JPH04502559A - 動物における筋肉組織の増大 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 動物における筋肉組織の増大 発明の背景 発明の分野 本発明はｃ−ｓｋｉ遺伝子に関する。特に、本発明はニワトリｃ−ｓｋｉタンパ ク質をコード化するＤＮＡセグメント、該ＤＮＡセグメントを含むＤＮＡ構築物 およびそれにより形質転換された細胞に関する。本発明はさらに、筋肉の大きさ が増大した動物に関する。

背景的情報 ｖ−ｓｋｉ腫瘍遺伝子を含むウィルスは試験管内での形態学的形質転換を引き起 こすことができるだけでなく、筋原性分化を誘導することも可能である（　５ｔ ａｖｎｅｚｅｒ等。

１９８１、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　３９．９２０−９３４；　Ｌｉ等、　１９８ ６．　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ。

５７、　１０６５−１０７２；　５ｔａｖｎｅｚｅｒ等、１９８６．　Ｊ、　Ｖ ｉｒｏｌ、　５７．　１０７３−１０８３；　Ｃｏｌｍｅｎａｒｅｓおよび５ｔ ａｖｎｅｚｅｒ、　１９８９．　Ｃｅ１２５９゜２９３−３０３　）　、　ｃ− ｓｋｉ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを保持・発現するウィルスもまた病巣および筋原性分化 を誘導する（　５ｕｔｒａｖｅ等。

１９９０、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｒｉａｌ、　１θ、　３１３７−３１４４ 　）　、このことは、ｓｋｉの２つの公知作用、すなわち形質転換および分化は 矛盾した特性であるように考えられるので、ｓｋｉ腫瘍遺伝子が二元機能性であ る可能性を示唆する。ｖ−ｓｋｉプローブを用いて、ｃ−ｓｋｉに対するゲノム クローンが単離され、そして部分的に配列決定されている（　５ｔａｖｎｅｚｅ ｒ等、　１９８９．　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　９．４０３８−４０ ４５　）　、一方のスプライシングにより関連づけられるｃ−ｓｋｉの２形態、 ならびに様々なｙ−ｓｋｉおよびｃ−ｓｋｉ欠失突然変異体の比較により、形質 転換および分化に必要なｓｋｉの部分はかなり類似していることが示された。こ れらの結果は、形質転換を引起し、そして分化を誘導するｃ−ｓｋｉおよびＶ− ｓｋｉの能力が２つの分断した機能というよりもむしろｓｋｉの単一特性の関連 した面であり得ることを示唆する。

ｓｋｉタンパク質の生化学的機能についてはあまり知られていない。研究された Ｃ−５ｋｔおよびｖ−ｓｋｉの生物学的に活性な形態の全ては主として核内に局 在している（Ｈａｒｋａｓ等、１９８６．　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１５１．　１３ １−１３８；　５ｕｔｒａｖｅ等、１９９０、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏ ｌ、　１０　、３１３７−３１４４　）　、　ｃ−ｓｋｉタンパク質がニワトリ 細胞内で過剰に発現されると、異なる形態のｃ−ｓｋｉはそれらの核内での局在 が異なるが、しかしこれらの相違に重要性があるかもしれないが、依然として不 明である。クロマチンが細胞分裂のために濃縮する際に、過剰発現したｃ−ｓｋ ｉタンパク質は濃縮クロマチンと凝縮される（　５ｕｔｒａｖｅ等、　１９９０ ．　Ｍｏｌ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ。

１０　、３１３７−３１４４　）　、生化学的研究により、ｃ−ｓｋｉの少なく とも１つの形態がその他のタンパク質の存在下にＤＮＡに結合し得ることもまた 示された（　Ｎａｇａｓｅ等、　１９９０゜Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、 　１８　、３３７−３４３　）。

成長および発達（もしあるならば）におけるその役割に関するか、または作用機 作への直接的洞察を得るようなｃ−ｓｋｉの正常機能を推論することを、利用可 能なデータは可能にはしない。

発明の要約 本発明の目的は、単離され、そして特徴づけられたＣ−５ｋｉｃＤＮＡを提供す ることである。

本発明の別の目的は、動物において筋肉の大きさを増大する遺伝子を提供するこ とである。

本発明の別の目的は、増大された筋肉の大きさおよび減少された脂肪組織を有す る家畜を提供することである。

本発明のその他の目的は、重大な筋肉傷害または筋肉変性疾病に苦しむ患者の治 療を提供することである。

本発明の種々のその他の目的および利点は本発明に関する図面および以下の記載 から明らかとなるであろう。

一実施態様において、本発明はニワトリｃ−ｓｋｉタンパク質をコード化するＤ ＮＡセグメントまたは該セグメントに相補的なりＮＡフラグメントに関する。

別の実施態様において、本発明はニワトリｃ−ｓｋｉタンパク質をコード化する ＤＮＡセグメントおよびベクターを含むＤＮＡ構築物に関する。その他の実施態 様において、本発明はｃ−ｓｋｌの機能を有する先端切除ニワトリＣ−５ｋｉタ ンパク質をコード化するＤＮＡセグメントおよびベクターを含むＤＮＡ構築物に 関する。本発明はまた、上記の２種のＤＮＡ構築物のいずれかで安定に、該構築 物にコード化されたタンパク質の発現を可能にするように形質転換された宿主細 胞に関する。

さらに別の実施態様において、本発明は筋肉の大きさが増大した動物に関し、そ の動物の細胞の全てが、動物または動物の先祖に導入された、５１２１タンパク 質をコード化するＤＮＡセグメントおよびベクターを含むＤＮＡ構築物を含有す る。ＤＮＡセグメントは全体のタンパク質または先端が切断された変形物をコー ド化し得る。

その他の実施態様において、本発明は筋肉の大きさが増大した動物に関し、その 動物の細胞の全てが、動物または動物の先祖に導入された、ｓｋｉの機能を育す る先端切除ｓｋｉタンパク質をコード化するＤＮＡセグメントおよびベクターを 含むＤＮＡ構築物を含存する。

別の実施態様において、本発明は、本発明のＤＮＡ構築物のタンパク質が発現さ れて、筋肉成長が誘導されるような条件下で、本発明のＤＮＡ構築物を筋肉に伝 達することからなる、筋肉成長を刺激するか、または筋肉変性を防止する方法に 関する。

その他の実施態様において、本発明は、本発明のＤＮＡ構築物のタンパク質が発 現されて、治療が達成されるような条件下で、本発明のＤＮＡ構築物を影響を受 けた筋肉に伝達することからなる、筋肉変性疾病を治療する方法に関する。

図面の簡単な説明 図１　：　ｃ−ｓｋｉ　ｃ　ＤＮＮツクローン構造。

ｃＤＮＡの長さは一定の率で拡大して描かれ、そして制限部位が示されている。

ｙ−ｓｋｉは比較のために示されている。ｙ−ｓｋｉにおけるドツトを付した四 角はウィルスＳＫＶを鋭敏に形質転換する際のｇａｇ−ｓｋｉ融合のｇａｇ領域 を示す。Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは、Ｓ１ヌクレア一ゼ保護分析のための一木調ブロ ーブを生成するために使用される領域を示す。矢印の次の数字はエキソン番号に 一致する。

図２：ＦＢ２９型のｃＤＮＡの完全コード配列および部分的コード領域。

これは、ＦＢ２９の５′末端配列がＦＢ２８およびＣＥＬクローンの５１末端に 類似していると仮定している。

↑はＦＢ２８およびＣＥＬが興なっている部位を示す。

ＣＥＬクローンにだけ見いだされた２５塩基は示されていない。番はｖ−ｓｋｌ の境界を示す。エキソン境界には番号が付され、そして交互にスプライシングさ れたエキソンは四角で囲まれている。ｃ−ｓｋｉ　とｖ−ｓｋｉの一個の塩基お よびアミノ酸の変化もまた破線の四角で囲まれている。

翻訳停止コドンは太線で囲まれている。可能性のあるポリアデニル化シグナルは 太く下線が付されている。ｍＲＮＡ安定性に包含され得るＡＴＴＴＡ配列を含む ＡＴリッチ領域は破線で下線が付されている。

図３　：　ｃＤＮＡ配列分析から予測されるようなＣ−５ｋｉ遺伝子座に対して 生成された交互のｍＲＮＡの説明図。

エキソンは一定の率で描かれていない。ｃ−ｓｋｉ　ｍ　ＲＮ　Ａはｖ−ｓｋｉ に関連して示されている。黒い部分は非コード領域であり、一方白い四角はｃＤ ＮＡのタンパク質コード領域である。ｙ−ｓｋｉの両末端にあるドツトを付した 四角はｓｋｉウィルスを形質転換する際のｇａｇ−ｓｋｉ融合のｇａｇ領域であ る。推定上の翻訳開始コドンおよび翻訳停止コドンの相対的位置もまた示されて いる。　図４＝全ＲＮＡの８１ヌクレア一ゼ保護分析。

図４Ａは、ハイブリダイゼーションに使用された均一に標識した一木調ブローブ が各写真の下に図式で示されており、太線がｃＤＮＡ配列を表し、そして細線は Ｍ１３配列を表す図面を示す。プローブの全体の長さおよび保護フラグメントの 予想長さもまた示されている。ＲＮＡハイブリダイゼーションは各列の上に示さ れている。列上の番号（８，１０，１２，１５または１７）はＲＮＡが調製され た胚の齢を示す。図４ＢはＦＢ２７／２９型のＫｐｎ　１−ＨｉｎｄＴ！ｉフラ グメントを含有するプローブＡ（図１参照）を示す。このプローブは矢印で示さ れるような６４５塩基対（ｂ　ｐ）のフラグメント１種と２６２および２７２ｂ ｌ）の２種のより短いフラグメントを産生じた。

