ES2246088T3 - Variantes de la proteina 3 de union de factor de crecimiento similar a la insulina. - Google Patents
Variantes de la proteina 3 de union de factor de crecimiento similar a la insulina.Info
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Abstract
La invención se refiere a variantes de la IGFBP-3 que están estabilizadas contra la hidrólisis no enzimática. Los inventores han descubierto que la IGFBP-3 es susceptible a la hidrólisis no enzimática en un sitio de Asp-Pro de la proteína. Asimismo y de forma sorprendente, los inventores han descubierto que un segundo sitio de la proteína es susceptible a la hidrólisis no enzimática. Los inventores han creado variantes de IGFBP-3 resistentes a la hidrólisis no enzimática en estos puntos. Las variantes de IGFBP-3 resistentes a la hidrólisis preferibles incluyen variantes de la proteína madura en la que los residuos 116 y/o 135 se cambian por residuos de aminoácidos distintos al aspartato. Con arreglo a esto, la invención proporciona IGFBP-3 resistente a la hidrólisis en la que el aspartato de la posición 135 se cambia por un aminoácido distinto al aspartato. Otras variantes de IGFBP-3 han alterado las señales de localización nuclear. Entre estas variantes se encuentra la IGFBP-3 madura, en la que los residuos 228 y/o 230 están alterados. A otras variantes de IGFBP-3 se ha añadido una extensión del N-terminal; éstas incluyen como extensión de N-terminal secuencias de unión a nucleótidos, dominios de unión a antígenos; hormonas de proteínas y factores de crecimiento. Pueden agregarse extensiones grandes del N-terminal al IGFBP-3 sin afectar a la capacidad extendida de los IGFBP-3 de ligar IGF y formar un complejo ternario con ALS. Una extensión del N-terminal puede ser una secuencia de unión a nucleótidos. La IGFBP-3 extendida puede formarse dentro de un complejo con un IGF (preferiblemente un ¿IGF nulo¿) y un nucleótido enlazado a la extensión del N-terminal. El complejo administrado de este modo tiene como resultado una vida media y una biodisponibilidad del nucleótido muy superiores.
Description
Variantes de la proteína 3 de unión de factor de
crecimiento similar a la insulina.
La presente invención se refiere a variantes de
la proteína de unión de factor de crecimiento similar a la insulina
(IGFBP), concretamente a variantes de IGFBP-3 que
son resistentes a la hidrólisis.
Los factores de crecimiento son polipéptidos que
estimulan una gran variedad de respuestas biológicas (por ejemplo,
síntesis de ADN, división celular, expresión de genes concretos,
etc.) en una población de células objetivo definidas. Se han
identificado varios factores de crecimiento, como la familia de
factores de crecimiento transformante beta
(TGF-\betas), el factor de crecimiento epidérmico
y el factor de crecimiento transformante de tipo alfa (los
TGF-\alphas), el factor de crecimiento derivado de
plaquetas (PDGFs), la familia de factores básicos de crecimiento de
fibroblastos (FGFs) y la familia de factores de crecimiento
similares a la insulina (IGF), que incluye IGF-I e
IGF-II.
IGF-I e IGF-II
(los "IGF") tienen la misma secuencia y estructura de
aminoácidos, y cada polipéptido tiene un peso molecular de
aproximadamente 7,5 kilodaltons (kDa). El IGF-I
actúa como mediador en los efectos principales de la hormona del
crecimiento y por lo tanto, es el mediador principal del
crecimiento después del nacimiento. El IGF-I también
está implicado en las acciones de otros factores de crecimiento, ya
que el tratamiento de células con estos factores de crecimiento
genera una mayor producción de IGF-I. Sin embargo,
se considera que el IGF-II tiene una función
destacada en el crecimiento fetal. Tanto el IGF-I
como el IGF-II realizan actividades similares a la
insulina (de ahí su nombre), y son mitógenos (estimulan la división
celular) de las células en un tejidos neurales.
Prácticamente la totalidad del IGF circula en un
complejo de IGF-I asociado no covalentemente, una
proteína 3 de unión de factor de crecimiento similar a la insulina
(IGFBP-3) y una subunidad de proteínas de mayor
tamaño denominada subunidad de ácido lábil (ALS), ya que hay muy
poco IGF-I detectable. El complejo ternario está
compuesto por cantidades equimolares de cada uno de los tres
componentes. La ALS no tiene actividad de unión directa con el IGF y
sólo parece ligarse al complejo IGF/IGFBP-3 (Baxter
et al., J. Biol. Chem.
264(20):11843-11848, 1989), aunque algunos
informes sugieren que la IGFBP-3 puede unirse a la
ALS en ausencia del IGF (Lee et al., Endocrinology
136:4982-4989, 1995). El complejo ternario de
IGF/ IGFBP-3/ALS tiene un peso molecular de
aproximadamente 150 kDa y posee una vida media en circulación
considerablemente más larga si se compara con el complejo binario
IGF/IGFBP-3 o con el IGF solo (Adams et al.,
Prog. Growth Factor Res.
6(2-4):347-356; presentado
en octubre de 1995, publicado en 1996). Se cree que este complejo
ternario actúa "como un depósito y un tampón para los
IGF-I y IGF-II impidiendo cambios
rápidos en la concentración de IGF libre" (Blum et al.
(1991), "Plasma IGFBP-3 Levels as Clinical
Indicators" in MODERN CONCEPTS OF
INSULIN-LIKE GROWTH FACTORS, pp.
381-393, E.M. Spencer, ed., lsevier, New York). A
pesar de que esencialmente no existe IGFBP-3
excesiva (desligada) en circulación, sí existe un considerable
exceso de ALS libre (Baxter, J. Clin. Endocrinol. Metab.
67:265-272, 1988).
Debe observarse que, a pesar de que la
IGFBP-3 es la más abundante de las proteínas de
unión IGF ("IGFBPs"), se han identificado al menos cinco IGFBP
distintas en varios tejidos y fluidos corporales. A pesar de que
estas proteínas se unen a los IGF, se originan en genes
independientes y poseen secuencias de aminoácidos distintas. A
diferencia de la IGFBP-3, otras IGFBP en
circulación no están saturadas con IGF. La IGFBP-3
es la única IGFBP que puede formar el complejo ternario 150 kDa con
IGF y ALS. Se cree que los dominios de IGF y ALS de unión de
IGFBP-3 están en la sección del
N-terminal de la proteína, ya que los fragmentos del
terminal de la proteína aislados del suero mantienen estas
actividades de unión. Sin embargo, también se ha sugerido el uso de
algunas de las demás IGFBP en combinación con el
IGF-I como terapias.
