JPH08511541A

JPH08511541A - Ｄｅｓ−ｔｙｒダイノルフィンおよび類似体に関する抗炎症組成物並びに方法

Info

Publication number: JPH08511541A
Application number: JP7502096A
Authority: JP
Inventors: ティー．ウエイ、エドワード; エー．トーマス、ホーリー
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 1993-06-09
Filing date: 1994-06-09
Publication date: 1996-12-03
Also published as: DE69429365D1; AU7058394A; AU679241B2; EP0751954B1; US5482930A; EP0751954A4; EP0751954A1; WO1994029337A1; CA2164880A1; ATE210149T1

Abstract

(57)【要約】炎症症状を治療する方法が提供され、この方法では、以下の配列を有するペプチドが炎症を低下させるために有効な量で投与される：G-G-F-L-R-R-I-R-P-K-L-K-W-D-N-Q（配列番号：１）、G-G-F-L-R-R-I-R-P-K-L-K-W-D-N-Q-NH₂（配列番号：２）、Ac-R-R-I-R-P-K-L-NH₂（配列番号：３）、またはAc-R-R-I-R-P-K-1-NH₂（配列番号：４）。

Description

【発明の詳細な説明】 DES-TYRダイノルフィンおよび類似体に関する抗炎症組成物並びに方法発明の分野本発明は、一般に、ダイノルフィン類の化合物でその通常のＮ−末端のチロシンが欠落しているものに関する。より具体的には、ある種のダイノルフィンＡ関連化合物の抗炎症剤としての使用に関する。本発明は、ＮＩＤＡ／ＵＳ公衆衛生事業から付与されたグラント第ＤＡ−０００９１号により政府の支援を受けて行われた。したがって国は本発明に関して特定の権利を有する。発明の背景脈管系は、ガスと栄養物の交換のため、さらに老廃物排出のためにその最外郭部分において血液と組織との間で表面積を維持できるようにデザインされた複雑な血管のネットワークである。炎症の初期段階では、微小血管の灌流に関係する鋭敏なメカニズムが変化し、それによって血管の完全性は低下し、血液の内容物は組織中に滲み出し、さらに鬱血が生じることがある。全身においては、微小循環に対する重篤で急激な損傷は組織構造を歪め、細胞への酸素の伝播を妨げ、さらに、血管部分からのはなはだしい体液の損失を引起して浮腫、電解質不均衡、ショックおよび他の循環障害をもたらす。この炎症即時反応を調節する薬剤を明らかにすることによって、臨床的に有用な薬剤が製造できるかもしれない。最近の研究によって、ある種のペプチドは炎症を抑制する作動薬として作用することが示唆されたが、これはコトランらによって末梢損傷に対する血管に富む生組織の反応として明らかにされた（Cotranら、“ロビンス：疾病の病理学的基礎”（Robbins:Pathologic Basis of Disease）より、ロビンス編、2:39-86、フィラデルフィア：サウンダース）。構造が特異的な拮抗物質は、炎症を促進する物質に対して１：１で作用し、１以上の仲介物質が組織の損傷中に放出される場合、１の拮抗物質の効果は限られたものとなろう。もし１以上の仲介物質によって開始した収斂性過程を作動薬（アゴニスト）（これはリュース（Br．J．Pharm ac ol.，3，129-62(1948)）によって導入された用語で、生物学的事象を活性化する化学物質を意味する）が抑制できるとしたら、作動薬は拮抗物質よりもさらに効果的であろう。抗炎症性作動薬としての薬剤の概念は、スベンショーとペルソンによって考察された（Svensjo & Persson(1985)：炎症ハンドブック(Handbook o f Inflammation)、ボンタ(Bonta)編、5:51-82、アムステルダム：エルセビアー）。例えば、我々は、１組の比較的小型のＣＲＦ−関連ペプチドについて報告したが（Wei & Thomas，Annu．Rev．Pharmacol．Toxicol.，33．91-108(1993)）、さらに、我々のうちの１人は、関連する別の１組の小型ＣＲＦ−関連ペプチドの抗炎症剤としての使用について報告した（Wei、米国特許第5,177,060号（本出願との共有譲渡）、1993年１月５日発行）。したがって、ヒト／ラットＣＲＦのカルボキシ末端１１残基に一致する粗ペプチドは、抗炎症活性を有することが分かった。さらに、この粗ペプチド混合物内の構造の性状決定によって、グルタミン酸残基（Ｅ）のアニソール付加グルタミン酸誘導体による置換は全体的な抗炎症能力を高めることが明らかにされた。このアニソール誘導体は、明らかに温度依存性フリーデル−クラフツアシル化反応（これはグルタミル含有ペプチドのフッ化水素切断時に生じる）の副産物であった。