ES2247584T3

ES2247584T3 - Virus atenuados por ingenieria genetica.

Info

Publication number: ES2247584T3
Application number: ES93912288T
Authority: ES
Inventors: Peter Palese
Original assignee: Mount Sinai School of Medicine
Current assignee: Icahn School of Medicine at Mount Sinai
Priority date: 1992-04-14
Filing date: 1993-04-13
Publication date: 2006-03-01
Anticipated expiration: 2013-04-13
Also published as: EP0636172A1; IL105379A; AU687738B2; DE69333856T2; DE69333856D1; IL105379A0; AU4289393A; WO1993021306A1; ATE302277T1; CN1065912C; IL192972A0; EP0636172B1; ZA932588B; EP1473361A3; EP1473361A2; CN1082606A; CA2118234A1; EP0636172A4

Abstract

LA PRESENTE INVENCION DESCRIBE A VIRUS ATENUADOS CONSTRUIDOS POR ALTERAR UNA ZONA NO CODIFICADA O LA SECUENCIA DE CODIFICACION DE UN GEN VIRAL. SE DESCRIBEN LAS ALTERACIONES DE LAS ZONAS NO CODIFICADAS QUE REGULAN LA TRANSCRIPCION Y/O LA REPRODUCCION. ESAS ALTERACIONES RESULTAN EN LA REGULACION DESCENDENTE DEL GEN VIRAL Y UNA ATENUACION DEL VIRUS, O POR LA PRODUCCION DE PARTICULAS DEFECTUOSAS DURANTE LA REPRODUCCION, O POR REDUCIR EL NUMERO DE VIRIONES DE PROGENIE PRODUCIDOS DURANTE LA REPRODUCCION VIRAL. LAS ALTERACIONES DE LAS SECUENCIAS DE CODIFICACION VIRAL SON TAMBIEN DESCRITAS QUE RESULTAN EN UN VIRUS ATENUADO QUIMERICO O RECOMBINANTE.

Description

Virus atenuados por ingeniería genética.

1. Introducción

La presente invención se refiere a atenuar por ingeniería genética virus alterando la secuencia de codificación de un gen viral. Se describen alteraciones de las secuencias de codificación virales que dan como resultado un virus atenuado recombinante o quimérico.

2. Antecedentes de la invención

Las vacunas de virus inactivados se preparan "matando" el patógeno viral, por ejemplo, mediante tratamiento con calor o formalina, de modo que no sea capaz de replicación. Las vacunas inactivadas tienen una utilidad limitada debido a que no proporcionan inmunidad duradera y, por lo tanto, procuran una protección limitada. Un enfoque alternativo para producir vacunas de virus implica el uso de vacunas de virus vivos atenuados. Los virus atenuados son capaces de replicación pero no son patogénicos y, por lo tanto, proporcionan una inmunidad más duradera y procuran una mayor protección.

Sin embargo, los procedimientos convencionales para producir virus atenuados implican el aislamiento casual de mutantes de espectro de hospedadores, muchos de los cuales son sensibles a la temperatura, por ejemplo, el virus se pasa a través de hospedadores innaturales, y se seleccionan los virus de progenie que son inmunogénicos, pero no patogénicos.

La tecnología de ADN recombinante y las técnicas de ingeniería genética procurarían, en teoría, un enfoque superior para producir un virus atenuado, ya que podrían introducirse deliberadamente por ingeniería genética mutaciones específicas en el genoma viral. Sin embargo, las alteraciones genéticas necesarias para la atenuación de los virus no son conocidas ni predecibles. En general, los intentos de utilizar tecnología de ADN recombinante para modificar por ingeniería genética vacunas virales se han dirigido principalmente a la producción de vacunas de subunidades que contienen sólo las subunidades proteicas del patógeno implicadas en la respuesta inmune, expresadas en vectores virales recombinantes tales como virus Vaccinia o baculovirus. Más recientemente, las técnicas de ADN recombinante se han utilizado en un intento de producir mutantes de deleción de herpesvirus o poliovirus que imitan virus atenuados encontrados en la naturaleza o mutantes de espectro de hospedadores conocidos. Hasta muy recientemente, los virus de ARN de cadena negativa no eran susceptibles de manipulación específica de sitio en absoluto, y por tanto no podían modificarse por ingeniería genética.

3. Sumario de la invención

La presente invención se refiere a la producción de virus atenuados utilizando técnicas de ARN recombinante. El enfoque de virus atenuados por ingeniería genética implica introducir alteraciones por ingeniería genética de una región de codificación viral de modo que la proteína viral expresada se altere por la inserción, deleción o sustitución de un resto aminoacídico o un epítopo, y se produce un virus quimérico atenuado, en el que la secuencia aminoacídica de la región del tallo de la proteína neuraminidasa se selecciona del grupo constituido por:

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en el que los restos aminoacídicos se presentan por el código de una letra.

Estos virus atenuados de la invención pueden utilizarse ventajosamente de forma segura en la formulación de vacuna de virus vivos. Como se utiliza en la presente memoria, el término virus "atenuado" designa un virus que es infeccioso pero no patogénico; o un virus infeccioso que pueden ser o no patogénico, pero que produce partículas defectivas durante cada serie de replicación o produce menos viriones de progenie que el correspondiente virus de tipo salvaje durante la replicación. Los virus patogénicos que se modifican por ingeniería genética para producir partículas defectivas o un número reducido de viriones de progenie están "atenuados" en que aunque el virus es capaz de causar enfer-
medad, los títulos de virus obtenidos en un individuo vacunado proporcionarán sólo niveles subclínicos de infección.

4. Descripción de las figuras

Fig. 1. Secuencias no de codificación de los segmentos NA del virus de la gripe A/WSN/33 y/o del virus transfectante NA/B-NS. Las secuencias 5' y 3'-terminales están dibujadas con estructura de ojal, que consiste en dos troncos de bases apareadas y un bucle interno desapareado en el medio. Los nucleótidos no de codificación del gen NA quimérico del virus NA/B-NS derivan del gen NS del virus de la gripe B/Lee. Las letras mayúsculas indican los nucleótidos en las regiones 5' y 3' terminales (que contienen 13 y 12 nucleótidos, respectivamente) que son diferentes para los dos genes NA. La estructura de ojal del gen NA de virus de tipo salvaje está dividida en las regiones A/D, B/E y C/F, y la del gen atenuado en a/d, b/e y c/f. Las regiones B/E y b/e contienen las regiones del segundo tronco de NA y los genes NA/
B-NB, respectivamente. El triángulo blanco marca la secuencia de Kozak alterada en el gen NA del virus NA/B-NS.

Fig. 2. Caracterización del ARN del virus NA/B-NS. A. Electroforesis de ARN. Se analizaron los ARN extraídos de virus purificados en un gel de poliacrilamida al 3% que contenía urea 7,7 M y se visualizaron mediante tinción con plata. Carril 1, ARN de virus de la gripe A WSN/33; carril 2, ARN de virus transfectante NA/B-NS; carril 3, ARN obtenido mediante transcripción de duplicación del plásmido Pt_{7}NA/B-NS que produce ARN de NA quimérico. B. Análisis del ARN de NA en viriones mediante el ensayo de protección de ribonucleasa (RPA). Se utilizaron 50 ng de ARN extraído de virus purificado en la reacción de hibridación con ribosondas específicas de NS y NA de sentido positivo como se describen en Materiales y procedimientos. Las sondas protegidas se sometieron a electroforesis en un gel de acrilamida al 6% que contenía urea 7 M. Carril 1: ribosondas sin digestión con ARNasa A/T_{1}; carril 2: ribosondas tras digestión con ARNasa A/T_{1}; carril 3: ribosondas protegidas por el ARN del virus de la gripe A/WSN/33; y carril 4: ribosondas protegidas por el ARN del virus transfectante NA/B-NS. C. Cuantificación del ARN específico de NA en virus mediante extensión por cebador. El ARNv extraído del virus NA/B-NS (carril 2) o del virus transfectante NA/B-NS (carril 3) se transcribió de forma inversa mediante transcriptasa inversa con ARNasa H menos utilizando cebadores específicos de segmentos NS y NA como se describen en Materiales y procedimientos. Los productos para los ARN de NS son de 195 nt de longitud, y aquellos para ARN de NA, de aproximadamente 260 nt de longitud. Se analizaron los productos en un gel de poliacrilamida al 6% que contenía urea 7 M. Los marcadores de tamaño se muestran a la izquierda.

