ES2245824T3

ES2245824T3 - Nuevo proceso de separacion de proteinas utilizando un eluyente que contiene ca++.

Info

Publication number: ES2245824T3
Application number: ES99913118T
Authority: ES
Inventors: Are Bogsnes
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1998-04-15
Filing date: 1999-04-13
Publication date: 2006-01-16
Anticipated expiration: 2019-04-13
Also published as: AU3137699A; EP1071703A1; DE69926226D1; US20040077527A1; DE69926226T2; ATE299889T1; EP1071703B1; WO1999052934A1; US6180757B1; JP2002511484A

Abstract

Proceso de separación de proteínas glicosiladas de proteínas no glicosiladas sometiendo una solución que comprende proteínas glicosiladas y no glicosiladas a una cromatografía utilizando un eluyente que contiene Ca++, y obteniendo una fracción que comprende proteínas no glicosiladas, dicha fracción estando esencialmente libre de proteínas glicosiladas.

Description

Nuevo proceso de separación de proteínas utilizando un eluyente que contiene Ca^{++}.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al proceso de separación por cromatografía de proteínas glicosiladas o de precursores de proteínas a partir de proteínas no glicosiladas o precursores de proteínas usando un eluyente que contiene Ca^{++}.

Antecedentes y descripción de la invención

En la producción de proteínas o de precursores de proteínas la separación de las proteínas glicosiladas de las proteínas no glicosiladas representa un campo independiente de investigación. Las implicaciones industriales de la presente invención se refieren a la optimización de la purificación de proteínas. El propósito de la purificación optimizada consiste en conseguir un producto final de uso comercial que comprenda proteínas no glicosiladas, esencialmente libres de proteínas glicosiladas.

Las proteínas o precursores de proteínas se pueden producir a partir de sistemas de expresión de levadura. Se ha observado una correlación entre un nivel elevado de expresión y un aumento de los precursores de proteínas glicosiladas. Como consecuencia resulta todavía más evidente la necesidad de un proceso más eficiente de separación de las proteínas no glicosiladas de las proteínas glicosiladas.

En el sistema de expresión de la levadura un organismo de levadura produce proteínas o precursores de proteínas sintetizadas intracelularmente. El microorganismo huésped de levadura es transformado por un vehículo de expresión que incluye ADN que codifica la proteína deseada. El proceso comprende la preparación de un cultivo del organismo huésped de levadura transformado, el crecimiento del cultivo y la recuperación de la proteína del medio de cultivo.

La recuperación según la técnica precedente de la proteína deseada comprendía varias fases de purificación utilizando el proceso de cromatografía, tal como la cromatografía de intercambio fónico que incluía un eluyente con un contenido de sal. Usando el método de cromatografía líquida de alto rendimiento en fase inversa (RP-HPLC) se puede llevar a cabo el procedimiento de separación de las proteínas no glicosiladas de las proteínas glicosiladas. El eluyente utilizado para la elución de las muestras de la prueba es preferiblemente un solvente orgánico con un contenido de sal, tal como el KCl. Aunque se han aplicado varias sales al solvente orgánico en la técnica precedente el efecto de un eluyente que contiene Ca^{++} no ha sido nunca descrito. La patente US-A-3.649.456 y US-A- 5.633.350 describe el uso de un eluyente que contiene Ca^{++} en separaciones cromatográficas de proteínas. No obstante, ninguno de estos documentos trata la separación de las proteínas glicosiladas.

En el presente contexto el término eluyente es sinónimo del tampón utilizado para la elución. La presente invención proporciona una purificación mejorada de las proteínas glicosiladas usando un eluyente que contiene Ca^{++}.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona un proceso mejorado de separación de las proteínas glicosiladas de las proteínas no glicosiladas En consecuencia la presente invención se refiere a un proceso de separación de las proteínas glicosiladas de las proteínas no glicosiladas mediante una solución que comprende proteínas glicosiladas y no glicosiladas sometida a una RP-HPLC (cromatografía líquida de alto rendimiento en fase inversa) usando un eluyente que contiene Ca^{++}, y a la obtención de una fracción que comprende proteínas no glicosiladas, dicha fracción está esencialmente libre de proteínas glicosiladas.

En la presente invención el término proteína se refiere a todas las proteínas o precursores de proteínas y el término proteínas glicosiladas incluye las proteínas glicosiladas o los precursores de proteínas. En una forma de realización preferida la proteína es insulina o un análogo o un precursor de ésta.

