ES2245125T3 - Ensayo de deteccion de las proteinas prion en una conformacion asociada con una enfermadad. - Google Patents

Abstract

Un método de ensayo para determinar la presencia de proteína prión (PrP) en su conformación relacionada con la enfermedad (PrPSc), comprendiendo las etapas de: pretratar una muestra, sospechosa de contener proteína PrP, para destruir o eliminar proteínas no relacionadas con la proteína PrP, reduciendo de ese modo la concentración de proteína en la muestra que no sea proteína PrPSc; tratar la muestra pretratada con un compuesto que destruya o hidrolice toda, o sustancialmente toda, la PrPc en la muestra pero no hidrolice la PrPSc en la muestra; parar la reacción de hidrolización; poner en contacto la muestra sometida al pretratamiento, y tratarla con una pareja de unión que se una a la PrPSc en la muestra; y determinar la presencia de PrPSc en la muestra basada en la unión de la pareja de unión.

Description

Ensayo de detección de las proteínas prión en una conformación asociada con una enfermedad.

Campo de la invención

Esta invención tiene que ver con el campo de los bioensayos, y más concretamente, a un ensayo que hace posible aislar y detectar una conformación de enfermedad de una proteína presente en una muestra natural conteniendo también una conformación de no enfermedad de la proteína.

Antecedentes de la invención

Los priones son patógenos infecciosos que causan enfermedades priónicas invariablemente fatales (encefalopatías espongiformes) del sistema nervioso central en humanos y animales. Los priones se diferencian significativamente de las bacterias, virus y viroides. La hipótesis dominante es que no es necesario ácido nucleico para permitir que prosiga la infectividad de una proteína prión.

Una etapa importante en el estudio de los priones y las enfermedades que causan fue el descubrimiento y purificación de una proteína denominada proteína prión [Bolton, McKinley y col. (1982), Science 218: 1.309-1.311; Prusiner, Bolton y col. (1982), Biochemistry 21: 6.942-6.950; McKinley, Bolton y col. (1983), Cell 35: 57-62]. Los genes completos que codifican la proteína prión han sido después clonados, secuenciados y expresados en animales transgénicos. La PrP^{c} está codificada por un gen del huésped de copia única [Basler, Oesch y col. (1986), Cell 46: 417-428] y, cuando la PrP^{c} es expresada, se encuentra generalmente en la superficie exterior de las neuronas. Muchas líneas de evidencia indican que las enfermedades priónicas resultan de la transformación de la forma normal de la proteína prión (PrP^{c}) en la forma anormal (PrP^{Sc}). No existe una diferencia detectable en la secuencia de aminoácidos de las dos formas. Sin embargo, la PrP^{Sc}, cuando es comparada con la PrP^{c}, tiene una conformación con contenido de lámina \beta superior y \alpha-hélice inferior [Pan, Baldwin y col. (1993), Proc Natl Acad Sci USA 90: 10.962-10.966; Safar, Roller y col. (1993), J Biol Chem 268: 20.276-20.284]. La presencia de la forma anormal PrP^{Sc} en los cerebros de humanos o animales infectados es el único marcador diagnóstico específico de las enfermedades priónicas. La PrP^{Sc} juega un papel clave en la transmisión y patogénesis de las enfermedades priónicas (encefalopatías espongiformes), y es un factor crítico en la degeneración neuronal [Prusiner (1997), The Molecular and Genetic Basis of Neurological Disease, 2ª edición; 103-143]. Las enfermedades priónicas más comunes en animales son el scrapie de ovejas y cabras y la encefalopatía espongiforme bovina (EEB) del ganado vacuno [Wilesmith y Wells (1991), Curr Top Microbiol Immunol 172: 21-38]. Se han identificado cuatro enfermedades priónicas de los humanos: (1) el kuru, (2) la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ), (3) la enfermedad de Gertsmann-Streussler-Sheinker (GSS), y (4) el insomnio familiar fatal (IFF) [Gajdusek (1977), Science 197: 943-960; Medori, Tritschler y col. (1992), N Engl J Med 326: 444-449]. Inicialmente, la presentación de las enfermedades priónicas humanas heredadas encerraba un enigma que ha sido explicado después mediante el origen genético celular de la PrP. En Goldmann (British Medical Bulletin 49: 839-859, 1993) se discute y examina el papel de la proteína prión PrP en la patogénesis de las encefalopatías espongiformes
transmisibles.

Los priones existen en múltiples aislados (cepas) con diferentes características biológicas cuando estas distintas cepas se infectan en huéspedes genéticamente idénticos [Prusiner (1997), The Molecular and Genetic Basis of Neurological Disease, 2ª edición; 165-186]. Las cepas se diferencian por el tiempo de incubación, por la topología de la acumulación de la proteína PrP^{Sc} y, en algunos casos, también por la distribución y características de la patología cerebral [DeArmond y Prusiner (1997), Greenfield's Neuropathology, 6ª edición: 235-280]. Debido a que la PrP^{Sc} es el principal y, muy probablemente, el único componente de los priones, la existencia de cepas de priones ha encerrado el enigma de cómo la información biológica puede estar cifrada en una molécula que no esté compuesta de ácidos nucleicos. Se ha descubierto que el tratamiento proteolítico parcial de homogenados cerebrales conteniendo algunos aislados priónicos genera péptidos con movilidades electroforéticas ligeramente diferentes [Bessen y Marsh (1992), J Virol 66: 2.096-2.101; Bessen y Marsh (1992), J Gen Virol 73: 329-334; Telling, Parchi y col. (1996), Science 274: 2.079-2.082]. Estos descubrimientos sugerían diferentes sitios de escisión proteolítica debido a la distinta conformación de las moléculas de PrP^{Sc} en diferentes cepas de priones. Alternativamente, las diferencias observadas podrían ser explicadas mediante la formación de diferentes complejos con otras moléculas, el formar sitios de escisión distintos en la PrP^{Sc} en cepas diferentes [Marsh y Bessen (1994), Phil Trans R Soc Lond B 343: 413-414]. Algunos investigadores han propuesto que los diferentes aislados priónicos pueden diferir en los patrones de glicosilación de la proteína prión [Collinge, Sidle y col. (1996), Nature 383: 685-690; Hill, Zeidler y col (1997), Lancet 349: 99-100]. Sin embargo, la exactitud de ambos patrones de glicosilación y del trazado del mapa peptídico en diagnósticos de múltiples cepas priónicas está actualmente aún debatido [Collings, Hill y col. (1997), Nature 386: 564; Somerville, Chong y col. (1997), Nature 386: 564].

EP-A-0861 900 describe anticuerpos monoclonales producidos por inmunización de ratones PrP^{0/0} con un fragmento recombinante de PrP.

En Serban y col., Neurology, Vol. 40, Nº 1, enero de 1990, se proporciona un sistema para detectar PrP^{Sc} mediante inmunorreactividad intensificada después de la desnaturalización. El ensayo directo, suficientemente sensible y específico, para la PrP^{Sc} infecciosa en muestras biológicas podría potencialmente abolir, completamente, la necesidad de inoculaciones en animales. Desafortunadamente, no parece ser posible con los ensayos de PrP^{Sc} actuales (se estima que el actual límite de sensibilidad de la detección de PrP^{Sc} basada en proteinasa K y Western blot está en un intervalo de 1 \mug/ml, lo que corresponde a 10^{4}-10^{5} unidades infecciosas priónicas). Adicionalmente, está en cuestión la especificidad de los ensayos tradicionales de PrP^{Sc} basados en proteinasa K, a la luz de los recientes descubrimientos de únicamente la relativa o ninguna resistencia a la proteinasa K de preparaciones priónicas indudablemente infecciosas [Hsiao, Groth y col. (1994), Proc Natl Acad Sci USA 91: 9.126-9.130; Telling y col. (1996), Genes & Dev.].

La transtiretina humana (TTR) es una proteína plasmática normal compuesta de cuatro unidades idénticas estructuradas predominantemente en láminas \beta, y sirve como transportador de hormona tiroxina. El autoensamblaje anormal de la TTR en fibrillas amiloides origina dos formas de enfermedades humanas, a saber, la amiloidosis sistémica senil (ASS) y la polineuropatía amiloide familiar (PAF) [Kelly (1996), Curr Opin Strut Biol 6(1): 11-7]. El origen de la formación amiloide en la PAF son mutaciones puntuales en el gen TTR; la causa de la ASS es desconocida. El diagnóstico clínico es verificado histológicamente, detectando depósitos de amiloide in situ en el material para biopsia.

Hasta la fecha, se sabe poco acerca del mecanismo de la transformación de la TTR en amiloide in vivo. Sin embargo, varios laboratorios han demostrado que la conversión de la amiloide puede ser estimulada in vitro mediante la desnaturalización parcial de TTR humana normal [McCutchen, Colon y col. (1993), Biochemistry 32(45): 12.119-27; McCutchen y Kelly (1993), Biochem Biophys Res Commun 197(2): 415-21]. El mecanismo de la transición conformacional implica un intermedio conformacional monómero que polimeriza en fibrillas amiloides estructuradas en láminas \beta lineales [Lai, Colon y col. (1996), Biochemistry 35(20): 6.470-82]. El proceso puede ser mitigado por la unión con moléculas estabilizadoras tales como tiroxina o triyodofenol [Miroy, Lai y col. (1996), Proc Natl Acad Sci USA 93(26): 15.051-6].

En vista de los aspectos anteriores, existe claramente la necesidad de un ensayo específico, de alto flujo a través, y rentable para ensayar materiales de muestra para la presencia de una proteína patogénica, incluyendo transtiretina y proteína prión.

Sumario

Hay algunas proteínas conocidas que existen en dos o más conformaciones. A menudo, tales proteínas tienen una primera conformación que es la conformación normal de la proteína, y una segunda, la conformación relacionada con la enfermedad. Las dos proteínas están a menudo presentes juntas y, con frecuencia, es difícil determinar la presencia de la conformación de la proteína relacionada con la enfermedad debido a que (1) es difícil obtener parejas de unión, tales como anticuerpos, que se unan a esta conformación; y (2) la conformación relacionada con la enfermedad está presente, a menudo, en una concentración relativamente baja dentro de la muestra, y con respecto a la conformación de no enfermedad. La presente invención se refiere a métodos de ensayo que utilizan tratamientos, enzimas y parejas de unión, tales como anticuerpos, para detectar la conformación de enfermedad de la proteína PrP, denominada PrP^{Sc}, de la manera siguiente:

pretratar una muestra, sospechosa de contener proteína PrP, para destruir o eliminar proteínas no relacionadas con la proteína PrP, reduciendo de ese modo la concentración de proteína en la muestra que no sea proteína PrP^{Sc};

tratar la muestra pretratada con un compuesto que destruya o hidrolice toda, o sustancialmente toda, la PrP^{c} en la muestra pero no hidrolice la PrP^{Sc} en la muestra;

parar la reacción de hidrolización;

poner en contacto la muestra sometida al pretratamiento, y tratarla con una pareja de unión que se una a la PrP^{Sc} en la muestra; y

determinar la presencia de PrP^{Sc} en la muestra basada en la unión de la pareja de unión.

