ES2247586T3 - Conjugados polimero-peptido. - Google Patents

Abstract

UN COMPLEJO DE PEPTIDO CONJUGADO ESTABILIZADO QUE COMPRENDE UN PEPTIDO CONJUGADAMENTE ACOPLADO A UN POLIMERO QUE COMPRENDE UNIDADES LIPOFILICA E HIDROFILICA, DONDE EL PEPTIDO PUEDE SER INSULINA, CALCIOTONINA O UNA ENZIMA.EN UN ASPECTO PARTICULAR, LA INVENCION COMPRENDE UNA COMPOSICION DE INSULINA APROPIADA PARA ADMINISTRACION PARENTERAL ASI COMO NO PARENTERAL, QUE COMPRENDE INSULINA COVALENTEMENTE ACOPLADA A UN POLIMERO QUE COMPRENDE UNA UNIDAD DE GLICOL DE POLIALQUILENO LINEAL Y UNA UNIDAD LIPOFILICA, DONDE LA INSULINA, LA UNIDAD DE GLICOIDE POLIALQUILENO LINEAL Y LA UNIDAD LIPOFILICA ESTAN DISPUESTA EN CONFORMACION UNA RESPECTO DE OTRA DE MANERA QUE LA INSULINA EN LA COMPOSICION TIENE UNA RESISTENCIA IN VIVO REALZADA A LA DEGRADACION ENZIMATICA, RELATIVA SOLO A LA INSULINA. LOS CONJUGADOS DE LA INVENCION SON EMPLEADOS UTILMENTE EN APLICACION TERAPEUTICA, Y NO TERAPEUTICA DE DIAGNOSTICO COMO SE MUESTRA EN LA FIGURA.

Description

Conjugados polímero-péptido.

Campo del invento

El invento se refiere a conjugados polímero-péptido y formulaciones, y a métodos para hacerlos y usarlos.

Descripción de la técnica relacionada

El uso de polipéptidos y proteínas para el tratamiento sistémico de ciertas enfermedades es ahora bien aceptado en la práctica médica. El papel que los péptidos juegan en la terapia de reemplazamiento es tan importante que muchas actividades de investigación están siendo dirigidas hacia la síntesis de grandes cantidades mediante tecnología de ADN recombinante. Muchos de estos polipéptidos son moléculas endógenas que son muy potentes y específicas en lo referente a provocar sus acciones biológicas.

Un factor importante que limita la utilidad de estas sustancias para su aplicación prevista es que son fácilmente metabolizables mediante proteasas plasmáticas cuando son dadas parenteralmente. La ruta oral de administración de estas sustancias es aún mas problemática debido a que además de la proteólisis en el estómago, la elevada acidez del estómago las destruye antes de que alcancen su tejido diana previsto. Los polipéptidos y fragmentos proteicos, producidos mediante la acción de las enzimas gástricas y pancreáticas, son cortados mediante exo- y endopeptidasas en la membrana del borde en cepillo intestinal para dar di- y tripéptidos, y aún si se evita la proteólisis mediante enzimas panceráticas, los polipéptidos son sometidos a degradación por las peptidasas del borde en cepillo. Cualquiera de los péptidos dados que sobreviven al paso a través del estómago son sometidos adicionalmente al metabolismo en la mucosa intestinal donde una barrera de penetración impide la entrada en las células.

Pese a estos obstáculos, hay evidencia sustancial en la bibliografía que sugiere que las proteínas nutricionales y farmacéuticas son absorbidas a través de la mucosa intestinal. Por otro lado, los (poli)péptidos nutricionales y fármacos son absorbidos por transportadores peptídicos específicos en las células de la mucosa intestinal. Estos hallazgos indican que los (poli)péptidos y proteínas formulados apropiadamente pueden ser administrados mediante la ruta oral, con retención de suficiente actividad biológica para su uso previsto. Si, sin embargo, fuera posible modificar estos péptidos a modo que sus actividades fisiológicas fueran mantenidas totalmente, o al menos a un grado significativo, y al mismo tiempo estabilizarlos frente a enzimas proteolíticas y potenciar su capacidad de penetración a través de la mucosa intestinal, entonces sería posible utilizarlos apropiadamente para su propósito previsto. El producto así obtenido ofrecería ventajas en que resultaría una absorción más eficiente, con la capacidad concomitante para usar dosis más bajas para obtener el efecto terapéutico óptimo.

Los problemas asociados con una administración oral o parenteral de proteínas son bien conocidos en la industria farmacéutica, y diversas estrategias están siendo utilizadas en un intento de solucionarlos. Estas estrategias incluyen la incorporación de potenciadores de la penetración, tales como los salicilatos, micelas mixtas lípido-sal biliar, glicéridos, y acilcarnitinas, pero se encuentra frecuentemente que éstas causan problemas de toxicidad local graves, tales como irritación y toxicidad local, abrasión completa de la capa epitelial e inflamación del tejido. Estos problemas surgen debido a que los potenciadores son normalmente coadministrados con el producto peptídico y pérdidas a partir de la forma de dosificación tienen lugar con frecuencia. Otras estrategias para mejorar el suministro oral incluyen mezclar los polipéptidos con inhibidores de proteasas, tales como aprotinina, inhibidor de la tripsina de soja, y amastatina, en un intento de limitar la degradación del agente terapéutico administrado. Desgraciadamente esos inhibidores de proteasas no son selectivos, y las proteínas endógenas son también inhibidas. Este efecto no es deseable.

La penetración potenciada de los péptidos a través de las membranas de las mucosas también ha sido buscada mediante la modificación de las propiedades fisicoquímicas de los fármacos candidatos. Los resultados indican que simplemente elevando la lipofilicidad no es suficiente para aumentar el transporte paracelular. En verdad, se ha sugerido que cortar los enlaces péptido-puentes de hidrógeno es la principal barrera de energía a superar para obtener la difusión del péptido a través de las membranas (Conradi, R.A., Hilgers, A.R., Ho, N.F.H., y Burton, P.S., "The influence of peptide structure on transport across Caco-2 cells", Pharma. Res., 8, 1453-1460, (1991)). La estabilización de proteínas ha sido descrita por varios autores. Abuchowski y Davis ("Soluble polymers-Enzyme adducts", En: Enzymes as Drugs, eds. Holcenberg y Roberts, J.Wiley and Sons, New York, NY, (1981)) describen diversos métodos de derivatización de enzimas para proporcionar productos estabilizados, hidrosolubles, no inmunogénicos, in vivo.

Se ha publicado una gran cantidad de trabajos que tienen que ver con la estabilización de proteínas. Abuchowski y Davis describieron diversos modos de conjugar enzimas con materiales poliméricos (Ibid.). Más específicamente, estos polímeros son dextranos, polivinipirrolidonas, glicopéptidos, polietilénglicol y poliaminoácidos. Los polipéptidos conjugados resultantes han sido documentados que conservan sus actividades biológicas y solubilidad en agua a partir de aplicaciones parenterales. Los mismos autores, en el documento de patente norteamericana No 4.179.337, describen que el polietilenglicol volvió las proteínas solubles y no inmunogénicas cuando se acopló a tales proteínas. Estos materiales poliméricos, sin embargo, no contuvieron fragmentos adecuados para la unión a la mucosa intestinal, ni contuvieron ningún resto que facilitara o potenciara la penetración de las membranas. Mientras que estos conjugados fueran hidrosolubles, no se pretendió que fueran para administración oral.

Meisner y otros, documento de patente norteamericana Nº 4.585,754, muestra que las proteínas pueden ser estabilizadas conjugándolas con condroitínsulfatos. Los productos de esta combinación son normalmente polianiónicos, muy hidrofílicos, y con una falta de capacidad de penetración celular. No se pretende normalmente que sean para administración oral.

Mill y otros, documento de patente norteamericana Nº 4.003.792, muestra que ciertos polisacáridos ácidos, tales como pectina, ácido algésico, ácido hialurónico y carageenan, pueden ser acoplados a proteínas para producir tanto productos solubles como insolubles. Tales polisacáridos son polianiónicos, derivados a partir de plantas alimenticias. Carecen de capacidad de penetración celular y normalmente no se pretende que sean para administración oral.

En Pharmacological Research Communication 14, 11-120 (1982), Boccu y otros, describió que el polietilenglicol podía estar unido a una proteína tal como superóxido dismutasa ("SOD"). El producto conjugado resultante mostró una estabilidad aumentada frente a la desnaturalización y digestión enzimática. Los polímeros no contuvieron restos que eran necesarios para la interacción de las membranas y por tanto adolecen de los mismos problemas como se observó anteriormente en que no son adecuados para administración oral.

Otras técnicas para estabilizar fármacos peptídicos y proteicos en los que las sustancias farmacéuticas proteináceas están conjugadas con compuestos de relativamente bajo peso molecular tales como aminoleticina, ácidos grasos, vitamina B_{12}, y glicósidos, son revelados en los siguiente artículos: R. Igarishi y otros, ``Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Materials, 17, 366, (1990); T. Taniguchi y otros Ibid 19, 104, (1992); G.J. Russel-Jones, Ibid, 19, 102, (1992); M. Baudys y otros, Ibid, 19, 210, (1992). Los compuestos modificadores no son polímeros y consecuentemente no contienen restos necesarios para transmitir tanto la solubilidad como la afinidad a la membrana necesarias para la biodisponibilidad tras administración oral como parenteral. Muchas de estas preparaciones carecen de biodisponibilidad oral.

Otra aproximación que ha sido tomada para alargar la duración in vivo de la acción de las sustancias proteináceas es la técnica de encapsulación. M. Saffan y otros, en Science, 223, 1081, (1986) muestra la encapsulación de fármacos poteináceos en una película de azopolímeros para administración oral. La película ha sido documentada que sobrevive a la digestión en el estómago pero que es degradada por la microflora en el intestino grueso, donde la proteína encapsulada es liberada. La técnica utiliza una mezcla física y no facilita la absorción de la proteína liberada a través de la membrana.

Ecanow, en documento de patente norteamericana Nº 4.963.367, muestra que los compuestos fisiológicamente activos, incluyendo las proteínas, pueden ser encapsuladas mediante una película derivada de un coacervante y el producto acabado puede ser adecuado para la administración transmucosal. Otras formulaciones del mismo invento pueden ser administradas mediante rutas de inhalación, oral, parenteral y transdérmica. Estas aproximaciones no proporcionan estabilidad intacta frente a la acidez y enzimas proteolíticas del tracto gastrointestinal, la propiedad como se desea para el suministro oral.

Otra aproximación tomada para estabilizar fármacos proteicos para administración oral así como parenteral implica el atrapamiento del agente terapéutico en liposomas. Una revisión de esta técnica se encuentra en Y. W. Chien, "New Drug Delivery Systems", Marcel Dekker, Nueva York, NY, 1992. Los complejos liposoma-proteína son mezclas físicas; su administración da resultados erráticos e impredecibles. La acumulación no deseable del componente proteico en ciertos órganos ha sido documentada, en el uso de tales complejos liposoma-proteína. Además de estos factores, hay inconvenientes adicionales asociados con el uso de liposomas, tales como el coste, procesos de fabricación difíciles que requieren ciclos de lipofilización complejos, e incompatibilidades con los disolventes. Por otro lado, la biodistribución alterada y las cuestiones de antigenicidad han surgido como factores limitantes en el desarrollo de formulaciones liposomales útiles clínicamente.

