ES2245454T3 - Genes patched y su utilizacion. - Google Patents
Genes patched y su utilizacion.Info
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Abstract
SE PRESENTAN GENES PATCHED DE VERTEBRADOS E INVERTEBRADOS, INCLUIDOS LOS GENES PATCHED DE RATONES Y SERES HUMANOS, ASI COMO LOS METODOS PARA AISLAR LOS GENES RELACIONADOS, EN DONDE LOS GENES PUEDEN SER DE ESPECIES DIFERENTES O DE LA MISMA FAMILIA. EL TENER LA CAPACIDAD DE REGULAR LA EXPRESION DEL GEN PATCHED, PERMITE LA ELUCIDACION DEL DESARROLLO EMBRIONICO, LA REGULACION CELULAR ASOCIADA A LA TRANSDUCCION DE SEÑALES POR PARTE DEL GEN PATCHED, LA IDENTIFICACION DE AGONISTAS Y ANTAGONISTAS A LA TRANSDUCCION DE SEÑALES, LA IDENTIFICACION DE LIGANDOS PARA ENLAZARSE AL PATCHED, EL AISLAMIENTO DE LOS LIGANDOS Y EL ENSAYO DE LOS NIVELES DE TRANSCRIPCION Y EXPRESION DEL GEN PATCHED.
Description
Genes patched y su utilización.
El campo de la invención hace referencia a los
genes de polaridad y segmentación y a sus utilizaciones.
Los genes de polaridad y segmentación se
descubrieron en las moscas gracias a mutaciones que cambiaban el
patrón de las estructuras de los segmentos corporales. Las
mutaciones en estos genes causan que los animales desarrollen
patrones cambiados en las superficies de los segmentos corporales,
los cambios afectan al patrón del eje cabeza-cola.
Por ejemplos, las mutaciones en el gen patched provocan que
cada segmento corporal se desarrolle sin estructuras normales en el
centro de cada segmento. En su lugar se forma una imagen especular
del patrón que se hallaría normalmente en el segmento anterior.
Así, las células en el centro del segmento generan estructuras
erróneas y se dirigen a la dirección equivocada respecto a la
polaridad cabeza-cola del animal. Se conocen
aproximadamente unos 16 genes en dicha clase. Las proteínas
codificadas incluyen la quinasa, los factores de transcripción, una
proteína de unión celular, dos proteínas secretadas denominadas
wingless (sin alas) (WG) y hedgehog HH), una proteína
transmembrana denominada patched (PTC) y algunas proteínas
nuevas no relacionadas con ninguna otra conocida. Todas estas
proteínas se cree que trabajan juntas en las vías de señalización
que informan a las células sobre el entorno vecino con el fin de
determinar el destino y polaridad de dichas células.
Muchas de las proteínas de polaridad y
segmentación de Drosophila y otros invertebrados están
estrechamente relacionadas con las proteínas de vertebrados, lo que
significa que los mecanismos moleculares implicados son antiguos.
Entre las proteínas de vertebrados relacionadas con los genes
fly se hallan la En-1 y -2, que actúan en el
desarrollo del cerebro de vertebrados y WNT-1, que
también está implicada en el desarrollo del cerebro, pero que se
descubrió en primer lugar como un oncogen implicado en muchos casos
de cáncer de mama en el ratón. En las moscas, el gen patched
se transcribe a RNA en un patrón complejo y dinámico en los
embriones, incluyendo las líneas transversales en cada primordio de
segmento corporal. Gracias al análisis de predicción de estructuras
proteicas, se sabe que la proteína codificada contiene muchos
dominios transmembrana. No tiene una similitud significativa con
ninguna otra proteína conocida. Otras proteínas que tienen un gran
número de dominios transmembrana incluyen diversos receptores de
membrana, canales de membrana y transportadores a través de la
membrana.
La proteína hedgehog (HH) de las moscas
tiene al menos tres proteínas relacionadas en vertebrados: Sonic
hedgehog (Shh); Indian hedgehog y Desert
hedgehog. La Shh se expresa en un grupo de células en la
parte posterior de cada primordio de desarrollo de extremidades.
Esto corresponde exactamente con el mismo grupo de células que se
halló tenían un papel importante en la polaridad de señalización en
el desarrollo de las extremidades. Esta señal parece estar
controlada de forma gradual, con células muy próximas a la fuente
posterior de la señal de formación de los dedos y otras estructuras
de extremidades y con células más allá de la fuente de la señal y
que forman estructuras más anteriores. Desde hace años se sabe que
la implantación de células de señalización, una región del primordio
de desarrollo de extremidades conocida como "zona de actividad de
polarización (ZPA)" tiene efectos dramáticos sobre el patrón de
extremidades. La implantación de una segunda ZPA anterior en el
primordio de desarrollo de extremidades causa el desarrollo de una
extremidad con características posteriores que reemplazan las
anteriores (dedos meñiques en lugar de pulgares). Shh es la
señal larga de ZPA. Las células cultivadas productoras de la
proteína Shh (SHH), cuando se implantan en la región del
primordio de desarrollo de extremidades anterior, tienen el mismo
efecto que la ZPA implantada. Esto demuestra que Shh es
claramente un desencadenante crítico del desarrollo de extremidades
posteriores.
Durante bastante tiempo se ha pensado que el
factor en la ZPA estaba relacionado con otra señal de desarrollo
importante que polariza el desarrollo de la columna vertebral. La
notocorda, un cordón de células del mesodermo que migra a lo largo
del costado dorsal de los embriones de vertebrados, es una fuente
de señales que polariza el tubo neural a lo largo del eje
dorso-ventral. Esta señal es responsable de que la
parte del tubo neural más próxima a la notocorda forme una placa
basal, parte morfológicamente distinta del tubo neural. La placa
basal, a su vez, envía señales externas a las partes más dorsales
del tubo neural para determinar el destino de las células. Se ha
descrito que la ZPA tiene el mismo efecto de señalización que la
notocorda cuando se transplanta adyacente al tubo neural,
sugiriendo que la ZPA produce la misma señal que la notocorda. En
este mismo contexto, se ha observado que Shh se produce por
las células de la notocorda y las células de la placa basal. Los
ensayos de expresión de Shh en ratones han demostrado una
sobre-expresión de los genes de la placa basal en
las células que normalmente no los expresan. En consecuencia, Shh
parece ser un componente de la señal de la notocorda a la placa
basal y de la placa basal a partes más dorsales del tubo neural.
Los genes hedgehog de vertebrados también se expresan en,
además de las extremidades y de los tubos neurales, muchos otros
tejidos que incluye, pero sin limitarse, el sistema nervioso
periférico, el cerebro, el pulmón, el hígado, el riñón, los
primordios dentales, y el endodermo del intestino posterior y
anterior.
La PTC ha sido propuesta como un receptor para la
proteína HH según los experimentos genéticos en moscas. Un modelo
para dicha relación se basa en que PTC actúa a través de una vía
ampliamente desconocida para inactivar tanto su propia
transcripción como la transcripción del gen de polaridad y
segmentación wingless. Este modelo propone que la proteína
HH, secretada por las células adyacentes, se une al receptor PTC, lo
inactiva, y en consecuencia previene que PTC inhiba su propia
transcripción o la de wingless. Diversos experimentos han
demostrado acciones coordinadas entre PTC y HH.
Los trabajos relativos a patched, y a su
papel con hedgehog, se pueden hallar en Hooper y
Scott, Cell 59, 751-765 (1989);
Nakano y col., Nature, 341, 508-513
(1989) (ambos también describen la secuencia de
patched de Drosophila), Simcox y col.,
Development 107, 715-722 (1989);
Hidalgo e Ingham, Development, 110,
291-301 (1990); Phllips y col.,
Development, 110, 105-114 (1990),
Sampedro y Guerrero, Nature 353,
187-190 (1991); Ingham y col.,
Nature 353, 184-187 (1991); y
Taylor y col., Mechanisms of Development 42,
89-96 (1993). Las discusiones sobre el papel
de hedgehog incluyen Riddle y col., Cell 75,
1401-1416 (1993); Echelard y col.,
Cell 75, 1417-1430 (1993);
Krauss y col., Cell 75, 1431-1444
(1993); Tabaka y Kornberg, Cell 76,
89-102 (1994); Heemskerk &
DiNardo, Cell 76, 449-460
(1994); Relink y col., Cell 76,
761-775 (1994); y un articulo corto de
revisión por Ingham, Current Biology 4,
347-350 (1994). La secuencia para la región
no codificante 5' de Drosophila se publicó por el GenBank,
con el nº de acceso M28418, referida por Hooper y
Scott (1989), supra. Véase también,
Forbes y col., Development 1993 Supplement
115-124.