Dependiendo de las etapas utilizadas en el ensayo, se puede utilizar uno de dos tipos de anticuerpos. La muestra es tratada con un compuesto, por ejemplo una metaloendopeptidasa, que hidrolice selectivamente la PrP^{c} pero no la PrP^{Sc}. Después de eso, la muestra tratada puede ser sometida a dos tipos diferentes de tratamiento, cada uno de los cuales utiliza un tipo de anticuerpo generalmente diferente.

El primer tipo general de anticuerpo se une selectivamente a la conformación de enfermedad de la proteína. Por ejemplo, los anticuerpos que identifiquen selectivamente a la PrP^{Sc} se unen a un epítopo en el C-terminal de la proteína. Cuando una proteína PrP está en su configuración PrP^{Sc}, su C-terminal puede ser unido a anticuerpos del tipo descrito en la Patente U.S. 5.846.533, publicada el 8 de diciembre de 1998; también se hace referencia a WO 98/37210 que reivindica el descubrir anticuerpos que se unen a la PrP^{Sc}.

El segundo tipo general de anticuerpo se une a las conformaciones de enfermedad y de no enfermedad de la proteína. Por ejemplo, los anticuerpos que identifiquen un epítopo en el N-terminal de la proteína PrP, identifican ambas PrP^{Sc} y PrP^{c} a continuación de la desnaturalización de las proteínas. Cuando la proteína PrP está en la configuración PrP^{Sc}, el N-terminal no está expuesto y, tal cual, no puede ser unido por un anticuerpo. Para exponer un epítopo del N-terminal, se desnaturaliza la PrP^{Sc}, por ejemplo mediante exposición a guanadina HCl, bajo condiciones (pH, temperatura, y tiempo) que originen que la PrP^{Sc} se despliegue o cambie su estructura tridimensional de manera que se exponga un epítopo del C-terminal. En esta configuración desplegada, se puede utilizar una amplia gama de parejas de unión para su detección, incluyendo anticuerpos disponibles comercialmente. Puesto que tales anticuerpos también se unen a la PrP^{c}, se tiene que eliminar toda la PrP^{c} mediante hidrólisis selectiva.

Un ejemplo de un anticuerpo que se una a un epítopo del N-terminal es el anticuerpo monoclonal 3F4 producido por la línea celular de hibridoma ATCC HB9222, registrada el 8 de octubre de 1986 en la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, y revelada y descrita en la Patente U.S. 4.806.627, publicada el 21 de febrero de 1989, revelando anticuerpos que se unen selectivamente a la PrP^{c} en su forma nativa. Además del anticuerpo, en el ensayo de la invención se podrían utilizar otras parejas de unión que se uniesen a la conformación relacionada con la no enfermedad, pero no a la conformación relacionada con la enfermedad. Están disponibles comercialmente anticuerpos tales como los 3F4 y otros utilizados en los ensayos descritos en los ejemplos.

Una porción de una muestra conteniendo dos conformaciones de una proteína (por ejemplo, PrP^{c} y PrP^{Sc}) puede ser hecha reaccionar con una pareja de unión (por ejemplo R1) que se une a ambas conformaciones, y otra porción de la misma muestra es hecha reaccionar con una pareja de unión (por ejemplo 3F4) que se une únicamente a una de las dos formas (por ejemplo PrP^{c}). La conformación relacionada con la enfermedad es determinada comparando las dos. Si la pareja de unión que se une a ambas conformaciones muestra más unión que la pareja de unión que se une únicamente a una conformación, esto demuestra que en la muestra están presentes ambas conformaciones. Por ejemplo, si R1 se une a más proteína que el 3F4, la PrP^{Sc} está presente en la muestra.

Un aspecto es proporcionar un inmunoensayo que sea aplicable a muestras de ensayo conteniendo proteínas, las cuales muestras sean sospechosas de contener una proteína que existe en una conformación de no enfermedad nativa y una conformación relacionada con la enfermedad (proteína PrP).

Otro aspecto es proporcionar un ensayo que diferencie entre (1) proteínas relacionadas con la enfermedad, o porciones de las mismas, que no sean hidrolizadas por un tratamiento limitado con proteasa, con una proteasa tal como la proteinasa K (proteínas resistentes a la proteasa, por ejemplo, PrP 27-30); y (2) proteínas relacionadas con la enfermedad que sean hidrolizadas por un tratamiento limitado con proteasa, con una proteasa tal como la proteinasa K (por ejemplo, PrP^{Sc} sensible a la proteasa).

El inmunoensayo puede determinar rápida y exactamente la presencia de proteínas en la conformación relacionada con la enfermedad (PrP^{Sc}), incluso aunque el anticuerpo utilizado en el ensayo no se una o tenga un grado muy bajo de afinidad de unión por la proteína en la conformación relacionada con la enfermedad, y la conformación relacionada con la enfermedad esté presente en una concentración inferior a la de la conformación de no enfermedad.

Una característica es que la señal obtenida puede ser intensificada mediante el empleo de animales transgénicos, por ejemplo, ratones que sean utilizados para detectar la presencia de una proteína en una muestra.

Otra característica es que, para intensificar la sensibilidad, se puede utilizar fluorescencia sincrónica intensificada por disociación, o un fluorómetro inducido por láser de longitud de onda dual.

Otra ventaja es que el ensayo puede detectar niveles de la conformación de la proteína, causante de la enfermedad, a una concentración de 1x10^{3} partículas/ml o inferior.

Un objeto específico es proporcionar un ensayo diagnóstico para determinar la presencia de proteína prión infecciosa en materiales de muestra variables obtenidos o derivados de tejidos y/o fluidos corporales humanos, de primate, de mono, de cerdo, bovinos, de oveja, de cabra, de ciervo, de venado, de gato, de perro, de ratón, de pollo, y de
pavo.

Otro objeto es proporcionar un rápido ensayo para la proteína prión infecciosa nativa en los cerebros de animales, transgénicos y no transgénicos, inyectados con material de muestra conteniendo potencialmente priones.

Otro objeto es proporcionar un método para evaluar procedimientos de descontaminación, comprobando el nivel de desnaturalización de las proteínas patogénicas (priones) después de tales tratamientos.

Otra ventaja es que el proceso puede ser realizado sin un anticuerpo directamente capaz de identificar una conformación infecciosa de una proteína, y sin utilizar una etapa con proteinasa K para eliminar la señal de isoformas normales (no enfermedad) de la proteína.

Una característica importante del ensayo es el diseño rápido, rentable, y de alto flujo a través que puede ser diseñado con la capacidad para escrutar 96 muestras por día y placa de 96 pocillos.

Estos y otros objetos, ventajas, y características serán evidentes para aquellos especializados en la técnica al leer los detalles del método de ensayo, el desarrollo de anticuerpos y pruebas, y el ratón transgénico, más completamente descritos a continuación, con referencia a las figuras adjuntadas.

Descripción detallada de las formas de realización preferidas

Antes de que los presentes ensayos y métodos sean revelados y descritos, se comprende que esta invención no se limita a anticuerpos, proteínas, marcadores, ensayos o métodos concretos ya que tales pueden, por supuesto, variar. También se comprende que la terminología utilizada aquí es con el propósito de describir únicamente formas de realización concretas, y no se pretende ser limitante puesto que el campo de aplicación de la presente invención estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntadas.

A menos que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados aquí tienen el mismo significado generalmente comprendido por un especializado en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque en la práctica o ensayo de la presente invención se pueden utilizar cualquier método y materiales similares o equivalentes a los descritos aquí, ahora se describen los métodos y materiales preferidos.

Las publicaciones comentadas aquí son proporcionadas únicamente para la revelación anterior a la fecha de presentación de la presente solicitud. Las fechas de las publicaciones proporcionadas están sometidas a cambio si se descubre que la fecha real de la publicación es diferente de la proporcionada aquí.

Definiciones

El término "proteína", como se utiliza aquí, pretende abarcar cualquier secuencia de aminoácidos e incluir secuencias modificadas tales como glicoproteínas, El término incluye proteínas y péptidos de existencia natural, además de aquellos que sean sintetizados recombinante o sintéticamente. El término "proteína" pretende específicamente comprender proteínas de existencia natural que existan en al menos dos conformaciones diferentes, en donde ambas conformaciones tienen la misma, o sustancialmente la misma, secuencia de aminoácidos pero tienen diferentes estructuras tridimensionales. Las dos conformaciones de la proteína incluyen al menos una conformación que no esté relacionada a un estado de enfermedad, y al menos una conformación que esté relacionada con un estado de enfermedad, patogénico. Una proteína específica como la utilizada a propósito de esta revelación es una proteína PrP que incluye la forma de no enfermedad, mencionada como la forma PrP^{c}, y la forma relacionada con la enfermedad, mencionada como la PrP^{Sc}. Aunque una proteína prión, o la forma PrP^{Sc} de una proteína PrP, es infecciosa y patogénica, la conformación de enfermedad de otras proteínas no es infecciosa aunque sea patogénica. Como se utiliza aquí, el término patogénico puede querer decir que la proteína causa realmente la enfermedad, o puede querer decir sencillamente que la proteína está asociada con la enfermedad y, por lo tanto, está presente cuando la enfermedad está presente. De este modo, una proteína patogénica como la utilizada a propósito de esta revelación no es necesariamente una proteína que sea el agente causativo específico de una enfermedad.

Los términos "pretratamiento", "tratamiento de desplegamiento", y "tratamiento limitado con proteasa" pretenden abarcar las descripciones y uso de estos términos como se suministran en las respectivas secciones que tengan estos encabezamientos.

Los términos "proteína PrP", "PrP" y semejantes son utilizados intercambiablemente aquí, y significarán ambos la forma PrP^{Sc} infecciosa de la partícula conocida por causar enfermedades (encefalopatías espongiformes) en humanos y animales, y la forma PrP^{c} no infecciosa que, bajo condiciones apropiadas, se transforma en la forma PrP^{Sc} infecciosa.

