR), unido a ARN, en presencia y ausencia de diversos surfactantes no iónicos. Los reactivos fueron mantenidos a temperatura ambiente durante tres meses y medio.
La Figura 11 son espectros de emisión del estudio de la vida media del colorante de cianina Sybr 11 patentado, unido a ARN, demostrando una estabilidad de cuatro meses bajo refrigeración.
La Figura 12 son espectros de emisión del estudio de la vida media del colorante de cianina Sybr 11 patentado, unido a ARN, demostrando una estabilidad de tres semanas a temperatura elevada.
La Figura 13 son espectros de emisión del estudio temporal del colorante de cianina patentado Sybr 16 (Molecular Probes, Eugene, OR), unido a ARN, en tampón Bis-Tris con y sin 1'0% de copolímero de bloques de Polioxipropileno-Polioxietileno (Pluronic® F127), y almacenado a temperatura ambiente durante seis meses y medio.
La Figura 14 son espectros de emisión del estudio de la vida media del colorante de cianina Sybr 11 patentado, unido a ARN, en diferentes tampones con 0'2% de Pluronic® F127. Todos los reactivos fueron almacenados a temperatura ambiente durante seis semanas.
La Figura 15a es una exposición bidimensional de señales FSC frente a FL1 en el citómetro FACScan®.
La Figura 15b es el histograma FL1 de la población de glóbulos rojos seleccionada de la Figura 15a.
La Figura 15c es un estudio temporal realizado en el citómetro de flujo FACScan®, expresado como % de reticulocitos desde 15 segundos hasta 4'0 minutos.
Descripción detallada de la invención
Las formas de realización de la presente invención constan de métodos y sistemas de reactivos acuosos estables para el rápido y exacto análisis de una muestra de sangre para reticulocitos, utilizando metodologías citométricas de flujo. En general, estas formas de realización tienen que ver con el análisis rápido y simultáneo de reticulocitos y recuentos de células sanguíneas completos ("CSC"), incluyendo glóbulos rojos nucleados ("GRN"). Las formas de realización de la presente invención pueden comprender el empleo de un instrumento analítico y un método para analizar sangre. Generalmente, tal instrumento analítico incluye un analizador de impedancia automatizado. En tal instrumento automatizado está integrado un analizador de dispersión de luz automatizado, y con el analizador de dispersión de luz automatizado está integrado un analizador de fluorescencia automatizado.
En consideración a esta revelación, un analizador automatizado se distingue porque no necesita que intervenga un operario en el análisis de la muestra, a saber, no se necesita ningún nuevo operario después de que el operario presente la muestra en el analizador automatizado. Adicionalmente, un analizador de hematología cuantifica y clasifica células en términos sustancialmente absolutos. Tal analizador utiliza al menos una de las propiedades de impedancia eléctrica y de dispersión óptica de las células para clasificar las células por su tamaño y forma.
Implementaciones de la invención pueden utilizar, generalmente, un analizador de hematología automatizado con un controlador que supervise y controle los diversos analizadores, recoja datos de los analizadores y reporte un resultado. Ilustrando mediante un ejemplo, la integración de los analizadores con un controlador permite a un operario introducir, dentro del controlador, datos acerca de una muestra de sangre completa. El operario selecciona un banco de ensayos a realizar en la muestra de sangre completa, con la ayuda del controlador. El operario presenta la muestra de sangre completa en los analizadores integrados, en un área de procesamiento de las muestras centralizado. El controlador activa los analizadores, permitiendo a los analizadores realizar análisis automáticamente en la muestra de sangre completa, bajo la dirección del controlador. El controlador utiliza los datos obtenidos de los analizadores para formular un resultado. El controlador informa del resultado al operario. Se debe indicar que no se necesita ninguna acción del operario después de que la muestra de sangre completa sea presentada a los analizadores integrados. Debido a que la preparación de la muestra de sangre completa es totalmente automatizada, en una forma de realización preferida se hacen primero pruebas de hematología convencionales con los ensayos de la muestra incubada que siguen. Debido a que los analizadores están integrados con el controlador, el controlador obtiene datos del analizador de hematología y del analizador de citometría de flujo. De este modo, el controlador es capaz de reportar al operario un análisis de sangre combinado del paciente.
Aunque se discutirán detalladamente formas de realización específicas de la invención para clarificar la comprensión, se debe recordar que también son posibles otras formas de realización. También es posible cualquier combinación de elementos de las formas de realización descritas.
En un aspecto de la invención, se proporciona una composición acuosa estable de reactivo. Este reactivo consta de: un colorante de cianina asimétrico capaz de teñir reticulocitos, de aproximadamente 20 mM hasta aproximadamente 50 mM de un tampón seleccionado del grupo que se compone de tampón de imidazol, tampón de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico ("Hepes"), tampón de ácido Bis(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico ("Bis-Tris") y tampón de Tris-Hidroximetil-Aminometano ("Tris"); un pH desde aproximadamente 6'0 hasta aproximadamente 8'0; una osmolaridad ajustada a aproximadamente 230 hasta aproximadamente 340 mOsm/l con una sal alcalina mono o divalente; y un surfactante no iónico (desde aproximadamente 5 mg/dl hasta aproximadamente 1'0 g/dl dependiendo del surfactante) que facilita la permeación de la membrana y estabiliza los colorantes de cianina en una solución acuosa isotónica. Preferentemente, los colorantes son cíclicos sustituidos y exhiben una fluorescencia intensificada al unirse con ADN o ARN. Más preferentemente incluso, el reactivo consta de aproximadamente 0'1 \mug/ml hasta aproximadamente 0'3 \mug/ml de un colorante de cianina asimétrico cíclico sustituido.
