ES2244955T3

ES2244955T3 - Factor derivado del estroma humano.

Info

Publication number: ES2244955T3
Application number: ES94116169T
Authority: ES
Inventors: Tasuku Honjo; Michio Shirozu; Hideaki C/O Minase Research Institute Tada
Original assignee: Ono Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Ono Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1993-10-14
Filing date: 1994-10-13
Publication date: 2005-12-16
Anticipated expiration: 2014-10-13
Also published as: PT657468E; TW302369B; JPH07188294A; US5563048A; DE69434428D1; KR100210308B1; EP0657468B1; JP3705732B2; ATE299891T1; CA2117953A1; JP2001017191A; CA2117953C; KR950011618A; JP3367581B2; DE69434428T2; DK0657468T3; EP1557428A1; US5756084A; JP2005336198A; CN1062908C

Abstract

La presente invención está relacionada con polipéptidos que poseen el aminoácido mostrado en la SEC. ID. Nº 1 o 5, y con el ADN que codifica un polipéptido de este tipo. Más particularmente, la presente invención está relacionada con ADN que posee la secuencia nucleotídica mostrada en la SEC. ID. Nº 2 o 3, y 6 o 7. Una realización adicional de la invención proporciona vectores de replicado y expresión comprendiendo ADN conforme a la invención. Los vectores pueden ser, por ejemplo, vectores plásmido, virus o fago, provistos de un origen de replicado, opcionalmente un promotor para la expresión de dicho ADN y, opcionalmente, un regulador del promotor. El vector puede contener uno o más genes marcadores seleccionables, por ejemplo un gen de resistencia a la ampicilina. El vector puede ser utilizado in vitro, por ejemplo, en la producción de ARN correspondiente al ADN, o ser utilizado para transfectar o transformar una célula huésped. Otra realización adicional de la invención proporciona células huésped transformadas o transfectadas con los vectores para el replicado y expresión del ADN conforme a la invención, incluyendo las SEC. ID. Núms. 2 o 3, y 6 o 7 de ADN, o el marco de lectura abierto de las mismas. Las células serán escogidas para ser compatibles con el vector y, por ejemplo, pueden ser procedentes de bacterias, levadura, insecto o mamífero. Otra realización adicional de la invención proporciona un método para la producción de un polipéptido, el cual comprende el cultivo de células huésped de la presente invención bajo condiciones efectivas para la expresión de un polipéptido de la invención. Preferiblemente, además, tal método es llevado a cabo bajo condiciones en las que el polipéptido de la invención es expresado y, a continuación, es producido por las células huésped.

Description

Factor derivado del estroma humano.

Nuevos Polipéptidos y ADNs que los codifican.

Campo de la invención

La presente invención está relacionada con nuevos polipéptidos producidos de la línea celular humana pro-B y con ADNs que los codifican.

EP-A-O 607 054, el cual es un documento sobre antecedentes en este campo, en el Artículo 54(3) y en (4) EPC, describe un proceso para la construcción de una librería de ADNc, la cual posee una selectividad para los péptidos señal que hace posible el identificar eficientemente un polipéptido desconocido y útil que comprenda un péptido señal. Ha sido identificado utilizando dicho proceso un nuevo polipéptido, consistente en 89 aminoácidos (incluyendo un péptido señal) producido por una línea celular estromal, el cual es útil como un agente para la prevención o tratamiento de, por ejemplo, la anemia, la leucopenia o infecciones, y similares, y ADNs que codifican para dicho polipéptido.

Science 261, pag. 600-603 (1993) describe un método para clonar -sin utilizar ensayos funcionales específicos- ADNs complementarios (ADNcs) que llevan secuencias señal aminoterminal específicas, tales como las que codifican moléculas transductoras de señal intercelular y receptores. El vector utilizado en este sistema dirigió la expresión de la superficie celular de las proteínas de fusión receptoras de interleukin-2 cuando fueron clonados insertos con secuencias señal con el armazón y orientación correctos. Fue construida una librería de expresión ADNc partiendo de una línea celular estromal de médula espinal, la cual contenía ADNcs enriquecidos con la porción 5' (el tamaño medio fue de 400 pares de bases). Fueron clonados dos ADNcs que codificaban moléculas de citoquina putativas, factor 1\alpha derivado de célula estromal (SDF-1\alpha) y SDF-1\beta, los cuales pertenecen a la superfamilia de la proteína inflamatoria macrofágica-intercrine.

En Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Vol. 91, pag. 2305-2309 (1994) es indicado que se sabe que la generación y proliferación de progenitores de células B tempranas requiere de moléculas derivadas de célula estromal. Se descubrió que una línea celular estromal, PA6, produce un mediador soluble, el cual era diferente del interleukin 7 (IL-7), y factor de células madre, y ayudaba a la proliferación de un clon de célula pre-B dependiente de célula estromal, el DW34. Fue aislado por medio de clonaje de expresión un clon de ADNc codificante de este factor estimulador de crecimiento DW34. La secuencia nucleotídica contenía un marco de lectura abierto único substancial de 267 nucleótidos, codificando un polipéptido de 89 aminoácidos. La secuencia aminoacídica de esta citoquina, llamada factor estimulador de crecimiento de célula pre-B (PBSF), reveló que es un miembro de la subfamilia de la "intercrine". El PBSF recombinante estimuló por sí mismo la proliferación de células DW34 y, además, aumento sinérgicamente el crecimiento de DW34, así como de los progenitores de células en la médula espinal en presencia de IL-7.

Propósito de la invención

La presente invención está relacionada con nuevos polipéptidos producidos por células hematopoyéticas y con ADNs que los codifican. Se sabe que existen muchos tipos de factores de crecimiento y diferenciación, tales como el interleukin (IL) de células hematopoyéticas.

Este hecho sugiere que los factores que poseen funciones similares o nuevas podrían ser secretados por las mismas, adicionalmente a los factores secretados conocidos ya descubiertos.

Los presentes inventores han prestado atención a este punto y han intentado encontrar un nuevo factor (polipéptido) producido por las células hematopoyéticas. La presente invención fue seleccionada por medio de hibridización cruzada utilizando ADNc de SDF-1 murino (Factor Derivado Estromal 1; descrito en la Solicitud de Patente japonesa nº 5-22098) como una sonda y, de esta forma, se obtuvo SDF-1 humano (2 tipos, \alpha y \beta) producido de células humanas pro-B y, a continuación, se completó la presente invención.