Los términos "prión", "proteína prión" y "proteína PrP^{Sc}" y otros fueron utilizados aquí intercambiablemente para mencionar a la forma PrP^{Sc} infecciosa de la PrP, y es una contracción de las palabras "proteína" e "infección". Las partículas están compuestas en gran parte, si no exclusivamente, de moléculas de PrP^{Sc} codificadas por un gen PrP. Los priones son distintos de las bacterias, virus y viroides. Los priones conocidos infectan a los animales para causar el scrapie, una enfermedad degenerativa transmisible del sistema nervioso de ovejas y cabras, así como la encefalopatía espongiforme bovina (EEB), o "enfermedad de las vacas locas", y la encefalopatía espongiforme felina de los gatos. Los cuatros enfermedades priónicas conocidas por afectar a humanos son (1) el kuru, (2) la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ), (3) la enfermedad de Gertsmann-Streussler-Sheinker (GSS), y (4) el insomnio familiar fatal (IFF). Como se utiliza aquí, "prión" incluye todas las formas de priones que causen todas o alguna de estas enfermedades u otras, en cualquier animal utilizado y, en particular, en humanos y animales de granja domesticados.

El término "gen PrP" es utilizado aquí para describir material genético que exprese proteínas incluyendo polimorfismos y mutaciones patogénicas conocidos. El término "gen PrP" se refiere en general a cualquier gen de alguna especie que codifique cualquier forma de una proteína PrP. Algunas secuencias de PrP comúnmente conocidas están descritas en Gabriel y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 9.097-9.101 (1992), y las Patentes U.S. 5.565.186, 5.763.740, 5.792.901; y WO 97/04814. El gen PrP puede ser de cualquier animal, incluyendo los animales "huésped" y "de ensayo" descritos aquí, y cualquier y todos los polimorfismos y mutaciones del mismo, siendo reconocido que los términos incluyen otros tales genes PrP que estén aún por ser descubiertos. La proteína expresada por tal gen puede tomar la forma PrP^{c} (no enfermedad) o PrP^{Sc} (enfermedad).

El término "pareja de unión" se refiere a cualquier molécula que se une la molécula diana de interés. Preferentemente, la unión es de una afinidad lo suficientemente alta para que haga posible unir moléculas diana de interés presentes a baja concentración, por ejemplo, 1x10^{3} partículas por ml o menos. Más preferentemente, la pareja de unión es selectiva en unirse únicamente a la molécula diana, y no a otras moléculas. Parejas de unión preferidas son los anticuerpos definidos abajo.

El término "anticuerpo" representa una proteína inmunoglobulina que es capaz de unirse a un antígeno. Anticuerpo, como se utiliza aquí, significa que incluye el anticuerpo entero así como cualquier fragmento de anticuerpo [por ejemplo F(ab)', Fab, Fv] capaz de unirse al epítopo, antígeno o fragmento antigénico de interés. Los anticuerpos para los ensayos de la invención pueden ser inmunorreactivos o inmunoespecíficos y, por lo tanto, se unen específica y selectivamente a una proteína de interés, por ejemplo, a una proteína \beta-amiloide A4 o una proteína PrP. Se pueden utilizar anticuerpos que sean inmunorreactivos e inmunoespecíficos para la forma de no enfermedad nativa y la forma de enfermedad tratada, pero no para la forma de enfermedad no tratada (por ejemplo, para la PrP^{c} nativa y la PrP^{Sc} tratada pero no para la PrP^{Sc} nativa), debido a que la muestra es tratada para eliminar, esto es, hidrolizar la PrP^{c}. Los anticuerpos para la PrP son preferentemente inmunoespecíficos, por ejemplo, no sustancialmente interreactivos con materiales afines. Algunos anticuerpos específicos que se pueden utilizar a propósito de la invención están revelados en la solicitud PCT publicada WO 97/10505. Esta solicitud PCT publicada corresponde a la USSN 08/713.939, publicada como Patente U.S. 5.846.533. Los anticuerpos revelados en la solicitud PCT, que se unen a la PrP^{Sc}, pueden ser utilizados para llevar a cabo el ensayo básico de la presente invención cuando la muestra haya sido tratada suficientemente con dispasa, para hidrolizar toda o sustancialmente toda la PrP^{Sc} presente en la muestra. Otro anticuerpo útil para unirse a la PrP^{c} es el anticuerpo monoclonal 3F4 263K producido por la línea celular de hibridoma ATCC HB9222, registrada el 8 de octubre de 1986 en la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, y revelado y descrito en la Patente U.S. 4.806.627, publicada el 21 de febrero de 1989, revelando anticuerpos que se unen selectivamente a la PrP^{c}. El término "anticuerpo" abarca todos los tipos de anticuerpos, por ejemplo, policlonales, monoclonales, y aquellos producidos por metodología de expresión en fagos. Anticuerpos particularmente preferidos son los anticuerpos que tienen un grado relativamente alto de afinidad por la PrP^{c} nativa y la PrP^{Sc} tratada, pero un grado relativamente bajo de afinidad, o sustancialmente ninguno, por la PrP^{Sc}. Más específicamente, los anticuerpos tienen preferentemente cuatro veces o más, más preferentemente quince veces o más, y aún más preferentemente 30 veces o más de afinidad de unión por la PrP^{c} nativa y la PrP^{Sc} desnaturalizada comparada con la afinidad de unión por la PrP^{Sc} nativa.

"Anticuerpo purificado" se refiere al que está suficientemente libre de otras proteínas, carbohidratos, y lípidos, con los que está naturalmente asociado. Tal anticuerpo "se une, de manera preferente", a una conformación de enfermedad desnaturalizada de una proteína tal como la conformación de lámina \beta desnaturalizada de la proteína PrP^{Sc} (o un fragmento antigénico de la misma), y sustancialmente no reconoce o se une a otras moléculas no relacionadas antigénicamente. Un anticuerpo purificado es, preferentemente, inmunorreactivo e inmunoespecífico para una especie específica, y más preferentemente, inmunoespecífico para la PrP^{c} nativa y para formas desnaturalizadas de PrP^{c} y PrP^{Sc} o, alternativamente, para la PrP^{Sc} nativa o no tratada.

"Fragmento antigénico" de una proteína (por ejemplo, una proteína PrP) significa una porción de tal proteína que es capaz de unirse a un anticuerpo.

Mediante "se une específicamente" se quiere decir alta avidez y/o alta afinidad de unión de un anticuerpo hacia un polipéptido específico, por ejemplo, un epítopo de una proteína, por ejemplo, PrP^{Sc} desnaturalizada o proteína \beta-amiloide A4 desnaturalizada. La unión del anticuerpo a su epítopo en este polipéptido específico es preferentemente más fuerte que la unión del mismo anticuerpo a cualquier otro epítopo, particularmente aquellos que puedan estar presentes en moléculas en asociación con o en la misma muestra, como el polipéptido específico de interés por ejemplo, se une más fuertemente a fragmentos de epítopos de una proteína tal como PrP^{Sc}, de modo que, ajustando las condiciones de unión, el anticuerpo se une casi exclusivamente a un sitio epitópico o fragmentos de una proteína deseada tal como un fragmento de epítopo expuesto mediante la desnaturalización de la PrP^{Sc}, y no expuesto en la PrP^{Sc} nativa.

Mediante "anticuerpo marcado detectablemente", "anti-PrP marcado detectablemente", o "fragmento anti-PrP marcado detectablemente" se quiere decir un anticuerpo (o fragmento de anticuerpo que conserva la especificidad de unión) que tiene un marcador detectable unido. El marcador detectable está normalmente unido mediante conjugación química, pero donde el marcador es un polipéptido, podría estar unido alternativamente mediante técnicas de ingeniería genética. Los métodos para la producción de proteínas marcadas detectablemente son conocidos en la técnica. Marcadores detectables conocidos en la técnica, salvo normalmente, son radioisótopos, fluoróforos, marcadores paramagnéticos, enzimas (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante), u otras porciones o compuestos que emitan una señal detectable (por ejemplo, radioactividad, fluorescencia, color) o emitan una señal detectable después de la exposición del marcador en su sustrato. En la técnica se conocen diversas parejas de marcador/sustrato (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante/diaminobencidina, avidita/estreptavidina, luciferasa/luciferina), métodos para marcar anticuerpos, y métodos para utilizar anticuerpos marcados [ver, por ejemplo, Harlow y Lane, eds. (Antibodies: A Laboratory Manual (1988), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)]. El europio es un marcador particularmente preferido.

Las abreviaturas utilizadas aquí incluyen:

SNC para sistema nervioso central;

EEB para encefalopatía espongiforme bovina;

ECJ para enfermedad de Creutzfeldt-Jacob;

IFF para insomnio familiar fatal;

GdnHCl para Guanidina Clorhidrato;

GSS para enfermedad de Gertsmann-Streussler-Sheinker;

Hu para humano;

HuPrP para proteína prión humana;

Mo para ratón;

MoPrP para proteína prión de ratón;

SHa para hámster sirio;

SHaPrP para proteína prión de hámster sirio;

Tg para transgénico;

Tg(SHaPrP) para ratón transgénico conteniendo el gen PrP de un hámster sirio;

Tg(HuPrP) para ratones transgénicos conteniendo el gen PrP humano completo;

Tg(ShePrP) para ratones transgénicos conteniendo el gen PrP de oveja completo;

Tg(BovPrP) para ratones transgénicos conteniendo el gen PrP de vaca completo;

PrP^{Sc} para la isoforma scrapie de la proteína prión;

PrP^{c} para la isoforma normal común, contenida en las células, de la proteína prión;

PrP 27-30 o PrP^{Sc} 27-30 para la forma de PrP^{Sc} resistente al tratamiento o a la proteasa;

MoPrP^{Sc} para la isoforma scrapie de la proteína prión de ratón;

MHu2M para un gen PrP quimérico de ratón/humano en donde la región del gen PrP de ratón está reemplazada por una secuencia humana correspondiente, que se diferencia de la PrP de ratón en 9 codones;

Ratones Tg(MHu2M) son ratones transgénicos de la invención, los cuales incluyen el gen quimérico MHu2M;

MHu2MPrP^{Sc} para la isoforma scrapie del gen PrP quimérico humano/de ratón;

PrP^{ECJ} para la isoforma ECJ de una proteína PrP;

Prnp^{0/0} para la ablación de ambos alelos de un gen endógeno de la proteína prión, por ejemplo, el gen MoPrP;

Tg(SHaPrP^{+/0})81/Prnp^{0/0} para una línea concreta (81) de ratones transgénicos expresando SHaPrP; +/0 indica heterocigoto;

Tg(HuPrP)/Prnp^{0/0} para un ratón híbrido obtenido cruzando un ratón, con un gen humano de la proteína prión (HuPrP), con un ratón con ambos alelos del gen endógeno de la proteína prión rotos;

Tg(MHu2M)/Prnp^{0/0} para un ratón híbrido obtenido cruzando un ratón, con un gen quimérico de la proteína prión (MHu2M), con un ratón con ambos alelos del gen endógeno de la proteína prión rotos;

TTR para transtiretina;

FVB para una cepa endogámica patrón de ratones utilizados a menudo en la producción de ratones transgénicos, puesto que los óvulos de ratones FVB son relativamente grandes y toleran la microinyección de ADN exógeno relativamente bien;

[PrP_{\beta}] B concentración de proteína prión en conformación de lámina \beta;

[\betaA4_{\beta}] B concentración de \beta A4 en conformación de lámina \beta;

[DRC] B concentración de una conformación de una proteína relacionada con la enfermedad.

