JPH10313876A

JPH10313876A - 抗腫瘍タンパク質およびその遺伝子

Info

Publication number: JPH10313876A
Application number: JP10031452A
Authority: JP
Inventors: Yukio Kawamura; 村幸雄河; Akihiro Morita; 田昭博森; Koji Izumo; 雲耕二出; Tomohide Saka; 智秀坂
Original assignee: MOMOYA KK; National Food Research Institute
Current assignee: MOMOYA KK; National Food Research Institute
Priority date: 1997-02-13
Filing date: 1998-02-13
Publication date: 1998-12-02
Anticipated expiration: 2018-02-13
Also published as: JP4041913B2

Abstract

(57)【要約】【課題】抗腫瘍タンパク質およびそれをコードする塩
基配列の提供。【解決手段】（ａ）配列番号１のアミノ酸配列、また
は（ｂ）１以上のアミノ酸が付加および／または挿入さ
れ、および／または１以上のアミノ酸が置換および／ま
たは欠失された配列番号１のアミノ酸配列であって、抗
腫瘍活性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の背景】発明の分野本発明は、抗腫瘍タンパク質およびこれをコードするＤ
ＮＡ配列に関する。

【０００２】背景技術食用キノコの抗腫瘍性物質に関する研究は以前から多く
行われてきている。

【０００３】例えば、特開昭５２−６１２１４号、特開
昭５５−７４７９７号、特開昭６１−２９３９２３号、
特公昭６１−４７５１８号、特公昭６１−４７５１９
号、特公平３−２６１７２号、特開平５−７０３６２号
および特開平６−８０６９９号には、キノコ類由来の抗
腫瘍性多糖類および糖タンパク質が記載されている。ま
た、これ以外にもキノコ類を経口投与し、抗腫瘍活性が
認められたとの報告がなされている。

【０００４】しかし、本発明者らが知る限り、ガン細胞
に直接作用するマツタケ（Tricholo ma matsutake）由来
の抗腫瘍タンパク質のアミノ酸配列およびこれをコード
するＤＮＡ配列は報告されていない。

【０００５】

【発明の概要】今般、本発明者らは、マツタケ由来の抗
腫瘍タンパク質を精製しこのタンパク質をコードするｃ
ＤＮＡおよびそのアミノ酸配列を決定した。また、該タ
ンパク質をコードするｃＤＮＡを単離し、そのｃＤＮＡ
配列を含んだベクターで大腸菌を形質転換し、抗腫瘍タ
ンパク質を発現させることに成功した。本発明はかかる
知見に基づくものである。

【０００６】従って、本発明は、抗腫瘍タンパク質、該
タンパク質をコードする塩基配列、該塩基配列を含んで
なるベクター、該ベクターによって形質転換された宿主
細胞、該タンパク質等の製造法、および該タンパク質に
対する抗体の提供をその目的とする。

【０００７】そして、本発明によるタンパク質は、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列、または（ｂ）１以上
のアミノ酸が付加および／または挿入され、および／ま
たは１以上のアミノ酸が置換および／または欠失された
配列番号１のアミノ酸配列であって、抗腫瘍活性を有す
るアミノ酸配列、を有するもの、である。

【０００８】

【発明の具体的説明】タンパク質本発明によるタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列
を有する。配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク
質は後記実施例に記載されるように抗腫瘍活性を有す
る。

【０００９】本発明によるタンパク質としては、配列番
号１のアミノ酸配列からなり、前記配列番号１のアミノ
酸配列に１以上のアミノ酸が付加および／または挿入さ
れ、および／または前記配列番号１のアミノ酸配列の１
以上のアミノ酸が置換および／または欠失され、前記改
変アミノ酸配列が抗腫瘍活性を有するものが挙げられ
る。ここにいう付加、挿入、置換、および欠失とは、配
列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質の抗腫瘍活
性を損なわないようなものをいう。付加、挿入、置換、
欠失の数は、抗腫瘍活性を損なわなければ特に限定され
るものではないが、通常は１〜８個程度であることがで
きる。

【００１０】アミノ酸配列中における付加、挿入、置
換、および欠失は、例えば、Molecular Cloning (A lab
oratory manual), second edition, Cold Spring Harbo
r Laboratory Press, Vol.2, Chap. 15(1989); Botstei
n, D. et al., Science, 229:1193(1985); Craik, C.S,
Bio Techniques, 3:12(1985); Itakura, K. et al., A
nnu. Rev. Biochem. 53:323(1984); Shortle, D. et a
l., Annu. Rev. Genet. 15:265(1981); Smith, M. Ann
u, Rev. Genet. 19:423(1985) に従って得ることができ
る。

【００１１】本発明において、「抗腫瘍活性を有するタ
ンパク質」とは、当業者により抗腫瘍活性が認められた
と評価されるタンパク質をいい、例えば、実施例１
（３）と同様の条件において実験した場合に抗腫瘍活性
が認められたと評価されるタンパク質を意味するものと
する。

【００１２】配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパ
ク質の分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で約６５
ｋＤａである。

【００１３】配列番号１のアミノ酸配列は、例えば、そ
のｃＤＮＡ配列（配列番号２のＤＮＡ配列）を細菌等に
おいて常法に従って発現させることによって得ることが
できる。ｃＤＮＡ配列は抗腫瘍活性を有するタンパク質
に対する抗体をプローブとして用い、マツタケ由来のｃ
ＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって
得ることができる（実施例２）。本発明によるタンパク
質は、抗腫瘍活性を有する。従って、子宮頚ガン、子宮
体ガン、ガン抑制遺伝子ｐ５３やｐＢＲの発現異常に起
因する各種ガン（皮膚ガン、肺ガン、肝臓ガン、腎臓ガ
ン、乳ガン等）の治療剤として用いることができる。

【００１４】本発明による治療剤は、また、経口または
非経口投与（例えば、筋注、静注、皮下投与、直腸投
与、経皮投与、経鼻投与など）することができ、薬剤と
して経口または非経口投与に適した種々の剤型で、ヒト
およびヒト以外の動物に使用される。薬剤として直接患
部に到達させる方法（例えば、局所で溶解する錠剤、塗
布、注射等）が有効であると考えられる。

【００１５】治療剤は、例えばその用途に応じて、錠
剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、細粒剤、トロー
チ錠などの該タンパク質の安定性とドラッグデリバリー
経路を勘案した経口剤、静注および筋注などの注射剤、
直腸投与剤、油脂性坐剤、水溶性坐剤などのいずれかの
製剤形態に調製することができる。これらの各種製剤
は、通常用いられている賦形剤、例えば、増量剤、結合
剤、湿潤化剤、崩壊剤、表面活性剤、潤滑剤、分散剤、
緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無
痛化剤、安定化剤などを用いて常法により製造すること
ができる。

