JPH09234079A

JPH09234079A - 単球の成熟分化因子

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Publication number: JPH09234079A
Application number: JP8075236A
Authority: JP
Inventors: Kiyomoto Ooi; 清源大井; Takashi Satsu; 隆史佐津; Masami Kizumoto; 真佐美木津本; Hisanori Hara; 久典原; Tatsuya Seki; 達也関; Manabu Shimonishi; 学下西; Tetsuji Nagasawa; 鉄二長澤; Harumi Sakai; 治美酒井; Norihide Shimizu; 範英清水; Michio Hagiya; 道雄萩屋
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 1996-03-04
Filing date: 1996-03-04
Publication date: 1997-09-09
Anticipated expiration: 2016-03-04
Also published as: JP4122530B2

Abstract

(57)【要約】【課題】単球又はマクロファージを長期生存維持さ
せ、成熟及び分化させる作用（ＭＭＤＦ活性）を有する
蛋白質、当該蛋白質を遺伝子操作技術を用いて生産する
に使用されるＤＮＡ及び形質転換体、当該蛋白質を含む
医薬組成物の提供。【解決手段】ＭＭＤＦ、ＭＭＤＦをコードするＤＮ
Ａ、その形質転換体、その形質転換体を培養し培養物か
らＭＭＤＦを採取する工程、並びにＭＭＤＦを有効成分
とする抗癌剤、免疫賦活剤、感染症治療剤、創傷治療剤
等に有用な医薬組成物。【効果】抗癌剤、免疫賦活剤、感染症治療剤等へのＭ
ＭＤＦの応用が可能となり、又、遺伝子操作技術の方法
を用いたＭＭＤＦの大量生産も可能となった。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、液体培養におい
て、単球又はマクロファ−ジを長期生存維持させるとと
もに、成熟及び分化させる作用を有する新しい生理活性
物質（以下、ＭＭＤＦと称する）とその製造方法、クロ
−ン化したＭＭＤＦをコードする遺伝子ならびに、ＭＭ
ＤＦ又はその一部を含む医薬組成物に関するものであ
る。

【０００２】

【従来の技術】単球又はマクロファ−ジは、生体におい
て老廃物を排除する細胞であるとともに生体防御機構に
おいて重要な役割を担う細胞である。即ち、外来刺激の
認識、貪食、消化、生理活性因子の分泌、抗原提示など
の様々な機能により生体防御に関与し、抗菌作用及び抗
腫瘍作用などを有する重要な細胞である。このような作
用を有する単球又はマクロファージに対し、インビトロ
で種々の作用を示す物質が発見されてきている。単球又
はマクロファ−ジを活性化する因子としては、インタ−
ロイキン１（ＩＬ−１）、リポポリサッカライド（ＬＰ
Ｓ）、ＭＡＦ（Ｄ．Ｇｅｍｓａら；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．，１３１、８８３（１９８８））等が公知であり、
コロニ−形成刺激因子としては、マクロファ−ジ（単
球）コロニ−形成刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）等が公知であ
る。

【０００３】単球又はマクロファ−ジを感染あるいは炎
症の局所に呼び寄せる作用をもつと考えられているマク
ロファ−ジ遊走因子としては、ＭＣＰ−１（Ｍａｃｒｏ
ｐｈａｇｅＣｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔＰｒｏ
ｔｅｉｎ−１）（Ｔ．Ｙｏｓｈｉｍｕｒａら；ＦＥＢＳ
Ｌｅｔｔ．，２４４，４８７−４９３（１９８
９）），ＲＡＮＴＥＳ／ＳＩＳ（Ｔ．Ｊ．Ｓｃｈａｌｌ
ら；Ｎａｔｕｒｅ，３４７，６６９−６７１（１９９
０）），ＭＣＡＦ（Ｙ．Ｆｕｒｕｔａｎｉら；ＷＯ９０
０７８６３）等が明らかにされている。さらに、これら
以外にもＭＳＰ（ＭａｃｒｏｐｈａｇｅＳｔｉｍｕｌ
ａｔｉｎｇＰｒｏｔｅｉｎ）（Ｊ．Ｌｅｏｎａｒｄ
ら；ＵＳ７５８６０８５）と言った因子の存在も示され
ている。また、無血清培養において、Ｍ−ＣＳＦが単球
を生存維持させ、分化させる作用も有することも示され
ている（Ｗ．Ｂｒｕｇｇｅｒら；Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔ
ｅＢｉｏｌ．，４９，４８３−４８８（１９９
１））。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】上述したように、単球
又はマクロファージは、体内に侵入した異物（抗原）や
生体内の老廃物の貪食処理、抗原提示、生理活性因子
（ＩＬ−１，腫瘍壊死因子ＴＮＦα，インターフェロン
等）の分泌等により、生体防御に関与し、抗菌作用、抗
腫瘍作用を有する細胞である。しかし、通常、液体培養
では単球又はマクロファージは死滅していき、培養６日
目頃には殆どの細胞が死んでしまう。本発明は、かかる
技術的背景の下に、単球又はマクロファージを長期生存
維持させながら、成熟及び分化させる作用（ＭＭＤＦ作
用）を有する蛋白質を、特に遺伝子操作技術を用いて生
産し、この蛋白質を種々の薬剤に応用することを課題と
する。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題を解決するために種々検討した結果、単球又はマクロ
ファージを活性化する作用、走化性を刺激する作用ある
いはコロニー形成を刺激する作用という従来の生理活性
因子の作用とは異なった作用、即ち、単球又はマクロフ
ァージを長期生存維持させながら、成熟及び分化させる
作用、即ちＭＭＤＦ活性をヒト癌細胞株の培養液に見出
した。ＭＭＤＦが存在すると、液体培養においても単球
又はマクロファージは長期生存維持され、成熟及び分化
していく。この作用に着目し、該蛋白質の分離精製なら
びに遺伝子のクローニングを行い、本発明を完成するに
至った。

【０００６】すなわち、本発明は液体培養において、単
球またはマクロファ−ジを長期生存維持させながら、成
熟及び分化させる作用（以下、ＭＭＤＦ活性という）を
有する蛋白質であることを特徴とする単球の成熟分化因
子である。

【０００７】また、本発明は液体培養において、ＭＭＤ
Ｆ活性を有する蛋白質をコ−ドするヌクレオチド配列を
有する単離されたＤＮＡである。

【０００８】さらに、本発明は発現制御配列を機能しう
る形で随伴した、ＭＭＤＦ活性を有する蛋白質をコ−ド
するヌクレオチド配列を含み、微生物、昆虫細胞又は哺
乳動物細胞等の形質転換体の培養において、該ＭＭＤＦ
活性を有する蛋白質を発現しうる組換え発現ベクタ−で
ある。

【０００９】本発明は、ＭＭＤＦ活性を有する蛋白質を
コ−ドするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクタ−
で形質転換された、該ＭＭＤＦ活性を有する蛋白質を発
現する能力を有する形質転換体である。

【００１０】また、本発明は以下の工程を包含する、前
述の単球の成熟分化因子を製造する方法である。（１）ＭＭＤＦ活性を有する蛋白質を発現しうる組換え
発現ベクタ−で形質転換された形質転換体を培養する工
程。（２）培養物からＭＭＤＦ活性を有する蛋白質を採取す
る工程。

【００１１】本発明は、ＭＭＤＦ活性を有する蛋白質を
治療上有効な量で含有する医薬組成物である。

【００１２】本発明は癌治療剤、白血病治療剤、免疫賦
活剤、感染症治療剤、及び創傷治療剤から選ばれる前記
医薬組成物である。

【００１３】

【発明の実施の形態】本発明に係わる、液体培養におい
て単球又はマクロファ−ジを長期生存維持させ、成熟及
び分化させる作用、ＭＭＤＦ活性を有する蛋白質（ＭＭ
ＤＦ）について、次に記す。ＭＭＤＦ活性測定用の単球
は次のようにして調製される。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａ
ｑｕｅ（ＬＳＭ，ＬｉｔｔｏｎＢｉｏｎｅｔｉｃｓ
社）を使用した密度勾配遠心法により、健康な人の末梢
血液から単核球細胞を分離し、非働化した血清を含む培
地を分注した培養容器に播種する。そして、３７℃、５
％炭酸ガスインキュベ−タ−内にてインキュベ−ション
し、壁着性細胞を付着させる。その後、培養容器基面を
新鮮な培地で洗浄することにより、非壁着性細胞を洗浄
除去する。次に、０．５％ＥＤＴＡと５％牛胎児血清
（ＦＣＳ）を含有させた二価金属イオン不含のダルベッ
コリン酸緩衝液で培養基面を処理することにより、壁着
性細胞を剥離する。剥離回収した細胞を新鮮な培地で洗
浄し、低血清濃度含有培地を分注したマルチタイタ−ウ
ェルに播種した後、種々のサンプルを各ウェルに添加す
る。

【００１４】ＭＭＤＦ活性は、ＭＴＴ法（Ｊ．Ｍ．Ｇｒ
ｅｅｎら；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、７
０、２５７−２６８（１９８４））による細胞数の測定
及び、顕微鏡下での細胞形態観察により行う。また、³
Ｈ−ロイシンの取り込み量を測定することにより、蛋白
質の合成能に対する影響を調べる。その結果、ヒト由来
の細胞、好ましくは血液由来の白血球を除く細胞、例え
ばヒト癌組織由来又はヒト正常組織由来の細胞株、好ま
しくはヒト甲状腺癌細胞株，さらに好ましくはＴＣＯ−
１の培養液に、末梢血由来の単球又はマクロファ−ジを
１％以下の低血清濃度添加培地中で、１４日間以上長期
生存維持させながら、成熟及び分化させる蛋白質性因子
を見出すことができる。上記活性測定方法を用いて、各
種培養細胞や初代培養細胞の培養液、または尿、血清、
血漿中のＭＭＤＦ活性の有無を測定することにより、Ｍ
ＭＤＦを産生する培養細胞や組織を選択することがで
き、天然のＭＭＤＦの供給源を特定できる。そして、こ
こで用いた培養細胞は、樹立された細胞株に限らず、初
代培養細胞も含まれる。又、培養細胞の培養上清の調製
は、無血清が望ましいが、１−１０％の牛胎児血清又
は、０．１−０．５％牛血清アルブミンを含有する培地
等でも行われる。活性測定に使用する血清濃度は、１％
以下が好ましいが、基礎培地等の選択によっては、１％
以上の血清濃度でも測定可能である。