Otro aspecto implica métodos para la rápida y continua detección y enumeración de reticulocitos y diferenciales de GR utilizando el presente sistema reactivo inventivo. Tales métodos son distintos debido a la particular ausencia de la necesidad de proporcionar una etapa de incubación independiente. El período mínimo de incubación requerido, de aproximadamente 10 a 60 segundos, esto todo lo que se necesita.
Una forma tal de realización es un método para enumerar reticulocitos de una muestra de sangre completa, aunque diferenciando simultáneamente una alícuota independiente de la muestra para obtener un análisis de células sanguíneas completo ("CSC"). Este método comprende el dirigir una o más alícuotas de la muestra a diversas posiciones dentro de un analizador automatizado para el análisis y diferenciación, mientras una alícuota de reticulocitos de la muestra se combina con un reactivo para tinción. Este reactivo consta de una cantidad de un colorante de cianina asimétrico, para tinción de reticulocitos, de aproximadamente 20 mM hasta aproximadamente 60 mM de una solución de tampón seleccionado del grupo que se compone de tampones de imidazol, Hepes, Bis-Tris y Tris, y de una cantidad de surfactante no iónico, estabilizador del colorante, seleccionado del grupo que se compone de N,N-bis [3-D-Glucon-amidopropil]colamida, n-Dodecil-D-Maltósido, un copolímero de bloques de polioxipropileno-polioxietileno, n-Tetradecil-D-Maltósido, Decanoíl-N-metil-glucamida, n-Dodecil-D-glucopiranósido y n-Decil-D-glucopiranósido, en donde dicho reactivo tiene un pH desde aproximadamente 6'0 hasta aproximadamente 8'0, y una osmolaridad ajustada a aproximadamente 230 hasta aproximadamente 340 mOsm/l con una sal alcalina mono o divalente que no interfiere con el colorante de cianina o precipita en la solución acuosa de reactivo, tal como ClNa, ClK, ClLi, Cl_{2}Ca, Cl_{2}Mg y Cl_{2}Zn. Después, la alícuota combinada de reactivo/reticulocitos es dirigida a una zona sensora óptica de un analizador automatizado. Después de eso, se pasa la alícuota de reactivo/reticulocitos a través de una zona sensora iluminada, esencialmente una celda cada vez, para originar sucesos de fluorescencia y de luz dispersada. Estos sucesos son detectados y, de ahí, se determina el número de reticulocitos presentes en dicha muestra.
Los colorantes asimétricos utilizables con el sistema reactivo de la presente invención tienen, generalmente, las características siguientes:
1.
Absorción máxima: 488 + 20 nm
2.
Alta afinidad de unión por los ácidos nucleicos
3.
Alto rendimiento cuántico: \geq 0'1
4.
Coeficiente de extinción molar: \geq 10.000
5.
Intensificación de la Fluorescencia en la unión a ARN o ADN: \geq 20
6.
Velocidad de permeación de la membrana: < 2 minutos
Típicamente, los colorantes utilizados en este reactivo acuoso inventivo, y en métodos para la enumeración de reticulocitos, son sumamente inestables en ambientes acuosos. En las Figuras 10 a 14 se muestran los datos de estabilidad para varios colorantes ensayados de esta clase.
Una forma de realización del presente sistema reactivo consta de aproximadamente 0'05 \mug/ml hasta aproximadamente 0'5 \mug/ml de Sybr 11, un colorante patentado vendido por Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR), de aproximadamente 20 mM hasta aproximadamente 50 mM de tampón de imidazol, y de aproximadamente 5 mg/dl hasta aproximadamente 20 mg/dl de N,N-bis[3-D-Glucon-amidopropil]colamida ("BIGCHAP"), de aproximadamente 0'02% hasta aproximadamente 0'05% de Proclin® 300 (5-cloro-2-metil-4-isotiazolin-3-ona + 2-metil-4-isotiazolin-3-ona). El pH se ajusta a aproximadamente 6'8 hasta aproximadamente 7'2 con ClH 1N, y se ajusta la osmolaridad con ClNa a aproximadamente 270 hasta aproximadamente 310 mOsm/l.
Un ingrediente principal del sistema reactivo es el colorante. Una clase tal de colorantes son los colorantes de cianina asimétricos tales como los revelados en WO94/24213, "CYCLIC-SUBSTITUTED UNSYMMETRIC DYES". Adicionalmente, los colorantes utilizados en esta invención exhiben una fluorescencia intensificada en la unión a ADN o ARN. Tales colorantes útiles tienen que tener también alta afinidad por el ARN y ADN, y un alto rendimiento cuántico. Se anticipa que se pueden utilizar una diversidad de colorantes de cianina asimétricos, los cuales exhiben las características descritas y reivindicadas aquí. Algunos ejemplos de tales colorantes incluyen, pero no se limitan a, Sybr 11, Sybr 14, Sybr 16, también obtenidos de Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR) ("MPI"). Otros colorantes de cianina asimétricos tales como el Syto 12, originado también en MPI, son útiles también al practicar la presente invención. Se cree que el Syto 12 es un colorante de cianina asimétrico neutro que consta de un sistema de anillo de benzazol sustituido unido, según un puente metino, a un sistema de anillo piridínico o quinoleína.
Un ingrediente adicional del sistema reactivo es un tampón cuyo pKa es desde aproximadamente 6'0 hasta aproximadamente 8'0, y es capaz de mantener la concentración requerida (para teñir ARN o ADN) de colorante de cianina en una solución acuosa, durante un periodo extenso de tiempo. Tales tampones no deberían reaccionar con los colorantes de cianina o con los surfactantes no iónicos utilizados en la práctica de esta invención para estabilizar el colorante. Los tampones ejemplares incluyen Imidazol, Hepes, Bis-Tris, y Tris.