El uso de "proteinoides" ha sido descrito recientemente (Santiago, N., Milstein, S.J., Rivera, T., Garcia, E., Chang., T.C., Baughman, R.A., y Bucher, D., "Oral Immunization of Rats with Influenza Virus M Protein (M1) Microspheres", Resumen nº A 221. Proc. Int. Symp. Control. Rel. Bioac. Mater, 19, 116, (1992)). El suministro oral de varias clases de agentes terapéuticos ha sido documentado usando este sistema, que encapsula el fármaco de interés en una funda polimérica compuesta de aminoácidos altamente ramificados. Como es el caso con los liposomas, los fármacos no están químicamente unidos a la esfera proteinoide, y las pérdidas de fármaco fuera de los componentes de la forma de dosificación son posibles.

Un péptidos que ha sido el centro de atención de muchos trabajos de síntesis, y esfuerzos para mejorar su administración y bioasimilación, es la insulina.

El uso de la insulina como un tratamiento para la diabetes data de 1992, cuando Banting y otros ("Pancreatic extracts in the Treatment of Diabetes mellitus", Can. Med. Assoc. J., 12, 141-146 (1922)) demostraron que el extracto activo del páncreas tenía efectos terapéuticos en perros diabéticos. El tratamiento de pacientes diabéticos en el mismo año con extractos pancreáticos dio como resultado una mejora dramática, que salvaba vidas clínicamente. Un curso de inyecciones diarias de insulina es requerido para la recuperación de gran extensión.

La molécula de insulina consiste en dos cadenas de aminoácidos unidos mediante puentes disulfuro; el peso molecular de insulina es alrededor de 6000. Las células \beta de los islotes pancreáticos secretan un precursor de insulina de cadena única, conocido como proinsulina. La proteólisis de la proinsulina da como resultado la eliminación de cuatro aminoácidos básicos (números 31, 32, 64 y 65 en la cadena proinsulina: Arg, Arg, Lys, Arg respectivamente) y el péptido ("C") conector. En la molécula de insulina de dos cadenas resultante, la cadena A tiene glicina en el extremo amino, y la cadena B tiene fenilalanina en el extremo amino.

La insulina puede existir como un monómero, dímero o un hexámero formado a partir de tres de los dímeros. El hexámero es coordinado con dos átomos de Zn^{2+}. La actividad biológica reside en el monómero. Aunque hasta hace poco la insulina bovina y porcina eran usadas casi exclusivamente para tratar la diabetes en humanos, numerosas variaciones en insulina entre especies son conocidas. La insulina porcina es la más similar a la insulina humana, de la que difiere sólo por tener una alanina más que un residuo de treonina en el extremo C de la cadena B. Pese a estas diferencias la mayoría de insulina de mamífero tiene una actividad específica comparable. Hasta hace poco los extractos animales proporcionaron todas las insulinas usadas para el tratamiento de la enfermedad. La llegada de la tecnología recombinante permite la fabricación a escala comercial de la insulina humana (por ejemplo, insulina Humulin™, disponible comercialmente a partir de Eli Lilly and Company, Indianápolis, IN).

Aunque la insulina ha sido usada ahora por más de 70 años como un tratamiento para la diabetes, pocos estudios de su estabilidad de formulación aparecieron hasta hace dos publicaciones recientes (Brange, J., Langkjaer, L., Havelund, S., and V\varnothinglund, A., "Chemical stability of insulin. I. Degradation during storage of pharmaceutical prepararions", Pharm. Res., 9, 715-726, (1992); y Brange, J. Havelund, S., y Gougaard, P., "Chemical stability of insulin. 2. Formulation of higher molecular weight transformation products during storage of pharmaceutical preparations", Pharm. Res., 9, 727-734, (1992)). En estas publicaciones, los autores describen exhaustivamente la estabilidad química de varias preparaciones de insulina a diversas temperaturas y condiciones de pH. Documentos anteriores se enfocaron casi en su totalidad en la potencia biológica como una medida de estabilidad de la formulación de insulina. Sin embargo la llegada de varias técnicas analíticas nuevas y potentes-electroforesis en disco, cromatografía de exclusión por tamaño, y HPLC- permite un examen detallado del perfil de estabilidad química de la insulina. Los estudios químicos anteriores sobre la estabilidad de la insulina fueron difíciles debido a que la insulina recristalizada sometida a examen se encontró que no era más pura del 80-90%. Más recientemente una insulina monocomponente de elevada pureza está disponible. Esta insulina monocomponente contiene impurezas a niveles indetectables mediante técnicas de análisis corrientes.

La insulina formulada es propensa a numerosos tipos de degradación. La desamidación no enzimática tiene lugar cuando un grupo amida de la cadena lateral a partir de un residuo glutaminil o asparaginil es hidrolizada hasta un ácido carboxílico. Hay seis sitios posibles para tal desamidación en la insulina: Gln^{A5}, Gln^{A15}, Asn^{A18}, Asn^{A21}, Asn^{B3}, y Gln^{B4}. Documentos publicados sugieren que los tres residuos Asn son más susceptibles a tales reacciones.

Brange y otros (Ibid) documentó que en condiciones ácidas la insulina es rápidamente degradada mediante una desaminación extensa en Asn^{A21}. Por el contrario, en formulaciones neutras la desamidación tiene lugar en Asn^{B3} a una velocidad mucho más lenta, independiente de la concentración de insulina y especie de origen de la insulina. Sin embargo, la temperatura y el tipo de formulación juegan un papel importante en determinar la velocidad de hidrólisis a B3. Por ejemplo, la hidrólisis a B3 es mínima si la insulina es cristalina a diferencia de si es amorfa. Aparentemente la flexibilidad reducida (estructura terciaria) en la forma cristalina ralentiza la velocidad de reacción. La estabilización de la estructura terciaria incorporando fenol en formulaciones neutras da como resultado velocidades de desamidación reducidas.

Además de los productos de degradación hidrolítica en las formulaciones de insulina, se forman también los productos de transformación de alto peso molecular. Brange y otros mostró mediante cromatografía de exclusión por tamaño que los productos principales formados en almacenamiento de formulaciones de insulina entre 4 y 45ºC son dímeros de insulina covalentes. En formulaciones que contienen protamina, se forman también los productos de protamina de insulina covalentes. La velocidad de formulación de los productos insulina-dímero e insulina-protamina es significativamente afectado por la temperatura. Para la insulina humana o porcina, (preparación N1 regular) tiempo de formación de productos de alto peso molecular al 1% disminuye desde 154 meses hasta 1,7 meses a 37ºC comparado con 4ºC. Para las preparaciones de la insulina porcina en suspensión de zinc, la misma transformación requeriría 357 meses a 4ºC pero sólo 0,6 meses a 37ºC.

Estos tipos de degradación en insulina pueden ser de mayor significancia a sujetos diabéticos. Aunque la formación de productos de alto peso molecular es generalmente más lenta que la formación de productos de degradación hidrolítica (química) descritos anteriormente, las implicaciones pueden ser más serias. Hay evidencias significativas de que la incidencia de respuesta inmunológicas a insulina puede resultar de la presencia de agregados de insulina covalentes (Robbins, D. C. Cooper, S. M. Fineberg, S. E., y Mead, P. M., "Antibodies to covalent aggregates of insulin in blood of insulin-using diabetic patients", Diabetes, 36, 838-841, (1987); Maislos, M., Mead, P.M., Gaynor, D. H., y Robbins, D. C., "The source of the circulating aggregate of insulin in type I diabetic patients is therapeutic insulin", J. Clin. Invest. 778, 717-723 (1986); y Ratner R. E. Phillips, T. M., y Steiner, M. "Persistent cutaneous insulin allergy resulting from high molecular weight insulin aggregates", Diabetes, 39, 728-733, (1990)). Hasta un 30% de sujetos diabéticos que reciben insulina muestran anticuerpos específicos frente a dímeros de insulina covalentes. A un nivel tan bajo como un 2% se documentó que la presencia de dímeros de insulina covalentes generó una respuesta significativamente elevada en estimulación linfocitaria en pacientes alérgicos. Las respuestas no fueron significativas cuando el contenido en dímeros estaba en el intervalo de 0,3-0,6%. Como resultado se recomienda que el nivel de dímeros de insulina covalente presente en la formulación se mantuviera por debajo del 1% para evitar manifestaciones clínicas.

Varias formulaciones de insulina están disponibles comercialmente; aunque la estabilidad ha sido mejorada hasta el extremo de que ya no es necesario refrigerar todas las formulaciones, queda una necesidad de formulaciones de insulina con una estabilidad potenciada. Una insulina modificada que no es propensa a la formación de productos de alto peso molecular sería un avance sustancial en las técnicas farmacéutica y médica, y las modificaciones que proporcionan esta estabilidad (y además proporcionan la posibilidad de una disponibilidad oral de la insulina) harían una contribución significativa al tratamiento de la diabetes.

Además del uso in vivo de los polipéptidos y proteínas como agentes terapéuticos, los polipéptidos y proteínas también encuentran un uso sustancial y creciente en aplicaciones de reactivos de diagnóstico. En muchas aplicaciones, los polipéptidos y las proteínas son utilizadas en entornos en disolución en los que son susceptibles de degradación térmica y enzimática de los (poli)péptidos y proteínas tales como enzimas, péptidos y hormonas proteicas, anticuerpos, conjugados enzima-proteínas usados para inmunoensayos, conjugados anticuerpo-hapteno, proteínas virales tales como las usadas en un gran número de metodologías de ensayo para diagnosis o cribado de enfermedades tales como SIDA, hepatitis y rubeola, factores de crecimiento peptídicos y proteicos usados por ejemplo en cultivo tisular, enzimas usadas en química clínica, y enzimas insolubles tales como las usadas en la industria alimentaria. Como un ejemplo específico adicional, la fosfatasa alcalina es ampliamente utilizada como un reactivo en kits usados para la detección colorimétrica de anticuerpos o antígenos en fluidos biológicos. Aunque tal enzima está disponible comercialmente en diversas formas, incluyendo enzima libre y conjugados de anticuerpos, su estabilidad en almacenamiento y disolución es con frecuencia limitada. Como resultado, los conjugados de fosfatasa alcalina están frecuentemente liofilizados, y aditivos tales como albúmina de suero bovina y Tween 20 son usados para alargar la estabilidad de las preparaciones enzimáticas. Tales aproximaciones, aunque ventajosas en algunos casos para potenciar la resistencia a la degradación de los agentes polipeptídicos y proteicos, tienen diversos defectos que limitan su aplicabilidad general.

Sumario del invento

El presente invento se refiere generalmente a conjugados polímero-péptido y formulaciones, y a métodos para hacerlos y usarlos.

Más particularmente, el presente invento se refiere en un aspecto composicional amplio a complejos peptídicos covalentemente conjugados en los que el péptido está covalentemente unido a una o más moléculas de un polímero que incorpora como una parte integral del mismo un resto hidrofílico, por ejemplo, un polialquilenglicol lineal, y en el que dicho polímero incorpora un resto lipofílico como una parte integral del mismo.

En un aspecto particular, el presente invento se refiere a una composición peptídica fisiológicamente activa que comprende un péptido fisiológicamente activo unido covalentemente con un polímero que comprende (i) un resto polialquilenglicol lineal y (ii) un resto lipofílico, en el que el péptido, resto polialquilenglicol lineal, y el resto lipofílico están ordenados conformacionalmente en relación al otro de modo que el péptido fisiológicamente activo en la composición peptídico fisiológicamente activo tiene una resistencia in vivo potenciada a la degradación enzimática, relativo al péptido fisiológicamente activo solo (es decir, en una forma sin conjugar desprovista del polímero al cual está acoplado).

