ES2245485T3

ES2245485T3 - Fosfodiesterasa 8.

Info

Publication number: ES2245485T3
Application number: ES98953651T
Authority: ES
Inventors: Kate Loughney
Original assignee: Icos Corp
Current assignee: Icos Corp
Priority date: 1997-10-16
Filing date: 1998-10-16
Publication date: 2006-01-01
Anticipated expiration: 2018-10-16
Also published as: EP1571216A2; WO1999019495A1; EP0944725A1; AU1097499A; CN1800399A; RU2005136013A; RU2272841C2; US6133007A; IL175698A0; DE69830143D1; EP1571216A3; CN1229499C; ATE295423T1; DE69830143T2; NO992916L; BR9806318A; CN1248291A; US20030215919A1; EP0944725B1; JP2001512327A

Abstract

LA PRESENTE INVENCION PROPORCIONAL POLIPEPTIDOS PDE8, POLINUCLEOTIDOS QUE CODIFICAN LOS POLIPEPTIDOS, CONSTRUCCIONES DE EXPRESION QUE COMPRENDEN LOS POLINUCLEOTIDOS, CELULAS HUESPEDES TRANSFORMADAS CON LAS CONSTRUCCIONES DE EXPRESION; PROCEDIMIENTOS PARA PRODUCIR POLIPEPTIDOS PDE8, POLINUCLEOTIDOS ANTISENTIDO, Y ANTICUERPOS ESPECIFICAMENTE INMUNORREACTIVOS CON LOS POLIPEPTIDOS PDE8.

Description

Fosfodiesterasa 8.

La presente invención se refiere en general a una familia de fosfodiesterasas designadas PDE8 y a las utilizaciones de la misma.

Las fosfodiesterasas (PDEs) hidrolizan nucleótidos cíclicos 3', 5', para obtener sus monofosfatos nucleósido 5 respectivos. Los nucleótidos cíclicos cAMP y cGMP son sintetizados por adenilil y guanilil ciclasas, respectivamente, y sirven de segundos mensajeros en cierto número de rutas de señalización celular. La duración y fuerza de la señal del segundo mensajero es función de la velocidad de la síntesis y de la hidrólisis del nucleótido cíclico.

Se han identificado varias familias de PDEs. El sistema de nomenclatura incluye primero un número que indica la familia PDE. Hasta la fecha se conocen siete familias (PDE1-7), que se clasifican según: (i) estructura primaria; (ii) preferencia de substrato; (iii) respuesta a moduladores diferentes; (iv) sensibilidad a inhibidores específicos; y (v) modos de regulación [Loughney and Ferguson, en Phosphodiesterase Inhibitors, (Inhibidores de la fosfodiesterasa), Schudt, et al. (Eds.) Academic Press: Nueva York, Nueva York (1996) páginas 1-19]. El número que indica la familia va seguido de una letra mayúscula que indica un gen diferente, y la letra mayúscula seguida de un segundo número que indica un empalme específico o una transcripción específica que utiliza un sitio de iniciación de transcripción
único.

Las secuencias de aminoácido de todos los PDEs de mamífero identificados hasta la fecha incluyen una región altamente conservada de aproximadamente 270 aminoácidos, situados en la mitad terminal carboxi de la proteína [Charbonneau, et al. Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 83:9308-9312 (1986)]. El dominio conservado incluye el sitio catalítico para hidrólisis de cAMP y/o cGMP y dos sitios de fijación de zinc putativos así como determinantes específicos de la familia [Beavo, Physiol. Rev. 75:725-748 (1995); Francis et al. J. Biol. Chem. 269:22477-22480 (1994)]. Las regiones terminales amino de los diversos PDEs son altamente variables y comprenden otros determinantes específicos de familia como: (i) sitios de fijación de calmodulina (PDE1); (ii) sitios de fijación de GMP cíclico no catalítico (PDE2, PDE5, PDE6); (iii) sitios de referencia (targeting) de membrana (PDE4); (iv) sitios de asociación de membrana hidrófoba (PDE3); y (v) sitios de fosforilación para la quinasa II calmodulin-dependiente (PDE1), la quinasa cAMP-dependiente (PDE1, PDE3, PDE4), o la quinasa cGMP dependiente (PDE5) [Beavo, Physiol. Rev. 75:725-748 (1995); Manganiello, et al., Arch. Biochem. Acta 322:1-13 (1995); Conti, et al., Physiol. Rev. 75:725-748
(1995).

Los miembros de la familia PDE1 son activados por calcio-calmodulina. Se han identificado tres genes: PDE1A y PDE1B hidrolizan de preferencia cGMP mientras que PDE1C presenta, según se ha visto, una alta afinidad tanto por cAMP como por cGMP. La familia de PDE2 se caracteriza porque es estimulada específicamente por cGMP [Loughney and Ferguson, supra]. Se ha identificado únicamente un gen PDE2A, cuyo producto enzimático es inhibido específicamente por eritro-9-(2-hidroxi-3-nonil) adenina (EHNA). Las enzimas en la familia PDE3 son inhibidas específicamente por cGMP. Se conocen dos genes PDE3A y PDE3B que tienen ambos una afinidad elevada por cAMP y cGMP, aunque el V_{max} para la hidrólisis de cGMP es suficientemente reducido para que cGMP funcione como un inhibidor competitivo para la hidrólisis de cAMP. Las enzimas de PDE3 son inhibidas específicamente por milrinona y enoximona [Loughney and Ferguson, supra]. La familia PDE4 realiza la hidrólisis de cAMP e incluye 4 genes, PDE4A, PDE4B, PDE4C y PDE4D, cada uno de los cuales tienen múltiples empalmes. Los miembros de esta familia son inhibidos específicamente por el fármaco antidepresor rolipram. Los miembros de la familia de PDE5 fijan cGMP en sitios no catalíticos e hidrolizan de preferencia cGMP. Únicamente se ha identificado un gen, PDE5A. Las enzimas PDE6 foto-receptoras hidrolizan específicamente cGMP [Loughney and Ferguson, supra]. Como genes se pueden citar PDE6A y PDE6B (cuyos productos proteínicos dimerizan y fijan dos copias de una subunidad inhibitoria \gamma más pequeña para formar PDE bastón (varilla) además de PDE6 que se asocia con tres proteínas más pequeñas para formar PDE cono. La familia PDE7 realiza la hidrólisis de cAMP pero, en contraste con la familia de PDE4, no es inhibida por rolipram [Loughney and Ferguson, supra]. Únicamente se ha identificado un gen
PDE7A.

Dada la importancia de cAMP y cGMP en la señalización intracelular del segundo mensajero, existe por lo tanto la necesidad permanente, en el estado de la técnica, de identificar especies PDE de adición. La identificación de familias de PDEs desconocidas hasta la fecha y de genes y empalmes de los mismos ofrecerá enfoques farmacológicos adicionales para el tratamiento de estados en los cuales las rutas de nucleótido cíclico son aberrantes así como estados en los cuales es deseable la modulación de niveles de cAMP intracelulares y/o cGMP en ciertos tipos de
células.

En suma, la presente invención se refiere a polipéptidos y polinucleótidos subyacentes para una nueva familia de PDE designada PDE8. Según la presente invención, se presenta un polipéptido PDE8 que comprende la secuencia de aminoácido indicada en SEQ ID NO: 2; un polipéptido PDE8 que comprende la secuencia de aminoácido indicada en SEQ ID NO: 4; un polipéptido PDE8 que comprende la secuencia de aminoácido indicada en SEQ ID NO: 6 y polinucleótidos que codifican estos polipéptidos. La invención comprende tanto los polinucleótidos PDE8 como los productos polipeptídicos de los mismos que se producen de forma natural y no natural. Los productos PDE8 que se producen de forma natural comprenden especies de polipéptido y gen diferentes dentro de la familia PDE8 (es decir PDE8A); estas especies comprenden aquellos expresados dentro de células del mismo animal así como homólogos de especies correspondientes expresados en células de otros animales. Dentro de cada especie de PDE8, la invención describe además empalmes codificados por el mismo polinucleótido pero que proceden de transcripciones diferentes de mRNA (es decir, PDE8A1 y PDE8A2). Los productos PDE8 que se producen de forma no natural comprenden variantes de los productos que se producen de forma natural, como análogos (es decir donde se añaden, se sustituyen o se eliminan uno o más aminoácidos) y aquellos productos PDE8 que comprenden modificaciones covalentes (es decir proteínas de fusión, variantes de glicosilación, Met^{-1}PDE8s, Met^{-2}-Lys^{-1}- PDE8s, Gly^{1}- PDE8s y similares). La familia PDE8 se distingue de las familias PDE conocidas con anterioridad por el hecho de que presentan una elevada afinidad por la hidrólisis de cAMP y cGMP aunque una sensibilidad relativamente baja a inhibidores enzimáticos específicos de otras familias PDE. En una realización preferida, la invención presenta un polinucleótido que comprende la secuencia indicada en SEQ ID NO: 1. La invención también comprende polinucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 2. Un polipéptido actualmente preferido de la invención comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 2. La invención describe dos empalmes cADNs que dan origen a dos polipéptidos designados PDE8A1 y PDE8A2. Los polipéptidos PDE8A1 y PDE8A2 y los polinucleótidos que codifican los polipéptidos se tratan aquí como representativos de la familia enzimática PDE8 contemplada por la invención.

La presente invención describe polinucleótidos aislados y purificados nuevos (por ejemplo secuencias ADN y transcripciones ARN, ambos sentidos y cadenas antisentido complementarias, inclusive empalmes de los mismos) que codifican los PDE8s humanos. Las secuencias de ADN de la invención incluyen secuencias genómicas y de cADN así como secuencias ADN total o parcialmente sintetizadas químicamente. El término "sintetizado" tal como se utiliza aquí y se entiende en el estado de la técnica, se refiere a métodos puramente químicos, en oposición a metidos enzimáticos para la producción de polinucleótidos. Por consiguiente, las secuencias ADN "enteramente" sintetizadas son producidas por lo tanto enteramente por medios químicos, y los ADNs parcialmente "sintetizados" abarcan aquellos en los que únicamente se producen por medios químicos partes del ADN resultante. En la SEQ ID NO: 1 se indica una secuencia ADN preferida que codifica un polipéptido PDE8 humano. La invención ofrece polinucleótidos que codifican el polipéptido PDE8 de la SEQ ID NO: 2 y los polipéptidos de empalme PDE8A1 y PDE8A2 indicados en la SEQ ID NO: 6 y 4, respectivamente. Los polinucleótidos preferidos que codifican PDE8A1 y PDE8A2 se indican en la SEQ ID NO: 5 y 3 respectivamente. La invención contempla además especies, de preferencia mamíferos, homólogos del ADN PDE8 humano.

La invención también contempla secuencias de ADN que codifican especies de PDE8 que hibridan en condiciones moderadamente rigurosas para las cadenas no codificadoras, o complementos de los polinucleótidos en la SEQ ID NO: 1, 3 y 5. También se contemplan secuencias de ADN que codifican polipéptidos PDE8A que podrían hibridar aunque para redundancia del código genético. Como ejemplos de condición de hibridación moderada se pueden citar las siguientes: hibridación a 65°C en 3X SSC, 0,1% sarcosil y 20 mM de fosfato sódico, pH 6,8 y lavado a 65°C en 2X SSC con 0,1% SDS. Se entiende en el estado de la técnica que se pueden conseguir condiciones de rigurosidad equivalente haciendo variar la temperatura y el tampón o la concentración salina tal como describe Ausebel, et al. (Eds). Protocols in Molecular Biology (Protocolos de biología Molecular) John Wiley & Sons (1994), páginas 6.0.3 a 6.4.10. Las modificaciones en las condiciones de hibridación se pueden determinar empíricamente o calcularse de forma precisa tomando como base la longitud y el porcentaje de emparejamiento de base guanosina/citosina (GC) de la sonda. Las condiciones de hibridación se pueden calcular según lo descrito en Sambrook, et al., (Eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Clonación Molecular. Manual de Laboratorios), Cold Spring Harbor Laboratory Press: cold Spring Harbor, Nueva York (1989), páginas 9.47 a 9.51.