Aspectos generales

El método de ensayo comprende el proporcionar una muestra sospechosa de contener una proteína que adopta una primera conformación y una segunda conformación relacionada con la enfermedad, y es capaz de detectar una conformación de enfermedad de la proteína cuando está presente en una concentración muy baja con respecto a la concentración de otras proteínas y compuestos que incluyen la conformación de no enfermedad.

El método de ensayo revelado permite a uno aislar y detectar la presencia de una conformación de una proteína, relacionada con la enfermedad (PrP^{Sc}), presente en una muestra conteniendo también la conformación de la proteína relacionada con la no enfermedad (PrP^{c}). La muestra es tratada (por ejemplo, puesta en contacto con dispasa) de una manera que hidrolice la PrP^{c} y no la PrP^{Sc}. La reacción de hidrolización se para (por ejemplo, mediante la adición de EDTA). La muestra tratada es puesta en contacto con una pareja de unión (por ejemplo, un anticuerpo marcado que se une a la PrP^{Sc}), y la existencia de unión proporciona una indicación de que está presente PrP^{Sc}. Alternativamente, la PrP^{Sc} de la muestra tratada es desnaturalizada (por ejemplo, puesta en contacto con guanadina) o desplegada para que haya epítopos expuestos. La PrP^{Sc} desplegada es puesta en contacto con una pareja de unión (por ejemplo, 3F4 marcado) y la aparición de unión indica la presencia de PrP^{Sc} en la muestra.

Conforme a alguna de las formas de realización del ensayo, es necesario pretratar la muestra, que se va a ensayar, para (1) eliminar tantas proteínas contaminantes como sea posible; y (2) aumentar la concentración de proteína en la muestra, relacionada con la enfermedad, con respecto a la conformación de la proteína relacionada con no enfermedad. Por ejemplo, la muestra inicial puede ser tratada químicamente con un compuesto que degrade o desnaturalice preferentemente las proteínas contaminantes y/o la forma aflojada de no enfermedad de la proteína, y/o se exponga a anticuerpos que se unen (para eliminar), de manera preferente, a contaminantes y/o la conformación de no enfermedad de la proteína.

Puede ser posible intensificar además la sensibilidad de diversos aspectos de la invención, concentrando la conformación de enfermedad de una proteína añadiendo un compuesto que se una selectivamente a la conformación de enfermedad para formar un complejo, y centrifugando la muestra para precipitar el complejo, el cual es ensayado después según los métodos descritos aquí. Los aspectos concretos en cuanto a tales métodos de concentración están descritos detalladamente en nuestra solicitud copendiente Nº de Serie 09/026.967, publicada como Patente U.S. 5.977.324 y titulada "Process for Concentrating Protein with Disease-Related Conformation".

Las diferentes formas de realización del ensayo descrito arriba son todas tipos de inmunoensayos "directos", significando que la muestra es directamente ensayada con el anticuerpo marcado, con o sin tratamiento para cambiar la conformación de cualquier proteína, con conformación relacionada con la enfermedad, presente en la muestra. También se puede utilizar un ensayo "indirecto". Por ejemplo, puede ser conveniente aumentar en la muestra el número de proteínas relacionadas con la enfermedad (si las hubiese), mediante el empleo de un ratón transgénico y, de ese modo, intensificar cualquier señal obtenida. Para llevar a cabo estas formas de realización, en primer lugar se utiliza la muestra para inocular un ratón transgénico que ha tenido su genoma modificado, de manera que desarrollará síntomas de enfermedad cuando sea inoculado con proteínas en la conformación relacionada con la enfermedad. Después de que los ratones sean inoculados, se deja que pase un periodo de tiempo suficiente (por ejemplo, 30 días), después de lo cual se sacrifica el animal transgénico y se utiliza una muestra, tal como tejido cerebral homogeneizado del ratón, en el ensayo directo descrito arriba. La presente revelación intensifica la capacidad de los ratones transgénicos para detectar priones, acortando el periodo de tiempo que tiene que pasar hasta que se pueda hacer una determinación como si la muestra original incluyera proteínas en la conformación relacionada con la enfermedad. También sería posible utilizar ratones del tipo revelado y descrito en cualquiera de las Patentes U.S. 5.565.186, 5.763.740, ó 5.792.901, o aplicar PrP etiquetada como se reveló en la Patente U.S. 5.750.361 para purificar por afinidad la PrP^{Sc} del cerebro de un ratón Tg y, después de eso, aplicar el ensayo de la presente invención. Sin la presente revelación, el ratón es inoculado, y uno tiene que esperar hasta que el ratón inoculado demuestre realmente síntomas de la enfermedad. Dependiendo del ratón, este puede tardar varios meses o incluso años. Cualquiera de los ensayos de la presente revelación podría ser utilizado con cualquier ratón transgénico, tal como aquellos descritos antes. Se podría utilizar el ensayo también antes de que el ratón desarrolle síntomas de enfermedad, acortando de ese modo el tiempo necesario para determinar si una muestra incluye proteínas infecciosas.

La metodología del ensayo puede ser aplicada a cualquier tipo de muestra, cuando la muestra sea sospechosa de contener una proteína PrP que exista en al menos dos conformaciones. La proteína tiene que existir en una conformación que se una a anticuerpos conocidos, anticuerpos que se puedan generar u otras parejas de unión específica. La segunda conformación tiene que suficientemente distinta de la primera conformación en términos de su capacidad para ser hidrolizada por un compuesto (por ejemplo, dispasa). En su forma conceptualmente más sencilla, la invención se desarrolla mejor cuando un compuesto hidrolice rápida y completamente la conformación de no enfermedad de la proteína, sin afectar a la conformación relacionada con la enfermedad.

La invención fue desarrollada para ensayar muestras para la presencia de proteínas PrP y determinar si la muestra incluía una proteína PrP en su conformación de enfermedad, esto es, incluía PrP^{Sc}. Por consiguiente, la mayoría de la revelación siguiente está dirigida a utilizar el inmunoensayo de la presente invención para detectar la presencia de PrP^{Sc} en una muestra.

Los anticuerpo utilizados (3F4), marcados con europio, tienen una alta afinidad de unión por la PrP^{c} (conformación de no enfermedad), la cual comprende una conformación rica en alfa-hélice. Los anticuerpos tienen una baja afinidad de unión por la PrP^{Sc} (conformación de enfermedad), la cual comprende una conformación rica en lámina \beta. La IgG puede ser obtenida a partir de anticuerpos monoclonales, policlonales o recombinantes comunes, reconociendo típicamente la secuencia 90-145 de la PrP^{c}, y proteína prión conformacionalmente desplegada. Las diferentes conformaciones de la proteína prión recombinante fueron reticuladas químicamente a placas de poliestireno mediante una etapa de activación con glutaraldehído. Las relativas afinidades de la IgG marcada con europio, con conformación de \alpha-hélice, lámina \beta y de ovillo, de proteína prión de hámster sirio recombinante correspondiente a la secuencia 90-231, fueron determinadas mediante fluorescencia sincrónica intensificada por disociación en un formato de placa de poliestireno de 96 pocillos.

Después de que los anticuerpos marcados hayan sido suministrados con suficiente tiempo, temperatura y condiciones químicas (por ejemplo, pH) para unirse a las proteínas apropiadas presentes en las respectivas porciones, se determina el nivel de unión del anticuerpo marcado a la proteína.

Una vez que un anticuerpo se ha unido a su diana, la detección puede ser difícil debido a la baja concentración de la molécula diana en la muestra. Para la detección se pueden utilizar diferentes métodos.

Dispositivos particularmente útiles son la fluorescencia sincrónica intensificada por disociación y, más preferentemente, los fluorómetros inducidos por láser, de longitud de onda dual [ver Hemmilä y col., Bioanalytical Applications of Labeling Technologies (eds. Hemmilä) 113-119 (Wallas Oy. Turku, Finlandia, 1995)].

Estos dispositivos hacen posible detectar concentraciones en una cantidad en el intervalo de aproximadamente 1x10^{3} partículas por ml o inferior. Se prefiere un alto grado de sensibilidad debido a que, en la mayoría de las muestras, la concentración de proteína en la conformación de enfermedad será muy baja. Por ejemplo, la conformación de no enfermedad de la proteína podría estar presente en una cantidad de aproximadamente 1x10^{8} partículas/ml, mientras que la conformación de enfermedad de la proteína esté únicamente presente en una cantidad de 1x10^{4} partículas/ml.

El ensayo se puede utilizar para comprobar la presencia de la conformación de enfermedad de una proteína PrP dentro de cualquier tipo de muestra. Algunas de las muestras más típicas a ensayar incluyen productos farmacéuticos que comprenden componentes que están derivados de mamíferos vivos, o utilizan materiales derivados de mamíferos vivos en su procesamiento. También sería conveniente ensayar órganos para trasplantes y artículos alimenticios tales como buey, el cual fuera sospechoso de contener priones infecciosos. El ensayo podría ser utilizado para comprobar la presencia de la conformación de enfermedad de PrP^{Sc} infecciosa en productos farmacéuticos, cosméticos, tejido para biopsia o autopsia, cerebro, médula espinal, nervio periférico, músculo, fluido cerebroespinal, sangre y componentes sanguíneos, nodos linfáticos, y cultivos derivados de animales o humanos infectados, o potencialmente infectados, por formas de enfermedad de proteínas tales como priones. Se podrían ensayar los cerebros de vacas sospechosas de estar infectadas con priones (esto es, BoPrP^{Sc}), para determinar si las vacas pueden ser utilizadas sin peligro para el consumo humano.

Tratamiento - general

Los tratamientos son: (1) pretratamiento, (2) tratamiento de desplegamiento, y (3) tratamiento de hidrólisis. Un ensayo puede utilizar todos, o los tratamientos (1) y (3) de los tres tipos básicos de tratamiento que están definidos arriba. En general, las condiciones para el pretratamiento son suaves, moderadas aquellas del tratamiento de desplegamiento, y son severas aquellas para el tratamiento de hidrólisis. Cada tipo de tratamiento puede emplear los mismos medios (por ejemplo, proteasas, pH, temperatura, etc.) pero cada uno emplea un grado diferente, por ejemplo, concentración superior, mayor tiempo, mayor temperatura. Sin embargo, el tratamiento de hidrólisis tiene que emplear un compuesto que hidrolice selectivamente sólo la conformación de no enfermedad y no la conformación de enfermedad.