アニソール付加グルタミン酸誘導体を含むいくつかのペプチドはＤ−アミノ酸置換（小文字の１文字コードで示される）によって作られる。審査中の米国特許出願第０７／９２５０８１号（1992年８月４日出願、発明者:Wei & Thomas、本出願との共有譲渡）はまた、ＣＲＦ−関連ペプチドの抗炎症的使用について開示している。抗炎症的利用に有用なまた別の化合物の探索が続いている。以前、我々のうちの１人が、特定のダイノルフィン化合物の抗炎症的用途の開発の価値があるかどうかを調べようとした。１９８６年にウェイらは、知覚神経の逆方向性刺激が小血管壁からの血漿蛋白の滲出を昂進させている生理学的に病的状態である、“神経性炎症”でダイノルフィンＡ（１−１３）およびダイノルフィンＡ（１−１０）アミドを調べた（Weiら、J．Pharmacol．Exp．Therap．238:783-787(1986)）。神経性炎症に対する検査系で染料滲出の５０％抑制を生じる中間有効量（ＥＤ₅₀ ）として生理的食塩水注射対照と比較して測定した場合は、ダイノルフィンＡ（１ −１３）およびダイノルフィンＡ（１−１０）アミドの有効性は高くなかった：それぞれ１．９（１．５−２．４）ｍｇ／ｋｇおよび５．０（３．５−７．２）ｍｇ／ｋｇが静脈から注射された。したがって、これらは、臨床利用のための有効な開発に値する範囲ではなかった。続いて、３．７５ｍｇ／ｋｇの用量で静脈投与したダイノルフィンＡ（１−１３）は、熱傷後の麻酔ラットの足の浮腫を防止することが報告された（Wei & Ki ang，European J．of Pharmacology，168:81-86(1989)）。これらの実験によって、ダイノルフィンＡ（１−１３）は損傷モデルにおける炎症を減少させる能力を欠くという結論が得られた。内在性オピオイドペプチドは、３種の別個の種類に分けることができ（エンドルフィン、エンケファリンおよびダイノルフィン）、全ては、２種の５アミノ酸配列の１つをそのアミノ末端に含み、中枢および末梢神経系内の種々の神経経路に存在する。分子遺伝学による実験によって、これら３種類のオピオイドペプチド３種の別個の前駆体から誘導されることが示された。プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）は、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）およびメラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）同様にエンドルフィンを生じる。〔Ｍｅｔ〕エンケファリン、〔Ｌｅｕ〕エンケファリン並びに関連ヘプタペプチドおよびオクタペプチドはプロエンケファリンから誘導される。第三の種類はプロダイノルフィンから誘導され、ダイノルフィンＡ、ダイノルフィンＢ（リモルフィンとしてもまた知られている）並びにα−およびβ−ネオエンドルフィンが含まれる。ダイノルフィンおよびダイノルフィン関連化合物の様々な使用は、麻酔性鎮痛剤またはアヘン誘導体活性に関連して組み合わせることが、適切な用途で既に知られている。さらに、ダイノルフィンＡ（１−１３）化合物関連化合物（但し、Ｎ−末端チロシンおよびグリシンをもたず、時にダイノルフィンＡ（３−１３）と呼ばれる）は、最近の研究の興味の対象であった。さらに別のペプチドフラグメントも研究されているが、例えばタケモリら（JPETアブストラクト、1993年）は、ダイノルフィンＡ（２−１７）が、モルヒネ依存マウスにおけるモルヒネ寛容のナロキソン誘発による消失と発現を抑制すること、ダイノルフィンＡ（２− １４）、（２−１１）および（２−８）についてさらに同様な抑制活性を報告した。米国特許第４３６１５５３号（発明者:Loh & Lee、1982年11月30日発行）は、天然のダイノルフィンＡ（１７個のアミノ酸を含む）について最初の１３個のペプチド配列を示したが、これは、モルモット回腸およびマウス精管で強力な作動薬特性を有することが見出された。この特許は、ダイノルフィンおよび特定のダイノルフィンＡ（１−１３）は、薬物に未経験の動物で認められた作用とは反対に麻酔性鎮痛剤に対して寛容の動物で作用（モルヒネまたはβ−エンドルフィン誘発鎮痛作用）を示すことを開示する。したがって、ダイノルフィンＡ（１−１３）は寛容動物で鎮痛効果を高める。ダイノルフィンは、麻酔性鎮痛剤と共同して、１服用量当たり投与される麻酔性鎮痛剤の量を減少させるために有用であることが判明した。米国特許第４３９６６０６号（発明者：Goldstein、1983年８月２日発行）は、チロシンを有するＮ−末端で始まる構造をもつダイノルフィンＡ（１−１３）の単離を開示する。この化合物は、モルモット回腸検査ではエンケファリンやβ −エンドルフィンよりも実質的にさらに活性が高いことが分り、この化合物を含む組成物は鎮痛剤として提唱された。米国特許第４４６２９４１号（発明者:Leeら、1984年７月31日発行）は、最初の７個のアミノ酸がダイノルフィンＡ（１−１７）および１−１３と同様であるが、次の７個のアミノ酸がＡＡ⁸−ＡＡ⁹−ＡＡ¹⁰であるダイノルフィンアミド類似体を開示する。