El término "péptido" como se usa aquí pretende ser ampliamente interpretado incluyendo polipéptidos per se que tienen pesos moleculares de hasta alrededor de 10.000, así como proteínas que tienen pesos moleculares tan altos como alrededor de 10.000, en los que los pesos moleculares son pesos moleculares de número promedio. Como se usa aquí el término "covalentemente unido" significa que los restos especificados son tanto directamente unidos covalentemente entre sí, o también están unidos covalentemente de modo indirecto entre sí a través de un resto o restos de modo indirecto, tal como un puente, espaciador, o resto o restos de unión. El término "acoplado conjugativamente" significa que los restos especificados están unidos covalentemente entre sí o están unidos de modo no covalente entre sí, por ejemplo, mediante puentes de hidrógeno, uniones iónicas, fuerzas de Van der Waals, etc.

El invento por lo tanto comprende diversas composiciones para aplicación terapéutica (in vivo), en la que el componente peptídico del complejo peptídico conjugado es un péptido fisiológicamente activo, o bioactivo. En tales composiciones que contienen péptidos, la conjugación del componente peptídico al polímero que comprende restos hidrofílicos y lipofílicos puede ser una unión covalente o una unión indirecta (a través de grupos espaciadores apropiados), y los restos hidrofílicos y lipofílicos pueden estar también ordenados estructuralmente en la estructura conjugante polimérica en una manera adecuada que implica una unión covalente directa o indirecta, relativa entre sí. Así, una amplia variedad de especies peptídicas pueden acomodarse en la amplia práctica del presente invento, según sea necesario o deseable en una aplicación terapéutica de uso final dada.

En otro aspecto, las composiciones peptídicas acopladas covalentemente tales como las descritas anteriormente pueden utilizar componentes peptídicos que se pretende que sean para diagnóstico o aplicaciones in vitro, en las que el péptido es por ejemplo un reactivo diagnóstico, un complemento de un conjugado diagnóstico para inmunoensayo u otras aplicaciones diagnósticas o no in vivo. En tales aplicaciones no terapéuticas, los complejos peptídicos del invento son altamente empleados útilmente como composiciones estabilizantes que pueden ser formuladas por ejemplo en disolventes compatibles u otras formulaciones basadas en disoluciones para proporcionar formas composicionales estables que son de una resistencias potenciada a la degradación.

En las aplicaciones terapéuticas y no terapéuticas (por ejemplo diagnósticas) precedentes, el presente invento se refiere en un aspecto composicional amplio a complejos peptídicos conjugados covalentemente en los que el péptido está unido covalentemente a una o más moléculas de un polímero que incorpora como parte integral de dicho polímero un resto hidrofílico, por ejemplo un resto polialquilenglicol, y un resto lipofílico, por ejemplo, un resto ácido graso. En un aspecto preferido, el péptido puede estar conjugado covalentemente mediante una unión covalente con una o más moléculas de un polímero polialquilenglicol lineal incorporado en el que como parte integral del mismo está un resto lipofílico, por ejemplo, un resto ácido graso.

En otro amplio aspecto particular, el presente invento se refiere a complejos peptídicos conjugados covalentemente en los que el péptido está asociado de modo no covalente con una o más moléculas de un polímero que incorpora como una parte integral del mismo un resto hidrofílico, por ejemplo, un resto polialquilenglicol, y un resto lipofílico, por ejemplo un resto ácido graso. El polímero puede estar estructurado de modo variado y ordenado de modo análogo a la descripción del polímero en los complejos peptídicos conjugados de modo covalente descritos anteriormente, pero en los que el péptido no está unido a la(s) molécula(s) poliméricas de un modo covalente, pero está sin embargo asociado con el polímero, como por ejemplo mediante unión asociativa, tal como una unión por puente de hidrógeno, una unión iónica, o por acomplejamiento, por uniones de Van der Waals, encapsulación o asociación (del péptido específico), etc.

Tales asociaciones no covalentes de un componente peptídico y resto(s) poliméricos pueden utilizar por ejemplo un componente peptídico para aplicaciones terapéuticas (por ejemplo, in vivo), así como componentes peptídicos no terapéuticos, por ejemplo, para diagnóstico u otro uso (in vitro).

En tales composiciones peptídicas conjugadas asociativamente, el componente polimérico puede ser construido, modificado o funcionalizado apropiadamente de modo adecuado para transmitir la capacidad para una conjugación asociativa en una manera selectiva (por ejemplo, para transmitir la capacidad de unión por puente de hidrógeno al polímero viz-a-vis el péptido), dentro del conocimiento de la técnica.

Otros aspectos, características, y modificaciones del invento serán más completamente evidentes a partir de la descripción que sigue y reivindicaciones anexas.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una gráfica de glucosa sérica, en mg/dl, como una función del tiempo, en minutos, para administración de insulina per se y en formas acomplejadas.

La Figura 2 es una gráfica de glucosa sérica, en mg/dl, como una función del tiempo, en horas, para administración de insulina en varias formas.

La Figura 3 es una gráfica de digestión por quimotripsina de la insulina y la insulina OT como una función del tiempo.

La Figura 4 es una gráfica de calcio sérico en ratas como una función del tiempo cuando las ratas fueron administradas oralmente con conjugados de calcitonina poliméricos.

La Figura 5 es una gráfica de barras que muestra niveles de calcio sérico de ratas como una función del tiempo, cuando las ratas fueron administradas oralmente con calcitonina polimérica OT1-ct o conjugados de calcitonina polimérica OT2-ct.

La Figura 6 muestra una gráfica de barras de los efectos de la insulina polimérica en modelos de ratas diabéticas.

La Figura 7 es una gráfica que muestra el efecto de insulina 001 administrada oralmente en monos cinomolgus como un efecto de la dosis a lo largo del tiempo.

Descripción detallada del invento, y realizaciones preferidas del mismo

La modificación de péptidos con polímeros no tóxicos, no inmunogénicos pueden ofrecer ciertas ventajas. Si las modificaciones son hechas de tal modo que los productos (conjugados polímero-péptido) conserven toda o la mayoría de sus actividades biológicas las siguientes propiedades pueden resultar: la capacidad de penetración epitelial puede ser potenciada; el péptido modificado puede ser protegido de digestión proteolítica y abolición subsiguiente de la actividad; afinidad por los sistemas de transporte endógeno pueden ser mejorados; la estabilidad química frente a la acidez estomacal puede ser conferida; el equilibrio entre lipofilicidad e hidrofobicidad de los polímeros puede ser optimizada. Las sustancias proteináceas dotadas con las propiedades mejoradas descritas anteriormente pueden ser eficaces como terapia de reemplazo tras la administración oral o parenteral. Otras rutas de administración, tales como nasal y transdérmica, pueden ser también posibles usando el péptido modificado.

En aplicaciones no terapéuticas, la conjugación-estabilización de las especies diagnósticas y/o reactivas de péptidos, incluyendo precursores e intermediarios del péptido de uso final u otros productos, proporciona ventajas correspondientes, cuando el componente peptídico está covalentemente unido a un polímero en la manera del presente invento. El péptido conjugado covalentemente resultante es resistente a factores degradativos ambientales, incluyendo procesos de degradación mediados por disolventes, o por disolución. Como resultado de tal resistencia potenciada a la degradación, la vida en almacenamiento del ingrediente peptídico activo es capaz de ser aumentado significativamente, con una fiabilidad concomitante de la composición que contiene el péptido en el uso final específico para el cual el mismo es empleado.

La conjugación covalente de los péptidos con polímeros en la manera del presente invento minimizan de modo eficaz la degradación hidrolítica, y logra la estabilización in vitro e in vivo.

Los beneficios análogos se realizan cuando las especies peptídicas terapéuticas, de diagnóstico o reactivas están conjugadas no covalentemente, de modo asociativo con moléculas poliméricas en la manera del presente invento.

Utilizando insulina covalentemente unida al componente polimérico como una realización ilustrativa del invento, la naturaleza de la conjugación, que implica uniones químicas covalentes susceptibles de corte, permite el control en términos de cinéticas del tiempo a lo largo del cual el polímero puede ser cortado a partir del péptido (insulina). Este corte puede tener lugar mediante mecanismos enzimáticos o químicos. El complejo conjugado polímero-péptido será intrínsecamente activo. La actividad total puede ser realizada siguiendo un corte enzimático del polímero a partir del péptido. Además, la modificación química permitirá la penetración del péptido unido, por ejemplo, insulina, a través de membranas celulares. En un aspecto preferido del presente invento, las propiedades de potenciación de la penetración de las membranas de residuos de ácidos grasos lipofílicos están incorporados en el cuerpo del polímero conjugante. A este respecto, de nuevo utilizando insulina como el péptido de interés, los derivados poliméricos de ácidos grasos de insulina mejoran la absorción intestinal de insulina: la carbamilación de los grupos amino de Phe^{B1} y Lys^{B29} con polímeros de ácidos grasos de cadena larga da compuestos que proporciona algún grado de actividad hipoglucémica. Esta derivatización aumenta la estabilidad de la insulina en la mucosa intestinal y su absorción a partir del intestino delgado.

Mientras que la descripción que sigue es principalmente e ilustrativamente dirigida al uso de insulina como un componente peptídico en diversas composiciones y formulaciones del invento, se apreciará que la utilidad del invento no está limitada, sino más bien se extiende a cualquier especie peptídica que sea conjugable covalentemente o asociativamente en la manera del invento, incluyendo, pero no limitado a, las siguientes especies peptídicas: calcitonina, ACTH, glucagón, somatostatina, somatotropina, somatomedina, hormona paratiroidea, eritropoyetina, factores de liberación hipotalámicos, prolactina, hormona estimulante del tiroides, endorfinas, anticuerpos, hemoglobina, CD-4 soluble, factores coagulantes, activador del plasminógeno tisular, encefalinas, vasopresina, opioides presentes de manera no natural, superóxido dismutasa, interferón, asparaginasa, arginasa, arginina desaminasa, ribonucleasa adenosina desaminasa, tripsina, quimotripsina, y papaína, fosfatasa alcalina, y otras enzimas adecuadas, hormonas, proteínas, polipéptidos, conjugados enzima-proteína, conjugados anticuerpos-hapteno, epítopos virales, etc.

Un objetivo del presente invento es proporcionar polímeros adecuados para la conjugación con péptidos a modo de obtener las características deseables enumeradas anteriormente. Otro objetivo es utilizar tales péptidos modificados para el suministro in vivo sostenido del péptido. Aun otro objetivo es usar la tecnología para suministrar péptidos oralmente en su forma activa.

Un objetivo adicional es emplear péptidos conjugados asociativamente para usar en inmunoensayo, diagnóstico, y otras aplicaciones no terapéuticas (por ejemplo, in vitro). Aún otro objetivo del presente invento es proporcionar composiciones peptídicas conjugadas establemente, incluyendo composiciones unidas covalentemente adecuadas de modo diverso para aplicaciones in vivo así como no in vivo, y para proporcionar alternativamente composiciones peptídicas conjugadas asociativamente de modo no covalente adecuadas de modo diverso para aplicaciones in vivo así como no in vivo.