Fig. 3. Transcurso temporal de la síntesis de ARNm en células MDBK. A. Cuantificación de ARNm específicos de NA y NS en diferentes puntos temporales d.i. mediante el ensayo de protección de ribonucleasa (RPA). El diagrama en la parte superior ilustra esquemáticamente el procedimiento. Ambas sondas NS y NA son de sentido negativo, y contienen secuencias correspondientes al lado 3'-terminal del ARNc, flanqueadas por secuencias de vector en la terminación 3' como indican los rectángulos blancos. Los tamaños de las sondas se muestran en la parte superior, y los tamaños de los productos resultantes se indican en la parte inferior del diagrama. Los puntos temporales (horas) se indican en la parte superior. Las posiciones de sondas y productos en el gel se indican mediante flechas a la izquierda y a la derecha, respectivamente. B. Transcurso temporal de la síntesis de ARNm específico de NS. La cantidad de ARNm de NS se midió mediante recuento directo de la radiactividad (cuentas por minuto) en la correspondiente banda escindida del gel mostrado en el panel A. C. Comparación de la síntesis de ARNm específico de NA del virus transfectante y del virus A/WSN/33 en células infectadas. Se determinó la cantidad de ARNm para cada punto temporal como se describe en el panel B.

Fig. 4. Análisis de la síntesis de ARNv específico de NA en células infectadas mediante extensión por cebador. El ARN aislado a partir de células infectadas se sometió a transcripción inversa utilizando transcriptasa inversa y cebadores específicos de ARNv de NA y NS, como se describe en Materiales y procedimientos. Los ARNv extraídos de virus purificados se utilizaron como control (derecha). Los productos resultantes se expusieron en un gel desnaturalizante de poliacrilamida al 6%. Los transcriptos inversos de los ARN de NS son de 195 nt de longitud, y aquellos de los segmentos específicos de NA son de aproximadamente 260 nt de longitud, como indican las flechas a la derecha. Los números en la parte superior indican el tiempo (horas) después de la infección. El virión representa el ARN obtenido a partir de virus purificado.

Fig. 5. Análisis de proteína NA en virión y en células infectadas. A. Análisis Western de proteína NA en virión. Como se describe en Materiales y procedimientos, se utilizó un anticuerpo monoclonal dirigido contra carbohidrato para cuantificar la glicoproteína en los virus. Las proteínas se indican por HA0 (HA no escindida), HA1 (subunidad 1 de HA) y NA a la derecha. B. Proteínas virales sintetizadas en células infectadas. En diferentes puntos temporales después de la infección (horas d.i.), se marcaron las proteínas virales con ^{35}S[cisteína) durante 30 minutos y se analizaron en un gel de Laemmli al 10%. Se marcan las diferentes proteínas a la derecha. La posición de la proteína NA está indicada por una flecha. Se determinó la cantidad de proteína NA mediante recuento en el gel con un sistema de formación de imágenes radioanalíticas AMBIS utilizando proteínas NP y M1 como controles.

Fig. 6. Vector para la construcción de moléculas HA quiméricas. Fig. 6A. Constructo de malaria HA/ME1 quimérico. Fig. 6B. Constructo de HA/VP1 de polio quimérico.

Fig. 7. Estructura esquemática de la neuraminidasa (NA). Se describe la NA tetramérica insertada en la membrana viral. Ct: cola citoplasmática; TM: dominio transmembrana; tallo: región del tallo; cabeza: el dominio globular más distal de la membrana viral.

Fig. 8. Diagrama de mutantes de neuraminidasa. Se indican los cuatro dominios de la molécula de neuraminidasa: CT: cola citoplasmática; TM: dominio transmembrana; tallo: región del tallo y cabeza: el dominio globular más distal de la membrana viral. El sistema de numeración de los aminoácidos es según Hiti y Nayak, 1982, J. Virol. 41, 730-734. Las deleciones son como se indican y las inserciones y mutaciones en la región del tallo están subrayadas. El diagrama no está dibujado a escala. (+) indica que el virus infeccioso se reutilizó después de la transfección del ARN mutante.

Fig. 9. Análisis en gel de los ARNv extraídos de virus purificados. Los virus y ARNv se prepararon como se describe en la sección 9.1. Se analizaron 200 ng de ARN de virión en un gel de poliacrilamida al 2,8% que contenía urea 7,7 M. Se visualizaron los segmentos de ARN mediante tinción con plata como se describe anteriormente (Enami et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 3802-3805). Cada fragmento de ADN está indicado a la izquierda. Carril 1, virus transfectado de tipo salvaje. Carril 2, virus mutante Del 16. Carril 3: virus mutante Ins 12. Carril 4, virus mutante Ins 24. Carril 5, virus mutante Ins 41. Las flechas indican la posición de los genes NA en cada una de las preparaciones de ARN.

Fig. 10. Análisis de ARNv mediante transcripción inversa y PCR. Se sometió a transcripción inversa el ARN extraído de virus purificado y se amplificaron después los transcriptos específicos del gen NA por PCR como se describe en la sección 9.1. Se analizaron los productos de PCR marcados como gamma [^{32}P]-ATP en un gel de poliacrilamida al 6% que contenía urea 7M (Luo et al., 1991, J. Virol. 65: 2861-2867). Los productos esperados para NA de tipo salvaje, NA mutantes Del 18m, Del 23N y Del 28N, fueron de 214, 160, 145 y 130 nucleótidos de longitud, respectivamente. Se marcaron los fragmentos de ADN PhiX174RF/Hae III (BRL, Bethesda, MD) con gamma ^{32}[P]-ATP y se utilizaron como marcadores de tamaño. Se indican los tamaños de los fragmentos de ADN a la izquierda. Carril 1, marcador de tamaño. Carril 2, producto de NA de tipo salvaje (T3NAmod). Carril 3, producto de NA mutante Del 18m. Carril 4, producto de NA mutante Del 23N. Carril 5, producto de NA mutante Del 28N. Las flechas indicaban la posición de los productos de PCR.

Fig. 11. Curvas de crecimiento de los virus transfectantes en células MDBK (A) y MDCK (B). Se infectaron las células con virus de tipo salvaje o mutante a una m.o.i. de 0,001, y se determinaron los títulos virales del sobrenadante recogido en los puntos temporales indicados como se describe en la sección 9.1.

5. Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a virus de la gripe atenuados por ingeniería genética en los que la secuencia aminoacídica de la región del tallo de la proteína neuraminidasa se selecciona del grupo constituido por:

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en el que los restos aminoacídicos se presentan mediante el código de una letra, y a procedimientos para su producción. Pueden utilizarse técnicas de ADN recombinante para introducir una mutación por ingeniería genética incluyendo, pero sin limitación, una inserción, deleción o sustitución de un resto(s) aminoacídico(s) o un epítopo(s) en una región de codificación del genoma viral, de modo que se expresen proteínas virales alteradas o quiméricas por el virus modificado por ingeniería genética. Las alteraciones de las proteínas virales descritas dan también como resultado la atenuación por razones peor entendidas.