Según la presente invención, se presenta un constructo de expresión que comprende un polinucleótido de la invención. En particular, se describen construcciones de expresión recombinante de replicación autónoma como vectores ADN plásmido y viral que incorporan secuencias PDE8. Se describen también constructos de expresión en los cuales unos polinucleótidos de codificación de PDE8 están operativamente ligados con una secuencia ADN de control de expresión endógena o exógena y un terminador de transcripción.

Según otro aspecto de la invención, se presentan células anfitrionas transformadas o transfectadas con un polinucleótido o constructo de expresión de la invención. En particular se transforman de forma estable o transitoria células anfitrionas que incluyen células procarióticas y eucarióticas, con secuencias ADN de la invención de una forma que permite la expresión de polipéptidos PDE8 de la invención. Las células anfitrionas de la invención son fuentes valiosas de inmunógeno para el desarrollo de anticuerpos específicamente inmunoreactivos con PDE8. Las células anfitrionas de la invención también resultan notablemente útiles en métodos para la producción a gran escala de polipéptidos PDE8 donde las células son cultivadas en un medio de cultivo adecuado y los productos polipéptidos deseados se aíslan de las células o del medio en el que se cultivan las células, por ejemplo, por purificación por
inmunoafinidad.

Según otro aspecto de la invención, se presenta un método para la producción de un polipéptido PDE8 que comprende las siguientes etapas: a) cultivo de una célula anfitriona de la invención en condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido PDE8 y aislamiento del polipéptido PDE8 de la célula anfitriona o del medio en el que se cultiva.

El conocimiento de la secuencias ADN PDE8 permite modificar células para conseguir o incrementar la expresión de PDE8 endógeno. Se pueden modificar células (por ejemplo por recombinación homóloga) para obtener una mayor expresión de PDE8 sustituyendo, total o parcialmente, el promotor PDE8 que se produce de forma natural por la totalidad o parte de un promotor heterólogo de forma que las células expresen PDE8 a niveles más elevados. El promotor heterólogo se inserta de modo que está ligado operativamente con secuencias de codificación de PDE8. Véase por ejemplo, Publicación Internacional PCT WO 94/12650, Publicación Internacional PCT WO 92/20808 y Publicación Internacional WO 91/09955. La invención también contempla que, además del ADN promotor heterólogo, se pueda insertar junto con el ADN promotor heterólogo ADN marcador amplificable (por ejemplo ada, dhfr, y el gen multifuncional CAD que codifica la carbamil fosfato sintasa, asparto transcarbamilasa y dihidroorotasa) y/o ADN intron. Si se liga a la secuencia de codificación de PDE8, la amplificación del ADN marcador por métodos de selección standard da como resultado una co-amplificación de las secuencias de codificación de PDE8 en las
células.

La información de la secuencia ADN ofrecida por la presente invención también permite el desarrollo, por ejemplo por estrategias de recombinación homóloga o "knock-out" [Capecchi, Science 244:1288-1292 (1989)], de animales que no expresan PDE8 funcional o que expresan una variante de PDE8. Estos animales resultan útiles como modelos para estudiar las actividades in vivo de PDE8 y moduladores de PDE8.

La invención también se refiere a polipéptidos de PDE8 de mamífero, purificados y aislados. Los polipéptidos PDE8A actualmente preferidos se indican en la SEQ ID NO: 4 y 6. Todavía se prefiere más un polipéptido PDE8 que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID NO:2. Los polipéptidos PDE8 de la invención se pueden aislar de fuentes celulares naturales o pueden sintetizarse químicamente, pero se producen de preferencia por procedimientos recombinantes que involucran células anfitrionas de la invención. Se espera que la utilización de células anfitrionas de mamífero proporcione modificaciones post-translacionales (por ejemplo glicosilación, truncación, lipidación y fosforilación) que se pueden necesitar para conferir actividad biológica óptima a productos de expresión recombínate de la invención. Los productos PDE8 de la invención pueden ser polipéptidos de longitud normal, fragmentos biológicamente activos o variantes de los mismos que mantienen actividad biológica específica PDE8. Las variantes pueden comprender análogos de polipéptido PDE8, donde uno o más de los aminoácidos especificados (es decir codificados naturalmente) es borrado o sustituido o donde se añade uno o más aminoácidos no especificados: (1) sin pérdida de una o más de las actividades biológicas o características inmunológicas específicas de PDE8; o (2) con incapacidad específica de una actividad biológica particular de PDE8.

Como productos variantes se pueden citar productos PDE8A maduros, es decir productos PDE8 en los que se quitan las secuencias líder o de señal, que tienen residuos amino terminales adicionales. Se contemplan productos PDE8 que tienen un residuo de metionina adicional en posición -1 (Met^{-1}-PDE8), como por ejemplos productos PDE8 que tienen residuos de lisina y de metionina adicional en las posiciones -2 y -1 (Met^{-1} - Lys^{-1} - PDE8). Las variantes de estos tipos resultan particularmente útiles para la producción de proteínas recombinantes en tipos de células
bacterianas.

La invención también contempla variantes de PDE8 que tienen residuos aminoácidos adicionales derivados del uso de sistemas de expresión específicos. Por ejemplo, la utilización de vectores disponibles en el comercio que expresan un polipéptido deseado como un producto de fusión de glutationa-S-transferasa (GST) ofrecen el polipéptido deseado que tiene un residuo de glicina adicional en la posición -1 como resultado de segmentación del componente GST del polipéptido deseado. También se contemplan variantes que resultan de la expresión en otros sistemas de
vectores.

La invención contempla productos PDE8 modificados que incluyen uno o más anclajes polímeros solubles en agua. Particularmente preferidos son los productos PDE8 modificados covalentemente con subunidades de polietilen glicol (PEG). Los polímeros solubles en agua se pueden unir en posiciones específicas, por ejemplo en el término amino de los productos PDE8, o anclarse aleatoriamente a una o más cadenas laterales del polipéptido.

La presente invención contempla también los anticuerpos (por ejemplo anticuerpos monoclonales y policlonales, anticuerpos de cadena simple, anticuerpos híbridos, anticuerpos con injerto CDR y similares) y otras proteínas de enlace específicas de productos PDE8 o de fragmentos de los mismos. Se pueden desarrollar proteínas de enlace específico utilizando productos PDE8 aislados o recombinantes, variantes de PDE8 o células que expresan dichos productos. Las proteínas de enlace resultan útiles para purificar productos PDE8 y detectar o cuantificar productos PDE8 en muestras de fluido y de tejido que utilizan procedimientos inmunológicos conocidos. Las proteínas de enlace resultan también manifiestamente útiles en la modulación (es decir, bloqueo, inhibición o estimulación) de actividades biológicas de PDE8, especialmente aquellas actividades que intervienen en la transducción de señales. También se contemplan anticuerpos anti-idiotípicos específicos de anticuerpos anti-PDE8 como por ejemplo hibridomas que se secretan anticuerpos anti-PDE8 de la invención.

El valor científico de la información aportada por las descripciones de secuencias de ADN y aminoácidos de la presente invención resulta evidente. En una serie de ejemplos, el conocimiento de la secuencia de un cADN para PDE8A permite, mediante la utilización de hibridación Southern o reacción de cadena polimerasa (PCR) la identificación de secuencias de ADN genómico que codifican PDE8 y secuencias reguladoras de control de expresión de PDE8 tales como promotores, operadores, potenciadores, represores y similares. Los procedimientos de hibridación de ADN/ADN realizados con secuencias ADN de la invención en condiciones moderadamente a altamente rigurosas permitirán, según se espera, con toda probabilidad, el aislamiento de variantes alélicos de PDE8A que codifican ADNs; en el estado de la técnica se conocen variantes alélicos que incluyen proteínas estructuralmente relacionadas que comparten una o más de las propiedades bioquímicas y/o inmunológicas específicas de PDE8A. De forma similar, también se pueden identificar proteínas de codificación de genes de especies no humanas, homólogas a PDE8A mediante análisis Southern y/o PCR. Como alternativa, los estudios de complementación pueden resultar útiles para identificar otros productos PDE8 humanos así como proteínas no humanas y ADNs que codifican las proteínas, y comparten una o más propiedades biológicas de PDE8A.

Los polinucleótidos de la invención resultan también útiles en los ensayos de hibridación para detectar la capacidad de las células para expresar PDE8. Los polinucleótidos de la invención también pueden constituir la base para métodos diagnósticos útiles para la identificación de una o varias alteraciones genéticas en un locus PDE8 sujeto a estado o estados patológicos.

La invención también presenta polinucleótidos antisentido que reconocen e hibridan polinucleótidos de codificación de PDE8. Se presentan polinucleótidos anti sentido en fragmento y longitud normal. Los polinucleótidos anti-sentido resultan particularmente relevantes para regular la expresión de PDE8 por medio de las células que expresan PDE8 mARN.

La información sobre secuencia de aminoácidos y ADN facilitados por la presente invención permite también el análisis sistemático de la estructura de PDE8s. La información de la secuencia de aminoácidos y ADN para PDE8 permite también la identificación de moléculas con las que interactúa PDE8A. Los agentes que modulan (es decir, aumentan, reducen o bloquean) la actividad de PDE8 se pueden identificar incubando un modulador putativo con PDE8 y determinando el efecto del modulador putativo en la actividad de fosfodiesterasa de PDE8. La selectividad de un compuesto que modula actividad del PDE8 se puede evaluar comparando su actividad en el PDE8 con su actividad en otras enzimas PDE. Se contemplan análisis de soluciones y métodos de base celular como análisis di-híbridos y análisis híbridos divididos, así como métodos in vitro, inclusive análisis en los cuales se inmoviliza un polipéptido o su elemento de enlace.

Los modulares selectivos pueden incluir por ejemplo anticuerpos y otras proteínas o péptidas que interaccionan específicamente con el PDE8 o el ácido nucléico del PDE8, oligonucleótidos que interactúan específicamente con PDE8 o ácido nucléico de PDE8 y otros compuestos no peptídicos (por ejemplo moléculas orgánicas aisladas o sintéticas) que reaccionan específicamente con PDE8 o ácido nucléico de codificación de PDE8. También se contemplan formas mutantes de PDE8 que afectan la actividad enzimática o la localización celular del PDE8 natural. Los blancos actualmente preferidos para el desarrollo de moduladores selectivos incluyen por ejemplo (1) regiones del PDE8 que están en contacto con otras proteínas y/o localizan el PDE8 dentro de una célula, (2) regiones del PDE8 que fijan substrato (3) sitio(s) de fijación de nucleótido cíclicos alostéricos de PDE8 (4) sitio(s) de fosforilación de PDE8 y (5) regiones del PDE8 involucradas en la multimerización de subunidades de PDE8. Los moduladores de la actividad de PDE8 pueden ser terapéuticamente útiles en el tratamiento de una amplia gama de patologías y estados fisiológicos en los cuales se sabe que actúa PDE.

La invención contempla además moduladores de molécula pequeña de la actividad enzimática de PDE8A. Existen por lo menos tres tipos diferentes de bibliotecas utilizados para la identificación de moduladores de molécula pequeña. Estos incluyen: (1) bibliotecas químicas, (2) bibliotecas de productos naturales, y (3) bibliotecas combinatorias que comprenden péptidos aleatorios, oligonucleótidos o moléculas orgánicas.