Una molécula polimérica única puede ser empleada para conjugación con una pluralidad de especies peptídicas, y puede ser ventajoso en la amplia práctica del invento para utilizar una variedad de polímeros como agentes conjugantes para un péptido dado; combinaciones de tales aproximaciones pueden ser también empleadas. Además, las composiciones peptídicas conjugadas de modo estable pueden encontrar utilidad en aplicaciones tanto in vivo como no in vivo. Adicionalmente, se reconocerá que los polímero(s) de conjugación pueden utilizar cualesquiera otros grupos, restos, u otras especies conjugadas, según sea apropiado para la aplicación de uso final. A modo de ejemplo, puede ser útil en algunas aplicaciones unir covalentemente al polímero un resto funcional que confiere una resistencia a la degradación por UV, o antioxidación, u otras propiedades o características al polímero. Como un ejemplo adicional, puede ser ventajoso en algunas aplicaciones funcionalizar el polímero para dar la misma reactividad o entrecruzamiento en el carácter, para potencia diversas propiedades o características del material conjugado total. Consiguientemente, el polímero puede contener cualquier funcionalidad, grupos de repetición, uniones, u otras estructuras constituyentes que no excluye la eficacia de la composición conjugada para su propósito previsto. Otros objetivos y ventajas del presente invento serán más claramente evidentes a partir de la descripción que sigue y las reivindicaciones anexas.

Los polímeros ilustrativos que pueden ser útilmente empleados para lograr estas características deseables están aquí descritos a continuación en un esquema de reacción de ejemplo. En aplicaciones de péptidos unidos covalentemente, los polímeros pueden ser funcionalizados y después acoplados a aminoácido(s) libres de los péptido(s) para formar enlaces volubles que permiten la retención de la actividad con los enlaces volubles intactos. La eliminación de la unión mediante hidrólisis química y proteólisis potencian después la actividad peptídica.

Los polímeros utilizados en el invento puede incorporar adecuadamente en sus moléculas constituyentes tales como ácidos grasos comestibles (extremo lipofílico), polietilenglicoles (extremos hidrosoluble), restos azúcares aceptables (extremo que interacciona con el receptor) y espaciadores para el péptido asociado. Entre los polímeros de elección, los polisorbatos son particularmente preferidos y son elegidos para ilustrar diversas realizaciones del invento en la discusión que sigue aquí. El alcance de este invento por supuesto no se limita a polisorbatos, y diversos otros polímeros que incorporan los restos anteriormente mencionados pueden ser útilmente empleados en la amplia práctica de este invento. A veces puede ser deseable eliminar uno de tales restos y conservar otros en la estructura polimérica, sin pérdida de los objetivos. Cuando así se desea, entonces los restos preferidos para eliminar sin perder objetivos y beneficios del invento son el azúcar y/o los restos espaciadores.

Se prefiere operar con polímeros cuyos pesos moleculares caigan entre 500 y 10.000 daltones.

En la práctica del presente invento, los residuos de polialquilenglicol de los polialquilenglicoles alquilo C_{2}-C_{4}, preferiblemente polietilenglicol (PEG), son ventajosamente incorporados en los sistemas poliméricos de interés.

La presencia de estos residuos PEG conferirá propiedades hidrofílicas al polímero y a los correspondientes conjugados polímero-péptido. El invento por lo tanto contempla productos polímero-péptido en los que el péptido, por ejemplo, insulina, está conjugado bien con el residuo hidrofílico o bien con el resto hidrofóbico del polímero. La porción de ácidos grasos del polímero se proporciona para asociarse con el dominio hidrofóbico del péptido y así impedir la agregación en disolución. Los conjugados polímero-péptido resultantes serán por tanto: estables (frente a hidrólisis química y enzimática), hidrosolubles, debido al residuo PEG; y, en virtud de las interacciones ácido graso-dominio hidrofóbico, no propensos a agregación.

La derivatización de polialquilenglicoles tiene un número de propiedades ventajosas en la formulación de conjugados polímero-péptido en la práctica del presente invento, asociado con las siguientes propiedades de derivados polialquilenglicoles: mejora de la solubilidad acuosa, mientras que al mismo tiempo no genera respuesta antigénica o inmunogénica; altos grados de biocompatibilidad; ausencia de biodegradación in vivo de los derivados polialquilenglicoles; y facilidad de excreción por organismos vivos.

Los polímeros empleados en la práctica del presente invento comprenden así restos lipofílicos e hidrofílicos, que hacen el conjugado polímero-péptido resultante altamente eficaz (bioactivo) en administración oral así como parenteral y otros modos de administración fisiológica, y altamente eficaz en aplicaciones no fisiológicas.

Expuestos a continuación como ejemplos ilustrativos de conjugados polímero-péptido del presente invento está la fórmula de un conjugado unido covalentemente indicado para facilidad de subsiguientes referencias como Conjugado 3, en el que "Ins" es insulina, y valores específicos de m, n, w, x, e y que serán descritos en la discusión que sigue.

Conjugado 3

Ins --- NH ---

\uelm{C}{\uelm{\dpara}{O}}

--- O(CH_{2})_{m}(OC_{2}H_{4})_{n}OCH_{3}

En el Conjugado 3, el residuo ácido graso lipofílico está más cerca al punto de unión a la insulina y la región PEG hidrofílica es distante a partir del punto de unión, que es a través de una unión carbamato.

En el Conjugado 3 el punto de unión de la unión carbamato entre los polímeros es preferiblemente la función amina de Gly^{A1}. Es posible, como se mencionó, que más de una unidad polimérica puede ser unida a cada molécula del péptido. Por ejemplo, si un segundo polímero es unido a la insulina, el punto de unión preferiblemente es a través de la función amina de Phe^{B1}. Al menos en teoría, un tercer polímero podría unirse a la función amina de Lys^{B29}. La experiencia ha demostrado sin embargo que dos uniones poliméricas por molécula de insulina es el grado práctico más alto de derivatización obtenible razonablemente.

En la práctica general del invento, diversos métodos de acoplamiento de los polímeros al péptido están disponibles y se tratan más completamente aquí a continuación. Trabajando con proteínas y polipéptidos, debería tenerse en cuenta que ciertos grupos de residuos en el péptido son importante en la integridad biológica total. Es importante elegir un agente de acoplamiento adecuado que no interfiera excesivamente con tales residuos. En algunos casos, puede ser difícil evitar el acoplamiento y por lo tanto enmascarar la actividad de estos residuos importantes, pero alguna actividad puede ser intercambiada por una estabilidad aumentada mientras que se mantienen las propiedades beneficiosas dotadas. En aplicaciones in vivo, por ejemplo, la frecuencia de dosificación puede por tanto ser reducida, resultando en costes reducidos y una conformidad del paciente aumentada.

Los polímeros utilizados en conjugación proteína/péptido de acuerdo con el invento son diseñados para incorporar buenas características físicas que les permitan lograr los objetivos deseados. Los potenciadores de la absorción, aunque permiten la penetración de los péptidos a través de la membrana celular, no mejoran las características de estabilidad de los péptidos, y las aplicaciones in vivo pueden por lo tanto utilizar los conjugados polímero-péptido del invento en formulaciones desprovistas de tales potenciadores de penetración. Un aspecto del presente invento se refiere por lo tanto a la incorporación de derivados de ácidos grasos dentro del polímero, para imitar a los potenciadores de penetración.

En los conjugados polímero-péptido conjugados covalentemente del presente invento, el péptido puede estar unido covalentemente al polímero hidrosoluble por medio de una unión química lábil. Esta unión covalente entre el péptido y el polímero puede ser cortada mediante una reacción química o enzimática. El producto polímero-péptido conserva una cantidad aceptable de actividad; una actividad completa del componente peptídico es observada cuando el polímero es cortado completamente del péptido. Al mismo tiempo, porciones de polietilénglicol están presente en el polímero de conjugación para dotar al polímero-péptido con una solubilidad acuosa elevada y una capacidad de circulación sanguínea prolongada. Las modificaciones descritas anteriormente confiere una solubilidad, estabilidad, y propiedades de afinidad de membrana sobre el péptido mejoradas. Como resultado de estas características mejoradas el invento contempla un suministro parenteral y oral de tanto las especies polímero-péptido como, tras el corte hidrolítico, una biodisponibilidad del péptido per se, en aplicaciones in vivo.

1

2

En la síntesis del polímero G es deseable proteger los restos hidroxilo en el primer y segundo carbono del glicerol, por ejemplo, solketal. El glicerol protegido es hecho reaccionar primero con ésteres y ácidos grasos que han sido halogenados en el carbono terminal del ácido. El grupo hidroxilo restante es convertido a sal de sodio en un disolvente inerte y hecho reaccionar con un polietilénglicol halogenado o tosilado, en el que un extremo del polietilénglicol ha sido protegido como un éster. La protección del glicerol es eliminada y los dos grupos hidroxilo libres resultantes son convertidos a las sales de sodio correspondientes. Estas sales son hechas reaccionar en un disolvente inerte con polietilénglicol que ha sido parcialmente derivatizado con ácidos grasos. La reacción tiene lugar después de que el grupo hidroxilo libre se convierta al tosilato o bromuro.

En un caso de esta realización el polietilénglicol con dos grupos hidroxilo libres terminales es tratado con hidruro de sodio en un disolvente inerte. Un peso equivalente de un derivado bromuro primario de un resto del tipo ácido graso es añadido a la mezcla disolvente polietilénglicol. El producto deseado es extraído en un disolvente inerte y purificado mediante cromatografía en columna si es necesario.

(Fórmula 9)CH_{3} (CH_{2})_{m}CH_{2}Br + HOCH_{2}CH_{2} (OC_{2}H_{4})_{n}OH \xrightarrow{\textstyle{NaH}}{} CH_{3} (CH_{2})_{m}CH_{2} (OC_{2}H_{4})_{n}OH

en la que se desea formar una unión carbamato con el polipéptido, el carboxilo o éster es convertido a un grupo hidroxilo mediante un método de reducción química conocido en la técnica.

(Fórmula 13)HO-(CH_{2})_{m}-(OC_{2}H_{4})_{n}XR

El presente invento proporciona conjugados de polímeros biocompatibles con macromoléculas biológicamente activas, reactivos de diagnóstico, etc., que pueden consistir por ejemplo en péptidos, proteínas, enzimas, hormonas de crecimiento, factores de crecimiento y similares. Tales compuestos macromoleculares pueden construirse con aminoácidos alfa unidos mediante una unión amida para formar péptidos oligoméricos y polímeros.

Dependiendo de las funciones de estas sustancias, los componentes peptídicos pueden ser proteínas, enzimas, hormonas de crecimiento, etc. Por el propósito de brevedad, estas sustancias son referidas colectivamente aquí como péptidos y son designadas como Pr. En todos los casos, los péptidos biológicamente activos contienen grupos amino o carboxilo libres. La unión entre los polímeros y péptidos es generalmente efectuada a través de grupos amino o carboxilo libres.

Los péptidos elegidos para los propósitos de ilustración aquí son de particular interés en los campos de la medicina, agricultura, ciencia, y aplicaciones domésticas, así como industriales. Pueden ser enzimas utilizadas en terapia de reemplazo; hormonas para promover el crecimiento en animales, o crecimiento celular en cultivo celular; o sustancias proteináceas activas usadas en diversas aplicaciones, por ejemplo, biotecnología y diagnósticos biológicos y médicos. Entre las enzimas que pueden ser mencionadas están la superóxido dismutasa, interferón, asparaginasa, glutamasa, arginasa, arginina desaminasa, ribonucleasa adenosina desaminasa, tripsina, quimotripsina, y papaína. Entre las hormonas peptídicas que pueden mencionadas están la insulina, calcitonina, ACTH, glucagón, somatosina, somatropina, somatomedina, hormona paratiroidea, eritropoyetina, factores de liberación hipotalámicos, prolactina, hormonas estimulantes del tiroides, endorfinas, encefalinas, y vasopresina.