Otro ingrediente del sistema reactivo es un surfactante no iónico. Dependiendo del surfactante o combinación de surfactantes no iónicos que se utilice, la concentración debería ser de aproximadamente 5 mg/dl hasta aproximadamente 1 g/dl. Parece que el surfactante(s) aumenta la velocidad de permeación del colorante de cianina a través de la membrana celular (antes de 30 segundos). Además, la solubilidad y la estabilidad de los colorantes de cianina en una solución acuosa isotónica son intensificadas por el surfactante. Sin embargo, tal surfactante(s) no debería precipitar o reaccionar con los colorantes de cianina o lisar los GR, incluso a bajas concentraciones. Ejemplos de tales surfactantes son, pero no se limitan a, BIGCHAP, n-Dodecil-D-Maltósido, copolímero de bloques de Polioxipropileno-polioxietileno ("Pluronic® F127"), n-Tetradecil-D-Maltósido, Decanoíl-N-metil-glucamida, n-Dodecil-D-glucopiranósido, y n-Decil-D-glucopiranósido.
Otro ingrediente aún del sistema reactivo es una sal alcalina, mono o divalente, para ajustar la osmolaridad del reactivo desde aproximadamente 230 mOsm/l hasta aproximadamente 340 mOsm/l, para evitar la lisis de los glóbulos rojos, incluyendo los reticulocitos, o los glóbulos blancos. Tales sales no deberían reaccionar con ninguno de los colorantes de cianina o precipitar en solución. Ejemplos de tales sales incluyen ClNa, ClK, ClLi, Cl_{2}Ca, Cl_{2}Mg, Cl_{2}Zn y otras.
Un ingrediente opcional es un conservante para prevenir el crecimiento microbiano en el reactivo. Tal conservante no debería cambiar las propiedades de dispersión de luz o de emisión fluorescente de las células o de las células teñidas. Ejemplos de tales conservantes incluyen Proclin® 300, Proclin® 150, azida sódica y otros.
Utilizando el sistema reactivo descrito anteriormente, es posible el análisis rápido de reticulocitos en un citómetro de flujo u otro analizador de hematología automatizado. En una forma de realización, se mezcla 5 \mul de una muestra de sangre completa con 1'0 ml del sistema reactivo revelado y reivindicado aquí, y se aplica la mezcla de muestra/reactivo en un citómetro de flujo disponible comercialmente, a los 30 a 60 segundos de la mezcla, y tan poco como diez (10) segundos. Las Figuras 1a a 1d muestran los resultados de tal método, utilizando una muestra de sangre normal preparada como se describe en el Ejemplo 1.
Una forma de realización adicional de la presente invención permite el análisis rápido y cuantitativo de reticulocitos en un analizador de hematología multiparámetro automatizado de alto rendimiento. La Solicitud de Patente U.S. Nº de serie 08/283.379, titulada "METHOD AND APPARATUS FOR PERFORMING AUTOMATED ANALYSIS", registrada el 1 de agosto de 1994, revela un analizador de hematología automatizado que utiliza señales de dispersión de luz, pérdida de luz axial ("PLA"), y dispersión del ángulo intermedio ("IAS") entre otras, así como detectar diversas señales fluorescentes para permitir que el instrumento diferencie automáticamente células y subclases de células de una muestra de sangre completa.
Generalmente, sin embargo, un método para practicar la presente invención comprende el mezclado de una muestra de sangre completa con un reactivo para teñir el ARN de cualquier reticulocito presente, hacer pasar la muestra, esencialmente una celda cada vez, a través de una celda de flujo óptico iluminada, detectar la luz dispersada y la fluorescencia emitida de ahí, y determinar la cantidad de reticulocitos presentes en la muestra, sin someter la mezcla de muestra/reactivo a una etapa o periodo de incubación independiente. Un reactivo de esta invención consta de aproximadamente 0'1 \mug/ml hasta aproximadamente 0'3 \mug/ml de un colorante de cianina asimétrico; de aproximadamente 20 mM hasta aproximadamente 60 mM de un tampón seleccionado del grupo que se compone de tampones de Imidazol, Hepes, Bis-Tris y Tris; de aproximadamente 5 mg/ml hasta 1'0 g/dl de un surfactante no iónico, dependiendo del surfactante o combinación de surfactantes, y el reactivo tiene un pH desde aproximadamente 6'0 hasta aproximadamente 8'0; y una osmolaridad ajustada a aproximadamente 230 hasta aproximadamente 340 mOsm/l con una sal alcalina mono o divalente.
Para analizar una muestra de sangre completa para el porcentaje así como los recuentos absolutos de reticulocitos en el analizador de hematología multiparámetro descrito anteriormente, se deposita unos 18'75 \mul de una muestra de sangre completa, mediante una sonda de aspiración de muestra, dentro de una copa para GR que contiene unos 7.856 \mul de una solución de diluyente/revestimiento (un salino isotónico), y se mezclan los fluidos. Luego, la muestra diluida es transportada a una abertura de impedancia revestida para determinar electrónicamente los recuentos absolutos de GR de la muestra (ver detalles de la calibración del instrumento para análisis de GR en la Solicitud de Patente U.S. Nº de Serie 08/283.379, titulada "METHOD AND APPARATUS FOR PERFORMING AUTOMATED ANALYSIS", registrada el 1 de agosto de 1994). A un tiempo medio, se transfieren unos 200 \mul de la muestra diluida dentro de otro receptáculo ("copa receptora de reticulocitos"), el cual contiene 600 \mul del reactivo de la presente invención, donde se mezclan. La muestra preparada (mezclada) es transportada luego a la celda de flujo óptico revestida para su detección. El proceso de medición empieza a medida que el corriente celular pasa a través de la celda de flujo, esencialmente una celda cada vez, en una corriente de muestra con fluencia laminar rodeada por una solución de diluyente/revestimiento. El volumen es iluminado por un haz de luz y es unido en las dos dimensiones normales al eje del flujo mediante la corriente celular enfocada hidrodinámicamente, y en la dimensión paralela al eje del flujo mediante el cuello del haz vertical, del haz del láser, que es de unas 17 micras. Cuando se hace este ensayo, la velocidad de flujo de la muestra es aproximadamente de 2'0 \mul por segundo, y el correspondiente volumen sensor iluminado de la corriente de la muestra de GR y reticulocitos se aproxima a un cilindro elíptico con una dimensión de unas 80 x 5 x 17 micras. La dimensión de 17 micras se mide a lo largo del eje del cilindro.