Las bibliotecas químicas están constituidas por análogos estructurales de compuestos conocidos o compuestos identificados como "hits" o "leads" por medio de examen del producto natural (screening). Las bibliotecas de productos naturales son colecciones de microorganismos, animales, plantas u organismos marinos que se utilizan para crear mezclas para selección (screening) por: (1) fermentación y extracción de caldos de microorganismos del suelo, vegetales o marinos o (2) extracción de plantas u organismos marinos. Las bibliotecas combinatorias constan de grandes números de péptidos, oligonucleótidos o compuestos organismos en forma de mezcla. Resultan relativamente fáciles de preparar con métodos de síntesis automática tradicional, PCR, clonación o métodos sintéticos protegidos por patentes. Presentan un interés particular las bibliotecas combinatorias de péptidos y oligonucleótidos. Otras bibliotecas de interés incluyen péptidos, proteínas, colecciones peptido miméticas, multiparalelas sinteticas, bibliotecas recombinatorias y polipéptidas. Para ver una panorámica de la química combinatoria y las bibliotecas creadas a partir de la misma, véase Myers, Curr. Opion. Biotechnol. 8:701-707 (1997).

La identificación de moduladores utilizando las diversas bibliotecas descritas aquí permite modificar el "hit" (o "lead") para optimizar la cantidad del "hit" para modular la actividad.

La invención ofrece además métodos para identificar un compuesto, elemento de fijación específico de un polipéptido de PDE8 de la invención que comprende las siguientes etapas: a) poner en contacto un polipéptido de PDE8 de la invención con un compuesto en condiciones que permitan la fijación entre el compuesto y el polipéptido de PDE8; b) detectar la fijación del compuesto al polipéptido de PDE8, y c) identificar el compuesto como elemento de fijación específica del polipéptido de PDE8. Los elementos de fijación identificados en los métodos de la invención modulan de preferencia la actividad enzimática de PDE8 ya sea por medio de inhibición o activación, o potenciación de la enzima.

La invención también presenta métodos para identificar un compuesto elemento de fijación específico de un polinucleótido de PDE8 de la invención que constan de las siguientes etapas: a) poner en contacto un polinucleótido de PDE8 de la invención con un compuesto en condiciones que permitan la fijación entre el compuesto y el polinucleótido de PDE8; b) detectar la fijación del compuesto en el polinucleótido de PDE8; y c) identificar el compuesto como elemento de fijación específico del polinucleótido de PDE8. El elemento de fijación del polinucleótido de PDE8 modula de preferencia la expresión de polipéptido de PDE8 codificado por el polinucleótido de PDE8, ya sea inhibiendo la expresión o potenciando la misma.

La invención también describe compuestos identificados por un método de la invención así como composiciones que comprenden un compuesto identificado y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La presente invención se ilustra con los siguientes ejemplos que se refieren al aislamiento de polinucleótidos que codifican polipéptidos de PDE8 así como a la expresión y la caracterización de los polipéptidos codificados. El ejemplo 1 describe métodos para buscar bases de datos de rótulo de secuencia expresada (EST) con el objeto de identificar sondas potencialmente útiles para aislar ADNs de la invención. El ejemplo 2 se refiere a la identificación de polinucleótidos que codifican PDE8A. El ejemplo 3 contempla el análisis de secuencia de los polinucleótidos aislados. El ejemplo 4 describe el análisis de polipéptidos codificados por los polinucleótidos de PDE8A. El ejemplo 5 contempla la expresión de polipéptidos de PDE8A recombinante. El ejemplo 6 se refiere al análisis Northern de expresión de PDE8A. El ejemplo 7 describe la cartografía cromosómica del gen de codificación de PDE8A. El ejemplo 8 describe la confirmación de que PDE8A1 y PDE8A2 son enlaces. El ejemplo 9 contempla la expresión y la caracterización de PDE8A recombinante. El ejemplo 10 detalla la producción de anticuerpos monoclonales anti-PDE8A. El ejemplo 11 describe un análisis de expresión de PDE8A por hibridación in situ.

Ejemplo 1 Identificación de un EST relacionado con un PDE humano

Utilizando las secuencias de fosfodiesterasas núcleotido cíclico 3', 5' humanas se realizó un estudio de la base de datos del National Center for Biotechnology Information (NCBI) Expressed Sequence Tags (EST) con el objeto de identificar fragmentos de cADN que pudieran ser potencialmente útiles para la identificación de genes de fosfodiesterasa (PDE) nuevos. Esta base de datos contiene secuencias de ADN que representan uno o ambos extremos de cADNs recogidos entre una variedad de fuentes de tejidos. Se realizó una serie (run) de secuencia única en uno o ambos extremos del cADN y la calidad de la secuencia ADN varia enormemente. En el momento en que los estudios de PDE fueron realizados, la base de datos de secuencia EST contenía más de 600.000 secuencias de cADN de toda una serie de organismos.

La búsqueda de nuevas secuencias PDE comprendía tres etapas. En primer lugar se utilizó el programa BLASTN puesto a disposición por NCBI para identificar secuencias ADN en la base de datos de secuencias EST que presentaran homologías con las secuencias cADN codificadoras de PDEs humanas conocidas. El programa compara una secuencia de consulta de nucleótido (query) con una base de datos de secuencia de nucleótido. Se obtuvieron las secuencias cADN de quince PDEs humanas conocidas y se realizaron quince búsquedas BLASTN; las secuencias PDE de consulta incluían PDE1A3 [Loughney, et al., J. Biol. Chem. 271: 796-806(1996)], PDE1B1 [Yu, et al., Cell Signaling, in press (1997)], PDE1C2 [Loughney, et al., J. Biol. Chem. 271: 796-806-(1996)], PDE2A3 [Rosman, et al., Gene 191:85-95 (1997)] PDE3A [Meacci, et al., Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 89:3721-3725 (1992)], PDE3AB [Miki et al., Genomics 36: 476-485 (1996)], PDE4A5 [Bolger et al., Mol. Cell Biol. 13:6558-6571 (1993)], PDE4D1 y PDE4D3 [Bolger et al., Mol. Cell Biol. 13:6558-6571 (1993)], PDE5A, PDE6A [Pittler, et al., Genomic 6: 272-283 (1990)], PDE6B [Collins, et al., Genomics 13:698-704 (1992)], PDE6C [Piriev, et al., Genomics 28: 429-435 81995)], y PDE7A1 [Michaeli, et al., J. Biol. Chem. 17:12925-12932 (1993)]. Se examinaron los resultados de BLASTN y las secuencias EST consideradas correspondientes a cada uno de los quince cADNs PDE conocidos se identificaron y recogieron en una tabla. Las secuencias de PDE6A y PDE6B utilizadas como consultas se truncaron en el extremo 3' (quitando una parte de la región no traducida 3') debido a la presencia de elementos repetitivos en la región no traducida 3' de los cADNs.

En segundo lugar, se utilizó el programa NCBI TBLASTN para examinar la homología entre la secuencia proteínica de los quince PDE humanos conocidos (como arriba) y las seis posibles proteínas diferentes codificadas por cada una de las secuencias EST ADN. En esta búsqueda, las secuencias EST se traducen en seis marcos de lectura y las secuencias de aminoácidos generadas se comparan con las secuencias de aminoácido PDE de consulta. Las secuencias identificadas como homólogas a nivel del aminoácido se examinaron y se descartó toda secuencia EST positivamente identificada como correspondiente a un PDE conocido durante la búsqueda BLASTN descrita
anteriormente.

La tercera etapa de la búsqueda comprendía el análisis de las secuencias que no eran PDEs conocidas. Estas secuencias de aminoácidos eran homólogas a una PDE conocida pero no se identificaron como uno de los quince genes PDE conocidos durante las búsquedas BLASTN.

Las búsquedas BLASTN identificaron una secuencia EST (designada WO4835) de una biblioteca cADN de pulmón fetal humano que codificaba una secuencia de aminoácidos que tenía homología con la región catalítica de PDE2A, PDE3A, PDE3B, PDE4A, PDE4B, PDE4C, PDE5A PDE6A barra alfa, PDE6B barra beta, PDE6C cono alfa y PDE7A. La secuencia de la base de datos de WO4835 se indica en LA SEQ ID NO: 7. Los resultados del análisis de la base de datos tratados a continuación se ejemplifican utilizan la secuencia PDE4D.

Se obtuvo WO4835 cADN de la American Type Culture Collection (Rockville, MD) que mantiene y pone a disposición del público depósitos de ESTs identificados y secuenciados por I.M.A.G.E., Lawrence Livermore National Laboratory, Livermore, CA). Se secuenció el ADN WO4835 a su recepción para confirmar su identidad y se determinó si se correspondía con SEQ ID NO: 7.

La secuencia de aminoácidos codificada por el marco de lectura -1 de la secuencia EST WO4835 fue reconocida por todas las secuencias cADN de consulta PDE con excepción de PDE1A, 1B y 1C. Utilizando los resultados TBLASTN con PDE4D3 como ejemplo, se detectaron dos regiones de similaridad. La primera región mostraba 15/37 coincidencias exactas ó 40% de identidad (19/37 aminoácidos similares) e incluía el motivo HD (X) _{2}HXG (X) _{13}A (SEQ ID NO: 8) encontrado en todas las secuencias de consulta. [Charboneau, Mol. Pharmacol. Cell Regul. 2:267-298 (1990)]. La región mostraba 9/20 coincidencias exactas o 45% de identidad e incluía el motivo YHNxxHA encontrado en la mayoría de las secuencias de consulta. El análisis BLASTN de la secuencia WO4835 reveló ser único ya que no era idéntico a ninguna otra secuencia ADN humano en la base de datos Genbank. La entrada de la base de datos EST para WO4835 identificaba la secuencia como similar a PIR:A47819, la secuencia de fijación cGMP bovina, de PDE5A1 de hidrolización de cGMP. La comparación de la secuencia proteinica del marco de lectura -1 WO4835 con la secuencia PDE5A1 bovino reveló 58/153 coincidencias para una identidad global de 38%. Dentro de esta región se encontraban pequeñas regiones de mayor homología. Una región mostró 12/14 aminoácidos idénticos. Dada la naturaleza única de la secuencia WO4835, su homología relativamente baja con PDE5A1 bovino y la presencia de motivos de aminoácido encontrados en la mayoría de otras secuencias de aminoácidos PDE humano, WO4835 representa un cADN de PDE humano nuevo.

Ejemplo 2 Aislamiento de cADN PDE putativo

Se procedió a la digestión de una inserción cADN WO4835 del vector pT7T3D en dos fragmentos con las enzimas de restricción EcoRI y HindIII y los dos fragmentos se purificaron utilizando dos geles agarosa secuenciales de fusión baja. Ambos fragmentos se utilizaron como sondas para examinar bibliotecas cADN derivadas de corazón humano (Stratagene, La Jolla, CA), y cerebro fetal humano (Stratagene) utilizando procedimientos rutinarios en el estado de la técnica. Se reconocieron aproximadamente 5 x 10^{5} fagos de cada biblioteca. La hibridación se realizó durante la noche en tampón que contenía 3X SSC, 0,1% sarcosil, 20 mM fosfato sódico, pH 6,8, 10X de solución Denhardt y 50 \mug/ml de ADN de esperma de salmón a 65°C. Los filtros se lavaron a 65°C en tampón que contenía 2X SSC y 0,1% SDS antes de la autoradiografia.

Se hibridaron nueve clones de la biblioteca de cADN de cerebro fetal y dos de la biblioteca de cADN de corazón para obtener la sonda WO4835. La secuenciación y cartografía parcial condujo a la selección de un clon de la biblioteca de cerebro fetal designados FB66a para su ulterior caracterización.