Pueden utilizarse muchos procedimientos para introducir las formulaciones de virus vivo atenuado en un sujeto humano o animal para inducir una respuesta inmune: estos incluyen, pero sin limitación, las vías oral, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea e intranasal. Es preferible introducir la vacuna de virus quimérico mediante su vía de infección natural.

Sin embargo, hasta recientemente, los virus de ARN de cadena negativa (por ejemplo, la gripe) no eran susceptibles de manipulación genética específica de sitio porque los ARN virales no son infecciosos. Sin embargo, una técnica recientemente desarrollada, denominada "genética inversa", permite la modificación por ingeniería genética y la producción de virus de ARN de cadena negativa recombinantes.

La técnica de genética inversa implica la preparación de ARN virales recombinantes sintéticos que contienen las regiones no de codificación del virus de cadena negativa que son esenciales para el reconocimiento del ARN viral por las polimerasas virales y para las señales de empaquetamiento necesarias para generar un virión maduro. Los ARN recombinantes se sintetizan a partir de un molde de ARN recombinante y se reconstituyen in vitro con complejo de polimerasa viral purificado formando ribonucleoproteínas (RNP) recombinantes que pueden utilizarse para transfectar células. Se consigue una transfección más eficaz si están presentes las proteínas polimerasa virales durante la transcripción in vitro de los ARN sintéticos. Las RNP recombinantes sintéticas pueden recuperarse en partículas virales infecciosas. Se describen las técnicas anteriores en la solicitud en tramitación junto con la presente de nº de serie 07/527.237, presentada el 22 de mayo de 1990, y en Enami & Palese, 1991, J. Virol. 65: 2711-2713, y virus de la gripe A que contienen inserciones, deleciones y mutaciones con la porción del tallo del gen NA, uno de cuyos cambios actúa como un mutante de espectro de hospedadores. Utilizando la técnica de genética inversa, se modifican por ingeniería genética los siguientes virus de cadena negativa recombinantes: virus de la gripe A que contienen inserciones, deleciones y mutaciones en la porción del tallo del gen NA, una de las cuales actúa como un mutante de espectro de
hospedadores. La invención se discute con más detalle en las subsecciones posteriores y los ejemplos a continuación.

Alteración de las proteínas virales

Un modo de atenuar virus por ingeniería genética implica la introducción de una alteración, incluyendo pero sin limitación una inserción, deleción o sustitución de uno o más restos aminoacídicos y/o epítopos en uno o más de las proteínas virales, dando como resultado un virus de la gripe atenuado por ingeniería genética en el que la secuencia aminoacídica de la región del tallo de la proteína neuraminidasa se selecciona del grupo constituido por:

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en el que los restos aminoacídicos se presentan por el código de una letra.

6. Ejemplo La transcripción reducida y replicación del gen NA de la gripe NA/B-NS es responsable de la atenuación

Para comprender las características moleculares responsables de la atenuación del virus transfectante NA/B-NS, se llevaron a cabo la siguiente serie de experimentos para analizar el virus a escala molecular. Los datos presentados en las subsecciones siguientes indican que la atenuación es el resultado del efecto de elementos en cis alterados en la replicación del gen NA quimérico. Un nivel bajo del gen NA en la preparación de virus da como resultado una mayor proporción de partículas defectivas que la que se encuentra en la preparación de virus de tipo salvaje. Además, los datos apoyan un mecanismo aleatorio para el empaquetamiento de ARNv en partículas del virus de la gripe.

6.1. Materiales y procedimientos 6.1.1. Virus y células

Se prepararon soluciones madre de virus de la gripe A/WSN/33 y virus transfectante NA/B-NS (Muster et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5177-5181) a partir de placas purificadas haciéndolos crecer en células de riñón bovino Madin-Daby (MDBK) en medio MEM reforzado (REM) que contiene 2 \mug/ml de tripsina. Se utilizaron las células MDBK para la infección de virus y el estudio de la síntesis de ARN específico de virus.

6.1.2. Plásmidos

Para generar ribosondas, se construyeron varios plásmidos. El ADN de pSP64-NS contiene el segmento NS entero del virus A/WSN/33 insertado en el sitio Sal I del vector pSP64 en la orientación en la que puede prepararse ARNm con sentido de ARN de NS utilizando ARN polimerasa SP6. El fragmento derivado de pSP64-NS mediante digestión con Hind III y Eco RI se insertó entre los sitios Hind III y Eco RI del vector IBI30. El plásmido resultante IBI30-NS puede producir ARN de NS de sentido negativo utilizando ARN polimerasa T7. Para obtener el plásmido \DeltaT3Nav que produce la sonda de ARN específica de NA con sentido negativo, se acortó el ADN del plásmido pT3NAv (Enami et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3802-3805) eliminando el fragmento entre los sitios Bam HI y Eco RI. Además, se creó un plásmido designado IBI30-NA insertando el fragmento entre los sitios XbaI y Eco RI de pT3NAv en el vector IBI30. Este plásmido puede generar ARN específico de NA con sentido positivo mediante transcripción con polimerasa T7.

6.1.3. Purificación de virus y extracción de ARN

Se hicieron crecer virus de la gripe A/WSN/33 y virus transfectante NA/B-NS en células MDBK, y después se purificaron mediante centrifugación en gradiente de sacarosa al 30-60% como se describe anteriormente (Enami, et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3802-3805). Se resuspendieron los virus purificados de cuatro matraces de 175 cm^{2} de células MDBK en 0,3 ml de tampón TMK (Tris 10 mM, pH 7,5, MgCl_{2} 1,5 mM, KCl 10 mM) y se desestabilizaron mediante incubación con 9 \mul de SDS al 10% y 7,5 \mul de proteinasa K (10 mg/ml) a 56ºC durante 10 minutos, seguido de la adición de 35 \mul de tampón SLN (SDS al 5%, LiCl 1,4 M, NaOAc 100 mM, pH 7,0). Se extrajeron los ARN de virión con fenol-cloroformo y se recogieron mediante precipitación con etanol. Para aislar los ARN virales de células infectadas, se infectaron células MDBK con virus de la gripe A/WSN/33 o virus transfectante NA/B-NS a una m.o.i. de 1, y se recogieron en los puntos temporales indicados. Se lavaron las células dos veces con PBS enfriado con hielo y se lisaron con isotiocianato de guanidinio 4 M (Sigma).

Se purificó después el ARN total mediante centrifugación en equilibrio en cloruro de cesio 5,7 M (Fisher) (Luo et al., 1991, J. Virol. 65: 261-2867).

6.1.4. Determinación de la relación de partículas infecciosas y físicas

Para determinar el número total de partículas físicas de virus de la gripe A/WSN/33 y virus transfectante NA/B-NS, se mezclaron las preparaciones de virus con un volumen igual de una suspensión de perlas de carboxilato de poliestireno (0,1 \mum de diámetro) a una concentración de 4,5 x 10^{9} partículas por ml (Polyscience, Inc., Warrington, PA), y después se tiñeron con ácido fosfotungsténico. Se determinó la relación de virus y perlas de poliestireno mediante recuento de las dos partículas diferentes mediante microscopio electrónico.

Para medir el número de partículas infecciosas en las preparaciones, se diluyeron en serie las soluciones madre y se sembraron en placa en células MDBK.

6.1.5. Electroforesis de ARN

Se sometieron a electroforesis los ARN extraídos del virus de la gripe A/WSN/33 y el virus transfectante NA/B-NS en un gel de poliacrilamida al 3% que contenía urea 7,7 M a 150 voltios durante 2 horas. Se visualizaron los segmentos de ARN mediante tinción con plata como se describe anteriormente (Enami et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 3802-3805).