En este momento, y como se muestra en el espacio característico bidimensional de IAS y FL1 del citograma de la Figura 4a, se detecta la presencia de una célula mediante un fotodiodo de dispersión del ángulo intermedio, el cual detecta luz en un cono de 3º a 10º, y un tubo fotomultiplicador ("TFM") que detecta fluorescencia verde, FL1. Cuando las células pasan a través del volumen iluminado mencionado, se generan impulsos y se miden por estos detectores. Luego, las amplitudes de estos impulsos son filtradas, amplificadas, digitalizadas, y almacenadas en modo de listado en el correspondiente espacio característico bidimensional de IAS y FL1. Las células son contadas durante 8 segundos. A la velocidad de flujo y velocidad de dilución descritas antes, con unos recuentos de GR de 5 millones por microlitro de volumen de sangre para un sujeto normal, la velocidad de recuento del acontecimiento resultante sería de 5.950 por segundo. Después se aplican algoritmos a los datos en modo de listado del espacio característico mencionado de IAS y FL1, y se miden los siguientes parámetros en 20 segundos de tiempo de computación:
1. Selección de GR: se excluyen los GB y las plaquetas seleccionando la población de GR, incluyendo reticulocitos, pero excluyendo GB y plaquetas.
2. El porcentaje de reticulocitos: La población de GR seleccionada es reanalizada según el tamaño de sus señales FL1. Se aplica un ajuste logarítmico al histograma FL1 para definir la región que pertenece a GR maduros, y las células cuyas señales FL1 caen dentro de la región son marcadas como reticulocitos. Se computa el % de reticulocitos dividiendo los recuentos de reticulocitos por los recuentos totales de GR.
3. Los recuentos absolutos de reticulocitos: Obtenidos multiplicando el porcentaje de reticulocitos por los recuentos absolutos de GR de la muestra, a partir del modo CSC.
4. Índice de Madurez de los Reticulocitos ("IMR"). El IMR se expresa como el porcentaje de reticulocitos cuyas señales FL1 son más de una (1) desviación estándar ("D.S.") superior a la fluorescencia media de una población normal de reticulocitos.
Tal descripción es meramente por conveniencia y no significa que la expresión del IMR de la presente invención esté limitada a únicamente los algoritmos discutidos aquí.
Los ejemplos siguientes exponen composiciones de reactivo y métodos que incorporan los mismos para el rápido análisis de reticulocitos utilizando técnicas de dispersión de luz y citométricas de flujo por fluorescencia. Se comprenderá que los siguientes ejemplos son solamente con fines ilustrativos, y no pretenden limitar el campo de aplicación de esta invención de ninguna manera.
Ejemplo 1
Se mezclaron cinco (5) microlitros de una muestra clínica con 1'0 ml del reactivo constando de 50 mM de tampón de imidazol, pH ajustado a 7'0 + 0'1 con ClH 1N, 6'4 g/l de ClNa, 0'1 microgramos por ml de Sybr 14 (Molecular Probes, Inc., Eugene OR), 0'2% de Pluronic® F127, y 0'03% de Proclin® 300. Después, la mezcla de muestra/reactivo es aplicada en 30-60 segundos, en un citómetro de flujo FACScan® (Becton Dickinson & Co.), para determinar la velocidad de permeación de la membrana por el colorante en la composición de reactivo. La Figura 1a es una exposición bidimensional de señales de Dispersión Frontal (FSC) frente a fluorescencia verde (FL1); la 1b es el histograma FL1 de la población de glóbulos rojos seleccionada que revela la población de reticulocitos teñidos a la derecha de la población de GR maduros. Las Figuras 1c y 1d muestran los resultados de una segunda muestra clínica expuestos de una manera similar como en las Figuras 1a y 1b respectivamente.
Ejemplo 2
La Figura 2a es un estudio temporal, realizado en el citómetro de flujo FACScan®, expresado como % de reticulocitos durante un periodo de tiempo extendido (de 30 segundos a 30 minutos), y la 2b está expresada como FL1 promedio de reticulocitos. Como se puede ver en las Figuras, el % de reticulocitos alcanza el estado estacionario antes de 30 segundos, y la intensidad de la tinción alcanza aproximadamente el 80% del máximo antes de los 30 segundos. Tal rápida tinción por la presente invención permite la incorporación del método y reactivos revelados aquí en analizadores de hematología automatizados, así como en citómetros de flujo, sin la necesidad de equipo o métodos de incubación independientes.