図４ＣはＦＢ２８型のＫｐｎ　Ｉ−Ｈ７ｎｄｍ　：７ラグメントを含有するプロ ーブＢ（図１参照）を示す。このプローブは矢印で示されるような５３４ｂｐの フラグメント１種を産生した。より小さいフラグメントは検出されなかった。

図４ＤはＭ１３配列に連結したＦＢ２７型の４９７ｂｐＨｉｎｄｍフラグメント を含有するプローブＣ（図１参照）を示す。該プローブは４９７ｂｐのフラグメ ント１種と２４３／２５４のより小さいフラグメント２種をもたらした。４７９ ｂｐのフラグメントだけが矢印で示されている。ｒ；１４ＥｊｔＦＢ２８／２９ １１０）Ｈ４ｎｄｍフ５’ｊＪントを含有する長さ１１１　ａｂｐであるプロー ブＤ（図１参照）を示す。プローブＤは矢印で示されている７９９ｂｐのフラグ メントを生じた。

図５　：　ｃ−ｓｋｉ　とトリ白血症ウィルスからのｇａｇのｐ１９領域との配 列相同性。Ｃ−ｓｋｌ配列は２１８ないし２４２位であり、ｇａｇ　ｆｌ域のｐ １９配列は６３ｇないし６５８位である。相同領域は四角で囲まれている。

図６　：　ｃ−ｓｋｉ発現カセット。

図中に示されたＰｖｕ　ＩないしＮｒｕ　［セグメントはプラスミドの二重消化 に続いてゲル電気泳動により単離された。

線状ＤＮＡが受精卵のマイクロインジェクションによりトランスジェニックマウ スを創成するために使用された。

図７　：　ｃ−ｓｋｉを発現するトランスジェニックマウスおよびその通常同腹 子。

ｃ−ｓｋｉ　トランス遺伝子は交配で正常に分離すると考えられる。写真は筋肉 の発達した表現型（前方）を示すヘテロ接合マウスおよびＤＮＡ陰性の同腹子を 示す。二重盲検ＤＮＡ分析により、筋肉の発達した表現型がトランス遺伝子と共 に分離することが確認された。

図８＝トランス遺伝子発現のノーザン転写分析パネルＡはＴＧ８５６６系のマウ スの種々の組織から単離されたＲＮＡの分析を示す。該パネルの上側はニワトリ ｃ−ｓｋｉ　とハイブリダイゼーションした後のオートラジオグラムを示す。ト ランス遺伝子から正確に転写されたｃ−ｓｋｉメツセージの移動の予測位置は２ ．５ｋｂである。

２．５ｋｂに相当する位置には印（Ｓｋｉ）が付されている。

下側のパネルはニワトリβ−アクチンｃＤＮＡへのハイブリダイゼーションに続 く同一フィルターからのオートラジオグラムを示す。β−アクチンｃＤＮＡはβ −アクチンｍＲＮＡだけでなく、その他のアクチンメツセージとハイブリダイゼ ーションするであろう。β−７クチンおよびα−アクチンｍＲＮＡの両方の移動 の予測位置はパネルの右側に示されている。

パネルＢ：バネルＢに示されたオートラジオグラムは、ＲＮＡが３種のその他の トランスジェニック系に由来することを除いて、パネル人に示されたものと同様 である。

ＲＮＡを調製するために使用された系は図面の右端に示されている。パネルＢＪ ：示されたフィルターは同時に行われ、パネルＡに示されたものは異なる日に行 われた。

図９ニドランス遺伝子からのＲＮＡのＲＮアーゼ保護。

図面の上側にゲルのオートラジオグラムを示す。第１列はＲＮアーゼ消化をして いないアンチセンスＲＮＡプローブを含む。次の２つの列はＲＮＡを添加しない か、またはｔＲＮＡを添加したプローブのハイブリダイゼーションの後の消化の 結果を示す。次の８つの列は４種のトランスジェニック系の心臓（Ｈｅａｒｔ） または骨格筋（Ｓｋ、　Ｍｕｓｃｌｅ）のいずれかから単離されたＲＮＡに対す るハイブリダイゼーションの結果を示す。次の列は、トランス遺伝子を保持しな いマウスの骨格筋からのＲＮＡにプローブをハイブリダイゼーションした結果を 示す（Ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｓｋ、　１ｉｕｓｃｌｅ）。最後の列は分子量マーカー を含有する。オートラジオグムの下側には、アンチセンスＲＮＡプローブに関す るＭ　Ｓ　Ｖ　Ｌ　Ｔ　Ｒｃ−ｓｋｉ発現カセットの説明図がある。Ｔ７転写は ｃ−ｓｋｉコード領域の中央で始まり、そしてＭｓＶ　ＬＴＲを介してｐＢＲ１ ２２（ｐＢＲと表記）に由来する隣接配列に進む。トランス遺伝子に由来する転 写が正確に開始するならば、そのとき９８４塩基のフラグメントが保護されるで あろう。

図１０ニドランスジエニツクマウスにおけるニワトリｃ−ｓｋｉタンパク質発現 。

抽出物は対照マウス（Ｃｏｎｔｒｏｌ）またはｃ−ｓｋｉ　）ランス遺伝子を保 持し発現するマウスの肝臓（Ｌｉｖ）または骨格筋（Ｓｋ、　Ｍ）からｍｓされ た。放射標識された分子量標準の移動位置は図面の左側に示されている。

図１１　：　（ａ）対照マウスおよび（ｂ）　Ｔ２Ｏ５６６系のマウスから０脚 底の筋肉の丁度中央から調製された横断切片。両方の図面は同じ倍率であり、サ イズマーカーは２００μである。（Ｃ）対照マウスの脚底および（ｄ）作用を受 けたマウス０脚底からのより高倍率の図面。（Ｃ）および（ｄ）におけるサイズ マーカーは１００μである。

図１２：通常およびトランスジェニックマウスからの選択された筋肉における繊 維径の分布。

パネルＡ　：　ｃ−ｓｋｉを発現するトランスジェニックマウスにおいて横隔膜 は正常のように見える。筋肉の発達した表現型を有するマウス（ＴＧ８５６６） からの横隔膜および通常の対照マウスからの横隔膜は切断され、そして得られた 横断切片領域の個々の筋繊維の数が記録された。

パネルＢ：前方脛骨筋はＴ０８５６６系からのマウスにおいて大きく増大されて いる。縦断切片はトランスジェニックマウスおよび対照マウスの両方から調製さ れた。

各々の得られた横断切片領域の繊維数が記録された。この筋肉は２種類の異なる タイプの繊維からなり、そのいくつかは、対照に見いだされた繊維に比べ、より 小さく、その他はより大きい（図１１もまた参照せよ）。

図１３：ＴＧ８５６６からの特定の筋肉におけるトランス遺伝子発現 全ＲＮＡ２０μｇを電気泳動により分画し、そしてニトロセルロース膜に転写す る。転写物はニワトリｃ−ｓｋｚでまず探索され、次にフィルターを細片化し、 そしてニワトリβ−アクチンｃＤＮＡで再び探索された（　Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ 等、　１９８０．　Ｃｅ１ｌ　２０　、９５−１０５）　、　ＲＮＡは横隔膜、 脚底または大骨格筋（Ｓｋ　Ｍｕｓｃｌｅ）から単離された。

図１４＝作用を受けたマウスのロームボイドイスキャビテイス筋の中央から調製 された切片の免疫蛍光染色。

（ａ）スローＭＨＣに特異的なモノクローナル抗体Ｎ０Ｑ７　５　４Ｄでの染色 。スロー繊維は肥大していない。

（ｂ）Ｉ［ａＭＨＣに特異的なモノクローナル抗体５Ｃ７１１での染色。Ｉ［ａ 繊維は肥大していない。（Ｃ）すべてのファストＭＨＣイソ体と反応するモノク ローナル抗体２Ｇ３での染色。全ての肥大した繊維はこの抗体で染まる。（ｄ） はｆｆｂＭＨｃに特異的なｍ／ａＢＰ−Ｆ３での染色。全てではないが多（の肥 大した繊維が染まる。

倍率２３０倍。

発明の詳細な説明 本発明はニワトリｃ−ｓｋｉタンパク質の全体またはユニーク部分をコード化す るＤＮＡセグメントに関する。該ＤＮＡセグメントは種々のニワトリｃ−ｓｋｉ タンパク質の１種、例えばＦＢ２９、ＦＢ２８およびＦＢ２７をコード化し得る 。本明細書で使用される「ユニーク部分」とは、少なくとも５個（または６個） のアミノ酸、またはそれに相当する少なくとも１５個（または１８個）のヌクレ オチドからなるものと定義される。本発明はまた、そのようなりＮＡ上セグメン ト含有するＤＮＡ構築物およびそれらで形質転換された細胞に関する。

本発明は図１に示されたエキソン６のアミノ酸配列または図１に示されたエキソ ン７のアミノ酸配列をコード化するＤＮＡセグメントに関する。本発明はまた、 エキソン７の他に、図１に示されたエキソン１、エキソン２、エキソン３、エキ ソン４、エキソン５またはエキソン６からなる群から選択されるる少なくとも４ つのエキソンをさらに含むＤＮＡセグメントに関する。そのようなりＮＡ上セグ メント例はＦＢ２９、ＦＢ２８およびＦＢ２７を包含する。

本発明が関するＤＮＡセグメントはまた、例えば図１のアミノ酸配列のアレリッ ク体を包含する図１のエキソンにおいてコード化される実質的に同様のタンパク 質をコード化するものを包含する。本発明はまた、上記配列に相補的なりＮＡフ ラグメントに関する。本発明のＤＮＡセグメントのユニーク部分またはその相補 的セグメントはＤＮＡまたはＲＮＡ試料中の相補的鎖の存在を検出するためのプ ローブとして使用され得る。