Se proporcionan los procedimientos para el
aislamiento de genes patched, en particular genes
patched de mamíferos, incluyendo genes patched de
ratón y el hombre, así como secuencias y genes patched de
invertebrados. Los procedimientos incluyen la identificación de
genes patched de otras especies, así como de los miembros de
la misma familia de proteínas. Se proporcionan procedimientos para
la producción de proteínas patched a partir de dichos genes,
en donde los genes y proteínas se pueden utilizar como sondas para
la investigación, diagnóstico, unión de proteína hedgehog
para su aislamiento y purificación, terapia génica, así como otras
utilidades.
De acuerdo con un aspecto de la presente
invención, se proporciona un DNA aislado, distinto del gen
patched o fragmento del mismo de Drosophila, con una
secuencia de DNA de al menos 12 pb distinta de la secuencia del gen
patched de Drosophila, en donde el DNA hibrida en
condiciones astringentes con cualquiera de las SEC ID: 1, 3, 5, 7,
9, 18 y fragmentos de éstas, y codifica un polipéptido
patched que se une a un polipéptido hedgehog.
De acuerdo con otro aspecto de la presente
invención, se proporciona un DNA aislado, distinto del gen
patched de Drosophila o de un fragmento del mismo, con
una secuencia de DNA de al menos 12 pb distinta de la secuencia del
gen patched de Drosophila, en donde la secuencia de
DNA comprende cualquier secuencia de las SEC ID: 1, 3, 5, 7, 9, 18
o un fragmento de al menos 12 pb de la misma.
Las características preferidas de estos aspectos
se especifican en las reivindicaciones.
La Fig. 1 es un gráfico que muestra el mapa de
restricción de aproximadamente 10 Kb de la región 5' cadena arriba
desde el codón de inicio del gen patched de
Drosophila, y también se muestran las gráficas de las
construcciones de porciones truncadas de la región 5' unida a la
\beta-galactosidasa. Dichas construcciones son
introducidas en líneas celulares de mosca para la producción de
embriones. En la tabla de la derecha, se indica la expresión de la
\beta-galactosidasa durante el desarrollo temprano
y tardío de los embriones. A mayor número de +, mayor es la
intensidad de
tinción.
tinción.
Se proporcionan procedimientos para la
identificación de miembros de la familia del gen patched
(ptc) de invertebrados y vertebrados, p.ej. especies de mamíferos,
así como la secuencia de cDNA completa del gen patched del
ratón y del hombre. También se proporcionan las secuencias para
genes patched de invertebrados. Los genes patched
codifican una proteína transmembrana que tiene un gran número de
secuencias transmembrana.
Al identificar los genes patched de ratón
y del hombre, se utilizaron cebadores para moverse por el árbol
evolutivo a partir de la secuencia conocida ptc de
Drosophila. Se utilizaron dos cebadores de la secuencia de
Drosophila con engarces de dianas de restricción adecuadas
para amplificar porciones del DNA genómico de un invertebrado
relacionado, como el mosquito. Las secuencias se seleccionaron a
partir de regiones que seguramente no divergieron durante la
evolución y presentan una degeneración baja. Por conveniencia,
estas regiones son las secuencias próximas al extremo
N-terminal, en general en las 1,5 Kb primeras,
comúnmente dentro de la primera 1 Kb de la porción codificante del
cDNA, y que corresponden con el primer bucle hidrofílico de la
proteína. Utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
con los cebadores, se puede obtener una banda del DNA genómico del
mosquito. La banda puede amplificarse y utilizarse a su vez como una
sonda. Se puede utilizar esta sonda para hibridar una librería de
cDNA de un organismo en una rama distinta del árbol genealógico,
como la mariposa. Mediante el cribado de la librería y la
identificación de secuencias que hibridan con la sonda, puede
obtenerse una porción del gen patched de mariposa. Uno o más
clones resultantes pueden utilizarse para cribar la librería con el
fin de obtener una secuencia más ampliada, hasta e incluyendo toda
la región codificante, así como las secuencias 5' y 3' no
codificantes. Si es necesario, es posible puede secuenciar toda o
parte de la secuencia codificante del cDNA resultante.
A continuación, se puede cribar una librería de
DNA genómico o de cDNA de una especie superior en la escala
evolutiva con sondas adecuadas de una o ambas secuencias
anteriores. De particular interés es el cribado de una librería
genómica, de un invertebrado relacionado lejanamente, p.ej., si se
utiliza una combinación de las secuencias obtenidas de las dos
especies anteriores, Drosophila y la mariposa. Mediante
técnicas adecuadas, se pueden identificar específicamente clones
que se unan a las sondas, los cuales pueden cribarse mediante
hibridación cruzada con cada una de las sondas individualmente. Los
fragmentos resultantes se pueden a continuación amplificar, p.ej.,
mediante subclonaje.
Teniendo todos o parte de los 4 genes
patched distintos, en el ejemplo que se muestra,
Drosophila (mosca), el mosquito, la mariposa y el escarabajo,
se pueden comparar los genes patched para poner en evidencia
sus secuencias conservadas. Las células de un primordio de
desarrollo de extremidades de un mamífero adecuado u otras células
que expresen patched, como la notocorda, el tubo neural, los
intestinos, los primordios pulmonares u otros tejidos, en
particular el tejido fetal, pueden utilizarse para el cribado.
Alternativamente, también puede utilizarse el tejido adulto que
produzca proteína patched. Teniendo en cuenta la secuencia
consenso disponible a partir de las 4 especies, se pueden
desarrollar sondas en las que en cada sitio al menos 2 de las
secuencias tengan el mismo nucleótido y en donde el sitio varíe
para cada especie, de modo que cada una tenga un nucleótido único,
en dicho caso se puede utilizar la inosina que se une a los 4
nucleótidos.
Se puede emplear la PCR con cebadores o, si se
desea, se puede hibridar una librería genómica de una fuente
adecuada. Con la PCR, se puede utilizar una librería de cDNA o la
PCR-transcriptasa inversa (RT-PCR),
si hay mRNA disponible a partir del tejido. Por lo general, cuando
se utiliza el tejido fetal, se utilizará tejido de primer o segundo
trimestre, preferentemente de la última mitad del primer trimestre o
del segundo trimestre, dependiendo del huésped particular. La edad
y la fuente del tejido dependerán a un nivel significativo de la
capacidad para aislar quirúrgicamente el tejido según su tamaño, el
nivel de expresión de patched en las células del tejido, la
accesibilidad del tejido, el número de células que expresan
patched y otros factores. La cantidad de tejido disponible
debería ser bastante importante para proporcionar suficiente mRNA
que pueda ser transcrito y amplificado. Con los tejidos de ratón,
se pueden utilizar primordios de extremidades de aproximadamente 10
a 15 dpc (días post-concepción).
En los cebadores, la secuencia de unión
complementaria será generalmente de al menos 14 nucleótidos,
preferentemente de al menos 17 nucleótidos y por lo general y
comúnmente de no más de 30 nucleótidos. Los cebadores también pueden
incluir una secuencia de enzima de restricción para el aislamiento
y clonaje. Con la RT-PCR, el mRNA puede
enriquecerse de acuerdo con procedimientos conocidos, p.ej.,
transcripción inversa y amplificación con cebadores adecuados. (Los
procedimientos utilizados para el clonaje molecular pueden hallarse
en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook y col., Cold
Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1988). En
particular, los cebadores pueden proceder de la secuencia próxima
al N-terminal o de otra región conservada, como las
secuencias con al menos 5 de 8 aminoácidos conservados en 3 de las 4
secuencias. Esto corresponde a las secuencias (SEC ID 11)
IITPLDCFWEG, (SEC ID 12) LIVGG; y (SEC ID 13) PFFWEQY. Los productos
de PCR resultantes con un tamaño esperado, si se cree conveniente,
se pueden subclonar y secuenciar.
