ES2341270T3 - Complejos rhigf-i/rhigfbp-3 purificados y procedimientos de fabricacion de los mismos. - Google Patents
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Abstract
Una proteína aislada que comprende un complejo de factor de crecimiento semejante a insulina I (IGF-I) y proteína 3 de unión al factor de crecimiento semejante a insulina (IGFBP-3), teniendo dicha proteína una pureza de al menos un 96% como se mide por CM-HPLC analítica.
Description
Complejos
rhIGF-I/rhIGFBP-3 purificados y
procedimiento de fabricación de los mismos.
La presente invención se refiere a composiciones
que comprenden complejos ultrapuros de factor de crecimiento
semejante a insulina I y proteína-3 de unión a
factor de crecimiento semejante a insulina, y a procedimientos para
fabricarlas.
IGF-I/IGFBP-3 es
un complejo proteico de factor de crecimiento semejante a
insulina-I ("IGF-I") y
proteína-3 de unión a factor de crecimiento
semejante a insulina ("IGFBP-3").
IGF-I es un pequeño polipéptido con fuerte
homología estructural y funcional con la
pro-insulina. Como tal, el IGF-I
induce muchos de los efectos fisiológicos de la insulina.
Pueden usarse complejos
IGF-I/IGFBP-3 para el tratamiento de
una amplia serie de trastornos (véanse, por ejemplo, las patentes
de Estados Unidos Nº 5.681.818, 5.723.441, 5.948.757, 6.015.786,
6.017.885, 6.025.332, 6.025.368, 6.514.937 y 6.518.238). En
individuos sanos, el IGF-I puede encontrarse dentro
de la circulación sanguínea unido a otras proteínas. Por ejemplo,
el IGF-I se encuentra con frecuencia unido a
IGFBP-3, la proteína de unión a
IGF-I más abundante. El complejo
IGF-I/IGFBP-3 se asocia con una
proteína de subunidad susceptible a ácidos, formando un complejo de
150 kD. Véase Adams y col., Prog. Growth Factor Res.
6(2-4):347-56 (1995). Este
complejo ternario grande sirve como reservorio circulatorio de
IGF-I ya que los complejos
IGF-I/IGFBP-3 presentan una mayor
semivida y mejor estabilidad que el IGF-I libre.
Véase Adams y col., supra, y Blum y col. (1991), Plasma
IGFBP-3 Levels as Clinical Indicators, en Modern
Concepts of Insulin-like Growth Factors, pág.
381-93, E.M. Spencer, ed., Elsevier, New York.
IGF-I, IGFBP-3 y
los complejos IGF-I/IGFBP-3 pueden
obtenerse a partir de fuentes naturales o por técnicas
recombinantes. Puede usarse tecnología recombinante para producir
IGF-I, IGFBP-3 y complejos
IGF-I/IGFBP-3 en organismos
eucariotas y procariotas (véanse, por ejemplo, las patentes de
Estados Unidos Nº 5.200.509, 5.670.341, 5.789.547 y 6.417.330).
IGF-I, IGFBP-3 y los complejos
IGF-I/IGFBP-3 recombinantes pueden
cultivarse en formatos discontinuos o continuos, recogiéndose el
sobrenadante de cultivo celular o las propias células
recombinantes.
IGF-I, IGFBP-3 y
los complejos IGF-I/IGFBP-3
típicamente se purifican después de la expresión en sistemas
recombinantes usando técnicas tales como cromatografía de exclusión
molecular, cromatografía de interacción hidrófoba y cromatografía
de intercambio iónico. Sin embargo, estas técnicas no pueden
eliminar todas las impurezas. Por ejemplo, los complejos
IGF-I/IGFBP-3 típicamente están
presentes en preparaciones parcialmente purificadas que contienen
agregados de proteína. Además, se han descubierto nuevas impurezas
tales como variantes de masa y de carga de IGFBP-3
que no se eliminan por procedimientos de la técnica anterior. La
Figura 1 proporciona un gráfico de intercambio catiónico obtenido a
partir de la cromatografía de intercambio iónico con carboximetilo
("CM-IEX") en gradiente lineal de muestras que
comprenden complejos IGF-I/IGFBP-3 y
agregados de proteína. La Figura 2 proporciona un análisis de CL/EM
de complejos IGF-I/IGFBP-3
purificados usando CM-IEX de gradiente lineal que
muestra variantes de masa y de carga descubiertas recientemente. La
Patente de Estados Unidos Nº 5.789.547 describe un procedimiento
para replegar el factor de crecimiento semejante a insulina I
(IGF-I) y la proteína de unión a factor de
crecimiento semejante a insulina 3 (IGFBP-3). El
procedimiento descrito incluye el co-plegamiento de
las dos proteínas purificadas y desnaturalizadas, expresadas por
separado, para solucionar problemas relacionados con la expresión
recombinante, es decir, un mal plegamiento y una baja solubilidad.
La Patente de Estados Unidos Nº 6.417.330 se refiere a variantes de
IGFBP, particularmente a variantes de IGFBP-3 que
son resistentes a la hidrólisis, tienen secuencias de localización
nuclear alteradas o tienen extensiones
N-terminales. Las variantes de proteínas se obtienen
por expresión recombinante y purificación por cromatografía de
intercambio catiónico y se describe que puede ayudarse al
plegamiento correcto de estas proteínas por una reacción de
co-plegamiento con IGF.
En las técnicas farmacéuticas está bien
establecido que es muy deseada la pureza de un fármaco y que incluso
pequeñas mejoras en la pureza del fármaco son mejoras importantes.
Esto se debe al hecho de que las impurezas pueden tener un impacto
imprevisto sobre la estabilidad, seguridad o eficacia del fármaco.
Por consiguiente, son intrínsecamente útiles y se necesitan
procedimientos mejorados para purificar complejos
IGF-I/IGFBP-3.
En una realización, la presente invención se
refiere a una proteína aislada que comprende un complejo de factor
de crecimiento semejante a insulina I ("IGF-I")
y proteína de unión a factor de crecimiento semejante a insulina 3
("IGFBP-3"), teniendo la proteína aislada una
pureza de al menos el 96%, una pureza de al menos el 97%, una
pureza de al menos el 98% o una pureza de al menos el 99%, como se
mide por CM-HPLC analítica.