本発明はさらに、ＤＮＡ構築物またはそれで形質転換された宿主細胞に関する。

一実施態様において、本発明のＤＮＡ構築物は本発明のｃ−ｓｋｉタンパク質を コード化するＤＮＡセグメントおよびベクター、例えばｐＭＥＸｎｅｏからなる 。別の実施態様において、ＤＮＡ構築物はｃ−ｓｋｉの機能を有する先端切除ｃ −ｓｋ！タンパク質をコード化するＤＮＡセグメント（例えばΔＦＢ２９）およ びベクター（例えばｐＭＥＸ＋５ｅｏ）からなる。ＤＮＡ構築物は宿主細胞を形 質転換するのに適当である。宿主細胞は原核細胞であるか、または好ましくは真 核細胞（例えば哺乳細胞）であってよい。

本発明はさらに、筋肉の大きさが増大した動物、例えば家畜に関する。増大した 筋肉を有する家畜のそのような品種の開発は通常の育種計画の主要な目的であり 続ける。（本明細書で使用されている家畜はその肉のために飼育される動物、例 えばブタ、ニワトリ、七面鳥、アヒル、ヒツジ、ウシおよび魚、特にマスおよび ナマズに関する）。

種々の遺伝子をマウスおよび種々のタイプの家畜の生殖系列に導入することは当 業者に比較的通常の操作である。本発明者は、ΔＦＢ２９とｐＭＥＸ＊ｅｏベク ターとを含むＤＮＡ構築物を受精卵に導入することにより筋肉の大きさが増大し たマウスを創成した。生成した創成マウスおよびそれらの子孫はそれらの全ての 体細胞および生殖細胞に当該ＤＮＡ構築物を有する。

ｓｋｉタンパク質（例えばｃ−ｓｋｉタンパク質）をコード化するＤＮＡ構築物 の動物の受精卵への導入（例えばマイクロインジェクション）により、増大した 筋肉発達および減少した脂肪組織を有する動物の品種を生じる。当業者が理解す るであろうように、本発明の大きさの増大した筋肉を有する動物はまた、様々な 種からのｓｋｉタンパク質をコード化するＤＮＡを用いて創成され得るにニワト リが丁度そのような例である）。さらに、本発明の動物はｓｋｉに関連するタン パク質をコード化するＤＮＡ構築物、例えばｓｎｏ遺伝子を用いて創成され得る 。

フレームシフト突然変異により作成されたＤＮＡセグメントΔＦＢ２９は先端切 除タンパク質を生じる。しかしながら、当業者が理解するであろうように、本発 明のトランスジェニック動物はまた、全長のｓｋｉタンパク質、ｓｋｉタンパク 質の一部をコード化するＤＮＡセグメント、例えば１種もしくは２種のエキソン または生物学的に活性な欠失誘導体、例えばウィルスタンパク質に融合した先端 切除ｃ−ｓｋｉを発現するｖ−ｓｋｉを含むＤＮＡ構築物により製造され得る。

さらに、筋肉組織におけるタンパク質の選択的発現がｐＭＥＸｎｅｏ以外のベク ターにおいて創成されたＤＮＡ構築物に由来し得ることも理解される。

本発明はまた、動物例えばヒトにおける筋肉成長を刺激する、および筋肉変性を 防止する方法に関する。筋肉組織の損失を生じる傷害および筋肉の変性を生じる 神経性障害に対する可能な治療は筋肉の成長を刺激することであろう。筋肉の損 失の場合に、この治療は組織の再生の刺激を含むであろう。一方、神経性障害の 場合には、筋肉成長は消失性神経刺激物と関係なくなされる必要があろう。本発 明によれば、筋肉成長はｓｋｉタンパク質をコード化するＤＮＡ構築物にコード 化されたタンパク質が発現されるような条件下で筋肉組織に該ＤＮＡ構築物を伝 達することにより刺激され得る。上記構築物は当業者には公知の標準法を用いて 筋肉に標的化され、そして伝達され得る。

本発明はさらに、筋肉変性疾病、例えば筋ジストロフィーおよび筋萎舘性側素硬 化症（ルイ・グーリック症としても知られている）を治療する方法に関する。治 療は本発明のＤＮＡ構築物にコード化されたタンパク質が発現されて、治療が達 成されるような条件下で、本発明のＤＮＡ構築物を影響を受けた筋肉に伝達する ことからなる。

実施例 ｃＤＮＡライブラリィのスクリーニング２種のニワトリｃＤＮＡライブラリィが 標準的プロトコル（Ｍａｎｉａｔｉｓ等、　１９８２．　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　 Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、コールド・スプ リング・ハーバ−研究所。

ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバ−）を用いてｖ−ｓｋｉプローブ でスクリーニングされた。一方のライブラリィは１０日胚の体壁から単離された ポリＡ’ｍＲＮＡから作成され、他方はＡＥＶ形質転換されたニワトリ赤芽細胞 から単離されたｍＲＮＡから作成された。

４種の異なるｃ−ｓｋｉ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａが単離され、８種は体壁ライブラリィ からであり（これらのクローンはＦＢ２７゜ＦＢ２８およびＦＢ２９と表記され た）、そして１種のｃＤＮＡクローンは赤芽細胞ライブラリィからだつた（ＣＥ Ｌと表記された）。これらのｃＤＮＡはウィルスに存在するｓｋｉの部分の両方 の５１および３′を延長する配列を含んでいた。そのｃＤＮＡは、ｖ−ｓｋｉが 単一の細胞遺伝子に由来することを示し、そして別個のｓｋｉタンパク質をコー ド化する多重ｃ−ｓｋｉ　ｍ　ＲＮ　Ａが交互スプライシングによりＣ−５ｋｉ 遺伝子座から産生きれることを示唆しく　Ｌｅｆｆ等！　１９８６．　Ａｎｎ、 　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｔ　５５　、１０９１−１１１７　”）　、これはこ の様式で多重量ＲＮＡを産生ずることが知られている腫瘍遺伝子の増加するリス トに加えられる（　Ｂｅｎ−Ｎｅｖｉａｈ等、１９８６．　Ｃｅ１ｌ　４４　、 　５７７−５８６；　Ｌｅｖｙ等、　１９８７＋　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉ ｏｌ、　７．４１４２−４１４５；　Ｍａｒｔｉｎｅｚ等、１９８７．　５ｃｉ ｅｎｃｅ　２３７　、　４１１−４１５；　ＭｃＧｒａｔｈ等、１９８３゜Ｎａ ｔｕｒｅ　３０４．５０１−５０６　）　。

ｃＤＮＡクローンの構造 ＤＮＡ配列決定（Ｓａｎｇｅｒ等、　１９７７、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ ｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７４　、５４６３−５４６７　）により特徴づけられたｃ− ｓｋｉ　ｃＤＮＡクローンの全ての構造およびそれらのｖ−ｓｋｉとの関係は図 １に示されている。

ＦＢ２８およびＣＥＬだけがｙ−ｓｋｉの５′配列を有し；ＦＢ２７およびＦＢ ２９の両方は５′末端で切除されている。ＦＢ２９の５′末端の消失配列がＦＢ ２８およびＣＥＬのものと類似していると仮定して、混成ヌクレオチド配列およ びＦＢ２９型のｃＤＮＡに対する予想アミノ酸配列が図２に示されている。実質 的な下流読み枠を有する最初のＡＴＧはヌクレオチド１６８位に位置する。この ＡＴＧの上流には読み枠は開放されておらず、これらの配列が５′非翻訳領域を 表すことを示唆する。

ｃＤＮＡ配列分析ならびにゲノム配列から公知のスプライシングドナーおよびア クセプタ一部位の位置の比較（５ｔａｖｎｅｚｅｒ等、　１９８９．　Ｍｏ１． 　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　９．４０３８−４０４５）に基づいて、エキソン境 界が誘導された（図３参照）。この図面に見られるように、Ｃ−ｓｋｉ配列は７ つのエキソンにわたって分布されている。ＦＢ２９は７つの全てのエキソンを含 有し、ＦＢ２８およびＦＢ２７はそれぞれエキソン２およびエキソン６を欠いて いる。この特異なスプライシングは３種のｃＤＮＡのタンパク質コード能力に影 響する。

エキソン２の特異なスプライシングは読み取り枠工流のコード能力に影響を及ぼ すことなく３７個のアミノ酸を欠失する。しかしながら、エキソン６の特異なス プライシングはエキソン７のコード能力に影響を及ぼす。エキソン５がエキソン ７にスプライシングされるならば（ＦＢ２７　ｃＤＮＡにおいて見られる）、翻 訳停止コドンがスプライシング結合部位に生成し、そしてエキソン７は非コード 性エキソンになる。しかしながら、ＦＢ２８／２９のように、エキソン５がエキ ソン６に、そしてエキソン６がエキソン７にスプライシングされるならば、この とき読み取り枠はエキソン７において追加のアミノ酸１２９個をコード化する４ １７ヌクレオチドが続く。

ＦＢ２９およびＦＢ２７ｍＲＮＡの消失性５１末端がＦＢ２８およびＣＥＬに存 在するものと同一の配列を含有すると仮定すると、そのときｃＤＮＡの３種の異 なるタイプに相当するｍＲＮＡの翻訳は３種のタンパク質の生成を導くであろう 。その１つ目は７５０個のアミノ酸（ＦＢ２９からの）を含み、２つ目は７１８ 個のアミノ酸（ＦＢ２８からの）を含み、そして３つ目のタンパク質は５１０個 のアミノ酸（ＦＢ２７からの）を含む。

