ES2246072T3 - Peptidos que tienen actividad como abridores de los canales de potasio. - Google Patents

Peptidos que tienen actividad como abridores de los canales de potasio.

Info

Publication number
ES2246072T3
ES2246072T3 ES98939267T ES98939267T ES2246072T3 ES 2246072 T3 ES2246072 T3 ES 2246072T3 ES 98939267 T ES98939267 T ES 98939267T ES 98939267 T ES98939267 T ES 98939267T ES 2246072 T3 ES2246072 T3 ES 2246072T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
peptide
glu
thr
val
gly
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES98939267T
Other languages
English (en)
Inventor
Nickolai V. Sinackevich
Alexis M. Rakhlilov
Sergei V. Maslennikov
Lawrence R. Green
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
CYTRAN Ltd
Original Assignee
CYTRAN Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by CYTRAN Ltd filed Critical CYTRAN Ltd
Application granted granted Critical
Publication of ES2246072T3 publication Critical patent/ES2246072T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06026—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atom, i.e. Gly or Ala
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/05—Dipeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/07—Tetrapeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06034—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms
    • C07K5/06052—Val-amino acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/1008—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atoms, i.e. Gly, Ala
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/101—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms, e.g. Val, Ile, Leu

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Esta invención se refiere a procedimientos para el tratamiento profiláctico y terapéutico de enfermedades que reaccionan a la abertura de los canales de potasio, péptidos que tienen actividad de abertura de canales de potasio y composiciones farmacéuticas y kits que comprenden dichos péptidos.