Otro objetivo de la presente invención es una fracción que se puede obtener usando el proceso según la invención, que comprende proteínas no glicosiladas esencialmente libres de proteínas glicosiladas.

Descripción detallada de la invención

Las proteínas o precursores de proteínas y análogos de éstos pueden producirse a partir de sistemas de expresión de levadura. En el proceso de fabricación de las proteínas o de los precursores de proteínas es habitual el uso de la purificación cromatográfica. Las proteínas o los precursores de proteínas son a menudo sometidos a modificaciones químicas y a una serie de fases de purificación cromatográfica, tal como la RP-HPLC, cromatografía de interacción hidrófoba y de intercambio iónico. La presente invención se refiere a una fase de purificación en la que el uso de la cromatografía en la separación de las proteínas glicosiladas de las proteínas no glicosiladas ha demostrado ser particularmente adecuado. El proceso comprende la aplicación a una solución que comprende proteínas glicosiladas y no glicosiladas de una cromatografía usando un eluyente que contiene Ca^{++}, y obteniendo así una fracción que comprende proteínas no glicosiladas, dicha fracción estando esencialmente libre de proteínas glicosiladas.

El principio de purificación de la proteína utilizando una cromatografía de columna se basa en las diferencias de equilibrio entre la fase fija y la móvil de las proteínas que deben ser separadas. Mediante el uso de una combinación apropiada de las fases fija y móvil, las proteínas saldrán de la columna en intervalos distintos.

El método de cromatografía puede ser cualquier método de cromatografía de columna, preferiblemente RP-HPLC, o cromatografía de interacción hidrófoba.

En la presente invención la ventaja reside en la pureza aumentada de la fracción de proteínas no glicosiladas. La fracción de proteínas glicosiladas puede consistir en proteínas monoglicosiladas y proteínas poliglicosiladas. La presente invención proporciona unos medios para la mejora de la separación de las proteínas glicosiladas, como las proteínas monoglicosiladas y las proteínas poliglicosiladas, de las proteínas no glicosiladas.

Otro aspecto de la presente invención consiste en obtener una fracción adicional que comprende proteínas glicosiladas y esencialmente ninguna proteína no glicosilada.

En función de la composición del material precursor las proteínas glicosiladas pueden ser monoglicosiladas, o al menos una parte de las proteínas glicosiladas pueden ser diglicosiladas, o al menos una parte de las proteínas glicosiladas pueden ser poliglicosiladas.

En comparación con otros métodos de cromatografía, en los que no se utiliza ningún eluyente que contenga Ca^{++}, la presente invención conserva la ventaja de una mayor productividad debido a una carga de columna aumentada de aproximadamente el 50%. La eficiencia de la purificación está influenciada por el ligando y por el tamaño de partícula del poro de la matriz. El tamaño de la partícula del poro puede variar según la naturaleza de la proteína que debe ser purificada. Cuando la proteína es insulina o un análogo de ésta la matriz de columna óptima es 200 \ring{A} y la columna puede estar cargada hasta 150 - 250 mg/cm^{2} cuando el material precursor pertenece a la composición descrita a continuación, y la longitud de la columna utilizada es tal como se describe a continuación.

La temperatura de la columna puede ser de 10-30ºC, preferiblemente de 18-25ºC. Cualquier temperatura, inferior a la gama de temperatura preferida puede llevar a un aumento de los costes de la purificación por un retraso del proceso.

Usando los métodos para la purificación de proteínas no glicosiladas descritos por la técnica anterior, todavía no se puede conseguir una fracción sustancialmente libre de proteínas glicosiladas manteniendo al mismo tiempo esta productividad elevada. No obstante la introducción de la presente invención ha mejorado el proceso de purificación de forma evidente, y la fracción final que comprende proteínas no glicosiladas está esencialmente libre de proteínas glicosiladas.

Usando los medios de la presente invención se puede obtener una fracción que comprende proteínas no glicosiladas, dicha fracción estando esencialmente libre de proteínas glicosiladas, al mismo tiempo que el nivel de productividad de dicha fracción aumenta.