6.1.6. Ensayo de protección de ribonucleasa

Se utilizó el ensayo de protección de ribonucleasa (RPA) para la cuantificación de ARN de virión en partículas virales, así como para la medida de los ARNm y ARNc virales en células MDBK infectadas. El segmento NS se eligió como control interno. Para medir los ARN de virión, se generaron sondas de ARN específicas de NS y NA de sentido positivo mediante transcripción de duplicación utilizando ARN polimerasa SP6 o T7 en fase y ADN del plásmido PSP64-NS linealizado con Nco I y del plásmido IBI30-NA digerido con Fok I, respectivamente. Para determinar la cantidad de ARNm y ARNc, se transcribieron sondas de ARN específicas de NS y NA con sentido negativo desde ADN de IBI30-NS digerido con Dde I y ADN de \DeltaT3NA cortado con Pvu II, respectivamente, utilizando ARN polimerasa de fago T7 o T3, respectivamente. Se marcaron las sondas de ARN con \alpha^{32}-P[UTP] (800 Ci/mM, Du Pont, NEN, Boston, MA). En general, hibridaron 50 ng de ARN de virión extraído de virus purificado con 5 x 10^{4} cpm cada una de sondas específicas de NS y NA de sentido positivo, o hibridó 5 \mug de ARN total extraído de células infectadas por virus con 5 x 10^{4} cpm de cada una de las sondas específicas de NS y NA de sentido negativo. Después de 12 horas de incubación a 45ºC, se digirió la mezcla de hibridación con ARNasa A/T1 siguiendo las instrucciones del fabricante (Ambion Inc., Austin, Tejas), y se analizaron los productos resultantes en un gel desnaturalizante de acrilamida al 6% (Luo et al., 1990, J. Virol. 64: 4321-4328).

6.1.7. Extensión por cebador

Se cuantificaron los ARN genómicos (ARNv) de los segmentos NA y NS del virus de la gripe A/WSN/33 y el virus transfectante NA/B-NS mediante extensión por cebador (Luo & Taylor, 1990, J. Virol. 64: 4321-4328). Los cebadores para detectar los ARNv específicos de NS y NA son de 21 nt de longitud y son complementarios de ARNv con sentido negativo. El cebador NS, 5'-GGGAACAATTAGGTCAGAAGT-3', cubre la región entre los nucleótidos 695 y 714 del ARNc de NS. El cebador NA, 5'-GTGGCAATAACTAATCGGTCA-3', cubre los nucleótidos 1151 a 1171 del ARNc de NA. Ambos cebadores NS y NA se marcaron en el extremo 5' mediante incubación con \gamma^{32}-P-ATP (3000 Ci/mM, Du Pont, NEN, Boston, MA) y ADN quinasa T4 (Biolabs, Beverly, MA). Se sometieron a transcriptasa inversa 100 ng de ARN extraído del virus o 5 \mug de ARN total aislado de células MDBK infectadas mediante transcriptasa inversa ARNasa H menos MLV (BRL, Gaithersburg, MD) en presencia de 3 x 10^{5} cpm de cada uno de los cebadores NS y NA marcados en el extremo 5'. Después de incubación a 37ºC durante 2 horas, se detuvo la reacción mediante la adición de EDTA 10 mM, y seguido por extracción con fenol-cloroformo y tratamiento alcalino (Luo & Taylor, 1990, J. Virol. 64: 4321-4328). Se analizaron los productos en un gel de poliacrilamida al 6% que contenía urea 7 M. Se midió la cantidad de producto mediante recuento directo de la radiactividad de la pieza de gel correspondiente a cada banda en la película.

6.1.8. Ensayo de neuraminidasa y análisis Western

Para el ensayo de la actividad neuraminidasa de los virus de la gripe A/WSN/33 y transfectante NA/B-NS, se utilizó como sustrato ácido 2'-(4-metilumbeliferil)-\alpha-D-N-acetilneuramínico (Sigma). La mezcla de reacción consistía en 25 \mul de sustrato 2 mM, 25 \mul de virus y 50 \mul de tampón fosfato 0,2 M (pH 6,0) que contenía CaCl_{2} 2 mM. Después de incubación a 37ºC durante 10 minutos, se detuvo la reacción mediante la adición de 2 ml de tampón glicina-NaOH 0,5 M (pH 10,6), y después se determinó la actividad neuraminidasa midiendo la fluorescencia con excitación a 365 nm y emisión a 450 nm, utilizando metilumbeliferona como patrón. Se midió la concentración de proteína de los virus utilizando el kit de ensayo de proteína Bio-Rad. Para el análisis Western de las proteínas NA y HA de los virus WSN/33 y NA/B-NS, se sometieron a electroforesis las proteínas virales en un gel de Laemmli al 10% (Laemmli, 1970, Nature, 227: 680-685), y se transfirieron posteriormente a una membrana de nitrocelulosa (Schleicher & Schuell, Keene, NH). Se utilizó un anticuerpo monoclonal dirigido contra carbohidratos para detectar las glicoproteínas de NA y HA de los virus.

6.1.9. Análisis de la síntesis de proteína en células infectadas

Se infectaron células MDBK (disco de 35 mm) con virus WSN/33 o virus transfectante NA/B-NS a una m.o.i. de aproximadamente 3. Se utilizó esta multiplicidad porque el virus transfectante NA/B-NS no crecía a mayor título. En los momentos indicados, se marcaron las proteínas en medio exento de cisteína con [^{35}S]cisteína (1027 Ci/mmol, Du Pint, NEN Research Products) a 100 \muCi/mol de medio durante 30 minutos. Se lavaron después las células dos veces con tampón PBS enfriado con hielo y se lisaron en 150 \mul de tampón de lisis que contenía 1% de NP-40, NaCl 150 mM, Tris-HCl 50 mM, pH 8,0 y PMSF 1 mM. Se cargó aproximadamente 1/20 de la muestra en un gel Laemmli al 10% (Laemmli, 1970, Nature, 227: 680-685).

6.2. Resultados

Los resultados descritos a continuación indican que los virus de la gripe para los que la síntesis de un segmento de ARNv está regulada negativamente producen partículas defectivas durante la replicación. Puesto que las proteínas del virus NA/B-NS están inalteradas comparadas con el virus de tipo salvaje, la atenuación debe ser el resultado de señales de acción en cis ineficaces.

6.2.1. Relación de partículas infecciosas a físicas

El genoma del virus NA/B-NS transfectante difiere del virus de la gripe de tipo salvaje A/WSN/33 sólo en la región no de codificación del gen NA. Por tanto, es probable que las propiedades biológicas alteradas del virus transfectante sean el resultado de señales en cis alteradas localizadas en la región no de codificación del gen NA quimérico. Específicamente, se observó anteriormente que el virus transfectante crecía a títulos inferiores que el virus de tipo salvaje en células MDBK, células MDCK y en ratones. Además, las curvas de crecimiento de baja multiplicidad en cultivo de tejido estaban significativamente retardadas respecto a las de virus de tipo salvaje (Muster et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5177-5181). Se examinó en el virus transfectante un fenotipo sensible a la temperatura, que podría explicar las características de crecimiento alterado. Sin embargo, el patrón de la curva de crecimiento a 30ºC, 33ºC, 37ºC y 38ºC para el virus NA/B-NS no era diferente del virus de tipo salvaje a las correspondientes temperaturas. Para responder a la pregunta de si estaban presentes partículas defectivas en la preparación de virus NA/B-NS, se caracterizó el virus mediante recuento de las partículas físicas por microscopio electrónico y comparando este número con las unidades formadoras de placa de la preparación. De forma interesante, el virus transfectante NA/NS-B mostró un número similar de partículas físicas que el virus de tipo salvaje, pero coherentemente menores títulos de UFP (Muster et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5177-5181) (Tabla II).