Description

Péptidos que tienen actividad como abridores de los canales de potasio.
Campo de la invención
Esta invención se refiere, en general, a métodos para tratar y prevenir enfermedades que responden a la apertura de canales de potasio, a péptidos que tienen actividades del abridor de canales de potasio y a composiciones farmacéuticas y kits que contienen péptidos de este tipo.
Antecedentes de la invención
Los canales de potasio (K^{+}) son importantes reguladores de numerosos procesos biológicos, incluidos procesos secretores, contracción muscular y cardioprotección post-isquémica. Estudios electrofisiológicos han descrito la existencia de canales de potasio en casi todos los tipos de células. Gopalakrishnan et al., Drug Dev. Res. 28:95-127 (1993). Este tipo de canales está presente en diversas formas que son generalmente distinguibles por sus respectivas características estructurales, biofísicas y farmacológicas. Id. Generalmente, es bien conocido que la apertura de los canales de potasio en una célula eléctricamente excitable que tiene este tipo de canales da como resultado un flujo incrementado de iones potasio desde el interior de la célula al exterior de la célula. Este flujo de iones potasio determina un cambio medible en el restante potencial de la membrana de la célula y conduce a una hiperpolarización de la membrana y a una relajación de la célula. La activación de los canales de potasio estabiliza el potencial de la membrana de la célula y, generalmente, reduce la excitabilidad de la célula.
Los canales de potasio han estado implicados en un gran número de enfermedades, incluida enfermedad cardiovascular, asma, hipertensión, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, diabetes, epilepsia, hipertensión sanguínea y trastornos en la alimentación y el apetito. Generalmente, se piensa que el mal funcionamiento de estos canales de potasio o la existencia de defectos de regulación en procesos que activan canales de potasio de este tipo puede jugar un papel importante en la patogénesis de enfermedades y dolencias de este tipo. Como resultado, compuestos que son de ayuda en la apertura de canales de potasio y, por consiguiente, en la modulación del funcionamiento electrofisiológico de las células pueden tener un potencial terapéutico y profiláctico importante para tratar o aliviar estados de este tipo.
Compuestos abridores de los canales de potasio exhiben un conjunto diverso de actividades biológicas y farmacológicas. Los abridores de los canales de potasio actualmente conocidos incluyen cromakalima, pinacidil (patente de EE.UU. nº 4.057.636) y nicorandil (patente de EE.UU. nº. 4.200.640). Se piensa que estos compuestos ejercen sus efectos principalmente a través de los canales de potasio sensibles a ATP. Tienen una alta afinidad por las células de la musculatura lisa vascular y se caracterizan por su capacidad de relajar la musculatura lisa vascular. Escande et al., Trends in Pharm. Sci. 23:269-272 (1992). Se ha observado que cromakalima, por ejemplo, induce la hiperpolarización del tejido de la musculatura lisa vascular, relaja los vasos y reduce los efectos de la lesión isquémica en el miocardio. Grover et al., J. Pharmac. & Expt'l Therapeutics 257:156-162 (1992). Cromakalima también parece ser un agente quimioterapéutico eficaz para disritmias cardíacas y el intestino irritable, ambos asociados con la activación de los canales de potasio. Además, se ha encontrado que cromakalima inhibe las contracciones prematuras del útero cuando se utiliza en combinación con estrógeno y relaxina. Downing et al., J. Endocrinol. 135:29 (1992). Pinacidil ha demostrado dilatar los vases precapilares y relajar la musculatura lisa. Nielsen-Kudsk et al., Europ. J. Pharmac. 157: 221-226 (1988). Se ha encontrado que cromakalima y pinacidil reducen el grado de lesión isquémica del miocardio. Grover et al., J. Pharmac. & Expt'l Therapeutics 251:98-104 (1989). Se ha observado que determinados abridores del canal de potasio, incluida cromakalima, actúan sobre las células de la musculatura lisa de la tráquea y producen efectos anti-asmáticos. Dilly, "Cromakalim/Lemakalim, Experience in Hypertension Nocturnal Asthma" in Conference Documentation, Potassium Channels, `90, The Royal College of Physicians, 6-7 de diciembre, 1990. Véase, también, Small et al., Braz. J. Med. Biol. Res. 25(10):983-998. Esta acción está asociada con la hiperpolarización de la membrana hacia el potencial de equilibrio de potasio y con el fomento del eflujo de iones potasio desde las células de la musculatura. Id. Además, se ha encontrado que algunos abridores del canal de potasio hiperpolarizan las células neuronales y poseen efectos anti-epilépticos y anticonvulsivos. Véase, por ejemplo, Gandolfo et al., Europ. J. Pharmac. 167:181-83 (1989); Abele et al., Neuroscience Letters 115:195-200 (1990).
Desgraciadamente, los abridores del canal de potasio actualmente conocidos producen típicamente graves efectos secundarios (incluidos graves dolores de cabeza, retención de fluido y taquicardia refleja) en sujetos a los que se administran. Adicionalmente, muchos de los abridores del canal de potasio conocidos son inestables y sus efectos farmacológicos son variables y difíciles de reproducir. Kidney et al., Thorax 49:130-133 (1993). Por consiguiente, está limitado el uso terapéutico y profiláctico de abridores del canal de potasio actualmente conocidos.
Existe la necesidad de compuestos que tengan una actividad abridora del canal de potasio que ejerzan sus respectivos efectos terapéuticos y profilácticos con pocos efectos secundarios tóxicos o sin ninguno de ellos. La presente invención cumple esta y otras necesidades.
\newpage
Sumario de la invención
La presente invención proporciona métodos para el tratamiento profiláctico o terapéutico de enfermedades que responden a la apertura de los canales de potasio en un sujeto en necesidad del mismo. Métodos de este tipo comprenden administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad eficaz de un péptido de la invención. Los péptidos de la invención incluyen L-glicil-L-ácido glutámico (L-Gly-L-Glu), L-valina-L-treonina (L-Val-L-Thr), polímeros de L-Gly-L-Glu y L-Val-L-Thr que comprenden no más de 16 residuos aminoácidos y combinaciones de los mismos, y sus sales farmacéuticamente aceptables. Los péptidos preferidos de la invención incluyen L-Gly-L-Glu y L-Val-L-Thr. Los métodos de la invención son útiles para el tratamiento profiláctico o terapéutico de una diversidad de enfermedades que son las responsables de y sensibles a las propiedades activadoras del canal de potasio.
En otro aspecto de la invención, se proporcionan métodos para el tratamiento profiláctico o terapéutico de enfermedades cardiovasculares en sujetos que lo necesitan. Métodos de este tipo comprenden administrar a un sujeto una cantidad eficaz de un péptido de la invención según se describe antes.
La invención también proporciona métodos para inducir la relajación de la musculatura lisa en sujetos que lo necesitan. Métodos de este tipo comprenden administrar al sujeto una cantidad eficaz de un péptido de la invención según se describe antes.
En otro aspecto, se proporcionan métodos para inducir la relajación de la musculatura del esqueleto en sujetos que lo necesitan. Estos métodos comprenden administrar al sujeto una cantidad eficaz de un péptido de la invención según se describe antes.
La invención también proporciona composiciones farmacéuticas en forma de dosificación unitaria que comprenden, por dosificación unitaria, un vehículo farmacéuticamente aceptable y un intervalo de aproximadamente 0,01 miligramos (mg) a aproximadamente 1000 mg de L-Gly-L-Glu o L-Val-L-Thr o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En un aspecto preferido, la invención proporciona composiciones farmacéuticas en forma de dosificación unitaria que comprenden, por dosificación unitaria, un vehículo farmacéuticamente aceptable y un intervalo de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 100 mg de L-Gly-L-Glu, L-Val-L-Thr o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En otro aspecto, la invención proporciona polímeros de péptidos que comprenden al menos dos dipéptidos, en donde cada uno de dichos dipéptidos de dicho polímero es L-Gly-L-Glu o L-Val-L-Thr.
Todavía en otro aspecto de la invención, se proporcionan métodos para preservar tejidos u órganos vivos. Estos métodos comprenden poner en contacto el tejido u órgano con una composición que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y una cantidad eficaz de un péptido, en donde el péptido es L-Gly-L-Glu, L-Val-L-Thr o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
La invención también proporciona kits para preservar tejidos u órganos vivos. Kits de este tipo incluyen una cantidad eficaz de un péptido, en donde el péptido es L-Gly-L-Glu o L-Val-L-Thr o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un recipiente para el tejido vivo.
Descripción detallada de la invención I. Definiciones
A menos que se defina de otro modo, todos los términos y expresiones técnicos y científicos utilizados en esta memoria tienen el mismo significado que el habitualmente comprendido por los expertos ordinarios en la técnica a los que pertenece la invención. Las siguientes referencias proporcionan a un experto una definición general de muchos de los términos y expresiones utilizados en esta invención: Singleton et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY (2ª ed. 1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY (Walker ed., 1988); y Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY (1991). Tal como se utiliza en esta memoria, los siguientes términos y expresiones tienen los significados atribuidos a los mismos, a menos que se especifique de otro modo. Aun cuando en la práctica o en el ensayo de la presente invención se pueden utilizar cualesquiera métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en esta memoria, se describen los métodos y materiales preferidos. Para los fines de la presente invención, se definen a continuación los siguientes términos o expresiones.
Las expresiones "abridor del canal de potasio" y "actividad del abridor del canal de potasio" se refieren, generalmente, a un flujo incrementado de iones potasio desde el interior de una célula eléctricamente excitable al exterior de la célula a través de una membrana de la célula que tiene al menos un canal de potasio. La actividad de abridor de canal de potasio puede ser observada midiendo un incremento en el flujo de iones potasio desde el interior de una célula al exterior de la célula a través de un canal de potasio en la membrana celular.
La expresión "enfermedad cardiovascular" significa generalmente enfermedades y estados patológicos relacionados con o que implican el corazón o los vasos sanguíneos. Ejemplos de enfermedades cardiovasculares incluyen todas las formas de enfermedad cardíaca isquémica, disritmia cardíaca y arritmia cardíaca, fallo cardíaco congestivo y enfermedad hipertensora listados en la Clasificación Internacional de Enfermedades, vol. 9, Clinical Modification, Easy Coder (1997) ("ICD 9 CM"), así como todas las enfermedades cardiovasculares que responden o son sensibles a la vasodilatación, y todas las enfermedades cardiovasculares descritas en E. Braunwald, HEART DISEASE: A TEXTBOOK OF CARDIOVASCULAR MEDICINE (3ª ed. 1988).
La expresión "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a sales por adición de ácidos no tóxicas, incluidas sales formadas con ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico y ácido perclórico, y sales formadas con ácidos orgánicos, tales como ácido acético, ácido oxálico, ácido maleico, ácido málico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido succínico o ácido malónico. Otras sales farmacéuticamente aceptables incluyen nitrato, sulfato, acetato, malato, formiato, lactato, tartrato, succinato, citrato, p-toluenosulfonato inorgánico, y similares que incluyen, pero no se limitan a cationes basados en los metales alcalinos y alcalinotérreos, tales como sodio, litio, potasio, calcio y similares, así como amonio no tóxico, amonio cuaternario y cationes amina, que incluyen, pero no se limitan a amonio, tetrametilamonio, tetraetilamonio, metilamina, dimetilamina, trimetilamina, trietilamina, etilamina y similares.
La expresión "composición farmacéutica" significa una composición adecuada para uso farmacéutico en un sujeto incluido un animal o ser humano. Una composición farmacéutica comprende generalmente una cantidad eficaz de un agente activo y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" abarca cualquiera de los vehículos, tampones y excipientes farmacéuticos estándares, incluida solución salina tamponada con fosfato, agua y emulsiones (tal como una emulsión de aceite/agua o de agua/aceite), y diversos tipos de agentes humectantes y/o adyuvantes. Vehículos farmacéuticos adecuados y sus formulaciones se describen en REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Publishing Co., Easton, 19ª ed. 1995). Vehículos farmacéuticos preferidos dependen del modo pretendido de administración del agente activo. Modos típicos de administración se describen más adelante.
La expresión "cantidad eficaz" significa una dosificación suficiente para producir un resultado deseado. El resultado deseado puede comprender una mejora subjetiva u objetiva en el receptor de la dosificación.
Un "tratamiento profiláctico" es un tratamiento administrado a un sujeto que no exhibe síntomas de una enfermedad o que exhibe sólo síntomas tempranos de una enfermedad, en donde se administra el tratamiento con el fin de disminuir el riesgo de desarrollar una patología.
Un "tratamiento terapéutico" es un tratamiento administrado a un sujeto que exhibe síntomas de patología, en donde el tratamiento se administra con el fin de disminuir o eliminar esos síntomas patológicos.
El término "órgano" significa sistemas del cuerpo tales como el corazón, hígado, pulmón, riñón, cerebro, glándulas adrenales, sistema vascular-endotelial, sistema inmune y similares.
El término "sujeto" pretende dar a entender un animal, tal como un mamífero, incluido un ser humano. Animales no humanos sujetos a tratamiento incluyen, por ejemplo, peces, aves y mamíferos tales como vacas, ovejas, cerdos, caballos, perros y gatos.
La expresión "enfermedad que responde a la apertura de canales de potasio" significa un estado patológico, enfermedad o trastorno que es profiláctica o terapéuticamente responsable o sensible a o está asociado con la activación o la apertura de canales de potasio en células del tejido diana.
El término "hipoxia" se refiere a un estado patológico que resulta de una deficiencia en la cantidad de oxígeno que alcanza los tejidos del cuerpo.
El término "anoxia" se refiere a un estado patológico que resulta de la ausencia de oxígeno.
II. Péptidos de la invención A. Características generales y usos
La presente invención proporciona una nueva clase de péptidos reguladores que se distinguen por su capacidad de tratar o prevenir enfermedades que responden o son sensibles a la apertura de canales de potasio, o que están asociadas con la activación del canal de potasio. Tal como se señaló anteriormente, los canales de potasio están presentes en casi todos los tipos de células, incluidas células del miocardio, células de la musculatura lisa, células de la musculatura esquelética, células beta pancreáticas, células secretoras, células neuronales, células del cerebro, y similares, y están implicados en el funcionamiento adecuado de la mayoría de las células. Se piensa que los mecanismos de acción de los péptidos de la invención implican la activación de los canales de potasio localizados en las membranas de células de este tipo.
Los péptidos objetos de la invención exhiben, generalmente, las actividades biológicas y farmacológicas de compuestos abridores del canal de potasio conocidos y, así, son útiles para tratar enfermedades que frecuentemente son tratadas por abridores del canal de potasio conocidos. Por ejemplo, los péptidos de la invención comparten la propiedad común de inducir la relajación de la musculatura lisa, un rasgo característico de abridores del canal de potasio conocidos. Estos péptidos reducen e inhiben la actividad contráctil de una diversidad de tejidos de la musculatura lisa, incluida la musculatura lisa del intestino, vascular, de la tráquea, bronquial y del útero. Como resultado, los péptidos de la invención son útiles para tratar y prevenir trastornos que pueden ser aliviados o prevenidos por la relajación de la musculatura lisa. Por ejemplo, dado que los péptidos de la presente invención relajan la musculatura lisa del intestino, son útiles para tratar y prevenir trastornos hiperreactivos del intestino, tales como el intestino irritable.
Dado que relajan la musculatura lisa vascular, los péptidos objetos de la invención también inducen una vasodilatación, como lo hacen los abridores del canal de potasio conocidos. Véase, por ejemplo, Guermonprez et al., Eur. Heart J.: 14 (Supl. B):30-34 (1993). La vasodilatación produce típicamente un incremento en el volumen de la sangre que fluye a través de un vaso y/o una disminución en la presión sanguínea en el vaso. Con sus efectos vasodilatadores, los péptidos objetos de la invención son útiles en el tratamiento profiláctico y terapéutico de enfermedades que responden o son sensibles a la vasodilatación, tales como las que se pueden tratar disminuyendo la presión sanguínea en los vasos o incrementando el volumen de sangre que fluye a través de los vasos. Por ejemplo, los péptidos objetos de la invención son útiles para tratar y prevenir la hipertensión que se caracteriza por una presión anormalmente elevada debido a que fomentan la vasodilatación y reducen la presión sanguínea. De manera similar, dado que mejoran el flujo de sangre, los péptidos objetos de la invención son útiles para tratar y prevenir la angina de pecho, un dolor paroxismal grave en el pecho asociado con un suministro insuficiente de sangre al corazón.
Los péptidos de la invención también exhiben propiedades anti-isquémicas y cardioprotectoras, típicamente observadas con abridores del canal de potasio conocidos y, así, sirven como útiles agentes anti-isquémicos y cardioprotectores. Es generalmente conocido que los canales de potasio están presentes en las células cardíacas y que la activación de estos canales da como resultado una hiperpolarización de la membrana y un acortamiento de la duración del potencial de acción. Véase, por ejemplo, Gopalakrishnan et al., supra; Grover et al., Europ. J. Pharmac. 191:11-18 (1990); Grover et al., J. Pharmac. & Expt'l Therapeutics 251:98-104 (1989); Grover et al., J. Pharmac. & Expt'l Therapeutics 257:156-152 (1991). Abridores del canal de potasio conocidos han demostrado reducir la isquemia del miocardio y proteger frente a una isquemia (es decir, ejercer efectos cardioprotectores). Véase, por ejemplo, Guermonprez, supra. Se piensa que la activación de los canales de potasio en el tejido cardíaco mediante abridores del canal de potasio reduce o invierte la despolarización inducida por isquemia y la lesión por reperfusión, posiblemente a través de la hiperpolarización de la membrana (es decir, incrementando el potencial de reposo de las células hacia niveles preisquémicos) y una reducción en el influjo de iones calcio celular. Grover et al., J. Pharmac. & Expt'l Therapeutics 251:98-104 (1989); Grover et al., J. Pharmac. & Expt'l Therapeutics 257:156-152 (1991).
En la presente invención, los péptidos objetos de la invención reducen significativamente los efectos de la lesión isquémica en el tejido del miocardio, restauran la contractilidad del músculo cardíaco tras isquemia y salvaguardan y protegen el tejido del miocardio de una lesión ulterior debida a la isquemia. Los péptidos objetos de la invención actúan también en calidad de agentes anti-arrítmicos. Dadas estas actividades, que se observan en abridores del canal de potasio conocidos, los péptidos de la invención son útiles para tratar y prevenir una diversidad de enfermedades cardiovasculares que responden a la activación del canal de potasio, incluida la enfermedad cardíaca isquémica, arritmias cardíacas, fallo cardíaco congestivo, apoplejía y angina de pecho. Vease, por ejemplo, Guermonprez, supra.
Los péptidos objetos de la invención también relajan la musculatura lisa de las vías respiratorias (por ejemplo, la musculatura lisa de la tráquea) y exhiben efectos broncodilatadores (es decir, incrementan el calibre del bronco o tubo bronquial) como lo hacen fármacos de apertura del canal de potasio conocidos. Así, son beneficiosos para tratar y aliviar determinados trastornos traqueales y bronquiales, incluido asma bronquial, enfermedades broncoespásticas y síndrome broncoespástico. Véase, por ejemplo, Small et al., Braz. J. Med. Biol. Res. 25(10): 983-998.
Adicionalmente, los péptidos de la invención son beneficiosos para tratar y prevenir enfermedades del cerebro que están asociadas con la activación del canal de potasio. Se ha encontrado que abridores del canal de potasio conocidos activan los canales de potasio en las células del cerebro, reduciendo con ello la excitabilidad neuronal de este tipo de células y produciendo efectos anticonvulsivos en tales células. De manera correspondiente, se espera que los péptidos objetos de la invención sean útiles para tratar y prevenir enfermedades neurodegenerativas asociadas con o que responden a la activación del canal de potasio y/o que implican una excitabilidad o despolarización de la célula y una lesión que resulta de ello. Enfermedades neurodegenerativas de este tipo incluyen, por ejemplo, epilepsia, anoxia (que se puede caracterizar por una hiperpolarización breve inicial, seguida de una despolarización sostenida de las células), hipoxia, convulsiones, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, y diversas formas de isquemia cerebral, incluida apoplejía y trauma. Véase, por ejemplo, Gopalakrishnan et al., supra; Ben-Ari et al., Neuroscience 3/.55-60 (1990); Gandolfo et al., supra; Ashford et al., Nature 370:456-59 (11 de agosto de 1994).
Enfermedades y trastornos adicionales susceptibles de tratamiento con los péptidos de la invención y métodos de utilizar estos péptidos se describen más abajo.
B. Péptidos representativos de la invención
Inicialmente, determinados péptidos de la invención fueros aislados a partir de un extracto de miocardio denominado "Cardialina". El extracto Cardialina se describe en el documento USSR nº 1.417.242 (1988). Este extracto ha demostrado prevenir la cardiomiopatía químicamente inducida (véase el documento USSR nº 2.007.157 (1992)), disminuir la lesión del tejido que resulta de infartos (Khavinson et al., Archive Pathology (USSR) 9:27-31 (1989)), y reducir la producción de ácido láctico en rodajas del músculo cardíaco disminuyendo la actividad de succinato deshidrogenasa (Khavinson et al., documento USSR nº 1.807.399 (1993)). Además, Cardialin (denominado alternativamente "Cordialin") ha demostrado afectar positivamente al metabolismo energético de las células del miocardio durante la hipoxia e isquemia. Pavlenko et al., Bull. Eksp. Biol. Med. (USSR) 112(7): 24-27 (1991); Pavlenko et al., Patol. Fiziol. Ter. (Rusia) 2:20-24 (1992). El extracto Cardialina puede también afectar a los canales de potasio sensibles a ATP en los cardiomiocitos. Babenko et al., Bull. Eksp. Biol. Med. (Rusia) 114(7):54-56 (1992). Sin embargo, en estudios previos, no ha sido posible determinar si estos efectos de Cardialina eran el resultado de un agente específico o un suceso no específico.
En la presente invención, extracto Cardialina se sometió a fraccionamiento por cromatografía de líquidos a alta presión (HPLC - siglas inglesas) utilizando la activación de la actividad de adenilato ciclasa de cardiomicitos en calidad de un ensayo de rastreo para la búsqueda de fracciones biológicamente activas (según se describe en el Ejemplo 1 que figura más abajo). Fracciones biológicamente activas aisladas fueron analizadas en cuanto al contenido de péptidos utilizando la degradación de Edman para determinar las respectivas secuencias de aminoácidos de fragmentos de péptidos en las fracciones. A partir de los resultados obtenidos por estos métodos, péptidos sintéticos candidatos fueron preparados y sometidos a ensayo en cuanto a sus capacidades respectivas para estimular la actividad de adenilato ciclasa de cardiomiocitos en cardiomiocitos aislados utilizando un radioinmunoensayo. Los péptidos sintéticos se sometieron posteriormente a un ensayo adicional en cuanto a la actividad farmacológica (tal como se esboza en los Ejemplos 2 a 9 que figuran más abajo).
Mediante estos métodos se identificaron cuatro péptidos. Estos péptidos incluyen los dipéptidos L-Gly-L-Glu y L-Val-L-Thr y los tetrapéptidos L-Gly-L-Glu-L-Gly-L-Glu y L-Val-L-Thr-L-Val-L-Thr. Se piensa que estos péptidos activan y abren los canales de potasio en membranas de la célula que tienen canales de potasio.
En un aspecto de la invención, los péptidos se caracterizan por su capacidad de activar o abrir canales de potasio en células que tienen canales de potasio en sus membranas celulares. Péptidos de la invención están constituidos, generalmente, por un conjunto en serie de 16 o menos residuos L-aminoácidos que se producen en la naturaleza (no derivatizados) unidos mediante péptidos uno con otro. Preferiblemente, un péptido de la invención está constituido por menos de aproximadamente 9 a aproximadamente 6 residuos aminoácidos. Más preferiblemente, el péptido está constituido por no más de 5 residuos aminoácidos. Típicamente, los péptidos tienen un peso molecular menor que aproximadamente 4000 daltons. Más preferiblemente, estos péptidos tienen un peso molecular menor que aproximadamente 2000 daltons y, lo más preferiblemente, menor que aproximadamente 1000 daltons.
En otro aspecto, los péptidos de la invención incluyen L-Gly-L-Glu, L-Val-L-Thr, L-Gly-L-Glu-L-Gly-L-Glu, L-Val-L-Thr-L-Val-L-Thr, polímeros de L-Gly-L-Glu que comprenden no más de 16 residuos aminoácidos, polímeros de L-Val-L-Thr que comprenden no más de 16 residuos aminoácidos, y sus sales farmacéuticamente aceptables. L-Gly-L-Glu y L-Val-L-Thr se simbolizan como GE y VT, respectivamente, de acuerdo con las recomendaciones de IUPAC-IUB publicadas en Arch. Biochem. Biophys. 115:1-12 (1966). Estos dipéptidos están disponibles de Sigma Chemical Company (P.O. Box 14508, St. Louis, Missouri, 63178-9916).
En otro aspecto, la invención proporciona polímeros de péptidos que comprenden un conjunto en serie de 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 dipéptidos de L-Gly-L-Glu y L-Val-L-Thr o cualquier combinación de los mismos, o sales farmacéuticamente aceptables de tales polímeros, en donde los dipéptidos están unidos uno con otro mediante péptidos. Los polímeros pueden comprender al menos dos dipéptidos, en donde cada dipéptido del polímero es L-Gly-L-Glu y L-Val-L-Thr. Por ejemplo, polímeros de la invención incluyen los tetrapéptidos L-Gly-L-Glu-L-Gly-L-Glu, L-Val-L-Thr-L-Val-L-Thr, L-Gly-L-Glu-L-Val-L-Thr y L-Val-L-Thr-L-Gly-L-Glu.
Polímeros de péptidos de la invención, que incluyen polímeros de L-Gly-L-Glu que comprenden no más de 16 residuos aminoácidos, polímeros de L-Val-L-Thr que comprenden no más de 16 residuos aminoácidos y polímeros que comprenden L-Val-L-Thr y L-Gly-L-Glu y que tienen más de 16 residuos aminoácidos y sus combinaciones, son digeridos típicamente de modo enzimático en la sangre o en los tejidos vivos o en órganos vivos para dar sus dipéptidos y tetrapéptidos respectivos. Se espera que los dipéptidos y tetrapéptidos que se liberan de polímeros de este tipo mediante digestión enzimática ejerzan los mismos efectos profilácticos y terapéuticos que lo hacen los dipéptidos y tetrapéptidos de la invención, incluidos los dipéptidos L-Gly-L-Glu y L-Val-L-Thr, y tetrapéptidos formados a partir de combinaciones de L-Gly-L-Glu y L-Val-L-Thr.
En otro aspecto, los péptidos de la invención se caracterizan por ser extraibles del miocardio a un pH de carácter ácido, incluido en un intervalo de aproximadamente 2 a aproximadamente 3,5, y aislables a partir del mismo en un volumen incluido de una resina cromatográfica G-25 superfina que no tiene ningún efecto sobre la contracción tóxica de una muestra de probeta de musculatura lisa inducida por una elevada concentración de cloruro de potasio, y que tiene un tamaño molecular menor que aproximadamente 15.000 daltons y, lo más preferiblemente, menor que aproximadamente 5.000 daltons. Un péptido de este tipo se puede denominar un "péptido del miocardio", ya que se aísla del miocardio. Alternativamente, los péptidos objetos de la invención se pueden sintetizar a partir de aminoácidos que se producen en la naturaleza y que pueden comprender un conjunto en serie de no más de 16 residuos L-aminoácidos.
A pesar que los péptidos de la invención se describen principalmente utilizando el término "péptido" o "péptidos", un experto en la técnica, tras leer la presente memoria descriptiva, apreciará que estos términos incluyen también análogos y derivados estructurales de los péptidos antes descritos. Por ejemplo, además de los péptidos antes descritos, que pueden comprender aminoácidos que se producen en la naturaleza, también se proporcionan peptidomiméticos de los péptidos de la presente invención. Análogos de péptidos se utilizan habitualmente en la industria farmacéutica en calidad de fármacos no peptídicos con propiedades análogas a las del péptido plantilla. Estos tipos de compuestos no peptídicos se denominan "miméticos de péptidos" o "peptidomiméticos" y se desarrollan habitualmente con ayuda de un modelo molecular computarizado. Fauchere, J., Adv. Drug Res. 15:29 (1986); Veber y Freidinger, TINS 392 (1985); y Evans et al., J. Med. Chem. 30:1229 (1987). Miméticos de péptidos que son estructuralmente similares a péptidos terapéutica o profilácticamente útiles se pueden utilizar para producir un efecto terapéutico o profiláctico equivalente. En general, peptidomiméticos son estructuralmente similares a un péptido paradigma (es decir, un péptido que tenga una actividad biológica o farmacológica) tal como péptidos que se producen en la naturaleza con una actividad de abridor del canal de potasio, pero que tienen uno o más enlaces péptido opcionalmente reemplazados por un enlace seleccionado del grupo consistente en: -CH_{2}NH-, -CH_{2}S-, -CH_{2}-CH_{2}- -CH=CH- (cis y trans), -COCH_{2}-, -CH(OH)CH_{2}- y -CH_{2}SO-. Peptidomiméticos de este tipo se pueden generar por métodos conocidos en la técnica y descritos adicionalmente en las siguientes referencias: Spatola, A.F. en CHEMISTRY AND BIOCHEMISTRY OF AMINO ACIDS, PEPTIDES, AND PROTEINS 267 (B. Weinstein, eds. 1983); Spatola, A.F. Vega Data Vol. 1, Facículo 3, "Peptide Backbone Modification" (marzo de 1983) (revisión general); Morley, J.S., Trends Pharm Sci., págs. 463-468 (1980) (revisión general); Hudson, D. et al., Int. J. Pept. Prot. Res. 14:177-185 (1979) (-CH_{2}NH-, -CH_{2}CH_{2}-); Spatola, A.F. et al., Life Sci. 38:1243-1249 (1986) (-CH_{2}-S); Hann, M., J. Chem. Soc. Perkin Trans. I 307-314 (1982) (-CH-CH-, cis y trans); Almquist, R.G. et al., J. Med. Chem. (1980) 23:1392-1398 (-COCH_{2}-); Jennings-White, C. et al., Tetrahedron Lett. 23:2553 (1982) (-COCH_{2}-); Szelke, M. et al., solicitud de patente europea EP 45665 (1982) CA: 97:39405 (1982) (-CH(OH)CH_{2}-); Holladay, M.W. et al., Tetrahedron Lett. 24:4401-4404 (1983) (-CH(OH)CH_{2}-); y Hruby, V.J., Life Sci. 31:189-199 (1982) (-CH_{2}-S).
Miméticos de péptidos pueden tener ventajas importantes frente a realizaciones de péptidos que incluyen, por ejemplo: producción más económica; mayor estabilidad química; propiedades farmacológicas reforzadas (semivida, absorción, potencia, eficacia, etc.); especificidad alterada (por ejemplo un amplio espectro de actividades biológicas), antigenicidad reducida; y otros.
Para algunas aplicaciones, también puede ser deseable proporcionar los péptidos de la invención en forma de entidades marcadas, es decir fijadas o enlazadas covalentemente a un grupo detectable, para facilitar la identificación, detección y cuantificación del péptido en una circunstancia dada. Estos grupos detectables pueden comprender un grupo de proteína detectable, por ejemplo una enzima ensayable o un epítopo de anticuerpo según se describe anteriormente en la discusión de las proteínas de fusión. Alternativamente, el grupo detectable puede seleccionarse de una diversidad de otros grupos detectables o marcas, tales como radiomarcas (por ejemplo ^{125}I, ^{32}P o ^{31}S) o un grupo quimioluminiscente o fluorescente. De manera similar, el grupo detectable puede ser un sustrato, cofactor, inhibidor o ligando de afinidad. La derivatización (por ejemplo marcaje) de peptidomiméticos no debería interferir sustancialmente con la actividad biológica o farmacológica deseada del peptidomimético. En general, se piensa que peptidomiméticos de péptidos de la invención poseen una actividad biológica detectable (es decir una capacidad de activar y de abrir los canales de potasio).
