ES2246911T3 - Compuesto polisacarido con actividad inmunoestimulante. - Google Patents
Compuesto polisacarido con actividad inmunoestimulante.Info
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Abstract
La presente invención proporciona un compuesto polisacárido de fórmula I que presenta actividad inmunoestimulante, un procedimiento para obtenerlo, el uso del mismo en el tratamiento de enfermedades inmunosupresoras y composiciones farmacéuticas que lo contienen. Un aspecto de la invención se refiere a compuestos polisacáridos de fórmula I Esquema I en la que n = 7 a 8. Un segundo aspecto de la invención se refiere al procedimiento para obtener el compuesto polisacárido de fórmula I. Este procedimiento comprende, en primer lugar, la obtención de un extracto acuoso de la planta Calendula officinalis de acuerdo con un procedimiento descrito en una solicitud de patente en tramitación junto con la presente de los autores de esta invención y, en segundo lugar, el aislamiento del polisacárido empleando una combinación de técnicas de separación controladas mediante bioensayo. Otro aspecto de la invención se refiere al uso del presente compuesto polisacárido de fórmula I como agente terapéutico enel tratamiento de enfermedades inmunosupresoras tales como cáncer, tuberculosis, gripe, resfriado común, alergias, lupus eritematoso, psoriasis y SIDA.
Description
Compuesto polisacárido con actividad
inmunoestimulante.
La presente invención se refiere a un compuesto
polisacárido de fórmula I que presenta actividad inmunoestimulante,
a un procedimiento para obtenerlo, al uso del mismo en el
tratamiento de enfermedades inmunosupresoras y a composiciones
farmacéuticas que lo contienen.
Se puede definir el sistema inmune como el
conjunto de moléculas, células y órganos cuyas complejas
interacciones forman un sistema de emergencia que es capaz, por lo
general, de proteger a un individuo tanto de los invasores externos
como de sus propias células alteradas.
El sistema inmune se puede separar en dos partes
funcionalmente distintas: los elementos que son innatos y los que
son adquiridos. La inmunidad innata se refiere a elementos inmunes
no específicos y sin capacidad de adaptación. Son capaces de
distinguir los organismos o tejidos extraños pero son incapaces de
reconocer un invasor particular. Se pueden dividir mejor en barreras
(piel y mucosas), agentes químicos no específicos (enzimas presentes
en las secreciones mucosas, quininas e histaminas) y células
efectoras no específicas (macrófagos). La inmunidad adquirida se
refiere a elementos específicos y con capacidad de adaptación. Son
capaces de distinguir las células extrañas de las propias, y pueden
distinguir un antígeno extraño de otro. Asimismo, la inmunidad
adquirida tiene memoria. Esto permite la inmunización y la
resistencia a la reinfección por el mismo microorganismo. Las
células que son responsables de la inmunidad adquirida son los
linfocitos, que se dividen, a su vez, en dos subclases: células B y
células T.
Se puede conseguir la inmunidad adquirida
mediante infección natural o vacunación (de un modo activo) o
mediante administración de células inmunes (de un modo pasivo).
Mientras que el primer modo presenta efectos de larga duración que,
incluso, pueden ser permanentes, los efectos del último son menos
duraderos.
Los pacientes que presentan enfermedades
inmunosupresoras se tratan con inmunoestimulantes con el fin de
activar su sistema inmune. Se describen diferentes
inmunoestimulantes en los documentos US 4801578, US 5417979 y WO
9851319. Se describen inmunoestimulantes polisacáridos en los
documentos DE 19817177 y EP 0 225 496. Estas patentes describen
compuestos polisacáridos con actividad inmunoestimulante así como
la obtención de los mismos a partir de cultivos de células
vegetales. Se emplean plantas como la Echinacea purpurea, la
Echinacea angustifolia o la Calendula officinalis.
Sin embargo, ninguno de estos compuestos
inmunoestimulantes presentan una actividad satisfactoria para las
enfermedades inmunosupresoras. Existe, por tanto, la necesidad en la
técnica de inmunoestimulantes alternativos que presenten una
actividad mejorada y más amplia.