Pretratamiento

Antes de llevar a cabo el tratamiento o el ensayo por anticuerpos de la muestra, es necesario someter la muestra a pretratamiento. Se realiza el pretratamiento para destruir o eliminar las proteínas no afines, así como alguna forma de no enfermedad de la proteína presente dentro de la muestra. Ejemplos de metodología de pretratamiento abarcan el producir una columna que incluya anticuerpos unidos a superficies soporte, los cuales anticuerpos se unen a la conformación de no enfermedad de la proteína, eliminado de ese modo tanta conformación de no enfermedad de las proteínas como sea posible. También se pueden utilizar anticuerpos que se unan a proteínas no afines pero comunes. Alternativamente, la muestra puede ser sometida a tratamiento físico, tal como presión o temperatura hidrostática de largo plazo, solas o en combinación con productos químicos tales como ácidos o álcalis como se indicó antes, para destruir proteínas presentes en la muestra, las cuales proteínas no son afines a aquellas que se van a ensayar o que están en conformación de no enfermedad. En algunos casos, serán destruidas las proteínas en conformación de no enfermedad y de enfermedad. Sin embargo, será destruido un porcentaje relativamente alto de las proteínas en la conformación de no enfermedad porque estas proteínas están inicialmente en una conformación más libre, que sea más vulnerable a la destrucción. De este modo, la metodología del pretratamiento produce una muestra que incluye una concentración relativamente inferior de la conformación de no enfermedad de la proteína con respecto a la concentración de la conformación de enfermedad de la proteína. Además, la muestra pretratada tendrá una concentración inferior de proteínas no afines. Esto aumenta la sensibilidad del ensayo, haciendo posible que detecte concentraciones inferiores de la conformación de enfermedad de la proteína. Se prefiere la eliminación de proteínas sobre la destrucción de tales porque la destrucción disminuirá la sensibilidad si se destruye la conformación de enfermedad. Un método de pretratamiento particularmente útil está revelado en nuestra solicitud de patente Nº de serie 09/026.967, publicada como Patente U.S. 5.977.324, y titulada "Process for Concentrating Protein with Disease-Related Conformation".

Tratamiento de desplegamiento

El tratamiento de desplegamiento desnaturaliza la proteína pero no hidroliza las proteínas de interés, y puede incluir el exponer las proteínas a cualquier método físico y/o químico que cause que la proteína, que está originalmente presente en una apretada conformación relacionada con la enfermedad (por ejemplo, PrP^{Sc}), adopte una conformación más aflojada que tenga un mayor grado de afinidad de unión por cualquier pareja de unión tal como anticuerpos (por ejemplo, exponer un epítopo del N-terminal de la PrP^{Sc}). En general, el tratamiento de desplegamiento implica el someter la proteína a algunos métodos que originen epítopos en la proteína, los cuales no estuvieran previamente expuestos, o parcialmente expuestos, para llegar a estar expuestos, o llegar a estar más expuestos, para que un anticuerpo u otra pareja de unión pueda unirse más rápidamente al epítopo recién expuesto.

Los métodos utilizados para el tratamiento de desplegamiento pueden comprender: (1) físicos, tales como presión o temperatura hidrostática, (2) químicos, tales como pH ácido o alcalino, sales caotrópicas, detergentes desnaturalizantes, clorhidrato de guanidina y proteinasas tales como la proteinasa K, y (3) combinaciones de los anteriores. Se tienen que tomar en cuenta la concentración, temperatura y tiempo a fin de que se obtenga el efecto deseado, por ejemplo, el desplegamiento pero no la hidrólisis.

El tiempo del tratamiento variará dependiendo del tratamiento utilizado, pero debería ser realizado durante suficiente tiempo para obtener el efecto deseado, por ejemplo, para el tratamiento de desplegamiento exponer nuevos sitios de unión pero siempre que no desnaturalice o hidrolice completamente la proteína. Cuando se lleva a cabo el tratamiento de desplegamiento en proteínas PrP sin tratamiento químico, se aumenta la temperatura a unos 40ºC hasta unos 80ºC, durante suficiente tiempo, ara obtener la cantidad deseada de desplegamiento de PrP^{Sc}. Se puede disminuir la temperatura y acortar el tiempo si se sube el pH hasta 12 ó 13.

Tratamiento de hidrólisis

El tratamiento de hidrólisis es un tratamiento lítico que es el método de tratamiento más importante utilizado en los ensayos de la invención. Después de que una muestra haya sido sometida al tratamiento de pretratamiento, es sometida al tratamiento de hidrólisis. Este tratamiento destruirá o hidrolizará toda, o sustancialmente toda, la proteína en la muestra, la cual está en conformación de no enfermedad, y no hidrolizará la proteína en la conformación de enfermedad. El tratamiento de hidrólisis es, preferentemente, vía una enzima tal como una hidrolasa que actúa en los enlaces peptídicos, preferentemente una proteasa neutra, más preferentemente una metaloendopeptidasa, y sumamente preferente dispasa o peptidasa A de leucostoma. Las proteasas utilizadas en el método de la invención pueden ser utilizadas solas, en combinación, o conjuntamente con enzimas que tengan actividad similar pero distinta, tales como una carbohidrasa, por ejemplo, colagenasa, amilasa, o serín-proteasa alcalina. La concentración de los compuestos tratadores, así como el tiempo y temperatura, variarán con la proteína a tratar y el resultado final a obtener. El tratamiento se lleva a cabo para hidrolizar toda, o sustancialmente toda, la no PrP^{c} presente, pero no hidrolizar la PrP^{Sc}. El objeto de este tratamiento es hidrolizar tanta proteína de no enfermedad como sea posible (preferentemente toda), mientras se hidroliza tan poca (preferentemente ninguna) proteína relacionada con la enfermedad como sea posible. El tratamiento está preferentemente diseñado de manera que pueda ser rápida y completamente detenido en cualquier momento dado. Por ejemplo, la hidrólisis de PrP^{c} con dispasa u otra proteasa afín puede ser detenida añadiendo EDTA.

La lista siguiente de enzimas son compuestos preferidos para su uso en el método de la invención:

Enzima	Fuente biológica
Dispasa	Bacillus polymyxa
Atrolisina A, B, C, E y F	Serpiente de cascabel Crotalus atrox
Envelisina	Diversos miembros de la clase Echinoidea
Oligopeptidasa Thimet	afín a la sacarolisina de Saccharomyces cerevisiae
Matrilisina	Útero de rata
Vibriolisina	Vibrio proteolyticus (antiguamente Aeromonas proteolytica)
Cocolisina	Streptococcus thermophilus
Micolisina	Streptomyces griseus

(Continuación)

Enzima	Fuente biológica
Meprin A	\begin{minipage}[t]{105mm} Membrana apical renal e intestinal de ratus norvergicus y musculus albinus \end{minipage}
Astacina	El cangrejo de río Astacus fluviatilis
Aureolisina	Staphylococcus aureus
Leishmanolisina	Diversas especies de protozoos Leishmania
Peptidil-Asp-metaloendopeptidasa	Pseudomonas fragi
Autolisina	Chlamydomonas reinhardtii
Deuterolisina	\begin{minipage}[t]{105mm} Penicillium roqueforti; las variantes de la especie incluyen Penicillium caseicolum, Aspergillus sojae, y Aspergillus oryzae \end{minipage}
Botrolisina	Veneno de serpiente de cascabel Bothrops jararaca
Estromelisina 1 y 2	Fibroblastos sinoviales reumatoides humanos
Bacilolisina	\begin{minipage}[t]{105mm} Bacillus Subtilis; las variantes de la especie incluyen Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus megaterium, Bacillus mesentericus, Bacillus cereus, y Bacillus stearothermophilus \end{minipage}
Termolisina	\begin{minipage}[t]{105mm} Bacillus thermoproteolyticus; las variantes de la especie incluyen Micrococcus caseolyticus y Aspergillus oryzae \end{minipage}
Aeromonolisina	Hongo de la miel Armillaria mellea
Leucolisina	\begin{minipage}[t]{105mm} Veneno de serpiente mocasín boca de algodón, Agkistrodon piscivorus \end{minipage}
Micolisina	\begin{minipage}[t]{105mm} Streptomyces griseus, Streptomyces naraensis, y Streptomyces cacaoi \end{minipage}
Pseudo-lisina	Pseudomonas aeruginosa
Peptidil-Lys-metaloendopeptidasa	Pseudomonas fragi
Neprilisina	\begin{minipage}[t]{105mm} Ampliamente distribuida en los tejidos de mamíferos, incluyendo cerebro, hígado y pulmón; abundante en la membrana apical de riñón \end{minipage}
Metaloendopeptidasa lítica \beta	\begin{minipage}[t]{105mm} Achromobacter lyticus y Lysobacter enzymogenes \end{minipage}
Ofiolisina	Veneno de la cobra rey Ophiophagus hannah
Pitrilisina	Escherichia coli
Insulisina	Mamíferos y Drosophila melanogasters
Serralisina	\begin{minipage}[t]{105mm} Pseudomonas aeruginosa; las variantes de la especie incluyen Escheria freundii, Serratia marcescens, y Erwinia chrysanthemi \end{minipage}

El método de la invención no se limita a estas enzimas y, de este modo, se pueden utilizar otras enzimas conocidas por aquellos especializados en la técnica, para funcionar en el método de la invención.

Proteínas de unión a superficies soporte

Los métodos de acoplamiento químico o de afinidad de la proteína PrP al soporte de plástico están descritos en general en la bibliografía disponible y pueden variar. Los anticuerpos utilizados en el ensayo diagnóstico son Fab policlonales, monoclonales o recombinantes, y necesitan ser específicos de la especie, con unión preferencial a la PrP^{c} nativa o a la forma desnaturalizada de la PrP^{Sc}, preferentemente con al menos una reactividad 4 veces inferior con la PrP^{Sc} infecciosa, asumiendo la misma cantidad de antígeno.

Utilizar el ensayo para detectar priones (PrP^{Sc})

Un aspecto de la invención es un proceso de dos etapas para diagnosticar la enfermedad priónica midiendo cuantitativamente la forma infecciosa nativa de la proteína PrP^{Sc} en un material de muestra, o en los cerebros de animales susceptibles inoculados con tal material. La muestra es pretratada para eliminar tanta proteína no afín y de no enfermedad como sea posible. La muestra pretratada es sometida en primer lugar a tratamiento de hidrólisis, y reticulada después al soporte plástico.