Ejemplo 3
Se mezclaron cinco (5) microlitros de unas muestras clínicas, con aproximadamente el 15% de reticulocitos, con 1'0 ml del reactivo de la presente invención constando de 50 mM de tampón de imidazol, pH ajustado a 7'0 + 0'1 con ClH 1N, 6'4 g/l de ClNa, 0'2 microgramos/ml de Sybr 11 (Molecular Probes, Inc., Eugene OR), 0'2% de Pluronic® F127, y 0'03% de Proclin® 300. Después, las mezclas de muestra/reactivo fueron aplicadas, antes de 30 segundos, en un citómetro de flujo FACScan® para determinar el % de reticulocitos en las muestras. La Figura 3a es una exposición bidimensional de señales FSC frente a FL1, y la Figura 3b es el histograma FL1 de la población seleccionada de glóbulos rojos. Como muestran los datos, los GB y las plaquetas están bien separados de la población de GR y reticulocitos, la intensidad FL1 de los reticulocitos teñidos es tal que es fácil definir la región de reticulocitos en el histograma FL1 de los glóbulos rojos para el análisis cuantitativo de la concentración de reticulocitos en una muestra de sangre.
Ejemplo 4
Para este ejemplo se utilizó un analizador de hematología multiparámetro automatizado de alto rendimiento (Solicitud de Patente U.S. Nº de Serie 08/283.379, titulada "METHOD AND APPARATUS FOR PERFORMING AUTOMATED ANALYSIS", registrada el 1 de agosto de 1994). Se depositaron, mediante una sonda de aspiración de muestra, 18'75 \mul de una muestra de sangre completa anticoagulada con EDTA de un sujeto normal, en la copa para GR que contiene unos 7.856 \mul de una solución de diluyente/revestimiento (un salino isotónico tamponado con fosfato), y se mezcló. Luego, la muestra diluida fue transportada a una abertura de impedancia revestida, para determinar los recuentos absolutos de GR de la muestra. Al mismo tiempo, se transfirieron unos 200 microlitros de la muestra de sangre completa diluida dentro de la copa para reticulocitos que contiene 600 microlitros del reactivo de la presente invención. Este reactivo contenía 50 mM de tampón de imidazol, pH ajustado a 7'0 + 0'1 con ClH 1N, 6'4 g/l de ClNa, 0'2 microgramos por ml de Sybr 11, 10 mg/ml de BIGCHAP, y 0'03% de Proclin® 300. Después, la mezcla de muestra/reactivo fue transportada a la celda de flujo óptico revestida para la detección de dispersión y fluorescencia. El proceso de detección del sistema ha sido descrito anteriormente, y el contenido completo de la Solicitud de Patente U.S. Nº de Serie 08/283.379, titulada "METHOD AND APPARATUS FOR PERFORMING AUTOMATED ANALYSIS", registrada el 1 de agosto de 1994. El tiempo de permanencia para el transporte de la mezcla de muestra/reactivo puede tan pequeño como diez (10 segundos). La población de GR, incluyendo los reticulocitos, está seleccionada en el citograma IAS frente a FL1 (Figura 4a), y el histograma FL1 de la población seleccionada de GR (Figura 4b) es utilizado para los recuentos de reticulocitos y mediciones del IMR. La exposición 1x del histograma FL1 está aumentada a escala para mostrar el valor máximo de la población de GR, y la exposición x5 muestra la población de reticulocitos. Estos resultados demuestran que es posible analizar una muestra para reticulocitos mientras se determina simultáneamente un análisis de GR, y sin la necesidad de equipo o métodos adicionales para la incubación de la muestra, o de etapas de preparación de la muestra fuera de línea.
Ejemplo 5
Una muestra clínica con baja concentración de reticulocitos y GB elevados, como se determinó por métodos de referencia, es depositada, mediante una sonda de aspiración de muestra, dentro de la copa para GR del instrumento descrito en la Solicitud de Patente U.S. Nº de Serie 08/283.379, la cual contiene unos 7.856 \mul de una solución de diluyente/revestimiento (un salino isotónico), y se mezcló. Luego, la muestra diluida es transportada a la abertura de impedancia revestida para determinar los recuentos absolutos de GR de la muestra. En el intermedio, se transfiere unos 200 microlitros de la muestra diluida dentro de la copa para reticulocitos que contiene 600 microlitros del reactivo de la presente invención compuesto por 50 mM de tampón de imidazol, pH ajustado a 7'0 + 0'1 con ClH 1N, 6'4 g/l de ClNa, 0'2 microgramos por ml de Sybr 11, 0'2% de Pluronic® F127, 2'5 mg/dl de n-Dodecil-D-Maltósido, y 0'03% de Proclin® 300, y se mezcla. Después, la mezcla de muestra/reactivo es transportada a la celda de flujo óptico revestida, para su detección. El proceso de detección del sistema ha sido ya descrito anteriormente. La población de GR, incluyendo los reticulocitos, está seleccionada en el citograma IAS frente a FL1 (Figura 5a), y el histograma FL1 de la población seleccionada de GR (Figura 5b) es utilizado para los recuentos de reticulocitos y mediciones del IMR (los recuentos Retic fueron demasiado bajos para calcular el IMR de esta muestra). Los histogramas FL1 de la Figura 5b están aumentados a escala para mostrar el valor máximo de la población de GR (exposición x1) y la población de reticulocitos (exposición 5x). En esta muestra no es observable ninguna población detectable de reticulocitos.
Ejemplo 6
Para este ejemplo se utilizó una muestra clínica con elevados reticulocitos (20%, como se determinó mediante un método de referencia) y elevados GB (96 k/l). La muestra fue procesada como se describe en el Ejemplo 4. Los resultados están presentados en las Figuras 6a y 6b. Como muestran los datos, la presente invención excluye exactamente los GB y las plaquetas, y permite identificar y contar los reticulocitos oscuros y los brillantes. El sistema produjo un valor elevado del IMR del 69'2% en esta muestra, utilizando el algoritmo descrito anteriormente.