TABLA II

Relación de partículas infecciosas a partículas físicas de virus de la gripe A/WSN/33 y virus transfectante
NA/B-NS
Virus	Nº de partículas físicas (pf)	Nº de partículas infecciosas (pi)	Relación pf/pi
WSN/33	1,8 x 10^{9}/ml	1,2 x 10^{8}/ml	15
NA/B-NS	1,2 x 10^{9}/ml	1,0 x 10^{7}/ml	120

Por tanto, el virus NA/B-NS crecido en células MDBK muestra al menos una relación de partícula infecciosa a partícula física menor de 5 a 10 veces que la observada con el virus de tipo salvaje WSN/33.

6.2.2. Caracterización del ARN del virus atenuado

Puesto que el virus NA/B-NS contiene muchas partículas defectivas, se examinó en el ARN viral la presencia de ARN defectivos. Después de la extracción del virus purificado, se separó el ARN genómico en un gel de poliacrilamida al 3% que contenía urea 7,7 M. Como se muestra en el panel A de la Fig. 2, el ARN de NA quimérico del virus transfectante NA/B-NS es casi invisible en el gel, mientras que los otros siete segmentos están presentes en concentraciones aproximadamente equimolares. Cuando se aumentó la cantidad de ARN en el gel, puede mostrarse que el ARN de NA quimérico migra en la misma posición que el ARN control en la Fig. 2, carril 3. Sin embargo, la electroforesis y tinción con plata no permitieron la cuantificación del ARN de NA quimérico empaquetado en viriones. Con este fin, se realizaron el ensayo de protección de ribonucleasa (RPA) y los experimentos de extensión por cebador. Hibridaron sondas específicas de NS y específicas de NA de sentido positivo en la misma reacción con ARN de virión purificado de virus WSN/33 (Fig. 2, carril 2) o virus transfectante NA/B-NS (Fig. 2, carril 3), y después se digirieron con ARNasa A/T_{1}. Se analizaron los productos resultantes en gel de poliacrilamida al 6% que contenía urea 7 M (Luo et al., 1991, J. Virol. 65: 2861-2867), y se calcularon las cantidades de ARNv mediante recuento de la radiactividad de las secciones de gel correspondientes a las bandas en la película. Como se muestra en el panel B de la Fig. 2, la sonda protegida por el ARN de NA quimérico migra más rápidamente que la del gen de tipo salvaje porque las secuencias no de codificación 5' son diferentes en los dos genes NA. Cuando se compara con el segmento NA del virus WSN/33, la cantidad de ARN de NA quimérico en el virus transfectante es aproximadamente 6 veces menor, utilizando el gen NS como control interno. El experimento de extensión por cebador, como se muestra en el panel C de la Fig. 2, muestra una reducción similar del ARN de NA quimérico empaquetado en viriones respecto al gen NS, sugiriendo una representación menor específica del gen NA quimérico en la preparación de virus transfectante.

6.2.3. Caracterización de la proteína del virus atenuado

Para determinar si el virus transfectante NA/B-NS contenía también o no menos proteína neuraminidasa, se realizaron ensayos de neuraminidasa y un análisis Western de la proteína NA en partícula virales. Para el ensayo enzimático de la neuraminidasa, se determinó primero la concentración total de proteínas virales mediante ensayo de proteína, y después se utilizó la misma cantidad de virus purificado. El virus transfectante NA/B-NS mostró sólo una actividad NA dos veces menor que el virus de tipo salvaje WSN/33. Se obtuvo un dato similar mediante análisis Western, que mostraba 1,9 veces menos proteína NA, pero la misma cantidad de proteína HA, en viriones del virus transfectante NA/B-NS en comparación con los del virus WSN/33 (Fig. 5, panel A).

6.2.4. Síntesis de ARN específica de virus en células infectadas

Basándose en el análisis de ARNv del virus transfectante NA/B-NS, existen pocas dudas de que está contenido en las partículas virales menos ARN de NA quimérico. El nivel inferior de ARN de NA quimérico en los viriones podría estar causado por un cambio en la señal de empaquetamiento que conduce a un empaquetamiento menos eficaz del ARN de NA, o por un cambio en la síntesis del ARN de NA genómico que podría ser el resultado de un reconocimiento ineficaz del promotor específico del virus de la gripe B por la polimerasa viral del virus de la gripe A. Para identificar el mecanismo exacto, se examinó la síntesis del gen NA quimérico en células MDBK infectadas. Considerando que el ARNv se sintetiza principalmente en la fase tardía de infección (Shapiro et al., 1987, J. Virol. 61: 764-773), se extrajo ARN de células a las 7, 8,5 y 10 horas después de la infección. Se utilizaron 5 \mug de ARN total extraído de células infectadas por virus para el análisis de extensión por cebador. Los datos en la Fig. 4 muestran que la síntesis de ARNv del gen NA quimérico estaba notablemente reducida respecto a la del virus control. Cuando se compara con la síntesis de ARN de NA del virus WSN/33, el gen NA quimérico está reducido por un factor de 9, 8 y 8 a 7, 8,5 y 10 horas d.i., respectivamente. Sin embargo, no se observó reducción de la síntesis de ARNv con respecto al segmento NS del virus transfectante NA/B-NS. Este resultado indica que la reducción del ARN de NA quimérico en virus transfectante es el resultado de su menor síntesis en células en lugar de ser debido a un defecto en el empaquetamiento del ARN de NA quimérico.

Para determinar el nivel de síntesis de ARNm del gen NA quimérico, se infectaron células MDBK con virus WSN/33 o virus transfectado NA/B-NS, y se aisló después el ARN total a partir de células infectadas por virus en diferentes momentos después de la infección. Posteriormente, se cuantificó el nivel de ARNm específicos de virus mediante RPA. De nuevo, se utilizó como control el segmento NA (véase la Fig. 3). Por el transcurso temporal, resulta evidente que el nivel de ARNm de NA quimérico está marcadamente reducido respecto al del virus de tipo salvaje, y que sólo aumenta ligeramente con el tiempo. A las 5 horas d.i., el nivel de ARNm de NA quimérico era cinco veces menor que el del virus WSN/33 (panel C), mientras que la síntesis de ARNm específico de NS del virus transfectante NA/B-NS era similar a la del virus WSN/33 en los momentos indicados (panel B). Debe observarse que la síntesis de ARNm específico de NS aparece antes y es más eficaz que la síntesis de ARNm específico de NA en ambas células infectadas por los virus WSN/33 y transfectante NA/B-NS (se utilizaron sondas de actividad similar en el experimento). El dato está bien de acuerdo con informes anteriores (Enami et al., 1985, Virology, 142: 68-77), y sugiere que la síntesis de ARNm de diferentes segmentos de ARN del virus de la gripe está regulada diferencialmente. Las condiciones del ensayo no permitieron la cuantificación del nivel de ARNc del gen NA quimérico porque se encontró que la síntesis de ARNc era sólo un 3-5% de la síntesis de ARNm.

6.2.5. Reducción de la síntesis de proteína NA in vivo

Se encontró que la proteína NA estaba reducida por un factor de dos en viriones del virus transfectante NA/B-NS, mientras que la síntesis de ARNm de NA quimérico estaba mucho más reducida. Surgió después la pregunta de si la proteína NA codificada por el ARNm de NA quimérico dentro de las células es paralela a la cantidad de su ARNm, o si hay una incorporación selectiva de la neuraminidasa a la cubierta viral. Para responder a esta pregunta, se midió la síntesis de proteína NA en células infectadas. Las proteínas virales se marcaron con ^{35}S[cisteína] a 1, 3, 5 y 7 horas después de la infección. Se analizaron después los lisados celulares en un gel Laemmli al 10% (Laemmli, 1970, Nature 227: 680-685), y se cuantificaron las proteínas mediante un sistema de formación de imágenes radioanalíticas AMBIS (Luo & Taylor, 1990, J. Virol. 64: 4321-4328). Como se muestra en el panel B de la Fig. 5, la síntesis de la proteína NA del virus transfectante NA/B-NS fue dos veces menor que la del virus de tipo salvaje tanto a las 5 como a las 7 h d.i. A partir de este experimento, puede concluirse que el ensamblaje de la proteína NA en viriones es paralelo a su síntesis en células infectadas.