Cuando son buscados con un ordenador polipéptidos que posean secuencias idénticas o altamente homólogas con las del polipéptido de la presente invención y los ADNs que los codifican, no se encuentra ninguno. De esta forma, ha sido probado que el polipéptido de la presente invención y el ADN que codifica para el mismo son nuevos.

(1) un polipéptido poseyendo una secuencia aminoacídica mostrada en la SEC. ID. Nº 1.

(2) un ADN que posee una secuencia nucleotídica mostrada en la SEC. ID. Nº 2, y

(3) un ADN poseyendo una secuencia nucleotídica mostrada en la SEC. ID. Nº 3.

(4) un polipéptido poseyendo una secuencia aminoacídica mostrada en la SEC. ID. Nº 5.

(5) un ADN poseyendo una secuencia nucleotídica mostrada en la SEC. ID. Nº 6 y,

(6) un ADN poseyendo una secuencia nucleotídica mostrada en la SEC. ID. Nº 7.

La presente invención está relacionada con polipéptidos que poseen el aminoácido mostrado en la SEC. ID. Nº 1 o 5, y con el ADN que codifica un polipéptido de este tipo. Más particularmente, la presente invención está relacionada con ADN que posee la secuencia nucleotídica mostrada en la SEC. ID. Nº 2 o 3, y 6 o 7.

Una realización adicional de la invención proporciona vectores de replicado y expresión comprendiendo ADN conforme a la invención. Los vectores pueden ser, por ejemplo, vectores plásmido, virus o fago, provistos de un origen de replicado, opcionalmente un promotor para la expresión de dicho ADN y, opcionalmente, un regulador del promotor. El vector puede contener uno o más genes marcadores seleccionables, por ejemplo un gen de resistencia a la ampicilina. El vector puede ser utilizado in vitro, por ejemplo, en la producción de ARN correspondiente al ADN, o ser utilizado para transfectar o transformar una célula huésped.

Otra realización adicional de la invención proporciona células huésped transformadas o transfectadas con los vectores para el replicado y expresión del ADN conforme a la invención, incluyendo las SEC. ID. Núms. 2 o 3, y 6 o 7 de ADN, o el marco de lectura abierto de las mismas. Las células serán escogidas para ser compatibles con el vector y, por ejemplo, pueden ser procedentes de bacterias, levadura, insecto o mamífero.

Otra realización adicional de la invención proporciona un método para la producción de un polipéptido, el cual comprende el cultivo de células huésped de la presente invención bajo condiciones efectivas para la expresión de un polipéptido de la invención. Preferiblemente, además, tal método es llevado a cabo bajo condiciones en las que el polipéptido de la invención es expresado y, a continuación, es producido por las células huésped.

El ADN conforme a la invención puede ser insertado también en los vectores descritos más arriba con una orientación antisentido, con el fin de ser válido para la producción de ARN antisentido. El ARN antisentido puede ser producido también por medios sintéticos. Tal ARN antisentido puede ser utilizado en un método de control de los niveles de un polipéptido de la invención en una célula.

Son descritos anticuerpos monoclonales o policlonales para un polipéptido conforme a la invención. Además, se describe un proceso para la producción de anticuerpos monoclonales o policlonales para los polipéptidos de la invención. Los anticuerpos monoclonales pueden ser preparados por medio de tecnología del hibridoma convencional, utilizando un polipéptido de la invención, o un fragmento del mismo, como un inmunogen. Lo anticuerpos policlonales pueden ser preparados también por medios convencionales, los cuales comprenden la inoculación en un animal huésped -por ejemplo, una rata o un conejo- de un polipéptido de la invención y la recuperación del suero inmune.

La presente invención proporciona también composiciones farmacéuticas conteniendo un polipéptido de la invención, junto con un diluyente y/o portador farmacéuticamente aceptable.

El polipéptido de la presente invención incluye uno, al cual le falta una parte de su secuencia de aminoácido (por ejemplo, un polipéptido que comprende la única secuencia esencial que revela una actividad biológica en una secuencia aminoacídica mostrada en la SEC. ID. Num. 1 o 5), uno en el cual una parte de su secuencia aminoacídica es reemplazada por otros aminoácidos (por ejemplo, aquéllos reemplazados por un aminoácido que posee una propiedad similar), y uno en el cual son añadidos o insertados otros aminoácidos en una parte de su secuencia aminoacídica, así como aquéllos que poseen la secuencia aminoacídica mostrada en las SEC. ID. Num. 1 o 5.

Como es bien sabido, existen de uno a seis tipos de codones para codificar un aminoácido (por ejemplo, son conocidos un tipo de codón para Met, y seis tipos de codón para leucina (Leu)). Por lo tanto, la secuencia nucleotídica de ADN puede ser cambiada con el fin de codificar el polipéptido que posea la misma secuencia aminoacídica.

El ADN especificado en (2) y (5) son la secuencia en su forma natural.

El ADN mostrado en (3) y (6) indica la secuencia de ADN especificada en (2) y (5) con una región no traducida.

Un péptido señal es una región hidrofóbica situada inmediatamente aguas abajo del aminoácido Met señalizador del comienzo de traducción. Se da por sentado que el péptido señal en el polipéptido de la presente invención reside en una región que va desde Met en la posición 1 a Gly en la posición 21 en la secuencia aminoacídica representada por la SEC. ID. Num. 1 o 5. La región esencialmente responsable de la expresión de actividad biológica corresponde a la parte de las secuencias aminoacídicas de las SEC. ID. Nums. 1 y 5 a las que les faltan los péptidos señal, es decir, la parte de proteína madura. De esta forma, los péptidos señal nunca están relacionados con la actividad.

El ADN que posee una secuencia nucleotídica mostrada en la SEC. ID. Num. 3 o 7 puede ser preparado conforme a los siguientes métodos, es decir:

(i) el aislamiento del ARNm de una célula, la cual produce el polipéptido de la presente invención (por ejemplo, la línea celular humana pro-B),

(ii) la preparación de una primera hebra (ADNc de hebra sencilla) del ARNm así obtenido, seguido de la preparación de una segunda hebra (ADNc de hebra doble) (síntesis de ADNc);

(iii) la inserción del ADNc así obtenido en un vector fago apropiado,

(iv) la transfección del fago recombinante en células huésped (construcción de librería de ADNc),

(v) el escrutinio mediante hibridación en placa de una librería de ADNc, utilizando ADNc de SDF-1 murino como una sonda,

(vi) la preparación de ADN del fago conteniendo el clon positivo obtenido, seguido del subclonaje del ADNc, el cual es cortado en un vector plásmido, y seguido de la preparación del mapa de restricción enzimática,

(vii) la determinación de la secuencia nucleotídica de cada fragmento cortado con la enzima de restricción, seguido del ensamblaje de la secuencia en su longitud total.