La presente invención ha demostrado ser particularmente ventajosa para la separación de insulinas glicosiladas de las insulinas no glicosiladas. Preferiblemente, la concentración de insulinas glicosiladas en la fracción de insulina no glicosilada es inferior al 0.2%, y también inferior al 0.1%. Esto supone una reducción de aproximadamente diez veces en la concentración de insulinas glicosiladas del material precursor.

El material precursor para la separación o la purificación puede ser cualquier solución proteínica que comprenda proteínas glicosiladas y no glicosiladas. El material precursor puede ser el medio obtenido directamente a partir de los sistemas de expresión de levadura, o bien, el material precursor puede estar sujeto a diversas etapas de purificación o de modificación química antes de la separación según la invención.

Sin limitarse en la teoría, en general se considera que la interacción de las proteínas con Ca^{++} produce un cambio en la hidrofobicidad de las proteínas. Se cree que el cambio diferencial de la hidrofobicidad producido por unas diferencias moleculares menores, tales como el azúcar o los grupos estéricos, constituye el núcleo del principio para la separación de las proteínas glicosiladas de las proteínas no glicosiladas o por otro lado de proteínas modificadas. El grado en el que el cambian las proteínas durante la hidrofobicidad en presencia de Ca^{++} depende de la naturaleza de la proteína, como por ejemplo la presencia de grupos glicosilo y/o estéricos.

De esta manera, el método según la presente invención puede ser utilizado para separar cualquier variante de proteínas, en el que la hidrofobicidad de las variantes cambia en función de la adición de Ca^{++} en el eluyente.

La aplicación de Ca^{++} a un eluyente orgánico a base de solvente mejora en gran medida la separación de las proteínas glicosiladas de las proteínas no glicosiladas en comparación con la de un eluyente que comprende K^{+} o Na^{+} o NH_{4}^{+} sólo o en combinación. Este hecho se debe al efecto selectivo del Ca^{++} con el aumento de la hidrofobicidad de proteínas no glicosiladas. Además de iones Ca^{++} el eluyente puede comprender cationes tales como K^{+} y/o Na^{+} y/o iones NH4^{+}. Los iones Ca^{++} pueden estar proporcionados mediante cualquier fuente adecuada, como por ejemplo CaCl_{2}.

\newpage

El inventor de la presente ha descubierto que la combinación de iones Ca^{++} y K^{+} en el eluyente mejora las propiedades cromatográficas. En la presente invención la composición preferida del eluyente es una mezcla de KCl y CaCl_{2} donde la concentración de Ca^{++} en el eluyente es inferior a 300 mM, así como inferior a 200 mM, preferiblemente inferior a aproximadamente 100 mM, más preferiblemente aproximadamente entre 5-50 mM, y una concentración de K^{+} de 100-300 mM, como por ejemplo aproximadamente 200 mM. En la concentración indicada, la concentración de KCl en el eluyente varía y excede preferiblemente la concentración de eluyentes de CaCl_{2}.

Cuando los iones Na^{+} y/o NH_{4}^{+} están presentes, la concentración de Na^{+} y/o de NH_{4}^{+} en el eluyente es de 100-300 mM, como por ejemplo aproximadamente 200 mM.

El valor del pH preferido de los eluyentes es superior al punto isoeléctrico de la proteína, y a sus análogos, que deben ser separados. Con respecto a la insulina, muchas insulinas presentan un punto isoeléctrico no inferior a un pH 5.0.

En la presente invención el volumen de retención se sitúa entre 5 y 10 CV (volumen de columna) en una elución isocrática.

El eluyente puede en principio comprender cualquier solvente orgánico. El solvente orgánico puede ser etanol, metanol, isopropanol o acetonitrilo. En la presente invención el solvente orgánico preferido es el etanol y tiene una concentración situada en la gama del 20-30% en peso.

La invención se refiere también a una fracción que se puede obtener utilizando el proceso según la invención que comprende proteínas no glicosiladas, donde la fracción está esencialmente libre de proteínas glicosiladas. La invención se utiliza de manera ventajosa para la separación de insulinas, donde la fracción puede tener una concentración de insulinas glicosiladas inferior al 0.2% en peso/volumen.

Las proteínas no glicosiladas purificadas, en particular las insulinas, pueden tener una aplicación en cualquier campo técnico, como el campo médico, como por ejemplo en el tratamiento de la diabetes.