La presente invención proporciona un compuesto
polisacárido de fórmula I que presenta actividad inmunoestimulante,
un procedimiento para obtenerlo, el uso del mismo en el tratamiento
de enfermedades inmunosupresoras y composiciones farmacéuticas que
lo contienen.
Un aspecto de la invención se refiere a
compuestos polisacáridos de fórmula I
Esquema
I
en la que n = 7 a
8.
Un segundo aspecto de la invención se refiere al
procedimiento para obtener el compuesto polisacárido de fórmula I.
Este procedimiento comprende, en primer lugar, la obtención de un
extracto acuoso de la planta Calendula officinalis de acuerdo
con un procedimiento descrito en una solicitud de patente en
tramitación junto con la presente de los autores de esta invención
y, en segundo lugar, el aislamiento del polisacárido empleando una
combinación de técnicas de separación controladas mediante
bioensayo.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso
del presente compuesto polisacárido de fórmula I como agente
terapéutico en el tratamiento de enfermedades inmunosupresoras tales
como cáncer, tuberculosis, gripe, resfriado común, alergias, lupus
eritematoso, psoriasis y SIDA.
Otro aspecto de la invención se refiere a
composiciones farmacéuticas que incluyen el compuesto polisacárido
de fórmula I.
La presente solicitud incluye las figuras y
tablas siguientes:
La Figura 1 es un esquema del aislamiento de
PF2.
La Figura 2 es un esquema del aislamiento de
PF2R.
La Figura 3 es el espectro
^{1}H-RMN de PF2RS8A.
La Figura 4 es el espectro
^{13}C-RMN de PF2RS8A.
La Figura 5 es la TLC de los productos de
hidrólisis de PF2RS8A con TFA y otros monosacáridos.
La Figura 6 es un esquema del aislamiento de
PF2RS8B2, es decir, el polisacárido de fórmula I.
La Figura 7 es el perfil HPLC de PF2RS8B2 con un
detector de dispersión de luz por evaporación.
La Figura 8 es el perfil HPLC de PF2RS8B2 con un
detector fotodiódico de UV.
La Figura 9 es el espectro
^{1}H-RMN de PF2RS8B2.
La Tabla 1 muestra el efecto de las muestras
PF2RS8A y PF2RS8B2 sobre la transformación linfocítica.
La Figura 10 es el espectro
^{13}C-RMN de PF2RS8B2, es decir, el polisacárido
de fórmula I.
La Figura 11 es el espectro
DEPT-135 de PF2RS8B2.
La Figura 12 es el espectro
DEPT-90 de PF2RS8B2.
La Figura 13 es el espectro HMQC de PF2RS8B2.
La Figura 14 es el espectro COSY
^{1}H-^{1}H de PF2RS8B2.
La Figura 15 es el espectro COSY
^{1}H-^{1}H de PF2RS8B2.
La Figura 16 es el espectro HMQC de PF2RS8B2.
La Tabla 2 muestra el espectro
^{13}C-RMN de PF2RS8B2.
La Figura 17 es el espectro HMBC de
PF2RS8B2.
La Figura 18 es el espectro HMBC de
PF2RS8B2.
La Figura 19 es la TLC de los productos de
hidrólisis de PF2RS8B2 con TFA y otros monosacáridos.
La Figura 20 es el diagrama de medida de los
pesos moleculares.
\newpage
Como se ha mencionado anteriormente, el primer
aspecto de la invención se refiere a un compuesto polisacárido de
fórmula I:
Esquema
I
en la que n = 7 a
8.
La estructura configuracional del compuesto de
fórmula I es:
Esquema
II
en la que n = 7 a
8.
El compuesto polisacárido presenta un peso
molecular medio de aproximadamente 10.000.
El segundo aspecto de la invención se refiere al
procedimiento para obtener el compuesto polisacárido de fórmula I.
