RS59459B1 - Hormoni rasta sa produženom in-vivo efikasnošću - Google Patents

Hormoni rasta sa produženom in-vivo efikasnošću

Info

Publication number
RS59459B1
RS59459B1 RSP20191198A RS59459B1 RS 59459 B1 RS59459 B1 RS 59459B1 RS P20191198 A RSP20191198 A RS P20191198A RS 59459 B1 RS59459 B1 RS 59459B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
nhc
conjugate
hgh
alkyl
growth hormone
Prior art date
Application number
Other languages
English (en)
Inventor
Carsten Behrens
Nils Langeland Johansen
Henrik Sune Andersen
Leif Nørskov-Lauritsen
Jens Buchardt
Original Assignee
Novo Nordisk Healthcare Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novo Nordisk Healthcare Ag filed Critical Novo Nordisk Healthcare Ag
Publication of RS59459B1 publication Critical patent/RS59459B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/27—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/542—Carboxylic acids, e.g. a fatty acid or an amino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/545—Heterocyclic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/643—Albumins, e.g. HSA, BSA, ovalbumin or a Keyhole Limpet Hemocyanin [KHL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/06—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N2030/022—Column chromatography characterised by the kind of separation mechanism
    • G01N2030/027—Liquid chromatography

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Description

OBLAST PRONALASKA
Predmetni pronalazak se odnosi na jedinjenje hormona rasta vezano na ostatak koji veže albumin preko hidrofilnog spejsera (odstojnika) i na postupke za pripremu i upotrebu takvih jedinjenja. Ovi konjugati hormona rasta imaju povećanu otpornost na proteolitičku razgradnju u kombinaciji sa dugotrajnim profilom delovanja i korisni su u terapiji.
STANJE TEHNIKE
Hormon rasta je hormon polipeptida koji kod sisara luči anteriorna hipofiza. Zavisno od vrsta, hormon rasta je protein sastavljen od otprilike 190 ostataka amino-kiselina koji odgovaraju molekulskoj masi od oko 22 kDa. Hormon rasta vezuje se za i signalizira putem receptora ćelijske površine, receptora hormona rasta (GHR). Hormon rasta igra ključnu ulogu u pospešivanju rasta, održavanju normalnog telesnog sastava, anabolizma i metabolizma lipida. Takođe, ima direktne uticaje na srednji metabolizam, poput smanjenog unosa glukoze, povećane lipolize, povećanog unosa amino-kiselina i sinteze proteina. Hormon, takođe, deluje na druga tkiva, uključujući masno tkivo, jetru, creva, bubrege, kostur, vezivno tkivo i mišiće. Rekombinantni humani hormon rasta (hGH) je proizveden i dostupan u prodaji kao, na primer: Genotropin™ (Pharmacia Upjohn), Nutropin™ i Protropin™ (Genentech), Humatrope™ (Eli Lilly), Serostim™ (Serono), Norditropin (Novo Nordisk), Omnitrope (Sandoz), Nutropin Depot (Genentech i Alkermes). Pored toga, analog sa dodatnim metioninskim ostatkom na N-kraju, takođe se prodaje kao npr. Somatonorm ™ (Pharmacia Upjohn/Pfizer).