En una realización, el complejo comprende
IGF-I e IGFBP-3 en una relación
molar de aproximadamente 0,8:1 a aproximadamente 1,2:1. En otra
realización, la relación molar es aproximadamente 1:1.
También se proporcionan composiciones
farmacéuticas que comprenden una proteína aislada que comprende un
complejo de IGF-I e IGFBP-3 y un
vehículo farmacéuticamente aceptable, teniendo la proteína una
pureza de al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al
menos el 99% como se mide por CM-HPLC analítica.
Se proporcionan procedimientos para purificar un
complejo de IGF-I e IGFBP-3 que
comprenden obtener un complejo de IGF-I e
GFBP-3, purificar parcialmente el complejo
IGF-I/IGFBP-3, adsorber el complejo
en una fase estacionaria, desorber el complejo usando una
multiplicidad de fases móviles, comprendiendo las fases móviles una
serie de fuerzas iónicas secuencialmente crecientes, y recuperar el
complejo de IGF-I e IGFBP-3
purificado. En una realización, la fase estacionaria es una resina
de intercambio catiónico. En otra realización, la resina de
intercambio catiónico contiene grupos carboximetilo funcionales. El
complejo rhIGF-I/rhIGFBP-3 es un
complejo proteico cargado, pero pueden producirse modificaciones
sutiles en el complejo proteico que reducen la carga del complejo
en 1 a 5 unidades positivas. Esto puede conseguirse por
neutralización de una o más cargas positivas o por introducción de
una o más cargas negativas. Los ejemplos de modificaciones que
pueden cambiar la carga total en una manera de carga positiva
incluyen, pero sin limitación, conjugación de amina
N-terminal, conjugado de lisina, conjugación con
arginina y desamidación. Al establecer dos condiciones tamponantes
isocráticas, se puede separar el complejo
rhIGF-I/rhIGFBP-3 nativo de un
complejo rhIGF-I/rhIGFBP-3 de carga
positiva reducida. El primer tampón isocrático tiene una fuerza
iónica suficiente para desorber el complejo
rhIGF-I/rhIGFBP-3 de carga positiva
reducida mientras que queda retenido el complejo
rhIGF-I/rhIGFBP-3 nativo. El segundo
tampón isocrático tiene una fuerza iónica suficiente para desorber
el complejo rhIGF-I/rhIGFBP-3 nativo
mientras que retiene otras impurezas tales como agregados de
rhIGF-I/rhIGFBP-3 y formas mal
plegadas de rhIGFBP-3. La Figura 6 representa dos
separaciones, usando la figura superior una resina preparativa y
usando la inferior una resina analítica. La identidad de los
componentes se indica encima del gráfico UV para los picos. Como
alternativa, el procedimiento puede realizarse con un solo tampón
que desorbe tanto el complejo
rhIGF-I/rhIGFBP-3 de carga positiva
reducida y el complejo
rhIGF-I/rhIGFBP-3 nativo,
consiguiéndose la separación durante el único tampón isocrático.
Este procedimiento generalmente se usa para análisis analítico y
generalmente no se usa para análisis preparativo debido al gran
volumen de tampón que se necesita para conseguir la separación.
Puede realizarse otro procedimiento alternativo con un primer tampón
isocrático para desorber el complejo
rhIGF-I/rhIGFBP-3 de carga positiva
reducida seguido de un gradiente de fuerzas iónicas crecientes para
eluir el complejo rhIGF-I/rhIGFBP-3
nativo y otras impurezas.
Se proporcionan procedimientos en los que la
multiplicidad de fases móviles comprende una primera fase móvil y
una segunda fase móvil. La primera fase móvil puede tener una
concentración de NaCl al menos aproximadamente 20 mM menor que la
segunda fase móvil, al menos aproximadamente 30 mM menor que la
segunda fase móvil, o al menos aproximadamente 40 mM menor que la
segunda fase móvil, o al menos aproximadamente 50 mM menor que la
segunda fase móvil, o al menos aproximadamente 60 mM menor que la
segunda fase móvil. En otra realización, la primera fase móvil
comprende NaCl de aproximadamente 160 mM a aproximadamente 185 mM y
la segunda fase móvil comprende NaCl de aproximadamente 200 mM a
aproximadamente 250 mM. La segunda fase móvil también puede
comprender NaCl aproximadamente 225 mM. La elección de la fase móvil
se basa en gran medida en la cantidad de complejo
rhIGF-I/rhIGFBP-3 de carga positiva
reducida que se necesita eliminar para conseguir la pureza deseada y
la retención relativa de la resina de intercambio catiónico.
Además, se proporcionan procedimientos para
purificar un complejo parcialmente purificado de
IGF-I e IGFBP-3 que comprenden
adsorber el complejo IGF-I/IGFHP-3
en una resina de intercambio catiónico y desorber el complejo
usando una serie de fases móviles por etapas. En una realización,
las fases móviles comprenden una primera fase móvil que tiene un
sistema tamponante de acetato sódico a aproximadamente pH 5,4 - 5,6
que contiene NaCl de aproximadamente 160 mM a aproximadamente 185
mM y una segunda fase móvil que tiene un sistema tamponante de
acetato sódico a aproximadamente pH 5,4 - 5,6 que contiene NaCl de
aproximadamente 200 mM a aproximadamente 250 mM. En otra
realización, la segunda fase móvil comprende NaCl aproximadamente
225 mM.
En los procedimientos de la presente invención,
las etapas de la elución isocrática por etapas se emplean usando
5-15 volúmenes de columna de fase móvil por etapa.
En una realización, la primera etapa isocrática usa
5-10 volúmenes de columna de fase móvil.
Otros objetos, características y ventajas de la
presente invención se harán evidentes tras la siguiente descripción
detallada. La descripción detallada y los ejemplos específicos se
proporcionan sólo con fines ilustrativos. Además, los ejemplos
demuestran el principio de la invención.