El fragmento de PCR clonado puede utilizarse como
una sonda para cribar una librería de cDNA de células de tejido de
mamífero que expresan patched. Los clones que hibridan se
pueden aislar en condiciones adecuadas de astringencia. De nuevo, la
librería de cDNA debería proceder de tejido que exprese
patched, teniendo en cuenta las limitaciones antes citadas
para el tejido en particular. Los clones que hibridan se subclonan y
criban. A continuación se pueden aislar y secuenciar los subclones
que hibridan o pueden analizarse además utilizando transferencias
de RNA e hibridaciones in situ en embriones completos y en
secciones. De forma adecuada, se puede utilizar un fragmento de
aproximadamente 0,5 a 1 Kb de la región codificante
N-terminal para la transferencia de Northern.
El gen de mamífero puede secuenciarse y tal como
se describió anteriormente, identificarse las regiones conservadas y
utilizarse como cebadores para analizar otras especies. La región
próximal N-terminal, la región
C-terminal o una región intermedia puede utilizarse
para las secuencias, si las secuencias se seleccionan con una
degeneración mínima y el nivel deseado de conservación en la
secuencia de la sonda.
La secuencia de DNA que codifica PTC puede ser un
cDNA o un DNA genómico o un fragmento de lo mismo, en particular
exones completos de DNA genómico, dicha secuencia puede ser como
una secuencia libre de secuencia de tipo salvaje procedente del
cromosoma, puede ser un fragmento de 50 Kb o un fragmento menor,
puede unirse a un DNA heterólogo o foráneo, el cual puede ser un
nucleótido único, oligonucleótido de hasta 50 pb, que puede ser una
diana de restricción u otro DNA identificador para utilizar como un
cebador, sonda o similar, o un ácido nucleico mayor de 50 pb, y si
dicho ácido nucleico fuera una porción de un vector de clonaje o
expresión, deberá comprender regiones reguladoras de un casete de
expresión, o similar. El DNA puede estar aislado, purificado tras
eliminar proteínas y otros ácidos nucleicos, o en solución o de otra
manera.
El gen en cuestión puede utilizarse para la
producción de toda o porciones de la proteína patched. El gen
determinado o un fragmento del mismo, generalmente un fragmento de
al menos 12 pb, generalmente de 18 pb, puede introducirse en un
vector adecuado para el mantenimiento extracromosómico o para su
integración en el huésped. Los fragmentos se unirán inmediatamente
por el extremo 5' y 3' a una secuencia nucleotídica o secuencia no
hallada en el gen natural o de tipo salvaje, o se unirán a un
marcador distinto de una secuencia de ácido nucleico. Para la
expresión, se puede utilizar un casete de expresión, que contenga
una región de inicio de la transcripción y de la traducción, que
puede ser inducible o constitutiva, la región codificante bajo el
control transcripcional de la región de inicio transcripcional, y
una región de finalización transcripcional y traduccional. Se
pueden utilizar diversas regiones de inicio de la transcripción que
sean funcionales en el huésped de expresión. El péptido puede
expresarse en procariotas o eucariotas de acuerdo con métodos
convencionales según el propósito de la expresión. Para la
producción de la proteína a gran escala, un organismo unicelular o
células de un organismo superior, p.ej., eucariotas como
vertebrados, en particular mamíferos, pueden utilizarse como
huéspedes de expresión, como E. coli, B. subtilis,
S. cerevisiae, y similares. En muchas de las situaciones,
puede ser deseable expresar el gen patched en un huésped
mamífero, con lo que el gen patched se transportará a la
membrana celular y se podrán realizar diversos estudios. La proteína
tiene dos partes que conforman un total de 6 regiones
transmembranas, con un total de 6 bucles extracelulares, tres para
cada parte. El carácter de la proteína tiene similitud con una
proteína transportadora. La proteína tiene dos tríadas de señales
de glicosilación.
Las secuencias de ácido nucleico pueden
modificarse con diversos propósitos, en particular si se han de
utilizar intracelularmente, uniéndose a un agente que corte el
ácido nucleico, p.ej., un ión de metal quelado, como hierro o cromo
para cortar el gen; como una secuencia antisentido; o similar. Las
modificaciones pueden incluir el reemplazar el oxígeno de los
ésteres de fosfato por sulfuro o nitrógeno, el reemplazar el fosfato
por fosforamida, etc.
Al disponer de proteína en grandes cantidades
gracias a la utilización de un huésped de expresión, la proteína
puede aislarse y purificarse de acuerdo con procedimientos
convencionales. Se puede preparar un lisado del huésped de expresión
y purificarse el lisado por HPLC, cromatografía de exclusión,
electroforesis en gel, cromatografía de afinidad, u otra técnica de
purificación. Por lo general, la proteína estará purificada al menos
en un 80%, preferentemente en al menos un 90% y más preferentemente
en un 100%. Por purificada se entiende que está libre de otras
proteínas, así como de restos celulares.
El polipéptido puede utilizarse para la
producción de anticuerpos. Los fragmentos cortos se utilizan para
anticuerpos específicos para el polipéptidos en particular,
mientras que los fragmentos mayores o el gen entero permiten la
producción de anticuerpos contra toda la superficie del polipéptido
o proteína, si la proteína está en su conformación natural.
Los anticuerpos se pueden preparar de acuerdo con
métodos convencionales. El polipéptido o la proteína expresada
pueden utilizarse como un inmunógeno, solos o conjugados con
vehículos inmunogénicos conocidos, p.ej., KLH, pre-S
HBsAg, otras proteínas virales o eucariotas, o similares. Se pueden
utilizar adyuvantes diversos, mediante inyecciones seriadas, según
sea conveniente. Para la obtención de anticuerpos monoclonales,
después de una o más inyecciones de estímulo, se puede aislar el
bazo, inmortalizar los esplenocitos y luego cribarlos por su unión
con un anticuerpo de alta afinidad. A continuación, pueden
expandirse las células inmortalizadas, p.ej., hibridomas,
productores de los anticuerpos deseados. Para una descripción más
detallada, véase Monoclonal Antibodiees: A Laboratory Manual,
Harlow y Lane eds., Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring
Harbor, New York, 1988. Si se desea, el mRNA que codifica las
cadenas ligeras y pesadas se puede aislar y mutar mediante clonaje
en E. coli, y para incrementar la afinidad del anticuerpo,
se pueden mezclar las cadenas ligera y pesada. Los anticuerpos
pueden tener un uso en ensayos diagnósticos para la detección de la
presencia de la proteína PTC en la superficie de las células, o
para inhibir la transducción de señal por el ligando de la proteína
PTC compitiendo por el sitio de unión.
El gen patched de ratón (SEC ID 09)
codifica una proteína (SEC ID 10) que tiene aproximadamente un 38%
de identidad aminoacídica con la PTC de la mosca (SEC ID 6) sobre
unos 1.200 aminoácidos. Esta conservación de secuencia está dispersa
por gran parte de la proteína excepto en el extremo
C-terminal. La proteína de ratón también tiene un
inserto de unos 50 aminoácidos relacionados con la proteína de la
mosca. El gen patched humano (SEC ID 18) contiene una pauta
de lectura abierta de aproximadamente 1450 aminoácidos (SEC ID 19)
que es aproximadamente un 96% idéntica (98% de similitud) a ptc de
ratón (EC ID 9). El gen patched humano (SEC ID 18),
incluyendo las secuencias codificantes y no codificantes, tiene
aproximadamente un 89% de identidad de secuencia con el gen
patched de ratón (SEC ID 9).
El homólogo de PTC de mariposa (SEC ID 4) tiene
1.300 aminoácidos y una identidad de secuencia del 50% (72% de
similitud) con la PTC de mosca (SECID 6). Con la excepción de un
C-terminal divergente, esta homología se extiende
regularmente por toda la secuencia codificante. Un exón de 267 pb
del gen patched del escarabajo codifica un fragmento
proteico de 89 aminoácidos que tiene un 44% y un 51% de identidad de
secuencia con las regiones correspondientes de la PTC de la mosca y
la mariposa, respectivamente.