Una sal farmacéuticamente aceptable de un péptido objeto de la invención puede prepararse fácilmente a partir de un péptido (o su análogo) por métodos convencionales. Por ejemplo, una sal de este tipo puede prepararse tratando el péptido con una solución acuosa del hidróxido metálico farmacéuticamente aceptable deseado u otra base metálica y luego evaporando la solución resultante hasta sequedad, preferiblemente bajo presión reducida en una atmósfera de nitrógeno. Alternativamente, una solución del péptido se puede mezclar con un alcóxido del metal deseado, y la solución se puede subsiguientemente evaporar hasta sequedad. Los hidróxidos, bases y alcóxidos farmacéuticamente aceptables abarcan aquellos con cationes para este fin, que incluyen pero no se limitan a potasio, sodio, amonio, calcio y magnesio. Otras sales farmacéuticamente aceptables representativas incluyen, hidrocloruro, hidrobromuro, sulfato, bisulfato, acetato, oxalato, valerato, oleato, laurato, borato, benzoato, lactato, fosfato, tosilato, citrato, maleato, fumarato, succinato, tartrato y similares.
Puede ser deseable estabilizar los péptidos de la invención y sus análogos o derivados para aumentar su duración de conservación y semivida farmacocinética. La estabilidad en la duración de conservación se mejora añadiendo excipientes tales como a) agentes hidrófobos (por ejemplo, glicerol), b) azúcares (por ejemplo sacarosa, manosa, sorbitol, ramnosa o xilosa); c) hidratos de carbono complejos (por ejemplo lactosa); y/o d) agentes bacteriostáticos. La duración de conservación farmacocinética de los péptidos objetos de la invención se puede modificar mediante acoplamiento a péptidos, polipéptidos e hidratos de carbono vehículo utilizando una derivatización química (por ejemplo, mediante acoplamiento de la cadena lateral o residuos N- o C-terminales) o alterando químicamente un aminoácido del péptido objeto de la invención. La duración de conservación farmacocinética y la farmacodinámica de estos péptidos también se puede modificar mediante: a) encapsulación (por ejemplo en liposomas); b) control del grado de hidratación (por ejemplo controlando el grado y el tipo de glicosilación del péptido); y c) control de la carga electrostática y de la hidrofobicidad del péptido.
Existe una amplia diversidad de procesos para la síntesis de péptidos, constituyendo el método preferido habitualmente la síntesis en fase sólida. Con este método. un aminoácido se une a una partícula de resina, y el péptido se genera de una manera escalonada mediante adiciones sucesivas de aminoácidos protegidos para producir una cadena de aminoácidos. Comúnmente se utilizan modificaciones de la técnica descrita por Merrifield. Véase, por ejemplo, Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 96:2989-93 (1964). En un método en fase sólida automatizado, los péptidos se sintetizan mediante la carga del aminoácido carboxi-terminal sobre un enlazador orgánico (por ejemplo, PAM, 4-oximetil-fenilacetamidometilo), que está fijado covalentemente a una resina de poliestireno insoluble reticulada con divinil-benceno. La amina terminal puede protegerse mediante bloqueo con t-butiloxicarbonilo. Grupos hidroxilo y carbonilo son comúnmente protegidos mediante bloqueo con grupos O-bencilo. La síntesis se consigue en un sintetizador de péptidos automatizado, tal como el disponible de Applied Biosystems. Véase, por ejemplo, Modelo 430-A, Applied Biosystems, Foster City, California.
Después de la síntesis, el producto se puede separar de la resina. Los grupos de bloqueo se separan utilizando ácido fluorhídrico o ácido trifluorometilsulfónico de acuerdo con métodos establecidos. Véase, por ejemplo, Bergot y McCurdy, Applied Biosystems Bulletin (1987). Una síntesis rutinaria puede producir 0,5 mmol de péptido-resina. Después de la escisión y de la purificación, se produce típicamente un rendimiento de aproximadamente 60 a 70%. La purificación de los péptidos producto se consigue, por ejemplo, cristalizando el péptido en un disolvente orgánico tal como metil-butil-éter, disolviéndolo luego en agua destilada y utilizando la diálisis (si el peso molecular del péptido objeto de la invención es mayor que aproximadamente 500 daltons) o cromatografía líquida a alta presión en fase reversa (por ejemplo utilizando una columna C^{18} con ácido trifluoroacético al 0,1% y acetonitrilo en calidad de disolventes), si el peso molecular del péptido es menor que 500 daltons. El péptido purificado se puede liofilizar y almacenar en un estado seco hasta su uso.
Los péptidos de la invención son solubles en agua a bajas concentraciones en las que se utilizan típicamente. Péptidos de este tipo se utilizan preferiblemente en forma de sus sales ácidas o alcalinas formadas con agentes farmacéuticamente aceptables, tales como ácido acético, ácido cítrico, ácido maleico o ácido succínico. Sales libremente solubles de los péptidos objetos de la invención también se pueden convertir en sales de baja solubilidad en fluidos corporales mediante la modificación con una sal farmacéuticamente aceptable y ligeramente soluble en agua (tal como ácido tánico o ácido palmoico), mediante inclusión en una formulación de péptido que se libera con el tiempo (tal como a través de acoplamiento covalente a una proteína o péptido vehículo mayor) o mediante inclusión en cápsula de liberación con el tiempo y similar. En general, las sales ácidas de los péptidos de la invención serán biológica y farmacológicamente equivalentes a los propios péptidos.
C. Actividades farmacológicas de péptidos de la invención
Tal como se ha señalado antes, los péptidos de la invención exhiben un amplio conjunto de actividades farmacológicas y biológicas asociadas con la activación o apertura de los canales de potasio. En un aspecto, los péptidos de la invención tienen la capacidad de regular la actividad funcional de la musculatura lisa de órganos, como lo hacen los conocidos abridores del canal de potasio. Las actividades del abridor del canal de potasio de estos péptidos se pueden medir mediante ensayos estándares, midiendo el flujo de salida incrementado de iones potasio desde el interior de una célula de ensayo eléctricamente excitable que tiene un canal de potasio en su membrana celular son bien conocidas por los expertos en la técnica. Ensayos de este tipo incluyen ensayos de parche y grapa estándares que son bien conocidos en la técnica.
De manera notable, los péptidos de la invención son capaces de inducir y producir la relajación de una diversidad de tipos de músculo liso. Al igual que con los abridores del canal de potasio estándares, los péptidos objetos de la invención inhiben la tensión espontánea y las respuestas contráctiles de los músculos lisos y reducen la actividad contráctil espontánea del músculo liso, al tiempo que no tienen o sólo tienen efectos mínimos sobre la contracción tónica inducida por potasio de músculos lisos. Los péptidos de la invención también exhiben efectos vasorrelajantes, según se evidencia, por ejemplo, por su capacidad para disminuir la amplitud de las contracciones del músculo liso vascular espontáneo.
Péptidos de la invención que inducen la relajación del músculo liso suprimiendo la amplitud de contracciones espontáneas del músculo liso de una manera similar a la de los bloqueadores del canal de calcio estándares (tal como Verapamil®). Se piensa que la supresión de la contracción espontánea del músculo liso por parte de estos péptidos está asociada con uno o más mecanismos de acción. En primer lugar, la administración de estos péptidos a una célula del músculo liso (o el contacto de estos péptidos con una célula del músculo liso) puede producir un desplazamiento en el potencial de reposo de la membrana de la célula del músculo liso hacia un valor más negativo (es decir, una hiperpolarización) mediante la apertura de canales de potasio en la membrana celular, provocando con ello un flujo hacia el exterior incrementado de iones potasio desde el interior de la célula hacia el exterior de la célula a través de los canales durante las fases 3 y 4 de un potencial de acción. En segundo lugar, estos péptidos pueden acelerar una repolarización de la célula, influyendo de este modo vicariamente sobre el influjo de ion calcio a través de los canales de calcio sensibles a la tensión y, en última instancia, la liberación del ion calcio del retículo sarcoplásmico esencial para el acoplamiento de excitación-contracción. Dado que la excitabilidad de las células del músculo liso depende en gran medida del potencial de reposo de la membrana, y la actividad contráctil de la célula del músculo liso depende de la concentración de calcio intracelular, péptidos que actúan a través de uno o más de estos dos mecanismos pueden inhibir las concentraciones de células del músculo liso en análisis de ensayo.
De manera significativa, los péptidos de la invención no ejercen efectos supresores de este tipo en análisis de ensayo en los que el fluido extracelular tenga una alta concentración de ion potasio. Esto se considera generalmente una característica importante de los abridores del canal de potasio. Una concentración de ion de potasio extracelular elevada desplazará típicamente el potencial de la membrana en equilibrio hacia un valor más positivo, induciendo con ello la contracción. Bajo condiciones de este tipo, un péptido con una actividad de abridor del canal de potasio puede fallar en la inhibición de la actividad contráctil de una célula. Bajo tales circunstancias, a pesar de que los canales de potasio de una membrana celular estén activados, los iones potasio en la célula no pueden fluir hacia afuera en contra del gradiente de concentración.
La relajación y contracción del músculo liso puede observarse mediante una diversidad de métodos bien conocidos. Por ejemplo, la relajación del músculo liso gastrointestinal puede observarse clínicamente mediante el examen del abdomen o mediante diversos métodos radiográficos, tales como estudios de colorante de contraste, ememas de bario y similares, o midiendo la reducción en la actividad peristáltica (por ejemplo, utilizando un estetoscopio para vigilar la actividad peristáltica).
En otro aspecto, los péptidos de la invención exhiben actividades farmacológicas de agentes anti-isquémicos, según se observa con determinados abridores de canales de potasio conocidos. De manera importante, los péptidos objetos de la invención restauran la función inotrópica del miocardio isquémico, sin inducir arritmia. Los péptidos objetos de la invención optimizan el trabajo contráctil del músculo isquémico y restauran la función contráctil a niveles pre-isquémicos según se evidencia por su capacidad de: (i) restaurar las presiones diferenciales cardíacas; (ii) inhibir las contracciones ventriculares prematuras (PVCs - siglas inglesas); (iii) restaurar las presiones diastólicas a valores normales; y (iv) restaurar la presión de desarrollo y la fuerza contráctil del ventrículo izquierdo. Los péptidos objetos de la invención exhiben una actividad inotrópica positiva en el miocardio isquémico (es decir, aumentan la eficacia del trabajo del corazón según se mide por el rendimiento cardíaco incrementado sin un consumo incrementado de oxígeno, una tasa metabólica incrementada o la inducción de arritmia) y una débil actividad crónotrópica negativa cuando se inyectan por vía intraperitoneal o intravenosa, o cuando se introducen en la circulación cardíaca (es decir, a través de la aorta) a determinadas concentraciones (por ejemplo, aproximadamente 10^{-5} a 10^{-7} M). Tal como se utiliza en esta memoria, un incremento en la eficacia del trabajo del corazón se refiere a una capacidad de realizar un mayor trabajo del corazón con menos gasto de energía, según se puede medir, por ejemplo, determinando el volumen de salida de sangre de un corazón que late a un ritmo particular a lo largo de un período de tiempo definido. Además, los péptidos de la invención exhiben una actividad cronotrópica débil negativa o nula (es decir, los péptidos objetos de la invención no aumentan el ritmo cardíaco, sino que en su lugar disminuyen el ritmo cardíaco o no tienen ningún efecto sobre el ritmo cardíaco. Tal como se utiliza en esta memoria, el término "cronotrópico" significa afectar la tasa de los movimientos rítmicos, tal como el ritmo del latido del corazón o contracciones cardíacas. La expresión "cronotrópico positivo" significa aumentar la tasa de movimientos rítmicos (por ejemplo incrementando el ritmo del latido del corazón o las contracciones cardíacas). La expresión "cronotrópico negativo" significa disminuir la tasa de movimientos rítmicos (por ejemplo disminuyendo el ritmo de contracciones cardíacas o el latido del corazón).
Péptidos de la invención reducen el grado de lesiones de miocardio isquémicas sin afectar adversamente a las funciones inotrópicas del corazón, según se evidencia por los bajos niveles de actividades enzimáticas de determinadas enzimas del miocardio intracelulares en la sangre tras el inicio de isquemia, según se discute con mayor detalle más abajo.
Los péptidos objetos de la invención actúan como agentes antiarrítmicos, reduciendo la incidencia de contracciones ventriculares prematuras o episodios de taquicardia ventricular o fibrilación ventricular. De manera importante, los péptidos objetos de la invención no tienen ningún efecto sobre el funcionamiento cardíaco normal.
Péptidos de la invención ejercen también efectos cardioprotectores que son similares a los generalmente observados con abridores del canal de potasio conocidos. Efectos cardioprotectores de este tipo incluyen: (1) restaurar la función inotrópica del miocardio isquémico (que puede ser evaluada midiendo las presiones sistólica y diastólica ventriculares, la presión de evolvente ventricular y las tasas de elevación y reducción de la presión ventricular máxima), pero no induciendo arritmia; (2) fomentar efectos anti-isquémicos disminuyendo el grado de isquemia en un tejido u órgano o disminuyendo el grado de lesiones en el miocardio del corazón tras una interrupción del flujo de sangre al músculo del corazón (tal como después de una oclusión coronaria) sin afectar adversamente a las funciones inotrópicas del corazón; (3) prevenir el desarrollo de arritmias (o disritmias), en que se utilizó cloroformo u oclusión coronaria para inducir la arritmia (o disritmia) según se refleja en una reducción del número de contracciones ventriculares prematuras o disminuyendo la duración total de los episodios de taquicardia ventricular o fibrilación ventricular; (4) producir efectos vasodilatadores, incluida una actividad coronario-dilatadora y efectos hipotensores; (5) tener un efecto mínimo o ningún efecto sobre la función inotrópica del miocardio o sobre el ritmo cardíaco de un corazón normal; y (6) tener una influencia mínima o ninguna sobre los parámetros electrofísiológicos del corazón normal, según se refleja por mediciones de electrocardiograma del miocardio normal.
Análisis de ensayo para evaluar las funciones del corazón son también bien conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, la vigilancia por electrocardiograma (ECG) se utiliza rutinariamente para identificar y medir contracciones ventriculares prematuras, taquicardia ventricular y fibrilaciones ventriculares. El grado de isquemia en un tejido u órgano de un sujeto puede determinarse mediante examen patológico tosco, examen histológico o medición de la actividad de un órgano in vivo o in vitro. La actividad del órgano cardíaco se puede determinar por diversos métodos comúnmente conocidos (tal como midiendo el ritmo cardíaco o la presión diastólica, sistólica, diferencial o de desarrollo en las cámaras del corazón, o midiendo el nivel de enzimas del músculo cardíaco, tal como creatinina fosfoquinasa, en la sangre).
Como se ha señalado antes, los péptidos de la invención reducen la actividad contráctil espontánea del músculo liso vascular. Sin embargo, en contraposición notoria a los bloqueadores del calcio, los péptidos objetos de la invención no ejercen ningún efecto sobre la contracción tónica inducida por elevadas concentraciones de cloruro de potasio. Los péptidos objetos de la invención exhiben actividades vasodilatadoras y son capaces de disminuir la presión media de la sangre arterial en sujetos que necesitan un tratamiento de este tipo. Estas actividades vasodilatadoras incluyen actividades coronario-dilatadoras (es decir, aumentar el área en sección transversal de un vaso sanguíneo coronario, tal como, por ejemplo, en una arteria coronaria) y actividades hipotensoras (es decir, provocando una reducción en la presión sanguínea).
Ensayos para medir los efectos vasodilatadores y anti-arrítmicos de sustancias son bien conocidos en la técnica e incluyen los ensayos ilustrados más abajo. Tal como se ha señalado antes, la vasodilatación puede aumentar el volumen de la sangre que fluye a través de un vaso y/o disminuir la presión de la sangre en el vaso. La vasodilatación se puede detectar y medir mediante una diversidad de técnicas y mediciones clínicas estándares. Por ejemplo, la vasodilatación está indicada en el caso de un sujeto que muestre un incremento en el eritema (por ejemplo, una rojez de la piel debida a un incremento en el flujo de sangre a la piel o "rubor"), una disminución de la presión sanguínea, un aumento en el ardor de la piel diana, o congestión vascular. La congestión vascular que sirve como indicación de la vasodilatación, se puede observar fácilmente en venas superficiales. El flujo de sangre se puede medir por métodos estándares, incluidas mediciones de la presión sanguínea mediante esfingomanómetro convencionales y mediciones del transductor de la presión. En los ejemplos que figuran más abajo se presentan también ensayos ilustrativos para detectar y medir la vasodilatación.
Adicionalmente, los péptidos objetos de la invención inducen y producen una relajación del músculo del esqueleto, según se evidencia por su capacidad de disminuir la amplitud de las contracciones del músculo liso intestinal inducidas por calcio. Al igual que con el tejido del músculo liso, se piensa que estos péptidos inducen la relajación del músculo del esqueleto activando o abriendo los canales de potasio del músculo del esqueleto. Ensayos para medir la contracción y relajación del músculo del esqueleto son bien conocidos por los expertos en la técnica e incluyen los descritos anteriormente.
Dadas sus actividades relajantes del músculo liso, se espera que también los péptidos de la invención relajen el músculo liso de las vías respiratorias (tal como el músculo liso traqueal) y que exhiban efectos broncodilatadores sobre el músculo liso bronquial. Se piensa que estos efectos broncodilatadores median a través de un mecanismo común que implica la restauración del diseño normal del funcionamiento electrofisiológico en las células eléctricamente excitables de un tejido patológicamente alterado (por ejemplo, músculo liso bronquial patológicamente modificado). Análisis de ensayo para medir la relajación del músculo liso de las vías respiratorias y el efecto broncodilatador, tal como en ensayos de funcionamiento de los pulmones ex vivo o in vivo, son bien conocidos en la técnica.
Además, debido a sus efectos relajantes del músculo liso, se anticipa que los péptidos de la invención ejercen efectos relajantes sobre el miometrio durante el embarazo y alivian las contracturas premenstruales y las contracciones prematuras del útero. Efectos de este tipo se pueden medir fácilmente por procedimientos bien conocidos por un experto en la técnica.
Debido a sus actividades activantes del canal de potasio, se piensa que los péptidos de la invención reducen la excitabilidad neuronal y exhiben efectos anticonvulsivos sobre las células del cerebro. La actividad eléctrica del cerebro se puede medir utilizando técnicas electroencefalográficas, escaneo PET y similares.
Al igual que agentes anti-isquémicos, los péptidos de la invención actúan para preservar a los tejidos y órganos. Se piensa que los efectos de preservación de estos péptidos están asociados con sus propiedades de abridor del canal de potasio y su capacidad de regular los canales de potasio. Análisis de ensayo para evaluar efectos de preservación de este tipo son generalmente conocidos en la técnica e incluyen los descritos anteriormente.
Ensayos ilustrativos para detectar y medir las actividades farmacológicas y biológicas de los péptidos de la invención se proporcionan en los ejemplos que figuran más abajo.
III. Composiciones farmacéuticas
La invención proporciona composiciones farmacéuticas en forma de dosificación unitaria que comprenden los péptidos de esta invención. Estos péptidos son útiles para tratar o prevenir enfermedades que responden a la apertura de canales de potasio en un sujeto que los necesita según se describe anteriormente. En particular, composiciones farmacéuticas que comprenden los péptidos de la invención son útiles para tratar o prevenir enfermedades cardiovasculares, inducir y producir la relajación del músculo liso e inducir y producir la relación del músculo esquelético. Composiciones farmacéuticas de la invención en forma de dosificación unitaria comprenden generalmente, por dosificación unitaria, un intervalo de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 1000 mg de L-Gly-L-Glu o L-Val-L-Thr o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En un aspecto preferido de la invención, la composición comprende por dosificación unitaria, un intervalo de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 100 mg de L-Gly-L-Glu, L-Val-L-Thr o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un vehículo farmacéuticamente.
La forma preferida de estas composiciones farmacéuticas depende del modo de administración y de la aplicación terapéutica pretendidos. Las composiciones pueden incluir (en función de la formulación deseada) vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables y no tóxicos, que se definen como vehículos comúnmente utilizados para formular composiciones farmacéuticas para la administración animal o humana.
IV. Aplicaciones A. Métodos terapéuticos y profilácticos
Esta invención proporciona métodos para tratar terapéutica o profilácticamente enfermedades y trastornos que responden a, son sensibles o están asociados con la apertura del canal de potasio en sujetos que necesitan un tratamiento de este tipo. Estos sujetos pueden incluir seres humanos y animales, particularmente mamíferos vertebrados. Los sectores de uso terapéuticos y profilácticos principales de estos péptidos incluyen tratamientos diseñados para conseguir los siguientes efectos: (1) efectos vasodilatadores, incluida dilatación coronaria, y efectos hipotensores (por ejemplo, utilizando los péptidos objetos de la invención para tratar sujetos que padecen insuficiencia cardíaca o para prevenir la insuficiencia cardíaca en sujetos que lo necesitan); (2) efectos cardioprotectores anti-isquémicos, que incluyen reducir el grado de lesiones isquémicas del miocardio sin afectar adversamente a las funciones inotrópicas del corazón (por ejemplo, utilizando los péptidos objetos de la invención para tratar sujetos después de una apoplejía y ataque al corazón); (3) efectos broncodilatadores (por ejemplo, utilizando los péptidos para tratar o prevenir el asma, trastornos broncoespásticos o síndrome broncoespástico y/o para inducir la relajación de la musculatura lisa de los bronquios); (4) efectos relajantes del músculo liso (por ejemplo, utilizando los péptidos para tratar embarazos anormales, incluidos estados que implican contracciones prematuras del útero y entumecimientos premenstruales, y para relajar el miometrio de sujetos durante el embarazo); (5) efectos relajantes del músculo del esqueleto; (6) efectos anti-epilépticos y anticonvulsivos; (7) reducción de la excitabilidad neuronal; y (8) regulación de la secreción de insulina. De manera importante, los péptidos de la invención son capaces de producir estos efectos a bajos niveles de dosificación y sin efectos secundarios tóxicos.
En un aspecto, esta invención proporciona métodos para el tratamiento profiláctico o terapéutico de enfermedades y trastornos que se pueden tratar mediante, responden a o son sensibles a la apertura de canales de potasio en membranas de la célula de sujetos que necesitan un tratamiento de este tipo. En lo que figura más abajo se comentan enfermedades y trastornos representativos. Estos métodos comprenden administrar a un sujeto que lo necesita, incluido un ser humano, una cantidad eficaz de un péptido de la invención según se describe antes. Generalmente, el péptido comprende L-Gly-L-Glu, L-Val-L-Thr, un polímero de L-Gly-L-Glu que comprende no más de 16 residuos aminoácidos, un polímero de L-Val-L-Thr que comprende no más de 16 residuos aminoácidos, un polímero de L-Val-L-Thr y L-Gly-L-Glu que comprende no más de 16 residuos aminoácidos o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos. Además, el péptido puede comprender un polímero de L-Val-L-Thr y L-Gly-L-Glu que comprende no más de 16 residuos aminoácidos.
En otro aspecto, la invención proporciona métodos específicamente dirigidos a tratar y prevenir enfermedades cardiovasculares asociadas con los canales de potasio, o que responden a la apertura o activación de canales de potasio. Enfermedades cardiovasculares de este tipo se discuten con detalle más abajo. Estos métodos comprenden administrar a un sujeto que lo necesita, incluido un ser humano, una cantidad eficaz de un péptido de la invención según se describe antes. El péptido comprende típicamente L-Gly-L-Glu, L-Val-L-Thr, un polímero de L-Gly-L-Glu que comprende no más de 16 residuos aminoácidos, un polímero de L-Val-L-Thr que comprende no más de 16 residuos aminoácidos, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos. El péptido puede comprender un polímero de L-Val-L-Thr y L-Gly-L-Glu que comprende no más de 16 residuos aminoácidos.
La presente invención también incluye métodos para inducir y producir la relajación del músculo liso en sujetos que necesitan un tratamiento de este tipo. Todavía en otra realización, la invención proporciona métodos para inducir y producir la relajación del músculo del esqueleto en sujetos que lo necesitan. Ambos métodos comprenden administrar al sujeto, que puede ser un ser humano, una cantidad eficaz de un péptido de la invención, según se describe antes. Habitualmente, el péptido comprende L-Gly-L-Glu, L-Val-L-Thr, un polímero de L-Gly-L-Glu que comprende no más de 16 residuos aminoácidos, un polímero de L-Val-L-Thr que comprende no más de 16 residuos aminoácidos, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos. El péptido puede comprender un polímero de L-Val-L-Thr y L-Gly-L-Glu que comprende no más de 16 residuos aminoácidos. Métodos de este tipo se pueden emplear para relajar diversos tipos de músculo liso, incluido el músculo liso intestinal, bronquial, traqueal, uterino, de la vejiga, del intestino, de los vasos deferentes y vascular.
B. Enfermedades y trastornos susceptibles de tratamiento
Debido a su capacidad de activar y abrir canales de potasio, los péptidos de esta invención son útiles para tratar o prevenir un amplio conjunto de enfermedades y trastornos que responden o son sensibles a la apertura de canales de potasio o están asociados con actividades del abridor del canal de potasio (incluidas las enfermedades o trastornos en los que la membrana celular del tejido u órgano del sujeto está parcialmente despolarizada, por ejemplo como en el caso de tejidos u órganos isquémicos). Péptidos de la invención son eficaces para tratar y aliviar enfermedades cardiovasculares que están asociadas con los canales de potasio o que son las responsables de la activación del canal de potasio. Los péptidos objetos de la invención son especialmente útiles para tratar y prevenir todas las formas de enfermedad cardíaca isquémica descritas en esta memoria (incluido infarto de miocardio, angina de pecho, insuficiencia coronaria aguda y crónica y cardioesclerosis por infarto post-miocardial). Los péptidos objetos de la invención actúan también con éxito en calidad de agentes anti-isquémicos y cardioprotectores para reducir el grado de lesiones isquémicas en el corazón, sin afectar adversamente a las respectivas funciones inotrópicas del corazón, según se discutió anteriormente. De manera notable, los péptidos de la invención restauran y mejoran la función cardíaca mecánica después del inicio de la isquemia e inhiben la formación de la contractura cardíaca. Los efectos cardioprotectores de estos péptidos están asociados, en parte, con su capacidad de regular y activar los canales de potasio en tejido del miocardio isquémico (es decir, de hiperpolarizar o inhibir una despolarización adicional de células portadoras de canales de potasio en el tejido isquémico). Estos péptidos ayudan a prevenir la lesión del corazón que típicamente se produce durante diversos malfuncionamientos cardíacos (por ejemplo, infarto de miocardio agudo).
Los péptidos objetos de la invención protegen también el corazón al proveerle de la capacidad de resistir mejor una desprivatización de oxígeno transitoria. Una característica de la lesión de células del miocardio en la isquemia e hipoxia es la perturbación de la función respiratoria de las mitocondrias o una reducción en o el bloqueo del suministro de oxígeno a las células del miocardio. Los efectos vasodilatadores de estos péptidos pueden dar como resultado un flujo incrementado de sangre y oxígeno al corazón.
Los péptidos de la invención son también útiles para tratar y prevenir otras enfermedades cardiovasculares asociadas con los canales de potasio o que responden a la activación del canal de potasio. Enfermedades de este tipo incluyen, pero no se limitan a disritmias cardíacas (incluida taquicardia paroxismal rítmica y otras formas de taquicardia, tal como taquicardia ventricular, fibrilación ventricular, ectopía supraventricular y latidos prematuros no especificados); arritmias cardíacas, cardiomiopatía y distrofia del miocardio; todos los tipos de enfermedad hipertensiva; fallo cardíaco congestivo; hipoxia; enfermedades cardiovasculares que resultan de la exposición a toxinas químicas; insuficiencia cardíaca; y enfermedades cardiovasculares asociadas con trastornos de la conducción (por ejemplo bloqueos AV de diferentes grados de gravedad). Véase, por ejemplo, Guermonprez et al., supra. Adicionalmente, debido a que los péptidos de la invención son agentes antiarrítmicos, vasodilatadores, dilatadores coronarios o hipotensores eficaces, pueden ser útiles para tratar y prevenir enfermedades cardiovasculares (y trastornos relacionados) que se pueden beneficiar de efectos de este tipo.
Adicionalmente, los péptidos de la invención son útiles para inducir y provocar una relajación del músculo liso y para tratar y prevenir enfermedades, trastornos y trastornos asociados con las contracciones del músculo liso y enfermedades que responden a la moderación de la respuesta contráctil del músculo liso. Los péptidos objetos de la invención son de ayuda para relajar el músculo liso vascular y las paredes de los vasos sanguíneos y para tratar y prevenir enfermedades, trastornos y trastornos asociados con la patología del músculo liso vascular.
Péptidos de la invención son también útiles para relajar el músculo liso no vascular (tal como la traquea, bronquios, vejiga urinaria, intestino, útero, vasos deferentes) y para tratar y prevenir trastornos, estados y enfermedades del músculo liso no vascular, incluidos trastornos hiper-reactivos del músculo liso no vascular (tal como asma, intestino irritable, vejiga irritable), estados hiper-reactivos en los pulmones y el tracto gastrointestinal y diversos estados alérgicos asociados con la reactividad del músculo liso anormalmente incrementada (por ejemplo, asma y trastornos broncoespásticos). Con sus propiedades relajantes del músculo liso, los péptidos objetos de la invención son útiles para tratar, prevenir y aliviar entumecimientos premenstruales, contracciones prematuras del útero y/o complicaciones que resultan de un tono incrementado del miometrio.
Tal como se señaló antes, se anticipa que los péptidos de la invención relajan el músculo liso de las vías respiratorias (por ejemplo el tejido del músculo liso bronquial) y exhiben efectos broncodilatadores, al igual que lo hacen abridores del canal de potasio conocidos. Se anticipa que los péptidos objetos de la invención son de beneficio para tratar, manipular y evitar trastornos asociados con el asma bronquial, incluida la broncoconstricción, estados broncoespásticos y síndrome broncoespástico y similares. La broncodilatación es indicada por una respiración mejorada en un paciente de asma y puede ser medida mediante una diversidad de ensayos de la función pulmonar estándares, tal como el volumen expiratorio forzado (FEV_{1} - siglas en inglés).
Dado que estos péptidos relajan el músculo liso e inhiben la contracción del músculo liso, son útiles para tratar y prevenir estados patológicos, situaciones o enfermedades que generalmente resultan o implican una contracción del músculo liso vascular patológica o una supra-reactividad del músculo liso (por ejemplo hipertensión). De manera similar, los péptidos objetos de la invención son útiles para tratar y prevenir la enfermedad vascular periférica y estados en los que se desea una reducción de la actividad peristáltica.