Figura 1 - (Superior) Purificación de
rhIGF-I/rhIGFBP-3 parcialmente
purificado usando una resina ToyoPearl CM-650 con un
gradiente lineal de NaCl. (Inferior) Análisis de
CM-HPLC analítica de las fracciones reunidas
(40-47) procedentes de la purificación lineal. Por
medio de este análisis, el rhIGF nativo tiene una pureza del 73,1%
con respecto a otras formas variantes de carga del complejo
rhIGF-I/rhIGFBP-3.
Figura 2 - (Superior) Purificación de
rhIGF-I/rhIGFBP-3 parcialmente
purificado usando una resina ToyoPearl CM-650 con
una elución isocrática por etapas de NaCl. (Inferior)
Análisis de CM-HPLC analítica de las fracciones
reunidas (68-90) procedentes de la purificación
isocrática. Por medio de este análisis, el rhIGF nativo tiene una
pureza del 99% con respecto a otras formas variantes de carga del
complejo rMGF-I/rhIGFBP-3.
Figura 3 - Purificación de
rhIGF-I/rhIGFBP-3 parcialmente
purificado usando una resina ToyoPearl CM-650 (Lote
Nº 1) con una elución isocrática por etapas con NaCl 175 mM y 225
mM.
Figura 4 - Purificación de
rhIGF-I/rhIGFBP-3 parcialmente
purificado usando una resina ToyoPearl CM-650 (Lote
Nº 2) con una elución isocrática por etapas con NaCl 185 mM y 225
mM. Los encartes son un análisis espectrofotométrico de masas de un
agrupamiento de iones de IGFHP-3 encontrado en las
fracciones reunidas; véase también la Figura 8.
Figura 5 - Purificación de
rhIGF-I/rhIGFBP-3 parcialmente
purificado usando una resina ToyoPearl CM-650 (Lote
Nº 3) con una elución isocrática por etapas de NaCl 165 mM y 225
mM.
Figura 6 - Comparación de los perfiles de
elución observados usando una resina CM preparativa (ToyoPearl
CM-650) en comparación con una resina CM analítica
(Tosho BioSep TSK Gel CM-5PW).
Figura 7 - (Superior) Cromatograma de
conjunto de variantes de masa Nº 2 e (Inferior) conjunto de
variantes de masa Nº 1 por RP-HPLC.
Figura 8 - (Superior) Espectros sumados
para el pico de IGFBP-3 para el conjunto de
variantes de masa Nº 2, (Central), conjunto de variantes de
masa Nº 1, e (Inferior)
rhIGF-I/rhIGFBP-3 nativo. Se muestra
el agrupamiento de iones correspondiente al estado de carga + 18 de
IGFBP-3.
Figura 9 - MaxEnt del pico de
IGFBP-3 para el conjunto de variantes de masa Nº 2.
La forma de variante de masa de IGFBP-3 presenta una
masa de 28.988.
Figura 10 - MaxEnt del pico de
IGFBP-3 para el conjunto de variantes de masa Nº 1.
La variante de masa de IGFBP-3 presenta una masa de
28.909.
Figura 11 - Espectros de péptido
N-terminal de IGFBP-3 para el
conjunto de variantes de masa Nº 1 en comparación con el patrón de
referencia rhIGF-I/rhIGFBP-3. El
conjunto de variantes de masa Nº 1 presenta dos masas de péptidos
N-terminales de IGFBP-3 observadas.
La forma de variante de masa de IGFBP-3 tiene una
masa observada de 1608,7576 frente al péptido no modificado que
presenta una masa de 1502,6,997 amu.
Se proporcionan complejos de
IGF-I e IGFBP-3 con nuevos niveles
de pureza. Se han desarrollado técnicas cromatográficas que
eliminan contaminantes, tales como variantes de masa y carga de
IGFBP-3. Las nuevas técnicas permiten la producción
de composiciones farmacéuticas de alta calidad que comprenden
complejos IGF-I/IGFBP-3.
Sorprendentemente, se descubrió que los
procedimientos previos de fabricación producían composiciones de la
técnica anterior de complejos
IGF-I/IGFBP-3 parcialmente
purificados que contenían variantes de masa y carga de
IGFBP-3. La Figura 1 (superior) demuestra el
procedimiento de purificación de la técnica anterior del complejo
rhIGF-I/rhIGFBP-3 usando un
gradiente lineal de NaCl para desorber el complejo proteico. La
Figura 1 (inferior) muestra un análisis de las fracciones reunidas
a partir del gradiente lineal mostrado en la Figura 1 (superior).
Como se ve en la Figura 1 (inferior), pueden detectarse varias
formas variantes de carga del complejo usando un perfil de elución
isocrático, cuyo procedimiento se describe en el presente documento.
La pureza global de este material es sólo del 73% comparando el
rhIGF-I/rhIGFBP-3 nativo con el de
otras formas variantes de carga. Por lo tanto, el procedimiento de
purificación de gradiente lineal no fue suficientemente sólido para
resolver variantes de formas de carga minoritarias o el complejo
rhIGF-I/rhIGFBP-3. Se crearon
procedimientos cromatográficos para eliminar estas variantes y
agregados. Los nuevos procedimientos implican, por ejemplo,
adsorber un complejo IGF-I/IGFBP-3
parcialmente purificado en una resina de intercambio catiónico y
desorber el complejo usando una técnica de elución de dos etapas.
Como se ve en la Figura 2 (superior), el procedimiento isocrático
preparativo de los complejos
IGF-I/IGFBP-3 parcialmente
purificados produce un perfil de elución que imita estrechamente
los resultados observados usando un procedimiento analítico. Las
fracciones reunidas del pico que eluyó durante la 2ª etapa
isocrática (complejo nativo marcado) proporcionaron una pureza del
99% por el procedimiento analítico de CM (mostrado en la Figura 2
(inferior).
A menos que se limite de otra manera por una
mención específica en el presente documento, los siguientes términos
tienen los siguientes significados:
"IGF-I" se refiere al
factor de crecimiento semejante a insulina I, incluyendo, sin
limitación, el IGF-I natural (es decir,
"nativo"), análogos o variantes del mismo, y fusiones entre
IGF-I y otras secuencias de aminoácidos.