【００１５】本発明では、天然のＭＭＤＦの供給源とし
て、ヒト癌細胞株、好ましくはヒト甲状腺癌細胞株，さ
らに好ましくはＴＣＯ−１を使用し、基礎培地として、
例えばＤＭＥＭ培地（日水製薬）とハムＦ−１０培地
（ＧＩＢＣＯ社）を３：１に混合した培地を使用する。
使用できる培地としては、前述の培地に限られたもので
はなく市販されているＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ
培地、ＩＭＤＭ培地等が挙げられる。基礎培地を使って
２×１０⁵個／ｍｌになるように細胞を調製し、２２５
cm²の培養用フラスコ（コ−スタ−社）等に４０−６０
ｍｌ播種し、３７℃で５％炭酸ガスインキュベ−タ−内
で培養する。細胞の増殖がコンフルエント前になった
ら、培養液を除去し、新鮮な同じ培地と交換する。この
培養液の採取回収並びに新鮮培地との交換は好ましくは
７日毎に行うが、特に限定されたものではない。

【００１６】本発明におけるＭＭＤＦ活性を有する物質
は、種々の分離操作により単離精製することができる。
単離精製方法としては、次の方法が用いられる。上記ヒ
ト細胞株の培養液を原材料として、種々の分離操作によ
り単離精製することができる。このような方法として
は、蛋白沈殿による方法、限外濾過による方法、イオン
交換クロマトグラフィ−による方法、疎水クロマトグラ
フィ−による方法、ゲル濾過又は分子篩クロマトグラフ
ィ−による方法、高速液体クロマトグラフィ−による方
法、逆相クロマトグラフィ−による方法、アフィニティ
−クロマトグラフィ−による方法、吸着クロマトグラフ
ィ−による方法、色素クロマトグラフィ−による方法、
電気泳動による方法などが挙げられる。蛋白沈殿による
方法では、硫酸アンモニウム、リン酸ナトリウム等の塩
析剤を用いることが好ましい。イオン交換クロマトグラ
フィ−による方法では、例えば、ＤＥＡＥ（ジエチルア
ミノエチル）、アミノエチル或いは、４級アミノエチル
基を官能基として有する陰イオン交換体並びに、カルボ
キシメチル或いはスルホメチルプロピル基を官能基とし
て有する陽イオン交換体を用いることができる。疎水ク
ロマトグラフィ−による方法では、フェニルセファロ−
ス、オクチルセファロ−ス、ブチルトヨパ−ル等を用い
ることができる。吸着クロマトグラフィ−による方法と
しては、ハイドロキシアパタイト等を用いることが好ま
しい。アフィニティ−クロマトグラフィ−による方法と
しては、抗体結合担体特に、抗体としてはモノクロ−ナ
ル抗体を用いたものが好ましい。

【００１７】原材料である上記ヒト癌細胞株の培養液
を、２．５ＭＮａＣｌ含有トリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５）で平衡化させた疎水クロマトグラフィ−例え
ば、ブチルトヨパ−ル（東ソー社）に付し、０．５Ｍ
ＮａＣｌ含有トリス緩衝液（ｐＨ７．５）でＭＭＤＦを
含む吸着物を溶出する。該溶出活性画分を０．５ＭＮ
ａＣｌ含有リン酸緩衝液（ｐＨ７．０〜７．５）で平衡
化したハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィ
−（バイオラッド社）に付し、１．４ＭＮａＣｌ含有
リン酸緩衝液でＭＭＤＦを含む吸着物を溶出する。ＭＭ
ＤＦ活性を有する該溶出活性画分を、１．５Ｍ硫酸ア
ンモニウム含有トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡
化した疎水クロマトグラフィ−例えば、フェニルセファ
ロ−ス（ファルマシア社）に付し、１．５Ｍから０Ｍへ
の硫酸アンモニウムの直線濃度勾配に変化させたトリス
塩酸緩衝液でＭＭＤＦを含む吸着物を溶出させると、
０．７Ｍ付近の硫酸アンモニウム濃度でＭＭＤＦ活性物
質が溶出される。該溶出活性画分を、約０．１ＭＮａ
Ｃｌ含有トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７）で平衡化した陰イ
オン交換カラムクロマトグラフィー、例えば、Ｑ−セフ
ァロースカラム（ファルマシア社）に付し、０．１Ｍか
ら０．４ＭのＮａＣｌの直線濃度勾配に変化させたトリ
ス塩酸緩衝液で溶出させる。その結果、約０．３ＭＮ
ａＣｌ濃度付近にＭＭＤＦ活性物質が溶出される。この
ようにして得たＭＭＤＦ活性物質を含む画分（以下Ｆ
ｒ．Ｑという）をゲル濾過カラム、例えば、ス−パ−ロ
−ズ１２（ファルマシア社）を装着したＦＰＬＣ（Ｆａ
ｓｔＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅＬｉｑｕｉｄＣｈｒ
ｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（ファルマシア社）に付す
と、標準蛋白質との比較によりＭＭＤＦ活性を有する物
質の分子量は（４５±５）ＫＤと推定される。

【００１８】次に、Ｆｒ．Ｑを非還元下でＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動に付し、電気泳動後、ゲル
を銀染色キット（和光純薬社）で染色しバンドを確認す
る。同時に平行して、同条件でＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動を行う。電気泳動後、分子量マ−カ−
を参考にしてゲルを、１０ＫＤ以下、１０−１６ＫＤ、
１６−２２ＫＤ、２２−３１ＫＤ、３１−４６ＫＤ、４
６ＫＤ以上の６画分に分割して切り取る。切り取ったゲ
ルを破砕し、０．３％ＳＤＳ溶液中で、４℃で一晩中イ
ンキュベ−ションすることにより、蛋白質を抽出後、Ｓ
ＤＳ除去カラム、例えば、ＡｍｐｕｒｅＤＴ（アマシ
ャム社）に付してＳＤＳを除去する。その後、抽出した
試料について活性を測定した結果、１６−２２ＫＤ画分
にだけ活性を認める。

【００１９】Ｆｒ．ＱをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動に付した後、クマシ−ブリリアントブル−染
色を行い、分子量２０ＫＤ付近のバンドの見える箇所の
ゲルを切り出し、水で脱色を行う。その後、ゲルをエッ
ペンドルフチュ−ブ内ですりつぶし、０．３％ＳＤＳを
含むトリス塩酸緩衝液を加えてよく混合後、リシルエン
ドペプチダ−ゼ（和光純薬社）を加えて３７℃で１５時
間インキュベ−ションする。反応液を濾過後、４ＳＤＳ
ガ−ドカ−トリッジ（ポリＬＣ社）を装着させたマイク
ロボンダスフェア−Ｃ１８逆相ＨＰＬＣカラム（ウォ−
タ−ズ社）に付すことによりペプチド断片を分離する。
溶離液Ａとして、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）
溶液、溶離液Ｂとして、０．１％ＴＦＡを含有するイソ
プロピルアルコ−ルとアセトニトリルの１：１の混合液
を用い、０％から９５％までＢ液の濃度を直線的に増加
させることによりペプチド断片を溶出させる。さらに、
分離したペプチド断片をプロテインシ−クエンサ−（４
７７Ａ形アプライドバイオシステムズ社又は、ＰＰＳ
Ｑ−１０形島津製作所）に付してエドマン分解し、そ
のアミノ酸配列を読み取り決定する。その結果、天然の
ＭＭＤＦには、少なくとも配列番号４、５、６、７、
８、９、１０、１１に示されるアミノ酸配列を含むこと
が明らかになる。

【００２０】天然のＭＭＤＦに含まれる部分アミノ酸配
列を基に、その配列をコ−ドすると考えられるＤＮＡの
塩基配列を予測することができる。方法としては、次の
方法を用いる。

【００２１】ＭＭＤＦの産生細胞であるヒト癌細胞株、
例えばヒト甲状腺癌細胞株，好ましくはＴＣＯ−１から
全ＲＮＡを抽出後、ｍＲＮＡを精製する。そして、天然
のＭＭＤＦの部分アミノ酸配列の解析により明らかにさ
れた配列番号４−１１を基に、その配列をコ−ドすると
考えられるＤＮＡの塩基配列を有するオリゴヌクレオチ
ドをＤＮＡ合成装置（３８１Ａ型、アプライドバイオシ
ステムズ社）で合成する。この合成したオリゴヌクレオ
チドをプライマ−とし、ｍＲＮＡを鋳型としてＲＴ−Ｐ
ＣＲ反応を実施した結果、プライマ−として使用したア
ミノ酸配列以外に、部分アミノ酸配列の解析で得られた
他の部分アミノ酸配列をもコ−ドするＤＮＡ断片を得
る。次に、該ヒト癌細胞株のｍＲＮＡを鋳型にしてｃＤ
ＮＡライブラリ−を作製し、得られたライブラリ−より
上記ＲＴ−ＰＣＲで得られたＤＮＡ断片をプロ−ブとし
てスクリ−ニングする。

【００２２】その結果、得られた陽性クロ−ンを大腸菌
に感染させ培養した後、ファ−ジＤＮＡを調製する。さ
らに、このファ−ジＤＮＡを制限酵素で消化後、プラス
ミドベクタ−に挿入し、クロ−ン化プラスミドＤＮＡを
得る。このＤＮＡを各種制限酵素で消化して制限酵素切
断点地図を得、さらに全塩基配列を決定する（配列番号
２）。次に、その塩基配列より推定されるコ−ド領域の
アミノ酸配列を決定する（配列番号１）。得られたｃＤ
ＮＡクロ−ンが求めるＭＭＤＦをコ−ドするものである
かどうかの確認は、天然のＭＭＤＦの部分アミノ酸配列
が、クローンにコードされているかどうかで判断でき
る。推定したアミノ酸配列には、分泌シグナルであると
予想される配列に続き、アミノ末端と考えられる配列及
び部分アミノ酸配列解析で得られたすべての配列が含ま
れていることを確認できる。

【００２３】本発明の蛋白質は、上記のアミノ酸配列を
有する蛋白質に限定されるものではなく、例えば配列番
号１に記載のアミノ酸配列のアミノ酸、該アミノ酸配列
のうち、少なくとも１つが削除または置換されたアミノ
酸配列を有するか、または該アミノ酸配列に少なくとも
１つのアミノ酸が付加又は挿入されたアミノ酸配列を有
する蛋白質等が包含される。また、本発明のＤＮＡは、
ＭＭＤＦ活性を有する蛋白質をコードするヌクレオチド
配列を含むＤＮＡ、例えば配列番号２に記載のヌクレオ
チド配列のヌクレオチド、該ヌクレオチド配列のうち、
少なくとも１つが削除または置換されたヌクレオチド配
列を有するか、または該ヌクレオチド配列に少なくとも
１つのヌクレオチドが付加又は挿入されたヌクレオチド
配列を有し、ＭＭＤＦ活性を有する蛋白質をコードする
ヌクレオチド配列を有するＤＮＡが包含される。