Ejemplo 7
Se analizaron setenta y siete (77) muestras clínicas en un analizador de hematología multiparámetro de alto rendimiento, como se describe en el Ejemplo 4, y también en un citómetro de flujo FACScan® como se describe en el Ejemplo 1, pero utilizando un método de naranja de tiazol (NT) que requiere 30 minutos de incubación a temperatura ambiente (Patente U.S. 4.883.867). También se realizó el método de referencia NCCLS (ver sección Técnica Anterior para detalle) en cada muestra. Después, los resultados del método inventivo presente, sin incubación, fueron comparados con los de los métodos del NT y NCCLS. En las Figuras 7 y 8 están presentados los trazados gráficos de regresión lineal. Como muestran los datos, los resultados de la presente invención tienen buena correlación con los del método microscópico NCCLS (R = 0'982, pendiente = 1'05, interceptación con Y = 0'002) y el método del NT (R = 0'986, pendiente = 0'964, interceptación con Y = 0'005).
Ejemplo 8
Se obtuvieron dos muestras de sangre completa de conejo anticoagulada con EDTA, una de un conejo normal (muestra nº 1) y otra de un conejo con reticulocitosis (muestra nº 2). La muestra nº 1 contenía 1'9% de reticulocitos y la muestra nº 2 contenía sobre el 90% de reticulocitos. Se prepararon muestras para linealidad según el protocolo siguiente:
1. La concentración de GR de ambas muestras fue ajustada a 3'5 + 0'05 M/l.
2. Se prepararon seis (6) niveles de muestras para linealidad mezclando las dos muestras como se muestra en la Tabla abajo:
Nº de Tubo Muestra nº 1 Muestra nº 2
1 0'00 ml 1'50 ml
2 0'30 ml 1'20 ml
3 0'60 ml 0'90 ml
4 0'90 ml 0'60 ml
5 1'20 ml 0'30 ml
6 1'35 ml 0'15 ml
3. Las muestras fueron analizadas en el analizador de hematología de la Solicitud de Patente U.S. Nº de Serie 08/283.379.
4. Se calcularon los valores teóricos para el % de reticulocitos y el recuento absoluto por \mul de la muestra de sangre completa, según la ecuación siguiente:
% Teórico Reticulocitos de la muestra = [(n/1'5) x %A] + [(m/1'5) x %B] x 100
donde
n = volumen de muestra nº 1 en la muestra para linealidad
m = volumen de muestra nº 2 en la muestra para linealidad
1'5 = volumen total de la muestra para linealidad
%A = % de Reticulocitos en la muestra nº 1 no diluida
%B = % de Reticulocitos en la muestra nº 2 no diluida
Nº Absoluto de Reticulocitos Teóricos = [(n x nº A) + (m x nº B)]/1'5 x %
Teórico de Reticulocitos de la muestra
donde:
n = volumen de muestra nº 1 en la muestra para linealidad
m = volumen de muestra nº 2 en la muestra para linealidad
1'5 = volumen total de la muestra para linealidad
nº A = nº de Reticulocitos en la muestra nº 1 no diluida
nº B = nº de Reticulocitos en la muestra nº 2 no diluida
5. Se trazó la curva de linealidad utilizando la abscisa para los valores teóricos y la ordenada para los valores obtenidos del instrumento de hematología multiparámetro.
Los resultados están presentados en la Figura 9. Como muestran los datos, el método y reactivo de la presente invención producen una respuesta lineal hasta una concentración de reticulocitos del 90%.
Ejemplo 9
En las Figuras 10-14 se muestra la estabilidad de varios reactivos preparados según la presente invención, en los que se evalúan diversos surfactantes. Esto se lleva a cabo añadiendo ARN a los reactivos y escaneando los espectros de emisión de los tintes de cianina para ácidos nucleicos, unidos a ARN, en un instrumento HITACHI F4500® (488 nm de excitación) según el protocolo siguiente:
1. Se prepararon soluciones de ARN (ARN de hígado de ternero, Cat. Sigma Nº R7250) en agua desionizada.
2. Se añadieron 100 \mul de cualquiera de la soluciones madre de ARN a 1'6 ml de un reactivo de ensayo de la presente invención, y se mezclaron.
3. Luego se escaneó el espectro de emisión del tinte de cianina para ácidos nucleicos, unido a ARN, desde 450 nm hasta 650 nm en un instrumento HITACHI F4500® (488 nm de excitación). La escala total para el colorante de cianina unido a ARN está establecida en 2.000 para todos los reactivos de ensayo.
Ejemplo 10
La Figura 10 son los espectros de emisión del colorante Sybr 11 (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR), unido a ARN, en 50 mM de tampón de imidazol preparado como se describe en el Ejemplo 4, excepto que se evaluaron 5 surfactantes distintos para su eficacia en estabilizar el colorante de cianina, Sybr 11, en una solución acuosa. Todos los reactivos fueron almacenados a temperatura ambiente durante un periodo de 3'5 meses. Empezando por el pico máximo:
A
= BIGCHAP (10 mg %)
B
= Maltósido (5 mg %)
C
= Pluronic® F127 (0'2%)
D
= Ácido cólico, sal de Na (10 mg %)
E
= ningún surfactante añadido
F
= Ácido caprílico, sal de Na (10 mg %)
\newpage
Como muestran los datos, el BIGCHAP, el Maltósido y el Pluronic® F127 son muy eficaces para conservar el colorante en una solución acuosa tamponada, mientras que la sal de Na del Ácido cólico, y la sal de Na del Ácido caprílico no lo fueron. En realidad, añadiendo Ácido caprílico al reactivo, se acortó la vida media del colorante.