Este procedimiento comprende, en primer lugar, la obtención de un
extracto acuoso de la planta Calendula officinalis de acuerdo
con un procedimiento descrito en una solicitud de patente en
tramitación junto con la presente de los autores de esta invención
titulada "Procedimiento para preparar extractos acuosos de plantas
y extractos obtenidos de este modo" y presentada simultáneamente
con la presente solicitud con número de serie PCT/IB 00/01947
(publicado como WO-A-02/41908 el 30
de Mayo de 2002) y, en segundo lugar, el aislamiento del
polisacárido mediante una combinación de técnicas de separación
controladas mediante bioensayo.
El extracto acuoso de la Calendula
officinalis se obtiene sometiendo las flores de esta planta al
siguiente procedimiento:
- a)
- Descontaminación de las flores
- b)
- Trituración de las flores.
- c)
- Tratamiento de las flores trituradas con una radiación láser.
- d)
- Suspensión de la mezcla obtenida en la etapa c) en agua.
- e)
- Maceración de la suspensión obtenida en la etapa d).
- f)
- Separación del líquido resultante.
La descontaminación (etapa a) se lleva a cabo
mediante lavado de las flores de Calendula officinalis con
agua. La cantidad de agua empleada en esta etapa no es determinante,
y puede variar dependiendo del estado de contaminación de la planta.
Aunque no se descartan temperaturas superiores o inferiores, la
temperatura del agua debe estar entre 10ºC y 40ºC, preferiblemente
entre 20ºC y 35ºC, siendo lo más preferible que sea de 28ºC. Se
puede emplear un túnel de lavado para facilitar esta etapa. Ni la
cantidad de agua ni el tiempo de residencia de la planta en el túnel
de lavado son determinantes y, por tanto, pueden variar dependiendo
del estado de contaminación de la planta. La etapa de lavado puede
efectuarse varias veces, con una etapa de secado entre ellas. Esta
etapa de secado se lleva a cabo preferiblemente dejando la planta al
sol.
Una vez que se han descontaminado las flores, se
trituran (etapa b) mediante procedimientos convencionales tales como
usando una máquina de trituración o, incluso, de forma manual.
Aunque no se descartan temperaturas superiores o inferiores, la
temperatura a la que se trituran las flores debe estar entre 10ºC y
40ºC.
Las flores trituradas se someten después a un
tratamiento con radiación láser (etapa c). Como fuente de la
radiación láser, se prefiere emplear un láser diódico lineal rojo
con una capacidad de generación de armónicos con longitudes de onda
en el intervalo de 150 a 810 nm. Más preferiblemente, la longitud de
onda de la radiación láser es de 200 a 400 nm y lo más preferible es
que sea de 250 nm. La potencia de la radiación láser es
preferiblemente de 1 a 60 vatios, más preferiblemente de 10 a 30
vatios y lo más preferible es que sea de 20 vatios. La mancha focal
tiene preferiblemente de 1 a 6 mm de diámetro, más preferiblemente
de 2 a 5 mm y lo más preferible es que sea de 4 mm. La planta
triturada se expone a la radiación láser de modo que se irradie toda
o la mayor parte de la mezcla. Esto se consigue bien desplazando
manualmente el generador de láser a lo largo de la planta triturada,
o bien haciendo pasar la materia triturada sobre una correa
transportadora a lo largo de un conjunto de varios generadores de
láser. Preferiblemente, se trata cada kilogramo de materia triturada
con la radiación láser durante un periodo de 3 a 10 minutos, más
preferiblemente durante un periodo de 5 minutos. Aunque no se
descartan temperaturas superiores o inferiores, la temperatura a la
que se trata la planta triturada con la radiación láser debe estar
entre 10ºC y 40ºC.
La materia tratada con láser se suspende después
en agua (etapa d). En esta etapa, se puede emplear cualquier agua
mineral comercial. La suspensión se lleva a cabo de modo que haya de
50 a 300 gramos, preferiblemente de 100 a 250 gramos, de la materia
tratada con láser por litro de agua. Aunque no se descartan
temperaturas superiores o inferiores, la temperatura a la que se
suspende en agua la planta triturada debe estar entre 10ºC y
40ºC.