El uso del complejo IGF/IGFBP-3
se ha sugerido para el tratamiento de varios desórdenes; véanse, por
ejemplo, las patentes U.S. nº 5,187,151, 5,527,776, 5,407,913,
5,643,867, 5,681,818 y 5,723,441, además de las aplicaciones de
patentes internacionales nº WO 95/03817, WO 95/13823, y WO 96/02563.
Asimismo, el complejo IGF-I/IGFBP-3
también está siendo desarrollado por Celtrix Pharmaceuticals, Inc.
como tratamiento para varias indicaciones, como recuperación para
quemaduras y operaciones de fracturas de cadera.
Un requisito previo para el uso de la
IGFBP-3 o cualquier proteína como componente
terapéutico es que la proteína sea estable en condiciones de
almacenamiento. Algunas proteínas son susceptibles a la hidrólisis
no enzimática en sitios que contienen una secuencia
"Asp-Pro", aunque no todas las proteínas que
contienen Asp-Pro son susceptibles a ella ni todos
los sitios de Asp-Pro dentro de una proteína son
susceptibles a la hidrólisis (véase, por ejemplo, Shahrokh et
al., 1994, Pharm. Res. 11(7):936-944).
Parece ser que la susceptibilidad a la hidrólisis de cualquier
secuencia de Asp-Pro depende del entorno local del
mencionado sitio en la proteína plegada. Si el
Asp-Pro no está presente en un sitio que es
accessible a un disolvente y no está restringido contra la
isomerización, el sitio puede ser susceptible a la hidrólisis.
Parece ser que la susceptibilidad de las secuencias
Asp-Pro a la hidrólisis en proteínas sin
estructuras tridimensionales conocidas no puede predecirse. No se ha
demostrado que la IGFBP-3 sea propensa a la
hidrólisis no enzimática, y la estructura tridimensional de la
IGFBP-3 no se conoce, por lo que la susceptibilidad
no puede predecirse.
Algunos informes han sugerido que la
IGFBP-3 tiene su propio receptor celular,
independiente de los receptores de IGF, y posee su propio conjunto
de bioactividades (Nickerson et al., 1997, Biochem.
Biophys. Res. Comm. 237(3): 690-69; Rajah
et al., 1997, J. Biol. Chem. 272(18):
12181-12188; Angelloz-Nicoud et
al., 1996, Growth Regul. 6(3):130-136).
Asimismo, se ha demostrado que la IGFBP-3, después
de la internalización, se dirige al núcleo, y se ha detectado una
señal de localización nuclear (NLS) en la secuencia de
IGFBP-3 madura (Radulescu, 1994, Trends Biochem.
Sci. 19(7):278; Jaques et al., 1997 Endocrinology
138(4):1767-1770).
Algunos compuestos terapéuticos, especialmente
los compuestos "biotecnológicos" como los oligonucleótidos
antisentido y las hormonas de las proteínas sufren problemas
relativos a la focalización y la vida media. Los oligonucleótidos
antisentido, por ejemplo, suelen sufrir problemas tanto en la
focalización como en la vida media. Los oligonucleótidos que
utilizan bases y ligamientos "normales" son eliminados
rápidamente de la circulación por las nucleasas presentes en el
suero. Aunque los oligonucleótidos se produzcan utilizando otros
nucleótidos y/o ligamientos siguen siendo eliminados rápidamente de
la circulación, principalmente por el riñón y el hígado. Algunos
componentes terapéuticos basados en proteínas (por ejemplo,
anticuerpos, hormonas de proteínas y factores de crecimiento) tienen
vidas medias de circulación muy cortas porque las proteínas son lo
bastante pequeñas para extravasarse, lo que permite que los riñones
y otros órganos las eliminen rápidamente, o que sean específicamente
eliminadas por el hígado (por ejemplo, anticuerpos). Se ha intentado
realizar una modificación covalente de las proteínas (por ejemplo,
pegilación) para incrementar la vida media de circulación, pero ésta
no ha sido satisfactoria.
Por lo tanto, en la técnica se necesitan
variantes estabilizadas de IGFBP-3.
Asimismo, en la técnica se necesitan terapias más
eficientes, ya que las terapias han incrementado la vida media y la
biodisponibilidad.
La invención se refiere a variantes de la
IGFBP-3 que están estabilizadas contra la hidrólisis
no enzimática. Los inventores han descubierto que la
IGFBP-3 es susceptible a la hidrólisis no enzimática
en un sitio de Asp-Pro de la proteína. Asimismo y de
forma sorprendente, los inventores han descubierto que un segundo
sitio de la proteína es susceptible a la hidrólisis no enzimática.
Los inventores han creado variantes de IGFBP-3
resistentes a la hidrólisis no enzimática en estos puntos. Las
variantes de IGFBP-3 resistentes a la hidrólisis
preferibles incluyen variantes de la proteína madura en la que los
residuos 116 y/o 135 se cambian por residuos de aminoácidos
distintos al aspartato.
Con arreglo a esto, la invención proporciona
IGFBP-3 resistente a la hidrólisis en la que el
aspartato de la posición 135 se cambia por un aminoácido distinto al
aspartato.
Otras variantes de IGFBP-3 han
alterado las señales de localización nuclear. Entre estas variantes
se encuentra la IGFBP-3 madura, en la que los
residuos 228 y/o 230 están alterados.
A otras variantes de IGFBP-3 se
ha añadido una extensión del N-terminal; éstas
incluyen como extensión de N-terminal secuencias de
unión a nucleótidos, dominios de unión a antígenos; hormonas de
proteínas y factores de crecimiento. Pueden agregarse extensiones
grandes del N-terminal al IGFBP-3
sin afectar a la capacidad extendida de los IGFBP-3
de ligar IGF y formar un complejo ternario con ALS.
Una extensión del N-terminal
puede ser una secuencia de unión a nucleótidos. La
IGFBP-3 extendida puede formarse dentro de un
complejo con un IGF (preferiblemente un "IGF nulo") y un
nucleótido enlazado a la extensión del N-terminal.
El complejo administrado de este modo tiene como resultado una vida
media y una biodisponibilidad del nucleótido muy superiores.
Una extensión del N-terminal
puede ser una secuencia de unión a péptidos. La
IGFBP-3 con el N-terminal extendido
puede estar formada dentro de un complejo con un IGF
(preferiblemente un "IGF nulo") y un péptido. El complejo
administrado de este modo transmite el péptido, y tiene como
resultado una vida media y una biodisponibilidad del péptido muy
superiores.
La extensión del N-terminal es un
miembro de unión específico. La IGFBP-3 con el
N-terminal extendido se forma dentro de un complejo
con IGF (preferiblemente un "IGF nulo") y se administra al
paciente. El complejo se une al objetivo de la extensión del
N-terminal del miembro de unión específico y tiene
una vida media y una biodisponibilidad muy superiores en comparación
con los anticuerpos, los receptores solubles y otros miembros de
unión terapéuticos específicos.