El mRNA de ptc es de aproximadamente 8 Kb
de largo y se expresa a niveles bajos y tempranamente, a los 7 dpc,
incrementándose su abundancia a los 11 y 15 dpc. La transferencia
de Northern indica una disminución clara en la cantidad de mRNA a
los 17 dpc. En el adulto, el RNA de PTC está presente en cantidades
elevadas en el cerebro y el pulmón, así como en cantidades
moderadas en el riñón e hígado. Señales débiles se detectan en el
corazón, bazo, músculo esquelético y testículos.
Utilizando la hibridación in situ, se ha
demostrado que en los embriones de ratón, el mRNA de ptc
está presente a los 7 dpc,. Ptc está presente a niveles
elevados a lo largo del eje neural de embriones de 8 dpc. A los 11,5
dpc, se puede detectar ptc en los primordios pulmonares y
del intestino en desarrollo, según el perfil de transferencia de
Northern. Además, el gen está presente a niveles elevados en la zona
ventricular del sistema nervioso central, así como en la zona
limitante del prosencéfalo. Ptc también se transcribe
fuertemente en el cartílago condensante del pericondrio de
primordios de extremidades de 11,5 y 13,5 dpc, así como en la
porción ventral de los somitas, una región que probablemente es el
futuro esclerotoma y eventualmente forma hueso en la columna
vertebral. La PTC está presente en un amplio abanico de tejidos
desde el endodermo, mesodermo, así como los de origen ectodérmico,
lo que evidencia su papel fundamental en muchos aspectos del
desarrollo embrionario, incluyendo la condensación del cartílago, el
patrón del desarrollo de las extremidades, la diferenciación del
tejido pulmonar y la generación de neuronas.
El ácido nucleico patched puede utilizarse
para el aislamiento de genes a partir de diversas fuentes de
mamíferos de interés, en particular de primates, más
particularmente de humanos, o de animales domésticos, tanto mascotas
como los animales de granja, p.ej., orden lagomorfos, roedores,
porcinos, bovinos, felinos, cánidos, ovinos, equinos, etc.
Utilizando sondas, en particular sondas marcadas de secuencias de
DNA, del gen patched, se puede ser capaz de aislar el mRNA o
el DNA genómico, el cual puede utilizarse para identificar
mutaciones, en particular las asociadas con enfermedades genéticas,
como la espina bífida, defectos del desarrollo de extremidades,
defectos pulmonares, problemas con la dentición, desarrollo
hepático y renal, desarrollo del sistema nervioso periférico y otros
sitios en donde el gen patched esté implicado en la
regulación. Las sondas del estudio pueden también utilizarse para
identificar el nivel de expresión en las células asociadas con los
testículos para determinar la relación con el nivel de expresión y
la producción de esperma.
El gen o sus fragmentos pueden utilizarse como
sondas para identificar la región no codificante 5' que comprende
la región del inicio de transcripción, en particular el
intensificador regulador de la transcripción de patched.
Hibridando una librería genómica, con una sonda que comprenda la
región codificante 5', se pueden obtener fragmentos que comprendan
la región no codificante 5'. Si fuera necesario, se puede extender
el fragmento para obtener más secuencia 5' y asegurarse que al
menos tiene una porción funcional del intensificador. El
intensificador también se ha hallado próximo a la región
codificante 5', un porción que se halla en la secuencia transcrita y
cadena abajo de las secuencias promotoras. La región de inicio de
la transcripción puede utilizarse para diversos fines, estudiar el
desarrollo embrionario, facilitar la expresión regulada de la
proteína patched u otra proteína de interés durante el
desarrollo embrionario o posterior, y en la terapia génica.
El gen puede también utilizarse para la terapia
génica, mediante transfección del gen normal en las células madre
embrionales o en las células maduras. Para la transfección y la
integración estable del gen en el genoma de las células, pueden
utilizarse una gran variedad de vectores virales. Alternativamente,
para la introducción de genes en una célula huésped adecuada, puede
utilizarse la micro-inyección, la fusión, u otros
métodos similares. Véase, por ejemplo, Dhawan y col., Science 254,
1509-1512 (1991) and Smith y col., Molecular and
Cellular Biology (1990), 3268-3271.
Al facilitar la producción de grandes cantidades
de proteína PTC, es posible utilizar la proteína para identificar
ligandos que se unan a la proteína PTC. En particular, se puede
producir proteína en células y utilizar los polisomas en columnas
para el aislamiento de ligandos para la proteína PTC. Es posible
incorporar la proteína PTC en liposomas combinando la proteína con
tensoactivos lipídicos adecuados, p.ej., fosfolípidos, colesterol,
etc., y sonicar la mezcla de la proteína PTC y los tensoactivos en
un medio acuoso. Con uno o más ligandos establecidos, p.ej.,
hedgehog, es posible utilizar la proteína PTC para rastrear
antagonistas que inhiban la unión del ligando. De este modo, es
posible identificar fármacos que prevengan la transducción de señal
por la proteína PTC en células normales y anormales.
La proteína PTC, en particular los fragmentos de
unión de la misma, el gen codificante de la proteína, o el
fragmento de la misma, en particular los fragmentos de al menos 18
nucleótidos, generalmente de unos 30 nucleótidos y hasta el gen
completo, más particularmente las secuencias asociadas con los
bucles hidrofílicos, todos se pueden utilizar en muy diversos
ensayos. En estas situaciones, las moléculas determinadas se unirán
normalmente con otra molécula, que hace de marcaje, y en donde el
marcaje puede facilitar directa o indirectamente una señal
detectable. Los diversos marcajes incluyen los radioisótopos, los
fluorocromos, los quimioluminiscentes, las enzimas, las moléculas
de unión específica, p.ej., partículas magnéticas y similares. Las
moléculas de unión específica incluyen las parejas, como la biotina
y la estreptavidina, la digoxina y la antidigoxina, etc. Para los
miembros de unión específica, el miembro complementario puede estar
normalmente marcado con una molécula que facilita su detección, de
acuerdo con procedimientos bien conocidos. Los ensayos pueden
utilizarse para detectar la presencia de moléculas que se unen al
gen patched o a la proteína PTC, en el aislamiento de
moléculas que se unen al gen patched, para la cuantificación
de la cantidad de patched, bien como la proteína o el mRNA,
para la identificación de moléculas que puedan servir como agonistas
o antagonistas, o similar.
En los ensayos es posible utilizar diversos
formatos. Por ejemplo, las células de mamífero o de invertebrados
pueden diseñarse para que respondan cuando un agonista se une a PTC
en la membrana de la célula. Se puede introducir un casete de
expresión en la célula, donde la región de inicio de la
transcripción de patched está unida a un gen marcador, como
la \beta-galactosidasa, para la cual existe un
sustrato que da color azul al reaccionar. Se ha identificado un
fragmento de 1,5 Kb que responde a la señalización de PTC y regula
la expresión de un gen heterólogo durante el desarrollo embrionario.
Cuando un agonista se une a la proteína PTC, la célula adopta una
coloración azul. En un ensayo de competición entre un agonista y un
componente de interés, la ausencia de formación de color azul es
indicativa de la presencia de un antagonista. Estos ensayos son bien
conocidos en la materia. En lugar de células, se puede utilizar la
proteína en un entorno de membrana y determinar las afinidades de
unión de los componentes. La PTC puede unirse a una superficie y
utilizarse un ligando marcado para PTC. Diversos marcajes se han
indicado con anterioridad en la presente invención. El compuesto
candidato se añade con el ligando marcado en un medio tamponado
adecuado para la PTC unida a una superficie. Después de la
incubación para asegurar que la unión tenga lugar, la superficie
puede lavarse para liberarse de cualquiera de los componentes de
unión inespecíficos del medio de ensayo, en particular cualquier
ligando marcado y unido inespecíficamente, y cualquier marcaje
unido a la superficie determinada. Si el marcaje es una enzima, se
puede utilizar un sustrato productor de una molécula detectable. El
marcaje puede detectarse y cuantificarse. Mediante la utilización de
procedimientos estándares, puede determinarse la afinidad de unión
del compuesto candidato.