Explicada en detalle, la fase (i) puede ser llevada a cabo siguiendo el método de Okayama, H. et al (descrito en Method in Enzymology, vol. 154, p. 3, 1987) después de que una línea celular humana pro-B es estimulada por medio de un estimulante apropiado (por ejemplo, IL-1, etc.) o sin estimulación.

Un ejemplo de células que secretan los polipéptidos de la presente invención es, preferiblemente, la línea celular humana pro-B FLEB14. Esta línea celular humana FLEB14 puede ser proporcionada por 1st Lecture Medicinal Chemistry, School of Medicine, Kyoto University.

Las fases (ii), (iii) y (iv) son una serie de fases para la preparación de una librería de ADNc, y pueden ser llevadas a cabo siguiendo el método de Glubler & Hoffman (Gene, vol. 25, pp. 263, 1983) con una ligera modificación.

Como ejemplos del vector utilizado en la fase (iii), son conocidos muchos vectores plásmidos (por ejemplo, pB322, pBluescript, etc.), vectores fago (por ejemplo, \lambdagt10, \lambdaDASH II, etc.), y es preferido un vector fago \lambdagt10 (43,3 kpb, Stratagene).

La célula huésped utilizada en la fase (iv) es preferiblemente la E.coli NM514 (Stratagene).

Las fases (v) y (vi) pueden ser llevadas a cabo conforme al método descrito en Molecular Cloning (escrito por Sam Brook, Fritsh, E.F. y Maniatis, T., publicado por Cold Spring Harbor Laboratory Press en 1989).

La secuenciación en la fase (vii) puede ser llevada a cabo conforme al método de Maxam-Gilbert, o al método de terminación dideoxi.

Es necesario el confirmar que el ADNc obtenido cubre la longitud total o casi total del ARNm intacto. Esta confirmación puede ser llevada a cabo por medio del análisis Northern, utilizando el ADNc como una sonda (ver Molecular Cloning).

Si el tamaño del ARNm obtenido de la banda hibridizada y el tamaño del ADNc son casi iguales, se pensará que el ADNc es de casi la longitud total.

Una vez que son determinadas las secuencias nucleotídicas mostradas en las SEC. ID. Nums. 2, 3, 6, 7, puede ser obtenido el ADN de la presente invención por medio de síntesis química, del método de PCR, o por hibridización, haciendo uso de un fragmento del ADN de la presente invención como una sonda. Adicionalmente, el ADN de la presente invención puede ser obtenido en una cantidad deseada al transformar con un vector ADN insertado -un ADN de la presente invención- en un huésped adecuado, seguido del cultivo del transformante.

Los polipéptidos de la presente invención (mostrados en las SEC. ID. Num. 1 o 5) pueden ser preparados por medio de:

(1) el aislamiento y purificación de un organismo o de una célula cultivada,

(2) la síntesis química, o

(3) la utilización de una técnica biotecnológica,

preferiblemente, por medio del método descrito en (3).

Ejemplos de sistemas de expresión a la hora de preparar un polipéptido utilizando una técnica biotecnológica es, por ejemplo, el sistema de expresión de la bacteria, levadura, célula de insecto o célula de mamífero.

Por ejemplo, la expresión en E.coli puede ser llevada a cabo añadiendo el codón iniciador (ATG) al extremo 5' de un ADN que codifica la proteína madura, conectando el ADN así obtenido aguas abajo de un promotor adecuado (por ejemplo, el promotor trp, el promotor lac, el promotor IPL, el promotor T7, etc.) y, a continuación, insertándolo en un vector (por ejemplo, pBR322, pUC18, pUC19, etc.), el cual funciona en una hebra de E.coli para preparar un vector de expresión.

Cuando es utilizado un péptido señal de bacteria (por ejemplo, el péptido señal de pel B), el polipéptido deseado puede ser producido también en periplasma. Además, una proteína de fusión puede ser también producida fácilmente con otros polipéptidos.

Además, la expresión en una célula de mamífero puede ser llevada a cabo, por ejemplo, insertando el ADN mostrado en la SEC. ID. Num. 3 o 6 aguas abajo de un promotor adecuado (por ejemplo, el promotor SV40, el promotor LTR, el promotor de metalotioneina, etc.) en un vector apropiado (por ejemplo, el vector de retrovirus, el vector del virus del papiloma, el vector del virus vaccinia, el vector SV40, etc.) con el fin de obtener un vector de expresión, y transfectando una célula de mamífero adecuada (por ejemplo, célula COS7 de mono, célula CHO de hámster chino, célula L murina, etc.) con el vector de expresión así obtenido y, a continuación, cultivando el transformante en un medio apropiado para conseguir un polipéptido deseado en el medio de cultivo. El polipéptido así obtenido puede ser aislado y purificado por medio de métodos bioquímicos convencionales.

Efectos de la invención

El polipéptido de la presente invención es producido y secretado en células pro-B, de tal forma que puede ser utilizado para enfermedades relacionadas con un bajo crecimiento o una proliferación anormal de células hematopoyéticas, mejora neuronal o depresión, mejora inmunológica y depresión, por ejemplo, enfermedades inflamatorias (artritis reumatoide, colitis ulcerativa, etc.), citopenia de células madre hematopoyéticas después de transplante de médula ósea, leucocitopenia, trombocitopenia, linfopenia B y linfopenia T después de quimioterapia, anemia, enfermedades infecciosas, cáncer, leucocitosis, SIDA, enfermedades neurodegenerativas (Alzheimer, esclerosis múltiple, etc.), prevención y tratamiento del daño neuronal, prevención o tratamiento del desorden en el metabolismo de la médula (osteoporosis, etc.) o reparación de tejido.