【００２４】以上の様にして前述のＤＮＡを得、そのｃ
ＤＮＡ又はその主要部分を挿入した発現ベクタ−によ
り、形質転換用の宿主、例えば微生物、好ましくは大腸
菌、枯草菌、及び酵母からなる群から選択される微生
物、又は昆虫細胞もしくは哺乳動物細胞、好ましくはＣ
ＯＳ−１，ＣＨＯ，ＢＨＫ及びＣ１２７Ｉからなる群か
ら選択される哺乳動物細胞を形質転換させ形質転換体を
得る。得られた形質転換体を用いて組換えＤＮＡ技術を
適用することにより発現させ、活性の確認をおこなう。
その場合、宿主によって、使用するベクタ−は使い分け
られる。このようにしてＭＭＤＦを発現させる。

【００２５】本発明により得られるＭＭＤＦ活性を有す
る蛋白質は、貪食能、生体防御作用、抗菌作用、抗腫瘍
作用を有する単球又はマクロファージを長期生存維持さ
せながら、成熟及び分化させる作用があることから、通
常使用される担体等と共に医薬組成物とされ、癌治療
剤、白血病治療剤、免疫賦活剤、感染症治療剤、創傷治
療剤として利用することができる。本発明におけるＭＭ
ＤＦ活性を有する蛋白質を含有する癌治療剤、白血病治
療剤、免疫賦活剤、感染症治療剤、創傷治療剤は、経口
あるいは静注、点滴、皮下注射により投与されうる。そ
の投与に際しては、それぞれの投与経路に応じて適当な
形態、例えば経口製剤、注射剤，外用剤として製剤され
る。これらの製剤はそれぞれ常法によって製造され、通
常それぞれの剤型に応じた製薬上許容される担体又は添
加物が配合される。当該治療剤に含有される、ＭＭＤＦ
活性を有する蛋白質の量は、投与方法、剤型、適用疾患
等に応じて適宜変更されうるので特に限定されない。当
該治療剤の投与量は、適用疾患、疾患の程度、投与方
法、患者の年齢等により異なるが、例えば癌患者に対し
て、静脈点滴により投与する場合、通常１００〜１００
０μｇ／ｋｇを１日１回投与する。

【００２６】

【実施例】次に実施例により、本発明の単球の成熟分化
因子（ＭＭＤＦ）の活性測定、精製、部分アミノ酸配
列、遺伝子クロ−ニング並びに発現について説明する。実施例１ＭＭＤＦ活性測定用単球の調製およびその活
性測定方法ヒト末梢血１００ｍｌに等量のハムＦ−１０培地（ＧＩ
ＢＣＯ社）を混合して希釈血液を調製し、Ｆｉｃｏｌｌ
−Ｈｙｐａｑｕｅ（ＬＳＭ、登録商標：Ｌｉｔｔｏｎ
Ｂｉｏｎｅｔｉｃｓ社）１５ｍｌに対し、該希釈血液
を３０ｍｌの割合で、両液が混じらないように静かに重
層し、１６００ｒｐｍで３０分間、２５℃で遠心した。
中間部に形成された単核球層を回収し、ハムＦ−１０培
地に分散させ、１６００ｒｐｍで１５分間、２５℃で遠
心分離を行った。得られた細胞集塊を、再度、ハムＦ−
１０培地に分散させ、１２００ｒｐｍで５分間、２５℃
で遠心分離を行った。次に、得られた細胞集塊を非働化
した牛胎児血清（ＦＣＳ）１０％を含有するハムＦ−１
０培地に分散させ、チュルク染色液を使って細胞数の測
定を行い、約７×１０⁶個／ｍｌに調整し、非働化ＦＣ
Ｓ１０％含有ハムＦ−１０培地の入った培養用プラステ
ィック製フラスコ（コ−スタ−社）に播種した。その
後、３７℃の５％炭酸ガスインキュベ−タ−内にて１時
間インキュベ−ションし、培養液を除き、新鮮な同培地
で４回培養基面を洗浄した。その後、基面に壁着してい
る単球を剥離させるため、０．５％ＥＤＴＡと非働化Ｆ
ＣＳ５％を含有するダルベッコリン酸緩衝液（日水製
薬）を上記フラスコに添加し、４℃で３０分間インキュ
ベ−ションした。最後に、フラスコを手で叩いて衝撃を
与えて細胞を剥離させ、細胞を回収し、活性測定用の単
球として使用した。このようにして得た単球浮遊液をダ
ルベッコリン酸緩衝液に希釈し、１５００ｒｐｍ、４℃
で５分間遠心分離後、上清を廃棄した。次に、１％非働
化ＦＣＳ含有ハムＦ−１０培地に細胞を浮遊させ、１５
００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離後、上清を廃棄し、
最終的に１％非働化ＦＣＳ含有ハムＦ−１０培地に浮遊
させた。チュルク染色液で細胞数を測定し、２×１０⁵
個／ｍｌに調整して９６穴マイクロタイタ−プレ−ト
（コ−スタ−社）に５０μｌ／穴を播種した。その後、
試料を５０μｌ／穴に添加し、炭酸ガスインキュベ−タ
−内にて培養を行った。培養中、２〜３日毎に１回、Ｍ
ＴＴ法で細胞数を測定し、培養の経過を追跡した。

【００２７】また、上記のように調整した単球を９６穴
マイクロタイタ−プレ−トに１×１０⁴個／穴で播種
し、培養の途中で、測定の前日より放射性標識物質であ
る³Ｈ−ロイシンを１μＣｉ／ｍｌ添加して２４時間パ
ルス標識した後、細胞を０．０２％ＥＤＴＡ含有のトリ
プシン溶液で処理することにより細胞を剥離し、セルハ
−ベスタ−（スカルトン社）によりガラスフィルタ−上
に細胞を捕獲した。その後、４℃でトリクロロ酢酸（Ｔ
ＣＡ）中にガラスフィルタ−上に捕獲した細胞を浸積
し、洗浄後、乾燥した。そして、シンチレ−タ−（アム
ライト、登録商標：デュポン社）３ｍｌを添加したバイ
アル内にフィルタ−を入れ、液体シンチレ−ションカウ
ンタ−でＴＣＡ不溶性画分への取り込み量を測定した。

【００２８】実施例２ヒト末梢血由来の単球に対する
作用実施例１で示した活性測定法により、粗精製のＭＭＤＦ
の活性を測定した。図１に示されるように、粗精製した
ＭＭＤＦを総蛋白濃度で０．０１〜１μｇ／ｍｌまで添
加し、ＭＴＴ法で細胞数をカウントし、培養経過を追跡
した。その結果、ＭＭＤＦ添加群では、長期間即ち１４
日間以上単球が生存維持されることが認められた。その
時、細胞形態を顕微鏡下で観察すると、無添加コントロ
−ル群では形態に変化はなく、細胞は死んでいき、培養
６日目頃には殆ど死滅したが、ＭＭＤＦ添加群では、殆
どの細胞が生存し、マクロファ−ジ様に大きくなって成
熟及び分化していくのが認められた。

【００２９】また、実施例１で示した³Ｈ−ロイシンの
取り込み法により、単球の蛋白質合成能に対するＭＭＤ
Ｆの影響を調べた。今回、培養経過の内、培養開始日、
６日目、及び９日目の細胞について³Ｈ−ロイシンの取
り込み量を測定した。その結果、ＭＭＤＦ添加群では、
表１に示すように、培養６日目並びに９日目ともに著し
く³Ｈ−ロイシンの取り込み量が増加されることが認め
られた。すなわち、単球がＭＭＤＦにより成熟及び分化
させられた結果、単球の蛋白質の合成が活発に促進され
たものと考えられる。

【００３０】

【表１】

【００３１】次に、実施例１で示した方法と同様な方法
でヒト単核球を分離し、末梢血供与者の自己血清を１％
含有するハムＦ−１０培地にその細胞を浮遊させ、チュ
ルク染色液で細胞数をカウントし、１×１０⁶個／ｍｌ
に調整した。その単核球を１×１０⁶個／穴で２４穴マ
ルチウェルデッシュ（ファルコン社）に播種した。その
後、３７℃の５％炭酸ガスインキュベ−タ−内に３時間
インキュベ−ションし、壁着性細胞を基面に付着させ
た。次に、パスツ−ルピペットを使いピペッテング洗浄
により非壁着性細胞を取り除いた。再度、ダルベッコリ
ン酸緩衝液を約１ｍｌ／穴添加し、ピペッテング洗浄に
より非壁着性細胞を取り除いた。そこに上記と同様の血
清及びＭＭＤＦを含むハムＦ−１０培地を添加し、３７
℃の５％炭酸ガスインキュベ−タ−内にて培養を行い、
２〜３日毎に核カウントを行って培養経過を追跡した。
培養基面に付着して残っている細胞が、９０％以上単球
であることを、非特異的エステラ−ゼ染色により確認し
た。また、核カウントは、培養液除去後、０．１％クエ
ン酸ナトリウム、１％セタブロン（Ｃｅｔｈｙｌｔｒｉ
ｍｅｔｈｙｌＡｍｍｏｎｉｕｍＢｒｏｍｉｄｅ）と
０．０５％ナフト−ルブル−ブラックを含有する溶液を
５０μｌ／穴添加し、３７℃で３０分間インキュベ−シ
ョンして細胞質の溶解並びに核染色を行い、血球計算盤
により測定を行った。その結果、ＭＭＤＦを添加すると
殆どの単球が、１４日間以上生存維持され、マクロファ
−ジ様に成熟及び分化されることが認められた。

【００３２】実施例３甲状腺癌細胞株ＴＣＯ−１の培
養液からのＭＭＤＦの精製甲状腺癌ＴＣＯ−１の培養は、ＤＭＥＭ培地（ダルベッ
コ改変イ−グル最小必須培地：ニッスイ製薬）とハムＦ
−１０培地（ＧＩＢＣＯ社）を３：１に混合した培地を
用い、無血清培地下で炭酸ガスインキュベ−タ−を使
い、５％炭酸ガス濃度及び３７℃の条件で行った。甲状
腺癌細胞株からＭＭＤＦを産生させるには、次のように
して行った。上記培地を用いて該細胞を２×１０⁵個／
ｍｌの細胞数に調整し、培養面積２２５ｃｍ²の培養フ
ラスコ（コ−スタ−社）に４５ｍｌずつ播種した。培養
は、５％炭酸ガス濃度，３７℃で行なった。細胞の増殖
がコンフルエント前になったら、新鮮な培地３０ｍｌに
交換し、７日毎に培養液採取並びに新鮮培地との交換を
行い、ＭＭＤＦの生産を行った。