【００１６】種々の治療のための投与量は、用法、患者
の年齢、性別、症状の程度などを考慮して適宜決定され
る。

【００１７】塩基配列本発明によれば、本発明によるタンパク質をコードする
塩基配列が提供される。この塩基配列の典型的配列は、
配列番号２のＤＮＡ配列の一部または全部を有するもの
である。この塩基配列の典型的配列は、また、配列番号
２のＤＮＡ配列の一部または全部を有するものである。

【００１８】配列番号２のＤＮＡ配列は、前記のように
マツタケ由来のｃＤＮＡライブラリーから得られたもの
である。このＤＮＡ配列は、前記タンパク質のオープン
リーディングフレームを含み、オープンリーディングフ
レームは１〜３番のＡＴＧから始まり、１６９９〜１７
０１番のＴＡＡで終了する。

【００１９】本発明によるタンパク質のアミノ酸配列が
与えられれば、それをコードする塩基配列は容易に定ま
り、配列番号１に記載されるアミノ酸配列をコードする
種々の塩基配列を選択することができる。

【００２０】従って、本発明によるタンパク質をコード
する塩基配列とは、配列番号２に記載のＤＮＡ配列の一
部または全部に加え、同一のアミノ酸をコードするＤＮ
Ａ配列であって縮重関係にあるコドンをＤＮＡ配列とし
て有する配列をも意味するものとし、更にこれらに対応
するＲＮＡ配列も含まれる。

【００２１】本発明による塩基配列は、天然由来のもの
であっても、全合成したものであってもよい。また、天
然物由来のものの一部を利用して合成を行ったものであ
ってもよい。塩基配列は、染色体ライブラリーまたはｃ
ＤＮＡライブラリーから遺伝子工学の分野で慣用されて
いる方法、例えば部分アミノ酸配列の情報を基にして作
成した適当なＤＮＡプローブを用いてスクリーニングを
行う方法、等によって得ることができる。本発明による
塩基配列は、例えば、マツタケｃＤＮＡライブラリーか
ら配列番号３〜１８のいずれかに示されたペプチドに対
応するオリゴヌクレオチドをスクリーニングの際のプロ
ーブとして用いることによって得ることができる。

【００２２】塩基配列が天然由来のものである場合、そ
の起源は特に限定されず、マツタケ由来のものであって
も、それ以外を由来とするものであってもよい。

【００２３】ベクターおよび形質転換本発明によれば、前記の本発明による塩基配列を、ベク
ターが宿主細胞内で複製可能な状態で、かつその塩基配
列がコードするタンパク質を発現可能な状態で含むベク
ターが提供される。更に、本発明によれば、このベクタ
ーによって形質転換された宿主細胞が提供される。この
宿主−ベクター系は特に限定されず、また、他のタンパ
ク質との融合タンパク質発現系などを用いることができ
る。

【００２４】融合タンパク質発現系としては、β−ガラ
クトシダーゼ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラー
ゼ、ルシフェラーゼ等との融合タンパク質が挙げられ
る。

【００２５】ベクターとしては、プラスミドベクター
（例えば、pBluescript SK(-) 、pBluescript SK(+) 、
ｐＧＥＸ−４Ｔ、ｐＧＥＸ−５Ｔ、ｐＲＩＴ２Ｔ、ｐＢ
ＰＶ、およびｐＳＶＫ３（以上ファルマシア社等）、Ｚ
ＡＰＥｘｐｒｅｓｓ、ｐＹＥＵｒａ３、ｐＭＡＭ、お
よびｐＯＧ（以上東洋紡社等）、ｐＥＴ−１１ａ〜ｄ、
ｐＥＴ２０ｂ、ｐＥＴ２８ａ〜ｃ、およびｐＥＴ−３２
ａ〜ｂ（以上Novagen 社）、ｐＱＥ−１０、１６、３
０、４０、５０、６０、および７０（以上Qiagen社））
やウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクタ
ー、アデノウイルスベクター）、リポソームベクター
（例えば、カチオニックリポソームベクター）が挙げら
れる。

【００２６】本発明によるベクターは、これを実際に宿
主細胞に導入して所望のタンパク質を発現させるために
は、前記の本発明による塩基配列の他に、その発現を制
御する配列（例えば、プロモーター配列、ターミネータ
ー配列、エンハンサー配列）や宿主細胞を選択するため
の遺伝子マーカー（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、
カナマイシン耐性遺伝子）等を含んでいてもよい。ま
た、このベクターは、本発明による塩基配列を反復した
形で（例えば、タンデムで）含んでいてもよい。これら
は常法に従いベクターに導入してよく、このベクターに
よる宿主細胞の形質転換の方法も、この分野で慣用され
ているものを用いることができる。

【００２７】本発明によるベクター構築の手順および方
法は、遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いる
ことができる。

【００２８】また、宿主細胞としては、例えば、大腸菌
（例えば、ＳＯＬＲ、ＪＭ１０９、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ
ＭＲＦ’、およびＢＬ２１（ＤＥ３））、酵母（例え
ば、ＹＲＧ−２株）、枯草菌、動物由来の細胞（ＣＨＯ
細胞、ＣＯＳ細胞、ヒトケラチノサイト、ＣＯＰ−５、
Ｃ１２７、マウス３Ｔ３細胞、ＦＲ３Ｔ３、ＨＢ１０１
等）が挙げられる。上記形質転換された宿主細胞を適当
な培地で培養し、その培養物から上記した本発明による
タンパク質を得ることができる。従って、本発明の別の
態様によれば、本発明によるタンパク質の製造法が提供
される。この方法により、抗腫瘍タンパク質を大量に生
産することができる。

【００２９】形質転換された宿主細胞の培養およびその
条件は、使用する細胞についてのそれと本質的に同様で
あってよい。また、培養液からの本発明によるタンパク
質の回収、精製も常法に従って行うことができる（後記
実施例参照）。例えば、イオン交換クロマトグラフィ
ー、ゲル濾過クロマトグラフィー、および免疫アフィニ
ティークロマトグラフィーのようなクロマトグラフィー
法を使用することができる。

【００３０】抗体本発明によれば、本発明によるタンパク質に対する抗体
が提供される。本発明において、抗体は、ポリクローナ
ル抗体およびモノクローナル抗体を含む。

【００３１】本発明による抗体は、当業界において慣用
されている方法によって製造することができる。例え
ば、配列番号１に記載されるタンパク質を、任意の担体
（例えば、フロイント完全および不完全アジュバンド）
とともに動物体内（例えば、ウサギ、ラット、マウス）
に注射し、一定期間の後に、その動物の血清を精製する
ことによって得ることができる。