Ejemplo 11
La Figura 11 son los espectros de emisión del colorante de cianina Sybr 11, unido a ARN, preparado como se describe en el Ejemplo 4, con los surfactantes BIGCHAP o Pluronic® F127, y almacenado a 4ºC durante 4 meses. Empezando con el pico máximo:
A
= reactivo de control recién preparado
B
= BIGCHAP (10 mg %)
C
= Pluronic® F127 (0'2%)
D
= Pluronic® F127 (1'0%)
E
= sin surfactante
Como se puede ver en la Figura, no hay deterioro significativo del colorante en la presente invención durante el periodo de ensayo de 4 meses.
Ejemplo 12
La Figura 12 son los espectros de emisión del colorante de cianina Sybr 11, unido a ARN, demostrando una estabilidad de tres (3) semanas a elevada temperatura, en el reactivo de la presente invención con 5 mgs % de BIGCHAP. Los reactivos de ensayo fueron preparados como se describe en el Ejemplo 4, y la adición de ARN fue preparada según el protocolo del Ejemplo 9. Empezando por el pico máximo:
A
= 4ºC
B
= 25ºC
C
= 37ºC
D
= 45ºC
Como demuestran los datos, la adición del surfactante no iónico, BIGCHAP, a una solución acuosa taponada apropiada, hace que el colorante de cianina sea menos sensible a las temperaturas elevadas y, por lo tanto, más estable.
Ejemplo 13
La Figura 13 son los espectros de emisión del Sybr 16 unido a ARN, en tampón Bis-Tris, con y sin 1'0% de Pluronic® F127. Los reactivos fueron preparados como se describe en el Ejemplo 4, excepto que el tampón de imidazol fue reemplazado con tampón Bis-Tris, y el Sybr 11 fue reemplazado con colorante Sybr 16 (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) y almacenados a temperatura ambiente durante 6'5 meses. Empezando por el pico máximo:
A
= reactivo Sybr 16 con 1'0% de Pluronic® F127
B
= Sybr 16 en tampón Bis-Tris sin ningún surfactante
C
= Sybr 16 en tampón de imidazol sin ningún surfactante
D
= Sybr 16 en tampón de Glicil-glicina con 1'0% de Pluronic® F127
Los resultados demuestran que la estabilización de este colorante de cianina requiere una adecuada combinación de un tampón y un surfactante.
Ejemplo 14
La Figura 14 son los espectros de emisión del colorante de cianina Sybr 11, unido a ARN, en diferentes tampones junto con 0'2% de Pluronic® F127. Todos los reactivos fueron almacenados a temperatura ambiente durante seis semanas. Empezando por el pico máximo:
\newpage
A
= tampón Tris
B
= tampón Bis-Tris
C
= imidazol
D
= tampón Hepes
E
= tampón de Glicil-glicina
F
= tampón de fosfato
Como muestran estos datos, los tampones Tris, Bis-Tris e Imidazol conservan el bien el colorante, mientras que los tampones de Glicil-glicina y de fosfato no.
Ejemplo 15
Se mezclaron cinco (5) microlitros de una muestra normal, con aproximadamente un 2'3% de reticulocitos, con 1'0 ml del reactivo de la presente invención compuesto de 50 mM de tampón Tris, pH ajustado a 7'0 + 0'1 con ClH 1N, osmolaridad ajustada a 290 mOsm/l con ClNa, 0'2 \mug/ml de Syto 12 (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR), 0'2% de Pluronic® F127, y 0'03% de Proclin® 300. Después, las mezclas de muestra/reactivo fueron aplicadas en un citómetro de flujo FACScan®, antes de 15 segundos, para determinar el % de reticulocitos en las muestras. La Figura 15a muestra la exposición bidimensional de señales FSC frente a FL1 del citómetro FACScan®, y la Figura 15b muestra el histograma FL1 de la población seleccionada de glóbulos rojos. La Figura 15c es un estudio temporal realizado en el citómetro de flujo FACScan®, expresado como % de reticulocitos, desde 15 segundos hasta 4'0 minutos. Como se puede ver en las Figuras, la selección de GR + reticulocitos separa limpiamente los reticulocitos de las plaquetas y los GB, y la tinción de reticulocitos es tan rápida que el % de reticulocitos alcanza el estado estacionario antes de 15 segundos. Tal rápida tinción permite la incorporación de la detección en analizadores de hematología automatizados, así como en citómetros de flujo.

Claims (15)

1. Un reactivo acuoso para tinción de ácidos nucleicos comprendiendo: una cantidad de un colorante de cianina asimétrico para tinción de reticulocitos; desde unos 20 mM hasta unos 60 mM de una solución de tampón seleccionado del grupo que se compone de tampones de imidazol, Hepes, Bis-Tris y Tris; y una cantidad de un surfactante no iónico, estabilizador del colorante, seleccionado del grupo que se compone de N,N-bis[3-D-Glucon-amidopropil]colamida, n-Dodecil-D-Maltósido, un copolímero de bloques de polioxipropileno-polioxietileno, n-Tetradecil-D-Maltósido, Decanoíl-N-metil-glucamida, n-Dodecil-D-glucopiranósido y n-Decil-D-glucopiranósido,
en donde dicho reactivo tiene un pH desde aproximadamente 6'0 hasta aproximadamente 8'0, y una osmolaridad ajustada a aproximadamente 230 hasta aproximadamente 340 mOsm/l con una sal alcalina mono o divalente que no interfiere con el colorante de cianina o precipita en la solución acuosa de reactivo.
2. El reactivo de la Reivindicación 1, en donde el colorante de cianina asimétrico es cíclico sustituido.
3. El reactivo de la Reivindicación 1, en donde dicho colorante de cianina asimétrico se selecciona del grupo que se compone de Sybr 11, Sybr 14, Sybr 16 y Syto 12.