En general, diversas técnicas pueden ser usadas ventajosamente para mejorar las características de estabilidad de los conjugados polímero-péptido del presente invento, incluyendo: la funcionalización del polímero con grupos de resistencia a hidrólisis superior, por ejemplo, la conversión previamente ilustrada de grupos éster a grupos éter; modificando el equilibrio lipofílico/hidrofílico del polímero conjugante, según sea apropiado para que el péptido sea estabilizado por el polímero; y adaptando el peso molecular del polímero al nivel apropiado para el peso molecular del péptido que es estabilizado por el polímero.

La propiedad única de los polímeros derivados de polialquilénglicol de valor para las aplicaciones terapéuticas del presente invento es la biocompatibilidad general. Los polímeros tienen diversas propiedades de hidrosolubilidad y no son tóxicos. Son no antigénicos, no son inmunogénicos y no interfieren con las actividades biológicas de las enzimas. Tienen una larga circulación en la sangre y son fácilmente excretados a partir de organismos vivos.

Se ha encontrado que los productos del presente invento son útiles en sostener la actividad biológica de los péptidos y pueden por ejemplo ser preparados para administración terapéutica disolviéndolos en agua o en un medio líquido aceptable. La administración es bien por ruta parenteral o bien por ruta oral. Las suspensiones coloidales finas pueden ser preparadas para administración parenteral para producir un efecto depósito, o por la ruta oral.

En estado seco, liofilizado, los conjugados péptido-polímero del presente invento tiene una buena estabilidad de almacenamiento; las formulaciones en disolución de los conjugados del presente invento se caracterizan igualmente por una estabilidad de almacenamiento buena.

Los conjugados polímero-péptido terapéutico del presente invento pueden ser utilizados para la profilaxis o el tratamiento de cualquier estado o estadío de enfermedad para el que el constituyente peptídico es eficaz.

Además, los conjugados polímero-péptido del presente invento puede ser utilizado en diagnosis de constituyentes, estados, o estadíos de enfermedad en sistemas o especímenes biológicos, así como para propósitos de diagnóstico en sistemas no fisiológicos.

Además, los conjugados polímero-péptido del invento puede tener aplicación en profilaxis o tratamiento de estado(s) o estadío(s) de enfermedades en sistemas vegetales. Por medio de un ejemplo, el componente peptídico del conjugado puede tener eficacia insecticida, herbicida, fungicida, y/o pesticida susceptible de uso en diversos sistemas vegetales.

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Aún más, el componente peptídico de los conjugados del presente invento puede ser anticuerpos o alternativamente con característica antigénica, para propósitos de diagnóstico, inmunológico, y/o de ensayo.

En el uso terapéutico, el presente invento contempla un método para tratar un sujeto animal que tiene o es susceptible de modo latente a tal(es) estado(s) o estadío(s) de la enfermedad con necesidad de tal tratamiento, que comprende administrar a tal animal una cantidad eficaz de un conjugado polímero-péptido del presente invento que es terapéuticamente eficaz para tal estado o estadío de enfermedad.

Los sujetos que han de ser tratados por los conjugados polímero-péptido del presente invento incluyen tanto sujetos humanos como animales no humanos (por ejemplo, pájaros, perros, gatos, vacas, caballos) y preferiblemente son sujetos mamíferos, y más preferiblemente sujetos humanos.

Dependiendo del estado o estadío de la enfermedad específicos a ser combatidos, los sujetos animales pueden ser administrados con conjugados polímero-péptido del invento y cualquier dosificación adecuada segura y eficaz terapéuticamente, como se puede determinar fácilmente dentro del conocimiento de la técnica, y sin experimentación indebida.

En general, las dosis adecuadas de los compuestos de fórmula (1) para lograr un beneficio terapéutico, estarán en el intervalo de 1 microgramo (ug) hasta 100 miligramos (mg) por kilogramos de peso corporal del recipiente por día, preferiblemente en el intervalo de 10 \mug hasta 50 mg por kilogramo de peso corporal por día y más preferiblemente en el intervalo de 10 \mug hasta 50 mg por kilogramo de peso corporal por día. La dosis deseada se presenta preferiblemente como dos, tres, cuatro, cinco, seis, o más subdosis administradas en intervalos apropiados a lo largo del día. Estas subdosis pueden ser administradas en formas de dosificación unitaria, por ejemplo, que contienen desde 10 \mug hasta 1000 mg, preferiblemente desde 50 \mug hasta 500 mg, y más preferiblemente desde 50 \mug hasta 250 mg de ingredientes activos por forma de dosificación unitaria. Alternativamente, si el estado del recipiente así lo requiere, las dosis pueden ser administradas como una infusión continua.

El modo de administración y formas de dosificación afectarán por supuesto las cantidades terapéuticas de los compuestos que son deseables y eficaces para la aplicación del tratamiento dada.

Por ejemplo, las dosificaciones administradas oralmente son típicamente al menos dos veces, por ejemplo 2-10 veces, los niveles de dosificación usados en los métodos de administración parenteral, para el mismo ingrediente activo.

Los conjugados polímero-péptido del invento pueden ser administrados per se así como en la forma de ésteres, sales y otros derivados del mismo fisiológicamente funcionales farmacéuticamente aceptables.

El presente invento también contempla formulaciones farmacéuticas, tanto para uso veterinario como para uso médico humano, que comprende como agente activo uno o más conjugado(s) polímero-péptido del invento.

En tales formulaciones farmacéuticas y medicamentosas, el agente activo se utiliza preferiblemente junto con uno o más vehículo(s) farmacéuticamente aceptables y opcionalmente cualquier otro ingrediente terapéutico. Los vehículo(s) deben ser farmacéuticamente aceptables en el sentido de ser compatibles con los otros ingredientes de la formulación y no excesivamente deletéreos para el recipiente del mismo. El agente activo es proporcionado en una cantidad eficaz para lograr el efecto farmacológico deseado, como se describe anteriormente, y en una cantidad apropiada para lograr la dosis diaria deseada.

Las formulaciones incluyen aquellas adecuadas para administración parenteral así como no parenteral, y modalidades de administración específicas incluyen administración oral, rectal, bucal, tópica, nasal, oftálmica, subcutánea, intramuscular, intravenosa, transdérmica, intratecal, intraarticular, intraarterial, subaracnoidea, bronquial, linfática, vaginal, e intrauterina. Las formulaciones adecuadas para administración oral y parenteral son preferidas.

Cuando el agente activo es utilizado en una formulación que comprende una disolución líquida, la formulación puede ser ventajosamente administrada oralmente o parenteralmente. Cuando el agente activo es empleado en una formulación de suspensión líquida o como un polvo en una formulación de vehículo biocompatible, la formulación puede ser ventajosamente administrada oralmente, rectalmente, o bronquialmente.

Cuando el agente activo es utilizado directamente en forma de un sólido en polvo, el agente activo puede ser ventajosamente administrado oralmente. Alternativamente, puede ser administrado bronquialmente, vía nebulización del polvo en un gas vehículo, para formar una dispersión gaseosa del polvo que es inspirado por el paciente a través del circuito de respiración que comprende un dispositivo nebulizador adecuado.

Las formulaciones que comprenden el agente activo del presente invento puede presentarse convenientemente en formas de dosificación unitarias y pueden ser preparadas mediante cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica farmacéutica. Tales métodos incluyen generalmente la etapa de poner en asociación los compuesto(s) activo(s) con un vehículo que constituye uno o más ingredientes accesorios. Típicamente, las formulaciones son preparadas poniendo en asociación de modo uniforme e íntimamente, los compuesto(s) activo(s) con un vehículo líquido, un vehículo sólido dividido finamente, o ambos, y después, si es necesario, dándole forma al producto en formas de dosificación de la formulación deseada.

Las formulaciones del presente invento adecuadas para administración oral pueden ser presentadas como unidades discretas tales como cápsulas, comprimidos, tabletas, o pastillas, conteniendo cada una una cantidad predeterminada del ingrediente activo como un polvo o gránulos; o una suspensión en un licor acuoso o un líquido no acuoso, tal como un jarabe, un elixir, una emulsión, o una disolución.

Una tableta puede ser hecha mediante compresión o moldeado, opcionalmente con uno o más ingredientes accesorios. Las tabletas comprimidas pueden ser preparadas comprimiéndolas en una máquina adecuada, con el compuesto activo que está un una forma de fluido libre tal como un polvo o gránulos que se mezclan opcionalmente con un aglutinante, desintegrante, lubricante, diluyente inerte, tensioactivo, o agente de descarga. Las tabletas moldeadas que comprendieron una mezcla del compuesto activo en polvo con un vehículo adecuado pueden ser hechas mediante el moldeado en una máquina adecuada.

Un jarabe puede ser hecho añadiendo el compuesto activo a una disolución acuosa concentrada de un azúcar, por ejemplo sacarosa, a la cual se puede añadir cualquier ingrediente(s) accesorio. Tal(es) ingrediente(s) accesorio(s) pueden incluir edulcorantes, conservantes adecuados, agentes de retraso de la cristalización del azúcar, y agentes para aumentar la solubilidad de cualquier otro ingrediente, tal como un alcohol polihidroxi, por ejemplo glicerol o sorbitol.

Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral comprenden de modo conveniente una preparación acuosa estéril del compuesto activo, que es preferiblemente isotónico con la sangre del recipiente (por ejemplo, disolución salina fisiológica). Tales formulaciones pueden incluir agentes en suspensión y agentes espesantes u otros sistemas microparticulados que son designados para dirigir el compuesto a los componentes sanguíneos o uno o más órganos. Las formulaciones pueden ser presentadas en forma unidosis o multidosis.

Las formulaciones de pulverizador nasal comprenden disoluciones acuosas de los compuestos activos con agentes conservantes y agentes isotónicos. Tales formulaciones son ajustadas preferiblemente a un pH y un estado isotónico compatible con las membranas mucosas nasales.

Las formulaciones para administración rectal pueden ser presentadas como un supositorio con un vehículo adecuado tal como mantequilla de cacao, grasas hidrogenadas, o ácidos grasos carboxílicos hidrogenados.

Las formulaciones oftálmicas son preparadas mediante un método similar al pulverizador nasal, excepto por que el pH y los factores isotónicos son ajustados preferiblemente para encajar con los del ojo.

Las formulaciones tópicas comprenden el compuesto activo disuelto o suspendido en uno o más medios, tales como aceite mineral, petróleo, alcoholes polihidroxilo, u otras bases usadas para formulaciones tópicos farmacéuticas.

Además de los ingredientes anteriormente mencionados, las formulaciones de este invento pueden incluir además uno o mas ingrediente(s) accesorios seleccionados a partir de diluyentes, tampones, agentes edulcorantes, desintegrantes, tensioactivos, espesantes, lubricantes, conservantes (incluyendo antioxidantes), y similares.

En aplicaciones no terapéuticas del presente invento, el conjugado polímero-péptido puede utilizar una relación de unión covalente o alternativamente unión no covalente entre el péptido y los componentes poliméricos. Además, componentes peptídicos y poliméricos relacionados asociativamente pueden ser utilizados en la administración de los agentes peptídicos terapéuticos, mediante métodos de administración apropiados tales como los ilustrativamente descritos aquí anteriormente en conexión con la discusión de modo ilustrativo de los conjugados polímero-péptidos unidos de modo covalentes del invento.