Un segundo cribaje de aproximadamente 7,5 x 10^{5} fagos de la biblioteca cADN de cerebro fetal en condiciones utilizadas en el primer reconocimiento utilizando el fragmento 1,3 kb EcoRI/HindIII de la parte 5' de WO4835 dio como resultado 19 clones de cADN adicionales. Seis de estos cADNs también hibridaron obteniéndose un fragmento HindIII/Kpnl de WO4835 que incluye una región nucleótida 256 en el extremo 5' de WO4835. La secuenciación y cartografía parcial de cinco de los clones condujo a la selección de un segundo clon designado FB85c-2 para su ulterior análisis.

Ejemplo 3 Análisis de secuencia ADN FB66a y FB85c-2

La secuencia ADN de FB66a se determinó para ambas cadenas utilizando iniciadores oligonucleótidos de ADN indicados más abajo en SEQ ID NO: 9 a 31 y un secuenciador Perkin Elmer Applied Biosystems División 373A ADN según el protocolo sugerido por el fabricante. La cantidad de producto PCR utilizada como plantilla se utilizó sobre la base del tamaño del producto PCR y se secuenció utilizando un ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit con ApliTaq ADN polimerasa, FS (Perkin Elmer Foster City, CA) y PCR asimétrico. El producto de reacción se purificó sobre una columna giratoria (Advanced Genetic Technologies Corp. Gaithersburg, MD) y se secó. Se añadió tampón de carga a cada muestra purificada y la mezcla se calentó a 90°C durante dos minutos. La solución se puso en hielo hasta cargar en un gel 4% poliacrilamida. Se recogieron automáticamente los datos una vez que se inició el programa Data Collection y se analizaron automáticamente y fueron leídos por el Programa de Análisis de Secuencia. Toda la operación de edición se realizó manualmente y las secuencias resultantes se analizaron cuando se determinó la secuencia de consenso.

36

El cADN FB66a indicado en la SEQ ID NO: 3 tiene 4389 nucleótidos de longitud y del nucleótido 3 al nucleótido 2411 codifica una proteína de 803 aminoácidos con un peso molecular previsto de aproximadamente 90.775 Da. La secuencia de aminoácidos deducida para FB66a se indica en SEQ ID NO: 4. La primera metionina está codificada en nucleótido 45; la ausencia de un codón de terminación corriente arriba en el marco de lectura hace que existan dudas acerca de si este residuo es una metionina interna o el comienzo del marco de lectura abierto.

La secuencia de FB85c-2 (SEQ ID NO: 5) se determinó de forma similar utilizando iniciadores M13Rev.1, W48A2, W48A9, W48A4, W48SI, W48A1, W48S6, W48A5, W48A6, W48S2, W48S3, W48S5, W48S5, W48S7, W48A8, y M13. Se observó que FB85c-2 incluida dos inserciones ADN distintas; únicamente una de ellas era homóloga a WO4835. La región homóloga a WO4835 tenía una longitud de aproximadamente 2,8 kb. La secuencia precisa en el extremo 5' de la inserción no se pudo determinar y por lo tanto no se incluye en la secuencia nucleótido 2573 indicada en SEQ ID NO: 5 unos cuantos centenares de bases de secuencia en lo que puede ser una región no traducida 5'. El nucleótido 67 al nucleótido 2406 codifica una proteína que tiene 779 aminoácidos, proteína (SEQ ID NO: 6) que tiene un peso molecular previsto de 88353 Da. Un codón de terminación corriente arriba del marco de lectura hace que se considere probable que la metionina codificada en la posición nucleótido 67 sea la metionina de iniciación.

Las proteínas codificadas por FB66a y FB85c-2 tienen diferentes secuencias amino terminales que pueden ser debidas a cortado y empalmado alternativo. Las secuencias de ADN divergen entre sí, 5' del nucleótido 112 en el FB66a y nucleótido 104 en FB85c-2. Por consiguiente, FB85c-2 tiene 13 aminoácidos en el término amino que no se encuentran en la proteína FB66a. La proteína FB66a incluye 23 residuos terminales amino únicos si la metionina de iniciación se codifica según lo supuesto en el nucleótido 35; la proteína incluye más de 37 residuos terminales amino únicos si el marco de lectura abierta en el clon FB66a es incompleto.

El análisis BLASTN en el que se compara una secuencia de nucleótido de consulta con una base de secuencia de datos de nucleótidos de la secuencia FB66a no reveló ninguna identidad con secuencias en Genbank, base de datos NCBI STS, NCBI GTSS o NCBI GSS. No obstante se identificaron dos secuencias idénticas en la base de datos NCBI EST.

Una secuencia fue la WO4835 EST que se utilizó para identificar el clon cADN. La segunda AA307865 (SEQ ID NO: 32) derivada de una línea celular de cáncer de colon KM12C (HCC) mostró identidad de secuencia con la región no traducida 3' de los clones FB66a y FB85c-2. Durante la búsqueda en la que se identificó AA307865, se identificaron ADNs EST adicionales supuestamente codificadores de ratón putativo (EST AA386789, SEQ ID NO: 38) y rata (EST H32734, SEQ ID NO: 33) homólogos a la proteínas humanas codificadas por FB66a y FB85c-2. La secuencia de ratón fue un 86% idéntica a las secuencias humana y la secuencia de la rata lo fue en un 81%.

Ejemplo 4 Análisis proteína FB85c-2 y FB66a

Las PDEs codificadas por clones FB85c-2 y FB66a se designaron PDE8A1 y PDE8A2, respectivamente. Ambas proteínas PDE8A que tienen identidad de secuencia de aminoácido completa más allá del punto de divergencia tratada anteriormente, son muy similares a PDE2A, PDE5A, PDE6A, PDE6B y PDE6C humanos. Los cuadros 1 y 2 muestran el porcentaje de identidad de aminoácido entre PDE8A y PDE2A, PDE5A y PDE6A. PDE8A1 y PDE8A2 comparten homología con otros PDEs sobre la región catalítica (aminoácidos 492 a 748 en PDE8A1) y con el dominio de fijación de cGMP putativo conservado en la región amino terminal del PDE2A, PDE5A, PDE6A, PDE6B y PDE6C. El dominio potencial de fijación de cGMP de PDE8A se extiende desde los aminoácidos 75 al aminoácido 445 en el polipéptido PDE8A1. Dentro de los dominios de fijación de cGMP de PDE2A, PDE5A, PDE6A, PDE6B y PDE6C hay dos repeticiones internas designadas "a" y "b" y cada repetición contiene una serie de aminoácidos conservados [McAllister-Lucas, et al., J. Biol. Chem. 268:22863-22873 (1993)]. En la región de repetición correspondiente "b" de PDE8A todos los aminoácidos conservados se encuentran en la región de repetición correspondiente "a"; únicamente algunos de los residuos conservados se detectaron. Un residuo de aspartato, considerado esencial para la fijación de cGMP por PDE5A bovino [McAllister-Lucas, et al., J. Biol. Chem. 270: 1-9 (1995)] no está presente en la región de repetición "a" de PDE8A. Por consiguiente no existe incertidumbre acerca de si esta región en PDE8A funciona par fijar cGMP.

CUADRO 1

Identidad de PDE8A en toda la proteína

PDE	2A	5A	6A	8A
2A	100	19	16	28
5A		100	23	28
6A			100	21
8A				100

\vskip1.000000\baselineskip

CUADRO 2

Identidad de PDE8A en el dominio catalítico

PDE	2A	5A	6A	8A
2A	100	38	33	41
5A		100	42	46
6A			100	37
8A				100

Ejemplo 5 Expresión de PDEBA recombinante

Se generó un constructo de expresión para PDE8A que incluía secuencias de ADN 3' desde el punto de divergencia de PDE8A1 y PDE8A2 por el codón de terminación. La construcción de expresión incluía ADN codificando un rótulo de epítopo de 8 aminoácidos. Se añadió el denominado "FLAG tag" que comprende la secuencia de péptido indicada en SEQ ID NO: 34 al término amino con el fin de poder identificar la proteína mediante técnicas de transferencia Western utilizando un anticuerpo anti-FLAG M2 (Eastman Kodak, Rochester, NY) que reconocía específicamente el péptido de SEQ ID NO: 34.

SEQ IN NO: 34 Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Lys

Se añadieron también secuencias que codifican una metionina de iniciación en el término amino de las proteínas.

Como primera etapa en la construcción se realizó el plásmido de expresión, PCR utilizando ADN FB66a como plantilla utilizando iniciadores indicados en SEQ ID NOs: 35 (más abajo) y W48A2 (SEQ ID NO: 10, página 14) en una mezcla de reacción que contenía 2 \mul de cada iniciador (cepa 100 \mug/ml), 2 \mul 10X PCR tampón II (Perkin Elmer), 2 \mul l0X cepa de cada nucleótido (cepa 2 mM), 1,2 \mul MgCl_{2} (cepa 25 mM), 0,09 \mul 5 unidades/\mul taq polimerasa (Perkin Elmer), ADN FB66a y agua para llevar la mezcla de reacción a 20 \mul. En el iniciador 5' (SEQ ID NO: 35) hay un sitio NcoI en negrita y en la región que codifica el rótulo FLAG está subrayada.

SEQ ID NO: 35

CAGTCAGCTAGCCGCCATGGACTACAAGGACGACGATGACCAAGTTGACTGATGAAAAGGTG

Se realizó PCR en un Perkin Elmer DNA Thermal Cycler en las siguientes condiciones: 94°C durante 4 minutos seguido de 30 ciclos de 94°C durante un minuto, 50°C durante un minuto y 72°C durante dos minutos.

Se realizó la digestión del producto PCR resultante con Ncol y Kpnl, gel purificado y subclonado en vector Bluescript SKII previamente digerido con las mismas enzimas. El vector Bluescript había sido modificado previamente para incluir un fragmento promotor de alcohol de hidrogenasa 2 Sacl/Ncol (ADH2) que se había quitado de un vector YepC-PADH2d [Price, et al., Meth. Enzymol. 183:308-315 (1990)]. El plásmido resultante se designó W48pcr1.

Se aisló de cADN FB66a un fragmento de Kpnl y SstI que contenía la parte 3' del marco de lectura abierto y se insertó en W48perl previamente diferido con Kpnl y EcoRV. El plásmido resultante se designó W485.1.

Se aisló de W49pcrl un fragmento de SacI/KpnI que contenía el promotor ADH2 y la parte 5' del gen PDE8A. Se aisló de W485.1 un fragmento de Kpnl/Sa/l que contenía la región 3' de PDE8A. Los dos fragmentos se ligaron en el vector de expresión de levadura YepC-PADH2d que había sido previamente digerido con SacI y Sa/l. El plásmido resultante se designó W48-2ADH2 y se depositó el 2 de octubre de 1997 según los términos del Tratado de Budapest en la American Type Culture Collection (A.T.C.C.) 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852. Se dio a la cepa bacteriana que llevaba el plásmido W48-ADH2 el número de acceso ATCC 98552. Las secuencias de ADN generadas por PCR y las secuencias de ADN en los enlaces PDE8/vector fueron determinadas para garantizar una construcción adecuada de plásmido. Tras la confirmación de la secuencia, el plásmido se transformó en una cepa de levadura BJ2-54 que carecía de actividad endógena PDE (ura3-52;trpl;leu2;cirº;gal2;pep4-3; prbl-1122;prcl-402;\DeltaPDE1::URA3;HIS3;\DeltaPDE2::TRP1).