En las actividades anteriores fue confirmado que el SDF-1\alpha de ratón estimuló la proliferación de la línea celular progenitora mieloide murina DA1G en la prueba de laboratorio. Se sugirió que el SDF-1\alpha humano tiene también la misma actividad.

Adicionalmente, los anticuerpos policlonales o monoclonales contra el polipéptido de la presente invención pueden ser utilizados en la determinación de la cantidad de dicho polipéptido en el organismo y, por lo tanto, pueden ser utilizados a la hora de investigar la relación entre dicho polipéptido y las enfermedades, o para diagnosticar enfermedades, y similares. El anticuerpo policlonal o monoclonal del mismo puede ser preparado por medio de métodos convencionales utilizando dicho polipéptido, o el fragmento del mismo, como un antígeno.

El ADN de la presente invención puede ser utilizado como un templete importante y esencial a la hora de preparar el polipéptido de la presente invención, del cual se espera que posea distintos usos para el diagnóstico y en el tratamiento de enfermedades genéticas (el tratamiento de enfermedad causada por defecto génico, y el tratamiento a través de inhibición de la expresión del polipéptido por medio de ADN antisentido (ARN), y similares). Además, el ADN genómico puede ser aislado utilizando el ADN de la presente invención como una sonda. De forma similar, es posible aislar genes que poseen una alta homología con el ADN de la presente invención en humanos, o aquéllos de otras especies.

Aplicación para Composiciones Farmacéuticas

El polipéptido de la presente invención es producido y secretado en células pro-B, de tal forma que puede ser utilizado en enfermedades relacionadas con un bajo crecimiento o una proliferación anormal de células hematopoyéticas, mejora neuronal o depresión, mejora inmunológica y depresión, por ejemplo, enfermedades inflamatorias (artritis reumatoide, colitis ulcerativa, etc.), citopenia de células madre hematopoyéticas después de transplante de médula ósea, leucocitopenia, trombocitopenia, linfopenia B y linfopenia T después de quimioterapia, anemia, enfermedades infecciosas, cáncer, leucocitosis, SIDA, enfermedades neurodegenerativas (Alzheimer, esclerosis múltiple, etc.), prevención y tratamiento del daño neuronal, prevención o tratamiento del desorden en el metabolismo de la médula (osteoporosis, etc.) o reparación de tejido.

Los polipéptidos de la presente invención pueden ser administrados normalmente de forma sistemática o parcial, usualmente por medio de administración oral o parenteral, preferiblemente oralmente, intravenosamente o intraventricularmente.

Las dosis a ser administradas son determinadas dependiendo de la edad, peso corporal, síntomas, el efecto terapéutico deseado, la ruta de administración, y la duración del tratamiento, etc. En el humano adulto las dosis por persona y dosis son generalmente de entre 100 \mug y 100 mg, por medio de administración oral, hasta varias veces por día, y de entre 10 \mug y 100 mg, por medio de administración parenteral, hasta varias veces por día.

Conforme es mencionado anteriormente, las dosis a ser utilizadas dependen de distintas condiciones. Por lo tanto, existen casos en los cuales pueden ser utilizadas dosis inferiores o superiores a los rangos anteriormente especificados.

La administración de los compuestos de la presente invención puede ser como composiciones sólidas, composiciones líquidas u otras composiciones para administración oral, como inyecciones, linimentos o supositorios, etc. para administración parenteral.

Las composiciones sólidas para administración oral incluyen tabletas comprimidas, píldoras, cápsulas, polvos dispersables, gránulos. Las cápsulas incluyen cápsulas blandas y cápsulas duras.

En tales composiciones, uno o más de los compuestos activos son mezclados con, al menos, un diluyente inerte (como la lactosa, el manitol, la glucosa, la celulosa de hidroxipropilo, la celulosa microcristalina, el almidón, la polivinilpirrolidona, el aluminato metasilicato de magnesio, etc.). Las composiciones pueden comprender también, como una práctica normal, substancias adicionales distintas a los diluyentes inertes: por ejemplo, agentes lubricantes (tales como el estearato magnésico, etc.), agentes desintegrantes (tales como la celulosa glicolato de calcio, etc.), agentes estabilizadores (tales como albúmina sérica humana, lactosa, etc.), y agentes que ayudan a la disolución (tales como la arginina, el ácido asparagínico, etc.).

Las tabletas o píldoras pueden estar recubiertas, si se desea, con una película de material gástrico o entérico (como el azúcar, la gelatina, la celulosa de hidroxipropilo o el ftalato de celulosa de hidroxipropilmetilo, etc.), o estar recubiertas con más de dos películas. Y, además, el recubrimiento puede incluir el estar contenidas dentro de cápsulas o materiales absorbibles, tales como la gelatina.

Otras composiciones para administración oral incluyen composiciones en spray, las cuales pueden ser preparadas por medio de métodos conocidos y que comprenden uno o más de los compuestos activos. Las composiciones en spray pueden comprenden substancias adicionales distintas de los diluyentes inertes: por ejemplo, agentes estabilizadores (sulfito sódico, etc.), tampón isotónico (cloruro sódico, citrato sódico, ácido cítrico, etc.). Para la preparación de tales composiciones en spray, por ejemplo, puede ser utilizado el método descrito en la Patente Americana Num. 2.868.691 o 3.095.355 (incorporadas aquí en su totalidad como referencia).

Las inyecciones pueden comprender substancias adicionales distintas de los diluyentes inertes: por ejemplo, agentes preservantes, agentes humectantes, agentes emulsificadores, agentes dispersantes, agentes estabilizadores (tales como la albúmina sérica humana, la lactosa, etc.), y agentes de ayuda, tales como agentes que ayudan a la disolución (la arginina, el ácido asparagínico, etc.).

Pueden ser esterilizadas, por ejemplo, por medio de filtrado a través de un filtro de retención de bacterias, por medio de la incorporación de agentes esterilizantes en las composiciones, o por irradiación. Pueden ser producidas también en forma de composiciones sólidas estériles, por ejemplo, por medio de liofilización, y pueden ser disueltas en agua estéril o en alguno de los otros diluyentes estériles para inyección, inmediatamente antes de ser usadas.

Otras composiciones para administración parenteral incluyen líquidos para uso externo, y linimentos endérmicos (ungüentos, etc.), supositorios para administración rectal y pesarios, los cuales comprenden uno o más de los compuestos activos y pueden ser preparados por medio de métodos conocidos.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos son ilustrativos, pero no limitan la presente invención.