ここで、ＡＡ⁸はイソロイシン、ロイシンまたはリジンで、ＡＡ⁹はアルギニンまたはプロリンで、ＡＡ¹⁰はプロリンで、ＡＡ¹⁰末端のカルボニル炭素はアミド化されている。他方耐性動物では、ダイノルフィンＡ（１−１０）アミド類似体は、ダイノルフィンＡ（１−１３）よりも強力で選択性のある類似体のようである。米国特許第４４８１１９１号（発明者:Weiら、1984年11月６日）は、ダイノルフィン関連オピオイドペプチドを投与することによる高血圧と心機能障害の治療方法を開示する。内在性オピオイドペプチドは、心拍および血圧に影響を与える刺激に対する末梢神経の感受性を調節するようである。米国特許第４６８４６２４号（発明者：ホソブチら、1987年８月４日発行）は、酸またはアミド化形のある種のダイノルフィン関連ペプチドを、脳虚血の患者の治療に使用することについて開示する。急性巣状脳虚血の患者にこれらオピオイドを投与することは延命に有用で、さらに脳虚血によって生じる神経性欠損を部分的に回復させることに有用であるように思える。発明の要旨血管からの滲出は急性炎症状態で発生し、一般に、組織が平衡状態にある体液交換から、血清とその溶質が周囲組織に自由に流れ出る状態に移行したことを示す。物質は、神経末端からまたは、血管透過性が高まった損傷組織内の細胞から遊離される。血液中の体液および蛋白は、続いて血管区画から組織区画へと痛みを伴いながら移動し、結果として組織は損傷を受ける。本発明による投与は、急性炎症を生じている患者に血管からの滲出を制限または最小にするために用いられる場合は、臨床的有効性を提供する。本発明の特徴の１つとして、抗炎症性組成物が提供されるが、この組成物は、患者に静脈内、皮内または皮下注射で投与したとき、約０．１から約５ｍｇ／ｋｇ患者体重を提供するために十分な濃度をもつ以下の配列を有するアミド化ペプチド（その塩を含む）を含み、さらにこのペプチドは、医薬的に許容できる担体中に存在する： G-G-F-L-R-R-I-R-P-K-L-K-W-D-N-Q-NH₂（配列番号：２）、 Ac-R-R-I-R-P-K-L-NH₂（配列番号：３）または Ac-R-R-I-R-P-K-l-NH₂（配列番号：４）本発明の別の特徴として、血管からの滲出が問題となる（例えば肺水腫）ような炎症状態を治療する方法が提供されるが、その場合、ペプチドは炎症を減少させるために十分な量で投与される。このペプチドは非アヘン誘導体で、ダイノルフィンＡ（６−１２）配列を含む。好ましいペプチド（塩の形態であってもよい）は以下の配列を有する： G-G-F-L-R-R-I-R-P-K-L-K-W-D-N-Q（配列番号：１）、 G-G-F-L-R-R-I-R-P-K-L-K-W-D-N-Q-NH₂（配列番号：２）、 Ac-R-R-I-R-P-K-L-NH₂（配列番号：３）または Ac-R-R-I-R-P-K-l-NH₂（配列番号：４）。図面の簡単な説明図１は、本発明のｄｅｓ−Ｔｙｒダイノルフィン化合物の１つの実質的な抗炎症特性を示すグラフであるが、同様な抗炎症作用を引き起こす能力を実質的に欠くことが分かっているダイノルフィンＡ（１−１３）およびダイノルフィンＡ（１−１７）と対照されている。好ましい実施例の詳細な説明内在性オピオイドペプチド類（Ｎ−末端の最初の４個のアミノ酸は同じで、５番目としてメチオニンまたはロイシンを含む）は、脳および末梢組織の主要なオピオイドレセプターサブタイプ（μ、κ、およびδ）と相互作用する。これらペプチドの薬理活性と構造的特性に基づいて、幾つかの特色がオピオイドとこのペプチドとの相互作用を決定することが分かった。必要条件は、（ａ）アミノ末端のチロシン残基(Xieら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，89:4124-4128(1992))および（ｂ）ナロキソン（アルカロイドオピオイドレセプター拮抗剤）のこれらペプチドの薬理活性を減弱させる能力であるチロシン基が排除されている、オピオイドペプチドのエンドルフィンおよびダイノルフィン類由来のペプチド（ｄｅｓ−Ｔｙｒ類似体）は、低用量で薬理活性を有することが示された。例えば、β−エンドルフィンのｄｅｓ−Ｔｙｒ類似体は、抗分裂病作用を有すると言われている。動物では、ダイノルフィンＡのｄｅｓ−Ｔｙｒ類似体（ダイノルフィンＡ（２−１７）とも呼ばれる）は、脳室内投与後行動性変化を生じる(Walkerら、Science 218:1136-1138(1982))。その１９９３年のアブストラクトで、タケモリらは、ダイノルフィンＡのｄｅｓ−Ｔｙｒ類似体はモルヒネ寛容と依存性に対する作用を有すると主張している。オピオイドペプチドのｄｅｓ−Ｔｙｒ類似体の作用は、その薬剤作用がオピオイドレセプターによって仲介されないので、“非オピオイド”と定義される。非オピオイド薬剤作用は、それにもかかわらず、該ペプチドを与えられる生物体に対する生理学的現象であり、薬剤を使用するために研究する必要があるかもしれない。