Una IGFBP-3 con el
N-terminal más extendido utiliza un factor u hormona
de crecimiento de proteínas como extensión del
N-terminal. La IGFBP-3 con el
N-terminal extendido se forma dentro de un complejo
con IGF (preferiblemente un "IGF nulo") y se administra al
paciente. La porción de la extensión del N-terminal
puede enlazarse con su receptor objetivo y tiene una vida media y
una bioactividad muy superiores al ser una parte del complejo
IGF/IGFBP-3/ALS.
La figura 1 muestra la secuencia de aminoácidos
(código de aminoácido de una única letra) de la variante de
IGFBP-3 humana madura Ala5 que se genera
naturalmente.
El "Factor de crecimiento similar a la
insulina" o "IGF" consta de una familia de factores,
incluyendo, con carácter no exhaustivo, IGF-I y
IGF-II. Los polipéptidos IGF tienen un peso
molecular de aproximadamente 7,5 Kd. El IGF incluye
IGF-I o IGF-II que se generan
naturalmente (nativos), análogos o variantes de éstos y fusiones
entre IGF-I o IGF-II y otras
secuencias de aminoácidos. El IGF puede obtenerse de fuentes
naturales o preparadas con medios recombinantes.
En el presente documento, el término
"IGF-I nulo" se refiere a moléculas de IGF que
tienen secuencias de aminoácidos alteradas en uno o varios puntos de
la molécula, mantienen su capacidad de enlazarse con
IGFBP-3, pero tienen las actividades de
activación/enlace del receptor alteradas (por ejemplo, en enlace o
la activación de los receptores de IGF de tipo I o II o el receptor
de la insulina). Podrá encontrar descripciones de los
IGF-I nulos en Cascieri et al. (1988,
Biochemistry 27:3229-3233; 1989, J. Biol.
Chem. 264:2199-2202), Bayne et al. (1990,
J. Biol. Chern. 265:15648-15652) and Baxter et
al. (1992, J. Biol. Chem. 267:60-65). Algunos
ejemplos de IGF-I nulos son mutantes en los que uno
o varios residuos de tirosina de IGF-I (es decir,
residuos 24, 31 ó 60, solos o combinados) son sustituidos por
residuos no aromáticos (es decir, distintos a la tirosina,
fenilalanina o triptofano), mutantes en los que los residuos de
aminoácidos 49, 50, 51, 53, 55 y 56, (solos o combinados) se han
alterado (por ejemplo, en los que los residuos
49-50 se han cambiado por
Thr-Ser-Ile o en los que los
residuos 55-56 se han cambiado por
Tyr-Gln).
En el presente documento,
"IGFBP-3" se refiere a la proteína 3 de unión
de factor de crecimiento similar a la insulina.
IGFBP-3 es un miembro de la familia de la proteína
de unión de factor de crecimiento similar a la insulina.
IGFBP-3 puede ser de cualquier especie, incluyendo
la bovina, ovina, porcina y humana, en una secuencia nativa o en una
forma variante, incluyendo, con carácter no exhaustivo, variantes
alélicas que se generan naturalmente (por ejemplo, se sabe que la
posición 5 de la proteína madura es glicina o alanina), variantes de
glicoscilación como variantes de ND y variantes resistentes a la
hidrólisis.
El término "IGFBP-3 nativa"
se refiere a IGFBP-3 que posee la secuencia natural
o de referencia para esa especie particular. El término
IGFBP-3 nativa incluye variantes que se generan
naturalmente (como la variación en la posición 5 de la proteína que
se genera naturalmente).
En el presente documento, el término
"IGFBP-3 variante de glicoscilación " hace
referencia a IGFBP-3s en las cuales los residuos de
aminoácidos en los sitios de glicoscilación ligada a N (es decir,
las posiciones 89, 109, y 172 de la proteína madura) se ha n
convertido, de forma individual o combinada, en residuos de
aminoácidos distintos a la asparraguina. Algunos ejemplos son las
variantes: N89B; N109B; N172B; N89B,N109B; N89B,N172B;
N109B,N172B; y N89B,N 109B,N172B, en las que B es cualquier
aminoácido distinto a la asparraguina. Un grupo preferido de
IGFBP-3 de variante de glicoscilación son las
"IGFBP-3 variantes de ND". Las
IGFBP-3 variantes de ND son variantes de
IGFBP-3 en las que los aminoácidos en los puntos de
glicoscilación unida a N (es decir, las posiciones 89, 109 y 172
de la proteína madura) se convierten en ácido aspártico. Las
IGFBP-3 variantes de ND incluyen las variantes:
N89D; N109D; N172D; N89D,N109D; N89D,N172D; N109D,N172D; y
N89D,N109D, N172D.
El término "IGFBP-3 variantes
resistentes a la hidrólisis" se refiere a variantes de
IGFBP-3 cuya secuencia natural ha sido alterada para
que sean más resistentes a la hidrólisis. Ejemplos concretos de
IGFBP-3 resistentes a la hidrólisis son alteraciones
en las posiciones 116 y 135 que convierten estas posiciones, de
forma individual o combinada, en residuos de aminoácidos distintos
al ácido aspártico (por ejemplo, D116J, D135J y D116J, D135J, donde
J es un aminoácido distinto al ácido aspártico). Las
IGFBP-3 variantes resistentes a la hidrólisis
preferibles son las variantes en las que se han alterado las
posiciones 116 y 135 de la proteína madura, de forma individual o
combinada, para convertirlas en ácido glutámico (es decir, D116E,
D135E y D116E, D135E).
"IGFBP-3 variante de NLS" se
refiere a las variantes de IGFBP-3 que han alterado
las señales de localización nuclear. El NLS de
IGFBP-3 está situado en la parte del carboxilo
terminal de la proteína, e incluye los residuos desde el 215 hasta
el 232 (Radulescu, 1994, Trends Biochem Sci. 19(7):278). Las
IGFBP-3 variantes de NLS pueden ser aquellas en las
que los residuos 228 y 230 de la proteína madura se convierten en
residuos distintos a los de la secuencia nativa (por ejemplo,
K228U1,R230U2, donde U1 es un aminoácido distinto a la lisina y U2
es un aminoácido distinto a la arginina), específicamente las
variantes en las que la posición 228 se convierte en ácido glutámico
y/o la posición 230 se convierte en glicina (por ejemplo,
K228E,R230U2, K228U1,R230G y K228E,R230G). Variantes de NLS
adicionales son variantes en las posiciones 215, 216 y 231.