Adicionalmente, debido a que los péptidos de la invención relajan el músculo liso vascular e inducen una vasodilatación, son útiles en el tratamiento profiláctico y terapéutico de enfermedades o trastornos que se pueden tratar mediante, responden o son sensibles a la vasodilatación. Por ejemplo, son de beneficio para tratar y prevenir hipertensión, tensión sanguínea elevada, enfermedad vascular periférica, y similares. De manera importante, la vasodilatación aumenta y restaura el flujo de sangre, oxígeno y nutrientes a tejidos dañados (tal como tejidos isquémicos) y tejidos que han sido desprovistos de sangre, oxígeno y nutrientes (tales como tejidos con zonas de hipoxia) y se puede prevenir, ralentizar o demorar la muerte de la célula. Como resultado, los péptidos objetos de la invención, con sus propiedades vasodilatadoras, son eficaces para prevenir y ralentizar la muerte de la célula en tejidos que han sido desprovistos de sangre, oxígeno y nutrientes, y para tratar y prevenir trastornos que resultan de este tipo de circunstancias (por ejemplo hipoxia, anoxia, isquemia).
Además, péptidos de la invención son útiles para inducir la relajación del músculo del esqueleto y para tratar y prevenir enfermedades y trastornos asociados con la contracción del músculo del esqueleto y enfermedades que responden a la moderación de la respuesta contráctil del músculo del esqueleto, incluidas determinadas miopatías del músculo del esqueleto y estados isquémicos del músculo del esqueleto. Carmeliet, Eur. Heart J. 12 (Supl. F): 30-37 (1991); McPherson, Gen. Pharmac. 24(2): 275-81 (1993).
Dadas sus propiedades relajantes del músculo liso y efectos vasodilatadores, se espera que los péptidos objetos de la invención sean útiles para tratar y prevenir la cirrosis del hígado. La cirrosis del hígado es una enfermedad crónica del hígado marcada por una destrucción progresiva y una regeneración de las células del hígado y la formación incrementada del tejido conjuntivo que, en última instancia, resulta en un bloqueo de la circulación portal, hipertensión portal, fallo del hígado y la muerte. Al inducir la relajación y vasodilatación del músculo liso, los péptidos objetos de la invención actúan para desviar el suministro de sangre fuera de la vena portal y, así, inhibir o ralentizar el progreso de la cirrosis. La actividad del hígado se puede determinar, generalmente, midiendo los niveles de enzimas (tal como fosfatasa alcalina) en la sangre periférica.
Los canales de potasio están ampliamente distribuidos en las células del cerebro y han estado implicados en diversos trastornos del cerebro, incluida epilepsia, anoxia, diversas enfermedades neurodegenerativas, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer y diversas formas de isquemia cerebral, incluida apoplejía y trauma. Véase, por ejemplo, Gopalakrishnan et al., supra; Ben-Ari et al., Neuroscience 37:55-60 (1990); Gandolfo et al., supra; Ashford et al., Nature 370:456-59 (11 de agosto de 1994). Se ha encontrado que abridores del canal de potasio conocidos reducen la excitabilidad neuronal y tienen efectos anticonvulsivos sobre las células del cerebro. Los efectos de los canales de potasio conocidos sobre las células del cerebro pueden ser debidos a varios mecanismos de acción. Al igual que en otros tejidos que tienen células con canales de potasio, la activación directa de los canales de potasio en células del cerebro parece reducir la excitabilidad de las células de este tipo y proteger a estas células.
Los abridores del canal de potasio pueden también beneficiar los tejidos del cerebro a través de sus propiedades vasodilatadoras. Algunas enfermedades neurodegenerativas se caracterizan, al menos en parte, por una carencia de oxígeno y de nutrientes en el tejido neuronal. Es sabido que una carencia progresiva de oxígeno y nutrientes en el cerebro y los tejidos neuronales fomenta el progreso de la enfermedad neurodegenerativa. Al mejorar el suministro de oxígeno y nutrientes al tejido neuronal, se pueden ralentizar y estabilizar enfermedades neurodegenerativas. La vasodilatación aumenta generalmente la circulación y el flujo de sangre y produce un suministro mejorado de oxígeno y nutrientes a los tejidos del cuerpo. Con sus efectos vasodilatadores, los abridores del canal del potasio pueden ayudar a retardar y estabilizar enfermedades neurodegenerativas, aumentando el flujo de oxígeno y nutrientes a los tejidos del cerebro que lo necesitan.
Dadas sus propiedades vasodilatadoras, se espera que los péptidos de la invención sean útiles para tratar y prevenir una diversidad de trastornos del cerebro que resultan, por ejemplo, de una excitabilidad neuronal excesiva o inadecauda. Se anticipa que los péptidos objetos de la invención reducen la excitabilidad neuronal y tienen efectos anti-isquémicos y anticonvulsivos sobre las células del cerebro que tienen canales del potasio. Así, los péptidos objetos de la invención deberían ser útiles para tratar y prevenir trastornos asociados con una lesión neuronal y una excitabilidad excesiva o inadecuada, incluida la epilepsia, anoxia, hipoxia, apoplejía, trauma, isquemia cerebral, convulsiones y enfermedad de Alzheimer.
Además, al igual que los vasodilatadores, los péptidos de la invención aumentan el flujo de sangre y el suministro de oxígeno y nutrientes a los tejidos neuronales y, así, mejoran la calidad y estabilidad de los tejidos neuronales y se espera que ralenticen el progreso de enfermedades neurodegenerativas. Así, los péptidos objetos de la invención son de beneficio para tratar y prevenir trastornos que resulten de una carencia o una desprovisión de oxígeno y nutrientes en los tejidos. Por estos motivos, los péptidos objetos de la invención son útiles para tratar y prevenir anoxia (por ejemplo, hipoxia cardíaca e hipoxia neuronal), hipoxia (por ejemplo, hipoxia cardíaca e hipoxia neuronal), enfermedad de Parkinson y enfermedad de Alzheimer. Además, dado que la epilepsia puede dispararse por una carencia de oxígeno y/o puede resultar de estados hipóxicos, se espera que los péptidos objetos de la invención sean útiles para tratar y prevenir la epilepsia y trastornos relacionados. De igual manera, los péptidos objetos de la invención son también útiles para tratar y prevenir isquemia cardíaca, ya que durante la isquemia cardíaca los miocitos sufren una pérdida de oxígeno y padecen la interrupción de la perfusión.
Además, dado que los canales de potasio pueden formar un bucle de retroalimentación con células beta pancreáticas para regular el apetito, se espera que los péptidos objetos de la invención sean de ayuda para tratar y prevenir trastornos y enfermedades del apetito y la alimentación. Gopalakrishnan et al., supra. Además, dado que los canales de potasio pueden estar asociados con la diabetes y trastornos relacionados, se piensa que los péptidos de la invención son útiles para tratar y prevenir la diabetes. Véase, por ejemplo, Ashford et al., supra.
También se anticipa que los péptidos son de ayuda para tratar y prevenir enfermedades del riñón. La actividad del riñón puede medirse vigilando el nivel de nitrógeno de urea en la sangre. Los péptidos de la invención son también de beneficio para preservar y conservar ex vivo tejidos y órganos vivos. Por ejemplo, péptidos de este tipo pueden utilizarse para preservar un tejido y órgano vivo tal como el corazón o un vaso sanguíneo, ex vivo antes del transplante (o re-implante) a un sujeto.
C. Dosificaciones y métodos de administración
En aplicaciones terapéuticas, un péptido de la invención se puede administrar a un sujeto que ya padece una enfermedad o estado indeseable (por ejemplo, enfermedad isquémica del corazón), en una cantidad suficiente para tratar, curar, detener parcialmente o ralentizar de manera detectable el progreso de la enfermedad y sus complicaciones. Una cantidad de un péptido de la invención eficaz para uso en aplicaciones terapéuticas dependerá de la gravedad del estado, del estado general del sujeto y de la vía de administración. La cantidad eficaz del péptido en aplicaciones terapéuticas estará, generalmente, dentro del intervalo de aproximadamente 0,15 microgramos por kilogramo (mg/kg) a aproximadamente 10 mg/kg del péptido (o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo) por dosis. La cantidad eficaz del péptido de esta invención puede oscilar entre aproximadamente 0,01 mg/kg y aproximadamente 10 mg/kg por dosis. Una cantidad eficaz de L-Gly-L-Glu o L-Val-L-Thr, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para uso en aplicaciones terapéuticas puede oscilar entre aproximadamente 0,15 mg/kg y aproximadamente 10 mg/kg del péptido respectivo (o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo) por dosis.
En aplicaciones profilácticas, los péptidos objetos de la invención o composiciones farmacéuticas de los mismos se administran a sujetos en riesgo de, pero que no padecen ya una enfermedad o estado indeseado. La cantidad eficaz del péptido a administrar dependerá del estado de salud del sujeto y del nivel general de inmunidad. La cantidad eficaz del péptido en aplicaciones profilácticas estará, generalmente, dentro de un intervalo de aproximadamente 0,15 microgramos por kilogramo (mcg/kg) a aproximadamente 10 mg/kg del péptido por dosis. La cantidad eficaz del péptido de esta invención puede oscilar entre aproximadamente 0,01 mg/kg y aproximadamente 10 mg/kg de agente activo por dosis. En aplicaciones profiláctica, una cantidad eficaz de L-Gly-L-Glu o L-Val-L-Thr, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, puede oscilar entre aproximadamente 0,15 mg/kg y aproximadamente 10 mg/kg del péptido respectivo (o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo) por dosis.
En métodos para inducir la relajación del músculo liso en sujetos que lo necesitan y en métodos para inducir la relajación del músculo del esqueleto en sujetos que lo necesitan. Para cada uno de estos métodos, una cantidad eficaz del péptido estará, generalmente, dentro del intervalo de aproximadamente 0,15 microgramos por kilogramo (mcg/kg) a aproximadamente 10 mg/kg del péptido por dosis. La cantidad eficaz del péptido objeto de esta invención puede oscilar entre aproximadamente 0,01 mg/kg y aproximadamente 10 mg/kg por dosis. En métodos para inducir la relajación del músculo liso o del músculo del esqueleto, una cantidad eficaz de L-Gly-L-Glu o L-Val-L-Thr, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, puede oscilar entre aproximadamente 0,15 mg/kg y aproximadamente 10 mg/kg del péptido respectivo por dosis.
Alternativamente, composiciones farmacéuticas en forma de dosificación unitaria pueden administrarse en las aplicaciones anteriores, incluidas en regímenes de tratamiento profiláctico. En una realización, estas composiciones farmacéuticas pueden comprender, por dosificación unitaria, una cantidad eficaz de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 1000 mg de L-Gly-L-Glu o L-Val-L-Thr (o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo), y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otra realización, composiciones de este tipo pueden comprender, por dosificación unitaria, una cantidad eficaz de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 100 mg de L-Gly-L-Glu o L-Val-L-Thr
(o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo), respectivamente, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
La forma preferida de los péptidos objetos de la invención para inóculos y dosificación variará con la indicación clínica. Los inóculos se preparan típicamente a partir de un péptido secado (o su conjugado) suspendiendo el péptido en un diluyente fisiológicamente aceptable tal como agua, solución salina o solución salina tamponada con fosfato. Necesariamente se producirá una cierta variación en la dosificación en función del estado del sujeto que esté siendo tratado, y del médico que determinará la dosis apropiada para el sujeto individual. La cantidad eficaz de péptido por dosis unitaria dependerá, entre otras cosas, del peso corporal y de la fisiología del sujeto y del régimen de inoculación elegido. Una dosis unitaria del péptido se refiere al peso del péptido sin el peso de un vehículo (cuando se utiliza un vehículo). Para una composición farmacéutica en forma de dosificación unitaria, un tratamiento terapéutico o profiláctico eficaz se conseguirá típicamente mediante la administración dentro un intervalo de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 1000 mg del péptido (o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo) por dosis, con unidades de dosificación sencillas del péptido de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 100 mg. La cantidad farmacológicamente eficaz de L-Gly-L-Glu o L-Val-L-Thr (o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo), está generalmente dentro de un intervalo de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 1000 mg del péptido objeto de la invención por dosis unitaria. Habitualmente, la cantidad farmacológicamente eficaz de L-Gly-L-Glu o L-Val-L-Thr (o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo) está dentro de un intervalo de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 100 mg por dosis unitaria.
La vía de suministro de los péptidos y composiciones farmacéuticas de la invención se determina por la enfermedad o indicación clínica y el sitio en el que se requiera el tratamiento. Para la aplicación tópica, puede ser deseable aplicar el péptido o su composición en el sitio local (por ejemplo, utilizando un catéter colocado en la arteria coronaria durante la cirugía, o aplicando un vendaje quirúrgico impregnado con el péptido al tejido del miocardio a tratar durante la cirugía cardíaca). Alternativamente, con enfermedades avanzadas puede ser deseable administrar el péptido o la composición por vía sistémica.
Por otras indicaciones, péptidos y composiciones farmacéuticas de la invención se pueden suministrar por inyección intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intranasal e intradérmica, así como por instilación intrabronquial (por ejemplo, utilizando un nebulizador) y suministro transmucosal, sistémico, transdermal (por ejemplo, con un vehículo soluble en lípido en un parche de la piel), oral y gastrointestinal (por ejemplo, con una cápsula o comprimido). Durante o después de la cirugía cardiovascular (por ejemplo, cirugía de bypass cardíaca, angioplastia y similares), péptidos y composiciones farmacéuticas se pueden administrar en una inyección de bolo intravenosa (o por perfusión).
Uno o más péptidos de la invención se pueden administrar en terapia de combinación, por ejemplo, uno o más péptidos de la invención se pueden administrar en combinación con un anti-coagulante (tal como estreptoquinasa/estreptodornasa, activador de plasminógeno de tejido o uroquinasa) a un sujeto que necesite un tratamiento de este tipo, tal como un sujeto quien previamente ha experimentado un episodio de trombosis coronaria.
La farmacocinética y farmacodinámica de péptidos de las composiciones farmacéuticas variará en diferentes sujetos. En un episodio agudo, puede ser deseable conseguir una concentración terapéutica o profiláctica del péptido en un órgano, en un sitio del tejido a tratar o en la sangre del sujeto que esté siendo tratado al administrar el péptido o su composición al sujeto de una manera que la concentración del péptido aumente rápidamente en el tejido, órgano o sangre. Por ejemplo, la concentración de un péptido en un sitio particular se puede incrementar rápidamente mediante inyección intravenosa de bolo o infusión del péptido o una composición farmacéutica del mismo. Alternativamente, se puede conseguir una concentración terapéutica o profiláctica del péptido en un órgano, en un sitio del tejido a tratar o en la sangre del sujeto al administrar una cantidad o dosificación creciente del péptido (o composición farmacéutica del mismo) a lo largo de un período de tiempo hasta que en el órgano, sitio del tejido o sangre se alcance una cantidad eficaz del péptido. La dosis inicial para este tipo de régimen dependerá de la vía de administración. A título de ejemplo, para la administración intravenosa de una composición farmacéutica que comprende un péptido que tenga un peso de molecular de aproximadamente 200 a aproximadamente 400 daltons, inicialmente se puede administrar una dosificación inicial de aproximadamente 0,001 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. Con cada administración subsiguiente, la dosificación se puede incrementar aumentando la concentración del péptido en un factor de 10.
Los péptidos de la invención se pueden administrar solos o en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable al igual que en las composiciones farmacéuticas descritas anteriormente. Los péptidos se pueden administrar en dosis sencillas o múltiples. Vehículos farmacéuticos adecuados incluyen diluyentes o cargas sólidas inertes, soluciones acuosas estériles y diversos disolventes orgánicos no tóxicos. Las composiciones farmacéuticas formadas al combinar un péptido objeto de la invención con un vehículo farmacéuticamente aceptable se pueden administrar fácilmente en una diversidad de formas de dosificación tales como comprimidos, pastillas, jarabes, soluciones inyectables y similares. Si se desea, los vehículos farmacéuticos pueden contener ingredientes adicionales, tales como saboreantes, aglutinantes, excipientes y similares.
Para la administración oral, comprimidos que contienen diversos excipientes, tales como citrato de sodio, carbonato de calcio y fosfato de calcio se pueden emplear junto con diversos desintegrantes, tal como almidón, y preferiblemente almidón de patata o tapioca, ácido algínico y determinados silicatos complejos, junto con agentes aglutinantes, tales como polivinilpirrolidona, sacarosa, gelatina y acacia. Para los fines de comprimidos, también se añaden agentes lubricantes tales como estearato de magnesio, laurilsulfato de sodio y talco. Composiciones sólidas de un tipo similar también se pueden emplear como cargas en sal y cápsulas de gelatina dura rellenas. Materiales preferidos para este fin incluyen lactosa y polietilenglicoles de alto peso molecular. Cuando para la administración oral se desean suspensiones acuosas de elixires, el ingrediente péptido activo esencial en ellas puede combinarse con diversos agentes edulcorantes o saboreantes, materia coloreada o colorantes y, si se desea, agentes emulsionantes o de suspensión junto con diluyentes, tales como agua, etanol, propilenglicol, glicerina y sus combinaciones.
Para la administración parenteral, se pueden emplear soluciones del péptido (o su análogo) en aceite de sésamo o de cacahuete o en propilenglicol acuoso, así como soluciones salinas acuosas estériles de las correspondientes sales de metales solubles en agua y farmacéuticamente aceptables previamente descritas. Una solución acuosa de este tipo debería estar adecuadamente tamponada en caso necesario, y el diluyente líquido debería hacerse primero isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para la inyección intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. Los medios acuosos estériles empleados son todos fácilmente obtenibles por técnicas estándares bien conocidas por los expertos en la técnica. Adicionalmente, los compuestos antes mencionados pueden administrarse por vía tópica (por ejemplo a través de un catéter colocado) utilizando una solución apropiada, adecuada para el fin particular. Soluciones parenterales se pueden formular con aproximadamente 0,001-10 mg/ml del péptido en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable en una solución de solución salina fisiológica estéril y administrar a un sujeto que lo necesite para lograr una dosificación de aproximadamente 0,1-10 mg/kg.
V. Métodos de preservar tejidos y órganos vivos
Los péptidos que proporciona la invención son útiles para preservar y almacenar tejidos u órganos vivos ex vivo en diversas aplicaciones. Por ejemplo, estos péptidos son útiles para preservar y conservar un tejido y órgano vivo, tal como un corazón o un vaso sanguíneo, ex vivo antes del trasplante (o re-implante) en un sujeto. Estos péptidos son también útiles para preservar y conservar tejidos y órganos vivos en condiciones isquémicas. Métodos de preservar tejidos y órganos vivos comprenden, típicamente, poner en contacto el tejido u órgano con una composición que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y una cantidad eficaz de un péptido de la invención. Péptidos de este tipo comprenden L-Gly-L-Glu, L-Val-L-Thr, un polímero de L-Gly-L-Glu, que comprende no más de 16 residuos aminoácidos, un polímero de L-Val-L-Thr que comprende no más de 16 residuos aminácidos, o una combinación de los mismos, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos. L-Gly-L-Glu y L-Val-L-Thr y polímeros de los mismos se encuentran entre los péptidos preferidos para uso en métodos de este tipo. Para estos métodos, la cantidad eficaz de L-Gly-L-Glu o L-Val-L-Thr es la cantidad que es suficiente para producir una concentración del péptido que es de aproximadamente 10^{-9} M a aproximadamente 10^{-5} M en el lugar del tejido u órgano a tratar.
VI. Kits para preservar tejidos y órganos vivos
La invención proporciona también kits útiles para preservar tejidos u órganos vivos. Estos kits incluyen una cantidad eficaz de L-Gly-L-Glu o L-Val-L-Thr o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos y un recipiente para el tejido vivo. La cantidad eficaz L-Gly-L-Glu o L-Val-L-Thr está generalmente dentro del intervalo de aproximadamente 10^{-9} M a aproximadamente 10^{-5} M. Alternativamente, kits de este tipo pueden incluir un polímero de L-Gly-L-Glu o L-Val-L-Thr o una combinación de los mismos, en donde el polímero comprende no más de 16 residuos aminoácidos. Kits de este tipo incluyen un recipiente para conservar el péptido y el tejido u órgano.
La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos. Estos ejemplos se proporcionan meramente para ilustrar aspectos de la presente invención y no pretenden ser limitaciones de esta invención.
Ejemplos Ejemplo 1 Aislamiento, Purificación y Caracterización de Péptidos del Miocardio con Actividad de Abridor del Canal de Potasio
Los dipéptidos de la invención, GE y VT, y dos polímeros tetrapéptidos de estos dipéptidos se identificaron, aislaron y purificaron como sigue.
Aproximadamente 0,5 gramos (g) de un extracto de tejido de corazón bovino de bajo peso molecular se preparó en cloruro de zinc (ZnCl) a un pH de 2 a 3 siguiendo un proceso similar al descrito en la patente de USSR nº 1.417.242 (1988) que se incorpora en esta memoria como referencia en su totalidad para todos los fines, para la preparación de un extracto de tejido denominado "Cardialina". Aproximadamente 100 miligramos (mg) del extracto de tejido de corazón bovino resultante se sometieron a cromatografía en tamiz molecular a escala preparativa sobre una columna G-25 de 2,6 x 88 centímetros (cm) de resina superfina (Pharmacia/LKB, Suecia) a un caudal de 1 mililitro/minuto (ml/min). Se recogieron fracciones de cinco mililitros del eluyente de la columna. La absorbancia (densidad óptica) de cada fracción se midió a 214 y 280 nanómetros (nm), respectivamente. El cromatograma resultante era complejo.
Se formaron siete agrupaciones de fracciones para el análisis ulterior como sigue: una agrupación de volumen vacío (agrupación I); una agrupación de volumen incluido en el centro (agrupación II); una agrupación de volumen incluido en la cola (agrupación III); y cuatro agrupaciones de fracciones que contienen picos de absorbancia de la cola (agrupaciones IV, V, VI y VII). Los componentes de las Agrupaciones I, II y III se evaluaron mediante cromatografía líquida de proteínas rápida (FPLC - siglas inglesas) (Pharmacia/LKB, Suecia) empleando el Gold-System® (Kodak) y una columna de 5,0 x 30 milímetros (mm) G-25 de resina superfina (Pharmacia/LKB, Suecia). Los componentes respectivos de estas agrupaciones se distinguieron comparando los tiempos de elución, las áreas pico y las mediciones de la densidad óptica a longitudes de onda seleccionadas. Los resultados se resumen en la Tabla A.
TABLA A
Separación cromatográfica de complejo de Cardialina
Agrupación nº Cantidad de Cardialina* Número aproximado de picos de
(mg) absorbancia discretos**
I 59,2 64
II 2,1 27
III 1,2 19
Total 62,5 110
* Estimada a partir de datos de absorbancia de densidad óptica, asumiendo un coeficiente de extinción de \approx 1,0
molar^{-1} centímetro^{-1} (M^{-1}cm^{-1}).
** Picos de absorbancia observados entre 199-214 nm ó 249-299 nm.
Para identificar los componentes biológicamente activos en las Agrupaciones I a VII procedentes de la columna G-25 de resina superfina G-25 preparativa, cada agrupación se rastreó respectivamente en cuanto a la activación de la actividad de adenilato ciclasa en cultivos de cardiomiocitos aislados utilizando el radioinmunoensayo (RIA) según se describe en "Materiales y Métodos para el Ensayo de Rastreo" que figura más abajo. Se encontró que las Agrupaciones II y V aumentaban significativamente la actividad de adenilato ciclasa en cardiomiocitos.
Las densidades ópticas de las agrupaciones II y V se midieron a continuación entre 200 nm y 214 nm y a 280 nm. Cada agrupación mostró densidades ópticas medibles a estas longitudes de onda. Dado que la detección de las densidades ópticas a estas longitudes de onda de fracciones recogidas de una columna de tamiz molecular resulta, típicamente, de la presencia de compuestos con residuos aromáticos y enlaces péptido, esta detección de las densidades ópticas para las agrupaciones II y V sugiere que estas agrupaciones contienen compuestos con residuos aromáticos y/o enlaces péptido.
Para asegurar que la actividad biológica no se debía a otro componente co-eluyendo con las fracciones que tengan densidades ópticas entre 200 nm y 214 nm y a 280 nm, tal como un compuesto intermedio lipídico, la Agrupación II se sometió a cromatografía de tamiz molecular por adición en una resina G-15 superfina en presencia de disolventes orgánicos. Fracciones recogidas de esta columna se rastrearon en cuanto a la activación de la actividad de adenilato ciclasa. Además, las densidades ópticas de estas fracciones se midieron a las longitudes de onda recogidas anteriormente. Como antes, se encontró también que las fracciones que exhibían activación de la actividad de adenilato ciclasa tenían densidades ópticas medibles a las longitudes de onda anteriores.
La Agrupación II se purificó adicionalmente, como antes, mediante FPLC en una columna G-25 de resina superfina de 5,0 x 30 cm. Las fracciones de eluyente se vigilaron ópticamente desde 199 a 214 nm y desde 249 a 299 nm. Fracciones que contenían los tres picos de absorbancia principales (denominados B1, B2 y B3) se analizaron adicionalmente mediante cromatografía líquida a alta presión (HPLC) utilizando una columna de 4,8 x 250 mm ODS de 18/5 microlitros (\mul), hecha funcionar a un caudal de 1 ml/min. Los tiempos de elución y las densidades ópticas de las fracciones de eluyente se vigilaron y utilizaron para distinguir al menos seis componentes principales de la Agrupación II, según se resume en la Tabla B que figura a continuación.
TABLA B
1
Picos en la ODS de 18/5 \mul mediante HPLC individuales se evaluaron en cuanto a la activación de la actividad de adenilato ciclasa utilizando el ensayo de rastreo RIA, seguido de una separación por HPLC adicional en diferentes sistemas de disolvente (por ejemplo acetonitrilo), incluyendo métodos de elución tanto isocráticos como de gradiente. Tres picos de absorbancia estrechamente separados (componentes 1-3 de la Tabla B anterior) exhibían la mayoría de la actividad biológica, pero eran relativamente inseparables mediante todas las técnicas empleadas. Los resultados sugieren que uno o más complejos de péptidos eran los responsables de la actividad biológica observada de los componentes 1, 2 y 3.
Seguidamente, cada pico se sometió a una degradación de Edman. Las relaciones molares y los residuos N-terminales de los aminoácidos detectados mediante este análisis sugirieron la presencia de dos dipéptidos y dos tetrapéptidos en las fracciones. Las relaciones molares de los dipéptidos sugirieron que glicina y ácido glutámico estaban presentes en cantidades aproximadamente y que valina y treonia estaban también presentes en cantidades aproximadamente iguales. En base a estos hallazgos, los péptidos sintéticos L-Gly-L-Glu (GE) y L-Val-L-Thr (VT) se prepararon y sometieron a un ensayo adicional en cuanto a la actividad farmacológica, tal como se muestra en los Ejemplos 2 a 9 que figuran más abajo.
Materiales y Métodos para el Ensayo de Rastreo
Cardiomiocitos tolerantes al calcio se aislaron de ratas utilizando el método de perfusión de Langendorff, un material perfundido que contenía enzimas proteolíticas, y raspado mecánico. Los cardiomiocitos se aislaron y evaluaron en cuanto a viabilidad utilizando criterios morfológicos microscópicos, con exclusión del azul triptano.
El método de parche-grapa, utilizado para evaluar las fracciones de Cardialina, se basa en las mediciones electrofisiológicas de corrientes de iones que se desplazan a través de canales de iones individuales en el sarcolema. Se utilizaron una micromanipulación y un microscopio invertido para implantar electrodos de vidrio en y sobre las membranas de cardiomiocitos individuales. Al variar la composición del medio en el electrodo, se midieron las corrientes de iones de canales de potasio eléctricamente sensibles, incluidos canales de rectificación de Tipo I y de Tipo II sensibles a ATP. Se estableció un nivel de fondo midiendo las corrientes de salida para cada célula individual antes de añadir un sustrato a ensayar (es decir, sustancia de ensayo). Con este método se pueden medir transiciones conformacionales de los canales de iones de estados "abiertos" a "cerrados", según se refleja en las fluctuaciones de corriente. Las corientes de los iones se registraron en un magnetógrafo y luego se codificaron digitalmente utilizando una interfase PSL-718 para el procesamiento en un ordenador IBM PC/AT. Se realizó un análisis matemático de los datos utilizando un software original. En calidad de sustancia control positiva, se utilizó el complejo de péptidos Cardialina total. En este ensayo, el complejo de péptidos Cardiolina logró un cambio en las corrientes de la membrana en el espacio de 1 milisegundo (ms) a concentraciones de 10^{-4} a 10^{-2} mg/ml de Cardialina, y en presencia de Cardialina la transición se mantuvo hasta durante 3 horas.
Los resultados registrados con Cardialina eran como siguen. Primeramente, después de la incubación con 10^{-4} mg/ml de Cardialina durante 10 a 15 minutos, se observó un nítido aumento en la corriente de iones, sugiriendo que los canales de ion potasio estaban "abiertos" (es decir, en un estado conductor), alcanzando un pico diez veces mayor que los valores de la línea base. En segundo lugar, a concentraciones mayores de Cardialina (por ejemplo 10^{-2} mg/ml), la conductividad del ion potasio aumentó en el espacio de sesenta minutos de incubación de los cardiomiocitos con el complejo de péptidos. La activación del canal de potasio en presencia de 10^{-4} mg/ml de Cardialina en la superficie exterior de la célula se midió utilizando la siguiente configuración fijada a la célula: milivoltios (mV) de retención = +20;
sensibilidad temporal = 0,424 ms; [K^{+}]_{o} = 140 milimolar (mM) (es decir, la concentración extracelular del ion potasio era 140 mM) y una banda de transmisión del filtro inicialmente establecida (es decir, a lo largo de los primeros 15-20 segundos) para frecuencias más bajas a aproximadamente 1000 Hertzios (Hz), y subsiguientemente ajustada a aproximadamente 1,5 min a aproximadamente 300 Hz. Los picos de corriente se registraron a lo largo de un total de aproximadamente 220 ms a cada intervalo de tiempo. Quince a veinte segundos después de la adición de Cardialina, las corrientes registradas máximas eran de aproximadamente 3 a aproximadamente 3,5 picoamperios (pA); la corriente media evocada era aproximadamente de 0,25 pA, con picos de corriente cada uno con una duración de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 ms; y la duración total de los eventos era aproximadamente 17,3 ms (del tiempo total de registro de 220 ms). Aproximadamente 1,5 min después de la adición de Cardialina, los picos de corriente registrados máximos eran aproximadamente de 8 pA, teniendo cada pico una duración de aproximadamente 2 a aproximadamente 4 ms; la corriente media evocada era aproximadamente 0,31 pA, y la duración de los eventos registrados era aproximadamente de 8 ms.
El radioinmunoensayo para la actividad de adenilato ciclasa en cardiomiocitos se realizó de acuerdo con métodos rutinarios en la técnica.
Ejemplo 2 Efectos de GE y VT sobre la Actividad Contráctil de Muestras del Músculo Liso de la Vena Portal de Rata