"IGFBP-3" se refiere a la
proteína de unión al factor de crecimiento semejante a insulina
humano 3. En el presente documento, IGFBP-3 también
puede referirse a análogos de IGFBP-3, variantes
alélicas naturales y fusiones entre IGFBP-3 y otras
secuencias de aminoácidos.
"Complejo" se refiere a un grupo de dos o
más proteínas asociadas. Las proteínas de un complejo se asocian a
través de cualquiera de una multiplicidad de interacciones
no-covalentes que incluyen, sin limitación, enlaces
iónicos, enlaces de hidrógeno, fuerzas de van der waals, e
interacciones hidrófobas. IGF-I e
IGFBP-3 están presentes en un complejo en diversas
relaciones molares. Un complejo puede comprender
IGF-I e IGFBP-3 en una relación
molar de aproximadamente 0,8:1 a aproximadamente 1,2:1. Además, un
complejo puede comprender IGF-I e
IGFBP-3 en una relación molar de aproximadamente
1:1.
"Parcialmente purificado" se refiere a un
complejo de IGF-I e IGFBP-3 que, en
alguna medida, se ha liberado de contaminantes celulares o de
fermentación, y/o concentrado y/o desalificado. "Parcialmente
purificado" también se refiere a un complejo de
IGF-I e IGFBP-3 que ha experimentado
una o más etapas de purificación previas, incluyendo sin exclusión
técnicas tales como cromatografía de exclusión molecular,
cromatografía de interacción hidrófoba o purificación por
intercambio iónico. "Purificación parcial" se refiere a someter
a un complejo de IGF-I e IGFBP-3 a
una o más etapas de purificación. "Parcialmente purificado"
también se refiere a un complejo de IGF-I e
IGFBP-3 que está sustancialmente purificado pero
requiere un "refinamiento" para eliminar las formas agregadas
de rhIGF-I/rhIGFBP-3,
IGFBP-3 mal plegada o formas variantes de masa/carga
del complejo
rhIGF-I/
rhIGFBP-3.
rhIGFBP-3.
"Cromatografía preparativa" se refiere a la
preparación de productos puros o parcialmente puros a una escala
técnica.
"Elución en gradiente o elución lineal" se
refiere a la práctica de cambiar continuamente la composición de la
fase móvil a lo largo de todo el análisis cromatográfico.
"Elución isocrática" e
"isocráticamente" se refiere a la práctica de mantener los
constituyentes de la fase móvil constantes durante un período de
tiempo.
"Fase móvil" se refiere a soluciones
acuosas de capacidad tamponante y fuerza iónica especificadas. En la
fabricación de rhIGF-I/rhIGFBP-3 se
emplean sales tamponantes farmacéuticamente aceptables. Para afectar
a la fuerza iónica se usan cationes farmacéuticamente aceptables,
tales como sodio. La fase móvil puede incorporar disolventes
miscibles con agua.
"Fase estacionaria" se refiere a materiales
de cromatografía poliméricos orgánicos que son eficaces para unirse
a (es decir, adsorber) un analito en condiciones de fase móvil
seleccionadas y liberar el analito en otras condiciones de fase
móvil seleccionadas.
Los "materiales de cromatografía poliméricos
orgánicos" incluyen resinas de intercambio catiónico. Estos
materiales incluyen resinas de intercambio catiónico débiles y
resinas que poseen grupos carboxilato funcionales. Los "grupos
carboxilato funcionales" se ejemplifican, por ejemplo, por
compuestos carboxilo y carboximetilo.
"Elución en etapas" y "elución por
etapas" se refiere a la práctica de cambiar las condiciones de
fase móvil desde una fase móvil isocrática a una segunda fase móvil
isocrática, típicamente aumentando la fuerza iónica entre cada
etapa. La elución (o desorción) de la proteína de interés se
consigue seleccionando una fase móvil isocrática que desorbe
selectivamente la proteína durante la etapa isocrática.
\vskip1.000000\baselineskip
Los complejos de IGF-I e
IGFBP-3 se aíslan a nuevos niveles de pureza usando
técnicas cromatográficas diseñadas para eliminar variantes tanto de
masa como de carga de IGFBP-3 y agregados de
complejos IGF-I/IGFBP-3. Estas
técnicas cromatográficas son adecuadas para cromatografía analítica,
semi-preparativa y preparativa.
Un procedimiento para purificar un complejo de
IGF-I e IGFBP-3 comprende obtener un
complejo de IGF-I e IGFBP-3,
purificar parcialmente el complejo, adsorber el complejo en una fase
estacionaria, desorber el complejo usando una multiplicidad de
fases móviles, siendo las fases móviles una serie de fuerzas iónicas
secuencialmente crecientes, y recuperar el complejo purificado.
Además, un procedimiento para purificar un
complejo parcialmente purificado de IGF-I e
IGFBP-3 comprende adsorber el complejo de
IGF-I e IGFBP-3 en una fase
estacionaria y desorber el complejo usando una serie por etapas de
fases móviles, obteniéndose de esta manera el complejo
purificado.
En otra realización, se proporciona un
procedimiento para purificar un complejo parcialmente purificado de
IGF-I e IGFBP-3 por cromatografía de
intercambio iónico usando una resina de carboximetilo, comprendiendo
la mejora desorber dicho complejo de la resina de carboximetilo
mediante la aplicación de una primera fase móvil que comprende NaCl
de aproximadamente 160 mM a aproximadamente 185 mM seguido de la
aplicación de una segunda fase móvil que comprende NaCl de
aproximadamente 200 mM a aproximadamente 250 mM, recuperándose de
esta manera un complejo purificado de IGF-I e
IGFBP-3 en la segunda fase móvil.
\newpage
Estas técnicas usan una diversidad de fases
estacionarias. Las fases estacionarias útiles incluyen materiales
de cromatografía poliméricos orgánicos tales como resinas de
intercambio catiónico. Las fases estacionarias útiles también
incluyen resinas de intercambio catiónico débiles que poseen grupos
carboxilato funcionales, tales como grupos carboximetilo
funcionales.