我々は、ダイノルフィンＡのｄｅｓ−Ｔｙｒ類似体は非オピオイド作用を有することを見出したが、このことは以前には認識されていなかった。この作用は、損傷後の組織中への血液構成成分の滲出を抑制する作用である。炎症の即時徴候（コトランらにより定義された通り、上掲書）は、浮腫と腫脹を生じる血液成分の組織マトリックスへの滲出であるので、我々は、この薬剤作用を“抗炎症性” と呼んだ。本発明による抗炎症的利用として有用な化合物は、Ｎ−末端のチロシンを持たず、ダイノルフィン（６−１２）部分を含み（但し幾つかの置換は可能である）、非アヘン誘導体である。これらの基準は以下でさらに考察する。分子モデルに関する予備実験によって、１０位のプロリンはループを形成し、隣接するアルギニンはこのヘアピンと一緒になって、活性に必要な固定された空間的連なりを構成するのかもしれない。ｄｅｓ−ＴｙｒダイノルフィンＡ（またはダイノルフィンＡ（２−１７））、ダイノルフィンＡ（１−１７）およびダイノルフィンＡ（１−１３）で認められる活性の特定のパターンによって、これらペプチドの構造とその生物学的活性との間に正確な関係が存在することが示唆された。ペプチドについては、生物学的活性は、細胞レセプターの環境下における分子の形態によって決定される。生物学的活性のために要求される分子の必要条件を確認するために、我々は、コンピューター支援定量的構造活性関係（quanti tative structure activity relationship）（ＱＳＡＲ）実験および比較分子野分析（comparative molecular field analysis）（ＣｏＭＦＡ）と呼ばれる技術を用いた。ＱＳＡＲ／ＣｏＭＦＡ系は、トリポスアソシエーツ（Tripos Associa tes）（セントルイス、ミズーリー）によるシビル(Sybyl)ソフトウェアープログラムの一部分として１９８８年に開発され、それはシリコングラフィクスＩＲＩＳ４Ｄ機または同等な機種を起動させる。ＱＳＡＲ／ＣｏＭＦＡプログラムは部分的最小平方退縮分析(partial least squares regression analysis)を用い、分子の分子野（独立変数）と生物学的特性（例えば有効性、（従属変数））との相関性を調べる。予備的データによれば、ｄｅｓ−ＴｙｒダイノルフィンＡフラグメントの幾つかの特性または分子野は、完全なダイノルフィンＡペプチドと比較してより大きい有効性を決定することが示唆された。このモデリング方法によって、（１）ダイノルフィンＡの１０位のプロリン残基は、このペプチドのアミノ末端とカルボキシ末端が近接するように分子を折り畳み、ヘアピンループの形成を誘発する、（２）ヘアピンループの緊張がダイノルフィンＡの二重のアルギニン残基（すなわちＡｒｇ⁶およびＡｒｇ⁷）の陽性荷電の配置、空間の取り方、特性を順に設定し、さらに、これら２つの塩基性アミノ酸の相対的配置は生物活性のために重要であるかもしれない、（３）いずれかの末端におけるコアペプチド（６−１２）への付加（または欠落）は、（ヘアピンの捩れまたは回転によって）このペプチドの他の領域の構造変化を引き起こすかもしれず、したがって生物学的活性にも影響を与えるかもしれないことを示した。これまで調べたペプチドのうち、血管からの滲出抑制のために最適な構造は、ダイノルフィンＡ（２− １７）によって与えられる構造である。抗炎症性残基としてｄｅｓ−ＴｙｒダイノルフィンＡ分子のコアまたは必須の部分は、ダイノルフィンＡ（６−１２）配列（−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−、配列番号：５）であると我々は考えている。このコアは、２つの塩基性残基と２つの疎水性残基とを有し、これまでに知られていた抗炎症性ペプチド作動薬と同じ大きさ（７残基）である。例えば、これまでに知られていたＣＲＦ（３１−４１）およびミスチキシンと呼ばれる関連する類似体（ニューロテンシン関連ペプチド、アンチフラミン１およびＶＩＰ）は全て、二重の塩基性残基を有する（すなわち、−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−、−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−、−Ａｒｇ−Ａｒｇ−、または−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−）。またこれらの全てに、少なくとも２個の疎水性残基（すなわち、ロイシン、イソロイシン、メチオニンまたはバリン）が存在する。ダイノルフィンＡの構造の比較分子野分析によって、プロリン残基によって付与される構造的な硬直性は、抗炎症性作用を促進させるために必要なものであることが示唆された。例えば酵素による分解に対する防御のような目的のために、コアのために適切である変更や置換には、Ｎ−アセチル化または、Ｎ−末端の第一のアミノ酸残基と第二のアミノ酸残基との間にシュードペプチド結合を導入することが含まれると、我々は考えている。