A continuación, la suspensión se deja en reposo
durante un periodo de entre 5 a 20 días, preferiblemente de 7 a 15
días, a una temperatura de 2ºC a 10ºC, preferiblemente de 4ºC a 8ºC,
de modo que se produzca la maceración de la mezcla (etapa e).
Por último, y después de la etapa de maceración,
se lleva a cabo la separación de la fase líquida y la fase sólida
(etapa f). Se pueden prensar los sólidos para facilitar la
separación. Dicha separación se puede conseguir mediante decantación
o, preferiblemente, mediante decantación seguida de filtración. La
filtración se lleva a cabo preferiblemente a presión. Lo más
preferible es efectuar tres filtraciones a presión con filtros de 5
\mum, 1 \mum y 0,22 \mum. Aunque no se descartan temperaturas
superiores o inferiores, la temperatura a la que la separación se
lleva a cabo debe estar entre 10ºC y 40ºC.
Se obtiene finalmente un extracto acuoso de color
ocre.
El extracto obtenido de este modo se somete a
continuación a un procedimiento de aislamiento que comprende la
precipitación con metanol, la centrifugación y la separación
cromatográfica controlada mediante bioensayo. El bioensayo empleado
se realizó in vitro mediante adición de las muestras a
linfocitos aislados de ratón de acuerdo con la referencia
bibliográfica Max W. et al. Journal of Natural Products. Vol. 54.
no. 6. pp. 1531-1542 (1991). Se controló la
incorporación de timidina que indica la replicación del ADN. Esta
incorporación es indicativa tanto de un aumento del número de
linfocitos como de un aumento de la actividad de dichos linfocitos.
Estas técnicas de separación empleadas incluyen la precipitación
repetida con etanol, la centrifugación, y la diálisis o la
cromatografía en columna.
Así pues, se liofilizaron 112 litros del extracto
acuoso obtenido previamente proporcionando 800 g de un polvo de
color castaño ("PF2"). Este polvo se fraccionó en un residuo
soluble en MeOH y otro insoluble en MeOH (PF2R, 350 g) que exhibe
actividad de transformación linfocítica. Una porción de este
material (80 g) se sometió a precipitación con MeOH, centrifugación,
y diálisis o cromatografía en columna Sephadex DEAE lo que produjo
el aislamiento de una serie de materiales cristalinos, que se
determinó eran sales inorgánicas inactivas (figura 1).
Una porción de PF2R (270 g) que se sometió a
precipitación con MeOH a unas concentraciones finales del 25%, del
50% y del 67% produjo precipitados activos. El material más activo
fue el precipitado obtenido en la solución de MeOH al 50% (PF2RS8,
51,2 g, LT = +1059%). El tratamiento de una porción de 5 g de PF2RS8
solubilizado en agua, seguido de la centrifugación, y la separación
cromatográfica del sobrenadante en Sephadex G-25,
produjo la fracción enriquecida con el polisacárido activo
denominada PF2RS8A (0,13 g, LT = +1074%). Posteriormente, se obtuvo
una fracción idéntica denominada PF2RS8A' (0,3 g) a partir de una
segunda porción (6 g) del precipitado en MeOH al 50%. Tal como se
indica en la figura 2, se aislaron una serie de materiales
cristalinos y de otras fracciones, aunque ninguno mostró el nivel de
actividad LT de la fracción PF2RS8A.
La fracción PF2RS8A se caracterizó mediante
análisis espectroscópico (^{1}H-RMN,
^{13}C-RMN, y espectros DEPT) y mediante análisis
químico (hidrólisis con TFA y análisis de TLC sobregel de sílice).
Véanse las Figuras 3, 4 y 5.