Las células anfitrionas se cultivaron durante la noche en un medio SC-leu selectivo, que contenía 2% de glucosa, diluido a 1-2 x 10^{5} células/ml y seguidamente se cultivó hasta una densidad de 10^{7} células/ml en el mismo medio. La presencia del plásmido de expresión pareció aumentar el tiempo de duplicación del crecimiento celular dos a tres veces incluso en condiciones no inductoras. Las células se recogieron por centrifugación, se lavaron con un medio YEP que contenía 3% de glicerol, se volvieron a suspender en YEP/3% glicerol a una densidad de 10^{7} células/ml y se cultivaron durante 24 horas antes de la colecta. Se congelaron las células hasta su utilización.

Los nódulos celulares congelados (0,06 ml) se descongelaron y volvieron a suspender en 0,2 ml de tampón de lisis que contenía 100 mM MOPS, pH 8,0, 200 mM NaCl, 2 \muM ZnSO_{2}, 2 mM ditiotreitol y 10 \mug/ml de cada inhibidor de proteasa pepstatina, leupeptina y aprotinina. Se añadieron aproximadamente 0,2 ml de perlas de cristal de 0,5 mm a las células que se sometieron a lisis con 4 ciclos de 30 segundos de vórtice. El lisato se aspiró y las perlas se lavaron dos veces con 0,3 ml de tampón de lisis. El lisato se combinó con los lavados para generar el extracto de levadura. En algunos experimentos, el lisato se fraccionó por centrifugación a 105.000 x g durante 30 minutos.

Se realizó el análisis Western en el extracto de levadura que contenía la proteína recombinante, en la forma indicada a continuación: las proteínas se separaron primero en SDS-PAGE y se transfirieron a Immobilon-P (Millipore) utilizando métodos standard. Las transferencias proteinicas se bloquearon utilizando 5% de leche seca no grasa en 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM, NaCl, 0,05% Tween-20 (tampón TBST más leche) durante una hora a temperatura ambiente. Las transferencias (blots) se incubaron con anticuerpo anti-FLAG M2 (tratado anteriormente) a una concentración de 1 \mug/ml en tampón TBST más leche durante una hora, durante lo cual las transferencias se lavaron cuatro veces con tampón TBST. Se incubaron entonces las transferencias durante una hora con anticuerpo IgG anti-ratón, cabra purificado de afinidad de calidad de transferencia conjugado con preoxidasa de rábano picante (HRP) (BioRad). El IgG de cabra se diluyó previamente a 1:10.000 en tampón TBST más leche. Los blots se lavaron cuatro veces con TBST y se trataron siguiendo el protocolo sugerido por el fabricante, con el Renaissance® system (New England Nuclear Life Science Products) para quimioluminiscencia potenciada antes de autoradiografía. La mayoría de la proteína detectada por el anticuerpo tenía el tamaño esperado para proteína
recombinante.

Se analizó la actividad de PDE por detección de fosfato ^{32}P liberado de ^{32}P-cAMP o ^{32}P-cGMP tal como se describió anteriormente [Loughney et al., J. Biol. Chem. 271:796-806 (1996)]. El extracto de levadura se diluyó en 0,5X de tampón de lisis que contenía también 0,5 mg/ml de albúmina de suero bovino. Se analizaron 20 \mul del extracto de levadura, o extracto de levadura diluido en un volumen de reacción de 100 \mul que comprendía además 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 5 mM, MgCl_{2} 1 \muM Zn SO_{2}, y 0,1 mg/ml de albúmina de suero bovino. Se analizó la concentración de proteína utilizando el método de Bradford.

Se observó que la PDE8A hidrolizaba tanto cAMP como cGMP. En lisatos no fraccionados, la actividad específica de cAMP era de 3,9 nmol/min/mg y para cGMP era de 7,6 nmol/min/mg. El fraccionamiento reveló que el 20-40% de la actividad total estaba asociada con la fracción sobrenadante de alta velocidad. El análisis cinético de la actividad con cAMP como substrato sugirió la presencia de formas altas y bajas de K_{m} de la enzima en una proporción de actividad 1:1. Los valores K_{m} estimados fueron 0,2 \muM y 350 \muM. El análisis del gránulo de alta velocidad sugirió que las mismas especies estaban presentes aunque en una proporción de actividad K_{m} alto: K_{m} bajo de 1:4. El análisis cinético con cGMP como sustrato sugirió también la presencia de formas altas y bajas de la enzima. En estos análisis, se estimó que los valores de K_{m} eran 3 \muM y 300 \muM.

Los valores IC_{50} para la inhibición de la actividad de PDE8A se determinaron utilizando un conjunto de inhibidores PDE isozima-selectivos y el inhibidor no selectivo isometil butil xantina (IBMX). Como estos ensayos se realizaron a una concentración de cAMP de 60 nM, los valores de IC_{50} reflejan la inhibición de la forma de K_{m} baja solamente. Los resultados se indican en el cuadro 3, donde los valores se dan en unidades micromolares.

CUADRO 3

Inhibición de PDE8 con inhibidores de PDE isozima-específicos

Compuesto	Familia PDE	IC_{50} para familia	IC_{50} para	Diferencia pliegue
	Blanco	blanco	PDE8	(Fold)
IC224	PDE1	0,08-0,008	2,7	38-338
EHNA	PDE2	2	65	31
Cilostamida	PDE3	0,02	12	750
IC197	PDE4	0,02	14	714
DMPPO	PDE5	0,016	1,1	66
IBMX	No select.	1-40	4,6	0,12-4,6

Los valores de IC_{50} para cada uno de los inhibidores selectivos fueron por lo menos 30 veces superiores frente a PDE8 que frente a sus isozimas blancos lo cual sugiere que el perfil inhibitorio de PDE8 es distinto del perfil de PDEs 1-5. La hidrólisis de cAMP y cGMP distingue claramente la actividad enzimática de PDE8A de la de PDE6 y PDE7A. El IC_{50} del inhibidor no selectivo IBMX para PDE8 se encontraba dentro de los márgenes observados para PDEs humano conocido, lo cual sugería que el sitio catalítico de PDE8 se parece a los de otros PDEs humanos y mamíferos y difiere de formas eucarióticas inferiores insensibles a IBMX.

Ejemplo 6 Análisis Northern de expresión de PDE8A

El análisis Northern de la expresión de PDE8A se realizó utilizando un blot de tejido múltiple humano (Clontech, Palo Alto, CA). La sonda de base 327 se extendía del nucleótido 1767 al nucleótido 2293 en SEQ ID NO: 3. Las condiciones de preparación e hibridación de ribosonda fueron como las descritas anteriormente [Loughney, et al., supra].

Los resultados mostraron un mARN 9,5 kb en todos lo tejidos examinados pero la intensidad de banda variaba. La señal era más fuerte en el corazón, el cerebro y el riñón. La señal era más débil en el hígado, la placenta, el páncreas y los músculos del esqueleto. La señal era muy débil en el pulmón.

Ejemplo 7 Cartografía cromosómica de PDE8A humano

Se aislaron cromosomas artificiales de levadura (YACs) que contenían el gen PDE8A humano de un grupo de YACs humanos comprados en Research Genetics y se cribaron por PCR de la siguiente forma.

Los super-grupos YAC se cribaron con dos pares encajados de iniciadores. En la primera reacción de cribaje, el iniciador de sentido W48S8 (SEQ ID NO: 36) se emparejó con el iniciador antisentido W48A10 (SEQ ID NO: 37). Se realizó el PCR con 10 mM Tris-HCl, pH 8, 3, 50 mM KCl, 2 mM MgSO_{4}, 0,2 mM de cada dNTP, 10 \mug/ml de cada iniciador, 0,5 unidades de polimerasa taq (Perkin Elmer) y 1,5 \mul de ADN del grupo YAC como plantilla. Se realizaron reacciones durante 30 ciclos; cada ciclo era de un minuto a 94°C, dos minutos a 60°C, y cuatro minutos a 72°C. Después de la primera tanda de amplificación, los productos de reacción se volvieron a amplificar con el par interno de iniciadores W48S12 (SEQ ID NO: 36) y W48S12 (SEQ ID NO: 37).

W48S12

\hskip0.5cm

CCAGAAGGGGTACTTTTCC

\hskip0.5cm

SEQ ID NO: 36

W48Al2

\hskip0.5cm

CATTGTCCTGAGGCTGTGG

\hskip0.5cm

SEQ ID NO: 37

Las reacciones se realizaron en la forma descrita anteriormente con la diferencia de que la plantilla era 1 \mul de una dilución 1:10 (en agua) de la reacción de la primera tanda. Se identificaron super-grupos que daban el producto PCR de tamaño correcto y se cribaron los sub-grupos correspondientes con los mismos pares encajados de iniciadores en las mismas condiciones para identificar direcciones únicas para YACS que contuvieran PDE8A.

Se compraron en Research Genetics cepas de levadura que albergaban los YACs relevantes. Con el objeto de verificar la presencia del gen PDE8A en los diversos YACs, se preparó ADN de cada cepa y se analizó por PCR con iniciadores W48S8 y W48A10. Se preparó ADN de cada cepa según un método descrito anteriormente [Hoffman and Winston, Gene 57:267-272 (1987)] que se modificó del siguiente modo. Se cultivaron cepas durante la noche a 30°C en medio YEP que contenía glucosa. Se granularon por centrifugación 10 ml de cultivo y se volvieron a suspender en 200 \mul de tampón acuoso que contenía 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl, 1 mM Na_{2}EDTA, 1% SDS y 2% Triton-X100. Las células se lisaron sometiéndolas a vórtice en presencia de 200 \mul de fenol/-cloroformo (mezcla 1:1) y 100 \mul de perlas de cristal (425-600 \mum). Tras la lisis, se añadieron 200 \mul del tampón TE (10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM Na_{2}EDTA) y la muestra se centrifugó para separar las fases. La fase orgánica se extrajo nuevamente con 200 \mul de tampón acuoso. La fase acuosa agrupada se trató con 100 unidades de RNase pancreático bovino (Boehringer Mannheim) durante una hora a 37°C y se extrajo la muestra con fenol/cloroformo, se volvió a extraer con cloroformo y se precipitó en etanol según los métodos establecidos. El nódulo resultante se volvió a suspender en 50 \mul de tampón TE. Se realizó el PCR en la forma descrita anteriormente con la diferencia que el volumen de reacción era de 25 \mul y la plantilla consistía en 1 \mul del preparado de ADN de levadura relevante.

Se identificaron tres YACs humanos que contenían el gen PDE8 con direcciones 805B6, 919H10 y 920A3 (según la designación CEPH). Según la información en la base de datos de Center for Genome Research (Whitehead), los tres YACs se solapan entre si y forman parte de un contig de ligado único (WC6.16) en cromosoma humano 6. Se colocaron sitios rotulados de dos secuencias dentro de este contig (D6S305 y D6S411) en el mapa genético de cromosomas 6 en una posición 167 cM del extremo de 6p en el Center for Genome Research; se cartografió D6S305 en una posición 173 cM del extremo de 6p en funcionamiento en CEPH-Genethon. Se cartografiaron otros tres YACs dentro del contig WC6.16 (932F1, 956B1 y 947D5) por fluorescencia hibridación in situ en CEPH-Genethon. Las señales de hibridación caen entre 0,94 y 0,99 unidades de longitud fraccional del extremo de 6p. Según el mapa resumen integrado CEPH [Chumakov et al., Nature 377 (Supp): 175-297 (1995)], esta región corresponde a la región citogenética 6q26-27.