Ejemplo 1 Análisis Northern de la línea celular humana FLEB14

Fueron homogenadas células de la línea celular pro-B humana FLEB14 (ver Katamine, S., et al. Nature, 309, 369 (1984)). El homogenado fue incubado con celulosa oligo-dT. Fue eluído ARN poli(A) después del lavado (Vennstorm, B. et al. Cell, 28, 135 (1982)). Fue sometida a electrofóresis 1 \mug de ARN poli(A) en un gel de agarosa al 1,0% y, a continuación, inmunotransferida a una membrana de nitrocelulosa.

La membrana fue hibridizada con el ADNc de SDF-1 murino marcado con 32P (descrito como SEC. ID. Nº 3 en la Solicitud de Patente japonesa Nº 5-22098; la secuencia es mostrada en la SEC. ID. Nº 9; el factor es llamado ahora SDF- 1\alpha, ya que fue descubierto otro SDF-1 procedente de ratón), con formamida 50%, SSC 5X, SDC 0,1%, SDS 0,1%, solución de Denhardt 5X, 0,1 mg/ml de ADN de esperma de salmón, a 39ºC, y lavada con 0,3 M de NaCl, 30 mM de citrato sódico, SDS 0,1%, a 50ºC y, a continuación, sometida a autoradiograma. Fueron hibridizados ARNms de 3,5 kpb y de 1,9 kpb.

Ejemplo 2 Preparación de ADNc procedente de ARNm de línea celular humana pro-B

Fue construída una librería de ADNc tomando células FLEB14 de la línea celular humana pro-B por medio de un método convencional (ver Molecular Cloning; Sambrook, J., Fritsh, E.F., & Maniatis, T., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). El ADNc fue sintetizado utilizando el kit de síntesis de ADNc Time Saver (Pharmacia).

La primera hebra fue sintetizada tomando ARN poli(A) de FLEB14 (5 \mug) utilizando una transcriptasa reversa y un iniciador oligo-dT. Y utilizando una ADN polimerasa I fue sintetizado el ADNc de doble hebra.

Al ADNc le fue ligado un adaptador EcoRI-Notl:

AATTCGCGGCCGCT	(SEC. ID. Nº 10)
GCGCCGGCGAp	(SEC. ID. Nº 11)

y, a continuación, fue fosforilado. Fueron recuperados los ADNc mayores de 800 pb de un gel de agarosa 0,8% con un polvo de cristal (kit de purificación de ADN Geneclean II, disponible en Bio101).

Ejemplo 3 Preparación de la librería de ADNc e hibridización cruzada

El ADNc obtenido fue ligado a un vector fago \lambdagt10 (disponible en Stratagene), el cual posee el brazo EcoRI tratado con fosfatasa.

Se siguió con el empaquetado in vitro, por medio del protocolo del kit de empaquetado in vitro LAMDA INN (disponible en Nihon gene). Los fagos recombinantes fueron transfectados a células huésped E. Coli NM514 (disponibles en Stratagene). Fue obtenida una librería de ADNc conteniendo 1 x 10^{6} placas. Fueron transfectadas 1 x 10^{6} placas de fago \lambdagt10 de la librería de ADNc a membranas de nitrocelulosa. Las membranas fueron hibridizadas con el ADNc de SDF-1\alpha murino marcado con 32P (mostrado en la SEC. ID. Nº 9, el mismo ADNc utilizado en el Ejemplo 1) en formamida 50%, SSD 5X, SDS 0,1%, Solución Denhart 5X, 0,1 mg/ml de ADN de esperma de salmón, a 39ºC, y lavadas en 0,3 M de NaCl, 30 mM de citrato sódico, SDS 0,1%, a 50ºC, y sometidas a autoradiograma. Fueron obtenidos 40 clones positivos.

Ejemplo 4 Aislamiento de los clones positivos

Fue preparado ADN del fago, procedente de 9 clones positivos, por medio del método convencional (ver Cell Technology Experimental Protocol, pp. 8, publicado por Shuujun-sha). El ADN del fago fue digerido en Not I. La longitud del inserto de ADNc fue medida por medio de electrofóresis en gel de agarosa. La longitud de los 8 clones fue de 1,9 kpb, y la longitud de un clon fue de 3,5 kpb. Se pensó que estos dos tipos de clones son casi de la longitud total del ADNc del SDF-1\alpha y del SDF-\beta humanos, dado el resultado del análisis Northern.

El ADNc de un clon fue tomado de entre los 8 clones de 1,9 kpb de longitud y de un clon de 3,5 kpb de longitud, fueron digeridos en Not I, fueron sometidos a electrofóresis en gel de agarosa, y los fragmentos fueron cortados y subclonados en el sitio Not I del plásmido pBluescript.

Ejemplo 5 Preparación del mapa de restricción enzimático y secuenciación

Fue preparado un mapa de restricción enzimático del SDF-1 humano (1,9 kpb) (mostrado en la Fig. 1). Cada fragmento de ADNc de la enzima de restricción fue subclonado en pBluescript, seguido de la determinación de secuencias nucleotídicas de alrededor de 300 pb en ambos extremos de cada inserto. Uniendo estas secuencias, fueron determinadas secuencias nucleotídicas de longitud total (mostrado en la SEC. ID. Nº 3).

Fueron determinados un marco de lectura abierto y una secuencia aminoacídica de la secuencia nucleotídica del ADNc de longitud total, con los resultados mostrados en la SEC. ID. Nº 1. En comparación con péptidos señal conocidos, fueron comparados 30-40 aminoácidos del terminal N obtenidos con un péptido señal conocido, se descubrió un péptido señal de los polipéptidos de la presente invención, y se obtuvo la secuencia mostrada en la SEC. ID. Nº 4 (ver Von Heuane, G. Nucleic Acids Res. 14, 4683 (1986)).

Por medio del mismo procedimiento que se ha descrito mas arriba, fueron obtenidos un mapa de restricción enzimático (mostrado en la Figura 2), secuencias nucleotídicas completas (mostradas en la SED. ID. Nº 7), un marco de lectura abierto (mostrado en la SEC. ID. Nº 6), una secuencia aminoacídica (mostrada en la SEC. ID. Nº 5) y una secuencia mostrada con el péptido señal (mostrada en la SEC. ID. Nº 8) del clon de 3,5 kpb.