Experimentaciones

El texto siguiente es una descripción de los experimentos realizados para mejorar la separación de las insulinas no glicosiladas de las insulinas glicosiladas. Usando un eluyente que contiene iones Ca^{++} se descubrió que la separación mejoró mucho, y que se consiguió un producto final más puro de insulinas no glicosiladas.

Materiales y métodos Métodos generales

Todos los experimentos fueron realizados en depósitos que contenían formas glicosiladas y no glicosiladas del análogo de insulina X14 o del análogo de insulina DesB30. El X14 posee las mismas cadenas a y b que la insulina humana, la única diferencia es la sustitución en la posición b28 de la prolina en la insulina humana por ácido aspártico en el X14. El DesB30 posee las mismas cadenas a y b que la insulina humana, la única diferencia es la falta de treonina en la posición b30. Todos los porcentajes están proporcionados en % en peso.

Los ejemplos 1-3 fueron realizados con X14, y el ejemplo 4 con DesB30.

Análisis

Unos depósitos seleccionados fueron fraccionados y analizados en RP-HPLC. Los depósitos fueron analizados para el producto principal así como para las variantes glicosiladas. Unas fracciones de X14 fueron analizadas también para el etilester.

Cromatografía

La cromatografía se realizó en un sistema BioCAD HPLC de PerSeptive Biosystems equipado con una celda de flujo de 6 o 3 mm. Los datos siguientes fueron constantes para todos los experimentos, excepto cuando se especifica como una variable en un experimento:

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Matriz	Partículas de fase inversa FD* 200\ring{A} C18 15 \muM
Temperatura	25°C
Columna	250 mm x I.D. 10mm (0.785 cm^{2}), volumen de columna = 19.6 ml
Flujo	2.5 cm/min
Tampón de regeneración	70% de etanol + 1 M de Ácido acético
*FD: Fuji Davison

Composición de tampón Condiciones experimentales generales

Todos los productos químicos utilizados en forma de tampones presentaban un grado analítico. El agua era de calidad WFI (agua de inyección). Todos los tampones fueron regulados a pH 7.0 con HCl.

Parámetros del proceso:
Funcionamiento de la columna
Equilibrado	16% de etanol	5 CV *
Aplicación		variable
Lavado	16% de etanol	1 CV
Elución		<12 CV
Regeneración		5 CV
* (CV = volumen de columna)

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 1 Purificación con sistemas de tampón que contienen CaCl_{2}

Parámetros de la prueba:
Eluyente	Elución [EtOH]	Carga (mg/cm^{2})	Figura. N°
2.5 g/kg de Tris,	28%	30	3
100 mM de CaCl_{2}
2.5 g/kg de Tris,	Aprox. 29%	30	4
50 mM de CaCl_{2}

Resultados y discusión

El CaCl_{2} era extremadamente diferente de cualquier otra sal sometida a la prueba (ver el Ejemplo 2 como comparación). Con 100 mM, el valor máximo que representaba las formas glicosiladas X14 era casi una línea de base separada. El valor máximo del X14 era grande y presentaba una pendiente del lado anterior muy ligera, mientras que el lado posterior en cambio, presentaba una pendiente muy empinada. En el recorrido de 50 mM la concentración de etanol durante el recorrido fue regulada manualmente, y por lo tanto no se puede comparar directamente, pero sin embargo, ésta indica un resultado muy similar.

Se comprobó que la hidrofobicidad de X14 aumentaba de forma selectiva por el CaCl_{2}, demostrado por la alta concentración de etanol necesaria para la elución de X14 en comparación con el KCl solo (ver Ejemplo 2 como comparación). Las formas glicosiladas de X14 y el etilester parecen estar menos alteradas por el CaCl_{2}.

De esta manera, los experimentos muestran que los tampones de CaCl_{2} aumentan de manera selectiva la hidrofobicidad de X14, dando como resultado una separación completa de las formas glicosiladas de X14.

Ejemplo 2

(Comparación)

Purificación con sistemas de tampón que contienen KCl

Estas pruebas fueron realizadas para mostrar el perfil de purificación de los procesos mediante el uso de KCl sin CaCl_{2}.