Estas técnicas también usan una diversidad de
fases móviles. Estas técnicas cromatográficas usan al menos dos
fases móviles, pero pueden emplear las fases móviles que sean
necesarias para obtener un analito purificado o una pluralidad de
analitos de interés purificados. Las fases móviles están
constituidas por diversas fuerzas iónicas de las que cada una se
aplica a la fase estacionaria de una manera por etapas (en lugar de
la aplicación en un gradiente) como se conoce algunas veces por los
expertos en la materia como "elución por etapas". De forma
similar, después de obtener el analito o analitos purificados, no se
necesita aplicación por etapas y, por ejemplo, puede usarse un
gradiente hasta una alta concentración salina para limpiar, aclarar
o regenerar la fase estacionaria. Como alternativa, la aplicación
de una sola fase móvil de una alta concentración salina tal como
NaCl 1 M, después de obtener el analito purificado, también puede
limpiar, aclarar o regenerar la fase estacionaria.
La densidad de la fase móvil puede variarse
ajustando la concentración de sal de las soluciones acuosas. Las
fases móviles útiles tienen una concentración de NaCl al menos
aproximadamente 60 mM menor que una segunda fase móvil
inmediatamente posterior. Las fases móviles también tienen
concentraciones de NaCl al menos aproximadamente 50 mM menores que
una segunda fase móvil inmediatamente posterior, o al menos
aproximadamente 40 mM menores que una segunda fase móvil
inmediatamente posterior o al menos aproximadamente 30 mM menores
que una segunda fase móvil inmediatamente posterior, o al menos
aproximadamente 20 mM menores que una segunda fase móvil
inmediatamente posterior o al menos aproximadamente 10 mM menores
que una segunda fase móvil inmediatamente posterior. Para la resina
catiónica preparativa, las primeras fases móviles tienen NaCl de
aproximadamente 160 mM a aproximadamente 185 mM. Las segundas fases
móviles pueden aplicarse a la fase estacionaria inmediatamente
después que las primeras fases móviles. Para resinas catiónicas
preparativas, las segundas fases móviles pueden tener NaCl de
aproximadamente 200 mM a aproximadamente 250 mM. Las segundas fases
móviles también pueden tener NaCl aproximadamente 225 mM.
Estos procedimientos producen proteínas puras
que comprenden complejos de IGF-I e
IGFBP-3. Los complejos de IGF-I e
IGFBP-3 pueden tener una pureza de al menos
aproximadamente el 96%. Los complejos también pueden tener una
pureza de al menos aproximadamente el 97%, al menos aproximadamente
el 98%, o al menos aproximadamente el 99%. Una proteína aislada
puede comprender complejos de IGF-I e
IGFBP-3 en una relación molar de aproximadamente
0,8:1 a aproximadamente 1,2:1. Además, una proteína aislada puede
comprender complejos de IGF-I e
IGFBP-3 en una relación molar de aproximadamente
1:1.
Estas proteínas aisladas son útiles para el
tratamiento de los trastornos descritos, por ejemplo, en las
Patentes de Estados Unidos Nº 5.681.818, 5.723.441, 5.948.757,
6.015.786, 6.017.885, 6.025.332, 6.025.368, 6.514.937 y 6.518.238.
Una composición farmacéutica puede comprender una proteína aislada
que comprende un complejo de IGF-I e
IGFBP-3 y un vehículo farmacéuticamente aceptable,
en la que la proteína tiene una pureza de al menos aproximadamente
el 96%. En otras realizaciones, la composición farmacéutica puede
tener una proteína con una pureza de al menos aproximadamente el
97%, una pureza de al menos aproximadamente el 98%, o una pureza de
al menos aproximadamente el 99%. Una composición farmacéutica puede
comprender una proteína aislada de complejos de
IGF-I e IGFBP-3 en una relación
molar de aproximadamente 0,8:1 a aproximadamente 1,2:1. Además, una
composición farmacéutica puede comprender una proteína aislada de
complejos de IGF-I e IGFBP-3 en una
relación molar de aproximadamente 1:1.
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes ejemplos son ilustrativos de la
presente invención y no deben considerarse limitaciones de la
misma.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo Nº
1
Se realizaron experimentos usando tres lotes de
resina de fabricante de resina Toyopearl^{TM}
CM-650M (Tosoh Bioscience LLC, Montgomeryville, PA,
Nº de Catálogo 14696). El procedimiento general para la
cromatografía se define a continuación. La fuerza iónica del primer
tampón de elución isocrática se adaptó para conseguir el perfil de
separación deseado. En las Figuras 3, 4 y 5 se muestran
cromatogramas preparativos.
Tampón de carga - acetato sódico 50 mM, NaCl 50
mM, pH 5,5
Tampón de lavado - acetato sódico 50 mM, NaCl
125 mM, pH 5,5
Primer tampón isocrático - acetato sódico 50 mM,
NaCl 165-185 mM, pH 5,5
Segundo tampón isocrático - acetato sódico 50
mM, NaCl 225 mM, pH 5,5
Gradiente - mezcla de acetato sódico 50 mM, NaCl
225 mM, pH 5,5 a NaCl 1 M.
\vskip1.000000\baselineskip
La primera etapa isocrática se aplicó para 6 -
9,5 CV dependiendo del ensayo. La segunda etapa isocrática se aplicó
hasta que el nativo de
rhIGF-I/rhIGFBP-3 nativo volvió a la
absorbancia basal \pm5%. El gradiente entre NaCl 225 mM y NaCl 1 M
se realizó para regenerar la resina.
El lote Nº 1 de resina requería NaCl 175 mM para
eluir las formas variantes de masa/carga del complejo
rhIGF-I/rhIGFBP-3. El lote de resina
Nº 2 requería NaCl 185 mM para eluir las formas variantes de
masa/carga del complejo
rhIGF-I/rhIGFBP-3. El lote de resina
Nº 3 requería NaCl 165 mM para eluir las formas variantes de
masa/carga del complejo
rhIGF-I/rhIGFBP-3.