【００３２】このポリクローナル抗体の特異的な反応
（すなわち、免疫反応）は、抗腫瘍タンパク質の存在の
１つの指標となる。従って、本発明による抗体は抗腫瘍
タンパク質の精製やスクリーニングに用いることができ
る。

【００３３】

【実施例】本発明を以下の実施例によって詳細に説明す
るが、本発明はこれらに限定されるものではない。実施例１抗腫瘍タンパク質の精製（１）タンパク質の精製市販されている（あるいは自生している）新鮮なマツタ
ケを常法により破砕して、カラムクロマトグラフィー、
HPLC、電気泳動等を用いる精製手段によって抗腫瘍作用
を有するタンパク質を得た。具体的には下記のように行
った。

【００３４】トリス緩衝液にＮａＣｌとプロテアーゼイ
ンヒビターとを含む溶液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＰＭ
ＳＦ、１ｍＭＥＤＴＡ、０．１ｍＭＩＡＡ（ヨード
アセトアミド）、１μｇ／ｍｌペプスタチンＡ、およ
び１μｇ／ｍｌロイペプチン）でタンパク質の粗抽出
をおこない、硫安沈殿処理（９０％飽和硫安）をおこな
った。硫安による沈殿を２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）（プロテアーゼインヒビター（ＰＩ）は
前記の１０分の１、以下同様）に対して透析し脱塩し
た。次いで、ＤＥＡＥトヨパール（イオン交換クロマ
トグラフティー）、活性画分の濃縮、フェニルセファロ
ース（疎水クロマトグラフティー）による精製、活性画
分の濃縮、ＨＰＬＣ（ＴＳＫｇｅｌＧ３０００Ｓ
Ｗ）によるゲル濾過を行い、該タンパク質を精製した。

【００３５】イオン交換クロマトグラフィーおよび疎水
クロマトグラフィーは、２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐ
Ｈ７．５）（ＰＩを含む）で溶出した。直線濃度勾配
は、それぞれＮａＣｌと（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄を用いた。
ゲル濾過は、０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．
２）バッファー中０．１ＭＮａ₂ＳＯ₄，およびＰＩ
を含む溶液で溶出した。

【００３６】ＨＰＬＣによりゲル濾過をおこなったサン
プルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。ゲル上のタンパク質
ＰＶＤＦ膜に転写したのち、ＣＢＢ染色して一本のバン
ド（約６５ｋＤａ）を検出した。

【００３７】なお、新鮮でないマツタケを用いた場合や
プロテアーゼインヒビターを精製工程において用いなか
った場合には、収率が低下し、後記する抗腫瘍活性も低
下することを本発明等は確認した。

【００３８】また、一部のサンプルについては、ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ後、ゲルをＣＢＢで染色し、ゲルを切りだし
て、電気抽出法でサンプルを回収した。このサンプルは
アミノ酸配列の決定（実施例２）に用いた。

【００３９】また、後記（２）の抗体をCNBr-activated
Sepharose 6MB樹脂（ファルマシア社）に結合させたカ
ラムを用いてアフィニティークロマトグラフィーを行
い、タンパク質を精製できることを確認した。

【００４０】（２）ポリクローナル抗体（１）で精製したタンパク質をウサギに免疫して抗血清
を調製した。具体的に下記のように行った。

【００４１】精製した該タンパク質１５μｇをフロント
の完全アジュバンドと混和し、強く攪拌してエマルショ
ンとした後、ウサギの背皮下に注射した。３週間後、該
タンパク質１５０μｇをフロイント不完全アジュバンド
と混和してエマルションとし、追加免疫をおこなった。
２週間後、抗原５０μｇを用いて直接ブースター免疫を
おこない、１週間後、耳から採血をした。

【００４２】次いで、５ｍｌ抗血清を５６℃で３０分間
処理した後、ＰＢＳ（−）を５ｍｌ加え、飽和（Ｎ
Ｈ₄）₂ＳＯ₄を等量加え、氷水中に静置した。遠心後
沈殿をナトリウム・リン酸緩液に再溶解し、２０％（Ｎ
Ｈ₄）₂ＳＯ₄になるように飽和（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄を
加えた。遠心後、上清を集め、３３％（ＮＨ₄）₂ＳＯ
₄になるように飽和（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄を加え、遠心
後、沈殿を集め、再溶解した。透析および脱塩の後、イ
オン交換クロマトグラフィー（ＤＥ５２樹脂）にかけて
ＩｇＧ画分とした。

【００４３】（３）抗腫瘍活性試験マウスやヒトの細胞をガン化することが知られているシ
ミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、ヒトパピローマウイ
ルス（ＨＰＶ）によってガン化した細胞に対して、その
致死作用を調べた。具体的には、細胞死をもって抗腫瘍
活性を測定した。上記（１）で精製したタンパク質を細
胞に与えた場合に５０％の細胞を死に至らしめるタンパ
ク質量はＳＶＴ２細胞（ＳＶ４０形質転換細胞）では１
０ｎｇ／ｍｌ、Ａ３１（ＳＶ４０形質転換細胞）では１
００ｎｇ／ｍｌ、ヒト包皮細胞（ＨＰＶ１６形質転換）
では１５−２０ｎｇ／ｍｌであった。

【００４４】実施例２ｃＤＮＡクローニングおよび配
列決定プロテインシークエンサー（ヒューレットパッカード
社）を用いて、実施例１で精製したタンパク質のＮ末端
アミノ酸配列（配列番号３および４）を決定した。

【００４５】さらに、実施例１で得られたタンパク質を
リシルエンド酵素（又は更にポストプロリンクリーベイ
ジ酵素）で分解して多くのペプチドフラグメントを調製
し、それらのうちの１４個のペプチドフラグメントのア
ミノ酸配列を決定した（配列番号５〜１８）。

【００４６】一方、マツタケのmRNAをｏｌｉｇｏ−ｄＴ
Ｌａｔｅｘ（ｏｌｉｇｏ−ｄＴ粒子）（タカラ社）を
用いて精製し、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥＺＡＰ−ｃＤＮ
ＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ（販売元：東洋紡社）を
用いて精製し、cDNAを合成した。ｃＤＮＡ合成後、ギガ
パックIII ゴールド（ストラタジーン社、販売元：東洋
紡社）を用いて、ｃＤＮＡをラムダファージにin vitro
パッケージングしてファージライブラリーを作成した。