【００３３】以上のようにして得た培養液１０〜２０リ
ットルを、２．５ＭＮａＣｌを含む５０ｍＭトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した疎水性クロマト樹
脂であるブチルトヨパ−ル（東ソ−社）を充填したカラ
ムに付し、０．５ＭＮａＣｌを含む５０ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）でＭＭＤＦを含む吸着物を溶
出させた。次に、該溶出活性画分を０．５ＭＮａＣｌ
を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化
したハイドロキシアパタイト（バイオラッド社）を充填
したカラムに付し、１．４ＭＮａＣｌを含む１０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）でＭＭＤＦを含む吸着物
を溶出させた。

【００３４】次に、該溶出活性画分に、最終濃度が１．
５Ｍになるように硫酸アンモニウムを加え、混合攪拌し
た。この溶液を、１．５Ｍ硫酸アンモニウムを含む５
０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した
疎水性クロマト樹脂であるフェニルセファロ−ス（ファ
ルマシア社）を充填したカラムに付し、硫酸アンモニウ
ム濃度を１．５Ｍから０Ｍの濃度までの直線的勾配で蛋
白質を溶出させた。その結果、約０．７Ｍ硫酸アンモ
ニウム濃度でＭＭＤＦ活性を有する物質が溶出された。
得られた該活性画分を、０．１ＭＮａＣｌを含む５０
ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した陰
イオン交換樹脂であるＱ−セファロ−スハイパフォ−マ
ンス（ファルマシア社）を充填したカラムに付し、塩濃
度を０．１Ｍから０．４Ｍまでの直線的勾配で上昇させ
ることによりＭＭＤＦを含む吸着物を溶出させた。その
結果、図２に示されるように、約０．２５ＭＮａＣｌ
で溶出される画分に活性ピ−クを認めた。さらに、該活
性画分をゲル濾過樹脂であるス−パ−ロ−ズ１２ＨＲ１
０／３０（ファルマシア社）を充填したカラムでＦＰＬ
Ｃ（ＦａｓｔＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅＬｉｑｕｉｄ
Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を行い、０．１５Ｍ
ＮａＣｌを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液で溶出し、
各画分の活性測定を行った。その結果、分子量約４４Ｋ
ＤにＭＭＤＦ活性ピ−クを認めた。

【００３５】実施例４甲状腺癌細胞株ＴＣＯ−１の培
養液から精製したＭＭＤＦのポリアクリルアミドゲル電
気泳動０．１％のＳＤＳを含む分離用１６％ポリアクリルアミ
ドゲルに、実施例２で得られた試料、すなわち、Ｑ−セ
ファロースハイパフォーマンスカラムで分画されたＭＭ
ＤＦ活性画分（Ｆｒ．Ｑ）を付し、非還元条件下及び還
元条件下で電気泳動を行った。ゲル内には０．１％ＳＤ
Ｓを含む２５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）、泳
動内には０．１％ＳＤＳと１９２ｍＭグリシンを含む２
５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）を用いた。１５
ｍＡの定電流で２時間泳動後に、ゲル中の蛋白質を銀染
色キット（和光純薬社）で染色し、泳動の結果を図３に
示す。標準分子量マーカーの分子量（ＫＤ）をレーン左
側に記載した。レーン１は標準分子量マーカー（ファル
マシア社）、レーン２は、実施例２で精製した画分を還
元下で泳動した結果を示し、レーン３は、非還元下で泳
動した結果を示す。同時に平行して、非還元下の同条件
でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、電
気泳動後のゲルを６画分に切り取った。すなわち、標準
分子量マ−カ−との相対的位置からの算定により、１０
ＫＤ以下、１０〜１６ＫＤ、１６〜２２ＫＤ、２２〜３
１ＫＤ、３１〜４６ＫＤ、４６ＫＤ以上の６画分にゲル
を分割して切り取った。切り取ったゲルを破砕し、０．
３％ＳＤＳ溶液中で、４℃で一晩中インキュベ−ション
することにより蛋白質をゲルから抽出した。その後、Ｓ
ＤＳ除去カラムのＡｍｐｕｒｅＤＴに付して、ＳＤＳ
を除去した試料について、実施例１で示した方法により
ＭＭＤＦ活性を測定した。その結果、１６〜２２ＫＤ画
分にだけ活性が認められた。

【００３６】実施例５甲状腺癌ＴＣＯ−１の培養液か
ら精製されたＭＭＤＦの部分アミノ酸配列の解析実施例３で精製したＭＭＤＦ活性画分（Ｆｒ．Ｑ）を約
５μｇ／レーン相当で１６％ＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動に付した後、クマシーブリリアントブル
ーで染色を行った。その後、２０ＫＤ付近のバンドの見
える箇所のゲルを切り出し、水で脱色を行った。さら
に、該ゲルをエッペンドルフチュ−ブ内でよくすり潰
し、０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．５）と０．３
％ＳＤＳ溶液を加えて良く混ぜた後、２５０ｐｍｏｌｅ
のリシルエンドペプチダーゼ（和光純薬社）を加えて、
３７℃で１５時間インキュベーションを行った。消化
後、１μｌのβ−メルカプトエタノールを添加し、さら
に３７℃で１時間インキュベーションを行い、０．２２
μｍのフィルターで濾過し、４ＳＤＳガードカートリッ
ジ（ポリＬＣ社）を繋いだマイクロボンダスフェアーＣ
１８（５μｍ、３００Å）逆相ＨＰＬＣカラム（ウォー
ターズ社）を用いてペプチド断片を分離した。溶離液Ａ
として、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）溶液、溶
離液Ｂとして、０．１％ＴＦＡを含有するイソプロピル
アルコールとアセトニトリルの１：１の混合液を用い、
４０分間に０％から４０％までＢ液を直線的に増加させ
た後、次の２０分間に４０％から８０％まで直線的に増
加させ、さらに、次の１０分間に８０％から９５％まで
増加させ、最終的に１０分間、９５％で流しペプチド断
片を溶出させた。次に、分離されたペプチド断片をプロ
テインシークエンサー（４７７Ａ形アプライドバイオ
システムズ社又はＰＰＳＱ−１０形島津製作所）を用
いてアミノ酸配列を読み取り決定した。その結果、配列
番号４、５、６、７、８、９、１０、１１に示されるア
ミノ酸配列が決定され、天然のＭＭＤＦには、少なくと
もこれら配列番号４−１１に示されるアミノ酸配列が含
まれることが明らかになった。

【００３７】次に、上記と同様に実施例３で精製したＭ
ＭＤＦ活性画分（Ｆｒ．Ｑ）をさらにフェニル５ＰＷ
ＲＰ逆相ＨＰＬＣカラム（ウォーターズ社）に付し、分
離精製を行った。溶離液Ａ及びＢは、上記マイクロボン
ダスフェアーＣ１８逆相ＨＰＬＣカラムの場合と同じ組
成の溶液を使用し、３５分間に５％から４０％までＢ液
を直線的に増加させた後、次の２０分間で４０％から８
０％まで直線的に増加させ、ＭＭＤＦ活性画分をさらに
分離精製した。そして、５本の蛋白質ピークが得られた
ので、それらを分画し、マススペクトル分析を行った
（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ：フィニガンマット社）。その結
果、１６３４３．５ダルトン、１７３２１．９ダルト
ン、１７７１２．０ダルトン、１７８３３．６ダルト
ン、１８５７７．９ダルトンのスペクトルが観測され
た。マススペクトルの精度を約０．０４％とし、配列番
号１を参考にすると、Ｃ末端アミノ酸は、１７７番のグ
リシン（Ｇｌｙ），１８６番のアスパラギン酸（Ａｓ
ｐ）、１９０番のバリン（Ｖａｌ），１９１番のグルタ
ミン酸（Ｇｌｕ）、１９７番のグルタミン酸（Ｇｌｕ）
であると推定された。従って、ＴＣＯ−１細胞由来の天
然のＭＭＤＦは、プロセッシングによりＣ末端にヘテロ
ジェネイティーを有していることが示唆され、少なくと
も配列番号１で示される２５番のスレオニンから１７７
番のグリシンまでを含む蛋白質、２５番のスレオニンか
ら１８６番のアスパラギン酸までを含む蛋白質、２５番
のスレオニンから１９０番のバリンまでを含む蛋白質、
２５番のスレオニンから１９１番のグルタミン酸までを
含む蛋白質、及び２５番のスレオニンから１９７番のグ
ルタミン酸までを含む蛋白質が含まれていることが考え
られた。

【００３８】実施例６ＭＭＤＦをコ−ドするｃＤＮＡ
のクロ−ニングＭＭＤＦを産生するヒト甲状腺癌細胞株ＴＣＯ−１をＲ
ＮＡ調製の供給源とした。細胞は、ＤＭＥＭ培地とハム
Ｆ−１０培地を３：１に混合した培地で維持した。全Ｒ
ＮＡはＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉとＳａｃｃｈｉの方法
（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６２，１５６−１５
９，（１９８７））に従い抽出した。全ＲＮＡからのｍ
ＲＮＡの調製には、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０Ｓｕ
ｐｅｒ（日本合成ゴム株式会社）を使用した。実施例５
で得られたＭＭＤＦの部分アミノ酸配列解析の結果の中
より、配列番号８に含まれるＩｌｅ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−
Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙを基に、５’
−ｄ［ＡＴＣＴＧＣＡＧＡＧＣＴＣＡＧＴＣＡＧＡＡ
Ｇ］−３’、配列番号１１に含まれるＧｌｕ−Ｖａｌ−
Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ａｓｎを基
に、５’−ｄ［ＡＴＴＧＴＴＴＣＴＣＧＴＴＡＡＣＴＣ
ＣＡＣＣＴＣ］−３’の配列を有するオリゴヌクレオチ
ドをＤＮＡ合成装置（３８１Ａ形、アプライドバイオシ
テムズ社）を用いて合成した。上記ｍＲＮＡ０．２μｇ
を鋳型としてＦｉｒｓｔＳｔｒａｎｄｃＤＮＡＳ
ｙｎｔｈｅｓｉｓＳｙｓｔｅｍ（アマシャム社）を用い
て、ＧｕｂｌｅｒとＨｏｆｆｍａｎの方法（Ｇｅｎｅ，
２５，２６３−２６８（１９８３））で１本鎖ｃＤＮＡ
を合成した。次に、これを鋳型に上記２種のオリゴヌク
レオチド及びＰｆｕＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
（ストラタジ−ン社）を使用して９５℃で５分を１サイ
クル、９５℃で１分、６５℃で２５分、７５℃で３分を
４０サイクルの条件でＲＴ−ＰＣＲ反応を実施した。そ
の結果、得られた３２１塩基対のＤＮＡ断片を、一旦、
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋プラスミドベクタ−（ス
トラタジ−ン社）の制限酵素ＥｃｏＲＶによる切断部位
にサブクローン化した後、塩基配列をＰＲＩＳＭＤｙｅ
Ｄｅｏｘｙｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｃｙｃｌｅｓｅ
ｑｕｅｎｃｉｎｇｋｉｔと３７３Ａ型ＤＮＡシーケ
ンサー（パーキンエルマ−社）を用いて決定した結果、
ＰＣＲプライマーの設計に使用したアミノ酸配列以外
に、部分アミノ酸配列の解析で得られていた他の部分ア
ミノ酸配列がコードされていることが確認された。