Para medir la concentración de PrP^{Sc} cuando sea mucho menor que la de PrP^{c}, el sistema de detección tiene que tener una sensibilidad excepcional y una escala lineal de al menos 10^{4}. El ensayo descrito aquí puede detectar fácilmente PrP^{Sc} a una concentración de (aproximadamente) 50 pg/ml utilizando IgG marcada con europio. Asumiendo 10^{5}-10^{6} moléculas de PrP^{Sc} por unidad de ID_{50}, el presente ensayo puede detectar fácilmente 5x10^{2} B 5x10^{3} unidades de ID_{50} por ml.

El ensayo puede detectar PrP^{Sc} en mezclas (mediante método directo) donde la concentración de PrP^{Sc} sea inferior al 1% de la concentración de PrP^{c}. Se puede lograr sensibilidad adicional por inmunoprecipitación, utilizando un formato "sándwich" para un ensayo en estado sólido, centrifugación diferencial con extracción con detergente para eliminar la PrP^{c}, el método indirecto en animales transgénicos, o combinaciones de estos métodos. Una estimación conservadora es que tales procedimientos deberían permitir la medición de entre 5 y 10 unidades de ID_{50} por ml o inferior, o menos conservadoramente, medir entre 0'1 y 0'01 unidades de ID_{50} por ml. Tales mediciones proporcionarían un rápido método "positivo" para establecer la esterilidad biológica, que es la "ausencia" de infectividad.

Anticuerpos

Los métodos para generar anticuerpos son conocidos en general por aquellos especializados en la técnica. Por cuanto que la forma de enfermedad está a menudo en una configuración más apretada que la forma de no enfermedad, con menos epítopos expuestos, uno puede generar fácilmente anticuerpos que se unan únicamente a la forma de no enfermedad de la proteína, o a la forma de enfermedad tratada. Por ejemplo, se pueden generar anticuerpos, que detecten formas tratadas de la proteína PrP^{c} y la proteína PrP^{Sc}, inmunizando conejos o ratones con conformaciones \alpha-helicoidales de PrP recombinante, PrP^{c} nativa de cerebros de animales, péptidos sintéticos en conformaciones \alpha-helicoidales o de ovillo, o contra PrP^{Sc} desnaturalizada o PrP 27-30. Únicamente se deberían seleccionar anticuerpos con afinidad al menos 4 veces superior por la PrP^{c} (o conformación desnaturalizada de la PrP^{Sc} de la misma especie) comparada con su afinidad por la PrP^{Sc}. Puede variar el método de generación, purificación, marcaje y detección de anticuerpos.

La IgG o Fab's pueden ser purificados a partir de diferentes fuentes mediante HPLC de afinidad utilizando HPLC en columna de proteína A y de exclusión granulométrica. Los anticuerpos purificados pueden ser marcados con europio, y detectados mediante fluorescencia sincrónica. La unión del anticuerpo a diferentes conformaciones de proteína PrP se puede medir mediante fluorescencia sincrónica intensificada por disociación. Sin embargo, puede variar el sistema de detección de la IgG unida a PrP en el soporte sólido, in situ o en solución. Además, es posible utilizar métodos inmunológicos directos o indirectos comprendiendo ensayos directos con radiomarcadores, fluorescencia, luminiscencia, amplificación con avidita-biotina, o de unión enzimática con sustratos cromáticos o luminiscen-
tes.

Un anticuerpo que se puede utilizar en la invención está revelado en U.S. 4.806.627, publicada el 21 de febrero de 1989, revelando el anticuerpo monoclonal 3F4 263K producido por la línea celular ATCC HB9222, registrada el 8 de octubre de 1986. La línea celular que produce el anticuerpo puede ser obtenida de la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852.

En general, la infección por scrapie fracasa, para producir una respuesta inmune, con organismos huésped que son tolerantes a la PrP^{Sc} de la misma especie. Los anticuerpos que se unen a PrP^{c} o a PrP^{Sc} están revelados en la Patente U.S. 5.846.533, publicada el 8 de diciembre de 1998. Se puede utilizar cualquier unión de anticuerpo a PrP^{c} y no a PrP^{Sc}, y aquellos especializados en la técnica pueden generar tales utilizando procedimientos conocidos, por ejemplo, ver los métodos para producir librerías de anticuerpos expresados en fagos en la U.S. 5.223.409. Sin embargo, han sido provocados anticuerpos policlonales anti-PrP en conejos después de inmunización con grandes cantidades de SHaPrP 27-30 desnaturalizada con ácido fórmico o SDS [Bendheim, Barry y col., (1984), Nature 310: 418-421; Bode, Pocchiari y col., (1985), J Gen Virol 66: 2.471-2.478; Safar, Ceroni y col., (1990), Neurology 40: 513-517]. De manera similar, en ratones han sido producidos un puñado de anticuerpos monoclonales anti-PrP contra PrP 27-30 [Barry y Prusiner (1986), J Infect Dis 154: 518-521; Kascsak, Rubenstein y col., (1987), J Virol 61: 3.688-3.693]. Estos anticuerpos fueron generados contra PrP 27-30 desnaturalizada con ácido fórmico o SDS, y son capaces de reconocer PrP^{c} nativa y PrP^{Sc} tratada o desnaturalizada de SHa y humanos igualmente bien, pero no se unen a PrP^{Sc} nativa. De modo no sorprendente, fue trazado el mapa de los epítopos de estos anticuerpos para las regiones de la secuencia conteniendo diferencias de aminoácidos entre la PrP de SHA y la de Mo [Rogers, Yehiely y col., (1993), Proc Natl Acad Sci USA 90: 3.182-3.186].

No está completamente claro porqué muchos anticuerpos del tipo descrito en las publicaciones citadas arriba se unirán a PrP^{c} y a PrP^{Sc} tratada o desnaturalizada, pero no a PrP^{Sc} nativa. Sin atarse a ninguna teoría concreta, se sugiere que tal puede tener lugar debido a que los epítopos que están expuestos cuando la proteína está en la conformación PrP^{c}, no están expuestos, o parcialmente ocultos, en la configuración PrP^{Sc} donde la proteína es relativamente insoluble y más compactadamente plegada a la vez.

Por lo que concierne a la invención, la indicación de que no ocurra unión significa que la constante de equilibrio o de afinidad K_{a} es 10^{6} l/mol o inferior. Además, la unión será reconocida como existente cuando la K_{a} sea 10^{7} l/mol o mayor, preferentemente 10^{8} l/mol o mayor. La afinidad de unión de 10^{7} l/mol o más puede ser debida a (1) un único anticuerpo monoclonal (esto es, muchos de una clase de anticuerpo), o (2) una pluralidad de diferentes anticuerpos monoclonales (por ejemplo, muchos de cada uno de cinco diferentes anticuerpos monoclonales), o (3) muchos anticuerpos policlonales. También es posible utilizar combinaciones de (1)-(3). Los anticuerpos preferidos seleccionados se unirán al menos cuatro veces más ávidamente a las formas PrP^{Sc} tratada o desnaturalizada de la proteína cuando se compara con su unión a la conformación nativa de PrP^{Sc}. El diferencial de cuatro veces en una afinidad de unión puede ser realizado utilizando varios anticuerpos diferentes como por (1)-(3) arriba, y como semejante, alguno de los anticuerpos en una mezcla podría tener menos de una diferencia de cuatro veces.

Se puede utilizar varios tipos diferentes de ensayos de la invención con uno o más anticuerpos distintos. Aquellos especializados en la técnica reconocerán que los anticuerpos pueden ser marcados con marcadores conocidos, y utilizados con robótica, ensayos tipo "sándwich", detectores electrónicos, citometría de flujo, y otros actualmente disponibles.

Mutaciones patogénicas y polimorfismos en el gen PrP

A continuación se dan las mutaciones patogénicas y polimorfismos conocidos en el gen PrP relacionados con las enfermedades priónicas, y las secuencias de humano, de oveja y bovina están dadas en la U.S. 5.565.186, publicada el 15 de octubre de 1996.

TABLA DE MUTACIONES

Mutaciones humanas patogénicas	Polimorfismos humanos	Polimorfismos en oveja	Polimorfismos bovinos
Inserto de 2 octarrepeticiones	Met/Val en el	Arg/Glu en el	5 ó 6
	codon 129	codon 171	octarrepeticiones
Inserto de 4 octarrepeticiones	Glu/Lys en el	Ala/Val en el
	codon 219	codon 136
Inserto de 5 octarrepeticiones
Inserto de 6 octarrepeticiones
Inserto de 7 octarrepeticiones
Inserto de 8 octarrepeticiones
Inserto de 9 octarrepeticiones
Pro-Leu en el codon 102
Pro-Leu en el codon 105
Ala-Val en el codon 117
Terminación en el codon 145
Asp-Asn en el codon 178
Val-Ile en el codon 180
Phe-Ser en el codon 198
Glu-Lys en el codon 200
Val-Ile en el codon 210
Asn-Arg en el codon 217
Met-Ala en el codon 232

Ejemplos

Los ejemplos siguientes están expuestos con el fin de proporcionar a aquellos especializados en la técnica una completa revelación y descripción de cómo hacer y utilizar los ensayos de la presente invención, y no pretenden limitar el campo de aplicación de lo que los inventores consideran como su invención, no pretenden representar o presuponer que los experimentos a continuación sean todos o los únicos experimentos realizados. Se han hecho esfuerzos para asegurar la exactitud con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.), pero algunos errores y desviaciones experimentales deberían ser justificados. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular promedio en peso, la temperatura está en grados centígrados, y la presión es, o casi, la atmosférica.

Ejemplo 1 Detección de PrP^{Sc} en cerebro de hámster

Para determinar los niveles de PrP^{Sc} en hámsters afectados, se sacrificaron un hámster infectado con priones y un hámster normal, y se extrajeron sus cerebros. Se preparó un homogenado al 10% (p/v) de cada uno de los cerebros, dispersando el tejido cerebral en PBS. Después, el homogenado de cerebro fue sometido a una centrifugación a baja velocidad de 500 xg, durante 15 minutos, para separar las proteínas suspendidas de los detritus celulares no deseados. Se midió la concentración de proteína total del sobrenadante (S1) utilizando un Ensayo de Proteínas BCA (Pierce), y se ajustó la concentración de cada homogenado de cerebro con PBS hasta 3'5 mg/ml. Se guardó una porción del homogenado para que sirviera como control de las proteínas cerebrales totales.

Se añadió la metaloendopeptidasa dispasa (Worthington) al resto de cada muestra, en una proporción enzima a proteína de 1:35. Los homogenados fueron digeridos con 100 \mug/ml de dispasa durante 60 minutos a 37ºC, en presencia de 0'15% de Zwittergent 3-12 (Calbiochem), o 0'2% ó 2% de dodecilsarcosinato sódico (Sarkosyl). También se puso a 37ºC una muestra sin la dispasa, para que sirviera como control de la digestión. Después de la digestión, se inactivó la dispasa mediante la adición de EDTA 50 mM.