En tales composiciones no terapéuticas, péptido-polímero relacionados asociativamente, los componentes peptídicos y polímeros pueden ser formulados inicialmente juntos para proporcionar una estabilidad potenciada y una resistencia a la degradación, alternativamente, estos componentes pueden por ejemplo ser partes separadas de una composición de múltiples partes, que es mezclada en el momento del uso, y que en ausencia de unión asociativa entre el polímero y el péptido en la mezcla resultante sería susceptible de una rápida descomposición u otra modalidad degradativa. A pesar de la forma de la composición péptido y polímero relacionados asociativamente, el presente invento contempla una asociación relacional que potencia algunas características o aspectos del péptido o potencia de otro modo la utilidad del mimo relativamente al componente peptídico en ausencia de tal polímero asociativo.

Consecuentemente, el presente invento contempla la provisión de polímeros adecuados para estabilización in vitro de péptidos en disolución, como una aplicación ilustrativa preferida de una aplicación no terapéutica. Los polímeros pueden ser empleados por ejemplo para aumentar la estabilidad térmica y la resistencia a la degradación enzimática del péptido. El potenciamiento de la característica de estabilidad térmica del péptido vía conjugación en la manera del presente invento proporciona un medio para mejorar la vida en almacenamiento, la estabilidad a temperatura ambiente, y la robustez del diagnóstico y los agentes y kits de investigación, por ejemplo kits de inmunoensayo. Por medio de un ejemplo específico, la fosfatasa alcalina puede ser acoplada covalentemente o asociativamente a un polímero adecuado de acuerdo con el invento, para conferir estabilidad a tal fosfatasa cuando se usa como un reactivo en kits para detección colorimétrica del anticuerpo o antígeno en fluídos biológicos.

Los siguientes Ejemplos se proporcionan para ilustrar el presente invento, y no deben ser interpretados como limitantes del mismo.

Ejemplo I de Referencia

Conjugado 1 de Referencia

Polisorbato trioleato p-nitrofenil carbonato

A una disolución de p-nitrofenilcloroformiato (0,8 g, 4 mmoles) en 50 ml de acetonitrilo anhidro se añadió polisorbato trioleato seco (7 g, 4 mmoles) seguido por dimetilaminopiridina (0,5 g, 4 mmoles). La mezcla de reacción es agitada a temperatura ambiente durante 24 horas. El disolvente es eliminado en condiciones de presión reducida y el precipitado resultante es diluido con benceno seco y filtrado a través de Celitas. El residuo es refrigerado durante toda la noche en benceno seco y el precipitado adicional es eliminado mediante filtración. El disolvente es eliminado en condiciones de presión reducida y el benceno residual es eliminado mediante evacuación a baja presión para dar 6,4 g de polisorbato trioleato p-nitrofenilcarbonato.

Acoplamiento de insulina con polímero activado

A una disolución de polisorbato trioleato p-nitrofenilcloroformiato activado (1 g) en agua destilada, se añade una disolución de insulina bovina (50 mg) en tampón fosfato 0,1 M pH 8,8. El pH es mantenido mediante adición de NaOH 1 N según sea necesario. La mezcla de reacción es agitada a temperatura ambiente durante 2,5 h. Después de este tiempo la mezcla es sometida a cromatografía de filtración en gel usando Sephadex G-75. La purificación mediante elución con tampón fosfato 0,1 M pH 7.0 y la recolección de fracciones con un colector de fracciones automatizado da el Conjugado 1 de referencia. El contenido en polímero se determina mediante ensayo de ácido trinitrobencenosulfónico (TNBS) y la concentración de proteínas por el Método Biuret. Una relación molar de polímero a insulina se determinó que era 1:1.

Ejemplo I

Conjugado I

El grupo hidroxilo terminal del polietilénglicol monoestearato es activado mediante reacción con p-nitrofenilcloroformiato como se describe anteriormente. A una disolución del polímero activo (1 g) en agua destilada se añade insulina bovina (80 mg) disuelta en tampón fosfato 0,1 M, a pH 8.8. El pH es mantenido mediante un ajuste cuidadoso con NaOH 1N. Después de agitar durante 3 horas, la mezcla de reacción es apagada con un exceso de glicina y sometida a cromatografía de filtración en gel usando Sephadex G-75. El conjugado insulina/polímero es recolectado y liofilizado. El contenido en proteína es determinado mediante ensayo Biuret, dando un rendimiento cuantitativo.

Ejemplo II

Conjugado 2

Tetrahidro-2-(12-bromododecanoxi)-2H pirano

A una disolución de 12-bromo-1-dodecanol (1 mol) en diclorometano que contiene p-toluensulfonato de piridinio (P-TSA) se añade dihidropirano (2 moles). La mezcla de reacción es agitada durante 24 horas y luego se lava dos veces con agua y se seca sobre MgSO_{4} anhidro. El diclorometano es eliminado en condiciones de presión reducida. Si fuera necesario el producto resultante se purifica mediante cromatografía en gel de sílice.

Acoplamiento de polietilénglicol al derivado tetrahidropirano

El derivato tetrahidropirano descrito anteriormente, disuelto en benceno seco, es añadido a una disolución de polietilénglicol (1 mol) en benceno seco que contiene NaH (1 mol). La mezcla de reacción es agitada a temperatura ambiente durante 24 horas. Después de ese tiempo la mezcla es eluída a través de una columna de gel de sílice con benceno. Una purificación adicional mediante cromatografía en columna, si fuera necesario, es realizada. El grupo tetrahidrofurano protector es eliminado mediante tratamiento con p-TSA a temperatura ambiente. El producto final es purificado, si es necesario, mediante cromatografía en columna. El grupo hidroxilo del polímero es activado mediante reacción con p-nitrofenilcloroformiato como se describe aquí anteriormente. La conjugación con insulina es llevada a cabo como se describe para el Conjugado 1 de referencia.

Ejemplo III

Estudios comparativos usando insulina bovina fueron llevados a cabo en conjugados polímero-insulina y en insulina nativa para determinar su estabilidad relativa y la actividad en modelos animales. En los estudios animales, la eficacia del polímero-insulina en reducir el nivel sanguíneo fue comparado con la de la insulina nativa. Ratones hembra y macho albinos con un promedio de 25 g en peso fueron puestos en ayunas durante toda la noche y usados en grupos de cinco para cada tratamiento llevado a cabo en varias fases a lo largo de un período de dos días.

Cada animal de ensayo recibió una dosis única de bien insulina nativa (Grupo 1, 100 \mug/kg, subcutáneamente); bien insulina nativa (Grupo 2, 1,5 mg/kg, oralmente mediante alimentación forzada); bien Conjugado 1) de referencia, Grupo 3, 100 \mug/kg oralmente); o bien Conjugado 1 de referencia (Grupo 4, 100 \mug/kg, subcutáneamente) a tiempo 0. Un grupo adicional (Grupo 5) no recibió insulina de ningún tipo pero fue administrado con glucosa 30 minutos antes de los tiempos de toma de muestras programados. Los animales fueron puestos en ayuno durante toda la noche antes del tratamiento y durante la duración del estudio. Todos los materiales del ensayo fueron preparados en tampón fosfato salino, pH 7,4. Treinta minutos antes de los tiempos de toma de muestras programados de 0,5, 1, 2, 4, 8 y 24 horas tras el tratamiento con insulina, los animales fueron ensayados con una dosis en bolus de glucosa (5 g/kg, como una disolución al 50%, dada oralmente), de modo que cada animal recibió sólo una dosis de insulina del Conjugado 1 de referencia y un ensayo de glucosa. Al tiempo de toma de muestras programado se recogió sangre a partir de la vena de la cola y se analizó inmediatamente en lo que se refiere al contenido en glucosa usando un Medidor de glucosa digital One Touch (Life Scan). Los resultados del ensayo se muestran en la Figura 1, para los grupos 1-5.

Los niveles de glucosa en sangre para los animales del grupo 1 (insulina nativa, subcutánea) fueron aproximadamente un 30% respecto a los animales testigo (Grupo 5, sin tratar) al punto de tiempo de 30 minutos. El efecto hipoglucémico duró sólo 3,5 horas en los animales del Grupo 1. La insulina nativa administrada oralmente (Grupo 2) disminuyó los niveles de glucosa en sangre hasta un máximo del 60% respecto al testigo, respuesta máxima que tuvo lugar 30 minutos después del tratamiento con la insulina. Por el contrario los niveles de glucosa en animales en el grupo 3 (Conjugado 1 de referencia, 100 \mug/kg, p.o.) fueron disminuidos con un comienzo de la actividad hipoglucémica aparentemente retrasado. La actividad hipoglucémica en los animales del grupo 3 fue más grande que la de los animales del Grupo 2 aún cuando la dosis de insulina administrada al Grupo 3 fue sólo una quinceava parte de la dada al Grupo 2. A todos los puntos de tiempo después de 3 horas los niveles de glucosa fueron menores para los animales del Grupo 3 que para cualquier otro grupo en tratamiento, siendo la diferencia más grande entre la cuarta y la octava hora de puntos de toma de muestras. Los niveles de glucosa en los animales del Grupo 4 (Conjugado de referencia 1, 100 \mug/kg, s.c.) seguido del mismo curso que los animales del Grupo 1 durante las primeras cuatro horas del estudio. Después de cuatro horas los niveles de glucosa del Grupo 2 permanecieron por encima de los niveles testigo (Grupo 5, sin tratar) mientras que los niveles de glucosa del Grupo 4 cayeron, a cuatro horas, hasta un 62% con respecto a los niveles del grupo 5, y permanecieron por debajo de los niveles del Grupo 5.

Ejemplo IV

Un estudio de eficacia de insulina fue llevado a cabo en ratones machos y hembras albinos usando como materiales de ensayo insulina en una forma no conjugada, y el Conjugado 1 de referencia. Un objetivo de este estudio fue determinar si la insulina en la forma del Conjugado 1 de referencia es capaz de actuar sobre los niveles de glucosa en sangre de la misma manera que la insulina cuando se administra subcutáneamente. Un segundo objetivo fue determinar si el complejo insulina del Conjugado 1 de referencia, a diferencia de la insulina libre, era capaz de actuar disminuyendo el nivel de glucosa en sangre cuando se administra oralmente. Los resultados se muestran en la Figura 2, en la que el "Complejo Insulina" significa Conjugado 1 de referencia.

Las muestras en sangre basales fueron obtenidas para análisis de glucosa en suero a partir de 10 ratones albino sin tratar puestos en ayunas (5 machos y 5 hembras); los valores basales en la Figura 2 se indican por el símbolo "O". Tres grupos adicionales (cinco machos y cinco hembras cada uno) fueron puestos en ayunas durante toda la noche y cargados con glucosa sola oralmente mediante alimentación forzada (5g/kg de peso corporal). Diez animales fueron sacrificados a cada uno de los tres períodos de tiempo para obtener muestras de sangre para el análisis de glucosa: 30, 60 y 120 minutos después de la dosificación. Una insulina comercial y un Conjugado 1 de referencia fueron administrados cada uno bien oralmente (p.o.) o bien parenteralmente (s.c.) a grupos de ratones puestos en ayunas (cinco ratones machos y cinco ratones hembras, para sacrificar y para análisis de sangre a cada uno de los tres períodos de tiempo), para proporcionar diferentes regímenes de tratamiento. El tratamiento, rutas de administración, y símbolos mostrados para los resultados en la Figura 2 incluyeron: (i) glucosa (5 g/kg, p.o.), símbolo: "\bullet"; (ii) insulina (100 \mug/kg, s.c.) y glucosa (5 g/kg p.o.), símbolo: "\nabla"; (iii) insulina (1,5 mg/kg, p.o.) y glucosa (5 g/kg p.o.), símbolo "\nabla"; (iv) Conjugado 1 de referencia (100 \mug/kg, s.c.) y glucosa (5 g/kg p.o.), símbolo "\Box"; (v) Conjugado 1 de referencia (250 \mug/kg, s.c.) y glucosa (5 g/kg p.o.), símbolo "\Box"; (vi) Conjugado 1 de referencia (1,5 mg/kg, s.c.) y glucosa (5 g/kg p.o.), símbolo: "\Delta". En estos ensayos del Conjugado 1 de referencia, la concentración de proteína en la disolución administrada fue de 0,1 mg de proteína/ml de disolución, para propósitos de comparación, un conjugado insulina-polímero unido covalentemente modificado, que tiene una concentración de proteínas en la disolución administrada de 0,78 mg de disolución de proteína/ml, se incluyó,(vii) Conjugado 1 de referencia modificado (100 \mug/kg, s.c.) y glucosa (5 g/kg p.o.), símbolo "\Delta".