ＣＥＬクローンは３′配列を消失している。体壁（ＦＢ）ライブラリィに由来す るｃＤＮＡは、ヌクレオチド２８０３ないし２８９８からの９５塩基対（ｂ　ｐ ）のＡＴリッチ領域を含む長い３１非翻訳領域を有する。この領域内には、ｃ− ｍｙｃ　、インターフェロン、ｃ−ｊｕｎおよびｃ−ｆｏｓ等の一時的に誘導さ れる種々のｍＲＮＡにおいてｍＲＮＡＲＮＡ脱安間化した配列ＡＴＴＴＡ２コピ ーがある（ＭｅｉｊＨｎｋ等、　１９８５．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ ｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ８２、　４９８７−４９９１；　Ｒｙｄｅｒ等、１９８ ５．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８５　、１４８７−１４９１；　Ｓｈａｗ等、　１９８６． 　Ｃｅ１ｌ　４６　。

６５９−６６７　）。これらの配列の付加または欠失はｃ−ｆｏｓの形質転換能 力に影響を及ぼすことが示された（Ｍｅｉｊｌｉｎｋ等、　１９８５．　Ｐｒｏ ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　１１２．４９８７−４９９ １）。

ｃ−ｓｋｉ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａは３３４８位と４１６７位に位置する２つの強力な ポリ（八）シグナル（ＡＡＴＡＡＡ）を含む。３種の全てのクローンはＦＢライ ブラリィから同じ位置で単離されたけれども、ポリ（Ａ）尾部を持たない。

それ故に、ｃ−ｓｋｉ　ｍ　ＲＮ　Ａの３′末端はこれらのクローンに含まれて いないといえそうである。単離され、そして特徴づけられた４、２ｋｂのｃＤＮ Ａはノーザン転写分析により検出された５、７−８．０ｋｂおよび１０゜０ｋｂ のｍＲＮＡ（Ｌｉ等、　１９８６．　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　５７．１０６５−１ ０７２）より小さい。この矛盾は説明されていないが、ポリ（Ａ）尾部を欠くこ れまで単離されたクローンもまたｍＲＮＡの３′末端からの配列を欠いているこ とが示唆される。

ｃ−ｓｋｉ　ｍ　ＲＮ　Ａの５′末端 ５′末端での配列比較は、ＦＢ２８およびＣＥＬの両方が推定上の翻訳開始ＡＴ Ｇコドンの上流８９ｂｐ位まで共直線性であることを示す。ＦＢ２８は追加の７ ６ｂｐを有するが、ＣＥＬはＦＢ２８に見いだされたものとは異なる２　５ｂｐ を存する。２つの配列が異なるこの領域がゲノムクローンからの配列と比較され （５ｔａｖｎｅｚｅｒ等、　１９８９．　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　 ９．４０３８−４０４５　）　、そしてＦＢ２８における上流配列はゲノム配列 と共直線性である。

ＣＥＬとＦＢ２８とが相違する点でのゲノムＤＮＡの配列の試験は、ドナーまた はスプライシング部位のためのコンセンサス配列を明らかにしない。クローンの 信頼性を確認するために、Ｓ１ヌクレア一ゼ保護分析が行われた。この結果は、 ＦＢ２８に存在する配列が通常の胚においてｍＲＮＡとして発現されることを示 した。同様の８１分析はＣＥＬクローンの５′最末端での２５ｂｐのｍＲＮＡ中 の存在に対する証拠を与えなかった。このことにより、ＣＥＬクローンの最初の ２５塩基はクローニング人工物の結果であること、およびＦＢ２８クローンに見 いだされた配列はｃ−ｓｋｉ　ｍ　ＲＮ　Ａ中に発現されることが示唆される。

どのくらい多（のｃ−ｓｋｉ　ｍ　ＲＮ　Ａの５′非翻訳領域がＦＢ２８中に含 まれるかを決定するために、プライマー伸長分析が行われた。ＦＢ２Ｂ中に存在 する５′セグメントの複製により約２８０塩基の伸長産物が得られるべきである 。しかしながら、２２０塩基のプライマー伸長産物が見られた。８１分析データ は、このセグメントがＲＮＡにおいて発現されることを示した。観察されたプラ イマー伸長産物は未熟な停止の結果であるかもしれないが、ｃ−ｓｋｉ　ｍ　Ｒ Ｎ　Ａのための多重５′末端があることも可能である。

内部エキソンの機構 ＦＢ２７、ＦＢ２８およびＦＢ２９ならびにＣＥＬｃＤＮＡの中心部での配列比 較は、ＦＢ２８が３７個のアミノ酸を失うであろう１０７９−１１９１の１ｌｌ ｂｐ（エキソン２）の小さい領域を欠いていることを示す。

相当する領域でのゲノム配列（５ｔａｖｎｅｚｅｒ等、　１９８９．　Ｍ。

１、　Ｃｅ１１．　Ｒ７ａ１．９．４０３８−４０４５　）は、ｃＤＮＡが別々 にスプライシングされたｍＲＮＡから誘導されることを示唆する、欠失の境界で のコンセンサス・スプライシングドナーおよびアクセプター配列の存在を明らか に示す。

ＦＢ２８およびＦＢ２８／２９型のｍＲＮＡの存在を確認するために、８１分析 が全ＲＮ人に関して行われた。

全ＲＮＡは標準的プロトコル（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ等、　１９７９．　Ｂｉｏｃｈ ｅｍｉｓｔｒｙ　１Ｂ　、　５２９４−５２９９　）を用いて８．１０，１２． １５および１７日齢のニワトリ胚から単離された。全ＲＮＡ約２０ないし３０μ ｇが標準的プロトコル（Ｍａｎｉａｔｉｓ等、１９Ｂ２．　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ 　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ。

コールド・スプリング・ハーバ−研究所２ニユーヨーク州コールド・スプリング ・ハーバ−）を用いる核Ｓ１分析のために使用された。

ＦＢ２９／２７またはＦＢ２８のＫｐｎ　ＩとＨｉｎｄｍ部位との間の領域に及 ぶ均一に標識された一木調プロープ（図１のプローブＡおよびＢ）を全体の細胞 ＲＮＡとハイブリダイゼーションさせた。ｒＭ４Ｂに示されるように、ｍＲＮＡ へのハイブリダイゼーション、統＜ＦＢ２９に由来するプローブの８１消化によ り、ＦＢ２７／２９型のｍＲＮＡへのハイブリダイゼーションを示す６４５ｂｐ の保護フラグメントおよび前記プローブがＦＢ２ａ型のｍＲＮＡとハイブリダイ ゼーションさせた場合に予想される２６２／２７２ｂｐフラグメントが得られた 。

ＦＢ２８（プローブＢ）は５３４ｂｐのフラグメントを保護した（図４０参照） 。ＦＢ２８プローブのＦＢ２７／２９型のｍＲＮＡへのハイブリダイゼーション からのより小さいフラグメントは観察されなかったが、ＳｌはＲＮＡのループ外 の領域に効果的に反対のＤＮＡプローブを常に切断するわけではない。これらの 試験は、第２エキソンを含むＦＢ２７／２９型の両方に相当するｍＲＮＡおよび 第２エキソンを欠＜ＦＢ２８型に相当するｍＲＮＡが通常の細胞中に発現される ことを示す。

３′コード性エキソンの機構 ３種の繊維芽細胞クローンの配列比較は、ＦＢ２８およびＦＢ２９がＦＢ２７に 欠けているセグメント（エキソン６）を含むことを示した。ｃＤＮＡが異なって いる位置に相当する位置でのゲノムＤＮＡの試験はコンセンサス・スプライシン グドナーを明らかにする（　５ｔａｖｎｅｚｅｒ等、　１９８９．　Ｍｏ１．　 Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　９．４０３８−４０４５　）　、　２種のｃＤＮＡは エキソン６を包含するか、または排除するスプライシングに由来するように考え られる。この相互のエキソンの下流で、３種全てのｃＤＮＡの３′部分は同一で ある。

両方のタイプのｃＤＮＡが通常の細胞ｍＲＮＡを表現するかどうかを調べるため に、８１分析が行われた。均一に標識された一木調ブローブはＦＢ２８の３′末 端からの７９９　ｂ　ｐＨ１ｎｄＴ！ｉフラグメント（プロー１０２図１参照） およびＭ１３ｍｐ１８中にサブクローン化されたＦＢ２７の３′末端からの４９ ７　ｂ　ｐＨ１ｎｄＴＩｉ”：ｌラグメント（プローブＣ）から製造された。− 重鎖プローブを製造し、そして異なる齢の全体のニワトリ胚から調製された全Ｒ ＮＡ２０μｇにハイブリダイゼーションさせた。

図４Ｅに示されるように、ＲＮＡのプローブＤ（ＦＢ２８）へのハイブリダイゼ ーションおよび続くＳ１処理により、ＦＢ２８／２９型のｍＲＮＡが存在する場 合に予想されるであろう７９９ｂｐフラグメントが得られた。

ＦＢ２７型のｍＲＮＡとハイブリダイゼーションするＦＢ２８プローブにより生 成されるであろうより小さいフラグメントは検出されなかった。ＦＢ２７ブロー ブ（プローブＣ）の８１消化により、４９７ｂｐのフラグメントおよび２４３な いし２５４ｂｐの２種のより小さいフラグメントが得られた（図４Ｄ参照）。こ れらのより小さいフラグメントは、ＦＢ２７ブローブがＦＢ２８／２９型のｍＲ ＮＡと異なる部位での該プローブの８１切断に由来すると考えられる。これらの データはＦＢ２８／２９型ｍＲＮＡの存在を確認するが、しかしＦＢ２７ｍＲＮ Ａが存在する場合、ＦＢ　２８／２９に比べより低いレベルで存在すると考えら れる。