Parámetros de la prueba:
Eluyente	Elución [EtOH]	Carga (mg/cm^{2})	Figura. N°
10 mM Bis-tris,	26.6%	30	5
50 mM KCl
10 mM Bis-tris,	26.6%	30	6
200 mM KCl

Resultados y discusión

Con una concentración de 50 mM de KCl el lado anterior del valor máximo de la elución empezaba con una pendiente empinada seguida de una pendiente aún más empinada. Esto indicaba la presencia de unos valores máximos de la elución más próximos y más pequeños. El aumento de la concentración de KCl a 200 mM mejoró la separación pero no el nivel de separación utilizando un eluyente que contenía Ca^{++}. Estas observaciones fueron confirmadas mediante un análisis de las fracciones.

Ejemplo 3 Purificación con sistemas de tampón que contienen KCl y CaCl_{2} combinados

Estas pruebas se realizaron para examinar la influencia de un sistema de tampón que combina KCl y CaCl_{2} en la separación simultánea de etilester y de formas glicosiladas de X14.

Prueba 1

Parámetros de la prueba:
Eluyente	Elución [EtOH]	Carga (mg/cm^{2})	Figura. N°
2.5 g/kg Tris, 25 mM CaCl_{2},	28%	30	7
100 mM KCl
2:5 g/kg Tris, 12.5 mM CaCl_{2},	28%	30	8
150 mM KCl

Resultados y discusión 1

Una mezcla de KCl y de CaCl_{2} (100/25 mM) produjo una separación mejor del etilester que con tampones de CaCl_{2} solo. La combinación 150/12.5 mM proporcionaba una separación aún mejor del etilester. No obstante, al mismo tiempo el valor máximo que representaba las formas glicosiladas de X14 estaba menos separado, pero mucho mejor que con KCl solo. El aumento lento de la pendiente del lado anterior fue menos pronunciado.

Los experimentos muestran que KCl y CaCl_{2} son componentes de tampón importantes. Los experimentos muestran que la presencia de Ca^{++} en el tampón mejora mucho el proceso de purificación. El aumento de las concentraciones de Ca^{2+} aumentó de manera selectiva la hidrofobicidad de X14 si se compara con el etilester y las formas glicosiladas de X14.

\newpage

Prueba 2

Este experimento se realizó como en la prueba 1 excepto para los parámetros siguientes cambiados: 180 mM KCl y 5 mM CaCl_{2}, 27.4% de etanol (elución) y la carga era de 150 mg/cm^{2}. El perfil del conjunto fue examinado antes y después de la purificación.

Resultados y discusión 2

Mediante esta purificación se puede obtener una fracción de X14 no glicosilado esencialmente libre de X14 glicosilado. Según se ha indicado, el contenido de X14 en el conjunto era de 89.98%. Aquí se ha demostrado que el contenido de X14 aumentaba hasta 98.38% después de la purificación, y el contenido de X14 monoglicosilado disminuía de forma significativa de 0.50% a 0.02%.

Ejemplo 4 Purificación de DesB30 utilizando sistemas de tampón con o sin CaCl_{2}

Se realizaron estas pruebas para demostrar el efecto de Ca^{++} sobre el perfil de elución del análogo de insulina DesB30. Todos los experimentos fueron realizados con pH: 7.2. Se utilizaron los datos siguientes:

\vskip1.000000\baselineskip

Matriz	Partículas de fase inversa FD* 200\ring{A} C18 15 \muM
Temperatura	22°C
Columna	250 mm x I.D. 10Mm (0.785 cm^{2}, volumen de columna = 19.6 ml
Flujo	3.0 cm/min
Tampón de regeneración	equilibrado con 16% de etanol, 0.1 M de Ácido cítrico
*FD: Fuji Davison

Parámetros del proceso

Funcionamiento de la columna
Equilibrado	16% de etanol	2.5 CV*
Aplicación		variable
Lavado	16% de etanol	1 CV
Elución		<12 CV
Regeneración		2 CV
*(CV = volumen de columna)

Prueba 1

Parámetros de la prueba:
Eluyente	Elución [EtOH]	Carga (mg/cm^{2})	Figura N°
15 mM Tris, 5 mM ácido maleico,	27%	190	9
0 mM CaCl_{2}. 200 mM KCl
15 mM Tris, 5 mM ácido maleico,	27%	190	9
20 mM CaCl_{2}, 200 mM KCl

\newpage

La diferencia entre el perfil de elución de DesB30 cuando se utiliza un eluyente que contiene 20 mM de CaCl_{2} comparado con el uso de un eluyente que no contiene CaCl_{2} muestra que cuando el Ca^{++} está presente en el eluyente, la separación de la insulina no glicosilada de la insulina glicosilada es mejorada.