Como defectos heredables que se han asociado con esta región de genoma humano se pueden citar la degeneración del cono retiniano (base de datos OMIM), diabetes mellitus dependiente de insulina [Davies et al., Nature 371:130-136 (1994); Luo et al., Am. J. Hum. Genet. 57:911-919 (1995)] y aparición juvenil de la enfermedad de Parkinson [Matsumine et al., Am. J. Hum. Genet. 60:588-596 (1997)]. Además se observa frecuentemente pérdida de heterocigosidad (LOH) en esta región en toda una serie de células cancerosas diferentes, inclusive el linfoma de Burkitt [Parsa et al., Genes Chromosomes & Cancer 9: 13-18 (1994)], astrocitoma [Liang et al. Neurology 44:533-536 (1994)], carcinoma gástrico [Queimado et al. Genes Chromosomes & Cancer 14:28-34 (1995)] adenoma paratiroide [Tahara et al. Cancer Res, 56: 599-605 (1996)] y carcinoma de ovario [Cooke et al. Genes Chromosomes & Cancer 15: 223-233 (1996)]; Saito et al. Cancer Res. 56:5586-5589 (1996)]. Se ha sugerido que LOH indica la presencia de un gen supresor de tumor en la región afectada [Weinberg, Science 254:1138-1146 (1996)]. Debido a su expresión muy extendida es posible que la mutación del gen PDE8 esté involucrada en todas o el algunas de estas anomalías
genéticas.

Ejemplo 8 Verificación de que PDE8A1 y PDE8A2 representan variantes Splice (empalmes) y esfuerzos para extender la secuencia 5' de PDE8A2

Se adoptaron dos métodos para verificar si PDE8A1 y PDE8A2 representan empalmes 5'. En primer lugar el análisis PCR reveló que en el ADN genómico no había secuencias PDE8A1 ni PDE8A2 adyacentes a la secuencia ADN de la región común. Las secuencias genómicas corriente arriba de la región común estaban presentes en un tercer cADN PDE8A, FB74b, que se identificó en el grupo de 6 clones originales que hibridaron para formar el extremo 5' de la sonda WO4835 descrita en el ejemplo 2. La secuencia parcial (755 nucleótidos en el extremo 3') del clon FB74b se indica en SEQ ID NO: 39. El cADN de FB74b divergía de FB85c-2 y FB66a en la misma posición que FB85c-2 y FB66a divergían entre si, pero el clon FB74b no mantenía el marco de lectura abierto. En la secuencia FB74b 5' hasta el punto de divergencia de secuencia respecto de los clones FB66a y FB85c-2, un codón de terminación dentro del marco de lectura estaba más cerca del punto de divergencia que un codón de metionina iniciador lo cual indicaba que si FB74b representaba un cADN y no un precursor cortado y empalmado la metionina de iniciación estaría situada necesariamente en la secuencia común tanto a FB66a como a FB85c-2.

El análisis PCR se realizó utilizando un iniciador designado FB74bS1 (SEQ ID NO: 40) dentro de las secuencias corriente arriba FB74b y un segundo iniciador designado W48A9 (SEQ ID NO: 11 dentro de las secuencias común a FB74b, FB66a y FB85c-2.

FB74bS1

\hskip0.5cm

GTTAGATGAGAGGTTGCTGG

\hskip0.5cm

SEQ ID NO: 40

Utilizando 1 \mug de ADN genómico humano como plantilla, se amplificó una banda que tenía el mismo tamaño que la amplificada utilizando FB74b como plantilla, lo cual indicaba que las secuencias únicas de FB74b y la región común eran adyacentes en el ADN genómico. Por consiguiente, la secuencia FB74b puede representar un intron no cortado ni empalmado o puede representar un tercer empalme que codificaría una proteína con una metionina de iniciación dentro de la región común. En cualquier caso, las secuencias de FB85c-2 y FB66a se generan supuestamente por cortado y empalme.

En segundo lugar, se realizó análisis 5' RACE utilizando ARN aislado de cortex humano, cerebellum, corazón, hígado y tejidos del pulmón. Se aisló ARN de tejidos de fragmento congelados según lo descrito [Loughney et al, J. Biol. Chem. 271:796-806 (1996)] y seleccionó poli A' mARN utilizando el sistema de aislamiento Fast Track^{TM} mARN (In-vitrogen). Se preparó cADN de doble cadena utilizando 5 \mug de mARN poli A^{+} y un kit de síntesis de cADN (Boehringer Mannheim). El cADN se ligó a un ligante formado hibridando oligonucleótidos L15 (SEQ ID NO: 41) y L30 (SEQ ID NO: 42).

L15	GTATGCTAATCTCAG	SEQ ID NO: 41
L30	CAACTCGAATTCCTTGACAGATTAGCATAC	SEQ ID NO: 42

Para el 5' RACE, se amplificó por PCR el cADN ligado al ligante utilizando oligonucleótidos L18 (SEQ ID NO: 43) y W48A13 (SEQ ID NO: 44).

L18	CAACTCGAATTCCTTGAC	SEQ ID NO: 43
W48A13	GTTGTTCTTCCTCTTCAGCC	SEQ ID NO: 44

La reacción contenía 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl_{2} 0,2 mM de cada dNTP, 10 \mug/ml de cada iniciador y 1 \mul de cADN ligado al ligante en un volumen de reacción de 25 \mul. Tras la etapa de calefacción a 94°C, se inició el PCR por medio de adición de 0,1 unidad de polimerasa Taq (Boehringer Mannheim) y se continuó con 30 ciclos de 1 minuto a 94°C, 2 minutos a 60°C y 4 minutos a 72°C.

Los productos de la reacción PCR se diluyeron diez veces con agua y se utilizaron como plantilla en una segunda reacción PCR con oligonucleótidos L21 (SEQ ID NO: 45) y W48A9S (SEQ ID NO: 46) en las mismas condiciones descritas anteriormente.

L21	CAACTCGAATTCCTTGACAGA	SEQ ID NO: 45
W48A9S	GATCGTCGACCTGTCTCTGCACTAACAC	SEQ ID NO: 46

Se separó con EcoRI y Sa/l ADN amplificado en la segunda reacción PCR y se ligó en el vector Bluescript (Stratagene) previamente digerido con las mismas enzimas.

Inicialmente, se examinaron secuencias ADN en 5 plásmidos de cada fuente de tejido y ambas secuencias PDE8A1 y PDE8A2 5' se encontraron entre los cADNs aislados. Se obtuvieron también secuencias FB74b 5' como si fueran varias secuencias, cada una aislada solo una vez, lo cual podría representar sin embargo empalmes adicionales o secuencias ADN no relacionadas.

Debido a que ninguno de los cADNs similares a PDE8A2 se extendieron más allá de 5' de lo que había hecho el cADN original FB66a, se analizaron clones adicionales PDE8A2 RACE en un intento de extender la secuencia final 5'. Se identificaron y secuenciaron 5 cADNs PDE8A2 de pulmón pero ninguno extendió la secuencia PDE8A2.

Se repitió una segunda tanda de RACE PCR utilizando el iniciador L21 (SEQ ID NO: 45) con el iniciador W48A14S (SEQ ID NO: 47).

W48A14S

\hskip0.5cm

GATCGTCGACAAGCACTCGGTCAGCCTTCG

\hskip0.5cm

SEQ ID NO:47

Los clones resultantes se cribaron por PCR y se eligieron los más largos para a secuenciación. Únicamente dos clones eran más largos que el cADN original de FB66a y extendieron la secuencia 5' 8 y 12 bp, respectivamente, en la región no traducida. Las secuencias FB66a se extendieron con 5'-CCCAGGGCGCCA. El extremo 5' de FB66a es muy rico en GC lo cual puede contribuir a la dificultad de aislar cADNs de longitud normal.

Ejemplo 9 Expresión y caracterización de PDE8A

El PDE8A recombinante descrito en el ejemplo 5 existía, tanto en formas de afinidad bajas como alta en el extracto de levadura. Debido a la posibilidad de que la forma de afinidad baja representada parcialmente enzima inactiva, se realizó la expresión de PDE8A en células sf9 y COS en un intento de obtener una enzima homogénea o determinar si las dos formas cinéticas se expresan siempre partir del cADN.

El constructo de expresión PDE8 sf9 se generó con un fragmento 3' KpnI-SalI a partir del plásmido W485.1 (descrito en el ejemplo 5) y un fragmento 5' generado por PCR en la forma indicada a continuación. Los iniciadores FLAG-1 (SEQ ID NO: 48) y W48A4 (SEQ ID NO: 12) se utilizaron en PCR con PDE8 COS-1 ADN (descrito más abajo) como plantilla.

FLAG-1

\hskip0.5cm

GATCGGATCCACCATGGACTACAAGG

\hskip0.5cm

SEQ ID NO: 48

Se realizó el PCR en la forma descrita en el ejemplo 8 con la diferencia de que se utilizó 2 mM MgSO_{4} n lugar de MgCl_{2} y también se utilizó 0,02 U Taq polimerasa. Tras un período inicial de cuatro minutos de incubación a 94°C, se realizaron 30 ciclos con un minuto a 94°C, un minuto a 50°C y dos minutos a 72°C. El producto de amplificación 5' se segmentó con BamHI y Knpl, se purificó en gel y se ligó con el fragmento 3' en el vector pFASTBAC (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) previamente digerido con BamHI y SalI. El plásmido resultante se designó pFBRPDE8. Se verificaron por secuenciación todos los productos de amplificación PCR y todas las nuevas uniones.

Se produjeron estirpes virales recombinantes utilizando el sistema FastBac (Gibco BRL) siguiendo el protocolo sugerido por el fabricante se realizó en la forma indicada a continuación la expresión proteinica. Se cultivaron células Sf9 a 27°C en medio CCM3 (Hyclone, Logan, UT) que contenía 50 \mug/ml penicilina y 50 \mug/ml de sulfato de estreptomicina (Gibco). Las células de crecimiento exponencial se infectaron con una multiplicidad de aproximadamente 2 virus por célula y se incubaron durante 48 horas. Las células se recogieron por centrifugación, se lavaron con CMF-PBS (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH_{2}PO_{4}, 137 mM NaCl, 8,1 mM, Na_{2}PO_{4}), y los nódulos se congelaron y almacenaron a -80°C hasta su utilización. Se lisaron células en tampón (50 mM MOPS pH 7,2, 10 \muM sulfato de zinc, 1 mM DTT, 2 mM benzamidina, 10 \mug/ml de pepstatina, leupeptina y aprotinina y 20 \mug/ml de inhibidores de calpain I y calpain II) sometiendo a vórtice en presencia de un volumen igual de perlas de cristal, (lavado en ácido, 0,5 mm, Sigma) y la actividad PDE se determinó en la forma descrita en el ejemplo 5.

En el extracto sf9, se detectó actividad de PDE 45,4 nmol/min/mg para hidrólisis cAMP (100 \muM sustrato) y 69,4 nmol/min/mg para hidrólisis cGMP (100 \muM sustrato). La actividad de fondo de PDE era despreciable. La actividad de PDE8A resultó ser una mezcla de formas de afinidad alta baja según se detectó en extractos de levadura, tal como se describe en el ejemplo 5.

Para la expresión en células COS, se generó PDE8 COS-1 combinando un fragmento 3' KpnI/SalI de plásmido W845.1 (ejemplo 5) y un fragmento de Nhel/kpnI obtenido por fragmentación de un producto de amplificación PCR de una reacción que comprendía cADN FB66a como plantilla con iniciadores W48A2 (SEQ ID NO: 10) Y ATG (SEQ ID NO:35). Las condiciones para el PCR incluían una incubación inicial durante 4 minutos a 94°C, seguido de 30 ciclos de un minuto a 94°C, un minuto a 50°C y dos minutos a 72°C en un ciclador termal ADN Perkin Elmer Cetus. El fragmento 5' resultante y el fragmento 3' descritos anteriormente se ligaron en el vector pClneo (Promega, Madison, WI) que había sido previamente digerido con NheI y SalI.