特異なスプライシング ｃＤＮＡクローンの核酸配列分析から予測されるような３種のｃ−ｓｋｉ　ｍ　 ＲＮ　Ａの特異なスプライシングの説明図は図３に示されている。ニワトリ胚か ら誘導された全ＲＮＡのＳ１分析により、エキソン２を含むものと含まないもの との２種のクラスのｍＲＮＡの存在が確認された。同様のプロトコルを用いて、 エキソン６を含むｍＲＮＡの存在が確認された。この技術を利用して、ＦＢ２７ ｃＤＮＡに相当するであろうエキソン６を欠＜ｍＲＮＡの存在を示すことはでき なかったが、一連の議論は、ＦＢ２７ｃＤＮＡが単純なりローニング人工物でな いことを示唆する。ＦＢ２７にない配列は確かなスプライシング結合部により結 合されている（ｃＤＮＡ配列および利用可能なゲノムＤＮＡ配列の両方の試験に より判断されるように）。おそらく部分的にプロセシングされたｍＲＮＡが逆転 写されるから、１またはそれ以上のイントロンを含むｃＤＮＡがときおり得られ るけれども、エキソンを人工的に消失しているｃＤＮＡの単離は理論に基づいて おそら（少なく、モしてｃＤＮＡライブラリィの作成において、たとえあっても まれにしか起こらないように思われる。これらの理由のために、ＦＢ２７が、比 較的まれであるならば、実際のＣ−５ｋｉ　ｍ　ＲＮ　Ａを表現するという理解 は現在支持されるている。

ｃ−ｓｋｉ　とｖ−ｓｋｉとの比較 レトロウィルスによるｃ−ｏｎｃの形質導入はｃ−ｏｎＣｉ：おける先端切除、 欠失または点突然変異をしばしば生じる（Ｂｉｓｈｏｐ、　Ｊ、　Ｍ、、　１９ ８３．　Ａｎｎ　Ｒｅｖ、　Ｂｊｏｃｈｅｍ、　５２　、３０１−３”４　）　 ｅ　ｃ−ｓｋｉ配列とｖ−ｓｋｉ配列の比較により、ｖ−ｓｋｉ遺伝子が５′お よび３′の両方の末端で先端切除され、そしてｃ−ｓｋｉコード領域の一部だけ を表現することが示されている（図１および３参照）。シーｓｋ！配列は２４４ 位で始まり（推定上のイニシューターＡＴＧは１６８位にある）、そして１５４ １位で終わるＣ図３参照）。

５１および３′の先端切除の生物学的意義は知られていない。ｖ−ｓｋｉが「Ｃ 」を有し、そしてｃ−ｓｋｒがｒＴＪを育する１２８４位で、ｃ−ｓｋｉに対し てｖ−ｓｋｉ　ニは１個の塩基変化だけがある。この塩基変化はｃ−ｓｋｉにお けるＴｒｐからシーｓｋｉにおけるＡｒｇに変更する。ｖ−ｓｋｉの欠失分析は 、上記アミノ酸変化がｖ　−ｓ’ｋ　ｉの形質転換能力に重要な役割を演じない ことを意味する。ｃＤＮＡの生物学的活性は複製能力のあるレトロウィルスベク ター（Ｈｕｇｈｅｓ等、　１９８７．　Ｊ、　Ｖｊｒｏｌ、　６１．３００４− ３０１２　）を用いるＣＤＮＡからのコード偏成を発現することにより評価され る。

図５に示されるように、２０ｂｐのうち１８ｂｐがＣ−ｓｋ２とｌ！ＡＬＶにお けるｇａｇのｐ１９領域との間で同一である。相同のこの領域はウィルス配列と シーｓｋｉ　との間に５ｌ結合部を含有する。そのような長い範囲の相同があれ ば、５′組換え結合部を正確に確認することが不可能である。実質的な相同性は ３’５ｋｉｌＡＬＶ結合部に正確に示され得ない。しかしながら、３１結合部の すぐ下流に、ｖ−ｓｋｉ　／　Ａ　Ｌ　Ｖ結合部の３′に見られたｃ−ｓｋｉの セグメントにきわめて相同である人ＬＶ配列がある。

組換えに包含される核酸の並列において相同のこの領域を引き起こすことが可能 である。

形質導入機構 レトロウィルスが細胞性腫瘍遺伝子を必要とする正確な機構は不明確なままであ る。第１段階として、ウィルスＤＮＡが細胞性腫瘍遺伝子の隣りかまたはその中 に組み込まれることが示唆されている（Ｂｉｓｈｏｐ、　Ｊ、　Ｍ、、　１９８ ３、　Ａｎｎ　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　５２　、３０１−３５４　）　ｏ 　レトロウィルスおよび細胞の配列は次にＤＮＡ欠失法（Ｂ１５ｈｏｐ、　Ｊ、 　Ｍ、　。

１９８３、Ａｎｎ　Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、５２　、　３０１−３５４；　Ｃ ｚｅｒｎｊｌｏｆｓｋｙ等、　１９８３．　Ｎａｔｕｒｅ　３０１．７３６−７ ３８　）またはＲＮＡリードスルー（Ｈｅｒｍａｎ等、１９８７．　５ｃｉｅｎ ｃｅ　２３６　、　８４５−８４８；　Ｎｉ１ｓｅｎ等、　１９８５．　Ｃｅ１ ｌ　４１　、１７１９−１７２６　）により融合され得るが、相同性はこれらの 方法のいずれかに関連することは知られていない。ｓｋｉの場合において、ｃ− ｓｋｉ配列とｐ１９コード領域との比較はｓｋｉウィルスの生成におけるいくつ かの過程が相同的組換えを含んでいたことを意味する。しかしながら、相同的組 換えは２次的であってよい。元の過程が非相同的であり、そして直接反復を含む ウィルスゲノムを生成するならば、ルイ悪性腫瘍ウィルスに観察されたように、 おそらく逆転写の間のコピー選択を介して反復間の配列がウィルス培養の間の組 換えにより消失され得ることが期待されるであろう。しかしながら、腫瘍遺伝子 がｃ−ｏｎｃと複製可能ウィルスとの間の相同組換えにより要求されるモデルを 提案することが可能である。相同の短い長さはウィルスｍ瘍遺伝子の両末端（Ｂ ａｎｎｅｒ等、　１９８５．　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　５．１４０ ０−１４０７；　Ｖａｎ　Ｂｅｖｅｒｅｎ等、１９８３．　Ｃｅ１ｌ　３２　、 　１２４１−１２５５　）または左側もしくは５′組換え結合部（Ｂｅｓｍｅｒ 等、　＋９８６゜Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）　３２０．　４１５−４２１； 　Ｒｏｅｂｒｏｅｋ　等、１９８７．　Ｊ。

Ｖｉｒｏｌ、　６１．２００９−２０１６　）だけに観察された。このデータは 、５１相同組換えが１次的であるか、または２次的であるかの決定を可能にしな い。

トランス遺伝子およびトランスジェニックマウスの創成ｃ−ｓｋｉの７程合ての コード性エキソン由来の配列を含むＦＢ２９であり、そしてＤＮＡ配列により判 断され、７５０個のアミノ酸のｃ−ｓｋｉタンパク質をコード化する単離された ｃＤＮＡの最大のものは誘導体ΔＦＢ２９の創成に使用された。ΔＦＢ２９は第 ５のコード性エキソン内の１４７５位にフレームシフト突然変異を存しく−続き の５個のＣ中の１個のＣがフレームシフト突然変異体において消失した）、そし て最初の４３６個のアミノ酸がｃ−ｓｋｉのＦＢ２９体の最初の４３６個のアミ ノ酸に同一である４４８個のアミノ酸のタンパク質を生じることが予測される（ 最後の１２個のアミノ酸がフレームシフト突然変異を受け、そのためｃ−ｓｋｉ のＦＢ２９体のものと異なっている）。トランス遺伝子の調製において使用され るΔＦＢ２９は図６に模式的に示されている。

トランス遺伝子のｓｋｉ部分の構築は既に記載されている（　５ｕｔｒａｖｅお よびＨｕｇｈｅｓ、　１９８９．　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　９゜４ ０４６−４０５１：　５ｕｔｒａｖｅ等、１９９０．　Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ、　 Ｂｉｏｌ、１０　。

３１３７−３１４４　）。要するに、ΔＦＢ２９と呼ばれる先端切除ニワトリＣ −５ｋｉ　ＣＤ　Ｎ　ＡはアダプタープラスミドＣ１ａ　１２Ｎｃ　ｏに予めク ローン化された。ΔＦＢ２９セグメントはＣ１ａ　１消化によりアダプタープラ スミドから切り出され、そして５１突出部をｆ：、　ｃｏＬｉ　ＤＮＡポリメラ ーゼＩのフレノウフラグメントおよび４種全てのｄＮＴＰを用いて充填する。こ のプラント末端フラグメントを、ＥｃｏＲＩ制限酵素での消化およびフレノウフ ラグメントとのプラント末端化を行ったｐＭＥＸｎｅｏベクターに連結した。正 しい配向に挿入されたクローンを選択し、そしてｐｖｕ　１およびＮγｕＩ両方 の制限エンドヌクレアーゼで消化した。これらの酵素はＭＳＶ　ＬＴＲおよびＳ Ｖ４０ポリＡシグナルが両端に配置されたへＦＢ２ｅｃＤＮ人を含むセグメント を遊離する（図６参照）。このセグメントをゲル精製し、そしてマウス受精卵に 注入するために用いた（Ｈｏｇａｎ等、　１９８６．　Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎ ｇ　ｔｈｅ　ｍｏｕｓｅｅｍｂｒｙｏ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕ ａｌ、（コールド・スプリング・ハーバ−研究所、ニューヨーク州コールド・ス プリング・ハーバ−）〕。