Prueba 2

Parámetros de la prueba:
Eluyente	Elución [EtOH]	Carga (mg/cm^{2})	Figura N°
15 mM Tris, 5 mM de ácido maleico,	26.8%	190	10
0 mM CaCl_{2}. 200 mM KCl
15 mM Tris, 5 mM de ácido maleico,	27.8%	190	10
20 mM CaCl_{2}, 200 mM de KCl

En comparación con la prueba 1 se cambió la concentración de etanol (elución) para obtener una retención similar.

El contenido del conjunto fue examinado antes y después de la elución. Antes de la elución había un 1.22% de DesB30 monoglicosilado en el conjunto de elución. Después de la purificación utilizando un eluyente que contenía Ca^{++} la cantidad de DesB30 monoglicosilado se redujo aproximadamente cinco veces menos hasta un 0.21%. Cuando se compara con el 1.10% de DesB30 monoglicosilado dejado después de la elución utilizando un eluyente que no contenía Ca^{++}, es evidente que cuando el Ca^{++} está presente en el eluyente la separación de la insulina no glicosilada de la insulina glicosilada mejora.

Claims

1. Proceso de separación de proteínas glicosiladas de proteínas no glicosiladas sometiendo una solución que comprende proteínas glicosiladas y no glicosiladas a una cromatografía utilizando un eluyente que contiene Ca^{++}, y obteniendo una fracción que comprende proteínas no glicosiladas, dicha fracción estando esencialmente libre de proteínas glicosiladas.

2. Proceso según la reivindicación 1, en el que la forma de cromatografía es RP-HPLC (cromatografía líquida de alto rendimiento en fase inversa).

3. Proceso según la reivindicación 1 o 2, en el que se obtiene una fracción adicional que comprende proteínas glicosiladas, y dicha fracción está esencialmente libre de proteínas no glicosiladas.

4. Proceso según la reivindicación 1, 2 y 3, en el que las proteínas glicosiladas son monoglicosiladas.

5. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que al menos una parte de las proteínas glicosiladas son poliglicosiladas.

6. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la proteína es insulina o un análogo de insulina.

7. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el eluyente comprende cationes, tales como NH_{4}^{+} y/o K^{+} y/o Na^{+}.

8. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el eluyente comprende CaCl_{2} o acetato de calcio.

9. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la concentración de Ca^{++} en el eluyente es inferior a 300 mM, como por ejemplo inferior a 200 mM, preferiblemente inferior a 100 mM, más preferiblemente de 5-50 mM.

10. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la concentración de NH_{4}^{+} en el eluyente es de 100-300, como por ejemplo aproximadamente 200 mM.

11. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la concentración de K^{+} en el eluyente es de 100-300 mM, como por ejemplo aproximadamente 200 mM.

12. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la concentración de Na^{+} en el eluyente es de 100-300 mM, como por ejemplo aproximadamente 200 mM.

13. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el eluyente tiene un valor de pH superior al punto isoeléctrico para las proteínas o los precursores de proteínas.

14. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la temperatura es de 10-30°C, preferiblemente de 18-25°C.

15. Proceso según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el eluyente comprende un solvente orgánico.

16. Proceso según la reivindicación 15, en el que el solvente orgánico está seleccionado entre etanol, metanol, isopropanol, y acetonitrilo.

17. Proceso según la reivindicación 16, en el que el eluyente tiene una concentración de etanol del 20-30% en peso

18. Composición que comprende insulina recombinante, no glicosilada, o un derivado análogo, en la que la composición está esencialmente libre de proteínas glicosiladas e incluye insulina glicosilada, y en la que la concentración de insulina glicosilada es inferior al 0.2% en peso/volumen.

19. Composición según la reivindicación 18, en la que la insulina no glicosilada, recombinante, o un derivado análogo, es producido en un sistema de expresión de levadura.

20. Composición según las reivindicaciones 18-19, en la que la concentración de insulina glicosilada es inferior al 0.1% en peso/volumen.

21. Composición según la reivindicación 18, en la que el análogo de insulina es X14.

22. Composición según la reivindicación 18, en la que el análogo de insulina es DesB30.

23. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22, en la que la composición puede ser obtenida por el proceso según se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17.