Como control, se realizó la digestión con proteinasa K en cada muestra de S1 sin tratar, con 20 \mug/ml a una proporción de enzima a proteína de 1:50 (Bolton, 1982), en presencia de 0'15% de Zwittergent, Sarkosyl al 0'2% ó 2%. Estas reacciones se terminaron mediante la adición de PMSF 2 mM.

Las muestras digeridas fueron centrifugadas a 100.000 xg durante 1 hora. El gránulo conteniendo todas las proteínas insolubles fue resuspendido en un volumen mínimo de PBS y 0'15% de Zwittergent. Posteriormente, las muestras digeridas y las muestras de homogenado de cerebro completas fueron sonicadas en un sonicador con baño de agua, durante 20 minutos, para desnaturalizar la proteína que quedaba después de la digestión.

Después, se analizó cada muestra por su contenido de proteína PrP mediante inmunoblot. Se puso una alícuota de 100 \mul de cada muestra en un tubo Eppendorf de 1'5 ml, con un volumen igual de tampón de carga de la muestra (1X = TrisCl 50 mM, pH 6'8; DTT 100 mM, 2% de SDS; 0'1% de azul de bromofenol; y 10% de glicerina). Además, se puede añadir una alícuota de \beta-mercaptoetanol para asegurar la desnaturalización de las proteínas en el gel. Las muestras fueron aplicadas sobre un gel de poliacrilamida al 10%, proporción molar de bisacrilamida:acrilamida de 1:29; para 15 V/cm durante unas 4 horas. Las muestras fueron cada una hervidas durante 10 minutos, y se cargó 15 \mul de cada muestra sobre el gel. Para una descripción más detallada de la separación de proteínas vía PAGE, ver Schägger y Von Jagow, Nature 166: 368-379 (1987); y Laemmli (G.B.) (1970), Nature 227,
680-685.

El gel fue extraído del aparato PAGE, y transferido sobre nylon no cargado (Amersham) utilizando un aparato de electroblotting. El gel y el nylon fueron emparedados entre piezas de papel Whatman 3MM remojadas en un tampón de transferencia conteniendo Tris, glicina, SDS y metanol. El sándwich fue colocado entre electrodos con placas de grafito, con el nylon en el lado anódico. Se aplicó una corriente de 0'65 mA/cm^{2} durante 1'5-2 horas. Después de la transferencia, se tiñó el gel con azul Coomasie para asegurarse de que la transferencia fue completa.

El filtro de nylon fue colocado en una bolsa de plástico termosellable, y se añadieron 0'1 ml de solución bloqueante por cm^{2} de filtro. La solución bloqueante contenía 5% (p/v) de leche descremada en polvo (Carnation), 0'01% de antiespumante A, y 0'02% de azida sódica en PBS. Después de agitar 1 hora a temperatura ambiente, se añadió el anticuerpo monoclonal 3F4 en una dilución 1:100, y se incubó el filtro durante 2-4 horas a 4ºC, con suave agitación en un agitador de plataforma. Después de la incubación, se eliminaron la solución bloqueante y el anticuerpo, y se lavó el filtro tres veces.

El filtro fue incubado con un anticuerpo secundario anti-Ig en solución bloqueante durante 1-2 horas a temperatura ambiente. El anticuerpo secundario fue radiomarcado para permitir la detección por inmunoblot. Para la sonda I^{125} radiomarcada, se añadió aproximadamente 10^{4} cpm del reactivo por cm^{2} de filtro. Después de la incubación, se lavó el filtro varias veces en PBS, cada lavado siendo de unos 10 minutos de duración. El filtro fue colocado en una casete con una pieza de película Xomat para rayos X (Kodak) a -70ºC.

Los resultados del inmunoblot fueron como sigue:

Tira 1

S1 de hámster normal

\quad

Resultado: banda intensa a aproximadamente 33-35 Kd

Tira 2

S1 de hámster normal a 37ºC

\quad

Resultado: banda intensa a aproximadamente 33-35 Kd

\newpage

Tira 3

S1 de hámster normal digerido con 100 \mug/ml de dispasa, 0'15% de Zwittergent

\quad

Resultado: sin banda

Tira 4

S1 de hámster normal digerido con 100 \mug/ml de dispasa, 0'2% de Sarkosyl

\quad

Resultado: sin banda

Tira 5

S1 de hámster normal digerido con 100 \mug/ml de dispasa, 2% de Sarkosyl

\quad

Resultado: sin banda

Tira 6

S1 de hámster normal digerido con 20 \mug/ml de proteinasa K, 0'2% de Sarkosyl

\quad

Resultado: sin banda

Tira 7

S1 de hámster normal digerido con 20 \mug/ml de proteinasa K, 2% de Sarkosyl

\quad

Resultado: sin banda

Tira 8

S1 de hámster infectado con priones

\quad

Resultado: banda intensa a aproximadamente 33-35 Kd

Tira 9

S1 de hámster infectado con priones a 37ºC

\quad

Resultado: banda intensa a aproximadamente 33-35 Kd

Tira 10

S1 de hámster infectado con priones, digerido con 100 \mug/ml de dispasa, 0'15% de Zwittergent

\quad

Resultado: banda muy intensa a aproximadamente 33-35 Kd

Tira 11

S1 de hámster infectado con priones, digerido con 100 \mug/ml de dispasa, 0'2% de Sarkosyl

\quad

Resultado: banda muy intensa a aproximadamente 33-35 Kd

Tira 12

S1 de hámster infectado con priones, digerido con 100 \mug/ml de dispasa, 2% de Sarkosyl

\quad

Resultado: banda muy intensa a aproximadamente 33-35 Kd

Tira 13

S1 de hámster infectado con priones, digerido con 20 \mug/ml de proteína quinasa, 0'2% de Sarkosyl

\quad

Resultado: banda muy intensa a aproximadamente 27-30 Kd

Tira 14

S1 de hámster infectado con priones, digerido con 20 \mug/ml de proteína quinasa, 2% de Sarkosyl

\quad

Resultado: banda muy intensa a aproximadamente 27-30 Kd

Estos resultados mostraron que la PrP^{c} de cerebro de hámster normal no fue detectada después de la digestión con dispasa o proteinasa K, mientras que las muestras de cerebro infectado con priones mostraron una señal muy intensa de la proteína resistente a la proteasa. Las muestras infectadas con priones, digeridas con proteinasa K, mostraron un desplazamiento esperado en la magnitud del peso molecular correspondiente a la digestión del N-terminal de la proteína. La digestión con dispasa no mostró desplazamiento en el peso molecular. Este descubrimiento demostró que la dispasa es selectiva para la conformación normal de la proteína.

Ejemplo 2 Detección de PrP^{Sc} en cerebro de ratón

Para determinar los niveles de PrP^{Sc} en ratones afectados, se sacrificaron un ratón infectado con priones y un ratón normal, y se extrajeron sus cerebros. Se prepara en PBS un homogenado cerebral al 10% (p/v) de los ratones normal e infectado con priones. Después de una centrifugación a baja velocidad a 500 xg durante 15 minutos, se mide la proteína total en el sobrenadante (S1) utilizando ensayos espectrofotométricos, y se ajusta la concentración a 2'5 mg/ml con PBS.

Las muestras son digeridas con 500 U/ml de leucolisina durante 45 minutos a 37ºC, en presencia de 2% de Sarkosyl. La digestión se detiene mediante la adición de EDTA 50 mM. Dos alícuotas de las proteínas, obtenidas en S1 antes y después de la digestión con leucolisina, son sometidas a electroforesis a 4ºC, en una plancha de gel de poliacrilamida al 8%, como se describió en la referencia Laemmli pero en ausencia de SDS y 2-mercaptoetanol. Esto permite que las proteínas no desnaturalizadas migren a través de la poliacrilamida, conservando mientras la estructura nativa de la proteína. Una vez inmovilizadas en la poliacrilamida, las proteínas del gel son luego transferidas a nitrocelulosa para la detección de las proteínas. La transferencia puede suceder como en el Ejemplo 1, o se puede utilizar un aparato de transferencia semiseca (referencia Maniatis).

Las muestras digerida y no digerida de ambos ratones infectado y normal son detectadas en un Western blot como se describe en el Ejemplo 1, pero utilizando un anticuerpo monoclonal que identifique la forma PrP^{Sc} nativa de la proteína. Tales anticuerpos están descritos en WO 98/37411, publicada el 27 de agosto de 1998, y en la Patente U.S. 5.846.533, publicada el 8 de diciembre de 1998. Preferentemente, el anticuerpo utilizado es el anticuerpo R1 específico para PrP^{Sc}. Los anticuerpos son añadidos a una concentración de aproximadamente 1:100 a 1:200, dependiendo del anticuerpo utilizado y de la cantidad de proteína pronosticada a inmovilizar en la nitrocelulosa.

La nitrocelulosa es colocada en una bolsa de plástico termosellable, y se añade 0'1 ml de solución bloqueante por cm^{2} de filtro. La solución bloqueante contiene 5% (p/v) de leche descremada en polvo (Carnation), 0'01% de antiespumante A, y 0'02% de azida sódica en PBS, y se añade Tween 20 hasta una concentración final del 0'02%. El Tween 20 es un detergente suave que ayuda además a reducir el fondo. Después de agitar 1 hora a temperatura ambiente, se añade el anticuerpo R1 en una dilución 1:100, y el filtro es incubado durante 2-4 horas a 4ºC, con suave agitación en un agitador de plataforma. Después de la incubación, se eliminan la solución bloqueante y el anticuerpo, y se lava el filtro tres veces.

El filtro es incubado con un anticuerpo secundario anti-Ig en solución bloqueante durante 1-2 horas a temperatura ambiente. El anticuerpo secundario es conjugado enzimáticamente con peroxidasa de rábano picante, para permitir la detección por inmunoblot. El anticuerpo secundario es añadido a un nivel mucho más diluido que el anticuerpo primario, de 1:500 a 1:2.000. Después de la incubación, se lava el filtro varias veces en PBS, cada lavado siendo de unos 10 minutos de duración. El filtro es colocado luego en una casete con una pieza de película Xomat para rayos X (Kodak) a -70ºC.

El blot resultante tendrá una banda correspondiente a la PrP^{Sc} en la muestra de cerebro de ratón infectado con priones tratado, antes y después de la digestión con leucolisina. La muestra de proteína de cerebro de ratón normal mostrará una banda de bajo nivel debido a la unión de la PrP^{Sc}. Sin embargo, la tira con la muestra de cerebro normal, sometida a hidrólisis con leucolisina, no tendrá una banda detectable puesto que la leucolisina habrá hidrolizado la proteína PrP en la muestra.