Hormon rasta deli zajedničku topologiju sa ostalim članovima proteina iz porodice hormona rasta, prolaktinom (PRL) i placentnim laktogenom (PL). Hormon rasta klasifikovan je kao snop proteina sa četiri spirale (crtež 1) koji pokazuje topologiju „gore-gore-dole-dole“ sa dve očuvane disulfidne veze. Konkretno, divlji tip humanog hormona rasta (hGH) sastoji se od 191 ostatka aminokiselina i ima četiri cisteinska ostatka na pozicijama 53, 165, 182 i 189, što stabilizuje trodimenzionalnu strukturu proteina formiranjem dve intramolekularne disulfidne veze koje povezuju C53 sa C165 i C182 sa C189, respektivno (crtež 1). Struktura hGH eksperimentalno je određena kristalografijom rendgenskih zraka u slobodnom obliku (Chantalet L. et al Protein and Peptide Letters3, 333-340, (1995)) i u kompleksu sa svojim vezujućim proteinom (ekstra ćelijski domen humanog GHR (hGHR)) (Devos, A. M. et al Science 255, 306-312, (1992)). Ove strukture su deponovane u Banci podataka o proteinima (PDB) i javno su dostupne (pristupni kodovi PDB 1HGU i 1HWG, respektivno). Dakle, iz objavljenih hGH struktura mogu se identifikovati ostaci važni za vezivanje hGH na hGHR. Dalje, dinamička svojstva hGH proučavana su spektroskopijom nuklearne magnetne rezonance (NMR) (Kasimova M.R. et al. J. Mol. Biol. 318, 679-695, (2002)). U kombinaciji, podaci rengenskih zraka i NMR mogu razlikovati oblasti hGH koje su dobro strukturirane i dobro definisane od oblasti koje su manje strukturirane i dinamične. Očekuje se da će manje strukturirane i dinamične oblasti hGH biti posebno podložne proteolitičkom cepanju i pravilna stabilizacija takvih oblasti bi dovela do poboljšane proteolitičke stabilnosti.
hGH je bio podvrgnut širokoj mutagenezi u pokušaju da se proizvedu hGH analozi sa željenim hemijskim ili biološkim svojstvima. Specifično su opisani cisteinski mutanti za više svrha.
US 2003/0162949 opisuje cisteinske varijante članova porodice GH supergena. Dat je opšti postupak za stvaranje specifičnih za lokaciju biološki aktivnih konjugata ovih proteina. Postupak uključuje dodavanje cisteinskih ostataka neesencijalnim oblastima proteina ili supstituciju cisteinskih ostataka neesencijalnim amino-kiselinama u proteinima korišćenjem mutageneze usmerene na lokaciju i zatim kovalentno spajanje cistein reaktivnog polimera ili druge vrste cistein reaktivne grupe na proteine preko dodatka ostatka cisteina
WO 02/055532 opisuje genetski modifikovane hGH mutante koji imaju najmanje jedan nepolipeptidni deo kovalentno vezan, naročito hGH mutante gde je uvedeni ostatak cisteina korišćen za pegilaciju.
US 5.951.972 opisuje fiziološki aktivne derivatizovane prirodne i rekombinantne proteine i polipeptide sisara i čoveka kod kojih je najmanje jedan ostatak cisteina koji se prirodno pojavljuje ili je cisteinski ostatak ugrađen unutar proteina derivatizovan sa različitim supstituentima.
Proteolitičko cepanje hGH detaljno je proučeno. Duga petlja sastavljena od ostataka 128 do 154 ima pretpostavljena mesta cepanja za nekoliko proteaza, kao što su trombin, plazmin, kolagenaza, subtilizin i hemotripsin slične serinske proteaze. Prema tome, pokazalo se da je ovaj deo hGH posebno podložan proteolitičkom cepanju (Lewis, U.J. Ann. Rev. Physiol.46, 33-42, (1984)). Enzimi za koje se navodi da razgrađuju hGH uključuju trombin, plazmin, subtilizin, serinske proteineze slične himotripsinu i kalikreine.
Degradacija hGH u tkivu pacova je istražena (Garcia-Barros et al.J. Endocrinol. Invest. 23, 748–754, (2000)).
Kod štitne žlezde pacova, nađene su proteaze slične himotripsinu, koje favoriziraju cepanje na glomaznim i lipofilnim ostacima amino-kiselina, tako da prvobitno cepaju peptidnu vezu između Y143 i S144, što rezultira dvolančanim molekulima, nakon čega dolazi do cepanja između Y42 i S43, oslobađajući N- terminalni peptid F1-Y42.
Podeljena petlja u molekulu sa dva lanca obrađuje se dalje cepanjem između F146 i D147 himotripsinu sličnim proteazama i dalje delovanjem karboksipeptidaza.
Zabeleženo je nekoliko postupaka za proizvodnju hGH analoga stabilizovanih na proteolitičku razgradnju.