Las secuencias aminoacídicas deducidas del clon de 3,5 kpb y del clon de 1,9 kpb fueron muy similares entre sí, de tal forma que el clon de 1,9 kpb fue llamado SDF-1\alpha y el clon de 3,5 kpb fue llamado SDF-1\beta.

Las secuencias nucleotídicas fueron determinadas por medio del método de secuencia de ciclo, utilizando un determinador de fluorescencia (suministrado por Applied Biosystem Inc.). La lectura de las secuencias nucleotídicas fue llevada a cabo por medio de un secuenciador de ADN (Modelo 373, suministrado por Applied Biosystem Inc.).

Las secuencias nucleotídicas y las secuencias aminoacídicas deducidas del SDF-1\alpha y del 1\beta fueron sometidas a búsqueda de homología por medio de un ordenador en una base de datos (GENBANK y EMBL para ADN, NBRF y SWISSPROT para la secuencia aminoacídica). Fue confirmado que los ADNcs de la presente invención son codificadores de nuevos péptidos.

Ejemplo 6 Construcción del vector plásmido para utilización de la preparación del vector de expresión

Como un vector de expresión, fue utilizado el derivado pUC-SR\alphaML-1 (este vector es descrito así como su preparación en la publicación de Patente europea Nº 559428). Este derivado fue construido para insertar dos tipos de fragmentos, conforme es mostrado más abajo:

fragmento T7: 5' GTAATACGACTCACTATAGGGGAGAGCT 3' (SEC. ID. Nº 12)

\quad: 3' ACGTCATTATGCTGAGTGATATCCCCTC 5' (SEC. ID. Nº 13)

entre PstI y SacI y

fragmento SP6: 5' CTAGTCTATAGTGTCACCTAAATCGTGGGTAC 3' (SEC. ID. Nº 14)

\quad: 3' AGATATCACAGTGGATTTAGCAC 5' (SEC. ID. Nº 15)

entre los sitios SpeI y KpnI en el sitio de multiclonaje, respectivamente.

El vector pUC-SR\alphaML-1 fue digerido con PstI y SacI y el digesto resultante fue sometido a electrofóresis en gel de agarosa, con el fin de preparar y recuperar un fragmento de alrededor de 4,1 kpb y, después, eliminar el grupo de ácido fosfórico del extremo 5' por medio de tratamiento con BAP (fosfatasa alcalina bacteriana). El fragmento fosforilado T7 de ADN fue ligado con el fragmento de alrededor de 4,1 kpb así preparado procedente de pUC-SR\alphaML-1, para hacer que tomaran forma circular. El vector resultante, además, fue digerido con SpeI y KpnI, y el digesto resultante fue sometido a electrofóresis en gel de agarosa, con el fin de preparar y recuperar un fragmento de alrededor de 4,1 kpb y, después, eliminar el grupo de ácido fosfórico del extremo 5' por medio de tratamiento con BAP (fosfatasa alcalina bacteriana). El fragmento fosforilado Sp6 de ADN fue ligado con el fragmento de alrededor de 4,1 kpb así preparado, con el fin de que tomaran forma circular. El vector plásmido construído de esta manera fue llamado pUC- SR\alphaML-2 (ver Figura 3).

Ejemplo 7 Construcción del vector de expresión

En relación con hSDF-1\alpha, fueron sintetizados los iniciadores X, Y e YH. Las secuencias de los iniciadores X, Y e YH son las siguientes:

Iniciador X

: 5'-A ATA TAG TCG ACC ACC ATG AAC GCC AAG GTC GTG GTC GTG CTG G-3' (SEC. ID. Nº 16)

Iniciador Y

: 5'-CGG CGG ACT AGT TTA CTT GTT TAA AGC TTT CTC CAG G-3' (SEC. ID. Nº 17)

Iniciador YH

: 5'-GCC GCC ACT AGT TTA GTG GTG GTG GTG GTG GTG CTT GTT TAA AGC TTT CTC CAG G-3' (SEC. ID. Nº 18)

El plásmido hSDF-1\alpha fue sometido a PCR, utilizando los oligonucleótidos así sintetizados X e Y como iniciadores. El fragmento PCR así obtenido contiene una secuencia situada adyacente al 5' del codón de iniciación, que corresponde a la secuencia Kozac -la cual es conocida entre los expertos en este campo- y ADNc, el cual codifica una molécula de proteína consistente en la proteína hSDF-1\alpha. El fragmento PCR fue digerido con SalI y SpeI, y el digesto resultante fue separado y purificado y, a continuación, insertado en el sitio SalI-SpeI del pUC-SR\alphaML2 preparado en el ejemplo 6, con el fin de obtener un vector de expresión pUC-SR\alphaML2 - hSDF-1\alphaA.

Además, el plásmido hSDF-1\alpha fue sometido a PCR utilizando los oligonucleótidos sintetizados X e YH como iniciadores. El fragmento PCR así obtenido contiene una secuencia situada adyacente al 5' del codón de iniciación, que corresponde a la secuencia Kozac -la cual es conocida entre los expertos en este campo- y ADNc, el cual codifica una molécula de proteína consistente en la proteína hSDF-1\alpha y seis residuos de histidina (His) adicionales unidos a su extremo C-terminal. El fragmento PCR fue digerido con SalI y SpeI, y el digesto resultante fue separado y purificado y, a continuación, insertado en el sitio SalI-SpeI del pUC-SR\alphaML2 preparado en el ejemplo 6, con el fin de obtener un vector de expresión pUC-SR\alphaML2 - hSDF-1\alphaB.

En cuanto al hSDF-1\beta, fueron sintetizados los iniciadores Z y ZH. Las secuencias de los iniciadores Z y ZH son las siguientes:

Iniciador Z

: 5'- CGG CGG ACT AGT TCA CAT CTT GAA CCT CTT GTT TAA AGC -3' (SEC. ID. Nº 19)

Iniciador ZH

: 5'- GCC GCC ACT AGT TCA GTG GTG GTG GTG GTG GTG CAT CTT GAA CCT CTT GTT TAA AGC -3' (SEC. ID. Nº 20)

El plásmido hSDF-1\beta fue sometido a PCR, utilizando los oligonucleótidos así sintetizados X y Z como iniciadores. El fragmento PCR así obtenido contiene una secuencia situada adyacente al 5' del codón de iniciación, que corresponde a la secuencia Kozac -la cual es conocida entre los expertos en este campo- y ADNc, el cual codifica una molécula de proteína consistente en la proteína hSDF- 1\beta. El fragmento PCR fue digerido con SalI y SpeI, y el digesto resultante fue separado y purificado y, a continuación, insertado en el sitio SalI-SpeI del pUC-SR\alphaML2 preparado en el ejemplo 6, con el fin de obtener un vector de expresión pUC-SR\alphaML2 - hSDF-1\betaA.