【００４７】実施例１の（２）で得られた抗体をプロー
ブとして、ファージライブラリーから抗腫瘍タンパク質
の遺伝子をもつファージをスクリーニングし、２１個の
陽性ファージを得た。具体的には以下のようにして行っ
た。

【００４８】ライブラリーの濃度を知るために、タイタ
ーを測定した。１５０ｍｍＮＺＹＭ培地のプレート
に、約２，０００から２０，０００個のファージと６０
０ｕｌのＥ．Ｃｏｌｉ（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ）宿主を６ｍ
ｌのＮＺＹＭＴｏｐＡｇａｒ（０．７％）と共にプ
レーティングした。４２℃で３〜４時間プラークが１ｍ
ｍ程の適当な大きさになるまで培養した。１０ｍＭＩ
ＰＴＧをしみ込ませた１３０−１４０ｍｍのニトロセル
ロース膜をプレートにのせ、３７℃で３時間培養した。
プレートを１時間以上４℃で冷やした後、ニトロセルロ
ースフィルターをプレートからはがし、３％スキムミル
クを含むＴＢＳ−Ｔ緩衝液にてしんとうした。

【００４９】次いで、１次抗体（実施例１の（２））の
緩衝液にフィルターをひたし、３％スキムミルクを含む
ＴＢＳ−Ｔ緩衝液にてゆるやかに振盪した。アルカリフ
ォスファターゼ（ＡＰ）結合２次抗体の緩衝液にフィル
ターをひたした後、ＴＢＳ−Ｔ緩衝液で洗浄した。アル
カリフォスファターゼ（ＡＰ）用緩衝液で洗浄した後、
陽性ファージを検出した。

【００５０】得られた陽性ファージを用いて大腸菌 SOL
R 株( ストラタジーン社) をin vivo Excision法によっ
て形質転換した。形質転換は、ストラタジーン社のＺＡ
Ｐ−ｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ（販売元：
東洋紡社）を用いて、その使用説明書に従って、行っ
た。

【００５１】この形質転換体から、図１に示されるプラ
スミドｐＴＳ１８を得た。なお、プラスミドｐＴＳ１８
（配列番号１のｃＤＮＡ配列を含む）は実施例３におい
て発現ベクターとして用いた。

【００５２】このｐＴＳ１８を Exo/Mung DNA Sequenci
ng System （ストラタジーン社）を用いてディレーショ
ンしたのち両端を平滑末端にし、ｓｅｌｆ−ＤＮＡにラ
イゲーションした（図２）。次いで、大腸菌 JM 109
（東洋紡社）をディレーションしたプラスミドDNA で形
質転換した。これらのディレーション変異が挿入された
遺伝子部分の塩基配列を、ABI PRISM Cycle Sequencing
Kit （パーキンエルマー社）を用いて、センス鎖とア
ンチセンス鎖の全塩基配列を解読した。

【００５３】解読した塩基配列の情報をつなぎ合わせ
て、抗腫瘍タンパク質のアミノ酸配列とｃＤＮＡ配列を
得た（配列番号２）。推定分子量は約６２ｋＤａであっ
た。

【００５４】Ｎ末端のアミノ酸配列（配列番号３および
４）は、配列番号１の２〜３０番のアミノ酸配列および
２〜５８番のアミノ酸配列と、それぞれ一致した。

【００５５】さらに、ペプチドフラグメントの配列（配
列番号５〜１８）が配列番号１に示したアミノ酸配列と
それぞれ一致した。対応関係は下記のとおりであった。

【００５６】配列番号５：配列番号１の５９〜７７番、
配列番号６：配列番号１の８９〜１４９番、配列番号
７：配列番号１の１５０〜１７８番、配列番号８：配列
番号１の１７９〜２０９番、配列番号９：配列番号１の
２１０〜２６７番、配列番号10：配列番号１の２６８〜
２９７番、配列番号11：配列番号１の２９８〜３５５
番、配列番号12：配列番号１の３５６〜４０６番、配列
番号13：配列番号１の４０７〜４３６番、配列番号14：
配列番号１の４３７〜４８６番、配列番号15：配列番号
１の４８７〜５２１番、配列番号16：配列番号１の５２
２〜５５４番、配列番号17：配列番号１の５５５〜５６
６番、配列番号１８：配列番号１の７８〜９９番。これ
らのペプチドは、抗腫瘍タンパク質のスクリーニングお
よび精製に用いることができる抗腫瘍タンパク質に対す
る抗体を得るための抗原として有用である。

【００５７】実施例３抗腫瘍タンパク質の製造（１） −８０℃のコンピテント細胞（ＪＭ１０９株：東洋紡
社）を融解して、Ｆａｌｃｏｎチューブ（コード２０５
９）にその１００μｌを移した。ｐＴＳ１８のディレー
ションクローン（実施例２）を加え氷中３０分間放置し
た。ヒートショック（４２℃）を３０秒間与え、氷中２
分間冷却した。ＳＯＣ培地を９００μｌ加え、３７℃で
１時間振とう培養した。ＬＢ／Ａｍｐプレートに適量播
種し、３７℃で一晩培養した。次にプレート上に現れた
コロニーから一白金耳かきとって液体ＬＢ培地（Ａｍｐ
を含む）に接種し、３７℃で６６０ｎｍの吸収（Ａｂｓ
６６０）が約０．２になるまで培養した。ＩＰＴＧを最
終１０ｍＭまで加え、Ａｂｓ６６０＝約１になるまで培
養して集菌した。

【００５８】菌体を実施例１の（１）で使用したＰＩを
含む、抽出液に（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ
７．５）懸濁し、超音波で破壊した。抽出液を（５０ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ）遠心し、上清を集め、実施例１
の（２）の抗体を結合させたアフィニティークロマトグ
ラフィー（CNBr-activated Sepharose 6MB樹脂、ファル
マシア社）にかけ、溶出液にて回収した。

【００５９】溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、実施例
１の（２）の抗体でウエスタンブロット解析を行った。
その結果、本発明によるタンパク質が発現されているこ
とが確認された。