La disponibilidad del gen y de la proteína
facilita la investigación del desarrollo fetal y del papel de
patched y otras moléculas que desempeñen alguna función en
dicho desarrollo. Mediante la utilización de secuencias
anti-sentido del gen patched, siempre y
cuando las secuencias puedan introducirse en las células en cultivo
o utilizando un vector que proporcione la transcripción del
anti-sentido del gen patched introducido en
las células, es posible investigar el papel de la proteína PTC en
el desarrollo celular. Con la inclusión de la proteína PTC o
fragmentos de ésta en un forma soluble que pueda competir con la
proteína PTC normal por el ligando, se puede inhibir la unión de
los ligandos con la proteína PTC celular y observar así el efecto
de la variación de la concentración de ligandos para la proteína
PTC sobre el desarrollo celular del huésped. Los anticuerpos contra
PTC también utilizarse para bloquear la función, ya que la PTC está
expuesta en la superficie celular.
El gen objeto de estudio también se puede
utilizar para preparar animales de laboratorio transgénicos, que
pueden servir para investigar el desarrollo embrionario y el papel
que desempeña la proteína PTC en dicho desarrollo. Al variar la
expresión de la proteína PTC, utilizando distintas regiones de
inicio de la transcripción que pueden ser constitutivas o
inducibles, es posible determinar el efecto sobre el desarrollo de
las diferencias en los niveles de proteína PTC. Alternativamente,
se puede utilizar el DNA para knockear la proteína PTC en las
células madre embrionarias, para producir huéspedes con sólo un gen
patched funcional o un huésped que carezca de un gen
patched funcional. Utilizando la recombinación homóloga, es
posible introducir un gen patched, que esté regulado
diferencialmente, por ejemplo que se exprese en el desarrollo del
feto, pero no del adulto. Es posible inducir la expresión del gen
patched en células o tejidos donde normalmente no se expresa
o expresarlo en tiempos anormales del desarrollo. Es posible
provocar la expresión errónea o un fallo de expresión en algunos
tejidos para simular enfermedades humanas. Así, están disponibles
modelos de ratones de espina bífida o de diferenciación motoneuronal
anómala en el desarrollo de la médula espinal. Además, al facilitar
la expresión de la proteína PTC en células en las que de otra
manera no se produciría normalmente, se pueden inducir cambios en el
comportamiento de la célula tras la unión del ligando a la proteína
PTC.
Las áreas de investigación pueden incluir el
desarrollo de tratamientos contra el cáncer. El gen
wingless, cuya transcripción está regulada en las moscas por
PTC, está estrechamente relacionada con un oncogen de mamíferos,
Wnt-1, un factor clave en muchos casos de
cáncer de mama en el ratón. Otros miembros de la familia Wnt,
que son proteínas de señalización secretadas, están implicados en
diversos aspectos del desarrollo. En las moscas, el factor de
señalización decapentaplegic, un miembro de la familia
TGF-beta de proteínas de señalización, conocido por
afectar el crecimiento y el desarrollo de mamíferos, también está
controlado por PTC. Ya que los miembros del TGF-beta
y de las familias Wnt se expresan en ratones en sitios
cercanos al solapamiento con patched, la regulación normal
proporciona una oportunidad para el tratamiento del cáncer. Además,
para la reparación y la regeneración tisular, pueden utilizarse
células competentes en la proliferación y productoras de PTC para
promover la regeneración y la curación de tejidos dañados. Dichos
tejidos pueden regenerarse mediante transfección de células del
tejido dañado con el gen ptc y su región de inicio de la
transcripción, o una región de inicio de la transcripción
modificada. Por ejemplo, PTC puede ser útil para estimular el
crecimiento de dientes nuevos mediante modificación por ingeniería
genética de células de la encía o de otros tejidos donde PTC se
expresa o se expresaba en estadios del desarrollo más
tempranos.
Ya que el análisis de transferencia de Northern
indica que ptc está presente a niveles elevados en el tejido
del pulmón adulto, la regulación de la expresión de ptc o la
unión a su ligando natural puede servir para inhibir la
proliferación de células pulmonares cancerosas. La disponibilidad
del gen que codifica PTC y la expresión del gen permiten el
desarrollo de agonistas y antagonistas. Además, PTC es central para
la capacidad de las neuronas de diferenciarse tempranamente. La
disponibilidad del gen permite la introducción de PTC en el tejido
enfermo del huésped, estimulando el programa fetal de división y/o
diferenciación. Esto podría realizarse junto con otros genes que
proporcionan ligandos que regulan la actividad de PTC o
proporcionando agonistas distintos al ligando natural.
La disponibilidad de la región codificante para
varios genes ptc de diversas especies, permite el
aislamiento de la región no-codificante 5' que
comprende el promotor y el intensificador asociados con los genes
ptc, con el fin de proporcionar la regulación
transcripcional y post-transcripcional del gen
ptc o de otros genes, lo que posibilita la regulación de
genes relacionados con la regulación del gen ptc. Dado que
el gen ptc se autoregula, la activación del gen ptc provocará
la activación de la transcripción un gen bajo el control de la
región de inicio de la transcripción del gen ptc. La región
de inicio transcripcional puede obtenerse de cualquier especie
huésped e introducirse en una especie huésped heteróloga, si dicha
región de inicio es funcional a un nivel deseado en el huésped
foráneo. Por ejemplo, un fragmento de aproximadamente 1,5 Kb cadena
arriba del codón de inicio, de hasta 10 Kb y preferentemente de
hasta 5 Kb, puede utilizarse para proporcionar el inicio de
transcripción regulado por la proteína PTC, en particular la región
no-codificante 5' de Drosophila (nº de acceso
de GenBank M28418).
Los siguientes ejemplos se ofrecen a título de
ilustración y no de limitación.
Los cebadores de PCR se basaron en los fragmentos
de secuencia aminoacídica de PTC de la mosca que no divergieron
durante la evolución y presentaban una baja degeneración. Dos de
dichos cebadores (P2R1 (SEC ID 14): GGACGAATTCAARGTNCAYCARYTNTGG,
P4R1 (SEC ID 15) GGACGAATTCCYCCCARAARCANTC, (las secuencias
subrayadas son los engarces de EcoRI) amplificaron una banda
de tamaño adecuado del DNA del mosquito utilizando la PCR. Las
condiciones del programa son las siguientes:
- 94ºC 4 min; 72ºC, añadir la Taq;
- [49ºC 30 s; 72ºC 90 s; 94ºC 15 s] 3 veces
- [94ºC 15 s; 50ºC 30 s; 72ºC 90 s] 35 veces
- 72ºC 10 min; mantener a 4ºC.
Esta banda se subclonó en una diana EcoRV de
pBluescript II y se secuenció utilizando el equipo USB
Sequence.
Utilizando el producto de PCR del mosquito (SEC
ID 7) como una sonda, se cribó una librería de cDNA en
\lambdagt10 (proporcionada generosamente por Sean Carroll). Los
filtros se hibridaron a 65ºC durante toda la noche en una solución
que contenía 5XSSC, sulfato de dextrano al 10%, 5X Denhardt, 200
\mug/ml de DNA de esperma de salmón sonicado y SDS al 0,5%. Los
filtros se lavaron en 0,1XSSC, 0,1% SDS a temperatura ambiente
durante varias veces para eliminar la hibridación inespecífica. De
las 100.000 calvas cribadas inicialmente, se aislaron 2 clones
solapantes, L1 y L2, que correspondían con el extremo
N-terminal de la PTC de mariposa. Utilizando L2
como una sonda, se volvieron a cribar los filtros de la librería y
se aislaron 3 clones adicionales (L5, L7, L8) que abarcaban el
resto de la secuencia codificante de ptc. La secuencia completa de
ptc de mariposa (SEC ID 3) se determinó mediante
secuenciación automática con el equipo ABI.
Se hibridó una librería genómica en
\lambdagem11 de Tribolium casteneum (cedida por Rob
Dennell) con una mezcla del producto de PCR del mosquito (SEC ID 7)
y el fragmento BstXI/EcoRI de L2. Los filtros se hibridaron a 55ºC
durante toda la noche y se lavaron como se indicó anteriormente. De
las 75.000 calvas cribadas, se identificaron 14 clones y el
fragmento SacI de T8 (SEC ID 1), que hibridaba de forma cruzada con
las sondas de mosquito y mariposa, se subclonó en pBluescript.