La mezcla de polisacáridos más activa, PF2RS8A
(1,4 g), se aisló a partir del precipitado en MeOH al 50% restante
(PF2RS8). Al mismo tiempo, el tratamiento de una porción (2,0 g) de
la fracción insoluble en MeOH al 67% (PF2RS9; LT = +735%) produjo
el aislamiento de una mezcla de polisacáridos (PF2RS9A, 0,3g) que,
mediante análisis ^{1}H-RMN, se comprobó que era
idéntica a la PF8RS8A. Por tanto, se combinaron las fracciones
PF2RS9A (0,2 g) y PF2RS8A (1,4 g), y la mezcla, denominada
"PF2S8B", se sometió a una separación adicional con Sephadex
G-50 (20-80 mm) tal como se muestra
en la figura 6. La elución con agua produjo seis fracciones
(PF2RS8B1, 2, 3, 4, 5 y 6), de las cuales se demostró, mediante
análisis de HPLC, que sólo la fracción principal aislada PF2RS8B2
era homogénea, usando tanto un detector de UV como uno de dispersión
de luz por evaporación (figuras 7 y 8). Los análisis espectrales de
^{1}H-RMN y ^{13}C-RMN (figuras
9 y 10) mostraron que los espectros de este producto aislado eran
muy similares a los obtenidos para PF2RS8A (figuras 3 y 4), lo que
implicaba que era el polisacárido principal de la mezcla. La
fracción PF2RS8B2 está formada, por tanto, por el polisacárido de
fórmula I y agua. Esta última se puede eliminar mediante
procedimientos conocidos en la técnica.
El bioensayo de la fracción homogénea aislada
PF2RS8B2 y de la mezcla precursora del mismo PF2RS8A en el mismo
ensayo mostró actividades de transformación linfocítica (LT) del
6203% y del 3532%, respectivamente (Tabla 1). El elevado nivel de
actividad mostrado por la fracción aislada implicaba que este
polisacárido es el principal constituyente activo respecto al efecto
biológico del presente extracto.
Se elucidó la estructura del polisacárido activo
PF2RS8B2 (polisacárido de fórmula I) mediante análisis
espectroscópico (espectros ^{1}H-RMN,
^{13}C-RMN, HMQC y
COSY^{1}H-^{1}H 2D) y mediante análisis químico
(hidrólisis con TFA y análisis de TLC sobre gel de sílice). Por
tanto, las señales de ^{1}H-RMN (Figura 9) a
\delta 5,3 y 3,2 ppm son indicativas de un polisacárido. Las
señales de ^{13}C-RMN (Figuras
10-12) a \delta 111,9 (d), 110,1 (d) ppm se
asignaron a los carbonos anoméricos de
\alpha-L-arabinofuranosa con unión
1\rightarrow3 y de
\alpha-L-arabinofuranosa terminal
(indicadas como Araf y Araf' respectivamente). Las señales a
\delta 106,1 (d) y 105,9 (d) ppm se asignaron a los carbonos
anoméricos de
\beta-D-galactopiranosa con unión
1\rightarrow6 y de
\beta-D-galactopiranosa con unión
1\rightarrow3 y 1\rightarrow6 (indicadas como Galp' y Galp
respectivamente), mientras que la señal a \delta 100,2 (d) ppm se
asignó a los carbonos anoméricos de
\alpha-L-ramnopiranosa (indicada
como Rhap). Las señales de protones anoméricos (H-1)
fueron reconocidas fácilmente debido a sus desplazamientos de campo
bajo en los espectros ^{1}H-RMN. La correlación
directa entre señales de protón y de carbono 13 observada en el
espectro HMQC (Figura 13) determinó que las señales de
^{1}H-RMN a \delta 5,08 (s a), 5,23 (s a), 4,47
(d, J=7,9 Hz), 4,53 (d, J=7,3Hz) y 5,1 (s a) ppm correspondían a los
protones anoméricos de
\alpha-L-arabinofuranosa (Araf'),
\alpha-L-arabinofuranosa (Araf),
\beta-D-galactopiranosa (Galp'),
\beta-D-galactopiranosa (Galp) y
\alpha-L-ramnopiranosa (Rhap).