【００３９】次に、上記ＭＭＤＦ産生細胞のｍＲＮＡ３
μｇを鋳型にしてｃＤＮＡライブラリ−を作製した。す
なわち、ｃＤＮＡｓｙｎｔｈｅｓｉｓｓｙｓｔｅｍ
ｐｌｕｓ（アマシャム社）を用いて合成した２本鎖ｃ
ＤＮＡに、Ｒａｐｉｄａｄａｐｔｏｒｌｉｇａｔｉ
ｏｎｍｏｄｕｌｅ（アマシャム社）を用いて、Ｅｃｏ
ＲＩアダプタ−を付加したものを、ＥｃｏＲＩ消化済の
λｇｔ１０ア−ム（ストラタジ−ン社）に結合した後、
ＧｉｇａｐａｃｋII ｇｏｌｄ（ストラタジ−ン社）を
用いてパッケ−ジングした。上記ＲＴ−ＰＣＲで得られ
たＤＮＡ断片をＭｕｌｔｉｐｒｉｍｅＤＮＡｌａｂ
ｅｌｌｉｎｇｓｙｓｔｅｍと［α³²Ｐ］ｄＣＴＰ（ア
マシャム社）で標識したものをプロ−ブとして使い、得
られたｃＤＮＡライブラリ−のうち、４０万個の組換え
ファ−ジを以下の方法でスクリ−ニングした。すなわ
ち、２３cm×２３cmのＬＢ寒天培地上に、組換えファ−
ジ１０万個と大腸菌ＮＭ５１４株と０．７％アガロ−ス
を含むＬＢ軟寒天培地と共に重層したものを４枚調製
し、３７℃で１２時間、４℃で１時間保温した。生じた
プラークをニトロセルロースフィルターに移し、１．５
ＭＮａＣｌ含有０．５ＭＮａＯＨ溶液に１分、１．
５ＭＮａＣｌ含有０．５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５）に５分、２×ＳＳＣに５分浸した後、風乾し、
ベーキング処理を８０℃で２時間行ってＤＮＡを固定し
た。該フィルタ−を０．１％ＳＤＳ含有６×ＳＳＣに浸
し、６０℃で２０分保温した後６×ＮＥＴ，５×Ｄｅｎ
ｈａｒｄｔ’ｓｓｏｌｕｔｉｏｎ，０．１％ＳＤＳ及
び大腸菌ＤＮＡ１００μｇ／ｍｌからなるプレハイブリ
ダイゼ−ション溶液中で、６５℃で２時間保温し、次い
で同じ組成溶液で標識プロ−ブを含むハイブリダイゼ−
ション溶液中で６５℃で１８時間保温した。保温後、フ
ィルタ−を０．１％ＳＤＳ含有１×ＳＳＣに浸し、６５
℃で保温して洗浄後、風乾し、Ｘ線フィルムと増感スク
リ−ンをあてて、−８０℃で４８時間露光した。現像
後、陽性プラ−ク候補を選択した。同様の方法で２次ス
クリーニングを実施し、７クローンの陽性が確認され
た。得られた７クロ−ンについて、以下のようにしてサ
ブクローニングを実施した。

【００４０】大腸菌ＮＭ５１４株にクローンのファージ
懸濁液を感染させたものにＮＺＹＭ培地を加えた後、３
７℃で１８時間振とうして溶菌液を得た。遠心分離した
上澄みにＤＮａｓｅとＲＮａｓｅをそれぞれ１０μｇ／
ｍｌを添加し、３７℃で２０分保温後、ＰＥＧ６０００
を１０％、ＮａＣｌを１．２５Ｍになるように添加して
氷上で１時間冷却した。その後、遠心分離によってファ
−ジ粒子を含む沈殿を得、１％ＳＤＳ存在下、６５℃で
５分保温した後フェノ−ル抽出及びエタノ−ル沈殿を行
ってファージＤＮＡを得た。得られたＤＮＡを制限酵素
ＥｃｏＲＩで消化し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋の
ＥｃｏＲＩ切断部位に挿入した。それぞれのサブクロー
ンプラスミドＤＮＡを各種制限酵素で消化して制限酵素
切断点地図を作製したところ、これらクローンは同様の
パターンを示したので、その中から３クローン（＃３、
＃５、＃１１）を選び、塩基配列を決定した。その結
果、クロ−ン間に塩基配列の不一致は認められなかった
ので、最長のクロ−ン（＃５）を選び、以下の実験に使
用することとした。

【００４１】＃５の塩基配列（配列番号２）から推定さ
れたコ−ド領域中のアミノ酸配列（配列番号１）中に
は、分泌シグナルであると予想される配列に続き、アミ
ノ末端と考えられる配列（配列番号４）並びに、部分ア
ミノ酸配列解析で得られた全ての配列が含まれているこ
とが確認された。クローン＃５ｃＤＮＡのコード領域を
含むＳｍａＩ−ＨｉｎｄIII 断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉ
ｐｔＳＫ＋に挿入してｐＢＳ［ＭＭＤＦ＃５］を得た。
このプラスミドＤＮＡにより形質転換された大腸菌ＪＭ
１０９をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｐＢＳ
（ＭＭＤＦ＃５）と命名し、工業技術院生命工学工業技
術研究所に平成７年１２月２５日に寄託した（受託番号
ＦＥＲＭＰ−１５３７１）。

【００４２】実施例７ＣＯＳ−１細胞によるＭＭＤＦ
の発現動物細胞での発現ベクタ−であるｐＣＤＭｍｃｓに実施
例６で得られたｃＤＮＡ（配列番号１）を挿入した。す
なわち、発現ベクターｐＣＤＭｍｃｓは、Ｓｅｅｄ（Ｎ
ａｔｕｒｅ，３２９，８４０−８４２（１９８７））に
よって開発されたｐＣＤＭ８のクローニング部位を含む
ＨｉｎｄIII −ＸｂａＩ断片をプラスミドＲｃ／ＲＳＶ
（インビトロジェン社）の同断片で置き換えたものであ
る。次に、実施例６で得たプラスミドＤＮＡｐＢＳ［Ｍ
ＭＤＦ＃５］を制限酵素ＳｍａＩ及びＸｈｏＩで切断し
て生じた断片を、ｐＣＤＭｍｃｓのＥｃｏＲＶとＸｈｏ
Ｉの消化部位に挿入して発現ベクタ−ｐＣＤＭｍｃｓ
［ＭＭＤＦ＃５］を得た。次に、調製したプラスミドＤ
ＮＡ２μｇ／ｍｌ、ＤＥＡＥデキストラン１００μｇ／
ｍｌ、およびクロロキン１００μＭを含むＤＭＥＭ培地
３ｍｌを、予めＣＯＳ−１細胞１×１０⁶個を播種した
ディッシュに添加し、３７℃の５％炭酸ガスインキュベ
ーター内で５時間インキュベーションした。その後、培
地を抜き取り１０％ＤＭＳＯ（ジメチルスルフォキシ
ド）および１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地１．５ｍｌ
を添加して室温で２分間インキュベ−ションした後、ゲ
ンタシン５０μｇ／ｍｌ及び１０％ＦＣＳを含むＤＭＥ
Ｍ培地３ｍｌと培地交換をした。２４時間インキュベ−
ション後、再度、ＤＭＥＭ培地３ｍｌと培地交換をし、
同じ５％炭酸ガスインキュベータ内で培養した。６日間
培養後、培養液を回収し組換え型ＭＭＤＦ（ｒＭＭＤ
Ｆ）のサンプルとした。

【００４３】次に、上記と同様にして、配列番号１に示
される１番のメチオニンから１９７番のグルタミン酸ま
でをコ−ドする遺伝子、１番のメチオニンから１８６番
のアスパラギン酸までをコ−ドする遺伝子を各々別々に
発現ベクターｐＣＤＭｍｃｓに挿入し、各々の発現ベク
タ−を作製した。さらに、同条件でＣＯＳ−１細胞にト
ランスフェクションさせ、６日間培養後の培養液を回収
した。以下、配列番号１をコ−ドする遺伝子を挿入して
得た培養液をｒＭＭＤＦ、１番のメチオニンから１９７
番のグルタミン酸までをコ−ドする遺伝子を挿入して得
た培養液をｒＭＭＤＦ（Ｇｌｕ１９７）、１番のメチオ
ニンから１８６番のアスパラギン酸までをコ−ドする遺
伝子を挿入して得た培養液をｒＭＭＤＦ（Ａｓｐ１８
６）とよぶこととした。

【００４４】実施例８各種組換え型ＭＭＤＦの活性測
定実施例７で示したように、得られた各種組換え体の培養
液、すなわち、ｒＭＭＤＦ、ｒＭＭＤＦ（Ｇｌｕ１９
７）、ｒＭＭＤＦ（Ａｓｐ１８６）について、実施例１
で示した活性測定方法で活性を測定した。同時に、ＭＭ
ＤＦの遺伝子を含まない発現ベクタ−で形質転換させた
細胞（Ｍｏｃｋ細胞）の培養液についても、並行して、
その活性を測定した。その結果、形質転換体の培養液で
あるｒＭＭＤＦ、ｒＭＭＤＦ（Ｇｌｕ１９７）およびｒ
ＭＭＤＦ（Ａｓｐ１８６）にはＭＭＤＦ活性が認められ
たが、Ｍｏｃｋ細胞の培養上清にはＭＭＤＦ活性は認め
られなかった。