En este experimento, los efectos de GE y VT sobre la actividad contráctil espontánea e inducida por cloruro de potasio de una probeta de músculo liso (SMS - siglas en inglés) de la vena portal de rata se compararon con la provocada por Verapamil, un vasodilatador que tiene actividad bloqueadora del canal de ion calcio. Los resultados de este experimento demuestran que tanto GE como VT reducen la actividad contráctil espontánea de la vena portal de rata y producen efectos relajantes sobre probetas del músculo liso venoso. Además, ninguno de estos dipéptidos afecta al carácter de la contracción tónica inducida en músculos lisos venosos por parte de KCl.
Etapa 1
Verificación de la Adecuidad de Muestras de Músculo Liso de la Vena Portal de Rata
Muestras SMS de la vena portal de rata se aislaron quirúrgicamente a partir de ratas criadas al azar que pesaban 200-250 g. La adecuidad de cada SMS de vena portal de rata aislada se estableció midiendo la respuesta a la contracción espontánea y su respuesta contráctil de la probeta a cloruro de potasio (KCl) como sigue. Cada SMS aislada se colocó en un baño de órganos con solución de Krebs-Henseleit (KH) estándar a 35ºC. Después se añadieron al baño de órganos 0,5 ml de solución salina fisiológica. En este proceso, se fijó un extremo de la tira de músculo liso, mientras que el otro extremo de la tira de músculo liso se conectó con una sonda que transmitía señales inducidas por la contracción a un convertidor de analógico a digital. Se registró la curva de contracción espontánea para cada SMS tomando mediciones repetidas a lo largo de un período de 1 minuto. Seguidamente, se añadieron 0,5 ml de una solución 600 mM de KCl en solución salina fisiológica a la muestra de SMS/baño de órganos para conseguir una concentración final de KCl 60 mM. KCl induce la concentración del tejido de la vena portal de rata a una concentración final del tejido de aproximadamente 60 mM.
La curva de contracción inducida por KCl para cada muestra de la probeta se registró entonces a lo largo del siguiente período de 5 minutos. Habiendo determinado los valores de las curvas de contracción espontánea e inducida por KCl de una muestra de SMS y habiendo confirmado su adecuidad para uso en los experimentos, la muestra de SMS se lavó luego con solución estándar de Krebs-Henseleit y se estabilizó incubando a 35ºC durante 30 minutos. Durante este período de estabilización, la curva de contracción espontánea para cada SMS se modificó vigilando los datos obtenidos del convertidor de analógico a digital.
Etapa 2
Determinación de la Línea Base Contráctil Inducida por KCl
Un valor de línea base para la respuesta contráctil de una SMS a KCl se determinó de acuerdo con el proceso esbozado en la Etapa 1 anterior. Específicamente, cada SMS se colocó en 0,5 ml de solución salina fisiológica en un baño de órganos a 35ºC. La curva de contracción espontánea para cada muestra de SMS se registró tomando mediciones repetidas a lo largo de un período de 1 minuto. Cinco mililitros de una solución 600 mM de KCl en solución salina fisiológica se añadieron luego a cada SMS hasta que en el baño se alcanzó la concentración final de KCl 60 mM. Seguidamente, se registró durante 5 minutos la curva de contracción inducida por KCl por cada muestra de probeta. La SMS se lavó con solución de Krebs-Henseleit estándar a 35ºC durante 30 minutos. La curva de contracción inducida por KCl sirvió como una curva control para comparación con la respuesta a la contracción inducida por potasio de la SMS en presencia de la sustancia de ensayo o sustancia de referencia. En este experimento, GE y VT servían como sustancias de ensayo y Verapamil servía como la sustancia de referencia. El Programa de Servicio de Farmacología General (Protocolo de Ensayos Actual, PAN Lab, GSP-26) recomienda Verapamil como sustancia de referencia en este modelo particular.
Etapa 3
Determinación de la Línea Base de Contracción Espontánea
A cada SMS en el baño de órganos, preparado de acuerdo con las Etapas 2 y 3 anteriores, se añadieron 0,5 ml de solución salina fisiológica, y la curva de contracción espontánea se registró durante 1 minuto. Cada curva de contracción espontánea servía como curva de línea base (control) para la comparación con las respectivas contracciones espontáneas de cada SMS en presencia de una sustancia de ensayo o sustancia de referencia.
Etapa 4
Comparación de los Efectos de GE, VT y Verapamil sobre la Actividad Contráctil de SMS Espontánea e Inducida por Potasio
Los efectos de GE, VT y Verapamil sobre la actividad contráctil de la SMS se estudiaron como siguen. Cada SMS se trató con GE, VT o Verapamil, respectivamente, añadiendo 0,5 ml de una solución de la sustancia respectiva en solución salina fisiológica a la muestra de SMS/baño de órganos de la Etapa 3 hasta que se alcanzó una concentración final en el baño de 10^{-6} g/ml para GE (solución 4,9 x 10^{-6} M de GE), 10^{-6} g/ml para VT (solución 4,58 x 10^{-6} M de VT) ó 5 x 10^{-7} g/ml para Verapamil (solución 1 x 10^{-6} M de Verapamil), respectivamente. Los valores de la curva de contracción espontánea para cada SMS se registraron haciendo mediciones repetitivas de la actividad contráctil espontánea de cada muestra a los 2, 5, 10 y 15 minutos después de la adición de la sustancia de ensayo o de referencia a cada SMS/baño de órganos. Seguidamente, 0,5 ml de una solución 600 mM de KCl en solución salina fisiológica se añadieron a cada SMS en el baño de órganos hasta alcanzar una concentración final de KCl 60 mM. La actividad contráctil de cada SMS se midió luego durante 5 minutos.
Etapa 5
Cálculos
La actividad contráctil espontánea de cada muestra de SMS se evaluó luego midiendo la amplitud de contracción y el área bajo la curva de contracción (AUC - siglas en inglés) durante 1 minuto. Los valores de los parámetros después de la aplicación de GE, VT y Verapamil se expresaron como porcentaje del correspondiente valor de línea base (control) establecido en la Etapa 3. Los resultados se presentan en las Tablas 1 y 2.
La actividad contráctil tónica (inducida por potasio) se determinó calculando el área bajo la curva de contracción durante 1 minuto. Los valores del parámetro después de la aplicación de GE, VT y Verapamil se expresaron como porcentaje del correspondiente valor de línea base (control) para la contracción inducida por potasio en la Etapa 2. Los resultados se presentan en la Tabla 3. Para cada sustancia de ensayo de referencia se realizaron determinaciones en 5 muestras de SMS aisladas. Todos los resultados se presentan como valores medianos con una desviación estándar.
TABLA 1
Los efectos de GE y VT sobre la actividad espontánea en células del músculo liso de la vena portal de rata
Amplitud de contracción (% de control)
Minutos después de aplicación de la sustancia
Sustancia Control (S) 2 min 5 min 10 min 15 min
GE 100,00 114,93 75,56 60,37 63,94
(\pm 14,62) (\pm 12,13) (\pm 12,46)* (\pm 11,78)*
VT 100,00 89,24 51,79 36,34 39,11
(\pm 7,71) (\pm 5,42) (\pm 4,43)* (\pm 5,98)*
Verapamil 100,00 95,82 78,58 60,79 37,92
(\pm 19,44) (\pm 22,20) (\pm 11,50)* (\pm 11,08)*
* Significativamente diferente (P < 0,05, test de t de Studen't pareado) a partir del nivel control (100%)
Abreviatura: S = solución salina fisiológica. 
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 2
Los efectos de GE y VT sobre la actividad espontánea en células del músculo liso de la vena portal de rata
Área bajo la curva (% de control)
Minutos después de aplicación de la sustancia
Sustancia Control (S) 2 min 5 min 10 min 15 min
GE 100,00 134,77 87,51 70,07 75,08
(\pm 15,51) (\pm 10,97) (\pm 15,34) (\pm 12,94)
VT 100,00 139,92 59,08 45,93 36,35
(\pm 6,25) (\pm 12,25) (\pm 6,91)* (\pm 2,30)*
Verapamil 100,00 82,41 62,11 49,83 35,13
(\pm 18,92) (\pm 14,06) (\pm 8,86)* (\pm 11,95)*
* Significativamente diferente (P < 0,05, test de t de Studen't pareado) a partir del nivel control (100%)
Abreviatura: S = solución salina fisiológica. 
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 3
Los efectos de GE y VT sobre la contracción tónica de la vena portal de rata inducida por KCI
Área bajo la curva de la contracción inducida por KCI (% de control)
Sustancia Aplicación de KCI control % de control (por la sustancia de ensayo o de control)
GE 100,00 90,26
(\pm 5,05)
VT 100,00 93,46
(\pm 4,01)*
Verapamil 100,00 23,98
(\pm 6,98)*
* Significativamente diferente (P < 0,05, test t de Student pareado) a partir del nivel control (100%) 
\newpage
Tal como se muestra en las Tablas 1 y 2, tanto GE como VT reducían de manera apreciable la amplitud y el área bajo la curva de contracción para contracciones espontáneas exhibidas en el cultivo de órganos por parte de probetas de músculo liso venoso aisladas. Es digno de mención que la velocidad del inicio del efecto inducido por VT era más rápida en comparación con Verapamil. Los resultados presentados en las Tablas 1 y 2 demuestran que GE y VT tenían efectos relajantes sobre el músculo liso de vasos en el cultivo de órganos.
Además, a pesar de que GE y VT reducían la contracción espontánea, ni GE ni VT efectuaban el carácter de la contracción tónica inducida en probetas del músculo liso venoso por parte de KCl, tal como se muestra en la Tabla 3. Estos resultados se encuentran en contraposición con los observados con Verapamil, que tenía un efecto pronunciado sobre la contracción tónica inducida por KCl.
Se sabe que sustancias que tienen actividad del canal del potasio reducen la actividad contráctil espontánea, pero no la actividad de contracción inducida por potasio en probetas de músculo liso vascular. Nidel et al., Br. J. Pharm. 95:741-52 (1988). Los resultados de este experimento sugieren que GE y VT tienen una actividad del canal del potasio, ya que ambos reducen la actividad contráctil espontánea, pero no la actividad de contracción tónica inducida por potasio.
Ejemplo 3 Efectos de GE y VT sobre la Actividad Contráctil Inducida por Calcio de Muestras de Probeta de Músculo Liso Intestinal
En este experimento se investigaron los efectos de GE y VT sobre la actividad contráctil inducida por calcio de muestras de probeta de músculo liso intestinal. Los resultados de este experimento demuestran que GE y VT disminuyen la amplitud de la contracción tónica del músculo liso inducida por calcio e inducen la relajación del músculo liso.
GE y VT servían como sustancias de ensayo en este experimento. GE se sometió a ensayo a concentraciones de 10^{-6} g/ml y 10^{-5} g/ml (4,9 x 10^{-6}M y 4,9 x 10^{-5} M), respectivamente, y VT se sometió a ensayo a concentraciones de 10^{-6} g/ml y 10^{-5} g/ml (4,58 x 10^{-6} y 4,58 x 10^{-5} M, respectivamente). Los bloqueadores del canal de ion calcio Verapamil, atropina colinolítica y diltiazem servían como sustancias de referencia y se sometieron a ensayo a las siguientes concentraciones: 10^{-8} g/ml, 10^{-7} g/ml de Verapamil (2,04 x 10^{-8} M y 2,04 x 10^{-7} M, respectivamente); 10^{-6} g/ml, 10^{-7} g/ml de atropina colinolítica (1,48 x 10^{-7} M y 1,42 x 10^{-6} M, respectivamente) y 10^{-9} g/ml, 10^{-8} g/ml de diltiazem (2,2 x 10^{-9} M y 2,2 x 10^{-8} M, respectivamente);
Etapa 1
Preparación de la muestra
Muestras de SMS del intestino delgado procedentes de diez cobayas se aislaron quirúrgicamente y se prepararon como sigue. Primeramente, las muestras de SMS se preincubaron durante 40 minutos en un baño de órganos manteniendo una solución salina fisiológica de Krebs-Henseleit estándar que contenía cloruro de calcio (CaCl_{2}) a una concentración de 2,5 mM. Seguidamente, cada SMS se lavó con una solución de Krebs-Henseleit exenta de calcio y se incubó en una solución de Krebs-Henseleit exenta de calcio durante 40 minutos. La actividad contráctil se pre-indujo en cada SMS perfundiendo primero el baño de órganos que contenía la muestra durante 15 minutos con una solución de Krebs-Henseleit que contenía KCl 30 mM y luego perfundiendo el baño durante 15 minutos adicionales con una solución de Krebs-Henseleit que contenía CaCl_{2} 20 mM. Finalmente, cada muestra de SMS se lavó con una solución de Krebs-Henseleit exenta de calcio durante 40 minutos. En estos experimentos, como control (línea base) servían las mediciones de la respuesta contráctil de SMS después de la adición de una solución de Krebs-Henseleit que contenía calcio 20 mM. Se registraron los cambios de las amplitudes de contracción utilizando el método recogido en la Etapa 1 del Ejemplo 2 anterior.
Etapa 2
Aplicación I
Después de lavar la SMS según se esboza en la Etapa 1, el baño de órganos con la muestra de SMS se perfundió durante 15 minutos con la solución de una sustancia de ensayo o de referencia. En este caso, GE y VT servían como las sustancias de ensayo, y cada dipéptido se sometió a ensayo a una concentración de 10^{-6} g/ml. Se emplearon las siguientes sustancias de referencia: 10^{-8} g/ml de Verapamil, 10^{-7} g/ml de atropina colinolítica y 10^{-9} g/ml de diltiazem.
Después de la perfusión con la sustancia de ensayo o de referencia, la muestra de SMS/baño de órganos se perfundió durante 10 minutos con una solución de Krebs-Henseleit que contenía KCl 30 mM y luego se perfundió durante 10 minutos adicionales con una solución de Krebs-Henseleit que contenía CaCl_{2} 20 mM. Seguidamente, cada muestra de SMS se lavó con una solución de Krebs-Henseleit exenta de calcio durante 40 minutos. El efecto de la sustancia de ensayo o de referencia sobre la muestra de SMS se evaluó midiendo la respuesta contráctil (es decir, el cambio en la amplitud de contracción) de la muestra después de la adición de la solución de Krebs-Henseleit que contenía CaCl_{2} 20 mM.
Etapa 3
Aplicación II
Cada SMS procedente de la Etapa 2 se expuso a la misma sustancia de ensayo o de referencia añadiendo la siguiente concentración de cada sustancia de ensayo o de referencia respectiva al material perfundido del baño de órganos: 10^{-7} g/ml de Verapamil; 10^{-6} g/ml de atropina colinolítica; 10^{-8} g/ml de diltiazem; y 10^{-5} g/ml de GE ó 10^{-5} g/ml de VT.
Seguidamente, el baño de órganos se perfundió durante 10 minutos con una solución de Krebs-Henseleit que contenía KCl 30 mM y luego durante 10 minutos adicionales con una solución de Krebs-Henseleit que contenía CaCl_{2} 20 mM. El efecto de la sustancia de ensayo o de referencia respectiva se evaluó una segunda vez midiendo el cambio en la amplitud de contracción de la SMS después de la adición de la solución de Krebs-Henseleit que contenía CaCl_{2} 20 mM. La eficacia del trabajo cardíaco se evaluó determinando el área bajo la curva de contracción de una probeta de músculo liso aislada.
Como demuestran los resultados en la Tabla 4, tanto GE como VT reducían significativamente la amplitud de la contracción tónica del músculo liso intestinal inducida por calcio. De manera notable, el efecto de VT era mayor que el observado para los bloqueadores del canal de ion calcio estándares Verapamil y diltiazem.
TABLA 4
Los efectos de GE y VT sobre la contracción del músculo liso intestinal inducida por calcio
Sustancia Control (% de KH) Amplitud de contracción (% de control^{a} nivel)
Aplicación I Aplicación II
Atropina 100,00 39,57* 25,08*
(\pm 13,52) (\pm 6,20)
Diltiazem 100,00 39,02* 12,95*
(\pm 11,78) (\pm 7,82)
Verapamil 100,00 39,57* 25,08*
(\pm 13,52) (\pm 6,20)
GE 100,00 51,08 33,14*
(\pm 14,13) (\pm 15,59)
VT 100,00 26,58 11,51*
(\pm 9,33)* (\pm 7,27)*
* Significativamente diferente (P < 0,05, ensayo t de Student) para un nivel control (100%)
^{a} \begin{minipage}[t]{150mm}% de control, en que los valores de control se tomaron después de la aplicación de una solución de Krebs- Henseleit que contenía calcio 20 mM según se describe en la Etapa 1 del Ejemplo 3.\end{minipage}
Abreviatura: KH = Krebs-Henseleit
Ejemplo 4.1 Efectos de GE y VT sobre la Función Inotrópica de un Corazón Normal de Rata
Este experimento se diseñó para evaluar los efectos respectivos de GE y VT sobre la función inotrópica de un corazón aislado de rata. La función inotrópica del corazón se evaluó midiendo diversos parámetros, incluida la presión sistólica en el ventrículo izquierdo (P_{sist.} mm de Hg); la presión diastólica en el ventrículo izquierdo (P_{diast.} mm de Hg); (iii) la presión de evolvente (P_{ev.} = P_{sist.} - P_{diast.} mm de Hg); (iv) la tasa máxima de incremento de la presión del ventrículo izquierdo (+dp/dt_{max} mm de Hg/s); y (v) la tasa máxima de disminución de la presión del ventrículo izquierdo (-dp/dt_{max} mm de Hg/s). Además, el ritmo cardiaca (HR - siglas inglesas) de cada corazón se determinó a partir de los registros de la variación de presión realizados de la presión del ventrículo izquierdo. Este experimento demuestra que ni GE ni VT tiene un efecto significativo sobre la función inotrópica o sobre el ritmo cardíaco de un corazón normal.
Probetas de corazón de rata se obtuvieron quirúrgicamente a partir de ratas macho criadas al azar blancas que pesaban aproximadamente 250 g. Los corazones se establecieron en cultivo utilizando una perfusión del corazón retrógrada de acuerdo con el método de Langendorff realizado con una solución de Krebs-Henseleit estándar oxigenada (95% de O_{2} y 5% de CO_{2}) a través de una cánula de la aorta de vidrio. La presión de retroperfusión obliga al cierre de las válvulas aórticas. De esta manera, la solución oxigenada pasó sólo a través de la vasculatura coronaria del corazón, de modo que los dos ventrículos permanecían eficazmente vacíos.
Condiciones de perfusión: se mantuvo un caudal de material perfundido constante medio de 15 a 25 ml/min con una presión de material perfundido constante de 80 cm de H_{2}O (0,00774 atm).
Mediciones de presión: Un catéter con globo de látex conectado con un transductor de la presión (EMT-746 Siemens-Elema, Suecia) se insertó en el ventrículo izquierdo del corazón para medir los parámetros de la función inotrópica del corazón. La curva de la variación de presión intraventricular para el ventrículo izquierdo se registró con un polígrafo.
Protocolo experimental: GE y VT servían como las sustancias de ensayo. Después de una adaptación durante 30 minutos del corazón a las condiciones de perfusión del cultivo de órganos, se tomó un conjunto de mediciones basales (control), según se describe en (i) a (v) que figuran más abajo. Después de estas mediciones, GE o VT se introdujo en el flujo de material perfundido a una dosis de 10, 100 ó 1000 \mug por 0,1 ml de solución de Krebs-Henseleit. La amina simpatomimética, isoproterenol (Novodrin, Germed, Alemania) servía como la sustancia de referencia y se administró a una dosis de 0,01 mg. Se sabe que isoproterenol reduce la resistencia vascular periférica y eleva el rendimiento cardíaco debido a sus acciones inotrópica positiva (es decir que aumenta la eficacia del trabajo contráctil realizado por un corazón isquémico) y cronotrópica cuando se infunde por vía intravenosa en un sujeto. Véase GOODMAN Y GILMAN'S THE PHARMACOLOGOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS 160 (Goodman et al., eds., 7ª ed. 1985). Cada dosis de cada sustancia de ensayo o de referencia respectiva se sometió a ensayo en cuatro corazones de rata diferentes. Las funciones inotrópicas de cada uno de los cuatro corazones de rata se evaluaron midiendo: (i) la presión sistólica en el ventrículo izquierdo (P_{sist.} mm de Hg); (ii) la presión diastólica en el ventrículo izquierdo (P_{diast.} mm de Hg); (iii) la presión de evolvente (P_{ev.} = P_{sist.} - P_{diast.} mm de Hg); (iv) la tasa máxima de incremento de la presión del ventrículo izquierdo (+dp/dt_{max} mm de Hg/s); y (v) la tasa máxima de disminución de la presión del ventrículo izquierdo (-dp/dt_{max} mm de Hg/s). Además, el ritmo cardiaco (HR - siglas inglesas) de cada corazón se determinó a partir de los registros de la variación de presión realizados de la presión del ventrículo izquierdo.
Tal como se muestra por los resultados que se presentan en las Tablas 5A y 5B, ni GE ni VT tenía un efecto significativo sobre la función inotrópica o el ritmo cardíaco del corazón. Más bien, cada dipéptido tenía poco efecto o un efecto mínimo sobre estos parámetros.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 5A
2
TABLA 5B
3
Ejemplo 4.2 Efectos de GE y VT sobre la Función Inotrópica de Miocardio Isquémico
En este experimento se evaluaron los efectos de GE y VT sobre la función inotrópica del tejido del miocardio isquémico midiendo diversos parámetros de la función inotrópica del corazón. Los resultados de este experimento revelan que cada uno de los dipéptidos restaura la función inotrópica del tejido del miocardio en el que se ha inducido la isquemia y reduce los efectos de la lesión isquémica en el tejido del miocardio.
Corazones de rata se aislaron quirúrgicamente a partir de ratas blancas criadas al azar que pesaban aproximadamente 250 g. Los corazones aislados se perfundieron con una solución de Krebs-Henseleit oxigenada estándar (95% de O_{2} y 5% de CO_{2}) de una manera retrógrada (es decir, de acuerdo con Langendorff y utilizando una presión del material perfundido constante de 80 cm [0,0774 atm.] de agua). Los corazones mantenían una tasa de contracción espontánea estable. Un catéter con globo de látex conectado a un transductor de presión (EMT-746, Siemens-Elema, Suecia) se insertó en el ventrículo izquierdo de cada corazón para medir la función inotrópica del corazón (según se describe en el Ejemplo 3 anterior). La curva de variación de la presión del ventrículo izquierdo se registró utilizando un polígrafo.
Protocolo experimental
La fase 1 ("régimen de adaptación") consistía en una adaptación durante 30 minutos de los respectivos corazones de rata al régimen de perfusión. Se registraron los parámetros de línea base para la función inotrópica de cada corazón para establecer los valores pre-isquémicos para los siguientes parámetros medidos: (i) la presión sistólica en el ventrículo izquierdo (P_{sis.} mm de Hg); (ii) la presión diastólica en el ventrículo izquierdo (P_{dias.} mm de Hg); (iii) la presión de evolvente (P_{ev.} = P_{sis.} - P_{dias.} mm de Hg); (iv) la tasa máxima de incremento de la presión del ventrículo izquierdo (+dp/dt_{máx} mm de Hg/s); y (v) la tasa máxima de disminución de la presión del ventrículo izquierdo (-dp/dt_{máx} mm de Hg/s). Además, el ritmo cardiaco (HR - siglas inglesas) de cada corazón se determinó a partir de los registros de la variación de presión realizados de la presión del ventrículo izquierdo a lo largo del tiempo. En la Etapa II ("simulación isquémica"), la isquemia se indujo en cada corazón interrumpiendo el suministro de la solución de perfusión al corazón. Aproximadamente 30 minutos más tarde, se inició la Fase III ("régimen de reperfusión"), volviendo a comenzar la reperfusión e incluyendo en la solución de material perfundido una sustancia de ensayo de control en una de la siguientes concentraciones respectivas: una solución de material perfundido de una sustancia de ensayo comprendía 0,06, 0,6 ó 6,0 mg/l de GE, ó 0,06, 0,6 ó 6,0 mg/l de VT, respectivamente; una solución del material perfundido de la sustancia control positiva comprendía 14 mg/l de inosina. La inosina es una preparación de nucleósidos que produce efectos inotrópicos favorables tanto sobre el miocardio normal como el isquémico, al tiempo que no induce perturbaciones ni aceleraciones del ritmo del desarrollo de contracción isquémica. Woollard et al., Cardiovasc. Res. 15:659-67 (1981). La inosina se obtuvo de Sigma Chemical Company, EE.UU. (Código de Cat. I-4125; número de lote 81H0227). La sustancia control negativa comprendía reperfusión utilizando una solución de Krebs-Henseleit oxigenada estándar.
Para cada corazón, la función inotrópica del miocardio se evaluó midiendo los parámetros (i) a (v) comentados anteriormente, y el ritmo cardiaco. Estos seis parámetros se registraron de modo continuo a lo largo del estudio (es decir, comenzando con la Fase I y continuando hasta la Fase III). Los registros se realizaron en los siguientes instantes: (a) inmediatamente antes de comenzar la Etapa II, es decir después del periodo de adaptación de la Etapa I de 30 minutos, pero antes de detener la perfusión); y (b) a los 1, 5, 10, 20 y 30 minutos en la reperfusión de la Fase III.
La frecuencia y duración de las perturbaciones del ritmo en el periodo de reperfusión de la Etapa III de 30 minutos se determinaron midiendo los siguientes parámetros: (i) el número de extrasístoles ventriculares; (ii) la duración global de taquicardias ventriculares (en segundos); y (iii) la duración global de la fibrilación ventricular (en segundos). Cada dosis de la sustancia de ensayo se sometió a ensayo en nueve corazones aislados.
Los resultados de este estudio se presentan en las Tablas 6 a 12 que figuran más abajo. Tal como se muestra en la Tabla 6, la inducción de isquemia en este modelo de corazón dio como resultado una reducción de aproximadamente el 50% en la presión sistólica a 1 minuto después del inicio de la reperfusión de la Fase III (el control negativo). A pesar de que se observó una cierta recuperación en la presión sistólica en el control negativo a los 5 a 10 minutos (es decir recuperación a aproximadamente el 78% de la presión sistólica pre-isquémica), la presión se deterioró después de ello. La reperfusión con GE o VT a concentraciones de 0,06 y 0,6 mg/ml, respectivamente, evitaron la drástica caída en la presión sistólica observada en el control negativo. Los efectos de GE y VT eran más pronunciados y se expresaban de un modo más rápido en este modelo que los efectos de inosina, lo que provocó una mejora gradual en la presión sistólica durante el periodo de observación de 30 minutos.
TABLA 6
\begin{minipage}[t]{155mm}Los Efectos de GE y VT sobre la Presión Sistólica en un Ventrículo Izquierdo Isquémico durante la Reperfusión (% de los Valores de Parámetros Preisquémicos)\end{minipage}
Sustancia Dosis (mg/l) Reperfusión
1 min 5 min 10 min 20 min 30 min
Control Negativo - 49,39 76,75 77,54 62,03 58,03
GE 0,06 115,11 98,86 89,79 84,10 72,11
0,6 74,01 90,02 88,40 82,35 91,89*
6,0 72,87 67,10 77,71 77,71 79,73
VT 0,06 91,69 94,33 82,56 85,55 79,52
0,6 128,62* 99,34 102,23 89,31 88,47
6,0 102,32 74,59 77,58 69,85 65,28
Inosina 14,0 62,15 66,17 86,05 99,29* 96,62
* \begin{minipage}[t]{155mm}Significativamente diferente (P < 0,05, ensayo t de Student) de los correspondientes valores del grupo de control negativo.\end{minipage}
En la Tabla 7 se resumen las mediciones de la tasa máxima de aumento de la presión de ventrículos izquierdos isquémicos (+dp/dt_{máx}) de corazones de ratas. La inducción de isquemia en este modelo de corazón dio como resultado una reducción de aproximadamente el 46% en el valor +dp/dt_{máx} del control negativo 1 minuto después del inicio de la reperfusión. Mientras que la recuperación del +dp/dt_{máx} en el control negativo a aproximadamente el 82% de su valor preisquémico se observó después de 5 mintuos, el +dp/dt_{máx} se deterioró subsiguientemente. Se encontró que GE y VT aumentaban el valor +dp/dt_{máx} durante el primer minuto de reperfusión. De manera notable, se encontró que concentraciones de 0,6 mg/l de GE y VT, respectivamente, restauran el +dp/dt_{máx} de un corazón aislado hasta cerca de su nivel preisquémico al cabo de 30 minutos de reperfusión.
TABLA 7
\begin{minipage}[t]{155mm}Los Efectos de GE y VT sobre la Tasa Máxima de Incremento de Presión en un Ventrículo Izquierdo durante la Reperfusión (% de los Valores Medianos de Parámetros Preisquémicos)\end{minipage}
Sustancia Dosis (mg/l) Reperfusión
1 min 5 min 10 min 20 min 30 min
Control Negativo - 46,47 81,84 73,74 54,74 40,02
GE 0,06 127,30* 98,87 87,39 87,39 70,93
0,6 71,21 84,14 88,69 81,12 97,62*
6,0 71,18 68,10 77,78 82,47 74,49
VT 0,06 93,83 89,14 76,40 80,01 70,75
0,6 118,03* 89,62 93,64 85,26 85,51*
6,0 101,78 71,53 62,09 67,53 57,96
Inosina 14,0 50,85 54,25 82,35 83,58* 77,85
* \begin{minipage}[t]{155mm}Significativamente diferente (P < 0,05, ensayo t de Student) de los correspondientes valores del grupo de control negativo.\end{minipage}
Los efectos de diversas concentraciones de GE y VT sobre la presión diastólica de este modelo de corazón de rata se presentan en la Tabla 8. Después de la inducción de isquemia en este modelo, la presión diastólica en el ventrículo izquierdo aumentó en más de dos veces en el control negativo. Tanto GE como VT impedían el aumento en la presión diastólica y se encontró que eran al menos tan eficaces como inosina en este modelo.
TABLA 8
\begin{minipage}[t]{155mm}Los Efectos de GE y VT sobre la Presión Diastólica en un Ventrículo Izquierdo Isquémico durante la Reperfusión (% de los Valores Medianos de Parámetros Preisquémicos)\end{minipage}
Sustancia Dosis (mg/l) Reperfusión
1 min 5 min 10 min 20 min 30 min
Control Negativo - 228,69 287,43 233,32 175,24 212,68
GE 0,06 95,96 124,53 128,57 134,92 91,20
0,6 69,70 113,42 95,24 99,28 127,06
6,0 53,97 65,08 103,17 83,98 132,47
VT 0,06 112,41 98,27 118,76 115,44 112,41
0,6 101,59 97,55 115,01 115,01 115,01
6,0 96,61 173,67 213,35 169,62 151,44
Inosina 14,0 92,35 111,83 139,32 148,63 149,42
Mediciones de la tasa máxima para la disminución de la presión del ventrículo izquierdo (-dp/dt_{máx}) en los ventrículos izquierdos isquémicos de corazones de rata se resumen en la Tabla 9. Estos resultados muestran una reducción de aproximadamente el 50% en el valor -dp/dt_{máx} en un ventrículo izquierdo isquémico para el control negativo 1 minuto después del inicio de la reperfusión de la Etapa III (el control negativo). A pesar de que el parámetro -dp/dt_{máx} para el control negativo se recuperó hasta aproximadamente el 88% de su valor preisquémico después de aproximadamente 10 minutos, -dp/dt_{máx} disminuyó después de ello. Después de ello, se observó que cada uno de GE y VT aumentaban significativamente el valor -dp/dt_{máx} en el ventrículo izquierdo isquémico dentro del primer minuto de reperfusión; por ejemplo, el valor mediano del parámetro aumentó hasta aproximadamente el 80 a 100% de su valor preisquémico con 0,06 mg/l de GE, 0,6 mg/l de VT y 0,6 mg/l de VT, respectivamente. En instantes posteriores, -dp/dt_{máx} para un corazón tratado con 0,6 mg/l de GE, 6,0 mg/l de GE ó 6 mg/l de VT, respectivamente, era típicamente mayor que el observado para el control negativo, y hacia el minuto 30 de reperfusión, era mayor que aproximadamente el 90% de su valor preisquémico. La reperfusión con inosina (la sustancia control positiva) producía un incremento lento y estable en el -dp/dt_{máx} en un corazón, de modo que aproximadamente el 80% del valor preisquémico para el parámetro se consiguió después de aproximadamente 10 a 20 minutos.
TABLA 9
\begin{minipage}[t]{155mm}Los Efectos de GE y VT sobre la Tasa Máxima de Disminución de Presión en un Ventrículo Izquierdo durante la Reperfusión (% de los Valores medianos de Parámetros Preisquémicos)\end{minipage}
Sustancia Dosis (mg/l) Reperfusión
1 min 5 min 10 min 20 min 30 min
Control Negativo - 48,74 75,90 87,57 80,59 75,17
GE 0,06 86,91* 89,27 82,04 75,11 66,02
0,6 53,56 79,56 87,20 84,10 91,20
6,0 59,93 70,76 93,15 95,32 93,07
VT 0,06 80,75 83,92 77,75 84,23 76,22
0,6 100,31* 85,83 96,20 88,18 91,44
6,0 75,83 65,42 70,90 69,93 60,00
Inosina 14,0 41,91 65,94 78,85 91,83 93,88
* \begin{minipage}[t]{155mm}Significativamente diferente (P < 0,05, ensayo t de Student) de los correspondientes valores del grupo de control negativo.\end{minipage}
La presión de evolvente del corazón es un parámetro importante que refleja la función de bombeo inotrópica del corazón. Los resultados presentados en la Tabla 10 demuestran que después de la inducción de la isquemia en el ventrículo izquierdo de un corazón de rata, la presión de evolvente disminuía hasta aproximadamente el 29% de su valor preisquémico en el espacio de 1 minuto y nunca excedía de aproximadamente el 55% de su valor preisquémico durante el subsiguiente período de observación de 30 minutos. La reperfusión con GE y VT aumentaron los valores de la presión de evolvente medida hasta dentro de aproximadamente 70 a 100% de sus valores preisquémicos respectivos. Se encontró que la reperfusión con 0,6 mg/l de GE ó 0,6 mg/l de VT restaura el valor de la presión de evolvente de un ventrículo izquierdo isquémico a aproximadamente 85% o más de su nivel preisquémico respectivo después de aproximadamente 20 o aproximadamente 30 minutos de reperfusión, respectivamente.
TABLA 10
\begin{minipage}[t]{155mm}Los Efectos de GE y VT sobre la Disminución de Presión de Evolvente en un Ventrículo Izquierdo Isquémico durante la Reperfusión (% de los Valores medianos de Parámetros Preisquémicos)\end{minipage}
Sustancia Dosis (mg/l) Reperfusión
1 min 5 min 10 min 20 min 30 min
Control Negativo - 29,04 51,50 55,16 45,39 34,17
GE 0,06 117,70* 92,58 86,19 74,40 68,73
0,6 71,90 83,73 86,63 78,42* 87,22*
6,0 78,34 68,80 74,86 78,47 73,08*
VT 0,06 90,10 93,41 74,75 78,47 71,47
0,6 136,04* 101,11 101,53* 86,21* 84,99*
6,0 99,46 67,93 63,87 57,45 55,34
Inosina 14,0 57,13 57,59 82,33 94,19 91,68*
* \begin{minipage}[t]{155mm}Significativamente diferente (P < 0,05, ensayo t de Student) de los correspondientes valores del grupo de control negativo.\end{minipage}