ΔＦＢ２９りｏ−：ｚ＋ｔＭＳＶ　ＬＴＲとＳＶ４０ポリアデニル化部位との間 に先端切除ｃ−ｓｋｉ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａがあるような配向でｐＭＥＸ発現プラス ミド内に置かれている（図６参照）。このプラスミドをｐｖｕ　ｌおよびＮｒｕ 　［で消化して発現カセットを遊離した。該発現カセットはゲル電気泳動により 精製され、そしてマイクロインジェクションによりマウス受精卵に導入された。

４４匹の創成マウが２回の別々の注射の後に得られた。マウスは尾切断部から単 離されたＤＮＡのドツトプロット分析により同定された。この分析はサザン転写 により確認された。

４４匹の創成マウスのうち３匹が明らかな筋肉表現型を示した（ＴＧ８５６６、 ＴＧ８８２１およびＴＧ８５６２）。この３匹の創成マウスおよび完全なトラン ス遺伝子の再配列されていないコピーを含むが、しかし表現型を示さない１匹の マウス（ＴＧ８５４２）が系を生成するために使用された。ＴＧ８５６６、ＴＧ ８８２１、ＴＧ８５６２およびＴＧ８５４２からのＤＮＡのサザン転写分析は、 各県のトランス遺伝子の組み込み部位が異なり、そしてコピー数がゲノムあたり 約５−３５コピーに及ぶことを示唆する。

３つの系（ＴＧ８５６６、ＴＧ８８２１およびＴＧ８５６２）からのＤＮＡ陽性 マウスは異常な筋肉成長を生じる同様の明確な外観ををしていた。３つの系のマ ウスは腫瘍遺伝子を保持するけれども、いずれの系も腫瘍の高められた発生を有 するようには見えない。ニワトリが感染細胞を注射されないならば、ｖ−ｓｋｉ ウィルスはその鳥において腫瘍原性でないから、上記の結果は全体的に予期され ないＣＢ、　５ｔａｖｎｅｚｅｒ、　１９８８．　Ｔｈｅ　Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　 Ｈａｎｄｂｏｏｋ、　Ｂ、　Ｐ、　Ｒｅｄｄｙ、　Ａ、　ＡｋａｌｋａおよびＴ 、　Ｃｕｒｒａｎ編。

（アムステルダム：エルセビエル・サイエンス出版社）３９３−４０１頁〕。３ つの系統のマウスは骨格筋の他は高レベルのトランス遺伝子を発現しない。この ことは、ｃ−ｓｋｉが骨格筋細胞に直接影響を及ぼすもので、改変された運動神 経機能の二次的結果としてではないという知見と一致する。大部分の骨格筋が包 含される。この表現型を有するマウスは拡大された前脚筋および顎筋の外観によ り容易に同定され得る（図７）。表現型は８つの別々の創成体で得られるから、 最も妥当な説明は表現型がニワトリｃ−ｓｋｉ　トランス遺伝子により引き起こ されるということである。それ故に、マウスの全４種の系、筋肉の発達した表現 型を有する３系および観察できる表現型を持たなかった１系が、トランス遺伝子 の発現のために試験された。

発現カセットもまた当業界で公知の標準法を用いてブタ受精卵内に導入された。

創成ブタは遺伝子の発現の予想された筋肉に特定した選択を示し、従って、当該 ブタが創成マウスにおいて見られたのと同様の筋肉表現型を有するであろうこと が予測される。

ＤＮＡ／ＲＮＡ分析 全体の細胞ＤＮＡおよびＲＮＡは標準法により単離された。ＲＮＡ単離のために 、組織を細かく切断し、ＲＮＡゾル（シナ・バイオテックス）中にホモジナイズ した後にすぐに液体窒素中で凍結させ、そして製造業者の推奨に従って処理した 。ノ・−ザン転写分析のために、異なる組織から全ＲＮＡ的２０μｇを、２．２ Ｍホルムアルデヒド含有１．５９６アガロースゲル上での電気泳動により分画し た。ＲＮＡをニトロセルロース膜に転写し、そしてニック翻訳されたニワトリ５ ｋｉｃＤＮＡまたはニワトリβ−アクチンｃＤＮＡのいずれかをプローブとして 検素した。β−アクチンｃＤＮＡのコード領域はその他の作用に対するメツセー ジと交差反応し、そしてほとんどの組織からのＲＮＡの定量および定性のために 使用され得る。

牌臓、肺、脳、腎臓、肝臓、胃、心臓および脚（骨格）筋からの全ＲＮＡが上記 のように単離され、そして結果が図８に示されている。表現型を有する３種の全 ての系（ＴＧ８５６６、ＴＧ８８２１およびＴＧ８５６２）は骨格筋において高 レベルに２．５ｋｂニワトリｃ−ｓｋｉ特定転写物を発現したが、いくつかの系 のマウスはその他の組織において低レベルのニワトリｃ−ｓｋｉ　ＲＮ　Ａを示 した。Ｔ０８５６２系は、骨格筋中に比べ低いけれども、心臓中にトランス遺伝 子からのＲＮＡを有する。ＴＯ８５６２マウスからの心臓の組織病理学は、該組 織への重要な影響がないことを示した。あらゆる表現型を示していないＴＧ８５ ４２系は、表現型を示した系に比べ、筋肉においてトランス遺伝子からのより低 いレベルのＲＮＡを有していた。ＭＳＶ　ＬＴＲはその他の遺伝子に連結された 場合に種々の組織において発現されることが示されているので（Ｋｈｉｌｌａｎ 等、　１９８７．　Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ、　ｌ、　１３２７−１３３５　）　、 発現が筋肉に制限されたという観察は予期されなかった。

ｓｋｉ　）ランス遺伝子を発現する組織において転写が適当な部位で開始された かどうかを決定するために、ＲＮアーゼ保護アッセイがＭｅｌｔＯｎにより記載 されたように行われた（Ｍｅｌｔｏｎ等、　１９８４．　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ ｓ　Ｒｅｓ、　１２　、７０３５−７０３６　）　、　Ｐｖｕ　ＩないしＢｇＬ 　Ｉの１，８ｋｂセグメントをブルースクリプトＫＳベクター中でサブクローン 化し、モしてＴ７プロモーターからの放射標識ＲＮＡを生成するために使用した 。全ＲＮＡ的１０μｇをプローブ５×１０’ｃｐｍとハイブリダイゼーションさ せた。ハイブリダイゼーションは８０％ホルムアミドおよび１倍緩衝液（５倍ハ イブリダイゼーション緩衝液は０．２ＭＰｉｐｅｓ、ｐＨ６，４，２Ｍ塩化ナト リウム、５ｍＭＥＤＴＡである）中５０℃で一晩行われた。ハイブリダイゼーシ ョンの後、試料をリボヌクレアーゼ消化緩衝液（１０ｍＭ）リスＣＩ、ｐＨ７， ５，０，８Ｍ塩化ナトリウム、５ｍＭ　ＥＤＴＡ）中に希釈し、モしてＲＮア− ゼＴ１とＩｕ／μ！の濃度で３０℃６０分間処理した。

２０％ＳＤＳ　１０μ！およびプロテイナーゼＫ（保存液１０ｍｇ／ｍＡ）４　 μｍ！の添加および３７℃で１５分間の保温によりＲＮアーゼ消化を停止させた 。消化試料をフェノール−クロロホルム（１：１混合液）で抽出し、担体ｔＲＮ Ａとエタノール沈殿させた。ベレットを７０％エタノールで１回すすぎ、乾燥さ せ、そしてブロモフェノールブルーおよびキシレンシアツール染料を含有するホ ルムアミド中に溶解させた。試料を１００℃で変性させ、そして７．５Ｍ尿素含 有の６％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。

均一に標識されたアンチセンスＲＮＡがＭＳＶ　Ｌ、ＴＲとｃ−ｓｋｉに及ぶフ ラグメントからのＴ７　ＲＮＡポリメラーゼにより製造された（図９参照）。３ 種の陽性トランスジェニック系からのＲＮＡを用いると、約９８０塩基の保護フ ラグメントが見られるが、これは転写がＭＳＶ　ＬＴＲ内の実際の開始部位で開 始される場合に予想される大きさである（図９参照）。この分析はまた、表現型 陽性および表現型陰性のマウス系の両方の心筋および骨格筋においてトランス遺 伝子ＲＮＡのレベルのより定量的な評価を与える。図９はＴＧ８８２１の心臓中 のトランス遺伝子ＲＮＡのレベルが骨格筋中に見いだされたレベルに比べより低 いことを示す（概算で１／１０ないし１／２０）。さらにこの分析は、表現型陰 性の系ＴＧ８５４２が低いが骨格筋中に検出可能なレベルのトランス遺伝子Ｒ， Ｎ　Ａを存することを示す。これらのデータは筋肉の発達した表現型がニワトリ ｃ−ｓｋｉ　）ランス遺伝子の発現と関連するだけでなく、筋肉表現型を製造す るために最低いき値レベルのｃ−ｓｋｉ　ＲＮ　Ａが達成されていなければなら ないことを示唆する。実際、これらのデータは、トランス遺伝子の効果を見るた めの最低いき値レベルは高く、おそらく被試験ニワトリ組織における内因性ｃ− ｓｋｉ発現（５ｕｔｒａｖｅおよびＨｕｇｈｅｓ、　１９８９．　Ｍｏ１．　Ｃ ｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　９．４０４６−４０５１　）の数千倍のレベルであるこ とを示唆する。