La insulina fue administrada 15 minutos previamente a la carga de glucosa.

La glucosa fue administrada oralmente mediante alimentación forzada a todos los grupos de animales excepto el basal a una dosis de 5 g/kg (10 mg/kg de una disolución 50% p/v en salino normal). Cuando la insulina fue administrada oralmente mediante administración forzada, fue dada a una dosis de 1,5 mg/kg (18,85 ml/kg de una disolución 0,008% p/v en salino normal). Cuando la insulina fue administrada subcutáneamente, fue dada a una dosis de 100 \mug/kg (2,5 ml/kg de una disolución 0,004% p/v en salino normal). Cuando el complejo Conjugado 1 de referencia polímero-insulina fue administrado oralmente mediante alimentación forzada, fue dado a una dosis de 1,56 mg/kg (2,0 ml/kg del material de ensayo sin diluir). Cuando el complejo Conjugado 1 de referencia polímero-insulina fue administrado subcutáneamente, fue dado a una dosis de 100 \mug/kg (1,28 ml/kg de una dilución 1:10 de la disolución 0,78 mg/ml recibida) o 250 \mug/kg (3,20 ml/kg de una dilución 1:10 de la disolución recibida). El Conjugado 1 de referencia modificado contenía 0,1 ml de insulina/ml y fue dosificado a una velocidad de 1,0 ml/kg para obtener una dosis de 100 \mug/kg.

La glucosa fue medida usando un Gemini Centrifugal Analyzer y los kits de reactivos de glucosa adquiridos. El ensayo fue un ensayo enzimático acoplado basado en la reacción de la glucosa y el ATP catalizado por la hexoquinasa, acoplado con la reacción de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, que da NADH. Las muestras duplicadas fueron analizadas y el valor medio documentado. La dilución (1:2 ó 1:4) de algunas muestras de suero fue necesaria para determinar la concentración muy alta de glucosa presente en ciertas muestras.

Después de la carga de glucosa, la media de la glucosa sérica se elevó hasta un nivel alto a 30 minutos, y disminuyó a 60 minutos, y estuvo por debajo del valor basal a 120 minutos. Si la insulina comercial fue administrada subcutáneamente (100 \mug/kg de peso corporal, fue altamente eficaz en prevenir el aumento de glucosa en sangre. Sin embargo, si la insulina fue dada oralmente (a una dosis elevada de 1,5 mg/kg) no hubo efecto sobre el aumento de la glucosa en sangre. Esto era esperado, puesto que la insulina, una proteína, es fácilmente hidrolizada en el tracto digestivo y no es absorbida intacta en la corriente sanguínea.

Cuando el Conjugado 1 de referencia fue dado subcutáneamente tanto a una dosificación de 100 como de 250 \mug/kg, fue altamente eficaz en restringir el aumento en la glucosa sanguínea después de la carga de la glucosa. Los valores de glucosa sérica medios fueron significativamente menores después de la dosis de 100 \mug/kg del Conjugado 1 de referencia tanto a 30 como a 60 minutos que lo que fueron después de 100 \mug/kg de insulina libre. La glucosa sérica media a 250 \mug/kg del Conjugado 1 de referencia fue inferior, aunque no significativamente, a 30 minutos, significativamente menor a 60 minutos y a 120 minutos volvió a los valores basales. Tanto con la insulina libre a 100 \mug/kg como con el Conjugado 1 de referencia a 100 \mug/kg, el nivel de glucosa permaneció por debajo de la línea basal a 120 minutos.

El Conjugado 1 de referencia modificado administrado a 100 \mug/kg produjo una reducción significativa en la glucosa sanguínea a 30 minutos.

Ejemplo de referencia II

Preparación de para-nitrofenilcarbonato de polisorbato monopalmitato

El polisorbato monopalmitato se seca primero mediante el método azeotrópico usando benceno seco.

A una disolución del polímero seco 82 g, 2 mmoles) en 10 ml de piridina seca se añade para-nitrofenilcloroformiato (0,6 g, 3 mmoles). La mezcla es agitada a temperatura ambiente durante 24 horas. La mezcla de reacción es enfriada en hielo y diluida con benceno seco y filtrada a través del filtro de ayuda. Este procedimiento es repetido y finalmente el disolvente es eliminado en el evaporador rotatorio. Las trazas del disolvente son eliminadas in vacuo. El rendimiento del producto es 1,8 g.

Ejemplo de referencia III

Preparación del conjugado polisorbato monopalmitato con insulina

De acuerdo con la reacción de conjugación descrita previamente el procedimiento de referencia del Ejemplo 1 pero usando monopalmitato polisorbato en la cantidad de 1 g de insulina en la cantidad de 80 mg, con separación HPLC del producto de reacción, se obtiene un conjugado insulina-monopalmitato polisorbato covalentemente unido.

Ejemplo V Preparación de Conjugados enzima-polímero

El acoplamiento de fosfatasa alcalina (AP) a un polímero fue llevado a cabo usando el mismo procedimiento como se describe para el Conjugado 1 de referencia en el Ejemplo de referencia 1. Además, para determinar si una relación alta o baja del polímero con respecto a las proteínas sería más ventajosa, los conjugados fueron preparados usando 140 moles de polímero/mol de la enzima y 14 moles de polímero/mol de enzima. El número de grupos poliméricos por molécula de AP conjugada son 30 y 5, respectivamente, para las relaciones alta y baja de polímero.

El siguiente procedimiento fue empleado para obtener alrededor de 5 grupos/molécula de fosfatasa alcalina: se disolvieron 4,1 mg (sal libre) en 0,05 M de bicarbonato sódico. A esta disolución se añadió un polímero activado (0,75 mg) en agua/dimetil-sulfóxido y la disolución fue agitada durante 3 a 12 horas a temperatura ambiente. La mezcla de reacción resultante fue dializada frente a una disolución de sal (NaCl 0,3 N) en un tubo de diálisis (peso molecular límite 12.000-14.000) a lo largo de 12 horas con 4 a 6 cambios de disolución de diálisis. El mismo procedimiento fue usado para la relación elevada. La concentración de proteína total de material dializado fue determinada mediante el método de Biuret.

Estudio de la medida de actividad y estabilidad

El ensayo fosfatasa fue llevado a cabo según el método de A. Voller y otros, Boletín WHO, 53, 55 (1976). Una alícuota (50 ml) fue añadida a micropocillos y mezclada con 200 microlitros de disolución sustrato (10 g/L, 4-nitrofenilfosfato en 20% de tampón etanolamina, pH 9,3) e incubada a temperatura ambiente durante 45 minutos. La reacción fue detenida mediante 50 microlitros de NaOH 3 M. La absorbancia fue medida a 405 nm en un lector de placas de microvaloración.

La actividad fosfatasa fue comparada con la de enzima nativa en diversas condiciones.

Las disoluciones diluidas que contenían concentraciones similares de fosfatasa alcalina y conjugados fosfatasa alcalina-polímero fueron almacenadas a diversas temperaturas. La actividad enzimática fue ensayada periódicamente. Los dos polímeros ensayados a 5ºC, 15ºC, 35ºC y 55ºC fueron comparados con la fosfatasa alcalina testigo almacenada a 5ºC.

Como se puede ver a partir de la Tabla A, la actividad enzimática inicial de ambos polímeros fue alrededor de tres ordenes mayor que el testigo. Ambos conjugados polímero-enzima tuvieron una estabilidad térmica potenciada sobre la enzima nativa. Esto es especialmente evidente para el conjugado caracterizado por la relación superior de polímero a enzima.

TABLA A

		DÍA
TEMP, ºC		0	2	3	4	5	6
AP/ALTA	5	399	360	321	371	343	337
	15		158	115	126	24	187
	35		132	112	135	138	123
	55		36	25	10	14
AP/BAJA
	5	324	252	210	220	162	159
	15		83	47	40	38	51
	35		61	36	35	33	32
	55		17	6	2	2
AP/TESTIGO
	5	100	100	100	100	100	100
	15		89	74	43	36	28
	35		53	48	21	20	20
	55		10	2	1	2

Ejemplo VI

Conjugado 1A

A una disolución de insulina (50 mg) en tampón bicarbonato sódico 0,05 M de pH 9,2 se añade una disolución de polímero activado (1 g) en agua/dimetilsulfóxido y se agita durante 3 horas, a temperatura ambiente. El pH de la mezcla es mantenido mediante un ajuste cuidadoso con NaOH 1N. La mezcla de reacción es entonces dializada frente a tampón fosfato 0,1 M pH 7.0. El producto purificado es liofilizado. El contenido en proteína (48 mg) es determinado mediante el ensayo Biuret. El número de cadenas poliméricas unidas a la insulina es determinado mediante en ensayo TNBS, dando una relación de dos moles de polímero a un mol de insulina

Ejemplo de referencia IV

La calcitonina-OT_{50} fue sintetizada de la siguiente manera. El OT activado (160 mg) en agua (2,0 ml) fue añadido a una disolución agitada de calcitonina de salmón (5 mg, Becham) en agua desionizada (1,5 ml) y tampón borato, a 5ºC. La disolución resultante fue agitada a 20ºC durante 1,5 h y el pH de la disolución fue ajustado hasta 8.8. La reacción fue agitada adicionalmente durante otras 9,5 h antes de que el pH fuera llevado a 3,8 con ácido clorhídrico (1 M). La mezcla de reacción fue almacenada a 5ºC durante toda la noche. La disolución fue dializada inicialmente frente a tampón PBS (pH 7,5, 2 L) y después frente a tampón PBS (ajustado a pH 3,6, 4 x 1 L) en una membrana de diálisis (pm CO 3500). La disolución dializada fue filtrada a través de un microfiltro de 0,22 y almacenada a 5ºC. La concentración de proteína fue determinada mediante Biuret y HPLC usando calcitonina nativa como el estándar. La pureza fue analizada mediante HPLC en una columna de exclusión por tamaño, usando tampón fosfato 0,05 M (ajustado a pH 3.8).