Se lavaron células COS semiconfluentes cultivadas en recipientes de 15 cm una vez con 25 ml DMEM (Medio Eagle Modificado de Dulbecco, 100 U/ml penicilina y 100 \mug/ml sulfato de estreptomicina, Gibco), después de lo cual se añadieron 14 ml de dextrano/cloroquina DMEM/DEAE por placa. El dextrano/cloroquina DMEM/DEAE comprende 75 ml DMEM y 30 \mul de 0,25 M cloroquina en PBS (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH_{2}PO_{4}, 137 mM NaCl, 8,1 mM, Na_{2}PO_{4}, 0,9 mM CaCl_{2} 0,5 Mm MgCl_{2}) junto con 0,75 ml 50 \mug/ml DEAE dextrano (Pharmacia, Uppsala, Suecia). Se añadieron 20 \mug de plásmido ADN en 135 \mul de tampón Tris/EDTA (TE) por placa y las placas se incubaron durante dos horas a 37°C en 5% CO_{2}. Se quitó el medio y se añadieron 12 ml de 10% de DMSO/PBS durante un minuto y se quitaron. Las células se lavaron una vez con 25 ml DMEM, después de lo cual se añadieron otros 25 ml de DMEM que contenían 10% de suero de ternera fetal (Hyclone, Logan, UT) y las células se incubaron durante la noche a 37°C en 5% CO_{2}. Se quitó el medio y se lavó el monocapa con 25 ml de CMF-PBS. Se añadieron seis ml de una solución que contenía 0,05% tripsina/0,5 mM EDTA (Gibco) y las células se incubaron 5 minutos a 37°C. Se quitaron las células de las placas por trituración y se transfirieron a tubos centrífugos cónicos. Se lavaron las placas con 6 ml de DMEM completo para recoger las posibles células restantes y se añadió solución de lavado a los tubos centrífugos. Las células se nodularon por centrifugación durante cinco minutos a aproximadamente 340 x g, se volvieron a suspender en 5 ml de DMEM completo se llevaron a un recipiente de cultivo de tejido de 15 cm que contenía 20 ml de DMEM completo y se incubaron durante la noche en 50% CO_{2}.

El monocapa se lavó dos veces con CMF-PBS, se incubó durante 5 minutos a 37°C en verseno (0,5 mM Na_{2}EDTA 2H_{2}O, 137 mM NaCl, 2,68 mM KCl 8,1 mM Na_{2}HPO_{4}, 1,1, mM glucosa, pH 7,4), y se recolectó en la forma descrita anteriormente. Las células noduladas se lavaron con CMF-PBS, se congelaron en hielo seco y se almacenaron a -80°C hasta su utilización. Las células se lisaron en tampón (50 mM MOPS, pH 7,2, 10 \muM sulfato de zinc, 1 mM DTT, 2 mM benzamidina, 10 \mug/ml de pepstatina, leupeptina y aprotinina y 20 \mug/ml de inhibidores de calpain I y calpain II) haciéndolas pasar por una célula de presión francesa (SLM Instruments) a 20.000 psi y de determinó la actividad PDE en la forma descrita en el ejemplo 5.

La expresión de PDE8A era baja en el extracto celular COS y no se pudo caracterizar con precisión debido al elevado nivel de la actividad de fondo de PDEs endógenas. Con el fin de caracterizar más completamente el producto de expresión celular, se purificó la enzima que comprendía un rótulo FLAG en el término amino (ejemplo 5) a partir de 100.000 x g de sobrenadante de extracto celular utilizando una columna de afinidad anti-FLAG M2 (Sigma) siguiendo el protocolo sugerido por el fabricante. Con el objeto de caracterizar con más precisión la actividad PDE8A de levadura se realiza la expresión de una proteína recombinante truncada en el término amino pero que mantiene la región catalítica, en la forma descrita en el ejemplo 5 en un intento de obtener una proteína homogénea.

Ejemplo 10 Producción de anticuerpos anti-PDE8A

Se produjo una proteína de fusión GST en E. coli para obtener un antígeno para la generación de anticuerpos monoclonales en PDE8A. Se inserto un fragmento de EcoRl de FB70a (un cADN de PDE8A que comprende nucleótidos 182-1330 de FB85c-2 y que era uno de los nuevo clonos identificados originalmente que se hibridaron para obtener la sonda W4835 de longitud normal descrita en el ejemplo 2), en el sitio EcoRl de pGEX5X1 (Pharmacia) y el constructor resultante se transformó en la cepa E. coli XL1 Blue. A partir de este constructo y trans inducción con IPTG se produjo una proteína de fusión GST-PDE8A que comprendía 382 aminoácidos de PDE8A. La proteína de fusión se aisló utilizando SDS-PAGE se extrajo del gel la banda de tamaño adecuada tras teñir con 0,4 M KCl frío y la proteína se obtuvo a partir de la acrilamida por electroelución. El producto de elusión se dializó frente a PBS y se concentró utilizando columnas Centriprep 10 y Centricon (Amicon, Beverly MA) antes de inyectarlo en ratones.

El día 0, se pre-sangraron cuatro ratones Balb/c y se inyectaron subcutáneamente con un conjunto de antígenos que incluía 30 \mug/ratón de proteína de fusión GST-PDE8 en adyuvante de Freund completo en 200 \mul de volumen total. Las mismas inyecciones se repitieron las semanas 3 y 9 en adyuvante de Freund incompleto. Diez días después de la última inmunización, se obtuvieron y cribaron sangrías de prueba por captura antígeno ELISA y análisis Western.

En el ELISA, se recubrieron cuatro placas Immulon (Dynex, Cambridge, Massachusetts) a 4°C con 50 \mul/pocillo de una solución que contenía 2 \mug/ml GST-PDE8 en 50 mM de tampón de carbonato pH 9,6). Las placas se bloquearon con gelatina de piel de pescado 0,5% (Sigma) durante 30 minutos y se añadieron 50 \mul de suero diluido en PBS con 0,5% Tween 20 (PBST). Las diluciones de suero oscilaban entre 1:100 y 1:102.400 y se obtuvieron con una serie de diluciones de duplicación. Tras la incubación a 37°C durante 30 minutos y el lavado tres veces con PBST se añadieron 50 \mul de anticuerpo IgG(fc) anti ratón cabra conjugada con peroxidasa de rábano picante (Jackson) (diluido 1:10.000 en PBST). Las placas se incubaron en la forma indicada anteriormente y se lavaron cuatro veces con PBST. Se detecto el anticuerpo con adición de tetrametil bencidina (Sigma Chemical, St. Louis, Missouri) y la reacción de color se detuvo a los cinco minutos con la adición de 50 \mul de 15 H_{2}SO_{4}. Se medió la absorbancia a 450 nM en un lector de placa.

Para el análisis Western, se vertieron geles SDS-PAGE con aproximadamente 10 \mug de extracto PDE8 de levadura y aproximadamente 200 ng de GST-PDE8 purificado con gel y las proteínas se transfirieron a Immobilon-PVDF. Se realizó un protocolo de transferencia Western de quimioluminiscencia potenciada standard (ECL) usando como anticuerpo secundario peroxidasa de rábano picante IgG anti ratón cabra BioRad.

En la preparación de hibridomas se fundieron esplenocitos de ratón que dieron un resultado positivo en los protocolos de transferencia Western y/o ELISA, en células NS-1 en una proporción de 5:1 utilizando métodos standard y polietilen glicol 1500 (Boehringer Mannheim) (Harlow and Lane, Anticuerpos Manual de Laboratorio, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Las células fundidas se volvieron a suspender en 200 ml RPMI que contenía 15% FBS 100 nM hipoxantina sódica, 0,4 mM aminopterina, 16 mM timidina (HAT) (Gibco) 25 unidades/ml IL-6 (Boehringer Mannheim) y 1,5 x 106 timocitos murino/ml y se prepararon en 10 placas de cultivo de tejido de fondo plano de 96 pocillos (Corning, Reino Unido) a 200 \mul/pocillo. Las células fueron alimentadas los días 2, 4 y 6 tras la fusión aspirando aproximadamente 100 \mul de cada pocillo con una aguja 18 G (Becton Dickinson) y añadiendo 100 \mul/pocillo de medio de chapado descrito anteriormente con la diferencia de que contenía 10 unidades/ml IL-6 y que carecía de timocitos. Los días 9 a 12, se cribaron los sobrenadantes de los pocillos de fusión por captura antígena ELISA utilizando GST y GST-PDE8 y por análisis Western ECL en la forma descrita anteriormente.

Se obtuvo una señal positiva del tamaño esperado en las dos bandas de la transferencia Western utilizando sangre de ratón y se obtuvo en la fusión ulterior un anticuerpo monoclonal con reactividad muy débil a la proteína recombinante de levadura. Se repitió todo el procedimiento utilizando 50 \mug antígeno/ratón para obtener anticuerpos monoclonales más fuertemente inmunoreactivos.

Ejemplo 11 Análisis de expresión de PDE8A por hibridación in situ

Se examinó la expresión de PDE8A en secciones de tejido por hibridación in situ en forma descrita seguidamente.

Preparación de la sonda

Se clonó en un vector Bluescript (Stratagene, La Jolla, CA) un fragmento de enzima de restricción Xhol/EcoRI del cADN FB70a (correspondiente a nucleótidos 571 a 1226 de SEQ ID NO: 1) para generar un plásmido de expresión designado PDE8XR2A. El plásmido se fragmentó con Xhol y se transcribió (véase más abajo) con T3 polimerasa para generar una sonda antisentido. Se generó una sonda antisentido fragmentando PDE8XR2A con EcoRI y transcribiendo con T7 polimerasa. Las plantillas PDE8A se transcribieron utilizando un kit de transcripción de ARN (Stratagene, La Jolla, CA) en una reacción que contenía 5 \mul de %X de tampón de transcripción (Stratagene) 30 mM DTT (Stratagene), 0,8 mM de ATP, CTP, GTP (10 mM (Stratagene) 40 U RNase Bloque II (Stratagene), 12,5 U T3 o T7 polimerasa (Stratagene) y 300 ng de plantilla de plásmido linealizado, 50 \muCi ^{35}S-UTP (superior a 1000 Ci/mmol, Amersham, Arlington Heights, IL). La mezcla se incubó a 37°C durante una hora tras lo cual se eliminó el ADN de plantilla añadiendo 1 \mul de DNase I libre de RNase (Stratagene) e incubando durante 15 min. a 37°C. La sonda se hidrolizó añadiendo 4 \mul 1M NaHCO_{3} y 6 \mul 1 M Na_{2}CO_{3} durante 22 minutos a 60°C y la mezcla de reacción se neutralizó añadiendo 25 \mul de una solución que contenía 100 \mul 3 M acetato sódico, 5 \mul ácido acético (VWR, So. Plainfield, NJ) y 395 \mul dH_{2}O. Se preparó una columna quick Spin G50 ARN (5'-3' Inc., Boulder, CO) siguiendo el protocolo sugerido por el fabricante. La sonda se colocó en el centro de la columna y la columna se centrífugo durante 4 minutos a 1.000 rpm en una centrifugadora de mesa. Se mezcló lo que circulaba por la columna con 50 \mul dH_{2}O, 2 \mul de una solución 10 mg/ml tARN, 10 \mul acetato sódico 3 M y 200 \mul 100% etanol VWR) y la mezcla resultante se incubó durante la noche a -20°C. La solución de la sonda se microfugó durante 15 minutos a 4°C, se eliminó el sobrenadante y el nódulo se volvió a suspender en 40 \mul 1X TBE que contenía 1 \mul de 0,1 M DTT. Se almacenó la sonda a -70°C hasta realizar el ensayo de hibridación in situ.