Alam et al., J. Biotech. 65, 183–190, (1998) dizajnirao je hGH mutante otporne na trombin i plazmin pomoću specifičnih tačkastih mutacija. Trombin cepa hGH posebno između R134 i T135, a dvostruki mutant R134D, T135P daje varijantu hGH otpornu na cepanje trombinom, a trostruki mutant R134D, T135P, K140A rezultirao je otpornošću na plazmin. Pored toga, poslednji mutant hGH bio je rezistentan na proteolizu humanom plazmom u periodu od 7 dana.
EP 534568 opisuje hGH mutante stabilizovane protiv proteolitičke razgradnje mutiranjem R134 u alanin, leucin, treonin, fenilalanin, prolin ili histidin.
WO 2004/022593/Nautilus opisuje opšte visoko propusne usmerene postupke evolucije za proizvodnju modifikovanih citokina, uključujući i GH varijante, sa povećanom proteolitičkom stabilnošću.
WO 2006/048777/Nautilus posebno opisuje modifikovane hGH analoge sa poboljšanom proteolitičkom stabilnošću.
Analozi sadrže jednu do pet mutacija na pozicijama 1-55, 57, 58, 60-63, 67-87, 89-91, 93, 95-100, 102-128, 131-132, 135-139, 141, 142, 144, 148-182, 184, 185 i 187-191.
Uvođenje cisteinskih ostataka može potencijalno dovesti do stvaranja neželjenih disulfidno povezanih dimera i u WO 2006/048777 supstitucija ostataka amino-kiselina cisteinom posebno je isključena iz obuhvata; u WO 2006/048777 (str. 65) navedeno je: „Zamena amino-kiselina ostacima cisteina izričito je izbegnuta jer bi ta promena potencijalno dovela do stvaranja intermolekularnih disulfidnih veza.“ Postoji očigledna potreba za razvijanjem hGH jedinjenja koja su otporna na proteolitičku razgradnju. Takva stabilizovana jedinjenja treba da pokazuju povećanu stabilnost prema proteolitičkom cepanju uz zadržavanje željenih bioloških svojstava hGH-a.Takvi GH molekuli bi imali povećanu stabilnost, sporiji klirens i/ili bi produžili in vivo poluživot.
Pored toga, dobro je izmeniti svojstva i odlike peptida konjugacijom grupa u peptid što pravilno menja svojstva peptida. Ovakva konjugacija generalno zahteva da neka funkcionalna grupa u peptidu reaguje sa drugom funkcionalnom grupom u konjugacijskoj grupi. Obično su amino grupe, kao što je N-terminalna amino grupa ili εamino grupa u lizinima, korišćene u kombinaciji sa pogodnim acilirajućim reagensom. Alternativno, polietilen glikol (PEG) ili njegovi derivati mogu biti vezani na proteine. Za pregled, videti Exp. Opion. Ther. Patent. 14, 859-894, (2004). Pokazano je da vezivanje PEG-a na hormon rasta može imati pozitivan uticaj na poluživot hormona rasta u plazmi, WO 03/044056.
Upotreba karboksipeptidaza za modifikaciju C-kraja peptida je opisana ranije. WO 92/05271 otkriva upotrebu karboksipeptidaza i nukleofilnih jedinjenja za amidaciju C-terminalne karboksi grupe, a WO 98/38285 opisuje varijante karboksipeptidaze Y naročito pogodne za ovu svrhu.
EP 243929 otkriva upotrebu karboksipeptidaze za uključivanje polipeptida, reporterskih grupa ili citotoksičnih agenasa na C-kraju proteina ili polipeptida.
WO 2005/035553 opisuje postupke za selektivnu konjugaciju peptida enzimskim ugrađivanjem funkcionalne grupe na C-kraju peptida.
Aktivirani derivati halogena i maleimidi predstavljaju neke od najčešće korišćenih funkcionalnih grupa kada se uvode konjugati sa sulfhidrilnim grupama u peptide (G. T. Hermanson in Bioconjugate Techniques 2. Ed.