【００４５】実施例９各種臓器及び細胞株におけるＭ
ＭＤＦ遺伝子の発現ヒトの各種臓器から抽出したｍＲＮＡを各２μｇずつ、
予めナイロンメンブランに固定してあるＭｕｌｔｉｐｌ
ｅＴｉｓｓｕｅＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔ（クロ
ンテック社）のＨｕｍａｎ，ＨｕｍａｎIIを５×ＳＳＰ
Ｅ，１０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓｓｏｌｕｔｉｏｎ，
５０％ホルムアミド、２％ＳＤＳおよび超音波処理した
Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡ１００μｇ／ｍｌからなるプレ
ハイブリダイゼ−ション溶液中で、４２℃で３時間保温
した後、実施例６で示したものと同じ標識プロ−ブを含
むプレハイブリダイゼ−ション溶液と同組成のハイブリ
ダイゼ−ション溶液中で、４２℃で１８時間保温した。
その後、メンブランを０．１％ＳＤＳ含有の１×ＳＳＣ
に浸し６５℃で保温して洗浄後、風乾し、Ｘ線フィルム
と増感スクリ−ンをあてて、−８０℃で７２時間露光
後、現像した。以上のようにして、ＭＭＤＦ遺伝子の発
現分布をノ−ザンブロッティングで調べた。その結果、
心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾
臓、胸腺、前立腺、精巣、卵巣、小腸、および結腸にＭ
ＭＤＦ遺伝子の発現を示す約３．０ｋｂと約２．１ｋｂ
のバンドが認められたが、末梢血由来白血球にはその存
在は認められなかった。

【００４６】次に、ヒト由来細胞株であるＡ４３１（Ａ
ＴＣＣＣＲＬ１５５５）、Ａ５４９（ＡＴＣＣＣＣ
Ｌ１８５）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣＣＣＬ２）、Ｈｅｐ
Ｇ２（ＡＴＣＣＨＢ８０６５）、ＬｏＶｏ（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ２２９）、ＫＡＴＯ−III （ＡＴＣＣＨＴＢ
１０３）、ＨＬ−６０（ＡＴＣＣＣＣＬ２４０）、Ｋ
５６２（ＡＴＣＣＣＣＬ２４３）、ＴＨＰ−１（ＡＴ
ＣＣＴＩＢ２０２）、Ｕ９３７（ＡＴＣＣＣＲＬ１
５９３）、ＴＣＯ−１（ＪＣＲＢ０２３９）の細胞より
調製したｍＲＮＡ各３μｇを、５０％ホルムアミド、
７．２％ホルムアルデヒド、２０ｍＭＭＯＰＳ緩衝液
（ｐＨ７．０）、０．１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭ酢酸
ナトリウム、エチジウムブロマイド２０μｇ／ｍｌから
なる溶液２０μｌに溶解し、６５℃で１０分間保温し
た。その後、１．２％アガロ−ス、６．６％ホルムアル
デヒド、２０ｍＭＭＯＰＳ緩衝液（ｐＨ７．０），
０．１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭ酢酸ナトリウムからな
るアガロ−スゲルに付し、２０ｍＭＭＯＰＳ緩衝液
（ｐＨ７．０）、１ｍＭＥＤＴＡ，１ｍＭ酢酸ナト
リウムからなる泳動用溶液中で電気泳動を行った。

【００４７】電気泳動後、ゲルを水に５分間浸した後、
５０ｍＭＮａＯＨ中で３０分、０．１Ｍトリス塩酸
緩衝液（ｐＨ７．５）中で３０分処理し、ゲル中のｍＲ
ＮＡを、１０×ＳＳＣを用いたキャピラリ−法でナイロ
ンメンブランに移した。そのメンブランを２×ＳＳＣで
リンスした後、風乾し、８０℃で２時間ベーキングして
ＲＮＡを固定した。次に、メンブランを０．１％ＳＤＳ
含有の４×ＳＳＣに浸し、５０℃で１０分間保温した
後、６×ＳＳＰＥ、１０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓｓｏｌ
ｕｔｉｏｎ，１％ＳＤＳ、４０％ホルムアミド及び超音
波処理したＥ．ｃｏｌｉＤＮＡ１００μｇ／ｍｌから
なるプレハイブリダイゼ−ション溶液中で４５℃で２時
間保温した。そして、５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒ
ｄｔ’ｓｓｏｌｕｔｉｏｎ、０．１％ＳＤＳ、４０％ホ
ルムアミド、１０％デキストラン硫酸、Ｅ．ｃｏｌｉ
ＤＮＡ１００μｇ／ｍｌおよび上記と同様に実施例６
で示したものと同じ標識プロ−ブからなるハイブリダイ
ゼ−ション溶液中で４５℃で１８時間保温した。その
後、メンブランを上記と同様に洗浄、乾燥、露光の操作
を実施した結果、Ａ５４９、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２及
び、ＴＣＯ−１にＭＭＤＦ遺伝子の発現を認めた。

【００４８】実施例１０白血病細胞株（Ｕ９３７）に
対するＭＭＤＦの作用白血病細胞株（Ｕ９３７）を１０％ＦＣＳを含有するＩ
ＭＤＭ培地に浮遊させ、２×１０⁵個／ｍｌに調製後、
９６穴マイクロタイタープレート（コースター社）に５
０μｇ／穴を播種した。その後、粗精製したＭＭＤＦを
総蛋白質濃度で０．１μｇ／ｍｌ添加し、組換え型ＭＭ
ＤＦについては、実施例７で示したように、得られた組
換え体の培養液（ｒＭＭＤＦ）並びに、Ｍｏｃｋ細胞の
培養液を各１０％添加して３日間培養を行った。ＭＴＴ
法で細胞数をカウントした結果、Ｍｏｃｋ細胞の培養液
添加群では細胞にまったく影響はなかったが、粗精製Ｍ
ＭＤＦ添加群では約４０％の増殖抑制が認められ、ｒＭ
ＭＤＦ添加群では約３０％の増殖抑制が認められた。

【００４９】

【発明の効果】本発明により、外来刺激の認識、貪食、
消化、生理活性物質の分泌、抗原提示などの様々な機能
により、生体防御に関与し、抗菌作用および抗腫瘍作用
などを有する細胞である単球或いはマクロファージに対
し長期生存維持させながら、成熟及び分化させる作用を
もつＭＭＤＦが得られた。その結果、抗癌剤、免疫賦活
剤、感染症治療剤として医薬への応用が可能になった。
また本発明により、ＭＭＤＦのｃＤＮＡがクローン化さ
れ、組換え型ＭＭＤＦの活性も確認されたことから、遺
伝子操作技術の方法を用い、ＭＭＤＦの大量生産も可能
になった。

【００５０】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：381 配列の型：アミノ酸鎖の数：１本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質(protein) 配列 Met Ser Ser Arg Ile Ala Arg Ala Leu Ala Leu Val Val Thr Leu Leu 1 5 10 15 His Leu Thr Arg Leu Ala Leu Ser Thr Cys Pro Ala Ala Cys His Cys 20 25 30 Pro Leu Glu Ala Pro Lys Cys Ala Pro Gly Val Gly Leu Val Arg Asp 35 40 45 Gly Cys Gly Cys Cys Lys Val Cys Ala Lys Gln Leu Asn Glu Asp Cys 50 55 60 Ser Lys Thr Gln Pro Cys Asp His Thr Lys Gly Leu Glu Cys Asn Phe 65 70 75 80 Gly Ala Ser Ser Thr Ala Leu Lys Gly Ile Cys Arg Ala Gln Ser Glu 85 90 95 Gly Arg Pro Cys Glu Tyr Asn Ser Arg Ile Tyr Gln Asn Gly Glu Ser 100 105 110 Phe Gln Pro Asn Cys Lys His Gln Cys Thr Cys Ile Asp Gly Ala Val 115 120 125 Gly Cys Ile Pro Leu Cys Pro Gln Glu Leu Ser Leu Pro Asn Leu Gly 130 135 140 Cys Pro Asn Pro Arg Leu Val Lys Val Thr Gly Gln Cys Cys Glu Glu 145 150 155 160 Trp Val Cys Asp Glu Asp Ser Ile Lys Asp Pro Met Glu Asp Gln Asp 165 170 175 Gly Leu Leu Gly Lys Glu Leu Gly Phe Asp Ala Ser Glu Val Glu Leu 180 185 190 Thr Arg Asn Asn Glu Leu Ile Ala Val Gly Lys Gly Ser Ser Leu Lys 195 200 205 Arg Leu Pro Val Phe Gly Met Glu Pro Arg Ile Leu Tyr Asn Pro Leu 210 215 220 Gln Gly Gln Lys Cys Ile Val Gln Thr Thr Ser Trp Ser Gln Cys Ser 225 230 235 240 Lys Thr Cys Gly Thr Gly Ile Ser Thr Arg Val Thr Asn Asp Asn Pro 245 250 255 Glu Cys Arg Leu Val Lys Glu Thr Arg Ile Cys Glu Val Arg Pro Cys 260 265 270 Gly Gln Pro Val Tyr Ser Ser Leu Lys Lys Gly Lys Lys Cys Ser Lys 275 280 285 Thr Lys Lys Ser Pro Glu Pro Val Arg Phe Thr Tyr Ala Gly Cys Leu 290 295 300 Ser Val Lys Lys Tyr Arg Pro Lys Tyr Cys Gly Ser Cys Val Asp Gly 305 310 315 320 Arg Cys Cys Thr Pro Gln Leu Thr Arg Thr Val Lys Met Arg Phe Arg 325 330 335 Cys Glu Asp Gly Glu Thr Phe Ser Lys Asn Val Met Met Ile Gln Ser 340 345 350 Cys Lys Cys Asn Tyr Asn Cys Pro His Ala Asn Glu Ala Ala Phe Pro 355 360 365 Phe Tyr Arg Leu Phe Asn Asp Ile His Lys Phe Arg Asp *** 370 375 380