酵素による分解に対する耐性を付与するこれらの技術は、例えば、ルグリンらの論文に記載されている（Lugrinら、Europ．J．Pharmaco l．205:191-198(1991)）。さらに、安定化、有効性の強化、および作用時間の延長を付与した天然に存在しないアミノ酸は、例えばネスターらの論文に記載されている（Nestorら、J．Medicinal Chem.，31(1):65-72(1988)および27:320-305( 1984)）。コア配列を修飾する別の技術は、Ｌ−アミノ酸残基をＤ−アミノ酸残基で置換するものである。修飾のまた別の技術は、ペプチド結合を例えばＣＨ₂ＮＨ（Ψ還元）結合をもつ誘導体によって置換するものである。本発明では、ダイノルフィン関連化合物（またはその塩）を用いて、哺乳類の皮膚、粘膜、または、筋肉の裂傷もしくは脳の損傷が存在する（または存在するであろう）場所の炎症が抑制される。投与は、静脈内、経口または局所的手段によるべきで、用量は、約０．００１から５ｍｇ／ｋｇ体重である。しかしながら、投与は静脈内、皮内または皮下注射が好ましく、少なくとも１回の投与量は、好ましくは約０．１から５ｍｇ／ｋｇ体重である。さらに、投与は、意図的に生じる筋肉の裂傷（例えば腹腔内または歯科手術時）の約２時間前まで、また、外科手術または事故による損傷後３日まで可能である。投与は最も好ましくは血流を介して行われるが、損傷組織（例えば筋肉）への局所注射も用いることができる。本発明のｄｅｓ−Ｔｙｒペプチドの使用によって組織の血管からの滲出の抑制特性が提供されるので、種々の多数の治療的応用が可能である。これらペプチドの臨床的な使用が考えられる特定の組織には、皮膚および粘膜（瞼、鼻粘膜、口腔咽頭膜、上気道、食道、下部消化管）、骨格筋、平滑筋、心筋、脳血管、肺および腎の血管が含まれる。例えば、これらペプチドの治療的使用には、熱傷、照射火傷、凍傷、または皮膚の他の炎症状態の治療のための投与が含まれる。このペプチドは、腫脹、疼痛、および血漿溢出を減少させるために用いることができる。上気道に堆積した刺激物のため、または慢性アレルギー状態（例えば喘息）では、このペプチドは、過敏性、気管炎症、浮腫および血漿溢出を減少させるために用いることができる。全組織に対する裂傷または外傷（例えばナイフの切り傷、外科手術および自動車事故後に生じるような損傷）については、このペプチドは、腫脹、疼痛、および炎症を減少させるために用いることができる。例えば卒中または心筋梗塞後に発生する組織低酸素症、虚血性無酸素症および浮腫を生じる組織の梗塞のためには、このペプチドは、組織マトリックス中への血液成分の流出を減少させ、残りの組織の生存を高めるために用いることができる。内皮を直接障害する内在性または外来化学物質（例えば、内毒素や炎症性仲介物のようなもので、敗血症性ショック症状をもたらす）の作用を防止するためには、このペプチドは、血液量の損失を減少させるために用いることができる。投与は、器官の血管樹の完全性を保存するために、移植では器官の摘出前または摘出中に行うことができる。移植される器官は腎、肝または心臓である。ｄｅｓ−Ｔｙｒダイノルフィン関連ペプチドは、医薬的に許容できる担体（例えば等張食塩水、リン酸緩衝液など）と組み合わせて投与できる。このペプチドは比較的小型であるので、局所投与もまた適切である。鼻粘膜を介する小型ペプチドの投与に有用な組成物および賦形剤は、例えば英国特許出願第８７１９２４８号（出願人：サンド・リミテッド、1988年２月24日公告）に開示されている。無傷の皮膚への浸透を強化した局所用組成物は増強剤を含むが、これらの多くは米国特許第４０９１０９０号（発明者：Sipos、1978 年５月23日発行）に記載されている。このペプチドは医薬的に許容できる塩を形成し、塩の形で投与できる。医薬的に許容できる塩を形成するために適切な酸の例は、塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、安息香酸、クエン酸、マロン酸、サリチル酸、リンゴ酸、フマル酸、コハク酸、酒石酸、乳酸、グルコン酸、アスコルビン酸、マレイン酸、ベンゼンスルホン酸、メタンおよびエタンスルホン酸、ヒドロキシメタンおよびヒドロキシエタンスルホン酸である。塩はまた医薬的に許容できる有機の塩基付加塩で作ることもできる。これらの有機塩基は、ひとつのクラスを形成し、その限界は当業者には容易に理解できる。単に例として挙げれば、そのようなクラスとは、モノ−、ジ− およびトリアルキルアミン例えばメチルアミン、ジメチルアミン、およびトリメチルアミン；モノ−、ジ−、またはトリヒドロキシアルキルアミン例えばモノ− 、ジ−、およびトリエタノールアミン；アミノ酸例えばアルギニンおよびリジン；グアニジン；Ｎ−メチルグルコサミン；Ｎ−メチルグルカミン；Ｌ−グルタミン；Ｎ−メチルピペラジン；モルフォリン；エチレンジアミン；Ｎ−ベンジルフェネチルアミン；トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンなどである（具体的には、「医薬の塩」“Pharmaceutical Salts”J．