Además, el plásmido hSDF-1\beta fue sometido a PCR utilizando los oligonucleótidos sintetizados X y ZH como iniciadores. El fragmento PCR así obtenido contiene una secuencia situada adyacente al 5' del codón de iniciación, que corresponde a la secuencia Kozac -la cual es conocida entre los expertos en este campo- y ADNc, el cual codifica una molécula de proteína consistente en la proteína hSDF-1\beta y seis residuos de histidina (His) adicionales unidos a su extremo C-terminal. El fragmento PCR fue digerido con SalI y SpeI, y el digesto resultante fue separado y purificado y, a continuación, insertado en el sitio SalI-SpeI del pUC-SR\alphaML2 preparado en el ejemplo 6, con el fin de obtener un vector de expresión pUC-SR\alphaML2 - hSDF-1\betaB.

Cada uno de los plásmidos así construidos pUC-SR\alphaML2-hSDF-1\alphaA, pUC-SR\alphaML2-hSDF-1\alphaB, pUC-SR\alphaML2-hSDF-1\betaA y pUC-SR\alphaML2-hSDF-1\betaB, fueron transfectados en una cepa DH5 de E.coli, fueron recuperados de un cultivo de 100 ml del transformante resultante y, a continuación, purificados dos veces por medio de centrifugación por gradiente de densidad de CsCl.

Ejemplo 8 Expresión en células COS

Cada una de las preparaciones de ADN plásmido pUC-SR\alphaML2, pUC-SR\alphaML2-hSDF-1\alphaA, pUC-SR\alphaML2-hSDF-1\alphaB, pUC-SR\alphaML2-hSDF-1\betaA y pUC-SR\alphaML2-hSDF-1\betaB fueron introducidas en células COS-7 (Cell, vol. 23, p. 175, 1981) por medio del método de dietilaminoetil (DEAE) dextran (J. Immunology, vol. 136, p. 4291,
1986).

Esto es, alrededor de 1,8 x 10^{6} células COS-7 fueron inoculadas en un matraz de 225 cm^{2} de capacidad (fabricado por Corning), junto con 50 ml de un medio de cultivo líquido (medio MEM modificado por Dulbecco, suplementado con 10% suero bovino fetal descomplementado). Después de su incubación durante la noche en un incubador de dióxido de carbono (37ºC, 5% de CO2) y de la subsiguiente retirada del sobrenadante del cultivo, fueron añadidos 12 ml de un cocktail de ADN (medio MEM modificado por Dulbecco suplementado con 15 \mug de cada ADN plásmido, 50 mM de tampón Tris-HCl (pH 7,4) y 400 \mug/ml de DEAE-dextran) a cada matraz y el cultivo fue llevado a cabo durante 3 horas a 37ºC en una atmósfera de 5% de CO2. A continuación, el cocktail de ADN fue reemplazado por 15 ml de una solución de cloroquina (medio MEM modificado por Dulbecco suplementado con 150 \muM de cloroquina y 7% suero bovino fetal descomplementado), seguido de 3 horas adicionales de
cultivo.

Después de eliminar la solución de cloroquina, fue añadido el medio de cultivo líquido anteriormente mencionado (50 ml) a cada uno de los matraces resultantes, los cuales fueron incubados, a continuación, a 37ºC en una atmósfera de 5% CO2 durante 72 horas, con el fin de hallar el crecimiento de las células en cada matraz en forma casi monocapa. Después de retirar el sobrenadante del cultivo, las células en cada matraz fueron lavadas con un medio de cultivo líquido libre de suero (nombre comercial, SFM-101; disponible en Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) y, a continuación, se las proporcionaron 75 ml del mismo medio de cultivo líquido libre de suero, y se continuó con el cultivo durante otras 72 horas. Después, el sobrenadante del cultivo resultante fue recuperado y filtrado a través de un filtro de membrana (nombre comercial, STERIVEX-GS; disponible en Millipore Corp.) con el fin de eliminar las células y los restos de célula. Las muestras así obtenidas de sobrenadante de cultivo fueron almacenadas a 4ºC para un uso futuro. Se espera que un sobrenadante de cultivo de células COS -las cuales han sido transformadas con plásmido conteniendo los insertos de ADNc de hSDF-1\alpha y \beta- contenga restos expresados y secretados de proteína madura de polipéptidos que correspondan a hSDF-1\alpha y \beta.

Ejemplo 9 Confirmación de la expresión

Una porción de 2 ml de cada uno de los sobrenadantes de cultivo de las células COS transformadas, obtenidas en el Ejemplo 8, fue concentrada a un volumen de 100 ml utilizando un filtro de concentración centrífuga (nombre comercial, Centricon-10; disponible en Millipore Corp.). Una porción de 1 \mul de cada una de las muestras así concentradas fue mezclada con el mismo volumen de un tampón de carga (0,125 M de tampón Tris-HCl (pH 6,8), dodecil sulfato sódico 4%, y glicerol 30%) para utilizar en SDS-PAGE (electrofóresis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato sódico), y la mezcla fue tratada a 90ºC durante 3 minutos y, a continuación, sometida a SDS-PAGE.

En el caso de las proteínas de hSDF-1\alphaB y \betaB poseyendo el hexámero His introducido en el C-terminal de las proteínas, no sólo su correspondiente sobrenadante de cultivo celular COS fue sometido al análisis SDS-PAGE, sino también sus productos purificados.