【００６０】実施例４抗腫瘍タンパク質の製造（２）（１）発現ベクターｐＥＴ−２８ａの調製抗腫瘍タンパク質をコードするＤＮＡ断片を、プラスミ
ドｐＴＳ１８（１０ｎｇ）（実施例２）を鋳型ＤＮＡと
して用いてポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）によって
得た。ＰＣＲ反応を市販キット（タカラ社）の試薬およ
び下記プライマー１および２（それぞれ５ｐｍｏｌｅ）
を用いて使用説明書に基づいて実施した。プライマー1:GAGAGACCATGGGGTATCGTCTTTCC (配列番号1
9) プライマー2:GAGAGAGGATCCGGAGACGCCAAGGAT ( 配列番号
20) ＰＣＲ反応後、生成物をＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩによ
って切断した。生じた断片（０．１μｇ）をｐＥＴ−２
８ａベクター（０．５μｇ）（Ｎｏｖａｇｅｎ社）のＮ
ｃｏＩ／ＢａｍＩ部位に連結した。生じたＤＮＡ構築物
をコンピテント細胞（大腸菌、ＤＨ５αおよびＪＭ１０
９株；東洋紡社）に導入した。これら形質転換細胞から
収集したプラスミドＤＮＡをさらにコンピテント細胞
（ＢＬ２１（ＤＥ３）株；Ｎｏｖａｇｅｎ社）に導入し
た。

【００６１】（２）発現ベクターｐＥＴ−２８ｂの調製抗腫瘍タンパク質をコードするＤＮＡ断片を、プラスミ
ドｐＴＳ１８（実施例２）をＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ
で切断し、ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ断片を収集することに
より調製した。生じた断片（０．１μｇ）をｐＥＴ−２
８ｂベクター（０．５μｇ）（Ｎｏｖａｇｅｎ社）のＥ
ｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ部位に連結した。生じたＤＮＡ構築
物をコンピテント細胞（大腸菌、ＤＨ５αおよびＪＭ１
０９株；東洋紡社）に導入した。これら形質転換細胞か
ら収集したプラスミドＤＮＡをさらにコンピテント細胞
（ＢＬ２１（ＤＥ３）株；Ｎｏｖａｇｅｎ社）に導入し
た。

【００６２】（３）抗腫瘍タンパク質遺伝子の発現一白金耳の上記実施例４（１）および（２）において記
載されるように得られた形質転換細胞（ｐＥＴ−２８ａ
を有するＢＬ２１（ＤＥ３）株およびｐＥＴ−２８ｂを
有するＢＬ２１（ＤＥ３）株）を５０μｇ／ｍｌカナマ
イシンを含有するＮＺＹＭ培地（１ｍｌ）に接種し、３
７℃で一晩前培養した。培養後の培地から１００μｌを
取り出し、これを５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有す
るＮＺＹＭ培地（１０ｍｌ）に接種し、Ａｂｓ６００が
約０．４となるまで２５℃にて培養した。ＩＰＴＧを最
終濃度で１．０ｍＭ加えた後、２４時間培養した。細胞
を培養培地から収集し、実施例１（１）において用いた
ＰＩを含む抽出液（２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ
７．０）に懸濁し、超音波で破砕した。

【００６３】抽出液を遠心した後、沈殿物を回収した。
この沈殿物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分析した。その結
果、単一のバンドが６５ｋＤａの位置に観察された。沈
殿物をまた実施例１（２）に記載された抗体を用いてウ
エスタンブロッティングにより分析した。免疫反応がＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて観察されたタンパク質のバ
ンドと同じ位置に観察された。この結果は、抗腫瘍遺伝
子が宿主細胞において発現されたことを示す。

【００６４】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：５６６配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列 Met Pro Ile Arg Leu Ser Lys Glu Lys Ile Asn Asp Leu Leu Gln Arg 1 5 10 15 Ser Gln Gly Asp Leu Thr Ser Ser Gln His Glu Ile Val His Phe Thr 20 25 30 Asp Val Phe Ile Ala Gly Ser Gly Pro Ile Ser Cys Thr Tyr Ala Arg 35 40 45 His Ile Ile Asp Asn Thr Ser Thr Thr Lys Val Tyr Met Ala Glu Ile 50 55 60 Gly Ser Gln Asp Asn Pro Val Ile Gly Ala His His Lys Asn Ser Ile 65 70 75 80 Lys Phe Gln Lys Asp Ile Asp Lys Phe Val Asn Ile Ile Asn Gly Ala 85 90 95 Leu Gln Pro Ile Ser Ile Ser Pro Ser Asp Thr Tyr Gln Pro Thr Leu 100 105 110 Ala Val Ala Ala Trp Ala Pro Pro Ile Asp Pro Ala Glu Gly Gln Leu 115 120 125 Val Ile Met Gly His Asn Pro Asn Gln Glu Ala Gly Leu Asn Leu Pro 130 135 140 Gly Ser Ala Val Thr Arg Thr Val Gly Gly Met Ala Thr His Trp Thr 145 150 155 160 Cys Ala Cys Pro Thr Pro His Asp Glu Glu Arg Val Asn Asn Pro Val 165 170 175 Asp Lys Gln Glu Phe Asp Ala Leu Leu Glu Arg Ala Lys Thr Leu Leu 180 185 190 Asn Val His Ser Asp Gln Tyr Asp Asp Ser Ile Arg Gln Ile Val Val 195 200 205 Lys Glu Thr Leu Gln Gln Thr Leu Asp Ala Ser Arg Gly Val Thr Thr 210 215 220 Leu Pro Leu Gly Val Glu Arg Arg Thr Asp Asn Pro Ile Tyr Val Thr 225 230 235 240 Trp Thr Gly Ala Asp Thr Val Leu Gly Asp Val Pro Lys Ser Pro Arg 245 250 255 Phe Ala Leu Val Thr Glu Thr Arg Val Thr Lys Leu Ile Val Ser Glu 260 265 270 Thr Asn Pro Thr Gln Val Val Ala Ala Leu Leu Arg Asn Leu Asn Thr 275 280 285 Ser Asn Asp Glu Leu Val Val Ala Lys Ser Phe Val Ile Ala Cys Gly 290 295 300 Ala Val Cys Thr Pro Gln Ile Leu Trp Asn Ser Asn Ile Arg Pro Tyr 305 310 315 320 Ala Leu Gly Arg Tyr Leu Ser Glu Gln Ser Met Thr Phe Cys Gln Ile 325 330 335 Val Leu Lys Arg Gly Ile Val Asp Ala Ile Ala Thr Asp Pro Arg Phe 340 345 350 Ala Ala Lys Val Glu Ala His Lys Lys Lys His Pro Asp Asp Val Leu 355 360 365 Pro Ile Pro Phe His Glu Pro Glu Pro Gln Val Met Ile Pro Tyr Thr 370 375 380 Ser Asp Phe Pro Trp His Val Gln Val His Arg Asp Ala Phe Ser Tyr 385 390 395 400 Gly Asp Val Gly Pro Lys Ala Asp Pro Arg Val Val Val Asp Leu Arg 405 410 415 Phe Phe Gly Lys Ser Asp Ile Val Glu Glu Asn Arg Val Thr Phe Gly 420 425 430 Pro Asn Pro Lys Leu Arg Glu Trp Glu Ala Gly Val Thr Asp Thr Tyr 435 440 445 Gly Met Pro Gln Pro Thr Phe His Val Lys Arg Thr Asn Ala Asp Gly 450 455 460 Asp Arg Asp Gln Arg Met Met Asn Asp Met Thr Asn Val Ala Asn Met 465 470 475 480 Leu Gly Gly Tyr Leu Pro Gly Ser Tyr Pro Gln Phe Met Ala Pro Gly 485 490 495 Leu Val Leu His Ile Thr Gly Thr Thr Arg Ile Gly Thr Asp Asp Gln 500 505 510 Thr Ser Val Ala Asp Pro Thr Ser Lys Val His Asn Phe Asn Asn Leu 515 520 525 Trp Val Gly Gly Asn Gly Cys Ile Pro Asp Ala Thr Ala Cys Asn Pro 530 535 540 Thr Arg Thr Ser Val Ala Tyr Ala Leu Lys Gly Ala Glu Ala Val Val 545 550 555 560 Asn Tyr Leu Gly Val Ser * 565