Las "IGFBP-3 con
N-terminal extendido" son las
IGFBP-3 que se han alterado para añadir secuencias
adicionales al N-terminal de la proteína. Las
IGFBP-3 con N-terminal extendido
pueden crearse utilizando cualquier secuencia de
IGFBP-3, incluyendo IGFBP-3 nativas
o secuencias de IGFBP-3 variantes: las secuencias de
extensión del N-terminal pueden ser de diversos
tipos, incluyendo, con carácter no exhaustivo, secuencias de unión
de nucleótidos, secuencias de unión de péptidos, miembros de unión
específicos, secuencias de hormonas de proteínas secuencias de
factor de crecimiento, enzimas y similares.
Las secuencias de extensión de
N-terminal pueden diseñarse de novo o pueden
derivarse de secuencias conocidas. Para las secuencias de extensión
de N-terminal derivadas de proteínas que se generan
naturalmente, ADNc y genes, la secuencia de extensión de
N-terminal puede derivarse de las mismas especies
que la secuencia de IGFBP-3 (por ejemplo, para
extensiones del N-terminal de
IGFBP-3 humanas, la extensión de
N-terminal puede derivarse de una proteína humana,
ADNc o gen).
Las "secuencias de unión a nucleótidos",
como se utilizan en el presente documento, son las secuencias de
aminoácidos que se unen a polímeros de nucleótidos con una secuencia
definida o sin secuencia definida. Las secuencias de unión a
nucleótidos con secuencia definida incluyen dominios de unión de ADN
discretos de factores de transcripción, como el homeodominio de la
proteína de homeodominio de MAT \alpha2 de levadura,
homeodominios de proteínas del homeodominio D. melanogaster como
las proteínas de homeodominio del complejo bitórax
(BX-C, Martin et al., 1995, Proc. Natl. Acad
Sci. U.S.A. 92(18):8398-8402), reducción
del polimorfismo cromosómico (Scr, LeMotte et al., 1989, EMBO
J. 8(1):219-227), secuencia homeótica de
segmento muscular (msh, D'Alessio et al., 1996, Mech. Dev.
58(1-2):217-231), los genes
HOX y otros conocidos en la técnica, dominios de dedos de zinc de
factores de transcripción, y similares. Las secuencias de unión a
nucleótidos sin una secuencia definida incluyen proteínas parciales
o completas, incluyendo dominios de unión de ADN discretos, que se
unen de forma no específica a ADN monocatenario o bicatenario,
incluyendo la proteína de unión a ADN monocatenario mitocondrial
(SSB, Tiranti et al., 1993, Gene
126:219-225), UP I (Riva et al., 1986, EMBO
J. 5 (9):2267-2273), RecA, y similares.
El término "secuencia de unión a péptidos"
hace referencia a secuencias de aminoácidos capaces de unirse a
péptidos o proteínas sin una secuencia definida. Las secuencias de
unión a péptidos pueden ser proteínas enteras o fragmentos o
dominios derivados de proteínas enteras. Ejemplos de proteínas que
incluyen secuencias de unión a péptidos son las proteínas conocidas
como "chaperonas", como las chaperoninas, inmufilinas y las
proteínas de choque térmico (hsp), así como las proteínas del
complejo mayor de histocompatibilidad (MHC). Las secuencias de unión
a péptidos preferibles son gp96, hsp70, hsp90, y las clases I y II
de MHC, especialmente los dominios extracelulares. Los productos de
los genes DsbA y DsbC de E. coli y sus homólogos no se
incluyen dentro del término "secuencia de unión a péptidos"
tal y como se utiliza en el presente documento.
Los "miembros de unión específicos" son
secuencias que unen secuencias objetivo específicas. Las secuencias
objetivo pueden ser proteínas, carbohidratos, nucleótidos o
cualquier otra molécula para la que haya un miembro de unión
específico disponible. Los anticuerpos y sus fragmentos o
componentes (es decir, secuencias de unión de antígenos) son un
grupo de miembros de unión específicos preferidos. La secuencia de
unión de antígenos puede ser una cadena pesada completa de
anticuerpos, un anticuerpo de cadena sencilla, un fragmento de
anticuerpo como Fab y F(ab')2 o un segmento de una cadena de
anticuerpo como la región variable de la cadena pesada (VH), un
segmento Fd de la cadena pesada (que incluye el dominio VH y el
primer dominio constante), sFv, una o varias de las regiones
determinantes de la complementariedad (CDR) de una cadena pesada de
inmunoglobina que es específica para la secuencia objetivo. De forma
alternativa puede utilizarse una secuencia de unión de ligandos como
miembro de unión específico. Las secuencias de unión de ligandos
pueden derivarse de receptores celulares y pueden incluir formas
solubles del receptor, el dominio extracelular o un fragmento de
éstos.
Los términos "hormona de proteína" y
"factores de crecimiento" se refieren a péptidos y proteínas
que funcionan de un modo endocrino, paracrino o autocrino. Las
hormonas de proteína y los factores de crecimiento son bien
conocidos en la técnica e incluyen varias familias. Algunos ejemplos
de factores de crecimiento son, con carácter no exhaustivo: los
factores de crecimiento transformantes (TGFs), incluyendo los
TGF-\alphas, como TGF-\alpha, el
factor de crecimiento epidérmico (EGF) y
TGF-\alphaHIII y la superfamilia de
TGF-\beta que incluye los
TGF-\betas, las proteínas morfogenéticas óseas
(BMPs), las activinas, e inhibinas entre otras; el factor de
crecimiento fibroblástico (FGF), incluyendo FGF1 hasta al menos
FGF-18; la familia de factor de crecimiento de
células endoteliales vasculares (VEGF), incluyendo VEGF, VEGF2,
VEGFC, y VEGFD; el factor de crecimiento derivado de las plaquetas
(PDGF), incluyendo las isoformas AA, AB y BB de PDGF; los factores
de crecimiento similares a la insulina (IGFs), incluyendo el
IGF-I y el IGF-II de secuencia
nativa, nativa,
des(1-3)IGF-I y otras
variantes de IGF conocidas en la técnica, así como otros factores de
crecimiento como se conocen en la técnica. Las hormonas de proteínas
incluyen la hormona del crecimiento, neuropéptidos como el péptido
intestinal vasoactivo (VIP), la neuroquinina A (NKA), el péptido
relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP), el polipéptido
activador de la adenilil ciclasa de pituitaria (PACAP), el
neuropéptido Y (NPY), y la somatostatina.