Pharm．Sci．66(1):1-19(1977 )を参照のこと）。ペプチドは種々の適切な化学的方法で合成できるが、好ましくは、メリーフィールド（Merrifield）によって最初開発され、スチュワートとヤングが記載した（J.M．Stewart & J.D．Young「固相ペプチド合成」“Solid Phase Peptide Sy nthesis”(1984)）自動または手動固相合成法によって合成される。化学合成は、アミノ酸を予め定めた配列でＣ−末端から結合させていく。塩基固相法は、Ｃ −末端保護アルファ−アミノ酸を適切な不溶性の樹脂支持体に共役させることを必要とする。記述のペプチドでは、ベンジヒドリルアミン（ＢＨＡ）または４− メチルベンジヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）樹脂が、完了の際にＣ−末端アミドを生成することを必要とする。合成のためにアミノ酸は、アルファ−アミノ基の保護を必要とし、それによって先行する残基（または樹脂支持体）との適切なペプチド結合が確保される。カルボキシ末端の縮合反応の完了後、アルファ−アミノ保護基は除去され、次の残基の付加が可能になる。アルファ保護基の幾つかの種類は既に報告されている（J.M．Stewart & J.D．Young，“Solid Phase Peptide Synthesis”(1984)を参照のこと）が、酸不安定ウレタン−基剤第三ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）がこれまで用いられており好ましい。他の保護基や関連する化学的方法もまた用いることができるが、これらには、塩基不安定性９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）が含まれる。また、反応性アミノ酸側鎖官能基は、合成が完了するまでブロックされている必要がある。機能的な保護基の複雑な配列は、それらを使用するさいの技術や制限も含めて以下の文献に記載されている（M．Bodansky「ペプチド合成」“Peptide Synthesis”(197 6)，J.M．Stewart & J.D.Young“Solid Phase Peptide Synthesis”(1984)）。固相合成は、既述のＣ−末端アルファ−保護アミノ酸残基の共役によって開始される。共役は、活性化剤（例えばジシクロヘキシカルボジイミド（ＤＣＣ））が１−ヒドロキシベンゾ−トリアゾル（ＨＯＢＴ）と共に又は単独で、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＩＰＣ）またはエチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド（ＥＤＣ））が必要とされる。特に好ましい本発明の抗炎症性用途のためのｄｅｓ−Ｔｙｒダイノルフィン関連化合物は、表１に挙げたダイノルフィンＡ（２−１７）、ダイノルフィンＡ（２−１７）アミドおよび２つのｄｅｓ−Ｔｙｒダイノルフィン関連フラグメントである。配列番号：１（実施例１）および配列番号：２（実施例２）の好ましい例は、それぞれダイノルフィンＡ（２−１７）およびアミド化ダイノルフィンＡ（２− １７）である。配列番号：３（実施例３）の好ましい例は、ダイノルフィンＡ（６−１２）配列を含むが、アシル化アミノ末端およびアミド化カルボキシル末端を有し、一方、配列番号：４（実施例４）の好ましい例は、さらにロイシンがＤ −ロイシンでアミノ酸置換されている。アミド化は効能を高めると考えられている。そのＣ−末端にアミドまたはカルボキシル部分をもつダイノルフィンＡ類似体を直接比較したとき、アミド化形はカルボキシル形よりも約２倍有効性が高いことが分かった。したがって、Ｄ−Ａｌａ²−ダイノルフィンＡ（２−１７）アミドのＥＤ₅₀は０．６５ｍｇ／ｋｇ（静注）で、これに対して、Ｄ−Ａｌａ²−ダイノルフィンＡ（２−１７）では１．２ｍｇ／ｋｇ（静注）であった。同様な結果がＤ−Ａｌａ²−ダイノルフィンＡ（１−１７）アミドで得られ、ＥＤ₅₀は０．５ｍｇ／ｋｇ（静注）で、それに対してＤ−Ａｌａ²−ダイノルフィンＡ（１ −１７）のＥＤ⁵⁰は１．０ｍｇ／ｋｇ（静注）であった。これらの結果から、アミド化ペプチドは、天然のカルボキシル末端をもつペプチドよりも大きな効能を有するであろうと考えられる。本発明の態様は以下の実施例によってこれから詳述するが、これらは単なる例であって制限のためのものでないことは理解されよう。これらの実施例はバイオアッセイの使用に関連する。ペプチドの“抗炎症性”特性を定義するために、炎症のどの段階が調べられているかを明確に説明し、実験モデルの重要性を明らかにすることは有用であろう。持続的症状（例えば関節炎、喘息および関連疾患）の重要性のために、慣例的には、薬理学研究者らは慢性的な炎症に興味を持ってきた。炎症の急性期を抑制する薬剤のためのバイオアッセイは工程時間が短く、原則として実施が迅速である。