Empleando estas señales como referencia, se pueden trazar otras
señales de protón analizando los espectros COSY
^{1}H-^{1}H 2D (figuras 14, 15). Análogamente,
se definieron las correspondientes señales de carbono mediante
espectros HMQC (figuras 13, 16 y Tabla 2). La secuenciación de las
unidades monosacáridas se determinó tal como sigue. El
desplazamiento de campo bajo de la señal en C-3 de
Araf (\delta 79,4) y Galp (\delta 82,8), y las señales en
C-6 de Galp y Galp' (\delta 69,2) sugirieron que
estos carbonos estaban unidos a otras unidades monosacáridas. La
observación de correlaciones a larga distancia entre
C-1 de Araf y C-6 de Galp y Galp' en
el espectro HMBC (Figura 17) sugirió una estructura de
\beta-D-galactopiranosa con unión
1\rightarrow6. La Araf presentaba una unión 1\rightarrow3 con
Galp a partir de la observación de una correlación a larga distancia
entre C-1 de Araf y C-3 de Galp
(Figura 18). A partir del espectro ^{1}H-RMN
(Figura 9), se calculó la proporción de monosacáridos de acuerdo con
los valores de integración de los picos de protones anoméricos, que
fue para Araf:Araf':Galp:Galp':Rhap de 3:1:2:2:1. Por tanto, se
elucidó la estructura de PF2RS8B2 como un polisacárido de cadena
larga ramificada con la estructura primaria mostrada en la fórmula I
(esquema I). El esquema II es una representación de la misma
estructura que muestra la configuración estereoquímica de los
monosacáridos individuales.
Para confirmar las identidades de los
monosacáridos sustituyentes, se hidrolizó el PF2RS8B2 con TFA (0,5
M, 100-120ºC) y luego se sometió a análisis de TLC
(Figura 19). La presencia de los monosacáridos principales, la
\alpha-L-arabinofuranosa y la
\beta-D-galactopiranosa, se
determinó fácilmente, mientras que la presencia del monosacárido
secundario la
\alpha-L-ramnopiranosa, se detectó
con más dificultad, debido probablemente a la cantidad de
hidrolizado aplicado a la placa de TLC.
El peso molecular del PF2RS8B2 se estimó
mediante cromatografía de filtración en gel (de exclusión
molecular). El peso molecular medio del PF2RS8B2 estimado de este
modo es de 10.000 (véase la Figura 20).
El compuesto polisacárido de fórmula I presenta
de un modo inesperado una elevada actividad como inmunoestimulante,
como se muestra en el ejemplo que sigue a continuación. El tercer
aspecto de la invención se refiere, por tanto, al uso del compuesto
polisacárido de fórmula I como agente terapéutico en el tratamiento
de enfermedades inmunosupresoras tales como cáncer, tuberculosis,
gripe, resfriado común, alergias, lupus eritematoso,
psoriasis y SIDA. Ejemplos no limitativos de cánceres son:
carcinoma hepático, cáncer de pulmón, cáncer de riñón, cáncer de
colon, cáncer de mama, cáncer de próstata o adenocarcinoma
prostático; cánceres de cerebro tales como astrocitoma y
glioblastoma; cáncer de cuello uterino y cáncer de vejiga.
El cuarto aspecto de la invención se refiere a
composiciones farmacéuticas que incluyen el compuesto polisacárido
de fórmula I.
El polisacárido de acuerdo con la presente
invención se puede administrar bien por separado como una sustancia
pura, o bien en forma de preparaciones farmacéuticas, aunque el
compuesto de la invención se administra preferiblemente en una
combinación. La combinación de fármaco está preferiblemente en forma
de una formulación que: (1) contiene el polisacárido de acuerdo con
la invención solo; (2) contiene uno o más aglutinantes, vehículos u
otros materiales auxiliares adecuados, y (3) puede contener además
sustancias terapéuticamente activas adicionales.