Cuando las IGFBP-3 con el
N-terminal extendido incluyen una enzima, ésta puede
ser una enzima que actuará en la célula objetivo. Se ha demostrado
que las IGFBP-3 que tienen una secuencia nativa en
las posiciones 215, 216, 228, 230 y 231 de la proteína madura se
translocan al núcleo de células en división, pero no a células
inactivas (Li et al., 1997, Endocrinology
138:1763-1766). Debe tenerse en cuenta que las
enzimas que son útiles como extensiones de
N-terminal no incluyen
glutatión-S-transferasa o
\beta-galactosidasa. Las IGFBP-3
variantes que incluyen una enzima como la extensión de
N-terminal funcionan como una plataforma para
entregar la enzima de extensión del N-terminal al
núcleo de células que se dividen rápidamente. La enzima de extensión
del N-terminal puede ser una enzima que actúe sobre
los ácidos nucleicos, como una integrasa, una ribonucleasa
(ribonucleasa pancreática), una endonucleasa de restricción, o
exonucleasa. La administración de de enzimas que cortan o degradan
los ácidos nucleicos (por ejemplo, nucleasas) puede alterar la
cinética de crecimiento, o incluso matar, las células que se dividen
rápidamente, como las células cancerígenas. La enzima de extensión
del N-terminal puede ser una enzima que confiere
sensibilidad a los fármacos a la célula objetivo, como el virus del
herpes simplex (HSV), el citomegalovirus (CMV) o el gen de la
timidinquinasa (TK). Las células que expresan HSV o CMV TK adquieren
sensibilidad a los fármacos acyclovir y ganciclovir, y por lo tanto,
las células objetivo pueden morir si se les administra acyclovir o
ganciclovir de forma simultánea o después de la administración de
IGFBP-3 con un N-terminal extendido
que incluya HSV o CMV TK.
Un "nucleótido terapéutico" es un poli u
oligonucleótido que puede administrarse para provocar un efecto
farmacológico al alterar la transcripción y/o traducción de
determinados genes y ARNm. Los nucleótidos terapéuticos preferibles
son los oligonucleótidos antisentido y las ribozimas. Un nucleotide
antisentido suele ser un oligonucleótido monocatenario diseñado
para formar un híbrido con un ARNm particular dentro de la célula
objetivo, lo que origina una detención de la traducción y/o
degradación del ARNm objetivo. Las ribozimas son ribonucleótidos que
tienen actividad enzimática y pueden designarse para romper
secuencias específicas (véase, por ejemplo, Lavrovsky et al.,
1997, Biochem. Mol. Med 62(1):11-22). Pueden
utilizarse oligonucleótidos de fosfodiéster no modificados; no son
tan preferibles, ya que son altamente sensibles a las nucleasas
presentes en el suero. Los oligonucleótidos modificados (que tienen
químicas básicas distintas al fosfodiéster, incluyendo
fosforotioato y metilfosfonato) son oligonucleótidos preferibles
para utilizar en la invención instantánea.
La IGFBP-3 de variantes
resistentes a la hidrólisis tiene utilidades en todas las
aplicaciones para la que la IGFBP-3 nativa posee
utilidad. La IGFBP-3 variante de NLS también tiene
utilidad en todas las aplicaciones para las que tiene utilidad la
IGFBP-3 nativa. Estas IGFBP-3
variantes pueden utilizarse como terapia para inhibir la acción de
IGF, o pueden administrarse como un complejo con IGF para el
tratamiento de una gran variedad de desórdenes.
Las IGFBP-3 con
N-terminal extendido tienen varias utilidades, en
función de la naturaleza de la extensión del
N-terminal. Por ejemplo, la IGFBP-3
con N-terminal extendido con una secuencia de unión
a nucleótidos como extensión del N-terminal puede
utilizarse para administrar medicamentos basados en nucleótidos,
como los oligonucleótidos antisentido. La IGFBP-3
con N-terminal extendido con una secuencia de unión
a péptidos o un miembro de unión específico como extensión del
N-terminal puede utilizarse, por ejemplo, para
suministrar terapias basadas en péptidos y proteínas y como un
agente de liberación controlada para la inmunización. La
IGFBP-3 con el N-terminal extendido
con una hormona de proteína o un factor de crecimiento es útil para
la liberación controlada de la hormona de proteína o el factor de
crecimiento que forma la extensión del
N-terminal.
Las IGFBP-3 variantes de la
invención se producen preferiblemente mediante métodos de expresión
recombinantes. En general, una secuencia de ADN que codifica la
variante se crea, por ejemplo, mediante síntesis de novo o mediante
mutagénesis dirigida de una codificación de ADN ya existente para la
IGFBP-3. En la síntesis de novo, la secuencia de ADN
que codifica la variante de IGFBP-3 normalmente se
producirá en varios segmentos (la IGFBP-3 nativa es
de 264 aminoácidos, por lo que requiere en una molécula de ADN al
menos 792 nucleótidos de longitud), que se unen para producir la
secuencia completa de ADN. Los métodos para crear alteraciones
específicas en una secuencia determinada de ADN son bien conocidos,
y como resultará evidente para los expertos en la técnica, cualquier
método útil para realizar alteraciones en una secuencia de ADN puede
utilizarse para alterar secuencias de ADN con el fin de crear una
secuencia de ADN que codifique una IGFBP-3 variante
de la invención.
Las IGFBP-3 variantes pueden ser
producidas como una proteína de fusión o mediante "expresión
directa" (producción de la IGFBP-3 variante sin
una señal asociada o secuencia de secreción o elemento con el que se
fusionan). Algunos elementos con los que se pueden fusionar
adecuados para la producción de proteínas de fusión de
IGFBP-3 variantes son la
glutatión-S-transferasa (GST),
secuencias de señal de secreción operables en la célula hospedadora
recombinante y los elementos que mejoran la solubilidad se revelan
en la patente U.S. nº 5,629,172 (por ejemplo, DsbA sin líder).
En el caso de la producción como una proteína de fusión, ésta puede
romperse para retirar el elemento con el que se fusiona mediante la
acción de una proteasa dentro de la célula hospedadora o in
vitro después de la obtención de la proteína de fusión
expresada. Habitualmente, esta ruptura requerirá la presencia de una
secuencia objetivo de proteasa insertada entre el elemento con el
que se fusiona y la secuencia de la IGFBP-3
variante. Puede utilizarse cualquier combinación de
secuencia/proteasa objetivo que proporcione la actividad y la
especificidad suficientes, aunque son preferibles los sistemas de
ubiquitina/hidrolasa o ubiquitina y los sistemas 3C de proteasa
HRV.
Normalmente, el ADN que codifica la
IGFBP-3 variante se inserta en un vector de
expresión (una construcción de ADN que contiene las secuencias
necesarias en la disposición adecuada para realizar la transcripción
y traducción del ARNm para la IGFBP-3 variante),
que posteriormente se introduce en una célula hospedadora
recombinante. Los vectores de expresión recombinantes suelen
contener secuencias necesarias para la iniciación de la
transcripción y traducción, incluyendo promotores, operadores,
potenciadores, sitios de unión a ribosomas y similares, además de
sitios de terminación transcripcional y secuencias necesarias para
el correcto procesamiento de ARNm (como los sitios de adición de
poli-A para las células hospedadoras eucariotas).