【００６５】配列番号：２配列の長さ：１７０１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡｔｏｍＲＮＡ配列 ATG CCG ATA CGT CTT TCC AAA GAA AAA ATC AAC GAC CTG CTG CAA CGT 48 Met Pro Ile Arg Leu Ser Lys Glu Lys Ile Asn Asp Leu Leu Gln Arg 1 5 10 15 TCT CAA GGG GAT CTT ACT TCC TCG CAA CAC GAA ATT GTA CAT TTC ACT 96 Ser Gln Gly Asp Leu Thr Ser Ser Gln His Glu Ile Val His Phe Thr 20 25 30 GAT GTT TTC ATT GCT GGC AGT GGT CCC ATT AGC TGT ACT TAC GCC CGC 144 Asp Val Phe Ile Ala Gly Ser Gly Pro Ile Ser Cys Thr Tyr Ala Arg 35 40 45 CAC ATC ATT GAC AAT ACC TCA ACT ACA AAG GTT TAC ATG GCC GAA ATA 192 His Ile Ile Asp Asn Thr Ser Thr Thr Lys Val Tyr Met Ala Glu Ile 50 55 60 GGT TCT CAA GAT AAC CCT GTC ATC GGG GCC CAT CAC AAG AAC TCC ATA 240 Gly Ser Gln Asp Asn Pro Val Ile Gly Ala His His Lys Asn Ser Ile 65 70 75 80 AAG TTT CAG AAA GAC ATT GAC AAG TTT GTG AAT ATC ATC AAC GGT GCC 288 Lys Phe Gln Lys Asp Ile Asp Lys Phe Val Asn Ile Ile Asn Gly Ala 85 90 95 CTC CAG CCG ATT TCG ATT TCG CCA TCG GAC ACC TAC CAG CCC ACT CTC 336 Leu Gln Pro Ile Ser Ile Ser Pro Ser Asp Thr Tyr Gln Pro Thr Leu 100 105 110 GCT GTA GCA GCG TGG GCG CCG CCC ATC GAT CCT GCC GAA GGC CAG CTC 384 Ala Val Ala Ala Trp Ala Pro Pro Ile Asp Pro Ala Glu Gly Gln Leu 115 120 125 GTG ATT ATG GGA CAC AAT CCG AAT CAG GAG GCC GGC CTG AAC CTT CCC 432 Val Ile Met Gly His Asn Pro Asn Gln Glu Ala Gly Leu Asn Leu Pro 130 135 140 GGT AGC GCT GTC ACT AGG ACA GTC GGG GGG ATG GCG ACC CAC TGG ACT 480 Gly Ser Ala Val Thr Arg Thr Val Gly Gly Met Ala Thr His Trp Thr 145 150 155 160 TGC GCG TGT CCT ACT CCA CAT GAC GAA GAG AGG GTC AAC AAC CCA GTT 528 Cys Ala Cys Pro Thr Pro His Asp Glu Glu Arg Val Asn Asn Pro Val 165 170 175 GAC AAG CAG GAG TTC GAC GCA CTG CTC GAA CGT GCT AAA ACA TTG CTC 576 Asp Lys Gln Glu Phe Asp Ala Leu Leu Glu Arg Ala Lys Thr Leu Leu 180 185 190 AAC GTT CAC AGC GAC CAG TAC GAC GAT TCT ATC CGT CAG ATA GTT GTC 624 Asn Val His Ser Asp Gln Tyr Asp Asp Ser Ile Arg Gln Ile Val Val 195 200 205 AAA GAG ACT CTT CAG CAG ACC CTT GAT GCG TCG CGG GGT GTG ACC ACT 672 Lys Glu Thr Leu Gln Gln Thr Leu Asp Ala Ser Arg Gly Val Thr Thr 210 215 220 CTC CCG CTG GGG GTG GAG CGC CGT ACG GAC AAT CCT ATT TAT GTC ACC 720 Leu Pro Leu Gly Val Glu Arg Arg Thr Asp Asn Pro Ile Tyr Val Thr 225 230 235 240 TGG ACC GGT GCC GAT ACC GTC CTT GGT GAT GTG CCG AAG AGT CCC CGA 768 Trp Thr Gly Ala Asp Thr Val Leu Gly Asp Val Pro Lys Ser Pro Arg 245 250 255 TTC GCT TTG GTT ACA GAG ACG AGA GTG ACG AAG CTT ATT GTC AGT GAA 816 Phe Ala Leu Val Thr Glu Thr Arg Val Thr Lys Leu Ile Val Ser Glu 260 265 270 ACC AAT CCG ACG CAG GTT GTT GCT GCG TTG CTA CGT AAC TTG AAT ACA 864 Thr Asn Pro Thr Gln Val Val Ala Ala Leu Leu Arg Asn Leu Asn Thr 275 280 285 AGC AAC GAT GAA CTT GTC GTG GCC AAG AGT TTC GTC ATA GCT TGT GGA 912 Ser Asn Asp Glu Leu Val Val Ala Lys Ser Phe Val Ile Ala Cys Gly 290 295 300 GCA GTC TGC ACA CCG CAA ATC TTG TGG AAC AGC AAC ATC CGC CCA TAT 960 Ala Val Cys Thr Pro Gln Ile Leu Trp Asn Ser Asn Ile Arg Pro Tyr 305 310 315 320 GCG CTT GGT CGC TAC CTC AGC GAA CAG TCC ATG ACT TTT TGT CAG ATC 1008 Ala Leu Gly Arg Tyr Leu Ser Glu Gln Ser Met Thr Phe Cys Gln Ile 325 330 335 GTT CTC AAG AGG GGC ATA GTC GAT GCC ATC GCT ACT GAC CCT CGC TTC 1056 Val Leu Lys Arg Gly Ile Val Asp Ala Ile Ala Thr Asp Pro Arg Phe 340 345 350 GCT GCG AAG GTT GAG GCG CAC AAG AAG AAG CAC CCC GAT GAC GTG CTG 1104 Ala Ala Lys Val Glu Ala His Lys Lys Lys His Pro Asp Asp Val Leu 355 360 365 CCC ATT CCA TTC CAC GAG CCT GAA CCT CAA GTG ATG ATT CCG TAC ACG 1152 Pro Ile Pro Phe His Glu Pro Glu Pro Gln Val Met Ile Pro Tyr Thr 370 375 380 TCG GAC TTC CCT TGG CAT GTT CAG GTG CAT CGC GAT GCA TTC TCA TAT 1200 Ser Asp Phe Pro Trp His Val Gln Val His Arg Asp Ala Phe Ser Tyr 385 390 395 400 GGT GAT GTT GGA CCC AAG GCC GAC CCG CGT GTT GTC GTC GAT CTG AGG 1248 Gly Asp Val Gly Pro Lys Ala Asp Pro Arg Val Val Val Asp Leu Arg 405 410 415 TTT TTC GGC AAA TCA GAT ATT GTC GAA GAA AAT CGA GTG ACT TTC GGT 1296 Phe Phe Gly Lys Ser Asp Ile Val Glu Glu Asn Arg Val Thr Phe Gly 420 425 430 CCG AAC CCT AAG CTA CGC GAG TGG GAA GCG GGT GTT ACA GAC ACT TAT 1344 Pro Asn Pro Lys Leu Arg Glu Trp Glu Ala Gly Val Thr Asp Thr Tyr 435 440 445 GGA ATG CCA CAG CCG ACA TTC CAT GTC AAG CGG ACC AAC GCC GAT GGA 1392 Gly Met Pro Gln Pro Thr Phe His Val Lys Arg Thr Asn Ala Asp Gly 450 455 460 GAC CGT GAC CAG AGG ATG ATG AAT GAT ATG ACC AAC GTC GCG AAC ATG 1440 Asp Arg Asp Gln Arg Met Met Asn Asp Met Thr Asn Val Ala Asn Met 465 470 475 480 CTG GGT GGG TAC CTT CCT GGC TCC TAC CCT CAA TTT ATG GCA CCT GGT 1488 Leu Gly Gly Tyr Leu Pro Gly Ser Tyr Pro Gln Phe Met Ala Pro Gly 485 490 495 CTC GTA CTG CAC ATC ACG GGA ACT ACT CGG ATC GGG ACA GAT GAT CAA 1536 Leu Val Leu His Ile Thr Gly Thr Thr Arg Ile Gly Thr Asp Asp Gln 500 505 510 ACT TCT GTT GCT GAT CCG ACA TCA AAG GTT CAT AAC TTC AAC AAT CTG 1584 Thr Ser Val Ala Asp Pro Thr Ser Lys Val His Asn Phe Asn Asn Leu 515 520 525 TGG GTC GGC GGG AAT GGG TGC ATT CCA GAT GCG ACT GCC TGC AAC CCG 1632 Trp Val Gly Gly Asn Gly Cys Ile Pro Asp Ala Thr Ala Cys Asn Pro 530 535 540 ACT CGT ACG AGC GTC GCG TAT GCG CTC AAG GGT GCT GAG GCT GTA GTC 1680 Thr Arg Thr Ser Val Ala Tyr Ala Leu Lys Gly Ala Glu Ala Val Val 545 550 555 560 AAT TAC CTT GGC GTC TCC TGA 1701 Asn Tyr Leu Gly Val Ser * 565