7. Ejemplo Pares de bases del ojal implicadas en la atenuación del virus de la gripe

Los experimentos descritos a continuación se diseñaron para identificar las secuencias nucleotídicas responsables de la atenuación y los efectos de la expresión génica sobre la replicación viral.

7.1. Materiales y procedimientos

Se utilizó la técnica de genética inversa para introducir mutaciones por ingeniería genética en la estructura de ojal del segmento NA de la gripe. Los virus y células se prepararon, se purificaron y se analizó la atenuación como se describe en la sección 6.1. y sus subsecciones, anteriormente.

7.2. Resultados 7.2.1. Secuencia de atenuación en la estructura del segundo tronco del promotor viral

Se muestran en la Tabla III a continuación una serie de mutantes quiméricos construidos y de atenuación analizada. Los resultados indican que UCCU/AGGA del mutante de la gripe NA/DeF/AbC son los pares de bases críticos implicados en la atenuación.

7.2.2. Reducción de la proteína y actividad enzimática

Un mutante atenuado adicional, designado NAM-3, tiene la siguiente estructura:

\vskip1.000000\baselineskip

1

NAM-3, como NA/B-NS, demuestra atenuación en que se producen partículas defectivas durante cada serie de replicación. Sin embargo, NAM-3 demostró también una reducción de diez veces de la expresión de neuraminidasa y la actividad enzimática (Tabla IV). Esta reducción de la expresión de la enzima no afectó a la replicación
viral.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA IV

Expresión de NA y actividad en el mutante del virus de la gripe
Cepa	Proteína^{1}	Actividad enzimática^{2}
		10 min	20 min	40 min
WSN-wt	1,00	3,6	5,48	5,17
NAM-3	0,14	0,19	0,26	0,67
^{1} \begin{minipage}[t]{145mm}Intensidades relativas de las bandas de NA expuestas en SDS-PAGE de células infectadas. Véase la sección 6.1.9 para los procedimientos. \end{minipage}
^{2} \begin{minipage}[t]{145mm}Se purificó el virus sobre sacarosa que contenía Ca^{++} como se describe en la sección 6.1.3. Se ensayó la actividad enzimática como se describe en la sección 6.1.8, y se expresa como porcentaje de conversión de sustrato por 1 ng de virus/minuto. \end{minipage}

8. Ejemplo Expresión de epítopos extraños en los sitios antigénicos B o E de ha de la gripe. Resultados en la atenuación

Los experimentos descritos a continuación indican que pueden introducirse alteraciones por ingeniería genética en la región B o E de HA para construir virus de la gripe quiméricos atenuados.

8.1. Materiales y procedimientos

Se utilizaron las técnicas de genética inversa descritas en la sección 6.1.1 anterior para (a) introducir el epítopo de malaria (ME 1) de Plasmodium yoelii (NEDSYVPSAEQI) en el sitio antigénico E de HA de la gripe (véase la Fig. 6A); o (b) introducir el determinante antigénico mayor del poliovirus de tipo 1, concretamente el bucle BC de VP1 de poliovirus de tipo 1 (PASTTNKDKL), en el sitio antigénico B de HA de la gripe (véase la Fig. 6B). La LD_{50} de la gripe quimérica y de tipo salvaje se determinó en ratones mediante el procedimiento de Karber (véase Muster et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5177-5181).

8.2. Resultados

El virus de la gripe/malaria quimérico tenía una LD_{50} 500 a 1000 veces menor que el virus de tipo salvaje cuando se ensayó en ratones. Igualmente, el virus de la gripe/polio quimérico demostró una menor LD_{50}.

9. Ejemplo Deleciones e inserciones del tallo de neuraminidasa del virus de la gripe: generación de un mutante de espectro de hospedadores

Aplicando un sistema genético inverso, se alteró el tallo del gen de neuraminidasa (NA) del virus de la gripe A/WSN/33 haciendo deleciones, inserciones y mutaciones en esta región del gen. Los datos presentados en este ejemplo muestran que la longitud del tallo de NA puede ser variable. De forma interesante, una deleción de 28 aminoácidos dio como resultado un virus mutante de espectro de hospedadores con una tasa de crecimiento marcadamente reducida en células MDCK en comparación con células MDBK. También, una inserción de 41 aminoácidos extra en el tallo no interfirió significativamente con el crecimiento viral en células MDCK ni MDBK, sugiriendo que la región del tallo puede tolerar la introducción de largos epítopos extraños.

9.1. Materiales y procedimientos 9.1.1. Células y virus

Se utilizaron células de riñón bovino Mardin-Darby (MDBK) para transfección de RNP. Se utilizaron células de riñón canino Mardin-Darby (MDCK) y células MDBK para la preparación de virus, así como para la determinación de las características del crecimiento viral. Se hicieron crecer las células MDBK en medio esencial mínimo reforzado (REM) (Whittaker, Walkersville, MD) suplementado con 10% de FCS (GIBCO), y se hicieron crecer las células MDCK en medio esencial mínimo (MEM) (Whittaker), que contenía 10% de FCS (GIBCO). Se mantuvieron las células MDBK y MDCK en REM y MEM que contenían 0,42% de albúmina bovina (AB), respectivamente. Se utilizó virus de la gripe WSN-HK (H1N2), un virus reasociante, para el experimento de transfección de RNP (Enami et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87: 3802-3805). Este virus tiene el gen NA del virus de la gripe A/Hong Kong/8/68 y otros siete segmentos de ARN del virus A/WSN/33, y no crece en células MDBK en ausencia de tripsina. El virus WSN-HK se propagó en huevos de gallina embrionarios de 11 días y se tituló en células MDCK.

9.1.2. Construcción de mutantes NA

Se describió anteriormente (Enami et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3802-3805) el clon pT3NAv, que contiene el ADNc del gen NA del virus de la gripe A/WNS/33. No se encontró un sitio de restricción enzimática único en la región que codificaba el tallo de la proteína NA. Para facilitar la manipulación del tallo de NA, tuvo que modificarse el plásmido pT3NAv. Una de las elecciones fue destruir el sitio Sty I/Dsa I en el nucleótido 875 para que el sitio Sty I en el nucleótido 169 y el sitio Dsa I en el nucleótido 253 se volvieran únicos. Para conseguir esto, se cortó el ADN de pT3NAv mediante Nco I en el nucleótido 875 y se recortó con nucleasa de judía Mung utilizando procedimientos estándar (Sambrook et al., 1989, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Se digirió después el ADN mediante Pst I en el nucleótido 926. Se reemplazó el fragmento entre los nucleótidos 875 y 926 por un fragmento de reacción en cadena con polimerasa (PCR) en el que el nucleótido 877 estaba cambiado por una mutación silenciosa. Se preparó el fragmento de PCR (Erlich, 1989, "PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification", Stockton Press) utilizando pT3Nav como molde y los oligonucleótidos NA01 y NA02 como cebadores (Tabla V). Después de la digestión con Pst I, se ligó el fragmento de PCR al ADN de pT3Nav, que se digirió tanto con Nco I como con Pst I. El pT3NAv modificado se denominó pT3NAmod. Utilizando el clon pT3NAmod, se generó una serie de mutantes NA con deleciones, inserciones y mutaciones en la región del tallo de la proteína NA. Los oligonucleótidos utilizados para preparar estos constructos se muestran en la Tabla V:

2

Se creó Del 16 reemplazando el fragmento entre los sitios Sty I y Dsa I en pT3NAmod por los oligonucleótidos asociados NA03 y NA04. Mediante mutaciones silenciosas, se creó un sitio Ava I único en el plásmido Del 16 (nucleótidos subrayados en la Tabla V). Los mutantes Del 18m, Del 23N y Del 28N se prepararon mediante PCR utilizando pT3NAv como molde y el cebador de secuenciación de codificación de M13/Puc (5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3') y NA05, NA06 y NA08 como cebador, respectivamente. Se digirieron los productos de PCR mediante Eco RI y Ava I, y se insertaron en ADN del plásmido Del 16, que se digirió con las mismas enzimas. Se prepararon también el mutante Del 23C y N72Q/C76S mediante PCR del mismo modo, excepto por utilizar NA07 y NA09 como cebador, respectivamente. Se digirieron los productos de PCR con Dsa I y Eco RI, y se insertaron en pT3NAmod digerido con las mismas enzimas. Se obtuvieron Ins 12 e Ins 24 insertando los oligonucleótidos asociados NA03 y NA04 en el sitio Sty I de pT3NAmod. Ins 24 contiene un duplicado de la inserción presente en Ins 12. Ins 41 se preparó mediante PCR utilizando pT3NAv como molde y los oligonucleótidos NA11 y NA12 como cebadores. Se digirió el fragmento de PCR por Dsa I y se insertó en el sitio Dsa I de pT3NAmod. Para preparar Del 28 C, se cortó el plásmido pT3NAmod con Dsa I, y se rellenó con transcriptasa inversa (BRL, Bethesda, Maryland). Se digirió después el ADN mediante Sty I, se recortó con nucleasa de judía Mung y se ligaron los extremos romos.

9.1.3. Transfección de RNP

Se llevaron a cabo los experimentos de transfección de RNP utilizando el protocolo estándar como se reseñó anteriormente (Enami y Palese, 1991, J. Virol. 65: 2711-2713). Brevemente, se digirieron los ADN de plásmido mediante la enzima de restricción Ksp6321 o Ear I. Se incubó 1 g de ADN linealizado en 10 \mul de nucleoproteína viral y proteínas de polimerasa (aproximadamente 1 \mug) aisladas del virus de la gripe A/PR/8/34 y 100 U de ARN polimerasa T3 (Stratagene, La Jolla, CA) en un volumen de 50 \mul en condiciones de transcripción. Se transfectó después el complejo de RNP reconstituido in vitro en células MDBK, que se infectaron con virus reasociativo WSN-HK a un modo de infectividad (m.o.i.)= 1. A las 20 horas después de la infección, se recogió el sobrenadante y se utilizó para ensayo en placa en células MDBK para seleccionar el virus transfectante.

9.1.4. Preparación de virus y extracción de ARN

Se aislaron virus transfectantes y se amplificaron a partir de placas individuales en células MDBK. Después, se propagaron los virus en matraces grandes de 175 cm^{2} de células MDCK, y se purificaron mediante gradientes de sacarosa de 30-60%. Se extrajo ARN de virión de virus purificados como se describe anteriormente (Luo et al., 1992, J. Virol. 66: 4679-4685).

9.1.5. Electroforesis y tinción con plata de segmentos de ARNv

Se analizó el ARNv extraído de virus en un gel de acrilamida al 2,8% que contenía urea 7,7 M. Se visualizaron después los segmentos de ARNv mediante tinción con plata como se reseñó anteriormente (Enami et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3802-3805).

9.1.6. Transcripción inversa y PCR

Se transcribieron ARN específico de NA de los virus que contenían NA del tipo salvaje o NA mutantes Del 18m, Del 23N y Del 28N mediante transcriptasa inversa (BRL, Bethesda, MD) utilizando el oligonucleótido 5'-GT
CAATCTGTATGGTAGTCGG-3' como cebador, que cubre los nucleótidos 52 a 72. Se amplificaron los transcriptos inversos mediante PCR utilizando el oligonucleótido anterior y el oligonucleótido NA12 (Tabla V) como cebadores (Luo et al., 1991, J. Virol. 65: 2861-2867). Se marcó el cebador NA12 con gamma ^{32}[P]-ATP. Los productos de PCR se desnaturalizaron mediante bases y se analizaron en un gel de poliacrilamida al 6% que contenía urea 7 M.

9.1.7. Curva de crecimiento

Se infectaron células MDBK y MDCK con virus de tipo salvaje y cada uno de los virus transfectantes a una m.o.i. =
0,001, y se mantuvieron en medios REM y MEM que contenían tripsina 0,5 \mug/ml. Se recogieron los sobrenadantes a 12, 24, 36 u 48 horas después de la infección. Se determinó el número de unidades formadoras de placa (UFP) de cada sobrenadante mediante ensayo de placa en células MDBK.

9.2. Resultados

La proteína neuraminidasa (NA) del virus de la gripe funciona durante el ciclo infeccioso como una enzima para retirar los ácidos siálicos terminales. Su acción puede prevenir la autoasociación de las partículas virales, y promueve la liberación de virus durante el brote de células hospedadoras (Palese et al., 1974, Virol. 61: 397-410). NA es una glicoproteína de membrana integral anclada en la membrana viral en forma de un homotetrámero. Cada NA tetramérica aparece como una punta en forma de champiñón (Fig. 7) sobre la superficie del virión cuando se observa al microscopio electrónico (Laver y Valentine, 1969, Virol. 38: 105-119; Wrigley et al., 1973, Virol. 51: 525-529). Estructuralmente, el monómero de NA consiste en cuatro dominios diferentes (Fig. 7): un dominio citoplasmático y uno transmembrana, el tallo fino y la cabeza globular (Blok y Air, 1982, Biochem. 21: 4001-4007; Colman, 1989, en "The Influenza Viruses", R.M. Krug, ed., pág. 175-218, Plenum Press, NY). Aunque se conoce mucho sobre la estructura y el papel de la región de cabeza, la relación estructura-función de la región del tallo se comprende peor. Se presenta a continuación un estudio de la región del tallo de NA en el que se varía la longitud y estructura del tallo mediante deleciones, inserciones y mutaciones.