Preferiblemente, los promotores, operadores y/o potenciadores son
inducibles, de modo que la expresión de la secuencia de la
IGFBP-3 variante es regulada por la presencia o
ausencia de un componente específico (por ejemplo, el uso del operón
de la laca confiere regulación por lactosa y análogos de la
lactosa). Los vectores de expresión recombinante para utilizar en
células hospedadoras eucariotas pueden contener además un intrón
heterólogo con las señales adecuadas para el procesamiento del
intrón, ya que se ha demostrado que esto incrementa la exportación
de ARNm en algunos sistemas. Las construcciones de expresión
preferibles para utilizar en células procariotas se revela en la
aplicación de patente internacional nº WO 96/40722.
Las técnicas generales para la manipulación de
ácido nucleico útiles para la práctica de la invención reivindicada
se describen de forma general, en Sambrook et al., MOLECULAR
CLONING: A LABORATORY MANUAL, Vols. 1-3 (Cold Spring
Harbor Laboratory Press, 2 ed., (1989); o F. Ausubel et al.,
CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Green Publishing and Wi-
ley-Interscience: New York, 1987) y en
actualizaciones periódicas. Reactivos útiles en la manipulación del
ácido nucleico, como las enzimas de restricción, la polimerasa ARN
T7, las ligasas de ADN, etc. son comercializados por proveedores
como New England BioLabs, Boerhinger Mannheim, Amersham, Promega
Biotec, U.S. Biochemicals, and New England Nuclear.
La expresión de construcción se introduce en la
célula hospedadora mediante un método apropiado para la célula,
como resultará evidente a los expertos en la técnica. En la técnica
se conocen varios métodos para introducir ácidos nucleicos en
células hospedadoras, incluyendo, con carácter no exhaustivo,
electroporación; transfección utilizando cloruro cálcico, fosfato de
calcio de cloruro de rubidio; DEAE-dextrano u otras
sustancias, bombardeo con microproyectiles; lipofección; e
infección (donde el vector es un agente infeccioso, con un genoma
retroviral). Véase, en general, Sambrook et al., supra
and Ausubel et al., supra.
La célula hospedadora recombinante puede ser
eucariota o procariota, aunque las células hospedadoras procariotas
son preferibles para la producción de las IGFBP-3
variantes de la invención. Entre los huéspedes procariotas, son
preferibles las bacterias gram negativas, especialmente las
Escherichia coli. También pueden utilizarse otras
procariotas, como la Bacillus subtilis o Pseudomonas.
Asimismo, pueden utilizarse células de mamíferos u otras células
hospedadora eucariotas, como levadura, hongos filamentosos, plantas,
insectos, anfibios o especies aviares. Véase TISSUE CULTURE (Kruse
and Patterson, ed., Academic Press, 1973). Algunas células de
mamíferos útiles son, con carácter no exhaustivo, las células, VERO
y HeLa, células de ovarios de hámster chino (CHO) y las líneas de
células W138, BHK, y COS.
Cuando se ha establecido una cepa de célula
hospedadora recombinante (es decir, la construcción de expresión se
ha introducido en la célula hospedadora y se han aislado las células
hospedadoras con la construcción de expresión adecuada), la cepa se
cultiva en las condiciones adecuadas para la producción de la
IGFBP-3 variante. Como resulta evidente a los
expertos en la técnica, el método de cultivo la cepa de la célula
hospedadora recombinante dependerá de la naturaleza de la
construcción de expresión utilizada y de la identidad de la célula.
Habitualmente, las cepas de la célula hospedadora recombinante se
cultivan en un medio líquido que contiene fuentes asimilables de
carbón, nitrógeno y sales inorgánicas, con métodos que son bien
conocidos en la técnica. Las células de insectos o mamíferos
transformadas se cultivan en un medio líquido que contiene fuentes
asimilables de carbón, nitrógeno y sales inorgánicas y que
opcionalmente, contiene vitaminas, aminoácidos, factores de
crecimiento y otros suplementos de cultivo proteínicos conocidos en
la técnica. Los medios líquidos para el cultivo de células
hospedadoras pueden contener de manera opcional antibióticos o
funguicidas para evitar el crecimiento de microorganismos o
compuestos no deseados, incluyendo, con carácter no exhaustivo,
antibióticos para seleccionar células hospedadoras que contienen el
vector de expresión.
Las células hospedadoras recombinantes pueden
cultivarse por lotes o en formatos continuos, con recolección
celular (en el caso en que la IGFBP-3 variante se
acumule intracelularmente) o el cultivo de sobrenadante en lote o en
formatos continuos. Para la producción en células hospedadores
procariotas, son preferibles el cultivo por lotes y la recolección
de células.
Las IGFBP-3 variantes suelen
purificarse después de la expresión en sistemas recombinantes. La
IGFBP-3 variante puede purificarse de las células
hospedadoras mediante varios métodos conocidos en la técnica.
Habitualmente, la IGFBP-3
variante producida en células hospedadoras bacterianas es muy poco
soluble o insoluble (en la forma de cuerpos de inclusión). En el
caso de las proteínas insolubles, la proteína puede recogerse de
lisados de células hospedadoras por centrifugación. En el caso de
proteínas y compuestos poco solubles, incluyendo, con carácter no
exhaustivo, polietilenimina (PEI) puede agregarse para inducir la
precipitación de una proteína parcialmente soluble. La proteína
precipitada puede entonces recogerse convenientemente para la
centrifugación.
La IGFBP-3 variante insoluble o
precipitada puede entonces solubilizarse mediante cualquiera de
varios agentes conocidos en la técnica. Preferiblemente el
IGF-I o IGFBP-3 se solubiliza con
urea o clorhidrato de guanidina.
Cuando la IGFBP-3 variante se
produce como una proteína de fusión, es preferible que la secuencia
de fusión se extraiga. La extracción de una secuencia de fusión
puede realizarse mediante un corte enzimático o químico,
preferiblemente por corte enzimático. La extracción enzimática de
secuencias de fusión puede lograrse mediante métodos bien conocidos
en la técnica. La elección de enzimas para eliminar secuencias de
fusión estará determinada por la identidad de la fusión, y las
condiciones de la reacción se especificarán según la enzima elegida
como resultará evidente a los expertos en la técnica.
Preferiblemente, la IGFBP-3 variante se purifica de
la fusión cortada mediante métodos bien conocidos. Tales métodos se
determinarán según la identidad y las propiedades de la secuencia de
fusión y la IGFBP-3 variante, como resultará
evidente a los expertos en la técnica. Los métodos de purificación
pueden ser, con carácter no exhaustivo, cromatografía de permeación
sobre gel, cromatografía hidrofóbica, cromatografía de intercambio
iónico o diálisis.