4. El reactivo de la Reivindicación 1, en donde el colorante de cianina asimétrico es Sybr 11.
5. El reactivo de la Reivindicación 3, en donde la cantidad de colorante de cianina asimétrico, para tinción de reticulocitos, es desde aproximadamente 0'1 \mug/ml hasta aproximadamente 0'3 \mug/ml.
6. El reactivo de la Reivindicación 5, en donde el tampón es imidazol.
7. El reactivo de la Reivindicación 5, en donde el surfactante no iónico está presente en una cantidad desde aproximadamente 0'1 g/dl hasta aproximadamente 1'0 g/dl.
8. El reactivo de la Reivindicación 7, en donde el surfactante no iónico es un copolímero de bloques de polioxipropileno-polioxietileno.
9. El reactivo de la Reivindicación 5, en donde el surfactante no iónico está presente en una cantidad desde aproximadamente 5 mg/dl hasta aproximadamente 20 mg/dl.
10. El reactivo de la Reivindicación 9, en donde el surfactante no iónico es N,N-bis[3-D-Glucon-amidopropil]colamida.
11. El reactivo de la Reivindicación 1, constando además de una cantidad eficaz de conservante inhibidor del crecimiento bacteriano.
12. El reactivo de la Reivindicación 11, en donde el conservante se selecciona del grupo que se compone de Proclin® 300, Proclin® 150, y azida sódica.
13. Un método para enumerar reticulocitos de una muestra de sangre completa mientras se diferencia simultáneamente una alícuota por separado de la muestra para obtener un análisis de células sanguíneas completo ("CSC"), en donde dicho método comprende:
a) dirigir una o más alícuotas de la muestra hacia diversas posiciones dentro de un analizador automatizado para el análisis y diferenciación;
b) combinar una alícuota de reticulocitos de la muestra con un reactivo que consta de una cantidad de un colorante de cianina asimétrico para tinción de reticulocitos, de aproximadamente 20 mM hasta aproximadamente 60 mM de una solución de tampón seleccionado del grupo que se compone de tampones de imidazol, Hepes, Bis-Tris y Tris, y de una cantidad de un surfactante no iónico, estabilizador del colorante, seleccionado del grupo que se compone de N,N-bis[3-D-Glucon-amidopropil]colamida, n-Dodecil-D-Maltósido, un copolímero de bloques de polioxipropileno-polioxietileno, n-Tetradecil-D-Maltósido, Decanoíl-N-metil-glucamida, n-Dodecil-D-glucopiranósido y n-Decil-D-glucopiranósido, en donde dicho reactivo tiene un pH desde aproximadamente 6'0 hasta aproximadamente 8'0, y una osmolaridad ajustada a aproximadamente 230 hasta aproximadamente 340 mOsm/l con una sal alcalina mono o divalente que no interfiere con el colorante de cianina o precipita en la solución acuosa de reactivo, mientras se dirige la alícuota combinada de reactivo/reticulocitos hacia una zona sensora óptica de un analizador automatizado;
c) provocar que la alícuota combinada de reactivo/reticulocitos pase a través de la zona sensora, esencialmente una celda cada vez;
d) iluminar la muestra teñida en dicha zona sensora óptica con un haz de luz incidente para originar acontecimientos de fluorescencia;
e) medir los acontecimientos de fluorescencia, para los reticulocitos en dicha solución de la muestra, a medida que los reticulocitos teñidos pasan a través de dicha zona sensora óptica; y
f) determinar el número de reticulocitos presentes en dicha muestra, contando los acontecimientos de fluorescencia medidos de los reticulocitos teñidos.
14. El método de la Reivindicación 20, en donde los colorantes de cianina cíclicos sustituidos son seleccionados del grupo que se compone de Sybr 11, Sybr 14 y Sybr 16.
15. Un método para enumerar reticulocitos de una muestra de sangre completa, en donde dicho método comprende:
a) combinar una alícuota de la muestra con un reactivo que consta de una cantidad de un colorante de cianina asimétrico para tinción de reticulocitos, de aproximadamente 20 mM hasta aproximadamente 60 mM de una solución de tampón seleccionado del grupo que se compone de tampones de imidazol, Hepes, Bis-Tris y Tris, y de una cantidad de un surfactante no iónico, estabilizador del colorante, seleccionado del grupo que se compone de N,N-bis[3-D-Glucon-amidopropil]colamida, n-Dodecil-D-Maltósido, un copolímero de bloques de polioxipropileno-polioxietileno, n-Tetradecil-D-Maltósido, Decanoíl-N-metil-glucamida, n-Dodecil-D-glucopiranósido y n-Decil-D-glucopiranósido, en donde dicho reactivo tiene un pH desde aproximadamente 6'0 hasta aproximadamente 8'0, y una osmolaridad ajustada a aproximadamente 230 hasta aproximadamente 340 mOsm/l con una sal alcalina mono o divalente que no interfiere con el colorante de cianina o precipita en la solución acuosa de reactivo, mientras se dirige la alícuota combinada de reactivo/reticulocitos hacia una zona sensora óptica de un analizador automatizado;
b) provocar que la alícuota de reactivo/reticulocitos pase a través de la zona sensora, esencialmente una celda cada vez;
c) iluminar la muestra teñida en dicha zona sensora óptica con un haz de luz incidente para originar acontecimientos de fluorescencia;
d) medir los acontecimientos de fluorescencia, para los reticulocitos en dicha solución de la muestra, a medida que los reticulocitos teñidos pasan a través de dicha zona sensora óptica; y
e) determinar el número de reticulocitos presentes en dicha muestra, contando los acontecimientos de fluorescencia medidos de los reticulocitos teñidos.
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