【００５１】配列番号：２配列の長さ：1146 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA 配列 ATGAGCTCCC GCATCGCCAG GGCGCTCGCC TTAGTCGTCA CCCTTCTCCA CTTGACCAGG 60 CTGGCGCTCT CCACCTGCCC CGCTGCCTGC CACTGCCCCC TGGAGGCGCC CAAGTGCGCG 120 CCGGGAGTCG GGCTGGTCCG GGACGGCTGC GGCTGCTGTA AGGTCTGCGC CAAGCAGCTC 180 AACGAGGACT GCAGCAAAAC GCAGCCCTGC GACCACACCA AGGGGCTGGA ATGCAACTTC 240 GGCGCCAGCT CCACCGCTCT GAAGGGGATC TGCAGAGCTC AGTCAGAGGG CAGACCCTGT 300 GAATATAACT CCAGAATCTA CCAAAACGGG GAAAGTTTCC AGCCCAACTG TAAACATCAG 360 TGCACATGTA TTGATGGCGC CGTGGGCTGC ATTCCTCTGT GTCCCCAAGA ACTATCTCTC 420 CCCAACTTGG GCTGTCCCAA CCCTCGGCTG GTCAAAGTTA CCGGGCAGTG CTGCGAGGAG 480 TGGGTCTGTG ACGAGGATAG TATCAAGGAC CCCATGGAGG ACCAGGACGG CCTCCTTGGC 540 AAGGAGCTGG GATTCGATGC CTCCGAGGTG GAGTTGACGA GAAACAATGA ATTGATTGCA 600 GTTGGAAAAG GCAGCTCACT GAAGCGGCTC CCTGTTTTTG GAATGGAGCC TCGCATCCTA 660 TACAACCCTT TACAAGGCCA GAAATGTATT GTTCAAACAA CTTCATGGTC CCAGTGCTCA 720 AAGACCTGTG GAACTGGTAT CTCCACACGA GTTACCAATG ACAACCCTGA GTGCCGCCTT 780 GTGAAAGAAA CCCGGATTTG TGAGGTGCGG CCTTGTGGAC AGCCAGTGTA CAGCAGCCTG 840 AAAAAGGGCA AGAAATGCAG CAAGACCAAG AAATCCCCCG AACCAGTCAG GTTTACTTAC 900 GCTGGATGTT TGAGTGTGAA GAAATACCGG CCCAAGTACT GCGGTTCCTG CGTGGACGGC 960 CGATGCTGCA CGCCCCAGCT GACCAGGACT GTGAAGATGC GGTTCCGCTG CGAAGATGGG 1020 GAGACATTTT CCAAGAACGT CATGATGATC CAGTCCTGCA AATGCAACTA CAACTGCCCG 1080 CATGCCAATG AAGCAGCGTT TCCCTTCTAC AGGCTGTTCA ATGACATTCA CAAATTTAGG 1140 GACTAA 1146

【００５２】配列番号：３配列の長さ：1146 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA 配列の特徴特徴を表す記号：mat peptide 存在位置： 1..1146 特徴を決定した方法：Ｓ配列 ATG AGC TCC CGC ATC GCC AGG GCG CTC GCC TTA GTC GTC ACC CTT CTC 48 Met Ser Ser Arg Ile Ala Arg Ala Leu Ala Leu Val Val Thr Leu Leu 1 10 CAC TTG ACC AGG CTG GCG CTC TCC ACC TGC CCC GCT GCC TGC CAC TGC 96 His Leu Thr Arg Leu Ala Leu Ser Thr Cys Pro Ala Ala Cys His Cys 20 30 CCC CTG GAG GCG CCC AAG TGC GCG CCG GGA GTC GGG CTG GTC CGG GAC 144 Pro Leu Glu Ala Pro Lys Cys Ala Pro Gly Val Gly Leu Val Arg Asp 40 GGC TGC GGC TGC TGT AAG GTC TGC GCC AAG CAG CTC AAC GAG GAC TGC 192 Gly Cys Gly Cys Cys Lys Val Cys Ala Lys Gln Leu Asn Glu Asp Cys 50 60 AGC AAA ACG CAG CCC TGC GAC CAC ACC AAG GGG CTG GAA TGC AAC TTC 240 Ser Lys Thr Gln Pro Cys Asp His Thr Lys Gly Leu Glu Cys Asn Phe 70 80 GGC GCC AGC TCC ACC GCT CTG AAG GGG ATC TGC AGA GCT CAG TCA GAG 288 Gly Ala Ser Ser Thr Ala Leu Lys Gly Ile Cys Arg Ala Gln Ser Glu 90 GGC AGA CCC TGT GAA TAT AAC TCC AGA ATC TAC CAA AAC GGG GAA AGT 336 Gly Arg Pro Cys Glu Tyr Asn Ser Arg Ile Tyr Gln Asn Gly Glu Ser 100 110 TTC CAG CCC AAC TGT AAA CAT CAG TGC ACA TGT ATT GAT GGC GCC GTG 384 Phe Gln Pro Asn Cys Lys His Gln Cys Thr Cys Ile Asp Gly Ala Val 120 GGC TGC ATT CCT CTG TGT CCC CAA GAA CTA TCT CTC CCC AAC TTG GGC 432 Gly Cys Ile Pro Leu Cys Pro Gln Glu Leu Ser Leu Pro Asn Leu Gly 130 140 TGT CCC AAC CCT CGG CTG GTC AAA GTT ACC GGG CAG TGC TGC GAG GAG 480 Cys Pro Asn Pro Arg Leu Val Lys Val Thr Gly Gln Cys Cys Glu Glu 150 160 TGG GTC TGT GAC GAG GAT AGT ATC AAG GAC CCC ATG GAG GAC CAG GAC 528 Trp Val Cys Asp Glu Asp Ser Ile Lys Asp Pro Met Glu Asp Gln Asp 170 GGC CTC CTT GGC AAG GAG CTG GGA TTC GAT GCC TCC GAG GTG GAG TTG 576 Gly Leu Leu Gly Lys Glu Leu Gly Phe Asp Ala Ser Glu Val Glu Leu 180 190 ACG AGA AAC AAT GAA TTG ATT GCA GTT GGA AAA GGC AGC TCA CTG AAG 624 Thr Arg Asn Asn Glu Leu Ile Ala Val Gly Lys Gly Ser Ser Leu Lys 200 CGG CTC CCT GTT TTT GGA ATG GAG CCT CGC ATC CTA TAC AAC CCT TTA 672 Arg Leu Pro Val Phe Gly Met Glu Pro Arg Ile Leu Tyr Asn Pro Leu 210 220 CAA GGC CAG AAA TGT ATT GTT CAA ACA ACT TCA TGG TCC CAG TGC TCA 720 Gln Gly Gln Lys Cys Ile Val Gln Thr Thr Ser Trp Ser Gln Cys Ser 230 240 AAG ACC TGT GGA ACT GGT ATC TCC ACA CGA GTT ACC AAT GAC AAC CCT 768 Lys Thr Cys Gly Thr Gly Ile Ser Thr Arg Val Thr Asn Asp Asn Pro 250 GAG TGC CGC CTT GTG AAA GAA ACC CGG ATT TGT GAG GTG CGG CCT TGT 816 Glu Cys Arg Leu Val Lys Glu Thr Arg Ile Cys Glu Val Arg Pro Cys 260 270 GGA CAG CCA GTG TAC AGC AGC CTG AAA AAG GGC AAG AAA TGC AGC AAG 864 Gly Gln Pro Val Tyr Ser Ser Leu Lys Lys Gly Lys Lys Cys Ser Lys 280 ACC AAG AAA TCC CCC GAA CCA GTC AGG TTT ACT TAC GCT GGA TGT TTG 912 Thr Lys Lys Ser Pro Glu Pro Val Arg Phe Thr Tyr Ala Gly Cys Leu 290 300 AGT GTG AAG AAA TAC CGG CCC AAG TAC TGC GGT TCC TGC GTG GAC GGC 960 Ser Val Lys Lys Tyr Arg Pro Lys Tyr Cys Gly Ser Cys Val Asp Gly 310 320 CGA TGC TGC ACG CCC CAG CTG ACC AGG ACT GTG AAG ATG CGG TTC CGC 1008 Arg Cys Cys Thr Pro Gln Leu Thr Arg Thr Val Lys Met Arg Phe Arg 330 TGC GAA GAT GGG GAG ACA TTT TCC AAG AAC GTC ATG ATG ATC CAG TCC 1056 Cys Glu Asp Gly Glu Thr Phe Ser Lys Asn Val Met Met Ile Gln Ser 340 350 TGC AAA TGC AAC TAC AAC TGC CCG CAT GCC AAT GAA GCA GCG TTT CCC 1104 Cys Lys Cys Asn Tyr Asn Cys Pro His Ala Asn Glu Ala Ala Phe Pro 360 TTC TAC AGG CTG TTC AAT GAC ATT CAC AAA TTT AGG GAC TAA 1146 Phe Tyr Arg Leu Phe Asn Asp Ile His Lys Phe Arg Asp *** 370 380

【００５３】配列番号：４配列の長さ：14 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列： Thr Cys Pro Ala ３a Cys His Cys Pro Leu Glu Ala Pro Lys 1 5 10

【００５４】配列番号：５配列の長さ：9 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド

【００５５】配列番号：６配列の長さ：3 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド

【００５６】配列番号：７配列の長さ：7 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド

【００５７】配列番号：８配列の長さ：27 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列： Gly Ile Cys Arg Ala Gln Ser Glu Gly Arg Pro Cys Glu Tyr Asn Ser 1 5 10 15 Arg Ile Tyr Gln Asn Gly Glu Ser Phe Gln Pro 20 25

【００５８】配列番号：９配列の長さ：17 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列： Gln Cys Thr Cys Ile Asp Gly Ala Val Gly Cys Ile Pro Leu Cys Pro 1 5 10 15 Gln 17

【００５９】配列番号：１０配列の長さ：8 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド

【００６０】配列番号：１１配列の長さ：15 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列： Glu Leu Gly Phe Asp Ala Ser Glu Val Glu Leu Thr Arg Asn Asn 1 5 10 15

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒト末梢血由来の単球を使い、ＭＭＤＦの活性
をＭＴＴ法で測定した結果を示す図である。

【図２】Ｑ−セファロ−スカラムクロマトグラフィ−に
よる、ＭＭＤＦの精製結果を示す図である。

【図３】Ｑ−セファロ−スカラムクロマトグラフィ−に
より精製されたＭＭＤＦのＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動の結果を示す図である。

【手続補正書】

【提出日】平成８年３月２９日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２５

【補正方法】変更

【補正内容】

【００２５】本発明により得られるＭＭＤＦ活性を有す
る蛋白質は、貪食能、生体防御作用、抗菌作用、抗腫瘍
作用を有する単球又はマクロファージを長期生存維持さ
せながら、成熟及び分化させる作用があることから、通
常使用される担体等と共に医薬組成物とされ、癌治療
剤、白血病治療剤、免疫賦活剤、感染症治療剤、創傷治
療剤として利用することができる。本発明におけるＭＭ
ＤＦ活性を有する蛋白質を含有する癌治療剤、白血病治
療剤、免疫賦活剤、感染症治療剤、創傷治療剤は、経口
あるいは静注、点滴、皮下注射により投与されうる。そ
の投与に際しては、それぞれの投与経路に応じて適当な
形態、例えば経口製剤、注射剤，外用剤として製剤され
る。これらの製剤はそれぞれ常法によって製造され、通
常それぞれの剤型に応じた製薬上許容される担体又は添
加物が配合される。当該治療剤に含有される、ＭＭＤＦ
活性を有する蛋白質の量は、投与方法、剤型、適用疾患
等に応じて適宜変更されうるので特に限定されない。当
該治療剤の投与量は、適用疾患、疾患の程度、投与方
法、患者の年齢等により異なるが、例えば癌患者に対し
て、静脈点滴により投与する場合、通常１００〜１００
０μｇ／ｍ^２を１日１回投与する。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００４８