なぜならば、外傷性損傷の単純な、非選択的方法が、組織反応についての即時指標を得るために利用できるからである。以下に述べる２通りのバイオアッセイが、迅速なスクリーニング手段として有用である。第一のものは、熱誘発腫脹と浮腫を測定する。第二のものは、エピネフリン誘発浮腫に対する薬剤の作用の測定を求める。これらのバイオアッセイは、完全な動物体で実施される。これらの結果は、組織に対して急性損傷が存在するヒトの症状に適用できる。第一のバイオアッセイでは、標準的固相法で合成されたダイノルフィンＡ（２ −１７）を滅菌生理食塩水に溶かし、種々の用量で麻酔ラットの大腿静脈の分岐部に静注した。１０分後、後ろ脚を５８℃の湯に１分間浸けた。熱に曝してから３０分後にくるぶしの結合部で足を除去し、重さを測定した。熱処置していない足に対する熱処置した足の重量の％増加を、炎症性熱性浮腫の指標として採用した。この方法の一般的原理は、ウェイとトーマスによって考察されている（Wei & Thomas Ann．Rev．of Pharmacol．& Toxicol.，33:91-108(1993)）。別のバイオアッセイでは、エピネフリン二酒石酸塩３０μｇ／ｋｇを静注する１０分前に、生理食塩水（１ｍｇ／ｋｇ）またはダイノルフィンＡ（２−１７）（０．２ｍｇ／ｋｇ）のいずれかを静注した。このバイオアッセイは、肺浮腫のモデルである。エピネフリン（血管を収縮させる）は、血液量を筋肉と内蔵から肺に急激に移動させる。肺の血管の流体静力学的圧における増加は、内皮による障壁を破壊し、続いて血液は肺の空隙に侵入し、肺の水分含有量（および重量）は増加する。正常な未処置のラットでは、肺重量は体重の約０．５％で、２１３ ±３ｇのラットでは１．０６ｇに当たる。エピネフリン二酒石酸塩処置後３０分で、肺重量は１．９０±０．１６ｇまで増加し、実験動物は喘ぎ呼吸を示し、気管を切開したとき桃色の泡が認められた。ダイノルフィンＡ（２−１７）で処置した後、肺重量は１．３２±０．１１ｇであった。この結果は極めて有意で（Ｐ＜０．０１）、ダイノルフィンＡ（２−１７）は、エピネフリン誘導肺浮腫を抑制することを示している。血管からの滲出は、血液が灌流している生組織に損傷を生じる何らかの刺激に対する炎症反応である。ｄｅｓ−ＴｙｒダイノルフィンＡペプチドの抗炎症作用をさらに明示するために、炎症過程の促進物質として作用する物質Ｐを麻酔ラットに注射した。エバンスブルー染料（血液蛋白に結合し、血管からの滲出に対するマーカーまたは標識として働く）で前処置したラットに、物質Ｐを４０μｇ／ｋｇで皮下注射して、注射部位（皮膚および筋肉）および体の他の血管富裕領域（耳介、食道、気管、膀胱など）に強い青斑を誘発させた。物質Ｐ静注の１０分前にダイノルフィンＡ（２−１７）（１ｍｇ／ｋｇ）を静注して前処置した動物では、上記の組織の青斑（炎症反応の指標となる）は抑制された（Ｎ＝４の動物ペアで調べた）。この作用は裸眼で明瞭で、組織の顕微鏡検査で確認された。熱誘発浮腫およびエピネフリン誘発浮腫と合わせて、これらの結果は、ダイノルフィンＡ（２−１７）の抗炎症特性が血管からの滲出に対する普遍的な抑制作用であることを明瞭に示している。０．２ｍｇ／ｋｇで静注されたｄｅｓ−ＴｙｒダイノルフィンＡは、１０−１５分持続するわずかな血圧降下を生じたが、その後平均動脈圧は基準値に復帰した。この用量を投与したラットの酸素摂取は良好のようであった；チアノーゼも、腸の低酸素状態を示唆する腸の運動も認められなかった。さらに、表１に配列番号：３（実施例３）および配列番号：４（実施例４）として示した２種のペプチドを合成した。ペプチドは、ｐ−メチルベンジヒドリルアミン（アミド化ペプチドのため）またはクロロメチルポリスチレン樹脂のいずれかの上で、標準的な教書（メリーフィールド(1963)；スチュワートとヤング(1 984)）にしたがって固相法で製造した。アミノ末端のアセチル化は、アセチル基の源として無水酢酸を用いて実施した。組み立てたペプチドの樹脂からの切断と脱保護は、１０％アニソールと１％（容量％）メチルエチルスルフィド中のフッ化水素を用いて０℃、１時間で実施した。生成物をゲル濾過と陽イオン交換クロマトグラフィーで精製した。最終精製物の純度は、高性能液体クロマトグラフィーで決定し、精製生成物の同定は、Ｈ／Ｐアミノクォントアミノ酸分析装置によるアミノ酸分析で証明した。これらのペプチドは、１．４（０．６−３．７）ｍｇ／ｋｇおよび２．２（１．２−４．１）ｍｇ／ｋｇ（静注）というＥＤ₅₀の値で示されるように熱性浮腫を低下させ、生物学的に活性であることが分かった。配列番号：１（０．５ｍｇ／ｋｇ、静注）および配列番号：３（３ｍｇ／ｋｇ、静注）の抗炎症作用は、オピオイドレセプター拮抗物質であるナロキソン（４ｍｇ／ｋｇ、静注）によって拮抗されなかった。麻酔ラットに生理食塩水（１ｍｌ／ｋｇ）またはナロキソン塩酸塩（４ｍｌ／ｋｇ）を静注し、その５分後に生理食塩水（１ｍｇ／ｋｇ）、ダイノルフィンＡ（２−１７）（０．５ｍｇ／ｋｇ）またはＮ−アセチル−ダイノルフィンＡ（６ −１２）−アミド（３ｍｇ／ｋｇ）を静注した。