Los aglutinantes, vehículos u otros materiales
auxiliares deben ser farmacéutica y farmacológicamente aceptables,
de modo que se puedan combinar con los otros componentes de la
formulación o preparación y no produzcan efectos adversos en el
organismo tratado.
Las formulaciones incluyen aquellas que son
adecuadas para administración oral o parenteral (incluyendo la
administración subcutánea, intradérmica, intramuscular e
intravenosa), aunque la mejor vía de administración depende del
estado del paciente.
Las formulaciones pueden presentarse en forma de
dosis sencillas. Las formulaciones se preparan de acuerdo con
procedimientos conocidos en el campo de la farmacología. Las
cantidades apropiadas de sustancias activas adecuadas para su
administración pueden variar en función del campo terapéutico
particular. En general, la concentración de sustancia activa en una
formulación de dosis sencilla es del 5% al 95% de la formulación
total.
La invención proporcionada por la solicitud se
ilustra mediante ejemplos presentados a continuación.
Se colocan en un túnel de lavado 500 g de flores
de Calendula officinalis y se someten a un lavado cuidadoso
con agua a aproximadamente 28ºC. Las flores se trituran a
continuación usando una máquina de trituración. Los 500 g de materia
triturada resultante se someten a un tratamiento con un láser
diódico lineal rojo que tiene una capacidad de generación de
armónicos con una longitud de onda de 250 nm, una potencia de 20
vatios y una mancha focal de 4 mm de diámetro. El tratamiento se
lleva a cabo desplazando manualmente el generador de láser a lo
largo de la materia triturada durante 2,5 minutos, de modo que se
irradie toda o la mayor parte de la mezcla. La materia tratada con
láser se suspende después en 2 litros de agua a una temperatura de
aproximadamente 20ºC. A continuación, la suspensión se deja en
reposo durante 12 días a una temperatura de 4ºC. Por último, se
lleva a cabo la separación de la fase líquida y la fase sólida, en
primer lugar, mediante decantación del líquido (los sólidos se
prensan para facilitar la separación) y, después, mediante tres
filtraciones a presión consecutivas con filtros de 5 \mum, 1
\mum y 0,22 \mum a una temperatura de aproximadamente 20ºC. El
procedimiento proporciona aproximadamente 1,7 litros de una solución
(extracto acuoso) de color ocre.
El aislamiento del polisacárido de fórmula I se
lleva a cabo tal como se muestra en las páginas
10-12 de la descripción.
El polisacárido de fórmula I se ensayó con el fin
de establecer su actividad como inmunoestimulante mediante
cuantificación de la actividad de transformación linfocítica (LTA).
Por actividad de transformación linfocítica se hace referencia al
hecho de que los linfocitos se transforman pasando de un estado
inactivo a un estado activo, lo que es necesario para luchar contra
determinadas enfermedades mediante un mecanismo inmunológico, o para
restablecer el sistema inmune, que puede debilitarse por diferentes
factores. Los ensayos se realizaron de acuerdo con la referencia
bibliográfica Max. W. et al., Journal of Natural Products. vol.
54. no. 6. pp. 1531-1542 (1991), mediante
adición in vitro de una solución del polisacárido de la
invención a linfocitos aislados de ratón. Se controló la
incorporación de timidina que indica la replicación del ADN. Esta
incorporación es indicativa tanto de un aumento del número de
linfocitos como de un aumento de la actividad de dichos
linfocitos.
El polisacárido de fórmula I presenta una LTA del
+6203% con respecto a linfocitos no estimulados.
Claims (17)
1. El polisacárido de acuerdo con la fórmula
I,
en la que n = 7 a
8.
2. El procedimiento para obtener el compuesto
definido en la reivindicación 1 que comprende:
1) separar las flores de la planta Calendula
officinalis,
2) someterlas al siguiente procedimiento de
extracción:
- a)
- Descontaminación de las flores
- b)
- Trituración de las flores.