Todos los lotes desorbieron eficazmente el
complejo rhIGF-I/rhIGFBP-3 nativo a
NaCl 225 mM en un volumen mínimo deseado. Además, ninguna de las
impurezas que eluyó durante el gradiente de sal eluyó durante la
etapa de NaCl 225 mM en ninguno de los 3 lotes de resina.
\vskip1.000000\baselineskip
Columna: Tosoh Biosep TSK Gel
CM-5PW, 10 \mu, 100 A, 7,5 mm x 7,5 cm, (Parte Nº
13068).
Disolvente A = acetato sódico 50 mM/cloruro
sódico 50 mM, pH 5,5, 27,2 g de acetato sódico + 11,69 g de cloruro
sódico + 4 l de agua, pH 5,5.
Disolvente B = acetato sódico 50 mM/cloruro
sódico 550 mM, pH 5,5, 27,2g de acetato sódico + 128,6 g de cloruro
sódico + 4 l de agua, pH 5,5.
Disolvente C = acetato sódico 50 mM/cloruro
sódico 1000 mM, pH 5,5, 27,2 g de acetato sódico + 233,76 g de
cloruro sódico + 4 l de agua, pH 5,5.
Los tampones se preparan añadiendo primero la
cantidad prescrita de sales al agua y mezclando hasta que se
disuelva. Después, el pH se ajusta a 5,5 ~ 5,6 usando ácido acético.
Después de obtener un pH estable, la solución se enrasa con agua y
se confirma el pH. Todas las soluciones se filtran usando un filtro
de 0,22 \mu o 0,45 \mu antes del uso.
\vskip1.000000\baselineskip
\bullet Longitud de onda = 276 nm
\bullet AUFS = 2
\bullet Constante de tiempo = 1
Bomba
Caudal = 1 ml/min
Disolvente A = acetato sódico 50 mM, NaCl 50 mM,
pH 5,5
Disolvente B = acetato sódico 50 mM, NaCl 550
nM, pH 5,5
Disolvente C = acetato sódico 50 mM, NaCl 1000
mM, pH 5,5
Disolvente D = Agua
\vskip1.000000\baselineskip
Comparación entre separación por CM analítica
y separación por CM preparativa. La Figura 6 (inferior) muestra
un cromatograma de un ensayo de CM-HPLC analítica
con los picos identificados como sus componentes. Como puede verse
comparando la separación por CM preparativa (superior) con la
separación por CM analítica (inferior) se apreciará que los mismos
componentes eluyen en el mismo orden de retención y pueden
identificarse basándose en esto.
La Figura 1 (inferior) y la Figura 2 (inferior)
muestran resultados de CM-HPLC analítica para
muestras que contienen formas variantes de masa/carga del complejo
rhIGF-I/rhIGFBP-3 (Figura 1) y una
muestra que contiene formas variantes de masa/carga pequeñas del
complejo rhIGF-I/rhIGFBP-3 (Figura
2).
\vskip1.000000\baselineskip
- Columna:
- Vydac 218 TP de fase inversa C 18 4,6 x 250 mm di
- Eluyente A:
- acetonitrilo al 50%, TFA al 0,1%
- Eluyente B:
- TFA al 0,1%
- Eluyente C:
- Acetonitrilo al 100%, TFA al 0,1%
- Caudal:
- 0,9 ml/min
- Volumen de inyección hasta
- 100 \mu
- Temperatura de la columna
- ambiente
- Longitud de onda de detección
- 210 nm
- Tiempo de ensayo
- 95 minutos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los análisis CLEM se realizaron usando el
sistema de HPLC Waters Alliance 2695 acoplado a un espectrómetro de
masas MicroMass LCT (TOF) y un detector de matriz de fotodiodos
Waters 2996 (PDA). La separación cromatográfica se realizó usando
una columna de fase inversa Vydac 218TP (250 x 4,6 mm, 300A) C18
eluyendo con un gradiente de H_{2}O- acetonitrilo que contenía
ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1% (v/v). La corriente de eluyente
de la columna de fase inversa se dividió (4 a 1) con la mayor parte
de la corriente dirigida al detector de PDA y el resto a la fuente
de electronebulización.
\vskip1.000000\baselineskip
Se analizaron muestras del conjunto de variantes
de masa/carga Nº 1 por digestión de péptidos seguido de análisis de
RP-CL/EM. Los fragmentos proteolíticos se separaron
usando una columna de RP-HPLC Cadenza (Nº de Cat.
CD026) 1 \mum (2 x 250 mm) C 18 a un caudal de 0,2 ml/min durante
un intervalo de acetonitrilo al 2% a acetonitrilo al 98%. Los picos
se detectaron usando absorbancia de la corriente de eluato a 210 nm
en un detector de matriz de fotodiodos, que después se infundió en
un espectrómetro de masas MicroMass LCT que funcionaba en el modo
de ionización electronebulización de ion positivo. El patrón de
picos de péptido (es decir, el mapa de péptidos) se comparó con un
patrón de referencia para establecer la identidad. Posteriormente,
los picos se identificaron sumando la corriente iónica total bajo
cada pico y midiendo los iones monoisotópicos, M2+ o M3+.
\vskip1.000000\baselineskip
Se extrajeron muestras en proceso durante el
transcurso de una campaña de fabricación. Las muestras se congelaron
y se almacenaron a -20ºC hasta el análisis.
\vskip1.000000\baselineskip
Se tomaron muestras durante la etapa de lavado
isocrática antes de la elución del complejo nativo del ensayo
mostrado en la Figura 4. Se reunieron muestras que representaban dos
picos anchos que eluyeron durante esta etapa. Se combinaron
volúmenes iguales de cada fracción para formar el conjunto y los
conjuntos se concentraron usando membranas de ultrafiltración de 10
kD (Centricon YM-10, Amicon, Nº de Cat. 4206).