2008, Elsevier).
Transglutaminaza je ranije korišćena za promenu svojstava peptida. U prehrambenoj industriji, a naročito u industriji mlečnih proizvoda, dostupne su mnoge tehnike, npr. unakrsno vezani peptidi korišćenjem transglutaminaze. Ostali dokumenti otkrivaju upotrebu transglutaminaze za promenu svojstava fiziološki aktivnih peptida. EP 950665, EP 785276 i Sato, Adv. Drug Delivery Rev. 54, 487-504, (2002) opsiuju direktnu reakciju između peptida koji sadrže najmanje jedan Gln i amin-funkcionalizovani PEG ili slične ligande u prisustvu transglutaminaze, i Wada, Biotech.
Lett. 23, 1367-1372, (2001) otkriva direktnu konjugaciju βlaktoglobulina sa masnim kiselinama pomoću transglutaminaze. Međunarodna patentna prijava objavljena kao WO 2005/070468 otkriva upotrebu transglutaminaze za uključivanje ručke na koju se mogu vezati konjugacione grupe.
Hormon rasta je ključni hormon koji učestvuje u regulaciji ne samo somatskog rasta, već i u regulaciji metabolizma proteina, ugljenih hidrata i lipida. Glavni efekat hormona rasta je da pospešuje rast. Humani hormon rasta je protein 191. ostatka amino-kiseline sa sledećim redosledom:
FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIP TPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLE EGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFL RIVQCRSVEGSCGF (SEQ ID NO: 1).
Davanje humanog hormona rasta i njegove srodne varijante koristi se za lečenje različitih bolesti povezanih sa nedostatkom hormona rasta. Budući da je polipeptid, hormon rasta se primenjuje parenteralno, tj., pomoću igle. Nadalje, hormon rasta odlikuje relativno kratak poluživot, pa su potrebne česte primene sa pratećim bolovima i neugodnostima za pacijenta. Stoga, i dalje postoji potreba za obezbeđivanjem jedinjenja hormona rasta sa poboljšanim farmakološkim svojstvima, kao što je npr. produženi poluživot.
Predmetni pronalazak obezbeđuje nove konjugate jedinjenja hormona rasta sa poboljšanim farmakinetičkim i farmakološkim svojstvima kao i postupke za njihovu proizvodnju.
KRATAK PRIKAZ PRONALASKA
Obim pronalaska je definisan patentnim zahtevima.
Bilo koje reference u opisu na postupaka lečenja odnose se na konjugate predmetnog pronalaska za upotrebu u postupku za lečenja ljudskog ili životinjskog tela terapijom.
Pronalazak se odnosi na konjugat hormona rasta koji ima formulu (I)
A-W-B-GH (I)
pri čemu
GH predstavlja jedinjenje hormona rasta sa jednom Cys mutacijom izabranom iz grupe mutacija koje odgovaraju: T3C, P5C, S7C, D11C, H18C, Q29C, E30C, E33C, A34C, Y35C, K38C, E39C, Y42C, S43C, D47C, P48C, S55C, S57C, P59C, S62, E65C, Q69C, E88C, Q91C, S95C, A98C, N99C, S100C, L101C, V102C, Y103C, D107C, S108C, D112C, Q122C, G126C, E129C, D130C, G131C, P133C, T135C, G136C, T142C, D147C, N149C, D154C, A155C, L156C, R178C, E186C, G187C i G190C hGH (SEQ ID NO: 1),
B predstavlja hidrofilni spejser (odstojnik),
W je hemijska grupa koja povezuje A i B, i
A predstavlja ostatak koji vezuje albumin izabran između:
i
pri čemu * označava vezivanje na B preko W i
pri čemu je ostatak koji veže albumin (A) preko hidrofilnog spejsera (B) povezan sa GH preko sumpornog ostatka pojedinačne Cys mutacije, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli.
Bioraspoloživost farmaceutskog jedinjenja koje se daje supkutano može se odnositi na brzinu apsorpcije.