Los efectos de GE y VT sobre el ritmo cardíaco de este modelo de corazón de rata se presentan en la Tabla 11. Cada uno de GE y VT producía un efecto cronotrópico negativo moderado deseable en el ritmo cardíaco (es decir, una disminución en el ritmo cardíaco) a concentraciones de 0,06 y 6,0 mg/l.
TABLA 11
\begin{minipage}[t]{155mm}Los Efectos de GE y VT sobre la Reperfusión del Ritmo Cardiaco (% de los Valores medianos de Parámetros Preisquémicos)\end{minipage}
Sustancia Dosis (mg/l) Reperfusión
1 min 5 min 10 min 20 min 30 min
Control Negativo - 51,98 71,35 91,57 108,51 109,30
GE 0,06 69,09 91,94 93,44 72,87* 68,67*
0,6 52,28 85,30 77,07 91,53 106,61
6,0 38,86 55,65 82,12 77,12* 63,29
VT 0,06 92,58 65,90 72,02 83,84 82,52
0,6 71,30 91,90 113,52 108,41 101,74
6,0 59,54 71,39 75,19 103,33 82,04
Inosina 14,0 45,37 69,97 67,52 79,97* 75,60*
* \begin{minipage}[t]{155mm}Significativamente diferente (P < 0,05, ensayo t de Student) de los correspondientes valores del grupo de control negativo.\end{minipage}
La Tabla 12 muestra los efectos de GE y VT sobre la frecuencia y duración de arritmias ventriculares durante la reperfusión. Se encontró que ni GE ni VT tenían un efecto arritmogénico sobre el modelo de corazón de rata empleado en este estudio.
TABLA 12
Los Efectos de GE y VT sobre la Frecuencia y Duración de Arritmias Ventriculares Durante la Reperfusión
Sustancia Concentración Número de Duración Global de Duración Global de
(mg/l) Extrasístoles Taquicardias la Fibrilación
Ventriculares Ventriculares (s) Ventricular (s)
Control Negativo - 180 10,2 32,1
(\pm 41,48) (\pm 9,48) (\pm 28,55)
GE 0,06 182,2 2,1 0
(\pm 54,50) (\pm 1,26)
0,6 168,5 22,2 44,3
(\pm 54,50) (\pm 21,60) (\pm 30,37)
6,0 174,9 5,2 79,6
(\pm 34,50) (\pm 2,63) (\pm 38,24)
VT 0,06 154,5 7,7 29,3
(\pm 20,85) (\pm 3,63) (\pm 29,33)
0,6 182,4 4,4 35,1
(\pm 20,85) (\pm 3,56) (\pm 29,33)
6,0 104,4 0 0
(\pm 20,82)
Inosina 14,1 230,4 1,3 52,9
(\pm 41,39) \pm 0,94) (\pm 52,90)
* \begin{minipage}[t]{155mm}Significativamente diferente (P < 0,05, ensayo t de Student) de los correspondientes valores del grupo de control negativo.\end{minipage}
En síntesis, se encontró que GE y VT optimizan la función inotrópica del corazón durante la isquemia, tal como se muestra por las mejoras en los valores medidos para la presión sistólica, presión de evolvente y la tasa máxima de aumento de la presión del ventrículo izquierdo (+dp/dt_{max}) en los corazónes de ensayo de ratas. GE y VT también prevenían el desarrollo de contracturas isquémicas y no producían ningún efecto arritmogénico en el miocardio isquémico. Estos efectos observados son consistentes con los inducidos por compuestos farmacéuticos que tienen actividad del abridor de postasio.
Ejemplo 5 Efectos de GE y VT sobre Lesiones Isquémicas del Miocardio en Animales
El ligamiento de la arteria coronaria conduce a una isquemia de miocardio aguda con lesiones irreversibles en las membranas de los cardiomiocitos y la liberación de enzimas del miocardio intracelulares, incluidas creatina fosfoquinasa (CPK - siglas en inglés), en la sangre. El nivel de la actividad enzimática de CPK en el plasma durante las primeras horas de isquemia se ha correlacionado con el grado de la lesión isquémica del miocardio. Véase, por ejemplo, G. Forster et al., Method of Enzymatic Analysis (U. Bergmeyer y W. Weynhame, eds, Verlack Chemie GMBH). En este experimento, se midió la actividad de CPK para vigilar el grado de lesión isquémica del miocardio que resulta de la oclusión de la arteria coronaria mediante ligamiento. Específicamente, la actividad de CPK se midió 1 hora después de la oclusión de la arteria coronaria en ratas que permanecían sin tratar o, alternativamente, fueron tratadas con una inyección intravenosa de una sustancia de ensayo o de control. Los resultados de este experimento demuestran que tanto GE como VT reducen el grado de lesiones isquémicas del miocardio y exhiben una actividad cardioprotectora.
Ratas machos criadas al azar blancas, que pesaban aproximadamente 200 g, se anestesiaron utilizando una administración de éter ligero y luego se inmovilizaron y oxigenaron artificialmente. La rama descendente de la arteria coronaria izquierda se ligó utilizando la técnica descrita por Selye et al., Angiology 11:398-407 (1960). Inmediatamente después del ligamiento se administró a una rata, a través de la vena femoral caterizada, una sustancia de ensayo, una sustancia control positiva o una sustancia control negativa (descritas más abajo). Cada dosis de cada sustancia de ensayo o sustancia control positiva o negativa se administró a un grupo experimental o de control de 9 ratas de ensayo. En este estudio, GE y VT servían como sustancias de ensayo, propanolol servía como la sustancia control positiva y la solución salina fisiológica servía como la sustancia de control negativa. A cada rata de ensayo en un grupo experimental se le administró una dosis de 0,1, 1,0 ó 10,0 miligramos de GE por kilogramo de peso corporal del animal sujeto (mg/kg) ó 0,01, 1,0 ó 10,0 miligramos de VT por kilogramo de peso corporal del animal. Cada animal del grupo control positivo recibió una dosis intravenosa de 0,5 mg de agente bloqueante \beta-adrenérgico, propanolol (Obzidan, Germed, Alemania) por kilogramo de peso corporal. El propanolol se utiliza comúnmente para tratar arritmias cardíacas y existe una cierta evidencia que el agente puede reducir el grado de lesión isquémica al corazón. Véase GOODMAN Y GILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS, supra, en 192. Cada animal del grupo control negativo recibió solución salina fisiológica.
Una hora después del inicio de la oclusión de la arteria coronaria, se sacrificó a cada animal de ensayo, se recogió su sangre y se midió la actividad de CPK en su suero sanguíneo. La actividad CPK se determinó utilizando un método bioquímico estándar, tal como el comercialmente disponible de Lachema Company (Chequia) en su kit de ensayo, y siguiendo las instrucciones del proceso del fabricante incluidas en el folleto del envase.
En calidad de control suplementario para el posible trauma provocado por el proceso quirúrgico se incluyó en el estudio un grupo de 9 ratas operadas en falso. Estos animales de ensayo se sometieron a la disección del tórax, pero no a una oclusión de la arteria coronaria. Estos animales "operados en falso" no se trataron con ninguna sustancia de ensayo o control y se eutanizaron 1 hora después de la intervención quirúrgica. Después se recogió su sangre para la determinación de la actividad de CPK.
Los resultados de este estudio se presentan en la Tabla 13. En cada caso, se encontró que dosis de GE a 0,1, 1,0 y 10,0 miligramos disminuían el grado de lesiones isquémicas del miocardio inducidas en las ratas de ensayo, según se midió por una reducción significativa en la actividad de CPK en el suero sanguíneo con relación al control negativo (es decir, la liberación de la enzima del miocardio intracelular en el suero se midió para vigilar el grado de lesión que resulta después del ligamiento de la arteria coronaria). VT producía resultados similares a dosis de 0,1 y 1,0 mg/kg, respectivamente. Animales con lesiones isquémicas del miocardio inducidas que fueron tratados con GE o VT tenían actividades de CPK en el suero que no eran significativamente diferentes de las observadas en el grupo de los animales operados en falso.
Las actividades biológicas de GE y VT observadas en este modelo son equiparables a las actividades previamente descritas para los activadores del flujo de potasio saliente sometidos a ensayo en modelos con animales en paralelo. Se ha demostrado que compuestos farmacéuticos que tienen actividades del abridor del canal de potasio ejercen efectos cardioprotectores sobre el miocardio isquémico para disminuir la "fuga" de enzima y para optimizar el gasto de fosfatos macroérgicos. Según se demuestra en este experimento, parece ser que GE y VT producen efectos que son idénticos a o al menos similares a compuestos conocidos que tienen actividades del abridor del canal de potasio.
TABLA 13
\begin{minipage}[t]{150mm}Los Efectos de GE y VT sobre la Actividad de CPK en el Suero Sanguíneo 1 Hora después de la Oclusión Coronaria\end{minipage}
Sustancia Dosis (mg/kg) Actividad de CPK (mcCat/L)
Animales operados en falso - 0,063 (\pm 0,011)
S - 0,263 (\pm 0,032)^{\amp{1}}
Propanolol - 0,170 (\pm 0,011)^{\text{*}}^{\amp{1}}
GE 0,1 0,062 (\pm 0,013)^{\text{*}}^{#}
1,0 0,056 (\pm 0,014)^{\text{*}}^{#}
10,0 0,110 (\pm 0,024)^{\text{*}}^{#}
VT 0,1 0,119 (\pm 0,032)^{\text{*}}
1,0 0,129 (\pm 0,020)^{\amp{1}}^{\text{*}}
10,0 0,176 (\pm 0,033)^{\amp{1}}
Significativamente diferente (P < 0,05, ensayo t de Student) de valores registrados para los siguientes grupos:
^{\amp{1}} animales operados en falso
^{\text{*}} control negativo
^{#} control positivo
Abreviatura: S = solución salina fisiológica
Ejemplo 6 Efectos Antiarrítmicos de GE y VT en un Modelo de Arritmia Inducida por Cloroformo
La inhalación de cloroformo induce la arritmia ventricular y se utiliza ampliamente como un ensayo de rastreo para inducir la arritmia en modelos de animales e identificar sustancias y compuestos que poseen una actividad antiarrítmica. En ratones, una profunda anestesia con cloroformo da origen a taquicardia ventricular y/o fibrilación ventricular. A pesar de que no ha sido claramente dilucidado el mecanismo de estos efectos arritmogénicos, existe una cierta evidencia de que las células del miocardio de ratones que han sido anestesiados con cloroformo tienen un período refractario acortado y exhiben una desincronización de su recuperación de la excitabilidad. Presumiblemente, estos estados contribuyen a la aparición del tipo de arritmias de re-entrada. Además, el cloroformo aumenta la sensibilidad del miocardio a catecolaminas endógenas, aumentando de esta forma sus efectos arritmogénicos. Winslow, Pharmac. Ther. 24:401-433 (1984).
Los resultados de este estudio demuestran que GE y VT exhiben actividades antiarrítmicas y efectos cardioprotectores en modelos con animales en los que se ha inducido una arritmia ventricular. Este estudio se realizó sobre la base de recomendaciones del Programa del Servicio General de Farmacología (Protocolos de Ensayos Actuales PAN Laboratory).
Cada ratón en el estudio fue tratado mediante inyección intraperitoneal de una dosis de una sustancia de ensayo o de control 15 minutos antes de la administración de una profunda anestesia con cloroformo. Después, se administró a cada ratón una sustancia de ensayo o de control. GE y VT servían como sustancias de ensayo, y cada péptido se examinó a dosis de 0,001, 0,01, 0,1, 1,0 y 10,0 mg/kg. Novocainamida, un agente antiarrítmico conocido, servía como la sustancia de control positiva y se administró a los ratones en el grupo control positivo a una dosis de 240 mg/kg. Solución salina fisiológica servía como la sustancia control negativa y se administró a los ratones en el grupo de control negativo.
La anestesia de cloroformo se administró a cada ratón colocando el ratón en un recipiente de vidrio estanco al aire con algodón empapado en 20 ml de cloroformo absoluto. En el momento del paro respiratorio, el ratón se retiró de la jaula y se inició una vigilancia del electrocardiograma (ECG) (plomo II estándar) y se continuó durante 30 segundos. De acuerdo con los criterios del Programa de Servicio General de Farmacología, una sustancia tiene un efecto antiarrítmico protector si, después de su administración a un animal de ensayo, éste no muestra ningún síntoma de perturbación del ritmo paroxismal ventricular (por ejemplo, taquicardia ventricular o fibrilación ventricular) durante el intervalo de 30 segundos de la parada respiratoria inducida por el cloroformo y si el ritmo cardíaco del animal de ensayo durante el período de 30 segundos permanece por debajo de 100 latidos cada 30 segundos. Una actividad antiarrítmica para una dosis particular de una sustancia de ensayo es farmacéuticamente aceptable si el 30% de los animales en un grupo de ensayo muestra los resultados del ensayo últimos (es decir, a saber ningún síntoma de perturbaciones del ritmo paroxismal ventricular y un ritmo cardíaco por debajo de 100 latidos cada 30 segundos en el espacio de 30 segundos después de la parada respiratoria).
Los resultados de este estudio se presentan en la Tabla 14. El tratamiento previo de ratones con GE o VT a una dosis de 0,01, 0,1, 1,0, o 10,0 mg/kg se encontró que prevenía el desarrollo de arritmias ventriculares inducidas por la inhalación de dosis tóxicas de cloroformo o la oclusión coronaria. Los efectos antiarrítmicos protectores exhibidos tanto por GE como por VT no eran significativamente diferentes de los efectos antiarrítmicos protectores producidos por novocainamida a una dosis de 240,0 mg/kg.
TABLA 14
Los Efectos Antiarrítmicos de GE y VT en un Modelo de Animal de Arritmia Inducida por Cloroformo
Sustancia Dosis Efecto Antiarrítmico (n° de animales) Resultado
mg/kg abs. %
S - 0 0 Sin efecto
Novocainamida 240 7 77,8^{\text{*}} Efecto antiarrítmico
GE 0,001 1 11,1 Sin efecto
0,01 4 44,4 Efecto antiarrítmico
0,1 4 44,4^{\text{*}} Efecto antiarrítmico
1,0 5 55,6^{\text{*}} Efecto antiarrítmico
10,0 6 66,7^{\text{*}}^{#} Efecto antiarrítmico
VT 0,001 0 0^{#} Sin efecto
0,01 3 33,3^{#} Efecto antiarrítmico
0,1 4 44,6^{#} Efecto antiarrítmico
1,0 6 66,7^{#} Efecto antiarrítmico
10,0 4 44,4^{#} Efecto antiarrítmico
^{\text{*}}Significativamente diferente (P < 0,05, ensayo Qui cuadrado) de valores del grupo de control negativo.
^{#}Significativamente diferente (p < 0,05, ensayo Qui cuadrado) de valores del grupo de control positivo.
Abreviatura: S = solución salina fisiológica
Ejemplo 7 Efectos de GE y VT sobre la Aparición, Frecuencia y Duración de Arritmias Isquémicas Tempranas
Arritmias isquémicas que se producen durante los primeros 20 a 30 minutos después de una oclusión coronaria se encuentran entre las complicaciones más formidables de isquemia aguda del miocardio, ya que a menudo son de carácter irreversible y dan como resultado una muerte repentina. Los mecanismos mediante los cuales se generan estas arritmias parecen resultar de la excitación del miocardio re-entrante. En este experimento, se demuestra que tanto GE como VT reducen la duración de taquicardias ventriculares en el miocardio isquémico.
A ratas machos criadas al azar blancas que pesaban 200 g se les administró una anestesia con éter ligera y luego se inmovilizaron y oxigenaron artificialmente. La rama descendente de la arteria coronaria izquierda de cada rata se ligó. Inmediatamente después del ligamiento, se administró a cada rata una sustancia de ensayo o de control a través de la vena femoral caterizada y se inició un registro del ECG (plomo II estándar) y se mantuvo durante los siguientes 30 minutos.
GE y VT servían como sustancias de ensayo y se administraron a animales en los respectivos grupos de ensayo a dosis de 0,1, 1,0 y 10,0 mg/kg. El agente bloqueante \beta-adrenérgico, propanolol (Obzidan, Germed, Alemania) servía como la sustancia control positiva y se administró por vía intravenosa a cada animal en el grupo control positivo a una dosis de 0,5 mg/kg. Solución salina fisiológica servía como la sustancia control negativa y se administró por vía intravenosa a animales en el grupo control negativo. Cada dosis de cada sustancia de ensayo o de control se sometió a ensayo por separado en un grupo de nueve animales.
Los siguientes parámetros fueron evaluados basándose en los registros del ECG: (i) el número de extrasístoles ventriculares que se producían en el espacio de un período de observación de 30 minutos después de la oclusión coronaria; (ii) la duración acumulativa global de taquicardias ventriculares (es decir, la suma de la duración de perturbaciones del ritmo ventricular paroxismal individual en segundos) que se producen dentro del período de observación de 30 minutos; y (iii) la duración global (en segundos) de las fibrilaciones ventriculares que se producen dentro del período de observación de 30 minutos. Los datos se trataron electrónicamente y se realizaron comparaciones estadísticas entre los valores obtenidos de los animales en los grupos de ensayo experimentales y aquellos en los grupos control respectivos diferentes.
Los resultados de este experimento se presentan en la Tabla 15. En este estudio no se registraron fibrilaciones ventriculares. Tal como se indica en la Tabla 15, todas las dosis de GE y VT ensayadas en este modelo reducían la duración global de taquicardias ventriculares en el miocardio isquémico. Dosis de GE de 0,1 mg/kg y 10,0 mg/kg y una dosis de VT de 10,0 mg/kg eran particularmente eficaces para reducir la duración global de estas taquicardias ventriculares. Se encontró que dosis de GE a 0,1 mg/kg y 10,0 mg/kg y dosis de VT a 1,0 y 10,0 mg/kg disminuían la duración global de la taquicardia ventricular. De manera notable, una dosis de VT a 10 mg/kg inducía una disminución de 3 veces en el número de extrasístoles ventriculares en comparación con el grupo control negativo.
TABLA 15
Los Efectos Antiarrítmicos de GE y VT sobre las Arritmias Tempranas del Miocardio Isquémico
Sustancia Dosis (mg/kg) Duración Global de Taquicardias Ventriculares (s) Número de Extrasístoles Ventriculares
S - 159,91 65,33
(\pm 24,24) (\pm 18,19)
Obzidan 0,5 56,74 61,22
(\pm 17,24) (\pm 27,02)
GE 0,1 38,67 25,22
(\pm 12,19) (\pm 8,36)
1,0 93,17 116,22
(\pm 25,90) (\pm 22,06)
10,0 51,78 47,78
(\pm 20,98)* (\pm 17,96)
VT 0,1 105,60 131,78
(\pm 33,89) (\pm 38,48)
1,0 88,56 51,33
(\pm 17,07) (\pm 10,12)
10,0 46,58 18,00
(\pm 15,85) (\pm 8,43)
*Significativamente diferente (P < 0,05, ensayo t de Student) de valores del grupo control negativo.
Abreviatura: S = solución salina fisiológica
Ejemplo 8 Efectos de GE y VT sobre la Presión Sanguínea Arterial
En este experimento se examinaron los efectos de GE y VT sobre la presión sanguínea arterial. Los resultados de este experimento demuestran que tanto GE como VT reducen la presión sanguínea arterial y exhiben efectos hipotensores (es decir, provocan una reducción en la presión sanguínea) y vasodilatadores en sujetos a los que se han administrado estos dipéptidos. Estos efectos son rasgos característicos de abridores del canal de potasio conocidos.
Para este estudio se emplearon ratas macho criadas al azar blancas que pesaban aproximadamente 200 g. Cada dosis de cada sustancia de ensayo control respectiva se administró a un grupo de cinco ratas. Como sustancias de ensayo se emplearon GE y VT y se administraron por vía intravenosa a dosis de 0,01, 0,1, 1,0 y 10,0 mg/kg. Solución salina fisiológica (0,2 ml) servía como la sustancia control negativa. El agente bloqueante gangliónico, pentamina, servía como la sustancia control positiva y se sometió a ensayo a una dosis de 5 mg/kg. Después de la administración de la sustancia de ensayo, la sustancia control positiva o la sustancia control negativa, se vigiló la presión sanguínea arterial de cada animal.
Antes de la administración de la sustancia de ensayo o de control, cada animal se anestesió con \alpha-cloralosa y luego se caterizó su arteria carótida y la vena yugular. El catéter carótido se conectó a un manómetro electrónico fijado a un registrador por ordenador desde un convertidor de analógico a digital. El nivel basal mediano de la presión sanguínea arterial se determinó como sigue: durante un período de 30 segundos, se registró la señal digital que pertenecía a la presión sanguínea arterial a intervalos de 1 segundo. El valor mediano de estas treinta mediciones individuales se determinó y registró luego.
Después de determinar el nivel basal mediano de la presión sanguínea arterial, una dosis particular de la sustancia de ensayo o de control se administró en un volumen de 0,2 ml de solución salina fisiológica a un animal a través del catéter venoso yugular. Mediciones de la presión sanguínea arterial se tomaron luego durante las siguientes 1,5 horas como sigue: (i) durante los primeros 5 minutos, se vigiló continuamente la presión sanguínea arterial y los valores medianos se calcularon electrónicamente y se registraron en cada caso a los 10 intervalos diferentes de 30 segundos (es decir, 30º segundo, 60º segundo, etc.); (ii) después, se calcularon los valores medianos de la presión sanguínea arterial a los primeros segundos del 10º minuto, 15º minuto, 30º minuto, 45º minuto, 60º minuto, 75º minuto y 90º minuto después de la administración de la respectiva sustancia de ensayo o de control.
Los resultados de este estudio se muestran en las Tablas 16A y 16B. En este modelo, la presión sanguínea arterial de animales tratados con solución salina fisiológica (sustancia control negativa) permanecieron en aproximadamente 92 a aproximadamente 100% de los niveles basales de pretratamiento durante el período de observación de 90 minutos. Se encontró que pentamina reducía la presión sanguínea arterial en aproximadamente 68 a aproximadamente 75% de los niveles basales de pretratamiento durante los primeros 5 minutos después de su administración, confirmando que este modelo con animales responde a agentes vasodilatadores. Se encontró que el tratamiento con GE o VT provoca una disminución moderada, pero retardada en la presión sanguínea arterial mediana después de aproximadamente 60 a 90 minutos. Estos resultados sugieren que GE y VT poseen cada uno características vasodilatadoras moderadas.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA 16A El Efecto de GE sobre la Presión Sanguínea Arterial
4
5
TABLA 16B El Efecto de VT sobre la Presión Sanguínea Arterial
6
7
Ejemplo 9 Efectos de GE y VT sobre la Función Cardíaca
Este experimento se diseñó para investigar los efectos de GE y VT sobre la función cardíaca. Los resultados de esta investigación revelan que ni GE ni VT tiene un efecto significativo sobre el funcionamiento de un corazón normal. De manera notable, ninguno de estos dipéptidos altera las características básicas de un electrocardiograma (ECG) normal.
Ratas macho criadas al azar blancas que pesan aproximadamente 200 g se anestesiaron utilizando Nembutal. Se tomó un ECG basal tan pronto como fue posible después de la anestesia para establecer las mediciones basales para los parámetros principales de funciones cardíacas. Del estudio se excluyeron ratas que mostraban cualquier desviación de los parámetros normales del ECG.
GE y VT servían como sustancias de ensayo. A cada animal en el grupo de ensayo se administró intravenosamente GE o VT a una dosis de 0,001, 0,01, 0,1, 1,0 10,0 y 100,0 mg/kg. Cada dosis de cada sustancia de ensayo se evaluó en un grupo experimental separado que consistía en 10 ratas. Se tomaron trazas de ECG (no menos de 4 complejas en cada caso) a los 1, 3, 5 y 10 minutos después de la inyección de la sustancia de ensayo. Como la sustancia control negativa servía solución salina fisiolígica. A cada animal en el grupo control negativo se administraron por vía intravenosa 2 ml de solución salina fisiológica.
La función cardíaca se evaluó vigilando los siguientes parámetros del ECG:
(i) la duración del intervalo PQ (que define el tiempo en el que el impulso pasa por ncima del atrio y el nodo atrioventricular). El valor normal para este parámetro para ratas anestesiadas con Nembutal es de 25 a 60 milisegundos (ms) utilizando un ECG de plomo II.
(ii) la anchura del complejo QRS (que define el paso del impulso por encima del miocardio ventricular). El valor normal para este parámetro para ratas anestesiadas con Nembutal es de 15 a 30 ms utilizando un ECG de plomo II.
(iii) el voltaje de la onda R (que define la difusión de la excitación sobre el ventrículo izquierdo). El valor normal para este parámetro para ratas anestesiadas con Nembutal es de 0,163 a 0,9 milivoltios (mV) utilizando ECG de plomo II.
(iv) la duración del intervalo QT (que define el tiempo desde el comienzo del complejo QRS al final de la onda T y que refleja la duración de la despolarización y repolarización ventriculares). El valor normal para este parámetro para ratas anestesiadas con Nembutal es 50 a 106 ms utilizando ECG de plomo II.
(v) el voltaje de la onda T (que define el proceso de repolarización en el ventrículo izquierdo). El valor normal para este parámetro para ratas anestesiadas con Nembutal es de 0,05 a 0,38 mV utilizando el ECG de plomo II.
Tal como se muestra en las Tablas 17A a 21B, para los intervalos de dosis sometidos a ensayo, GE y VT no tenían ningún efecto significativo sobre ninguno de estos parámetros estándares de la función del corazón. Incluso en aquellos pocos casos en los que, para un parámetro dado, se observó una diferencia estadísticamente significativa entre el valor inicial y uno o más valores medidos con posterioridad, los valores medidos con posterioridad se encontraban dentro del intervalo normal.
TABLA 17A
El Efecto de GE sobre la Duración del Intervalo PQ (% del Valor Mediano Inicial)
Sustancia Dosis mg/kg Tiempo desde la Administración de la Sustancia (min)
1 3 5 10
S - 93,75 110,59 108,31 108,51
(\pm5,35) (\pm8,39) (\pm7,35) (\pm8,39)
GE 0,001 99,74 98,42 103,01 104,96
(\pm4,78) (\pm4,28) (\pm5,89) (\pm7,36)
0,01 115,72 105,79 109,65 103,17
(\pm6,34)^{\text{*}}^{#} (\pm4,13) (\pm3,60)^{\text{*}} (\pm4,52)
1,0 107,30 95,03 99,18 102,38
(\pm5,94) (\pm3,56) (\pm6,67) (\pm4,40)
10,0 100,38 99,92 98,87 94,70
(\pm4,93) (\pm4,08) (\pm4,87) (\pm4,99)
100,0 103,51 99,07 102,80 99,97
(\pm3,40) (\pm2,99) (\pm3,99) (\pm4,17)
Significativamente diferente (test t de Student pareado) frente a: ^{\text{*}} - correspondiente al nivel inicial; ^{#}- valores de
los parámetros en el grupo control en un minuto correspondiente.
Abreviatura: S = solución salina fisiológica
TABLA 17B
El Efecto de VT sobre la Duración del Intervalo PQ (% del Valor Mediano Inicial)
Sustancia Dosis mg/kg Tiempo desde la Administración de la Sustancia (min)
1 3 5 10
S - 93,75 110,59 108,31 108,51
(\pm5,35) (\pm8,39) (\pm7,35) (\pm8,39)
VT 0,001 107,20 108,87 107,04 108,39
(\pm4,61) (\pm6,72) (\pm6,05) (\pm5,26)
0,01 101,70 102,23 101,58 103,58
(\pm3,63) (\pm6,42) (\pm5,34) (\pm7,02)
0,1 96,37 99,99 101,55 100,12
(\pm2,88) (\pm4,66) (\pm2,54) (\pm1,90)
1,0 102,33 103,40 103,31 99,43
(\pm2,73) (\pm2,57) (\pm2,82) (\pm3,95)
10,0 106,10 109,78 108,95 107,05
(\pm4,41) (\pm7,96) (\pm4,60) (\pm5,51)
100,0 100,00 102,86 100,00 100,00
(\pm0,00) (\pm2,86) (\pm0,00) (\pm0,00)
Abreviatura: S = solución salina fisiológica 
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 18A
El Efecto de GE sobre la Anchura del Complejo QRS (% del Valor Mediano Inicial)
Sustancia Dosis mg/kg Tiempo desde la Administración de la Sustancia (min)
1 3 5 10
S - 100,00 100,00 110,00 110,00
(\pm0,00) (\pm0,00) (\pm0,00) (\pm0,00)
GE 0,001 100,00 100,00 100,00 100,00
(\pm0,00) (\pm0,00) (\pm0,00) (\pm0,00)
0,01 100,00 100,00 100,00 100,00
(\pm0,00) (\pm0,00) (\pm0,00) (\pm0,00)
0,1 102,00 102,00 102,00 100,33
(\pm2,00) (\pm2,00) (\pm2,00) (\pm2,47)
1,0 99,29 109,32 113,78 101,14
(\pm5,83) (\pm6,01) (\pm10,53) (\pm11,05)
10,0 104,40 98,58 97,57 102,15
(\pm5,67) (\pm3,97) (\pm5,89) (\pm5,99)
100,0 101,67 100,00 100,00 100,00
(\pm1,67) (\pm0,00) (\pm0,00) (\pm0,00)
Abreviatura: S = solución salina fisiológica
TABLA 18B
El Efecto de VT sobre la Anchura del Complejo QRS (% del Valor Mediano Inicial)
Sustancia Dosis mg/kg Tiempo desde la Administración de la Sustancia (min)
1 3 5 10
S - 100,00 100,00 110,00 110,00
(\pm0,00) (\pm0,00) (\pm0,00) (\pm0,00)
VT 0,001 102,50 100,00 105,67 105,00
(\pm7,66) (\pm0,00) (\pm11,68) (\pm0,00)
0,01 100,00 100,00 100,00 100,00
(\pm0,00) (\pm0,00) (\pm0,00) (\pm0,00)
0,1 102,00 102,00 102,00 100,33
(\pm2,00) (\pm2,00) (\pm2,00) (\pm2,47)
1,0 99,29 109,32 113,78 101,14
(\pm5,83) (\pm6,01) (\pm10,53) (\pm11,05)
10,0 104,40 98,58 97,57 102,15
(\pm5,67) (\pm3,97) (\pm5,89) (\pm5,99)
100,0 101,67 100,00 100,00 100,00
(\pm1,67) (\pm0,00) (\pm0,00) (\pm0,00)
Abreviatura: S = solución salina fisiológica 
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 19A
El Efecto de GE sobre el Voltaje de la Onda R (% del Valor Mediano Inicial)
Sustancia Dosis mg/kg Tiempo desde la Administración de la Sustancia (min)
1 3 5 10
S - 102,88 102,20 103,36 106,21
(\pm2,60) (\pm4,89) (\pm4,29) (\pm8,22)
GE 0,001 98,63 98,88 97,86 98,63
(\pm1,55) (\pm1,60) (\pm1,20) (\pm1,55)
0,01 102,20 104,62 102,15 102,17
(\pm3,38) (\pm2,81) (\pm3,66) (\pm4,10)
0,1 103,63 102,80 102,74 103,81
(\pm4,41) (\pm5,21) (\pm5,26) (\pm5,67)
1,0 101,87 102,38 104,35 107,60
(\pm1,86) (\pm2,91) (\pm2,68) (\pm2,80)
10,0 102,97 105,82 103,51 104,78
(\pm2,58) (\pm4,11) (\pm3,60) (\pm3,60)
100,0 96,62 100,45 99,74 102,25
(\pm2,33) (\pm3,67) (\pm3,30) (\pm2,76)
Significativamente diferente (P < 0,05, test t de Student pareado) del correspondiente nivel inicial.
Abreviatura: S = solución salina fisiológica
TABLA 19B
El Efecto de VT sobre el Voltaje de la Onda R (% del Valor Mediano Inicial)
Sustancia Dosis mg/kg Tiempo desde la Administración de la Sustancia (min)
1 3 5 10
S - 102,88 102,20 103,36 106,21
(\pm2,60) (\pm4,89) (\pm4,29) (\pm8,22)
VT 0,001 106,63 100,74 104,34 101,32
(\pm4,20) (\pm4,00) (\pm3,22) (\pm3,36)
0,01 107,95 107,66 106,79 110,95
(\pm4,21) (\pm5,94) (\pm5,60) (\pm8,12)
0,1 105,29 105,82 102,17 103,73
(\pm2,40) (\pm2,77) (\pm2,17) (\pm2,30)
1,0 96,68 96,28 94,74 93,52
(\pm2,27) (\pm1,44) (\pm2,25)* (\pm3,07)
10,0 99,80 97,46 98,49 98,69
(\pm2,05) (\pm1,29) (\pm2,16) (\pm2,68)
100,0 102,40 102,04 103,34 102,24
(\pm2,04) (\pm2,04) (\pm2,23) (\pm2,72)
Significativamente diferente (P < 0,05, test t de Student pareado) del correspondiente nivel inicial.
Abreviatura: S = solución salina fisiológica 
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 20A
El Efecto de OE sobre la Duración del Intervalo QT (% del Valor Mediano Inicial)
Sustancia Dosis mg/kg Tiempo desde la Administración de la Sustancia (min)
1 3 5 10
S - 105,60 101,43 102,92 98,15
(\pm3,39) (\pm5,74) (\pm5,16) (\pm3,88)
GE 0,001 102,50 94,33 97,83 89,61
(\pm6,34) (\pm7,50) (\pm6,56) (\pm8,53)
0,01 105,68 102,58 106,74 102,86
(\pm3,39) (\pm4,26) (\pm4,94) (\pm3,84)
0,1 97,76 96,73 95,17 91,84
(\pm3,45) (\pm5,14) (\pm5,42) (\pm5,40)
1,0 101,77 99,08 100,34 93,90
(\pm4,89) (\pm3,65) \pm5,74) (\pm4,80)
10,0 94,63 102,86 103,00 101,74
(\pm2,83)^{#} (\pm3,20) (\pm3,19) (\pm3,86)
100,0 100,60 100,67 97,82 94,29
(\pm3,65) (\pm2,83) (\pm3,73) (\pm3,07)
^{#} \begin{minipage}[t]{155mm}Significativamente diferente (p < 0,05, test t de Student pareado) de los valores de los parámetros en el grupo control a un minuto correspondiente.\end{minipage}
Abreviatura: S = solución salina fisiológica
TABLA 20B
El Efecto de VT sobre el Voltaje de la Onda R (% del Valor Mediano inicial)
Sustancia Dosis mg/kg Tiempo desde la Administración de la Sustancia (min)
1 3 5 10
S - 105,60 101,43 102,92 98,15
(\pm3,39) (\pm5,74) (\pm5,16) (\pm3,88)
VT 0,001 101,80 105,73 102,20 101,24
(\pm5,54) (\pm5,46) (\pm6,81) (\pm5,79)
0,01 99,86 101,48 101,09 97,32
(\pm3,54) (\pm3,63) (\pm3,26) (\pm3,39)
0,1 102,97 98,39 95,65 90,67
(\pm3,17) (\pm3,17) (\pm3,21) (\pm3,54)
1,0 105,57 105,58 102,18 101,18
(\pm6,58) (\pm6,61) (\pm7,96) (\pm7,58)
10,0 94,89 95,91 96,52 88,88
(\pm3,26)^{#} (\pm3,60) (\pm3,78) (\pm3,42)^{\text{*}}
100,0 100,00 100,82 97,96 94,74
(\pm0,00) (\pm3,78) (\pm2,04) (\pm2,52)
*Significativamente diferente (p < 0,05, test t de Student pareado) frente a:
^{\text{*}} - nivel inicial correspondiente;
^{#} - valores de los parámetros en el grupo control en un minuto correspondiente.
Abreviatura: S = solución salina fisiológica 
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 21A
El Efecto de GE sobre el Voltaje de la Onda T (% del Valor Mediano Inicial)
Sustancia Dosis mg/kg Tiempo desde la Administración de la Sustancia (min)
1 3 5 10
S - 99,31 107,13 105,85 112,54
(\pm4,44) (\pm5,66) (\pm4,20) (\pm7,46)
GE 0,001 99,17 105,50 110,00 100,72
(\pm9,82) (\pm9,53) (\pm9,69) (\pm13,51)
0,01 97,81 104,28 101,69 105,67
(\pm4,62) (\pm3,52) (\pm6,49) (\pm6,83)
0,1 97,90 99,92 103,63 103,25
(\pm3,34) (\pm3,62) (\pm4,62) (\pm7,75)
1,0 98,54 96,11 99,82 99,71
(\pm3,47) (\pm4,73) (\pm3,92) (\pm4,52)
10,0 97,27 104,28 96,80 94,67
(\pm3,62) (\pm6,29) (\pm5,44) (\pm4,52)
100,0 108,35 109,59 96,71 108,93
(\pm3,52)* (\pm5,92) (\pm3,12) (\pm5,45)
^{#}Significativamente diferente (p < 0,05, test t de Student pareado) del correspondiente nivel inicial.
Abreviatura: S = solución salina fisiológica
TABLA 21B
El Efecto de VT sobre el Voltaje de la Onda T (% del Valor Mediano Inicial)
Sustancia Dosis mg/kg Tiempo desde la Administración de la Sustancia (min)
1 3 5 10
S - 99,31 107,13 105,85 112,54
(\pm4,44) (\pm5,66) (\pm4,20) (\pm7,46)
VT 0,001 105,36 111,12 107,40 109,87
(\pm4,95) (\pm6,12) (\pm8,16) (\pm6,97)
0,01 103,91 102,55 109,96 102,30
(\pm3,91) (\pm5,72) (\pm3,37)^{\text{*}} (\pm4,59)
0,1 100,21 101,07 105,61 105,40
(\pm5,44) (\pm6,38) (\pm4,02) (\pm4,61)
1,0 112,11 110,44 102,45 101,73
(\pm6,54) (\pm6,23) (\pm8,54) (\pm8,64)
10,0 97,47 95,94 99,08 93,04
(\pm4,01) (\pm2,24) (\pm4,71) (\pm4,22)^{#}
100,0 102,20 101,72 101,72 101,72
(\pm2,20) (\pm7,28) (\pm7,28) (\pm7,28)
*Significativamente diferente (P < 0,05, test t de Student pareado) frente a:
^{\text{*}} - nivel inicial correspondiente;
^{#} - valores de los parámetros en el grupo control en un minuto correspondiente.
Abreviatura: S = solución salina fisiológica