Con fines comparativos, también se tomó una
fracción de la parte superior del pico durante la elución del
complejo rhIGF-I/rhIGFBP-3 nativo
durante la etapa de elución isocrática 225 mM. También se tomó una
muestra de un saliente del pico isocrático 225 mM (que se provocó
por flujo a corto plazo en la conductividad durante la etapa del
tampón). Estas muestras se usaron para el análisis por CLEM y una
muestra se analizó por mapeo de péptidos.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 7 muestra cromatogramas del conjunto
de variantes de masa Nº 2 y el conjunto de variantes de masa Nº 1
medidos por RP-HPLC Vydac. En la Figura 1, el
IGF-I nativo eluye como un pico a 41,8 - 42 minutos,
eluyendo el IGF-I oxidado inmediatamente antes del
pico de IGF-I nativo.
El IGFBP-3 eluye como un pico a
48 - 48,7 minutos. No se observan otras impurezas significativas en
estas muestras. Los espectros se sumaron sobre el pico para
IGFBP-3 en cada una de estas muestras, así como el
de una muestra que representa el ápice de la etapa isocrática de
NaCl 225 mM. La Figura 8 muestra expansiones de los espectros de
masas sumados a través del pico de IGFBP-3, y
rhIGF-I/rhIGFBP-3 nativo alrededor
de m/z 1597, que corresponde al estado de carga +18 del
agrupamiento de iones de IGFBP-3. Esto demuestra que
IGFBP-3 esta significativamente modificada en el
conjunto de variantes de masa Nº 2 y en las muestras del conjunto
de variantes de masa Nº 2, pero está modificado relativamente poco
de la IGFBP-3 en el pico de elución de sal 225 mM.
Como comentario, estos son los mismos espectros mostrados como
encartes en la Figura 4. Hay numerosas modificaciones observadas en
la muestra del conjunto de variantes de masa Nº 2, pero se observa
un ion prominente a 1611,3 amu. La Figura 9 muestra los espectros
MaxEnt de esta muestra, que indica una proteína con un peso
molecular de 28988,5313, que es + 257,03 con respecto a la masa
calculada de rhIGFBP-3 (28731,5). Hay numerosas
modificaciones observadas en la muestra del conjunto de variantes de
masa Nº 1, pero se observa un ion prominente a 1606,9 amu. La
Figura 10 muestra los espectros de MaxEnt de esta muestra, que
indica una proteína con un peso molecular de 28909,5547, que es +
178,05 con respecto a la masa calculada de
rhIGFBP-3.
\vskip1.000000\baselineskip
Se comparó el cromatograma UV del AspN péptido
del conjunto de variantes de masa Nº 1 con el patrón de referencia
rhIGF-I/rhIGFBP-3 y no hubo
aparición o desaparición definida de ningún pico prominente. Por lo
tanto, las variantes de masa observadas no produjeron una migración
claramente diferente de ninguno de los picos.
Se sumaron los espectros sobre la región del
cromatograma cerca de los picos a 46,1 - 46,5 minutos, que
corresponde al tiempo de retención del péptido
N-terminal para rhIGFBP-3. La Figura
11 muestra los agrupamientos iónicos monoisotópicos
correspondientes al péptido en el extremo N de
IGFBP-3 (superior) y el patrón de referencia de
rhIGF-I/rhIGFBP-3 (inferior). La
muestra del conjunto de variantes de masa Nº 1 presenta un
agrupamiento iónico a 1502,6997 que corresponde al del péptido
N-terminal nativo de IGFBP-3 así
como un agrupamiento iónico a 1680,7576 que es + 178,0579 en
comparación con el péptido parental. Este aducto de masa observado
es coherente con el aducto de masa calculado para la proteína
entera por MaxEnt (178,05). De esta manera, esta sola adición de
aducto de masa explicaría la modificación en el
IGFBP-3. El péptido 1680,7576 no está presente en el
patrón de referencia como se observa comparando el gráfico superior
del agrupamiento iónico con el gráfico inferior del agrupamiento
iónico debido a la falta de sensibilidad del procedimiento de mapeo
de péptidos.
\vskip1.000000\baselineskip
En espectros expandidos alrededor del estado de
carga +18 de IGFBP-3, las muestras en las que se
observaron los iones más prominentes fueron a 1611,3 (grupo de
variantes de masa Nº 2) y 1606,9 (grupo de variantes de masa Nº 1)
correspondientes a los aductos de masas de aproximadamente 258 y 178
amu respectivamente.
La secuencia peptídica de este péptido es
*GASSAGLGPVVRCEPC (SEC ID Nº 1), representando el primer resto de
glicina el extremo N de IGFBP-3. La masa
monoisotópica calculada de este péptido es 1502,7090.
Se consideraron posibles modificaciones que
podrían explicar los aductos de masa en 178 y 258 amu. La
posibilidad más probable es la gluconilación
N-terminal (178 amu) y la
alfa-N-6-fosfogluconilación
N-terminal (258 amu). Geoghegan y col. informan
sobre la modificación de una proteína expresada en E. coli
con una secuencia N-terminal de
GSS[His]6 (SEC ID Nº 2) en la que el resto de glicina
N-terminal es objeto de una modificación (Geoghegan
y col. (1999) Anal. Biochem 267(1) 169-84).
La gluconilación N-terminal conjugaría un resto
C6H10O6 (178,0477 amu) sobre el péptido con un grupo amina. La masa
de la modificación observada es 1680,7576-1502,6997
= 178,0579 amu. De esta manera, el aducto observado es coherente con
esta modificación (178,0477 - 178,0579 = 0,0102 amu) que está
dentro del error experimental y los límites de este espectrómetro de
masas. Hay dos posibles sitios de modificación, el grupo amina
N-terminal en el resto de glicina y el grupo
guanidinilo de la arginina.
\vskip1.000000\baselineskip
Se detectan variantes de carga de
rhIGFBP-3 por separación de formas variantes de
masa/carga del complejo
rhIGF-I/rhIGFBP-3 usando un
gradiente isocrático de cloruro sódico en una columna de intercambio
iónico TSK-GEL CM-5PW, 7,5 cm x 7,5
mm DI, 10 \mum, de acuerdo con el procedimiento de ensayo descrito
anteriormente.