Se diseñaron 2 cebadores degenerados (P4REV: (SEC
ID 16) GGACGGAATTCYNGANTGYTTYTGGGA; P22: (SEC ID 17)
CATACCAGCCAAGCTTGTCIGGCCARTGCAT) se diseñaron basándose en una
comparación con las secuencias aminoacídicas de PTC de la mosca
(Drosophila melanogaster) (SEC ID 6), el mosquito
(Anopheles gambiae) (SEC D 8), la mariposa (Precis
coenia) (SEC ID 4), y el escarabajo (Tribolium
casteneum) (SEC ID 2). I representa la inosina, la cual puede
formar pares de bases con los cuatro nucleótidos. P22 se utilizó
para la transcripción inversa del RNA de los primordios de
desarrollo de extremidades a 12,5 dpc (obtenido de David Kingsley)
durante 90 min a 37ºC. A continuación, se realizó la PCR utilizando
los cebadores P4REV (SEC ID 17) y P22 (SEC ID 18) con 1 \mul del
cDNA resultante en las condiciones siguientes:
- 94ºC 4 min; 72ºC añadir la Taq;
- [94ºC 15 s; 50ºC 30 s; 72ºC 90 s] 35 veces
- 72ºC 10 min; mantener a 4ºC.
Los productos de PCR del tamaño esperado se
subclonaron en el vector TA (Invitrogen) y se secuenciaron con el
equipo Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing (U.S.B.).
Utilizando el fragmento de PCR de ratón como una
sonda, se cribaron 300.000 calvas de una librería de cDNA de ratón
de 8,5 dpc en \lambdagt10 (donada por Brigid Hogan), se
hibridaron a 65ºC al igual que antes y se lavaron en 2XSSC a
temperatura ambiente. Se aislaron 7 clones, y tres (M2, M4 y M8) se
subclonaron en pBluescriptII. Se rehibridaron 200.000 calvas de
esta librería utilizando primero un fragmento EcoRI de 1,1 Kb de M2
para identificar 6 clones (M9-M16) y secundariamente
una sonda mixta que contiene las secuencias más
N-terminales (fragmento XhoI de M2) y las más
C-terminales (fragmento BamHI/BglII de M9) para
aislar 5 clones (M17-M21). M9, M10, M14 y
M17-21 se subclonaron en la diana EcoRI de
pBluescript II (Stratagene).
Se hibridaron una transferencia de Northern de
múltiples tejidos embrionarios y adultos de ratón con un fragmento
EcoRI de 900 pb de una región codificante del
N-terminal de ptc de ratón. La hibridación se
realizó a 65ºC en 5XSPPE, 10XDenhardt, 100 \mug/ml de DNA de
esperma de salmón sonicado y 2% de SDS. Después de varios lavados
cortos a temperatura ambiente en 2XSSC, 0,05% SDS, se lavaron a
elevada astringencia en 0,1XSSC, 0,1% SDS a 50ºC.
Se diseccionaron en PBS embriones de ratón de
7,75, 8,5 y 13,5 dpc, y se congelaron en medio
Tissue-Tek a -80ºC. Las secciones congeladas de
12-16 \mum se recogieron en portaobjetos
recubiertos con VectaBond (Vector Laboratories), y se secaron
durante 30-60 minutos a temperatura ambiente. Al
cabo de 10 minutos de fijación en paraformaldehido al 4% en PBS,
las preparaciones se lavaron 3 veces durante 3 min en PBS, se
acetilaron durante 10 min en ácido acético al 0,25% en
trietanolamina y se lavaron tres veces más durante 5 minutos. La
prehibridación (formamida al 50%, 5XSSC, 250 \mug/ml de tRNA de
levadura, 500 \mug/ml de DNA de esperma de salmón sonicado y 5X
Denhardt) se llevaron a cabo durante 6 horas a temperatura ambiente
en formamida al 50%/5XSSC en cámaras humidificadas. La sonda, que
consistió de 1 Kb del extremo N-terminal de
ptc, se añadió a una concentración de
200-1000 ng/ml en la misma solución utilizada para
la prehibridación, y luego se desnaturalizó durante 5 min a 80ºC.
Aproximadamente, se añadieron 75 \mul de la sonda a cada uno de
los portaobjetos y se cubrieron con un parafilm. Los portaobjetos
se incubaron durante la noche a 65ºC en la misma cámara humidificada
utilizada anteriormente. Al día siguiente, la sonda se lavó
sucesivamente en 5XSSC (5 min, 65ºC), 0,2XSSC (1 h, 65ºC), y
0,2XSSC (10 min, temperatura ambiente). Después de 5 minutos en
tampón B1 (ácido maleico 0,1 M, NaCl 0,15 M, pH 7,5), los portas se
bloquearon durante 1 hora a temperatura ambiente en reactivo
bloqueante al 1% (Boehringer-Mannheim) en tampón
B1, y luego se incubaron durante 4 horas en tampón B1 que contenía
el anticuerpo conjugado con DIG-AP
(Boehringer-Mannheim) a una dilución de 1:5000. El
exceso de anticuerpo se eliminó con lavados de 15 minutos en tampón
B1, seguido de 5 minutos en tampón B3 (Tris 100 mM, NaCl 100 mM,
MgCl_{2} 5 mM, pH 9,5). El anticuerpo se detectó mediante adición
de un sustrato de fosfatasa alcalina (350 \mul de 75 mg/ml de
X-fosfato en DME, 450 \mul de 50 mg/ml de NBT en
DMF al 70% en 100 ml de tampón B3) y se dejó reaccionar durante la
noche en oscuridad. Tras un lavado rápido en Tris 10 mM, EDTA 1 mM,
pH 8,0, los portaobjetos se montaron con Aquamount (Lerner
Laboratories).
Laboratories).
Se diseñó una serie de construcciones que unían
diferentes regiones del promotor de ptc de Drosophila
con un gen reportero lacZ con el fin de estudiar la regulación cis
del patrón de expresión de ptc. Véase la Fig. 1. Se obtuvo Un
fragmento BamHI/BspMI de 10,8 Kb que comprende la región
no-codificante 5' del mRNA en su extremo 3' y se
truncó mediante digestión con enzimas de restricción tal como se
muestra en la Fig. 1. Estos casetes de expresión se introdujeron en
líneas de Drosophila utilizando un vector de elemento P
(Thummel y col., Gene 74, 445-456 (1988), y se
inyectaron en embriones, los cuales podían generar moscas que
podían crecer para producir embriones (Véase, Spradling y Rubin,
Science (1982) 218, 341-347 para una descripción del
procedimiento). El vector se derivó de pUC8 y se le introdujo el
gen white para generar ojos amarillos, porciones del
elemento P para la integración, y a continuación las construcciones
se insertaron en un poliengarce cadena arriba del gen LacZ. Los
embriones resultantes se tiñeron con anticuerpos contra la proteína
LacZ conjugados con HRP y se desarrollaron los embriones con el
colorante OPD para identificar la expresión del gen LacZ. El patrón
de expresión se describe en la Fig. 1, indicando si se tiñó durante
el desarrollo temprano o tardío del embrión.
Se aislaron homólogos de PTC de la mosca (SEC ID
6) de tres insectos: mosquito, mariposa y escarabajo, utilizando PCR
o cribados de librerías a baja astringencia. Se diseñaron cebadores
de PCR para fragmentos de 6 aminoácidos de PTC de baja mutabilidad
y degeneración. Un par de cebadores, P2 y P4, amplificaron un
fragmento homólogo de ptc del DNA genómico del mosquito que
correspondía con el primer bucle hidrofílico de la proteína. El
producto de PCR de 345 pb (SEC ID 7) se subclonó y secuenció y
cuando se alineó con el PTC de la mosca, mostró una identidad de
secuencia aminoacídica del 67%.