タンパク質分析 基礎にある仮定は、Ｃ−５ｋｉ　ＲＮ　Ａ発現が筋肉の発達した発現型を直接生 じるということではなく、むしろ該発現型がｃ−ｓｋｉタンパク質の存在のため であるということである。従って、ｃ−ｓｋｉタンパク質がウェスタン転写アッ セイにおいて観察された。ｃ−ｓｋｔの５０ｋｄ体を特異的に認識するウサギ抗 血清が調製されたけれども（Ｓｕｔｒａｖｅ等、　１９９０．　Ｍｏ１．　Ｃｅ １１．　Ｂｉｏｌ、　１０　、３１３７−３１４４　）、これらの抗血清はウェ スタン転写アッセイにおいて十分に作用しない。ｃ−ｓｋｉを認識し、ウェスタ ン転写アッセイにおいて十分に作用するマウスモノクローナル抗体が開発された が、これらの試薬の使用は技術的問題を提示する。これらのモノクローナル抗体 は直接標識を可能にする十分量利用できなかった。例えば標識ウサギ抗マウスを 用いる間接標準法は、抗ｓｋｉモノクローナルだけでなく、内因性マウス重鎮を も検出し、これはトランス遺伝子から製造されたｃ−ｓｋｉの５０ｋｄ体と一緒 に移動する。この問題を解決するために、通常対照およびトランスジェニックマ ウスからの筋肉および対照組織（肝臓）の抽出物が調製された。内因性マウス抗 体は下記のようにウサギ抗マウス抗体との沈殿によりこれらの抽出物から除去さ れた。

トランスジェニックおよび対照マウスからの組織中のｓｋｉタンパク質の検出の ために、組織１−５ｍｇをＲＩＰＡ緩衝液１ｍｆ、２０ｍＭ）リスＣｌｐＨ７， ５，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．５％ＳＤＳ、、０．５％ＮＰ４０．０．５％デ オキシコール酸ナトリウム、１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭ　ＰＭＳＦおよび３５μ／ ｍｉ！アブロテイニン中にホモジナイズした。ホモジネートを１１０００Ｏｒｐ で１０分間の遠心分離により清澄化した。１ｍｇ／ｍｉウサギ抗マウスｌ　ｇＧ 　（ＰＢＳ中）１０μｉ’との氷上で２時間の保温により、マウスＩｇＧが上澄 み１００μｌから除去された。複合体がＲＩＰＡ緩衝液中の４０％プロティンＡ セファロースビーズ１００μｌを添加することにより除去された。生成する上澄 みが集められ、そして２０μ！が１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で分画 された。タンパク質を、０．１２５ＭトリスＣ１，０，０９２Ｍグリシンおよび ２０％メタノール、ｐＨ８，３含有の緩衝液中で一晩ニトロセルロース展に転写 した。ＴＢＳ緩衝液（０，５Ｍ）リスＣ１，ｐＨ７，４および０．２Ｍ塩化ナト リウム）中の４％乾燥脱脂乳を用いて室温で２時間フィルターをブロックし、そ して３種の抗ｓｋｉモノクローナル抗体の混合物とに３０００の希釈で２時間室 温で保温し、次いでＴＢＳで３回洗浄した。ウサギ抗マウスＩｇＧとの２回目の 保温は室温で２時間行われた（　１　ｍ　ｇ　／　ｍ　１貯蔵液から１＝２００ ０希釈）。フィルターを上記のように洗浄し、そして最後に目５ＩプロティンＡ （アマルシャム、比活性３０ｍＣｉ／ｍｇ）５　μＣｉと室温で２時間保温した 。

フィルターをＴＢＳで３回洗浄し、そしてＭＡＲコダックフィルムに一７０℃で ６日間暴露した。

トランスジェニック動物からの作用を受けた組織（骨格筋）だけが５０ｋｄのｃ −ｓｋｉタンパク質を含有する（図１０）。これらのデータはまた、３種の陽性 系の筋肉中のｃ−ｓｋｉタンパク質のレベルに違いがあり得るということを示唆 するが、この実験における操作の複雑さは定量的理解を不確かな問題にする。

組織学 組織学のために、ＴＧ８５６６系からの選択された筋肉が起始点および着生点で 付着したままであるように分離され、次に２％ホルムアルデヒド、２％グルタル アルデヒド中に固定された。固定された筋肉を筋膨大部の中央を正確に通って切 開し、そしてＪＢ４プラスチック（ポリサイエンセズ、ペンシルベニア州）中に 包埋した。

免疫細胞化学のために、組織を液体窒素中で冷却したイソペンタン中で急速冷凍 した。免疫化学染色のための操作はＮａｒｕｓａｗａ等に概略従った（（１９８ ７）、　Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉ。

１、１０４．４４７−４５９　）。

結果は、トランス遺伝子の発現がほとんどあり、そしてその作用は筋肉に制限さ れ、発現および作用が少なくともＴＧ８５６６系においては、特定の筋肉、明確 には特定の繊維型に限定されていることを示した。しかしながら、作用を受けた 繊維は同型の全てであるわけではない。

心筋は正常であり、そしてこれらの動物において内蔵の平滑筋の異常はなかった 。図１１ａおよびｌｌｂは成熟オス対照マウスとトランスジェニックマウスから の脚底筋の中央から正確に作成された横断切片を比較する。

対照の横断切片面積は２．７μ２であり、ＴＣ；８５６６マウスのそれは対照値 の２倍以上である９゜４μ２である。この増大した成長は一般化されている。横 断切片における匹敵する増大はＴＧ８５６６系のオスおよびメスのマウスを通じ てほぼ全ての軸性および虫垂筋に見られた。３種の筋肉だけ：舌、横隔膜および 脚底が正常であることが見いだされた。これらはトランスジェニックマウスにお いて対照マウスのものと同じ大きさである（図１２参照）。ＲＮＡはＴＧ８５６ ６マウスの横隔膜および脚底筋から単離された。ノーザン転写分析により、ニワ トリｃ−ｓｋｉ　ＲＮＡのレベルが同系からの作用を受けた筋肉に比べこれら２ つの表現型的に通常の筋肉においてより低いことが示される（図１３）。

最も明らかなその他の全体的な形態学的異常性は、トランスジェニック動物にほ ぼ全体的に脂肪がないのに対し、対照動物が実質量の皮下脂肪および腹膜組織内 脂肪を含むことである。このために、対照マウスとＴ０８５６６マウスには体重 の違いがほとんどない。骨格の異常性もあるニドランスジェニック動物の脛骨は 大きさが正常であるが、明らかに、前部脛骨と伸長ジギトラム筋の大きさ２倍以 上の増大に順応するための適応として、頭蓋骨のように湾曲している。

対照マウスにおける筋肉はある範囲の横断切片面積を有する繊維からなる。大き さの範囲はＴＧ８５６６マウスにおいて極めて増大されている（図１１および１ ２）。

全ての繊維が作用を受けているわけではない。肥大は選ばれた数の繊維に限定さ れている（図１１ｄ）。これらの繊維の肥大はＴＧ８５６６系における筋肉量の 増大を明らかに説明する。繊維数は個々の筋肉において顕著に増大しているとい う証拠はなかった。例えば、対照脚底における繊維数は９１２±１１１　（ｎ＝ ３）であり、ＴＧ８５６６では９９１±８７（ｎ＝３）である。同様に、ＴＧ８ ５６６マウスと対照マウスの伸長ジギトラム長筋内の繊維総数に違いは見られな かった。

繊維のどの型がＴＧ８５６Ｂ系において作用を受けているかを調べるために、ス ローミオシン重鎮（ＭＨＣ）（ＮＯＱ７　５　４Ｄ、Ｎａｒｕｓａｗａ等、１９ ８７．　Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　１０４．４４７−４５９　）　、全て のファストＭＨＣ（２Ｇ３゜Ｎａｒｕｓａｗａ等、１９８７．　Ｊ、　Ｃｅ１１ ．　Ｂｉｏｌ、１０４．　４４７−４５９　）　Ｉｔ型ファストＭＨＣ（Ｓ　Ｃ ７１１、５ｃｈｉａｆｆｉｎｏ等、１９８９゜Ｊ、　Ｍｕｓｃｌｅ　Ｒｅｓ、　 ａｎｄ　Ｃｅ１ｌ　Ｍｏｔｉｌ、　１０　、１９７−２０５　）およびｎｂ型フ ァストＭＨＣ（Ｂ　Ｐ　−Ｆ　３　、５ｃｈｉａｆｆｉｎｏ等。

１９８９、Ｊ、Ｍｕｓｃｌｅ　Ｒｅｓ、ａｎｄ　Ｃｅ１ｌ　Ｍｏｔｉｌ、１０　 、　１９７−２０５　）を特異的に認識する３種のモノクローナル抗体が使用さ れた。図１４はこれらの３種の抗体を有するロームボイドイスキャビテイス筋か らの切片の免疫蛍光染色を示す。

スロー繊維が増大している証拠は見られず（図１４ａ）、そしてＴＧ８５６６マ ウスからのロームボイドイスキャビテイス筋のスロー繊維の総数（１２０）は対 照マウスからのロームボイドイスキャビテイス筋に見いだされたスロー繊維の数 （１１７）に近似する。Ｉ［ａ型繊維の多くは肥大繊維間にあり、そしてそれら の近傍への広がりにより圧迫されるかのように、しばしば形が歪められている（ 図１４ｂ）。

小さいファストｌｌａ型繊維および全ての肥大繊維はモノクローナル抗体２Ｇ３ で染色され（ｒＥＩ１４ｃ）、全てが肥大繊維がファストであることを示す。ロ ームボイドイスキャビテイスにおいて、全てでないがほとんどの大きい繊維もま た、Ｉ［ｂＭＨＣに特異的であるモノクローナル抗体ＢＰ−Ｐ３で染色される（ 図１４ｄ）。脚底では、反応性に多くの相違があり、そして肥大繊維の５０％の みがＢＦ−Ｐ３で染色される。これらの結果は、ＴＧ８５６１３マウスにおける 繊維の肥大変形が少なくとも２つの型のファスト繊維を含むことを示す。これら の１つはｍｂ型である。排除により、われわれは他方が■。