Claims (22)

1. El uso de una cantidad eficaz de un péptido seleccionado de L-Gly-L-Glu, L-Val-L-Thr, un polímero de dos a ocho dipéptidos, en donde cada uno de dichos dipéptidos es L-Gly-L-Glu o L-Val-L-Thr, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento profiláctico o terapéutico de una enfermedad que responde a la apertura de los canales de potasio, en donde la enfermedad:
(a)
implica condiciones broncoespásticas o broncodilatación,
(b)
es asma,
(c)
está asociada con la hipoxia,
(d)
está asociada con la anoxia,
(e)
es epilepsia,
(f)
es isquemia cerebral,
(g)
es enfermedad neurodegenerativa,
(h)
es diabetes,
(i)
es enfermedad de Parkinson,
(j)
es enfermedad de Alzheimer, o
(k)
es cirrosis del hígado.
2. El uso según la reivindicación 1, en el que el tratamiento comprende administrar una cantidad creciente del péptido a lo largo del tiempo hasta que se alcanza la cantidad eficaz de dicho péptido en un sitio del tejido a ser tratado o en la sangre.
3. El uso de una cantidad eficaz de un péptido, seleccionado de L-Gly-L-Glu, L-Val-L-Thr, un polímero de dos a ocho dipéptidos, en donde cada uno de dichos dipéptidos es L-Gly-L-Glu o L-Val-L-Thr, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento profiláctico o terapéutico de una enfermedad cardiovascular.
4. El uso según la reivindicación, en el que la enfermedad es:
(a)
enfermedad del corazón isquémico,
(b)
arritmia cardíaca,
(c)
enfermedad hipertensora,
(d)
fallo del corazón congestivo, o
(e)
respuesta a la vasodilatación.
5. El uso de una cantidad eficaz de un péptido, seleccionado de L-Gly-L-Glu, L-Val-L-Thr, un polímero de dos a ocho dipéptidos, en donde cada uno de dichos dipéptidos es L-Gly-L-Glu o L-Val-L-Thr, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento para inducir la relajación de un músculo liso.
6. El uso según la reivindicación 5, en el que el músculo liso es;
(a)
músculo liso intestinal,
(b)
músculo liso bronquial,
(c)
músculo liso traqueal,
(d)
músculo liso del útero,
(e)
músculo liso de la vejiga,
(f)
músculo liso del intestino, o
(g)
músculo liso vascular, opcionalmente en donde la relajación del músculo liso vascular produce una vasodilatación.
7. El uso de una cantidad eficaz de un péptido, seleccionado de L-Gly-L-Glu, L-Val-L-Thr, un polímero de dos a ocho dipéptidos, en donde cada uno de dichos dipéptidos es L-Gly-L-Glu o L-Val-L-Thr, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento para inducir la relajación de un músculo del esqueleto.
8. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, en el que el péptido se administra por vía tópica, sistémica, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intranasal, transdermal, oral o por inyección intradérmica, instilación intrabronquial, suministro gastrointestinal o suministro transmucosal.
9. El uso según cualquier reivindicación precedente, en el que el péptido es L-Gly-L-Glu o L-Val-L-Thr o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
10. El uso según la reivindicación 9, en el que el péptido es L-Gly-L-Glu o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
11. El uso según la reivindicación 9, en el que el péptido es L-Val-L-Thr o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
12. El uso según cualquier reivindicación precedente, en el que el medicamento está destinado a la administración a un ser humano, preferiblemente en donde la cantidad eficaz del péptido se encuentra dentro de un intervalo de aproximadamente 0,15 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg.
13. Una composición farmacéutica en forma de dosificación unitaria que comprende, por dosificación unitaria, un intervalo de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 1000 mg, preferiblemente de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 100 mg de L-Gly-L-Glu o L-Val-L-Thr, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
14. Una composición farmacéutica según la reivindicación 13, en la que la composición comprende, por dosificación unitaria, un intervalo de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 1000 mg de L-Gly-L-Glu o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
15. Una composición farmacéutica según la reivindicación 13, en la que la composición comprende, por dosificación unitaria, un intervalo de aproximadamente 0,01 mg a aproximadamente 1000 mg de L-Val-L-Thr o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
16. Un kit útil para preservar un tejido vivo o un órgano vivo, comprendiendo dicho kit un recipiente para contener el tejido u órgano y una cantidad eficaz de un péptido para preservar el tejido u órgano, en donde dicho péptido es L-Gly-L-Glu, L-Val-L-Thr, un polímero de dos a ocho dipéptidos de L-Gly-L-Glu o L-Val-L-Thr, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, preferiblemente en donde la cantidad eficaz del péptido se encuentra dentro del intervalo de aproximadamente 10^{-9} M a aproximadamente 10^{-5} M.
17. Un kit según la reivindicación 16, en el que el péptido es L-Gly-L-Glu o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
18. Un kit según la reivindicación 16, en el que el péptido es L-Val-L-Thr o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
19. Un método in vitro para preservar un tejido vivo o un órgano vivo, que comprende poner en contacto el tejido u órgano con una composición que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y una cantidad eficaz de un péptido, en donde dicho péptido es L-Gly-L-Glu o L-Val-L-Thr, un polímero de dos a ocho dipéptidos de L-Gly-L-Glu o L-Val-L-Thr, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, preferiblemente en el que la cantidad eficaz del péptido se encuentra dentro del intervalo de aproximadamente 10^{-9} M a aproximadamente 10^{-5} M.
20. Un método según la reivindicación 19, en el que el péptido es L-Gly-L-Glu o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
21. Un método según la reivindicación 19, en el que el péptido es L-Val-L-Thr o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
22. Un polímero peptídico que comprende al menos dos dipéptidos, en donde cada uno de dichos dipéptidos de dicho polímero es L-Gly-L-Glu o L-Val-L-Thr.
ES98939267T 1997-08-07 1998-08-06 Peptidos que tienen actividad como abridores de los canales de potasio. Expired - Lifetime ES2246072T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US908328 1997-08-07
US08/908,328 US5972894A (en) 1997-08-07 1997-08-07 Peptides having potassium channel opener activity