Preparación de muestras de tejido e hibridación in situ

Se cortaron a 6 \mum unos tejidos (National Disease Research Interchange, Philadelphia, PA y Cooperative Human Tissue Network, Philadelphia, PA) y se colocaron sobre portaobjetos Superfrots Plus (VWR). Las secciones se fijaron durante 20 minutos a 4°C en 4% para formaldehído (Sigma, St. Louis, MO). Los portaobjetos de enjuagaron en 3 cambios de 1X CMF-PBS, se deshidrataron con tres lavados sucesivos con 70% etanol, 95% etanol y 100% etanol y se secaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los portaobjetos se colocaron en 70% formamida (J.T. Baker) en 2X SSC durante dos minutos a 70°C, se enjuagaron en 2X SSC a 4°C, se hidrataron con lavados de etanol al 70%, 95% y 100% y se secaron durante 30 minutos a temperatura ambiente.

Se realizó una etapa de prehibridación colocando los portaobjetos en una caja hermética al aire que contenía un papel de filtro saturado con tampón box que contenía 50% de formamida (J.T.Baker) en 4X SSC. Cada sección se cubrió con 100 \mul de tampón rHB2 que consistía en 10% sulfato de dextrano (Sigma), 50% formamida (J.T.Baker, Phillpsburg, NJ), 100 mM DTT (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN), 0,3 M NaCl (Sigma), 20 mM Tris, pH 7,5, 5 mM EDTA Sigma) y 1X solución de Denhardt (Sigma) y los portaobjetos se incubaron a 42°C durante 1 hora. La sonda descrita anteriormente se preparó mezclando 4 x 10^{5} cpm/sección de tejido con 5 \mul de una solución de 10 mg/ml tARN por sección y se calentó la mezcla a 95°C durante 3 minutos. Se añadió tampón helado rHB2 para llevar el volumen final a 20 \mul/sección. La solución que contenía la sonda (20 \mul/sección) se añadió a 100 \mul de tampón rHB2 previamente aplicado. Los portaobjetos se incubaron a 55°C durante 12 a 16 horas. Tras la hibridación, los portaobjetos se lavaron una vez en 4X SSC que contenía 10 mM DTT durante una hora a temperatura ambiente, una vez en formamida desionizada al 50% (J. T. Baker), un 1X SSC, y 1 mM DTT durante 40 minutos a 60°C, una vez en 2X SSC durante 30 minutos a temperatura ambiente; y una vez en 0,1X SSC durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las secciones se deshidrataron mediante lavados de etanol al 70%, 95% y 100% y se secaron al aire durante 30 minutos. Los portaobjetos se sumergieron en emulsión unclear Kodak NTB2, se secaron durante una a tres horas en temperatura ambiente en la oscuridad y se almacenaron en un sitio oscuro a 40% con desecante hasta el momento del revelado. Los portaobjetos se revelaron en revelador Kodak Dektol 4°C durante 4 minutos, se sumergieron 4 veces en dH_{2}O 4°C y se colocaron en fijador 4°C Kodak durante minutos. Los portaobjetos se enjuagaron en dH_{2}O y se realizó una tinción standard H&E en la forma indicada a continuación.

Los portaobjetos se enjuagaron en dH_{2}O y se tiñeron con hematoxilina y eosina haciendo pasar los portaobjetos por una serie de etapas siguientes: 5 minutos en formadlehído/alcohol (100 ml formaldehído, 900 ml 80% etanol); tres enjuagues en agua por un total de 2 minutos; 5 minutos en 75% Harris hematoxilina (Sigma); tres enjuagues en agua con un total de dos minutos; una inmersión en 1% HCl/50% etanol; un enjuague en agua; cuatro inmersiones en carbonato de litio 1%; 10 minutos en agua de grifo; dos minutos en 0,5% en eosina (Sigma); tres enjuagues en agua durante un total de dos minutos; dos minutos en 70% etanol; tres enjuagues de un minuto en 95% etanol; dos enjuagues de un minuto en 100% etanol y dos enjuagues de dos minutos en xileno. Los portaobjetos se montaron con citoseal 60 (Stephens Scientific, Riverdale, NJ).

Las señales obtenidas con una sonda antisentido PDE8A se compararon con las señales de control generadas por una sonda de sentido PDE8A y se consideró que toda señal específica de la sonda antisentido representaba una expresión de PDE8A. La señal PDE8A se detectó en gran parte del cerebelo, en un subconjunto de células en los túbulos seminíferos del testes en células diseminadas de origen todavía indeterminado en el músculo del esqueleto, en células granulosas y a estromas del ovario, en células epiteliales en el bucle de Henle en el riñón y el músculo liso de algunas arteriolas en el corazón.

Estos resultados difieren de los obtenidos por transferencia Northern y descritos en el ejemplo 6 en el sentido de que se detectó una señal moderada en el corazón por transferencia Northern mientras que los datos in situ, utilizando esta muestra de corazón, dieron una señal débil. La inconsistencia puede reflejar diferencias en los tejidos de individuos diferentes o diferencias en el nivel de detección inherentes a los dos métodos. La señal en el ovario y la señal en el riñón puede indicar que PDE8A interviene en la ovulación o en la homeostasis de la sal y/o del agua, respectivamente.

Los expertos en la materia podrán imaginar numerosas modificaciones y variaciones en la invención expuesta en los ejemplos anteriores a modo de ilustración. Por consiguiente, la invención sólo tiene en cuenta las limitaciones reflejadas en las reivindicaciones adjuntas.

<110> Loughney, Kate

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<120> Fosfodiestersa 8A

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<130> 27866/35047

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<140>

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<141>

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<150> 08/951,648

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<151> 1997-10-16

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<160> 48

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<170> PatentIn Ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 2298

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(2298)

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (868)..(870)

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<223> El aminoácido codificado por nucleótidos 868—870 es Pro o LEU

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<400> 1

1

2

3

4

5

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<210> 2

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<211> 766

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

6

7

8

9

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4389

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)..(2411)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

10

11

12

13

14

15

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 803

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

16

17

18

19

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3195

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (67)..(2403)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

20

21

22

23

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 779

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

25

26

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 458

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

29

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Asp Xaa Xaa His Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa}

\sac{Xaa Xaa Xaa Xaa Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggaaacagct atgaccatg

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

actctccaag gaatacag

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctgtctctgc actaacac

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttggcaaggc ctctgcat

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cctctatgaa ctgagcag

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211>18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaaggcactg ccactgat

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: iniciador

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcgagctgta tcggcact

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agcgtgtgat tgttctgaa

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgctggccaa gtagcaag

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaggtcacag gcagtcat

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaagagtggc aaggtctc

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcatgacctg gaccaccag

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccttcttgaa gaggtttgc

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atgactgcct gtgacctt

\hfill

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctgctataca acccttacc

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211>18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctaatattg ctgaggcc

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

taagtgagag gtgactgc

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cctaaagggc tgagatca

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcagtcacc tctcactt

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211>18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgtaaaacga cggccagt

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acaaaacgcc tatggtgg

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213>Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttgatctcag ccctttagc

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcatgtggca ggaaactg

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 484

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

30

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 404

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

32

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223>Descripción de secuencia artificial: iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Lys Asp Asp Asp Asp Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cagtcagcta gccgccatgg actacaagga cgacgatgac caagttgact gatgaaaagg

\hfill

60

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tg

\hfill

62

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211>19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccagaagggg tacttttcc

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cattgtcctg aggctgtgg

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 477

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

33

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 755

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

35

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gttagatgag aggttgctgg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtatgctaat cccag

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caactcgaat tccttgacag attagcatac

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caactcgaat tccttgac

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gttgttcttc ctcttcagcc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caactcgaat tccttgacag a

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripci6n de secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatcgtcgac ctgtetctgc actaacac

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: iniciador

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatcgtcgac aagcactcgg tcagccttcg

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatcggatcc accatggact acaagg

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

Claims

1. Polipéptido PDE8 que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 2.

2. Polipéptido PDE8 que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 4.

3. Polipéptido PDE8 que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 6.

4. Polinucleótido que codifica el polipéptido según las reivindicaciones 1, 2 o 3.

5. El polinucleótido según la reivindicación 4 que comprende la secuencia indicada en SEQ ID NO. 1.

6. El polinucleótido según la reivindicación 4 que comprende la secuencia indicada en SEQ ID NO. 3.

7. El polinucleótido según la reivindicación 4 que comprende la secuencia indicada en SEQ ID NO. 5.

8. Polinucleótido que codifica un polipéptido PDE8 humano elegido dentro del grupo formado por:

a): el polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7; y

b): un ADN que hibrida en condiciones moderadamente rigurosas para formar el complemento del núcleotido de (a), comprendiendo dichas condiciones moderadamente rigorosas un lavado final a 65°C en 2 x SSC y 0,1% SDS.

9. El polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, que es una molécula de ADN.

10. El polinucleótido de la reivindicación 9, en el que el ADN es una molécula de cADN.

11. El polinucleótido de la reivindicación 9, en el que el ADN es una molécula de ADN genómico.

12. El polinucleótido de la reivindicación 9, en el que el ADN es una molécula de ADN total o parcialmente sintetizada químicamente.

13. Un polinucleótido antisentido que hibrida específicamente con el polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8.

14. Un constructo de expresión que comprende el polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8.

15. Una célula anfitriona transformada o transfectada con el polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8 o el constructo de expresión de la reivindicación 14.

16. Método para producir un polipéptido PDE8 que comprende las siguientes etapas:

a): cultivar la célula anfitriona según la reivindicación 15 en condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido PDE8 y

b): aislar e polipéptido PDE8 de la célula anfitriona de su medio de cultivo.

17. Anticuerpo específicamente inmunoreactivo con el polipéptido según la reivindicación 1, 2 o 3.

18. El anticuerpo según la reivindicación 17, que es un anticuerpo monoclonal.

19. Un hibridoma que segrega el anticuerpo según la reivindicación 18.

20. Un anticuerpo anti-idiotipo específicamente inmunoreactivo con el anticuerpo según la reivindicación 17.

21. Método para identificar un compuesto elemento de fijación específico de un polipéptido PDE8 que comprende las siguientes etapas:

a): poner en contacto el polipéptido PDE8 de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 con un compuesto en condiciones que permitan la fijación entre el compuesto y el polipéptido PDE8;

b): detectar la fijación del compuesto en el polipéptido PDE8; e

c): identificar el compuesto como un elemento de fijación específico del polipéptido PDE8.

\newpage

22. El método según la reivindicación 21, en el que, en la etapa b), se detecta la modulación de la actividad del polipéptido PDE8.

23. El método según la reivindicación 22, en el que, en la etapa b), se detecta la inhibición de la actividad del polipéptido PDE8.

24. El método según la reivindicación 22, en el que, en la etapa b), se detecta la potenciación de la actividad del polipéptido PDE8.

25. Método para identificar un compuesto-elemento de fijación específico de un polinucleótido PDE8, que comprende las siguientes etapas:

a): poner en contacto el polinucleótido PDE8 de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8 con un compuesto en condiciones que permitan la fijación entre el compuesto y el polinucleótido PDE8;

b): detectar la fijación del compuesto en el polinucleótido PDE8; e

c): identificar el compuesto como un elemento de fijación específico del polinucleótido PDE8.

26. El método según la reivindicación 25 en el que, en la etapa b), se detecta la modulación de expresión de un polipéptido PDE8 codificado por el polinucleótido PDE8.

27. El método según la reivindicación 26, en el que, en la etapa b), se detecta la inhibición de la expresión del polipéptido PDE8.

28. El método según la reivindicación 26, en el que, en la etapa b), se detecta la potenciación de la expresión del polipéptido PDE8.