9.2.1. Recuperación de mutantes de deleción de NA en virus infecciosos

Basándose en las comparaciones de secuencia de diferentes genes de NA del virus de la gripe A, se ha sugerido que la región del tallo de NA varía entre 25 y 57 aminoácidos (Blok y Air, 1982, Biochem. 21: 4001-4007; Blok y Air, 1982, Virol. 118: 229-234; Els et al., 1985, Virol. 142: 241-247; Colman, 1989 en "The Influenza Viruses", R.M. Krug, Ed., pág. 175-218, Plenum Press, NY). La región del tallo de NA del virus de la gripe A/WSN/33 que se utilizó en este estudio tiene aproximadamente 41 aminoácidos de longitud (Blok y Air, 1982, Biochem. 21: 4001-4007; Blok y Air, 1982, Virol. 118: 229-234; Hiti y Hagar, 1982, J. Virol. 41: 730-734; Colman, 1989 en "The Influenza Viruses", R.M. Krug, ed., pág. 175-218, Plenum Press, NY). Se cuestionó primero si los mutantes de NA con grande deleciones podrían recuperarse en partículas virales infecciosas. El primer gen mutante que se construyó, Del 16, carecía de 48 nucleótidos (posición aminoacídica 53-69) (Fig. 8), y después de la transfección de RNP se aisló virus infeccioso. Se separó el ARN purificado en un gel de poliacrilamida al 2,8% que contenía urea 7,7 M, y se mostró que el segmento de NA con la deleción de 48 nucleótidos (Del 16) migraba más rápidamente que el ARN de NA del virus de tipo salvaje (Fig. 9: comparar el carril 1 y el carril 2). Esto sugería que el virus de la gripe A/WSN/33 puede tolerar una neuraminidasa con un tallo de aproximadamente sólo 25 aminoácidos. Se construyó entonces un gen que codificaba NA con una deleción de 28 aminiácidos (Del 28C, Fig. 8). Sin embargo, después de la transfección de RNP, no se recuperó virus infeccioso. Este resultado podría ser debido tanto al truncamiento de la región del tallo como debido a la deleción de un sitio de glicosilación potencial en la posición 74, y/o una cisteína en la posición 76. Puesto que el sitio de glicosilación potencial y el residuo de cisteína están altamente conservados entre diferentes NA (Blok y Air, 1982, Biochem. 21: 4001-4007), se exploró primero la probabilidad de que se destruyeran elementos estructurales importantes mediante esta deleción. Con este fin, se construyeron otros tres mutantes de NA: N72Q/C76S, Del 23C y Del 18m (Fig. 8). En el mutante N72Q/C76S, se mutaron la asparagina (N) en la posición 72 y la cisteína (C) en la posición 76 a glutamina (Q) y serina (S), respectivamente. Aunque este gen tiene la misma longitud del tallo que el gen de tipo salvaje, no pudo recuperarse virus infeccioso. Para diseccionar la contribución del sitio de glicosilación y del resto de cisteína, se construyó el mutante Del 18m cambiando la asparagina en posición 72 a leucina y eliminando los aminoácidos 53 a 71. De forma interesante, se obtuvo un virus de progenie infecciosa después de la transfección de RNP de ARN de NA de Del 18m. Este dato sugiere que la cisteína en posición 76, en lugar del sitio de glicosilación potencial en la posición 72, es esencial para la formación de virus infeccioso. Sin embargo, no estaba claro si pueden tolerarse o no deleciones más allá de la cisteína. Por tanto, se diseñó el mutante Del 23C, en el que se reintrodujeron el sitio de glicosilación potencial y la cisteína en NA, pero se retiraron dos aminoácidos C-terminales a la cisteína. No se obtuvo virus que contuviera el gen mutante Del 23C. Por tanto, parece que la secuencia que sigue a la región del tallo no tolera deleciones, sugiriendo que esta región es parte de la "cabeza" de NA. Sin embargo, no podría descartarse la posibilidad de que el virus mutante Del 23C fuera no infeccioso debido al acortamiento adicional del tronco de NA en 5 aminoácidos. Por lo tanto, se crearon dos constructos más: Del 23N y Del 28N. El mutante Del 23N tiene una deleción de 23 aminoácidos entre los aminoácidos 47 y 69, y el mutante Del 28N tiene una deleción de 28 aminoácidos que empieza en el aminoácido 42 y se extiende hasta el aminoácido 69. Ambos Del 23N y Del 28N dieron como resultado virus de la gripe infecciosos. Esto sugiere que un tallo de NA de aproximadamente 12 aminoácidos basta para generar virus infecciosos. No se extendió el análisis de deleción más allá porque el virus que contenía el NA mutante Del 28N no crece tan bien como el virus de tipo salvaje (véase a continuación), y tiene una deleción que deja sólo unos pocos aminoácidos cerca de la membrana viral en la terminación N y la cisteína en el lado C-terminal. Para verificar que los ARN de NA de los virus mutantes tenían regiones de tallo truncado, se sometieron a transcripción inversa ARN específicos y se analizaron mediante PCR utilizando un cebador marcado. Los tamaños de los productos de PCR de tipo salvaje, Del 18m, Del 23N y Del 28N fueron como se esperaban (Fig. 10, carriles 2-5).

9.2.2. Recuperación de mutantes de inserción de NA en virus infecciosos

El análisis de deleción reveló que la longitud del tallo de NA es flexible. El virus sigue siendo viable incluso cuando contiene un NA cuya región del tallo está casi completamente eliminada. Sin embargo, seguía permaneciendo la pregunta de si el tallo de la molécula de NA puede tolerar la inserción de aminoácidos extra. Para responder a esto, se insertaron 12 y 24 aminoácidos en la región del tallo de NA entre los aminoácidos 50 y 51, como se muestra en la Fig. 8 (Ins 12 e Ins 24, respectivamente). Después de la transfección de RNP, se recuperaron ambos ARN de NA mutantes Ins 12 e Ins 24 en virus transfectantes infecciosos. El hecho de que estos dos mutantes de NA fueran viables, condujo a la inserción de aminoácidos adicionales. Con este fin, se generó el NA mutante Ins 41 insertando 41 aminoácidos entre la posición 39 y 40. El mutante Ins 41 contiene una duplicación en el tallo de NA. De nuevo, se recuperaron virus infecciosos, indicando que el tallo de NA tolera una inserción de 41 aminoácidos. Se analizaron los ARN purificados de virus mutantes Ins 12, Ins 24 Ins 41 en un gel de poliacrilamida, y se encontró que los ARN de NA recuperados migraban en las posiciones esperadas (Fig. 9, carriles 3, 4 y 5).

9.2.3. Características de crecimiento de los virus transfectantes NA

Para determinar si las deleciones e inserciones en la región del tallo de la molécula de NA tienen efectos sobre el crecimiento viral, se caracterizaron los virus transfectantes en células MDBK y MDCK. Los resultados se muestran en la Fig. 11. Puesto que todos los virus mutantes se recuperaron aislando virus de progenie en células MDBK para permitir la selección frente al virus auxiliar, no es sorprendente que todos los mutantes crezcan en este tipo de células (Fig. 11A). Parece que el mutante Del 28N y el mutante Ins 24 crecen ligeramente más lentos y a menores títulos que los mutantes restantes o el virus de tipo salvaje. Debe observarse también que la línea celular MDBK actualmente en uso proporciona títulos totales menores que otras líneas celulares MDBK. Los rendimientos en las células MDCK (Fig. 11B) son mayores en aproximadamente una unidad logarítmica, excepto aquellos del mutante Del 18m y el mutante Del 28N, que crecen a 10^{2} y 10^{4} veces menos título, respectivamente, que el virus de tipo salvaje. Por tanto, el mutante Del 28N es un mutante de espectro de hospedadores que crece aproximadamente 1.000 veces menos eficazmente en células MDCK en comparación con células MDBK.

Claims

1. Un virus de la gripe atenuado por ingeniería genética en el que la secuencia aminoacídica de la región del tallo de la proteína neuraminidasa se selecciona del grupo constituido por:

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en el que los restos aminoacídicos se presentan mediante el código de una sola letra.

2. Una preparación de vacuna que comprende un virus atenuado de la reivindicación 1.

3. Un procedimiento para generar el virus de la gripe atenuado de la reivindicación 1, que comprende las etapas de:

(a) introducir un molde de ARN de cadena negativa recombinante que codifica la secuencia aminoacídica de la región del tallo de la proteína neuraminidasa de la reivindicación 1 en una línea celular que incluye un virus auxiliar capaz de producir segmentos de ARN del virus de la gripe;

(b) recoger el virus de la línea celular.

4. Un procedimiento para la preparación de la preparación de vacuna de la reivindicación 2, que comprende las etapas de:

(b) recoger el virus de la línea celular; y

(c) formular el virus atenuado en una vacuna.

5. Un procedimiento in vitro para generar el virus de la gripe atenuado de la reivindicación 1, que comprende las etapas de:

(a) sintetizar los ARN del virus de la reivindicación 1 a partir de un molde de ADN recombinante;

(b) formar ribonucleoproteínas recombinantes (RNP) in vitro con complejo de polimerasa viral purificado; y

(c) transfectar una célula con las RNP de la etapa (b).