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2246072T3 true ES2246072T3 (es) 2006-02-01

Family

ID=25425604

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES98939267T Expired - Lifetime ES2246072T3 (es) 1997-08-07 1998-08-06 Peptidos que tienen actividad como abridores de los canales de potasio.

Country Status (10)

Country Link
US (1) US5972894A (es)
EP (1) EP1001976B1 (es)
JP (1) JP2001512740A (es)
AT (1) ATE299510T1 (es)
AU (1) AU731793B2 (es)
CA (1) CA2301669A1 (es)
DE (1) DE69830842T9 (es)
ES (1) ES2246072T3 (es)
TW (1) TWI230613B (es)
WO (1) WO1999007729A2 (es)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002000665A1 (en) * 2000-06-26 2002-01-03 Novo Nordisk A/S Use of potassium channel openers for the treatment of insulitis
CN1135983C (zh) * 2001-06-28 2004-01-28 中山大学 二酸（5－雄甾烯－17－酮－3β－羟基）二酯用于制备药物
GB0206711D0 (en) * 2002-03-21 2002-05-01 Isis Innovation HIF Inhibitor
US7585523B2 (en) * 2002-08-27 2009-09-08 Targeted Medical Pharma Composition and method to augment and sustain neurotransmitter production
JPWO2005018316A1 (ja) * 2003-08-22 2006-10-12 内田　康美 肥大型心筋症モデル動物
JP2007504202A (ja) * 2003-09-04 2007-03-01 ポセイドン ファーマシュティカルズ アクティーゼルスカブ 心臓不整脈を治療するためのｅｒｇチャネル開口薬
US20060263805A1 (en) * 2005-03-16 2006-11-23 Andre Terzic Diagnosing and treating potassium channel defects
MX365525B (es) * 2011-09-06 2019-06-06 Curna Inc Compuestos que regulan la expresión de subunidades alfa de canales de sodio regulados por voltaje en enfermedades relacionadas con epilepsia mioclónica severa de la infancia.
CN104736552B (zh) * 2012-08-24 2018-04-06 庆熙大学校产学协力团 用于预防或治疗心血管疾病的、包含对血管紧张素‑i转换酶表现出抑制活性的肽作为活性成分的药物组合物
US9687526B2 (en) 2015-01-30 2017-06-27 Par Pharmaceutical, Inc. Vasopressin formulations for use in treatment of hypotension
US9925233B2 (en) 2015-01-30 2018-03-27 Par Pharmaceutical, Inc. Vasopressin formulations for use in treatment of hypotension
US9750785B2 (en) 2015-01-30 2017-09-05 Par Pharmaceutical, Inc. Vasopressin formulations for use in treatment of hypotension
US9744239B2 (en) 2015-01-30 2017-08-29 Par Pharmaceutical, Inc. Vasopressin formulations for use in treatment of hypotension
US9937223B2 (en) 2015-01-30 2018-04-10 Par Pharmaceutical, Inc. Vasopressin formulations for use in treatment of hypotension
US9744209B2 (en) 2015-01-30 2017-08-29 Par Pharmaceutical, Inc. Vasopressin formulations for use in treatment of hypotension
US20210106648A1 (en) * 2019-10-11 2021-04-15 TOBEBIO Novel Drug Laboratory Co., Ltd. Synergistic combination of chemotherapy and peptide for treating cancer

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1489879A (en) * 1974-12-20 1977-10-26 Leo Pharm Prod Ltd N'-cyano-n'-3-pyridylguanidines
US4200640A (en) * 1976-04-02 1980-04-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Nitric ester of N-(2-hydroxyethyl)nicotinamide and pharmaceutical use
NO812612L (no) * 1980-08-06 1982-02-08 Ferring Pharma Ltd Enzym-inhibitorer.
SU1417242A1 (ru) * 1985-10-28 1995-10-27 Г.М. Яковлев Способ получения вещества, восстанавливающего функцию миокарда
GB9510477D0 (en) * 1995-05-24 1995-07-19 Sandoz Ltd Organic compounds
US5565483A (en) * 1995-06-07 1996-10-15 Bristol-Myers Squibb Company 3-substituted oxindole derivatives as potassium channel modulators

Also Published As

Publication number Publication date
WO1999007729A3 (en) 1999-06-03
US5972894A (en) 1999-10-26
JP2001512740A (ja) 2001-08-28
DE69830842T9 (de) 2007-01-18
AU8773598A (en) 1999-03-01
AU731793B2 (en) 2001-04-05
ATE299510T1 (de) 2005-07-15
TWI230613B (en) 2005-04-11
WO1999007729A2 (en) 1999-02-18
DE69830842D1 (de) 2005-08-18
EP1001976A2 (en) 2000-05-24
DE69830842T2 (de) 2006-05-24
EP1001976B1 (en) 2005-07-13
CA2301669A1 (en) 1999-02-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2246072T3 (es) Peptidos que tienen actividad como abridores de los canales de potasio.
Hay et al. A novel angiotensin-(1-7) glycosylated mas receptor agonist for treating vascular cognitive impairment and inflammation-related memory dysfunction
JP2003526622A (ja) 老化防御効果を示すテトラペプチド、これを基にした薬理学的物質、及びその利用法
US20080242837A1 (en) Peptide compositions
PT2263694E (pt) Agente antitumoral compreendendo o inibidor da histona desacetilase fk228 e o inibidor da topoisomerase ii, doxorrubicina
US20060135413A1 (en) Depsipeptide for therapy of kidney cancer
CN113549129A (zh) 一种d-构型抗肿瘤肽及其制备方法和应用
JPH06184196A (ja) ビトロネクチン由来合成ペプチドおよびそれらを含有する医薬組成物
JPH08511541A (ja) Ｄｅｓ−ｔｙｒダイノルフィンおよび類似体に関する抗炎症組成物並びに方法
JP2022511939A (ja) ミトコンドリア標的化ペプチド
EP0397635A1 (en) Peptide with anti-metastasis activity
JPWO1997035609A1 (ja) 組織因子凝固系インヒビター含有血管新生阻害剤
JPS61500119A (ja) ひとカルシトニン遺伝子関連ペプチド
TW402607B (en) Difluoro pentapeptide derivative anti-inflammatory agents
US20060205642A1 (en) Oral methods of treatment using proANF peptides
CN117659002A (zh) 一种基于n端法则诱导bcr-abl降解的protac化合物及其应用
US20070054841A1 (en) Method of treatment of systemic injury secondary to burns
EP1937710B1 (en) Kinin b1 receptor peptide agonists and uses thereof
EP0538476A1 (en) Preventive or remedy for ischemia, reperfusion-induced tissue disorder and arrhythmia as well as pulmonary disorder caused by activated oxygen free radical
EV et al. Effect of Synthetic Peptide LKEKK in Experimental Myocardial Infarction
Preusse et al. Different behaviour of the electrical impedance of the myocardium in normothermia after use of various cardioplegic methods
CN121800877A (zh) 亚精胺-多肽偶联化合物及其制备方法和应用
CN114869894A (zh) 一种小分子化合物在制备作为尿激酶受体抑制剂药物中的应用
CN120248042A (zh) 保护血管内皮细胞的环状肽及其衍生物和用途
JP3488504B2 (ja) カルシウムチャンネルブロック作用を有するペプチド