Ejemplo de Referencia V

La Calcitonina-001 fue sintetizada de la siguiente manera. El compuesto 001 activado (130 mg) en dimetilsulfóxido (1 ml) fue añadido a una disolución agitada de calcitonina de salmón (5 mg) en agua desionizada (2 ml) y tampón borato (1,5 ml, 0,1 M, pH 8,8) a 5ºC. La disolución fue agitada a 20ºC durante 1,5 h y el pH fue ajustado a 8,8 con ácido clorhídrico. La reacción fue agitada durante otra hora antes de que el pH fuera llevado a 3,8 y la mezcla de reacción almacenada a 5ºC durante toda la noche. Se añadieron 4 ml de agua desionizada a la mezcla de reacción y el sobrenadante fue dializado inicialmente frente al tampón fosfato salino (PBS) (pH 7,4, 2 L) en la membrana de diálisis (pm CO 3500) y después 4 veces frente a tampón PBS (ajustado a pH 3,6). La disolución dializada fue filtrada a través de un filtro de 0,22 \mu y almacenado a 5ºC. La concentración de proteína fue determinada mediante los métodos de Biuret y HPLC, usando calcitonina nativa como el estándar. La pureza fue analizada mediante HPLC usando una columna de espacio inversa C-8 con un gradiente de elusión de acetonitrilo/TFA 0,1% (30 a 55% a lo largo de 25 minutos).

Ejemplo VII

La insulina-OT fue preparada de la siguiente manera. 2,0 g de polímero OT activado fueron pesados en un frasco de fondo redondo de 250 ml. El polímero OT fue disuelto completamente en 10 ml de DMSO anhidro, y 20 ml de agua desionizada fueron añadidos y agitados durante 5 minutos. La disolución de OT resultante fue enfriada a 10ºC. 100 mg de insulina (Sigma/Páncreas bovino/Zn) disueltos en 40 ml de tampón borato sódico 0,1 M (pH 9,3) fueron añadidos a la vez a la disolución de polímero OT. La mezcla de reacción se volvió amarillo brillante. Después de 30 minutos, el pH de la disolución fue ajustado a 8,8 usando HCl 2 N. La disolución de reacción fue agitada durante 1,5 h adicionales y el pH fue ajustado a 8,4. La mezcla de reacción fue filtrada a través de un filtro de membrana de 0,8 micrómetros y dializada en tampón PBS (pH 7,4). La mezcla dializada fue filtrada a través de un filtro de 0,22 micrones y concentrada. La muestra concentrada fue cromatografiada usando Sephadex G-75 (eluyente tampón fosfato sódico 0,05 M). Columna: 2,5 cm diámetro x 32 cm altura. El análisis indicó que el rendimiento de conjugado de insulina fue cuantitativo con dos moles de polímero por mol de insulina.

Ejemplo VIII

El complejo 001-insulina fue administrado oralmente a grupos de tratamiento de monos cinomolgus administrados con glucosa en dosificaciones de 0,5 mg, 2 mg y 5 mg respectivamente. El área bajo la curva (AUC) fue calculada para cada grupo de tratamiento. Usando esta medida, los valores inferiores representaron la mayor eficacia en disminuir la glucosa en sangre. Los resultados AUC se muestran en la Fig. 8. Estos resultados muestran que una dosis única administrada oralmente de 001-insulina es eficaz en proteger frente a una elevación de glucosa sanguínea tras la administración de glucosa en monos cinomolgus. El AUC tras la administración oral de 001-insulina es menor de ½ que para los animales sin tratar, demostrando una actividad hipoglucémica significativa de 001-insulina en monos cinomolgus.

Ejemplo de referencia VI

La actividad hipocalcémica de conjugados polímero-calcitonina dados vía administración oral fue evaluada en un modelo hipocalcémico. Dos derivados polímero-calcitonina (OT-calcitonia y 001-calcitonia) fueron evaluados de la siguiente manera. Ratas macho Sprague-Dawley (peso promedio 54 g) fueron puestas en ayunas durante toda la noche. Los animales fueron asignados aleatoriamente a grupos de tratamiento (5 por grupo) y los niveles de calcio séricos basales fueron determinados para cada grupo. Los grupos de tratamiento recibieron entonces una dosis única de bien calcitonina sin modificar, a una dosis de 50 mg por kg, OT-calcitonina a una dosis de 2,5 mg por kg, o bien 001-calcitonina a dosis de 250 mg por kg, 2,5 mg por kg, y 25 mg por kg, respectivamente. Las dosis fueron dadas mediante ruta oral. El calcio sérico fue determinado 2 y 4 horas después de la administración. Los resultados se presentan en la Fig. 4 como porcentaje de los niveles de calcio sérico originales a lo largo del tiempo. El ( ) representa la calcitonina, ( ) representa 001, 250 mg, \lozenge representa 001 2,5 \mug, \Delta representa 001, 25 mg, y \bullet representa OT, 2,5 \mug. Los resultados muestra una disminución significativa de calcio sérico en una manera relacionada con la dosis. Parece que los conjugados son activos durante más de las 4 horas de tiempo de duración inicialmente evaluadas. Una duración extendida de la acción puede corresponder a una biodisponibilidad significativa que sigue a la administración oral.

Ejemplo de referencia VII

La actividad hipocalcémica del polímero-calcitonina administrado oralmente en un modelo de rata fue demostrado de la siguiente manera. Ratas macho Sprague-Dawley, de peso promedio 54 gramos, fueron puestas en ayunas durante toda la noche. Los animales fueron asignados aleatoriamente a grupos de tratamiento (4 por grupo) y los niveles de calcio sérico basales fueron determinados para cada grupo. Los grupos testigo recibieron una dosis única de calcitonina (ct) sin modificar mediante bien la ruta subcutánea (s.c.) (50 mg por kg) o bien oralmente (25 \mug por kg). Los grupos de tratamiento recibieron bien OT1-ct o bien OT2-ct (2,5 \mug por kg) mediante la ruta oral. El calcio sérico fue determinado 2 y 4 horas después de la administración. Los resultados se presentan en la Fig. 5 como porcentaje de niveles de calcio sérico originales a lo largo del tiempo. OT1-ct y OT2-ct son preparaciones repetidas del mismo conjugado calcitonina-polímero, evaluadas en paralelo para demostrar la consistencia de la respuesta desde un lote al siguiente. Los resultados muestran una disminución significativa de calcio sérico. Parece que los conjugados son activos durante más de las cuatro horas de tiempo de duración inicialmente evaluadas.

Ejemplo IX

El polímero-insulina es evaluado en un modelo de rata diabética (BB) de la siguiente manera. La rata BB es un modelo fiable de diabetes insulino-dependiente. Sin la administración subcutánea (sc) diaria las ratas BB mueren dentro de dos días. En un estudio de 14 días la insulina sc fue detenida y los animales fueron cambiados a un tratamiento con polímero-insulina administrado oralmente a concentraciones bajas (100 microgramos por kilogramo por día), medias (3 miligramos por kilogramo por día) y altas (6 miligramos por kilogramo por día). Los resultados (tiempo de supervivencia medio) se muestran en la Figura 6. El cambio abrupto desde sc a administración oral constituye particularmente ensayos duros para la insulina polimérica. Los resultados muestran que los animales con bajas dosis no recibieron suficiente insulina para sobrevivir; el grupo de dosis media mostró algún aumento en el tiempo de supervivencia y el grupo de dosis alta en el que algunos animales sobrevivieron durante la duración entera (14 días) del estudio recibieron sólo insulina polimérica administrada oralmente. La insulina polimérica fue administrada mediante alimentación forzada en una formulación no optimizada. Este estudio también mostró una disminución significativa estadísticamente en pm comparado con los niveles de glucosa en sangre am y estuvieron mejor controlados si los animales recibían múltiples administraciones diarias en lugar de un bolus único. La administración oral diaria del polímero insulina a animales normales (no diabéticos) causa una disminución significativa de los niveles de glucosa en sangre am.

Ejemplo X

El efecto del 001-insulina administrado oralmente a monos cinomolgus se mostró de la siguiente manera. 6 monos cinomolgus (3 machos, 3 hembras, peso promedio 2,5 kilogramos) fueron puestos en ayunas durante toda la noche. Los niveles de glucosa basal fueron determinados antes de que los animales recibieran una administración de glucosa de 3 gramos por kilogramo de peso corporal administrado mediante alimentación forzada como una disolución al 50%. A diversos tiempo (0-4 horas) los niveles de glucosa en sangre fueron documentados. Dos días después los animales fueron puestos de nuevo en ayunas y administrados con 3 gramos por kilogramo de peso corporal de glucosa. Esta vez los animales recibieron 001-insulina (equivalente a 5 miligramos por kilogramo de insulina)mediante al ruta oral. Los niveles de glucosa en sangre fueron medidos a diversos puntos de tiempo. El efecto de dosis de 2 miligramos por kilogramo y 0,5 miligramos por kilogramos de 001-insulina usando los mismos animales y protocolos fueron determinados después de que se dejara un período de dos días de lavado entre tratamiento. Los resultados para cada tratamiento (testigo, 0,5, 2 ó 5 miligramos por kilogramo) fueron calculados como porcentaje de cambio en glucosa sanguínea a lo largo del tiempo y los resultados se muestran en la Figura 7. Donde representa glucosa, representa 5 miligramos, representa 2 miligramos y representa 0,5 miligramos. 2 horas después de la administración de glucosa, el aumento promedio de niveles de glucosa en sangre en el grupo tratado es un tercio del aumento en los animales sin tratar.

Ejemplo XI

La digestión por quimotripsina de la insulina y la insulina OT fue medida de la siguiente manera. La quimotripsina (purificada por Sigma tipo 1S) fue incubada a 37ºC con bien insulina (bovina) o bien conjugado insulina-OT disuelto en tampón fosfato salino a pH 8. Las alícuotas fueron eliminadas periódicamente y acidificadas mediante la adición de una décima parte del volumen de ácido trifluoracético (TFA) al 2% para parar la reacción. Las muestras fueron analizadas mediante HPLC y los resultados fueron mostrados en la Figura 3 en la que la OT-insulina está representada por un \sqbullet y la insulina está representada por un \Box.

Mejor modo de llevar a cabo el invento

Actualmente, las composiciones y formulaciones de polímeros polipeptídicos estabilizados por conjugación del presente invento se refieren a complejos peptídicos conjugados covalentemente en los que el péptido está unido covalentemente a uno o más moléculas del polímero que incorporan como parte integral del mismo un resto hidrofílico, por ejemplo, un polialquilénglicol lineal, y en el que dicho polímero incorpora un resto lipofílico como una parte integral del mismo.

Un aspecto particularmente preferido del presente invento se refiere a una composición peptídica fisiológicamente activa que comprende un péptido fisiológicamente activo acoplado covalentemente con un polímero que comprende (i) un resto polialquilenglicol lineal, y (ii) un resto lipofílico, en el que el péptido, resto polialquilenglicol lineal, y resto lipofílico son dispuestos conformacionalmente en relación entre sí tal que el péptido fisiológicamente activo en la composición peptídico fisiológicamente activa tenga una resistencia in vivo potenciada a la degradación enzimática, relativa al péptido fisiológicamente activo solo (es decir, en una forma conjugada desprovista del polímero al cual se acopla).

Aplicación industrial del invento

El presente invento contempla el uso de composiciones polipeptídicas estabilizadas mediante conjugación descritas aquí, para dosificaciones de administración oral para la mediación y tratamiento de los estadíos de las enfermedades en las que están implicadas deficiencias peptídicas.

Claims (4)

1. Un conjugado polímero-péptido que tiene la siguiente fórmula

Pr-Z-(CH_{2})_{m}(OC_{2}H_{4})_{n}-XR

en la que

Pr = péptidos;

R = alquilo;

n = 5 a 120;

m = 2 a 15;

2. Un conjugado polímero-péptido según la reivindicación 1, en el que el péptido es insulina.

3. Una composición farmacéutica que comprende un conjugado polímero-péptido de la reivindicación 1, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

4. El uso de un conjugado polímero-péptido de la reivindicación 1, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, para la fabricación de un medicamento oral para el tratamiento de la insuficiencia de insulina.