Estas impurezas no se detectaron previamente en
lotes de producto farmacéutico con los procedimientos que estaban
disponibles en el momento de su fabricación. Cuando estaban
disponibles, las muestras se obtuvieron de material conservado para
establecer un intervalo de estas impurezas en las muestras
históricas. Los resultados mostrados en la Tabla 1 se presentan
como pureza de rhIGF-I/rhIGFBP-3
nativo, estando asociada la diferencia con dos picos que
representan dos variantes de masa/carga. El máximo grado de pureza
observado por este procedimiento fue del 95,4%.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
<110> SLEEVI, MARK C.
\hskip1cmKELLEY, GLEN L.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> COMPLEJOS
rhIGF-I/rhLIGRBP-3 PURIFICADOS Y
PROCEDIMIENTO DE FABRICACIÓN DE LOS MISMOS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 057491-0870
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> 11/311.633
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
20-12-2005
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/639.349
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
24-12-2004
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 3.3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de Secuencia Artificial:
Péptido sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
Claims (23)
1. Una proteína aislada que comprende un
complejo de factor de crecimiento semejante a insulina I
(IGF-I) y proteína 3 de unión al factor de
crecimiento semejante a insulina (IGFBP-3), teniendo
dicha proteína una pureza de al menos un 96% como se mide por
CM-HPLC analítica.
2. La proteína de la reivindicación 1, en la que
dicha proteína tiene una pureza de al menos el 97% como se mide por
CM-HPLC analítica.
3. La proteína de la reivindicación 1, en la que
dicha proteína tiene una pureza de al menos el 98% como se mide por
CM-HPLC analítica.
4. La proteína de la reivindicación 1, en la que
dicha proteína tiene una pureza de al menos el 99% como se mide por
CM-HPLC analítica.
5. La proteína de la reivindicación 1, en la que
dicho complejo comprende IGF-I e
IGFBP-3 en una relación molar de aproximadamente
0,8:1 a aproximadamente 1,2:1.
6. La proteína de la reivindicación 1, en la que
dicho complejo comprende IGF-I e
IGFBP-3 en una relación molar de aproximadamente
1:1.
7. Una composición farmacéutica que comprende
una proteína aislada que comprende un complejo de
IGF-I e IGFBP-3 y un vehículo
farmacéuticamente aceptable, en la que dicha proteína tiene una
pureza de al menos el 96% como se mide por CM-HPLC
analítica.
8. La composición farmacéutica de la
reivindicación 7, en la que dicha proteína tiene una pureza de al
menos el 97% como se mide por CM-HPLC analítica.
9. La composición farmacéutica de la
reivindicación 7, en la que dicha proteína tiene una pureza de al
menos el 98% como se mide por CM-HPLC analítica.
10. La composición farmacéutica de la
reivindicación 7, en la que dicha proteína tiene una pureza de al
menos el 99% como se mide por CM-HPLC analítica.
11. Un procedimiento para purificar un complejo
de IGF-I e IGFBP-3, que
comprende
- obtener un complejo de IGF-I e IGFBP-3;
- purificar parcialmente dicho complejo;
- adsorber dicho complejo en una fase estacionaria catiónica;
- desorber dicho complejo usando una multiplicidad de fases móviles, comprendiendo dichas fases móviles una serie de fuerzas iónicas secuencialmente crecientes; y
- recuperar dicho complejo purificado.
\vskip1.000000\baselineskip
12. El procedimiento de la reivindicación 11, en
el que dicha fase estacionaria es una resina de intercambio
catiónico.
13. El procedimiento de la reivindicación 12, en
el que dicha resina de intercambio catiónico contiene grupos
carboximetilo funcionales.
14. El procedimiento de la reivindicación 11, en
el que dicha multiplicidad de fases móviles comprende una primera
fase móvil y una segunda fase móvil.
15. El procedimiento de la reivindicación 14, en
el que dicha primera fase móvil tiene una concentración de NaCl al
menos aproximadamente 10 mM menor que dicha segunda fase móvil.
16. El procedimiento de la reivindicación 14, en
el que dicha primera fase móvil tiene una concentración de NaCl al
menos aproximadamente 20 mM menor que dicha segunda fase móvil.
17. El procedimiento de la reivindicación 14, en
el que dicha primera fase móvil tiene una concentración de NaCl al
menos aproximadamente 40 mM menor que dicha segunda fase móvil.
\newpage
18. El procedimiento de la reivindicación 14, en
el que dicha primera fase móvil comprende NaCl de aproximadamente
160 mM a aproximadamente 185 mM y dicha segunda fase móvil comprende
NaCl de aproximadamente 200 mM a aproximadamente 250 mM.
19. El procedimiento de la reivindicación 14, en
el que dicha segunda fase móvil comprende NaCl aproximadamente 225
mM.
20. Un procedimiento para purificar un complejo
parcialmente purificado de IGF-I e
IGFBP-3, que comprende adsorber dicho complejo en
una resina de intercambio catiónico y desorber dicho complejo usando
una serie de fases móviles por etapas.
21. El procedimiento de la reivindicación 20, en
el que dichas fases móviles comprenden una primera fase móvil que
tiene NaCl de aproximadamente 160 mM a aproximadamente 185 mM y una
segunda fase móvil que tiene NaCl de aproximadamente 200 mM a
aproximadamente 250 mM.
22. Un procedimiento para purificar un complejo
parcialmente purificado de IGF-I e
IGFBP-3 por cromatografía de intercambio iónico
usando una resina de carboximetilo, comprendiendo la mejora desorber
dicho complejo de dicha resina de carboximetilo por la aplicación de
una primera fase móvil que comprende NaCl de aproximadamente 160 mM
a aproximadamente 185 mM seguida de la aplicación de una segunda
fase móvil que comprende NaCl de aproximadamente 200 mM a
aproximadamente 250 mM, recuperando de esta manera dicho producto
purificado.
23. El procedimiento de la reivindicación 22, en
el que dicha segunda fase móvil comprende NaCl aproximadamente 225
mM.
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