第二の注射の１０分後に、ラットの後足を５８℃の湯に１分間浸し、さらに３０分後にこのラットを安楽死させ、熱処置および非熱処置足の重量を測定した。生理食塩水／生理食塩水、またはナロキソンＨＣｌ／生理食塩水で処置した後、非熱処置足と比較したときの熱処置足の重量の％増加は、それぞれ１０４±１−％および９８±９％であった。生理食塩水／ダイノルフィンＡ（２−１７）およびナロキソンＨＣｌ／ダイノルフィンＡ（２−１７）群の％増加は、それぞれ２６±６％および２６±５％であった。生理食塩水／Ｎ−アセチル−ダイノルフィンＡ（６−１２）アミドおよびナロキソンＨＣｌ／Ｎ−アセチル−ダイノルフィンＡ（６−１２）アミド群の％増加は、それぞれ２１±３％および２７±１２％であった。これらの結果はｄｅｓ−ＴｙｒダイノルフィンＡペプチドの抗炎症作用は高用量のナロキソンによって拮抗されないことを明瞭に示し、さらに、これらのペプチドはチロシンを含まないという事実と合わせて、この薬物の作用は、オピオイドレセプターの活性化と無関係であることを示している。図１では、ｄｅｓ−ＴｙｒダイノルフィンＡについて容量反応関係が示されている。このデータは、さらに、ダイノルフィンＡ（２−１７）、ダイノルフィンＡ（１−１３）およびダイノルフィンＡ（１−１７）の有効性を比較することによって、ｄｅｓ−ＴｙｒダイノルフィンＡペプチドの固有の非オピオイド抗炎症特性を示している。ダイノルフィンＡ（２−１７）は熱性浮腫の強力な抑制物質で、０．１５（０．０９−０．２４）ｍｇ／ｋｇ（静注）という臨床的に意義のある平均有効用量（ＥＤ₅₀）を有する。対照的に、ダイノルフィンＡ（１−１３）およびダイノルフィンＡ（１−１７）のＥＤ₅₀は、それぞれ３．２（１．９−５．５）ｍｇ／ｋｇ（静注）および１．７（１．２−２．４）ｍｇ／ｋｇ（静注）で、この値はｄｅｓ−Ｔｙｒペプチドよりも有効性が１オーダー低く、臨床テストを実施するには不十分な値である。好ましい実施例と組み合わせて発明を上記で詳述したが、これらの記載および実施例は単なる例示で、制限的なものではないことは理解されよう。発明の範囲は添付の請求の範囲によって限定されるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者トーマス、ホーリーエー. アメリカ合衆国 60091 イリノイ州ウィルメッテクリーブランドストリート 1215

Claims

【特許請求の範囲】１．G-G-F-L-R-R-I-R-P-K-L-K-W-D-N-Q-NH₂（配列番号：２）、 Ac-R-R-I-R-P-K-L-NH₂（配列番号：３）または Ac-R-R-I-R-P-K-l-NH₂ の配列を有するアミド化ペプチドまたはその塩を、静脈内、皮内または皮下注射によって患者に投与した場合、約０．１から約５ｍｇ／ｋｇ患者体重を提供することができるように十分な濃度で含む抗炎症組成物であって、該ペプチドが医薬的に許容できる担体中に存在する、前記抗炎症組成物。２．血管からの滲出が要素となっている急性炎症症状に対して患者を治療する方法であって、当該方法が、炎症を減少させるために十分な量のペプチド（その塩を含む）を投与することを含み、当該投与されるペプチドが、−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−（配列番号：５）を含むコア配列を有する非アヘン誘導体である、前記急性炎症症状のための治療方法。３．該急性炎症症状が肺性浮腫である、請求の範囲第２項の方法。４．該投与が静脈内、皮内、または皮下注射である、請求の範囲第２項または３項の方法。５．該ペプチドが、医薬的に許容される担体と組み合わせて投与され、さらに、場合によって酵素による分解に対する抵抗性を与えるため、または安定性を強化するために修飾される、請求の範囲第４項の方法。６．該投与が、約０．１から約０．５ｍｇ／ｋｇ患者体重の間の注射用量または輸液用量である、請求の範囲第２項の方法。７．該ペプチドまたはその塩が、 G-G-F-L-R-R-I-R-P-K-L-K-W-D-N-Q（配列番号：１）、 G-G-F-L-R-R-I-R-P-K-L-K-W-D-N-Q-NH₂（配列番号：２）、 Ac-R-R-I-R-P-K-L-NH₂（配列番号：３）または Ac-R-R-I-R-P-K-l-NH₂ の配列を有する、請求の範囲第２項の方法。８． G-G-F-L-R-R-I-R-P-K-L-K-W-D-N-Q（配列番号：１）、 G-G-F-L-R-R-I-R-P-K-L-K-W-D-N-Q-NH₂（配列番号：２）、 Ac-R-R-I-R-P-K-L-NH₂（配列番号：３）または Ac-R-R-I-R-P-K-l-NH₂ の配列を有するアミド化ペプチドまたはその塩を医薬的に許容できる担体と組み合わせて組織を曝すことを含む、組織の炎症症状を治療する方法。９．該組織が、移植のための除去前、または除去時の器官を含む、請求の範囲第８項の方法。１０．該組織が損傷の約２時間前、および損傷の後約３日までに曝される、請求の範囲第８項の方法。