El fragmento clonado del mosquito se utilizó para
rastrear una librería de cDNA de mariposa. De las 100.000 calvas
rastreadas, se aislaron 5 clones solapantes y se utilizaron para
obtener la secuencia codificante de tamaño completo. El homólogo de
PTC de mariposa (SEC ID 4) tiene 1.311 aminoácidos y
aproximadamente un 50% de identidad de secuencia aminoacídica (72%
de similitud) con la PTC de la mosca. Excepto un extremo C- terminal
divergente, esta homología se extiende por toda la secuencia
codificante. El clon de PCR del mosquito (SEC ID 7) y un fragmento
correspondiente del cDNA de la mariposa se utilizaron para cribar
una librería genómica de DNA en \lambdagem11. De las calvas
cribadas, se identificaron 14 clones. Un fragmento de un clon (T8),
que se hibridó con las sondas originales, se subclonó y secuenció.
Este fragmento de 3 Kb contiene un exón de 89 aminoácidos (SEC ID
2), el cual tiene un 44% y un 51% de identidad aminoacídica con las
regiones correspondientes de la PTC de mosca y mariposa,
respectivamente.
Utilizando un alineamiento de los cuatro
homólogos de insecto en el primer bucle hidrofílico de la PTC, se
diseñaron dos cebadores de PCR para un fragmento de 5 a 6
aminoácidos que eran idénticos y presentaban baja degeneración.
Estos cebadores se utilizaron para aislar el homólogo de ratón
mediante RT-PCR con RNA de primordios de desarrollo
de extremidades en el embrión. Se amplificó una banda de tamaño
adecuado y tras el clonaje y secuenciación, se demostró que
codificaba una proteína 65% idéntica con la PTC de la mosca.
Utilizando el producto de PCR clonado y posteriormente los
fragmentos del cDNA de ptc de ratón, se cribó una librería de
\lambdacDNA. De las 300.000 calvas aproximadas, se identificaron
17 clones y de éstos, 7 clones solapantes abarcan el cDNA que
comprende la mayor parte de la secuencia codificante de la proteína
(SEC ID 9).
En las transferencias de Northern de tejido
embrionario y de adulto, la sonda de ptc detecta un mRNA de 8 Kb.
Una exposición más prolongada no reveló bandas adicionales ni
minoritarias. Durante el desarrollo, el mRNA de ptc está presente a
niveles bajos en estadios tan tempranos como a los 7 dpc y
posteriormente a los 11 y 15 dpc es bastante abundante. Mientras
que el gen está todavía presente a 17 dpc, la transferencia de
Northern indica una clara disminución de la cantidad de mensajero
en dicho estadio. En el adulto, el RNA de ptc está presente
en cantidades elevadas en el cerebro y el pulmón, así como en
cantidades moderadas en el riñón y el hígado. Se detectaron señales
débiles en el corazón, bazo, músculo esquelético y testículos.
El análisis de la transferencia de Northern
indica que el mRNA de ptc está presente a los 7 dpc,
mientras que no hay señal detectable en las secciones de los
embriones de 7,75 dpc. Esta discrepancia se explica por el bajo
nivel de transcripción. Por el contrario, ptc está presente
a niveles elevados a lo largo del eje neural de embriones de 8,5
dpc. A los 11,5 dpc, se puede detectar el ptc en los
primordios pulmonares en desarrollo y en el intestino, consistente
con el perfil de transferencia de Northern del adulto. Además, el
gen está presente a niveles elevados en la zona ventricular del
sistema nervioso central, así como en la zona limitante del
prosencéfalo. El ptc también se transcribe fuertemente en el
cartílago condensante de los primordios de desarrollo de
extremidades de 11,5 y 13,5 dpc, así como en la porción ventral de
los somitas, una región que probablemente es el futuro esclerotoma y
eventualmente forma hueso en la columna vertebral. Ptc está
presente en un amplio abanico de tejidos desde el endodermo,
mesodermo, así como los de origen ectodérmico, lo que evidencia su
papel fundamental en muchos aspectos del desarrollo
embrionario.
embrionario.
Para aislar el ptc humano (hptc),
2x105 calvas de una librería de cDNA de pulmón humana (HL3022a,
Clontech) se cribaron con un fragmento ptc de 1 Kb,
M2-2. Los filtros se hibridaron durante la noche a
una astringencia reducida (60ºC en 5XSSC, 10% sulfato de dextrano,
5S Denhardt, 0,2 mg/ml de DNA de esperma de salmón sonicado, y 0,5%
de SDS). Se aislaron 2 clones positivos (H1 y H2), los insertos se
clonaron en pBluescript y se secuenciaron, demostrándose que ambos
contenían una secuencia muy similar con el homólogo ptc de
ratón. Para aislar el extremo 5, se cribaron 6x105 calvas
adicionales por duplicado con sondas M2-3 EcoRI y
M2-3 XhoI (que contenían la secuencia no traducida
5' del ptc de ratón). Se purificaron 10 calvas y de éstas, se
subclonaron 6 insertos en pBluescript. Para obtener la secuencia
codificante completa, se secuenciaron completamente H2 y
parcialmente H14, H20 y H21. La secuencia de ptc humano de
5,1 Kb (SEC ID 18) contiene una pauta de lectura abierta de 1.447
aminoácidos (SEC ID 19) que es idéntica en un 96% y similar en un
98% con la del ptc de ratón. Las secuencias 5' y 3' no
traducidas del ptc humano (SEC ID 18) son también muy
similares con la de ptc de ratón (SEC ID 9), lo que sugiere
la existencia de una secuencia reguladora conservada.
La secuencia deducida de la proteína PTC de ratón
(SEC ID 10) tiene aproximadamente un 38% de identidad de secuencia
aminoacídica con la PTC de la mosca en unos 1.200 aminoácidos.
Dicha conservación de secuencia se extiende por la mayor parte de
la proteína exceptuando la región C-terminal. La
proteína de ratón también tiene un inserto de 50 aminoácidos
relacionado con la proteína de la mosca. Según la conservación de
la secuencia de PTC y de la conservación funcional de
hedgehog entre la mosca y el ratón, se concluye ptc
funciona de forma similar en los dos organismos. Una comparación de
la secuencia aminoacídica de ratón (mptc) (SEC ID 10), humana
(hptc) (SEC ID 19), mariposa (bptc)(SEC ID 4) y
drosophila (ptc) (SEC ID 6) se muestra en la Tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
La identidad de los otros 10 clones recuperados
de la librería de ratón no se determinó. Estos cDNAs hibridaron con
la secuencia ptc de ratón, mientras que diferían en sus
mapas de restricción. Estos genes codifican una familia de proteínas
relacionadas con la proteína patched. El alineamiento de las
secuencias nucleotídicas humanas y de ratón, que incluyen la
secuencia codificante y no-codificante, demuestra
una identidad del 89%.
De acuerdo con el objetivo de la presente
invención, se proporcionan los genes patched de mamífero,
incluyendo los genes humanos y los de ratón, los cuales permiten
una producción a nivel elevado de la proteína patched que a
su vez puede servir para muy diversos fines. La proteína
patched puede utilizarse en un cribado para agonistas y
antagonistas, para el aislamiento de su ligando, en particular
hedgehog, más particularmente Sonic hedgehog, y para
el ensayo de transcripción del mRNA de ptc. La proteína o
fragmentos de lo mismo pueden utilizarse para producir anticuerpos
específicos para la proteína o epitopos específicos de ésta.