La purificación de la proteína fue llevada a cabo por medio de una cromatografía de afinidad de metal quelado (Biotechnology, vol. 9, p. 273, 1991), haciendo uso de la función de His para formar compuestos complejos con distintos iones de metal de transición. Es decir, un sobrenadante de cultivo (350 ml) obtenido de células COS fue mezclado con una solución acuosa de cloruro sódico en una cantidad tal que la concentración final de la sal fue de 1 M, y la mezcla resultante fue aplicada a una columna llena de 4 ml de una Sefarosa quelante ligada a zinc (nombre comercial, Chelating Sepharose Fast-Flow; disponible en Pharmacia) para adsorber la proteína a la resina. La columna fue lavada con 50 mM de tampón fosfato (pH 7,0) conteniendo 1 M de solución acuosa de cloruro sódico (40 ml), y la proteína retenida en la columna fue eluída con 50 mM de tampón fosfato (pH 7,0) conteniendo 1 M de solución acuosa de cloruro sódico y 0,4 M de imidazol. Después, el eluído resultante fue concentrado a un volumen de 100 \mul, y una porción de la muestra concentrada fue sometida a análisis SDS-PAGE. El análisis SDS-PAGE fue llevado a cabo utilizando un gradiente de gel SDS de 10/20 y fue detectado un producto, el cual corresponde a un peso molecular de hSDF-1\alpha y hSDF-1\beta, respectivamente.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: Ohno Pharmaceutical Co., Ltd.

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: 1-5, Doshomachi 2-chome

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: Chuo-ku, Osaka-shi

\vskip0.500000\baselineskip

(D): ESTADO: Osaka

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAIS: Japón

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL (ZIP): 541

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Nuevos Polipéptidos y ADNs que los codifican

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 20

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): REQUERIMIENTOS DE ORDENADOR PARA SU LECTURA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO MEDIO: Disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): SOFTWARE: PatentIn Release nº 1.0, Versión nº 1.25 (EPO)

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE ID. Nº: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 89 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

1

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE ID. Nº: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 267 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc para ARMm

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 2:

2

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE ID. Nº: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1856 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc para ARMm

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 3:

3

4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE ID. Nº: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1856 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc para ARMm

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.500000\baselineskip

(H): LÍNEA CELULAR: FLEB14

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 80..349

\vskip0.500000\baselineskip

(C): MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: por similaridad con otros patrones

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: sig_péptido

\vskip0.500000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 80..142

\vskip0.500000\baselineskip

(C): MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: por similaridad con secuencia conocida en un consenso establecido.

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: mat_péptido

\vskip0.500000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 143..346

\vskip0.500000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 4:

5

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE ID. Nº: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 93 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

7

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE ID. Nº: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 279 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc para ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

8

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE ID. Nº: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 3526 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc para ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(x): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

10

11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE ID. Nº: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 3526 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc para ARMm

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.500000\baselineskip

(H): LÍNEA CELULAR: FLEB14

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 80..361

\vskip0.500000\baselineskip

(C): MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: por similaridad con otros patrones.

\vskip0.800000\baselineskip

(ix: ) RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: sig_péptido

\vskip0.500000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 80..142

\vskip0.500000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: mat_péptido

\vskip0.500000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 143..358

\vskip0.500000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 8:

13

14

15

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE ID. Nº: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1797 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc para ARNm

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 9:

16

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE ID. Nº: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 14 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AATTCGCGGC CGCT

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE ID. Nº: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 10 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): RASGO:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: rasgo_misc

\vskip0.500000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 1

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /marca= fosforilado

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGCGGCCGCG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE ID. Nº: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTAATACGAC TCACTATAGG GGAGAGCT

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE ID. Nº: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTCCCCTATA GTGAGTCGTA TTACTGCA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE ID. Nº: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 32 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTAGTCTATA GTGTCACCTA AATCGTGGGT AC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE ID. Nº: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CACGATTTAG GTGACACTAT AGA

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE ID. Nº: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 44 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AATATAGTCG ACCACCATGA ACGCCAAGGT CGTGGTCGTG CTGG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE ID. Nº: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 37 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi: ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGGCGGACTA GTTTACTTGT TTAAAGCTTT CTCCAGG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE ID. Nº: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 55 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCGCCACTA GTTTAGTGGT GGTGGTGGTG GTGCTTGTTT AAAGCTTTCT CCAGG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE ID. Nº: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 39 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 19:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGGCGGACTA GTTCACATCT TGAACCTCTT GTTTAAAGC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA DE ID. Nº: 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 57 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucléico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (sintético)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. Nº: 20:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCGCCACTA GTTCAGTGGT GGTGGTGGTG GTGCATCTTG AACCTCTTGT TTAAAGC

\hfill

Claims

1. Un polipéptido poseyendo la secuencia aminoacídica mostrada en la SEC. ID. Nº 1.

2. ADN que posee la secuencia nucleotídica mostrada en la SEC. ID. Nº 2.

3. ADN que posee la secuencia nucleotídica mostrada en la SEC. ID. Nº 3.

4. Un vector de replicado y expresión comprendiendo ADN conforme a cualquiera de las reivindicaciones 2 o 3.

5. Células huésped transformadas o transfectadas con un vector de replicado y expresión, conforme a la reivindicación 4.

6. Un método de producción de un polipéptido, el cual comprende el cultivo de células huésped conforme a la reivindicación 5, bajo condiciones efectivas para la expresión de un polipéptido conforme a la reivindicación 1.

7. Una composición farmacéutica conteniendo un polipéptido conforme a la reivindicación 1, junto con un diluyente y/o portador farmacéuticamente aceptable.

8. Un polipéptido que posee la secuencia aminoacídica mostrada en la SEC. ID. Nº 5.

9. ADN que posee la secuencia nucleotídica mostrada en la SEC. ID. Nº 6.

10. ADN que posee la secuencia nucleotídica mostrada en la SEC. ID. Nº 7.

11. Un vector de replicado y expresión comprendiendo ADN conforme a cualquiera de las reivindicaciones 9 o 10.

12. Células huésped transformadas o transfectadas con un vector de replicado y expresión, conforme a la reivindicación 11.

13. Un método de producción de un polipéptido, el cual comprende el cultivo de células huésped conforme a la reivindicación 12, bajo condiciones efectivas para la expresión de un polipéptido conforme a la reivindicación 8.

14. Una composición farmacéutica conteniendo un polipéptido conforme a la reivindicación 8, junto con un diluyente y/o portador farmacéuticamente aceptable.

15. Un polipéptido que presenta una región que oscila de la posición 22 a la posición 89 en la secuencia aminoácida mostrada en la SEC ID No. 1.

16. Un polipéptido que presenta una región que oscila de la posición 22 a la posición 93 en la secuencia aminoácida mostrada en la SEC ID No. 5.