Ejemplo 3 Detección de PrP^{Sc} en cerebro de vaca

Un homogenado cerebral al 10% (p/v) de vacas normal e infectada con priones es resuspendido en 1 l de Tris HCl 25 mM, pH 8'0, EDTA 5 mM (tampón A). Este es centrifugado a 10.000 xg durante 20 minutos, y se descarta el sobrenadante conteniendo proteínas citoplásmicas solubles. Se resuspende el gránulo en 1 ml de tampón A, se pasa dos veces a través de un disruptor de células (Microfluidics International, modelo MF110), y se centrifuga a 30.000 xg durante 1 hora, después de lo cual se descarta el sobrenadante y se lava el gránulo una vez con tampón A, y se centrifuga nuevamente a 30.000 xg durante 1 hora. En esta fase, se podría almacenar el gránulo a -20ºC antes de la hidrólisis.

La digestión con metaloendopeptidasa lítica \beta se hace a una proporción enzima a proteína de 1:40. La proteína es digerida con 100 \mug/ml de metaloendopeptidasa lítica \beta (Sigma) durante 75 minutos a 40ºC, en una solución tamponada a pH 8'0 conteniendo 0'2% de Sarkosyl. La digestión se para mediante la adición de EDTA 50 mM. Después de la hidrólisis de la conformación PrP^{c} de la proteína prión, la PrP^{Sc} puede ser desnaturalizada para permitir que el anticuerpo 3F4 identifique su epítopo. Las muestras normal e infectada con priones son tratadas con una solución de desnaturalización de guanidina HCL 6M. La solución de desnaturalización se prepara diluyendo 10 x tampón [HEPES 250 mM (pH 7'9); Cl_{2}Mg 30 mM; ClK 40 mM] con cinco volúmenes de agua destilada. Se añade una cantidad adecuada del guanidina HCl, y se lleva la solución a 1 x utilizando agua destilada. Finalmente, se añade ditiotreitol hasta una concentración final de 1 mM. Las muestras hidrolizadas son sometidas a tratamiento con la solución de desnaturalización, durante 30 minutos a 4ºC.

Después, las muestras son cargadas sobre geles de poliacrilamida al 10% como se describió en el Ejemplo 1, y transferidas a una membrana de nylon. La membrana de nylon es colocada en una bolsa de plástico termosellable, y se añade 0'1 ml de solución bloqueante por cm^{2} de filtro. La solución bloqueante contiene 5% (p/v) de leche descremada en polvo (Carnation), y 0'02% de azida sódica en PBS. Después de agitar 1 hora a temperatura ambiente, se añade el anticuerpo monoclonal 3F4 en una dilución 1:200, y se incuba el filtro durante 2-4 horas a 4ºC, con suave agitación en un agitador de plataforma. Después de la incubación, se eliminan la solución bloqueante y el anticuerpo, y se lava el filtro tres veces. El filtro es incubado con un anticuerpo secundario anti-Ig en solución bloqueante durante 1-2 horas a temperatura ambiente, lavado el filtro varias veces en PBS, y colocado en una casete con una pieza de película Xomat para rayos X (Kodak) a -70ºC.

La determinación de la infección por priones se basa en la comparación de la identificación de la PrP en las muestras normal e infectada. Las tiras conteniendo S1 no hidrolizado deberían contener cantidades relativamente similares de proteína PrP, identificada por el anticuerpo 3F4. Las tiras conteniendo las muestras hidrolizadas, tratadas con guanidina HCl, permitirán la detección de PrP^{Sc} en la muestra infectada puesto que la única forma que queda después de la hidrólisis es la forma PrP^{Sc}. La relación de señal entre la muestra hidrolizada y la no hidrolizada de la vaca infectada determinará el porcentaje de PrP que está en la conformación PrP^{Sc}. La muestra hidrolizada de vaca normal servirá además como control de que la hidrólisis de la conformación PrP^{c} fue completa.

Ejemplo 4 Comparación de tinción de 3F4 y R1 de una muestra

Para determinar los niveles de PrP^{Sc} en ratones infectados, se sacrifican un ratón infectado con priones y un ratón normal, y se extraen sus cerebros. Se preparó un homogenado al 10% (p/v) de cada uno de los cerebros, dispersando el tejido cerebral en PBS. Después, el homogenado de cerebro fue sometido a una centrifugación a baja velocidad de 500 xg, durante 15 minutos, para separar las proteínas suspendidas de los detritus celulares no deseados. Se midió la concentración de proteína total del sobrenadante (S1) utilizando un Ensayo de Proteínas BCA (Pierce), y se ajustó la concentración de cada homogenado de cerebro con PBS hasta 3'5 mg/ml. Se guardó una porción del homogenado para que sirviera como control de las proteínas cerebrales totales.

Luego, cada muestra fue analizada para el contenido de proteínas PrP^{Sc} y PrP^{c} mediante inmunoblot. Se procesaron dos alícuotas de 100 \mul de cada muestra y se sometieron a electroforesis, a 4ºC, en una plancha de gel de poliacrilamida al 8% como se describió en el Ejemplo 2, esto es, bajo condiciones no desnaturalizantes. El gel es cargado en dos tiras de muestra del ratón afectado y en dos tiras de muestra del ratón de control y, preferentemente, se aplica una tira de cada uno en una cara del gel, una tira de cada uno en la otra cara del gel, con los pocillos no conteniendo muestra y separando las dos caras. Se aplica el gel y se transfiere a nylon como en el Ejemplo 1.

Después de la transferencia, se corta el nylon para separarlo en dos blots independientes, cada uno conteniendo una tira de muestra afectada y una tira de control. Cada filtro de nylon es colocado en una bolsa de plástico termosellable, y se añade 0'1 ml de solución bloqueante por cm^{2} de filtro. La solución bloqueante contiene 5% (p/v) de leche descremada en polvo (Carnation), y 0'02% de azida sódica en PBS. Después de agitar 1 hora a temperatura ambiente, a un blot se añade anticuerpo monoclonal 3F4 en una dilución 1:200, y al otro blot anticuerpo R1 en una dilución 1:200, y se incuba el filtro durante 2-4 horas a 4ºC, con agitación suave en un agitador de plataforma. A continuación de la incubación, se eliminan la solución bloqueante y el anticuerpo, y se lava cada filtro tres veces.

El anticuerpo secundario es adecuadamente marcado para permitir la detección por inmunoblot. El anticuerpo secundario es añadido a un nivel mucho más diluido que el anticuerpo primario, de 1:500 a 1:2.000. Después de la incubación, se lava el filtro varias veces en PBS, cada lavado siendo aproximadamente de 10 minutos de duración. Luego, el filtro es colocado en una casete con una pieza de película Xomat para rayos X (Kodak) a -70ºC.

Se puede determinar el nivel de PrP^{Sc} en la muestra afectada comparando los niveles de señal relativos de cada anticuerpo en el ratón afectado frente al de control. Este proceso puede ser una comparación física para determinar las diferencias relativas en el nivel de señal entre el anticuerpo R1 y el 3F4, o puede ser una comparación cuantitativa. Las técnicas de comparación, ambas físicas y cuantitativas, serán conocidas por aquellos especializados en la técnica. La comparación cuantitativa puede ser valorada utilizando técnicas de barrido del blot en las que se determinan los niveles utilizando programas de ordenador diseñados especialmente para calcular los niveles comparativos. Uno de tales métodos es utilizar un programa de hojas de cálculo Excel modificado. Tales programas permiten ajustes entre muestras, basados en variables tales como el fondo, el tiempo de hibridación, etc.

Los niveles de tinción de 3F4 deberían ser coherentes entre las muestras de control normales de ambos blots con anticuerpos R1 y 3F4. El nivel de diferencia entre la tinción de R1 y la tinción de 3F4 en la muestra afectada debería permitir la cuantificación de PrP^{Sc} en la muestra restando el nivel de señal de PrP^{c}, utilizando el anticuerpo 3F4, del nivel de señal de PrP^{Sc} y PrP^{c} del anticuerpo R1. Tal cuantificación puede ser ajustada basada en la sensibilidad, concentración de los anticuerpos, etc.

Claims (10)

1. Un método de ensayo para determinar la presencia de proteína prión (PrP) en su conformación relacionada con la enfermedad (PrP^{Sc}), comprendiendo las etapas de:

pretratar una muestra, sospechosa de contener proteína PrP, para destruir o eliminar proteínas no relacionadas con la proteína PrP, reduciendo de ese modo la concentración de proteína en la muestra que no sea proteína PrP^{Sc};

tratar la muestra pretratada con un compuesto que destruya o hidrolice toda, o sustancialmente toda, la PrP^{c} en la muestra pero no hidrolice la PrP^{Sc} en la muestra;

parar la reacción de hidrolización;

poner en contacto la muestra sometida al pretratamiento, y tratarla con una pareja de unión que se una a la PrP^{Sc} en la muestra; y

determinar la presencia de PrP^{Sc} en la muestra basada en la unión de la pareja de unión.

2. El método de ensayo de la Reivindicación 1, en donde el compuesto que hidroliza la PrP^{c}, pero no la PrP^{Sc}, es seleccionado del grupo que se compone de metaloendopeptidasa y dispasa.

3. El método de ensayo de la Reivindicación 2, en donde dicha metaloendopeptidasa es seleccionada de peptidil-Lys-metaloendopeptidasa, metaloendopeptidasa lítica \beta, y peptidil-Asp-metaloendopeptidasa.

4. El método de ensayo de la Reivindicación 1, en donde el compuesto que hidroliza la PrP^{c}, pero no la PrP^{Sc}, es seleccionado de atrolisina A, B, C, E y F, envelisina, oligopeptidasa Thimet, matrilisina, vibriolisina, cocolisina, micolisina, meprin A, astacina, aureolisina, leishmanolisina, autolisina, deuterolisina, botrolisina, estromelisina 1 y 2, bacilolisina, termolisina, aeromonolisina, leucolisina, pseudo-lisina, neprilisina, ofiolisina, pitrilisina, insulisina, y serralisina.

5. El método de ensayo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el pretratamiento comprende el extraer la proteína en la muestra poniendo en contacto la muestra con anticuerpos unidos a un soporte, los cuales anticuerpos se unen a la proteína que no sea PrP^{Sc}.

6. El método de ensayo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la pareja de unión es el anticuerpo R1, específico para PrP^{Sc}.

7. El ensayo de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 5, en donde la pareja de unión es un anticuerpo 3F4 (ATCC HB9222).

8. El método de ensayo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la pareja de unión está unida a un marcador detectable.

9. El método de ensayo de la Reivindicación 8, en donde se lleva a cabo la detección utilizando fluorescencia sincrónica intensificada por disociación.

10. El método de ensayo de la Reivindicación 8, en donde se lleva a cabo la detección utilizando un fluorómetro inducido por láser, de longitud de onda dual.