- c)
- Tratamiento de las flores trituradas con una radiación láser.
- d)
- Suspensión de la mezcla obtenida en la etapa c) en agua.
- e)
- Maceración de la suspensión obtenida en la etapa d).
- f)
- Separación del líquido resultante.
y 3) someter el líquido obtenido en
la etapa f) a un procedimiento de aislamiento que comprende la
precipitación con metanol, la centrifugación y la separación
cromatográfica controladas mediante
bioensayo.
3. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 2, en el que la etapa 3) comprende:
- g)
- Liofilización del líquido obtenido en la etapa f).
- h)
- Precipitación de la materia liofilizada obtenida en la etapa g) con metanol.
- i)
- Separación de la fase líquida y la fase sólida.
- j)
- Precipitación de la fase sólida obtenida en la etapa i) con metanol a unas concentraciones finales del 25%, del 50% y del 67%.
- k)
- Solubilización en agua del precipitado obtenido en la etapa j) al 50% y al 67%, centrifugación y realización de una separación cromatográfica del sobrenadante.
- l)
- Identificación de la fracción activa mediante bioensayo.
- m)
- Realización de una segunda separación cromatográfica de la fracción activa.
- n)
- Identificación de la fracción activa mediante bioensayo.
- o)
- Eliminación del eluyente.
4. El procedimiento de acuerdo con las
reivindicaciones 2 y 3, en el que el tratamiento con la radiación
láser se lleva a cabo con un láser diódico lineal rojo que tiene una
capacidad de generación de armónicos con longitudes de onda en el
intervalo de 150 a 810 nm, una potencia de 1 a 60 vatios y una
mancha focal de 1 a 6 mm de diámetro.
5. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 4, en el que la longitud de onda está en el intervalo
de 200 a 400 nm, siendo preferiblemente de 250 nm, la potencia es
de 20 vatios y la mancha focal es de 4 mm de diámetro.
6. El procedimiento de acuerdo con cualquier
reivindicación anterior, en el que se trata cada kilogramo de
materia triturada con la radiación láser durante un periodo de 3 a
10 minutos, preferiblemente durante un periodo de 5 minutos.
7. El compuesto definido en la reivindicación 1
para su uso como agente terapéutico.
8. El compuesto de acuerdo con la reivindicación
1 para su uso en el tratamiento de enfermedades
inmunosupresoras.
9. El compuesto de acuerdo con la reivindicación
1 para su uso en el tratamiento de enfermedades inmunosupresoras
tales como cáncer, tuberculosis, gripe, resfriado común, alergias,
lupus eritematoso, psoriasis y SIDA.
10. El compuesto de acuerdo con la reivindicación
1 para su uso en el tratamiento de: carcinoma hepático, cáncer de
pulmón, cáncer de riñón, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de
próstata o adenocarcinoma prostático; cánceres de cerebro tales como
astrocitoma y glioblastoma; cáncer de cuello uterino y cáncer de
vejiga.
11. El uso del compuesto definido en la
reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento.
12. El uso de acuerdo con la reivindicación 11
para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento de
enfermedades inmunosupresoras.
13. El uso de acuerdo con la reivindicación 12
para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento de:
cáncer, tuberculosis, gripe, resfriado común, alergias, lupus
eritematoso, psoriasis y SIDA.
14. El uso de acuerdo con la reivindicación 13
para la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento de:
carcinoma hepático, cáncer de pulmón, cáncer de riñón, cáncer de
colon, cáncer de mama, cáncer de próstata o adenocarcinoma
prostático; cánceres de cerebro tales como astrocitoma y
glioblastoma; cáncer de cuello uterino y cáncer de vejiga.
15. Una preparación farmacéutica que incluyen un
compuesto de acuerdo con la reivindicación 1.
16. La preparación farmacéutica de acuerdo con la
reivindicación 15 que incluye además un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
17. La preparación farmacéutica de las
reivindicaciones 15 y 16 que incluye además al menos otro compuesto
farmacéuticamente activo.
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