También es preferible que las
IGFBP-3 se purifiquen para extraer el ADN de la
solución de proteína. El ADN puede extraerse mediante cualquiera de
los diferentes métodos conocidos en la técnica, como la
precipitación o la cromatografía de intercambio iónico, pero es
preferible que se extraiga mediante precipitación con precipitación
con sulfato de protamina. La IGFBP-3 variante puede
separarse del ADN precipitado mediante métodos como la
centrifugación o filtración.
En el caso de producción procariota de
IGFBP-3 variante, con frecuencia la
IGFBP-3 variante producida de este modo está mal
plegada completamente o casi en su totalidad y por lo tanto, carece
de actividad biológica. La bioactividad de la proteína puede
recuperarse "plegándola de nuevo". En general, la
IGFBP-3 variante mal plegada se pliega de nuevo
mediante solubilización (donde la IGFBP-3 variante
es también insoluble), desplegando y reduciendo la cadena de
polipéptidos mediante uno o varios agentes caotrópicos (por ejemplo,
urea y/o guanidina) y un agente capaz de reducir enlaces de
disulfuro (por ejemplo, ditiotreitol, DTT or
2-mercaptoetanol, 2-ME). En una
concentración moderada de agente caotrópico se añade un agente
oxidante (por ejemplo, oxígeno, cistina o cistamina), que permita
reformar los enlaces de disulfuro de intracadena. La
IGFBP-3 variante puede volver a plegarse utilizando
métodos estándar conocidos en la técnica, como los descritos en las
patentes de EE.UU. nº 4,511,502, 4,511,503, y 4,512,922. De
modo alternativo, la IGFBP-3 variante puede volver a
plegarse en una reacción de plegado conjunto con IGF, como se
describe en la Aplicación de patente internacional nº WO 96/40736
(nº de serie PCT/US96/08113).
Después de plegarla de nuevo, es preferible
purificar aún más la IGFBP-3 variante. La
purificación de IGFBP-3 variante puede realizarse
utilizando varias técnicas conocidas, como cromatografía
hidrofóbica, cromatografía de permeación sobre gel, cromatografía
de intercambio iónico, cromatografía líquida de alta resolución de
fase invertida, cromatografía de afinidad, y similares.
Preferiblemente, el complejo de IGFBP-3 variante
nativa se purifica mediante cromatografía de intercambio de cationes
utilizando una matriz de cromatografía en columna derivada de
sulfopropil (por ejemplo, SP-Sephadex, Pharmacia,
Uppsala, Sweden). La purificación adicional también puede incluir
una fase de secado o precipitación de la proteína purificada.
Después de la purificación, la
IGFBP-3 variante puede intercambiarse en diferentes
tampones y/o concentrarse mediante varios métodos conocidos en la
técnica, incluyendo, con carácter no exhaustivo, diafiltración y
diálisis.
Preferiblemente, la IGFBP-3
variante purificada tiene una pureza mínima del 90% (medida según la
cromatografía líquida de alta resolución de fase invertida,
RP-HPLC, o electroforesis en gel de poliacrolamida
con dodecilsulfato de sodio, SDS-PAGE) o al menos
con un 95% de pureza, más preferiblemente de una pureza mínima del
98%; lo más preferible es que tenga una pureza del 99%.
Independientemente del valor numérico exacto de la pureza de la
IGFBP-3 variante, la IGFBP-3
variante es preferiblemente lo bastante pura como para utilizarla
como un producto farmacéutico.
Los IGF, incluyendo los IGF-I y
IGF-II nativas además de IGF variantes, como IGF
nulos, pueden producirse con cualquier método conocido en la
técnica, y preferiblemente se producen utilizando métodos
recombinantes, preferiblemente utilizando células hospedadoras
procariotas como se describen en la Aplicación internacional de
patente nº WO 96/40722. Los IGF, ya sean producidos en forma
insoluble y/o mal plegada, pueden volver a plegarse utilizando
cualquiera de los métodos descritos para plegar de nuevo las
proteínas en general, o mediante métodos específicamente revelados
para IGF, como en las patentes de U.S. nº 5,288,931, 5,410,026,
5,663,304, o el IGF puede volver a plegarse con IGFBP, como se
revela en la patente U.S. nº 5,683,980 y la Aplicación internacional
de patente No. WO 96/40722.
Preferiblemente, el IGF utilizado para la
formación compleja con IGFBP-3 variantes de la
invención está purificado al menos parcialmente. El complejo binario
de IGF y IGFBP-3 variante puede purificarse aún más
después de la formación del complejo utilizando cualquier método
conocido en la técnica, y es preferible que se purifique. Los
métodos y condiciones precisos para la purificación del complejo de
IGF/ IGFBP-3 variante variarán en función de la
forma de el IGF y la variante de IGFBP-3 específica
utilizadas, como resultará evidente a los expertos en la
técnica.
Ciertas IGFBP-3 variantes (por
ejemplo, IGFBP-3 resistentes a la hidrólisis y
IGFBP-3 y IGFBP-3 variante NSL)
pueden utilizarse como agentes terapéuticos a falta de otras
proteínas (distintas a excipientes, portadores, y estabilizadores,
por ejemplo, la sueroalbúmina), o pueden complejarse con un IGF. El
IGF puede ser una variante IGF-I,
IGF-II, o IGF de secuencia nativa como un IGF nulo.
La formación de complejos de IGFBP-3 y IGF variantes
se consigue simplemente mezclando las dos proteínas en la solución.
Las IGFBP-3 variantes mantienen su capacidad de
unirse a IGF y ALS, por lo que la administración del complejo
binario de el IGF/IGFBP-3 aun sujeto originará la
formación de un complejo ternario IGF/IGFBP-3/ALS.
El complejo ternario tiene una larga vida media en circulación, muy
superior a la vida media de IGF o IGFBP-3 o del
complejo binario.
Habitualmente, las IGFBP-3s con
el N-terminal extendido se administrarán como un
complejo de IGF y una IGFBP-3 variante. Para
ciertas IGFBP-3s con el N-terminal
extendido, el complejo de IGF/IGFBP-3 variante se
administrará como un complejo con un tercer componente. En el caso
en que la extensión del N-terminal sea una secuencia
de unión a nucleótidos, el complejo binario incluirá además un
nucleótido terapéutico. En el caso en que la secuencia de unión a
nucleótidos sea una secuencia de unión a nucleótidos con una
secuencia definida, el nucleótido terapéutico que se incluye en el
complejo contendrá una secuencia (la "secuencia objetivo de
unión") a la que se unirá la secuencia de unión a nucleótidos
con una secuencia definida. Por ejemplo, si la secuencia de unión a
nucleótidos es el homeodominio MAT \alpha2, el nucleótido
terapéutico puede incluir la secuencia
5'-ACATGTAATT-3' o variantes de ésta
a las que se unirán en el homedominio MAT \alpha2. Sin embargo,
no es necesario que el nucleótido terapéutico contenga una secuencia
objetivo de unión si la secuencia de unión a nucleótidos no tiene
una secuencia definida.