Además, el gen puede utilizarse para estudiar el desarrollo
embrionario, mediante cribado de tejido fetal, preparando animales
transgénicos que sirvan como modelos y otros similares.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: ANUNCIO DEL FIDEICOMISARIO DE LELAND STANFORD JUNIOR UNIVERSITY
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Genes patched y su utilización
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 19
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN POSTAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DIRECCIÓN: Flehr, Hohbach, Test, Albritton & Herbert
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Four Embarcadero center, Suite 3400
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: San Francisco
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: CA
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: US
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 94111
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMATO LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO MEDIO: disco blando
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: compatible PC IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA: Patent Release #1.0, Versión #1.30
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD; PCT/US95/
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE SOLICITUD: 06-OCT-1995
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN SOBRE EL ABOGADO/AGENTE DE PATENTES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Rowland, Bertran I
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 20015
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE:a60190-1
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 415-781-1989
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: 415-398-3249
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 736 pb
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:1:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO:2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 107 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO DE MOLÉCULA: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:2:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO:3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5187 pb
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO:4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1311 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO DE MOLÉCULA: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO:5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 4434 pb
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO:6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1285 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO DE MOLÉCULA: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO:7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 345 pb
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO:8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 155 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO DE MOLÉCULA: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:8:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO:9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5187 pb
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO:10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1434 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO DE MOLÉCULA: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO:11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 11 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO DE MOLÉCULA: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:11:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Ile Thr Pro Leu Asp Cys Phe Trp Glu
Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO:12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO DE MOLÉCULA: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:12:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Ile Val Gly Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO:13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO DE MOLÉCULA: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:13:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Phe Phe Trp Glu Gln Tyr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO:14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pb
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGACGAATTC AARGTNCAYC ARYTNTGG
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO:15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pb
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGACGAATTC CYTCCCARAA RCANTC
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO:16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pb
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGACGAATTC YTNGANTGYT TYTGGGA
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO:17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 pb
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador"
\vskip0.500000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCATACCAGCC AAGCTTGTCN GGCCARTGCA T
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO:18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5288 pb
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO:19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1447 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO DE MOLÉCULA: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:19:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (27)
1. DNA aislado, distinto del gen patched
de Drosophila o un fragmento del mismo, que tiene una
secuencia de DNA de al menos aproximadamente 12 pb distintos de la
secuencia del gen patched de Drosophila, en donde el
DNA hibrida en condiciones astringentes con cualquiera de las
secuencias SEC ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 18 y fragmentos de las mismas,
y codifica un polipéptido patched que se une a un polipéptido
hedgehog.
2. DNA de acuerdo con la reivindicación 1, en
donde dicho gen patched es un gen de mamífero.
3. DNA de acuerdo con la reivindicación 1 para el
gen patched humano, de ratón, mosquito, mariposa o
escarabajo.
4. DNA de acuerdo con la reivindicación 3, en
donde la secuencia de DNA es una secuencia humana.
5. DNA de acuerdo con la reivindicación 4, en
donde la secuencia de DNA es una secuencia de ratón.
6. DNA de acuerdo con la reivindicación 1, en
donde dicho DNA es un fragmento de al menos aproximadamente 18
pb.
7. DNA de acuerdo con la reivindicación 1, en
donde dicho DNA está unido a un DNA que contiene una secuencia de
reconocimiento de una enzima de restricción.
8. DNA de acuerdo con la reivindicación 1, en
donde la secuencia de DNA comprende cualquiera de las secuencias
SEC ID No: 1, 3, 5, 7, 9, 18 o un fragmento de las mismas.
9. Casete de expresión que comprende una región
de inicio de transcripción funcional en un hospedador de expresión,
una secuencia de DNA de acuerdo con la reivindicación 1 bajo la
regulación transcripcional de dicha región de inicio de la
transcripción, y una región de finalización de la transcripción
funcional en dicho hospedador de expresión.
10. Casete de expresión de acuerdo con la
reivindicación 9, en donde dicha región de inicio de la
transcripción es heteróloga a dicha secuencia de DNA.
11. Casete de expresión de acuerdo con la
reivindicación 9, en donde dicha región de inicio de la
transcripción es homóloga a dicha secuencia de DNA e incluye la
región intensificadora.
12. Célula que comprende un casete de expresión
de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11 como parte
de un elemento extracromosómico, o integrado en el genoma de una
célula hospedadora como resultado de la introducción de dicho
casete de expresión en dicha célula hospedadora, y la progenie
celular dicha célula hospedadora, en donde dicha progenie celular
también comprende dicho casete de expresión como parte de un
elemento extracromosómico o integrado en el genoma de la célula.
13. Célula de acuerdo con la reivindicación 12,
que además comprende el polipéptido patched en la membrana
celular de dicha célula.
14. Célula de acuerdo con la reivindicación 12,
en donde dicho polipéptido patched es un polipéptido
patched de ratón.
15. Célula de acuerdo con la reivindicación 12,
en donde dicho gen patched codifica un polipéptido
patched humano.
16. Célula de acuerdo con la reivindicación 12,
en donde dicha región de inicio de la transcripción es una región
de inicio de la transcripción del gen patched de
Drosophila que comprende el promotor y el intensificador
unido a un gen heterólogo.
17. Célula que comprende un casete de expresión
que contiene una región de inicio de la transcripción funcional en
un hospedador de expresión, dicha región de inicio de la
transcripción consistiendo en una región no codificante 5'
reguladora de la transcripción de una secuencia de DNA de acuerdo
con la reivindicación 1 que comprende el promotor y el
intensificador, un gen marcador y una región de finalización de la
transcripción, como parte de un elemento extracromosómico o
integrado en el genoma de una célula hospedadora como resultado de
la introducción de dicho casete de expresión en dicho hospedador, y
la progenie celular del mismo, en donde dicha progenie celular
también comprende el mencionado casete de expresión como parte de un
elemento extracromosómico o integrado en el genoma de la célula.
18. Célula de acuerdo con la reivindicación 17,
en donde dicha región de inicio de la transcripción es la región de
Drosophila.
19. Procedimiento para el seguimiento del
desarrollo embrionario no-humano utilizando el
polipéptido patched, comprendiendo dicho procedimiento:
- la integración de un casete de expresión que contiene una región de inicio de la transcripción en las células hospedadoras embrionarias, consistiendo dicha región de inicio de la transcripción de una región no-codificante 5' reguladora de la transcripción de una secuencia de DNA de acuerdo con la reivindicación 1, un gen marcador y una región de finalización de la transcripción, en donde dichas células hospedadoras embrionales son capaces de desarrollar un feto;
- el crecimiento de dichas células embrionarias, con lo que tiene lugar la proliferación y la diferenciación; y
- la localización de las células que expresan el polipéptido patched mediante procedimientos de expresión con dicho gen marcador.
20. Procedimiento para la producción del
polipéptido patched, comprendiendo dicho procedimiento:
- el crecimiento de una célula de acuerdo con la reivindicación 12, con lo que se expresa dicho polipéptido patched; y
- el aislamiento de dicho polipéptido patched libre de otras proteínas.
21. Procedimiento para el cribado de compuestos
candidatos por su afinidad de unión con el polipéptido
patched, comprendiendo dicho procedimiento:
- la combinación de dicho compuesto candidato con una célula de vertebrado o invertebrado que contiene dicha proteína patched en la membrana celular y un casete de expresión que comprende una región de inicio de la transcripción funcional en dicha célula, una secuencia de DNA de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende la secuencia codificante completa bajo la regulación transcripcional de dicha región de inicio de la transcripción, y una región de finalización de la transcripción funcional en dicha célula, expresándose el polipéptido patched en la mencionada célula; y
- el ensayo para la unión del compuesto candidato con dicho polipéptido patched.
22. Procedimiento para el cribado de compuestos
candidatos por su actividad agonista con un polipéptido
patched, comprendiendo dicho procedimiento las etapas
de:
- combinación de dicho compuesto candidato con una célula de vertebrado o invertebrado que contiene dicho polipéptido patched en la membrana de dicha célula y un casete de expresión que contiene una región de inicio de la transcripción funcional en un hospedador de expresión, consistiendo dicha región de inicio de la transcripción en una región no-codificante 5' reguladora de la transcripción de una secuencia de DNA de acuerdo con la reivindicación 1, un gen marcador y una región de finalización de la transcripción como parte de un elemento extracromosómico o integrado en el genoma de una célula hospedadora; y
- el ensayo para la expresión de dicho gen marcador.
23. Anticuerpo monoclonal de unión específica con
un polipéptido patched que codifica una secuencia de DNA de
acuerdo con la reivindicación 1.
24. DNA aislado, distinto del gen patched
de Drosophila o un fragmento del que tiene una secuencia de
DNA de al menos aproximadamente unas 12 pb distintas de la
secuencia del gen patched de Drosophila, en donde la
secuencia de DNA comprende cualquiera de las secuencias SEC ID: 1,
3, 5, 7, 9, 18 o un fragmento de las mismas de al menos 12 pb.
25. DNA aislado de acuerdo con la reivindicación
24, que codifica un polipéptido patched que se une a un
polipéptido hedgehog.
26. Polipéptido aislado codificado por el ácido
nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1-8 ó
24-15.
27. Anticuerpo monoclonal que se une
específicamente al polipéptido de la reivindicación 26.
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