【００６６】配列番号：３配列の長さ：２９配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Pro Ile Arg Leu Ser Lys Glu Lys Ile Asn Asp Leu Leu Gln Arg Ser 1 5 10 15 Gln Gly Asp Leu Thr Ser Ser Gln His Glu Ile Val His 20 25

【００６７】配列番号：４配列の長さ：５７配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Pro Ile Arg Leu Ser Lys Glu Lys Ile Asn Asp Leu Leu Gln Arg Ser 1 5 10 15 Gln Gly Asp Leu Thr Ser Ser Gln His Glu Ile Val His Phe Thr Asp 20 25 30 Val Phe Ile Ala Gly Ser Gly Pro Ile Ser Cys Thr Tyr Ala Arg His 35 40 45 Ile Ile Asp Asn Thr Ser Thr Thr Lys 50 55

【００６８】配列番号：５配列の長さ：１９配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Val Tyr Met Ala Glu Ile Gly Ser Gln Asp Asn Pro Val Ile Gly Ala 1 5 10 15 His His Lys

【００６９】配列番号：６配列の長さ：６１配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Phe Val Asn Ile Ile Asn Gly Ala Leu Gln Pro Ile Ser Ile Ser Pro 1 5 10 15 Ser Asp Thr Tyr Gln Pro Thr Leu Ala Val Ala Ala Trp Ala Pro Pro 20 25 30 Ile Asp Pro Ala Glu Gly Gln Leu Val Ile Met Gly His Asn Pro Asn 35 40 45 Gln Glu Ala Gly Leu Asn Leu Pro Gly Ser Ala Val Thr 50 55 60

【００７０】配列番号：７配列の長さ：２９配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Arg Thr Val Gly Gly Met Ala Thr His Trp Thr Cys Ala Cys Pro Thr 1 5 10 15 Pro His Asp Glu Glu Arg Val Asn Asn Pro Val Asp Lys 20 25

【００７１】配列番号：８配列の長さ：３１配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Gln Glu Phe Asp Ala Leu Leu Glu Arg Ala Lys Thr Leu Leu Asn Val 1 5 10 15 His Ser Asp Gln Tyr Asp Asp Ser Ile Arg Gln Ile Val Val Lys 20 25 30

【００７２】配列番号：９配列の長さ：５８配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Glu Thr Leu Gln Gln Thr Leu Asp Ala Ser Arg Gly Val Thr Thr Leu 1 5 10 15 Pro Leu Gly Val Glu Arg Arg Thr Asp Asn Pro Ile Tyr Val Thr Trp 20 25 30 Thr Gly Ala Asp Thr Val Leu Gly Asp Val Pro Lys Ser Pro Arg Phe 35 40 45 Ala Leu Val Thr Glu Thr Arg Val Thr Lys 50 55