Las IGFBP-3 con el
N-terminal extendido que incluyen una secuencia de
unión a péptidos o un miembro de unión específico también se
administran complejados con IGF y un tercer compuesto. En este
caso, el tercer compuesto es un péptido, una proteína u otro
compuesto que se une a la extensión del N-terminal.
La unión entre la extensión del N-terminal puede ser
específica (como en un miembro de unión específico) o no específica,
como sucede cuando la extensión del N-terminal es
una secuencia de unión a péptidos.
Ejemplo comparativo
1
Una construcción de ADN que codifica una
IGFBP-3 variante de NLS (IGFBP-3
variante de ND Ala5 K228E, R230G) se creó mediante mutagénesis
dirigida con reacción en cadena de polimerasa, pKN72249 (que incluye
una secuencia de ADN que codifica la IGFBP-3
variante de ND Ala5) se utilizó como la plantilla de dos reacciones
PCR diferentes, una utiliza NLSF iniciadores
(5'-CAATGCCGTCCGAGTGAGGGTGG-
TAAACGAGGTTTTTGTTGGTG-3') y CYC5'R
(5'-CTCCAGTTCGATGTTACCAGCTGAGG-3'),
y la segunda utiliza NLSR
(5'-ACAAAAACCTCG
TTTACCAC- CCTCACTCGGACGGCATTGTTTC-3') y BP3#1 (5'-TTCATCCGTTGCACTCT-3'). La amplificación se realizó con arreglo a las instrucciones de los fabricantes. Se amplificaron de nuevo partes alícuotas de 1\mul de cada reacción mediante iniciadores BP3#1 y CYC5'R para producir un producto de amplificación de 0,8 kb (que se esperaba que contuviera una mezcla de ADN de IGFBP-3 variante de NLS).
TTTACCAC- CCTCACTCGGACGGCATTGTTTC-3') y BP3#1 (5'-TTCATCCGTTGCACTCT-3'). La amplificación se realizó con arreglo a las instrucciones de los fabricantes. Se amplificaron de nuevo partes alícuotas de 1\mul de cada reacción mediante iniciadores BP3#1 y CYC5'R para producir un producto de amplificación de 0,8 kb (que se esperaba que contuviera una mezcla de ADN de IGFBP-3 variante de NLS).
El producto de amplificación de 0,8 kb se
purificó mediante electrofóresis en gel de agarosa y Geneclean®
(Bio101, La Jolla, CA), y posteriormente se digirió con enzimas de
restricción SalI y NsiI. Los productos de digestión de restricción
se vertieron sobre un gel de agarosa y se aisló el producto de 0,25
kb (este fragmento contiene la secuencia que codifica la región NL
de la IGFBP-3) mediante electrofóresis en gel
pDM46908 también se digirió con SalI y NsiI y la estructura
principal de vector de 4,6 kb (que también contiene el resto de la
secuencia IGFBP-3) se aisló mediante electrofóresis
en gel.
Los dos fragmentos de ADN aislados se unieron y
se transformaron en cepas JM109 de E. coli y se cultivaron en
medios nutrientes que contenían ampicilina (pDM46908 transporta el
gen bla). Se seleccionaron varios clones resistentes a la ampicilina
y se prepararon, y minipreparaciones de ADN plásmido. Se digirió la
minipreparación de ADN con BamHI y NsiI, que producirían una banda
de 1,4 kb de diagnóstico de plásmidos unidos correctamente. Se
seleccionó un único aislamiento (designado 1-2) con
la digestión de restricción de BamHI/NsiI correcta para una mayor
caracterización.
La región NLS del ADN se secuenció utilizando
BP3#1 como el iniciador de secuencia, para comprobar que el
aislamiento 1-2 tenía la secuencia esperada. Después
de confirmarse la secuencia correcta, el aislamiento
1-2 se utilizó como ADN de origen para la creación
de una construcción de expresión para producir
IGFBP-3 variante NLS de ND Ala5.
Un fragmento de SalI-NsiI de 0,25
kb del aislamiento 1-2 de NLS se unió en una
reacción tridireccional con un fragmento de XbaI/SalI de 1,2 kb de
pKN72253 y un fragmento de XbaI/NsiI de 5,5 kb de pDJ12887, y se
creó un plásmido esencialmente idéntico al
pDM46884-BP3 (Zhang et al.1998, Prot.
Exp. Purif. 12:159-165) excepto en que la
secuencia IGFBP-3 fue sustituida por la nueva
secuencia de IGFBP-3 variante NLS de Ala5 ND. La
reacción de unión se transformó en JM109 y las células transformadas
se cultivaron en medios nutrientes que contenían ampicilina y
traciclina. Se aislaron varios clones y se tamizaron mediante la
digestión de XbaI/NsiI de una minipreparación de ADN (se esperaba
que se originara una unión correcta en un fragmento de 1,4 kb de
diagnóstico). Se seleccionó un clon que diera el patrón de digestión
de restricción adecuado y se preparó ADN plásmido. El ADN plásmido
se transformó en E. coli SB 1076 para la expresión de la
IGFBP-3 variante de NLS.
Claims (9)
1. IGFBP-3 resistente a la
hidrólisis, en las que el aspartato de la posición 135 se cambia
por un amino ácido distinto al aspartato.
2. IGFBP-3 resistente a la
hidrólisis de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el
aspartato en el residuo 116 se cambie por un amino ácido distinto al
aspartato.
3. IGFBP-3 resistente a la
hidrólisis de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 2, en la que el
residuo 116 y/o la posición 135 se cambien por ácido
glutámico.
4. IGFBP-3 resistente a la
hidrólisis de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones
anteriores, en la que la IGFBP-3 sea una a
IGFBP-3 variante de glicoscilación.
5. IGFBP-3 resistente a la
hidrólisis de acuerdo con la reivindicación 4, en la que la
asparragina en al menos una de las posiciones 89, 109 y 172 se ha
transformado en un aminoácido distinto a la asparragina.
6. Un complejo binario de IGF y
IGFBP-3 resistente a la hidrólisis de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
7. IGFBP-3 resistente a la
hidrólisis de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones de la 1
a la 5 para utilizarlas en la terapia.
8. Un agente terapéutico que incluya una
IGFBP-3 resistente a la hidrólisis de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 5 y un excipiente o
portador adecuado.
9. Un agente terapéutico de acuerdo con la
reivindicación 8 en el que la IGFBP-3 resistente a
la hidrólisis se compleje con IGF.
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