繊維（５ｃｈｉａｆｆｉｎｏ等、　１９８９．　Ｊ、　Ｍｕｓｃｌｅ　Ｒｅｓ、 　ａｎｄ　ＣｅｌｌＭｏｔｉｌ、　１θ、　１９７−２０５；　Ｔｅｒｍｉｎ等 、　１９８９．　Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　９２　、４５３−４５７；　 Ｇｏｒｚａ、　１９９０．　Ｊ、　Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ、　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、 　３８．２５７−２６５　）であることを示唆する。

酸予備保温後の肥大繊維のアクトミオシンＡＴＰアーゼ組織化学的反応での染色 における相違、ミトコンドリア酵素活性のためのＤＰＮＨ染色およびＰＡＳ染色 の全てが１以上のファスト繊維型がこの系のトランスジェニックマウスにおいて 作用を受けるという結論を支持する。

これらの結果はまた、ｍｂおよびπＸ繊維の両方が肥大しているという解釈を支 持する。

偶発的壊死性および再生性繊維がＴ０８５６６マウスの筋肉の全てではないがい くつかに見いだされた。後ろ脚において、これらは前部脛骨筋に最も広範囲に存 在するように見え、それらはロームボイドイスキャビテイス、首の表面筋には決 して見いだされなかった。

＊　零　零　零　ネ　ネ 上記の全ての刊行物は引用によりそれら全体が本明細書に編入される。

以上、本発明は明確化および理解のためにある程度詳細に記載されてきたが、本 明細書の開示を読めば、当業者により、形態および詳細の種々の変化は本発明の 真の範囲および特許請求の範囲を離脱せずになされ得ることが理解されるであろ う。

し。

ＡＴＧ　ＴＡＣＡＡＧ　ＡＡＡ　ＧＡＣＡＡＴ　ＧＧＣＡＡＡ　ＧＡＣＣＣＡ　 ＧＣＣＷ　ＣＣＴ　ＧＴＡ　ＣＴＧ　ＣＡＴＭｅｔＴｙｒＬｙｓＬｙｓＡｓｐＡ ｓｎＧｌｙＬｙｓ＾５ｐＰｒｏＡｌａＧｌｕＰｒｏＶａｌＬｅｕＨ４ｓＣＴＧ　 ＣＣＣＣＣＶ　ＡＴＣＣＡＧ　ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＧＴＧ　ＡＴＧ　ＣＣＴ　Ｇ ＧＴ　ＣＣＣＴｒＣＴＴＣＡＴＧ　ＣＣＣ３９５Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｉ〕 ＠　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｍｅｔ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｐｒ ｏ　Ｐｈ＠Ｐｈｅ　Ｍｅｔ　oｒｏ　７６ ＡＴＣＴＣＣＴＧＣＴＴＣＧＴＧ　ＧＴＧ　ＧＧＴ　ＧＧＧ　（ａＡＡ　ＡＡＧ 　ＣＧＣＣＴＴ　ＴＧＣＴｒＧ　ＣＣＣＣＡＧ　ＡＴＣ１４X４ １１ｅ　Ｓ＠ｒ　Ｃｙｓ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｖａｔ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　 Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ@ｌｉｅ　１０９ ＣＴＧ　ＡＡＣＴＣＧ　ＧＴＧ　（７ＣＡＧＧ　ＩＩＪｃ　ＴＴＣＴＣＣＣＴＧ 　ＣＡＧ　ＣＡＧ　ＡＴＣＡＡＴ　ＴＣＧ　ＧＴＧＬｅｕ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｖ ａｌ　Ｌ＠ｕ　Ａｒｇ＾ｓｐ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｇｌｎ　ＩＩ ｓ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　ＶａｌＴＧＣＧＡＴ　ＣＡＧ　ＣＴＡ　ＣＡＣＡＴｒ　Ｔ ＡＣＴＧＣＴＣＣＡＧＡ　ＴＧＣＡＣＣＧＣＴ　（ａＡｃ　ＣＡＧ　ＣＴＧ　Ｇ ＡＧ　５X３ Ｃｙｓ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｈ４ｓ　ｌｉｅ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ＾ ｒｇ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ＾１昌＾ｓｐ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｇｌ普@！４２ ＦｊＧ、２ ＧＡＣＴＣＴＧＣＡ　ＡＡＣＴＧＩ：ｔ　ＡＧＧ　ＴＣＣＴＡＣＡＴＣＣＴＣＣ ＴＴ　ＡＧＣＣＡＧ　１．ＡＴ　ＴＡＣＡＣＴ　ＧＧＧ　９W９ Ａｓｐ　Ｓｅｒ＾ｌａ　Ａｓｎ　Ｔｒｐ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｘ１ｅ　Ｌ ｅｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　ＡＬＰ　ＴＦ　Ｔｈｒ　Ｇ撃凵@２７４ Ｎ） ミー ＦＩＧ、４Ａ ＦＩＧ、５ ＦＩＧ、　６ ＦＩＧ、７ ＴＧ　８５６６ ＦＩＧ、　８Ａ ＦＩＧ、８Ｂ ＦＩＧ、　９ Ｃｏｎすｒｏｌ　ＴＧ　８８２１ ＦＩＧ、１０ ＴＧ　８５６６ 月ｉｒ／ｊ ＦＩＧ、１３ ＦＩＧ、１４Ａ　ＦＩＧ、　１４Ｂ 補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）

Claims (32)

【特許請求の範囲】
1. １．ニワトリｃ−ｓｋｉタンパク質をコード化するＤＮＡセグメントまたは該Ｄ ＮＡセグメントに相補的なＤＮＡフラグメント。
2. ２．図１に記載されたエキソン６を含むＤＮＡセグメント。
3. ３．図１に記載されたエキソン７を含むＤＮＡセグメント。
4. ４．図１に記載されたエキソン１、エキソン２、エキソン３、エキソン４、エキ ソン５およびエキソン６からなる群から選択される少なくとも４つのエキソンを さらに含む請求項３記載のＤＮＡセグメント。
5. ５．ｉ）請求項１記載のＤＮＡセグメント、およびｉｉ）ベクター を含むＤＮＡ構築物。
6. ６．ベクターがｐＭＥＸｎｅｏである請求項５記載の構築物。
7. ７．ｉ）ｃ−ｓｋｉの機能を有する先端切除ｃ−ｓｋｉタンパク質をコード化す るＤＮＡセグメント、およびｉｉ）ベクター を含むＤＮＡ構築物。
8. ８．ＤＮＡセグメントがΔＦＢ２９である請求項７記載のＤＮＡ構築物。
9. ９．ベクターがｐＭＥＸｎｅｏである請求項７記載のＤＮＡ構築物。
10. １０．請求項５記載の構築物においてコード化された前記タンパク質の発現を可 能にする様式で、前記構築物で安定に形質転換された宿主細胞。
11. １１．請求項７記載の構築物においてコード化された前記タンパク質の発現を可 能にする様式で、前記構築物で安定に形質転換された宿主細胞。
12. １２．哺乳細胞である請求項１０または１１記載の宿主細胞。
13. １３．細胞の全てが、動物または該動物の子孫に導入された、ｓｋｉタンパク質 をコード化するＤＮＡセグメントおよびベクターからなるＤＮＡ構築物を含む、 筋肉の大きさが増大した動物。
14. １４．ｓｋｉタンパク質がｃ−ｓｋｉタンパク質である請求項１３記載の動物。
15. １５．タンパク質がニワトリｃ−ｓｋｉタンパク質である請求項１３記載の動物 。
16. １６．ベクターがｐＭＥＸｎｅｏである請求項１３記載の動物。
17. １７．家畜である請求項１３記載の動物。
18. １８．プタである請求項１７記載の動物。
19. １９．哺乳類である請求項１３記載の動物。
20. ２０．マウスである請求項１９記載の哺乳類。
21. ２１．細胞の全てが、動物または該動物の子孫に導入された、ｓｋｉの機能を有 する先端切除ｓｋｉタンパク質をコード化するＤＮＡセグメントおよびベクター からなるＤＮＡ構築物を含む、筋肉の大きさが増大した動物。
22. ２２．タンパク質がニワトリｃ−ｓｋｉタンパク質である請求項２１記載の動物 。
23. ２３．ＤＮＡセグメントがΔＦＢ２９である請求項２１記載の動物。
24. ２４．ＤＮＡセグメントがｖ−ｓｋｉタンパク質をコード化する請求項２１記載 の動物。
25. ２５．ベクターがｐＭＥＸｎｅｏである請求項２１記載の動物。
26. ２６．家畜である請求項２１記載の動物。
27. ２７．プタである請求項２６記載の動物。
28. ２８．哺乳類である請求項２１記載の動物。
29. ２９．マウスである請求項２８記載の哺乳類。
30. ３０．ｓｋｉタンパク質をコード化するＤＮＡセグメントおよびベクターからな るＤＮＡ構築物のタンパク質が発現されて、筋肉成長が誘導されるような条件下 で、前記ＤＮＡ構築物を筋肉に伝達することからなる、筋肉成長を刺激するか、 または筋肉変性を防止する方法。
31. ３１．ｓｋｉタンパク質をコード化するＤＮＡセグメントおよびベクターからな るＤＮＡ構築物のタンパク質が発現されて、治療が達成されるような条件下で、 前記ＤＮＡ構築物を影響を受けた筋肉に伝達することからなる、筋肉変性疾病を 治療する方法。
32. ３２．筋肉変性疾病が筋ジストロフィーまたは筋萎縮性側索硬化症である請求項 ３１記載の方法。