【００７３】配列番号：１０配列の長さ：３０配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Leu Ile Val Ser Glu Thr Asn Pro Thr Gln Val Val Ala Ala Leu Leu 1 5 10 15 Arg Asn Leu Asn Thr Ser Asn Asp Glu Leu Val Val Ala Lys 20 25 30

【００７４】配列番号：１１配列の長さ：５８配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Ser Phe Val Ile Ala Cys Gly Ala Val Cys Thr Pro Gln Ile Leu Trp 1 5 10 15 Asn Ser Asn Ile Arg Pro Tyr Ala Leu Gly Arg Tyr Leu Ser Glu Gln 20 25 30 Ser Met Thr Phe Cys Gln Ile Val Leu Lys Arg Gly Ile Val Asp Ala 35 40 45 Ile Ala Thr Asp Pro Arg Phe Ala Ala Lys 50 55

【００７５】配列番号：１２配列の長さ：５１配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Val Glu Ala His Lys Lys Lys His Pro Asp Asp Val Leu Pro Ile Pro 1 5 10 15 Phe His Glu Pro Glu Pro Gln Val Met Ile Pro Tyr Thr Ser Asp Phe 20 25 30 Pro Trp His Val Gln Val His Arg Asp Ala Phe Ser Tyr Gly Asp Val 35 40 45 Gly Pro Lys 50

【００７６】配列番号：１３配列の長さ：３０配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Ala Asp Pro Arg Val Val Val Asp Leu Arg Phe Phe Gly Lys Ser Asp 1 5 10 15 Ile Val Glu Glu Asn Arg Val Thr Phe Gly Pro Asn Pro Lys 20 25 30

【００７７】配列番号：１４配列の長さ：５０配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Leu Arg Glu Trp Glu Ala Gly Val Thr Asp Thr Tyr Gly Met Pro Gln 1 5 10 15 Pro Thr Phe His Val Lys Arg Thr Asn Ala Asp Gly Asp Arg Asp Gln 20 25 30 Arg Met Met Asn Asp Met Thr Asn Val Ala Asn Met Leu Gly Gly Tyr 30 40 45 Leu Pro 50

【００７８】配列番号：１５配列の長さ：３５配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Gly Ser Tyr Pro Gln Phe Met Ala Pro Gly Leu Val Leu His Ile Thr 1 5 10 15 Gly Thr Thr Arg Ile Gly Thr Asp Asp Gln Thr Ser Val Ala Asp Pro 20 25 30 Thr Ser Lys 35

【００７９】配列番号：１６配列の長さ：３３配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Val His Asn Phe Asn Asn Leu Trp Val Gly Gly Asn Gly Cys Ile Pro 1 5 10 15 Asp Ala Thr Ala Cys Asn Pro Thr Arg Thr Ser Val Ala Tyr Ala Leu 20 25 30 Lys

【００８０】配列番号：１７配列の長さ：１２配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド

【００８１】配列番号：１８配列の長さ：２２配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Asn Ser Ile Lys Phe Gln Lys Asp Ile Asp Lys Phe Val Asn Ile Ile 1 5 10 15 Asn Gly Ala Leu Gln Pro 20

【００８２】配列番号：１９配列の長さ：２６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 GAGAGACCAT GGGGTATCGT CTTTCC 26

【００８３】配列番号：２０配列の長さ：２７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：合成ＤＮＡ配列 GAGAGAGGAT CCGGAGACGC CAAGGAT 27

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミドベクターｐＴＳ１８の構造を示した
図である。

【図２】ＴＴＭ遺伝子のディレーションを示した図であ
る。点線はディレーションされた部分を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＤＣ１２Ｐ 21/02 33/574 ＡＧ０１Ｎ 33/53 33/577 Ｂ 33/574 Ａ６１Ｋ 35/76 33/577 Ｃ１２Ｐ 21/08 // Ａ６１Ｋ 35/76 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＵＣ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者出雲耕二埼玉県春日部市中央７−１−15 春日部セントラルコーポ303 (72)発明者坂智秀茨城県つくば市松代２−23−４ノーブル野村601

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記アミノ酸配列を含む、タンパク質：（ａ）配列番号１のアミノ酸配列、または（ｂ）１以上
のアミノ酸が付加および／または挿入され、および／ま
たは１以上のアミノ酸が置換および／または欠失された
配列番号１の改変アミノ酸配列であって、抗腫瘍活性を
有するアミノ酸配列。
【請求項２】請求項１に記載のタンパク質をコードする
塩基配列。
【請求項３】配列番号２の塩基配列である、請求項２に
記載の塩基配列。
【請求項４】塩基配列がマツタケ由来である、請求項３
に記載の塩基配列。
【請求項５】配列番号３〜１８のいずれかの配列表に記
載されたペプチド。
【請求項６】請求項２〜４のいずれか一項に記載の塩基
配列を含んでなる、ベクター。
【請求項７】プラスミドベクター、ウイルスベクター、
およびリポソームベクターからなる群から選択される、
請求項６に記載のベクター。
【請求項８】pBluescript SK(-) 、pBluescript SK(+)
、ｐＧＥＸベクター、ｐＲＩＴ２Ｔ、ｐＢＰＶ、ｐＳ
ＶＫ３、ｐＥＴベクター、およびｐＱＥベクターからな
る群から選択される、請求項７に記載のベクター。
【請求項９】請求項６〜８のいずれか一項に記載のベク
ターによって形質転換された、宿主細胞。
【請求項１０】大腸菌、酵母、枯草菌、ＣＨＯ細胞、Ｃ
ＯＳ細胞、ヒトケラチノサイト、ＣＯＰ−５、Ｃ１２
７、マウス３Ｔ３細胞、ＦＲ３Ｔ３、およびＨＢ１０１
からなる群から選択される、請求項９に記載の宿主細
胞。
【請求項１１】大腸菌が、ＳＯＬＲ株、ＪＭ１０９株、
ＳＵＲＥ株、ＴＯＰＰ株、およびＢＬ２１株からなる群
から選択される、請求項１０に記載の宿主細胞。
【請求項１２】酵母がＹＲＧ−２株である、請求項１０
に記載の宿主細胞。
【請求項１３】請求項１０〜１２のいずれか一項に記載
の宿主細胞を培養し、そしてその培養物から請求項１に
記載のタンパク質を単離することを含む、請求項１に記
載のタンパク質の製造法。
【請求項１４】請求項１に記載のタンパク質を薬学上許
容されうる担体とともに含む、抗腫瘍剤。
【請求項１５】請求項１に記載のタンパク質に対する抗
体。
【請求項１６】ポリクローナル抗体である、請求項１５
に記載の抗体。