【補正方法】変更

【補正内容】

【００４８】実施例１０白血病細胞株（Ｕ９３７）に
対するＭＭＤＦの作用白血病細胞株（Ｕ９３７）を１０％ＦＣＳを含有するＩ
ＭＤＭ培地に浮遊させ、２×１０^５個／ｍｌに調製後、
９６穴マイクロタイタープレート（コースター社）に５
０μｌ／穴を播種した。その後、粗精製したＭＭＤＦを
総蛋白質濃度で０．１μｇ／ｍｌ添加し、組換え型ＭＭ
ＤＦについては、実施例７で示したように、得られた組
換え体の培養液（ｒＭＭＤＦ）並びに、Ｍｏｃｋ細胞の
培養液を各１０％添加して３日間培養を行った。ＭＴＴ
法で細胞数をカウントした結果、Ｍｏｃｋ細胞の培養液
添加群では細胞にまったく影響はなかったが、粗精製Ｍ
ＭＤＦ添加群では約４０％の増殖抑制が認められ、ｒＭ
ＭＤＦ添加群では約３０％の増殖抑制が認められた。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５３

【補正方法】変更

【補正内容】

【００５３】配列番号：４配列の長さ：１４配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列：

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＤＸＡ６１Ｋ 37/02 ＡＢＤＣ０７Ｈ 21/04 ＡＤＡＣ０７Ｋ 14/47 ＡＤＵ 14/52 ＡＤＶＣ１２Ｎ 5/10 ＡＤＸＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者原久典滋賀県大津市堅田二丁目１番１号東洋紡績株式会社医薬研究所内 (72)発明者関達也滋賀県大津市堅田二丁目１番１号東洋紡績株式会社医薬研究所内 (72)発明者下西学滋賀県大津市堅田二丁目１番１号東洋紡績株式会社医薬研究所内 (72)発明者長澤鉄二滋賀県大津市堅田二丁目１番１号東洋紡績株式会社医薬研究所内 (72)発明者酒井治美滋賀県大津市堅田二丁目１番１号東洋紡績株式会社医薬研究所内 (72)発明者清水範英滋賀県大津市堅田二丁目１番１号東洋紡績株式会社医薬研究所内 (72)発明者萩屋道雄滋賀県大津市堅田二丁目１番１号東洋紡績株式会社医薬研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】液体培養において、単球またはマクロフ
ァ−ジを長期生存維持させながら、成熟及び分化させる
作用（ＭＭＤＦ活性）を有する蛋白質であることを特徴
とする単球の成熟分化因子。
【請求項２】単球またはマクロファ−ジがヒト細胞由
来のものである、請求項１に記載の単球の成熟分化因
子。
【請求項３】ヒト細胞由来の蛋白質である、請求項１
記載の単球の成熟分化因子。
【請求項４】ヒト細胞が血液由来の白血球を除くヒト
癌組織またはヒト正常組織より樹立された細胞株であ
る、請求項３記載の単球の成熟分化因子。
【請求項５】血液由来の白血球を除くヒト癌組織また
はヒト正常組織より樹立された細胞株であるヒト細胞の
培養液から精製された、請求項１に記載の単球の成熟分
化因子。
【請求項６】液体培養における血清濃度が１％以下
で、単球またはマクロファージを長期生存維持させなが
ら、成熟及び分化させる、請求項１に記載の単球の成熟
分化因子。
【請求項７】液体培養における長期生存維持作用を、
１４日以上継続させる、請求項１に記載の単球の成熟分
化因子。
【請求項８】ゲル濾過法により測定した分子量が、
（４５±５）×１０³ダルトンである、請求項１に記載
の単球の成熟分化因子。
【請求項９】配列番号１に記載のアミノ酸配列を有す
る、請求項１記載の単球の成熟分化因子。
【請求項１０】配列番号１に記載のアミノ酸配列のア
ミノ酸のうち、少なくとも１つが削除または置換された
アミノ酸配列を有するか、または該アミノ酸配列に少な
くとも１つのアミノ酸が付加または挿入されたアミノ酸
配列を有する、請求項１に記載の単球の成熟分化因子。
【請求項１１】遺伝子組換え技術により生産された、
請求項１に記載の単球の成熟分化因子。
【請求項１２】血清濃度が１％以下である液体培養に
おいて、ヒト細胞由来の単球またはマクロファ−ジを１
４日以上継続させて、長期生存維持させながら、成熟及
び分化させる作用を有する、ゲル濾過法により測定した
分子量が、（４５±５）×１０³ダルトンである、ヒト
細胞由来の蛋白質であることを特徴とする単球の成熟分
化因子。
【請求項１３】液体培養において、単球またはマクロ
ファ−ジを長期生存維持させながら、成熟及び分化させ
る作用（ＭＭＤＦ活性）を有する蛋白質をコードするヌ
クレオチド配列を有する単離されたＤＮＡ。
【請求項１４】配列番号１に記載のアミノ酸配列を有
する蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求
項１３に記載の単離されたＤＮＡ。
【請求項１５】配列番号１に記載のアミノ酸配列のア
ミノ酸のうち、少なくとも１つが削除又は置換されたア
ミノ酸配列を有するか、または該アミノ酸配列に少なく
とも１つのアミノ酸が付加又は挿入されたアミノ酸配列
を有し、ＭＭＤＦ活性を有する蛋白質をコ−ドするヌク
レオチド配列を含む、請求項１３に記載の単離されたＤ
ＮＡ。
【請求項１６】配列番号２に記載のヌクレオチド配列
を有する、請求項１３に記載の単離されたＤＮＡ。
【請求項１７】配列番号２に記載のヌクレオチド配列
のヌクレオチドのうち少なくとも１つが削除又は置換さ
れたヌクレオチド配列を有するか、又は該ヌクレオチド
配列に少なくとも１つのヌクレオチドが付加又は挿入さ
れたヌクレオチド配列を有し、ＭＭＤＦ活性を有する蛋
白質をコ−ドする請求項１３に記載の単離されたＤＮ
Ａ。
【請求項１８】発現制御配列を機能しうる形で随伴し
た液体培養において、単球またはマクロファージを長期
生存維持させながら、成熟及び分化させる作用（ＭＭＤ
Ｆ活性）を有する蛋白質をコードするヌクレオチド配列
を含み、形質転換された宿主細胞の培養において、該Ｍ
ＭＤＦ活性を有する蛋白質を発現しうる組換え発現ベク
タ−。
【請求項１９】ＭＭＤＦ活性を有する蛋白質が、配列
番号１に記載のアミノ酸配列を有する請求項１８に記載
の組換え発現ベクタ−。
【請求項２０】ＭＭＤＦ活性を有する蛋白質が、配列
番号１に記載のアミノ酸配列のアミノ酸のうち少なくと
も１つが削除又は置換されたアミノ酸配列を有するか、
又は該アミノ酸配列に少なくとも１つのアミノ酸が付加
又は挿入されたアミノ酸配列を有する請求項１８に記載
の組換え発現ベクタ−。
【請求項２１】ＭＭＤＦ活性を有する蛋白質をコ−ド
するヌクレオチド配列が、配列番号２に記載のヌクレオ
チド配列を含む請求項１８に記載の組換え発現ベクタ
−。
【請求項２２】ＭＭＤＦ活性を有する蛋白質をコ−ド
するヌクレオチド配列が、配列番号２に記載のヌクレオ
チド配列のヌクレオチドのうち少なくとも１つが削除又
は置換されたヌクレオチド配列を有するか、又は該ヌク
レオチド配列に少なくとも１つのヌクレオチドが付加又
は挿入されたヌクレオチド配列を含む請求項１８に記載
の組換え発現ベクタ−。
【請求項２３】ＭＭＤＦ活性を有する蛋白質をコ−ド
するヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクタ−で形質
転換された、該ＭＭＤＦ活性を有する蛋白質を発現する
能力を有する形質転換体。
【請求項２４】大腸菌、酵母、枯草菌、昆虫細胞およ
び哺乳動物細胞からなる群から選択される請求項２３に
記載の形質転換体。
【請求項２５】ＭＭＤＦ活性を有する蛋白質をコ−ド
するヌクレオチド配列が、配列番号１に記載のアミノ酸
配列をコ−ドするヌクレオチド配列を含む請求項２３に
記載の形質転換体。
【請求項２６】ＭＭＤＦ活性を有する蛋白質をコ−ド
するヌクレオチド配列が、配列番号１に記載のアミノ酸
配列のうち少なくとも１つが削除または置換されたアミ
ノ酸配列を有するか、又は該アミノ酸配列に少なくとも
１つのアミノ酸が付加又は挿入されたアミノ酸配列をコ
−ドするヌクレオチド配列を含む請求項２３に記載の形
質転換体。
【請求項２７】ＭＭＤＦ活性を有する蛋白質をコ−ド
するヌクレオチド配列が、配列番号２に記載のヌクレオ
チド配列を含む請求項２３に記載の形質転換体。
【請求項２８】ＭＭＤＦ活性を有する蛋白質をコ−ド
するヌクレオチド配列が、配列番号２に記載のヌクレオ
チド配列のうち少なくとも１つが削除又は置換されたヌ
クレオチド配列を有するか、又は該ヌクレオチド配列に
少なくとも１つのヌクレオチドが付加又は挿入されたヌ
クレオチド配列を含む請求項２３に記載の形質転換体。
【請求項２９】以下の工程を包含する、請求項１に記
載の単球の成熟分化因子を製造する方法。（１）ＭＭＤＦ活性を有する蛋白質を発現しうる組換え
発現ベクタ−で形質転換された形質転換体を培養する工
程。（２）培養物からＭＭＤＦ活性を有する蛋白質を採取す
る工程。
【請求項３０】形質転換体が、請求項２４に記載の形
質転換体である請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】形質転換体が、請求項２５に記載の形
質転換体である請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】形質転換体が、請求項２６に記載の形
質転換体である請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】形質転換体が、請求項２７に記載の形
質転換体である請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】形質転換体が、請求項２８に記載の形
質転換体である請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】請求項２９に記載の方法によって生産
される請求項１に記載の蛋白質。
【請求項３６】ＭＭＤＦ活性を有する蛋白質を治療上
有効な量で含有する医薬組成物。
【請求項３７】癌治療剤、白血病治療剤、免疫賦活
剤、感染症治療剤、及び創傷治療剤から選ばれる請求項
３６記載の医薬組成物。
【請求項３８】発現制御配列を機能しうる形で随伴し
た、ＭＭＤＦ活性を有する蛋白質をコ−ドするヌクレオ
チド配列を有するＤＮＡを含む組換えベクターにより形
質転換された形質転換体を培養し、単球の成熟分化因子
を採取することを特徴とする単球の成熟分化因子の製造
法。