Sposobnost jedinjenja da prođe uske spojeve potkožnih kapilara može delom biti povezana sa njihovim fizičkim i hemijskim svojstvima, kao i sa molekularnom veličinom ili hidrodinamičkom zapreminom jedinjenja. Proteinski konjugat kao što je pegilirani hGH (PEG-hGH) sa 40 kDa PEG ima prividnu molekulsku masu od 150 do 250 kDa. Molekul hGH sa kovalentno vezanim albuminom ima molekulsku masu od 87 kDa, dok će molekul hGH sa nekovalentnim vezanim albuminom biti odvojen od dela vremena albumina i na taj način će imati molekulsku masu od 22 kDa.
Zamišljeno je da vreme provedeno u disociranom stanju zavisi, barem delimično, od afiniteta grupe koja vezuju album. Stoga brzina apsorpcije hGH molekula sa nekovalentnim vezanim albuminom može biti brža nego za PEG-hGH. Povećana brzina apsorpcije može se postići kada se koriste grupe koje vezuju albumine koje imaju niži afinitet prema albuminu.
Pored toga, fizička i hemijska svojstva linkera i/ili spejsera koja obezbeđuju vezivanje grupe koja vezuje albumin na hGH će uticati na funkcionalnosti jedinjenja.
Predmetni pronalazači iznenađujuće su otkrili da jedinjenja hormona rasta (GH) sa jednom Cys mutacijom i/ili dodatnim disulfidnim mostom mogu se selektivno vezivati na ostatak koji vezuje albumin - preko hidrofilnog spejsera koji razdvaja GH i ostatak koji vezuje albumin, obično sa hemijskom grupom koja ima mLogP <0 - ili cLogP <0,5 da se dobiju GH konjugati sa poboljšanim svojstvima, kao što je visoka in vitro potentnost, ili kao što je povećanje in vivo poluživota, ili kao što je povećana otpornost na proteolitičku razgradnju, moguće u kombinaciji sa produženim in vivo profilom delovanja. Vezivanjem ostatka koji vezuje albumin preko hidrofilnog spejsera sa jedinstvenom Cys mutacijom može se zadržati biološka aktivnost i može se dobiti jedno ili više gore navedenih poboljšanja.
U jednoj realizaciji predmetnog pronalaska, stabilna jedinjenja hGH imaju dodatne disulfidne veze. Disulfidne veze nastaju između parova cisteina od kojih su jedan ili oba uvedeni tačkastim mutacijama u hGH sekvencu divljeg tipa.
Dodatna disulfidna veza(e) formirana između parova dodatnih cisteina i dodatni cisteini uvode se tačkastim mutacijama u hGH sekvencu divljeg tipa.
Dalje, predmetni pronalazak zasnovan je na zapažanju da se uvođenje ostatka koji vezuje albumin preko hidrofilnog spejsera u humani hormon rasta (hGH) može da se izvrši selektivno, pri čemu je zadržan veliki deo aktivnosti. Ostatak koji vezuje albumin preko hidrofilnog spejsera uvodi se na poziciju(e) koja odgovara uvedenom cisteinu(ima) na poziciji koja odgovara: T3C, P5C, S7C, D11C, H18C, Q29C, E30C, E33C, A34C, Y35C, K38C, E39C, Y42C, S43C, D47C, P48C, S55C, S57C, P59C, S62, E65C, Q69C, E88C, Q91C, S95C, A98C, N99C, S100C, L101C, V102C, Y103C, D107C, S108C, D112C, Q122C, G126C, E129C, D130C, G131C, P133C, T135C, G136C, T142C, D147C, N149C, D154C, A155C, L156C, R178C, E186C, G187C and G190C of hGH (SEQ ID NO: 1).
Konjugati jedinjenja hormona rasta iz predmetnog pronalaska imaju bržu potkožnu apsorpciju u poređenju sa PEGiliranim hGH, i na taj način omogućavaju manju ili nikakvu lipoathrofiju. Nadalje, ostatak koji vezuje albumin i hidrofilni spejser su biorazgradivi za razliku od PEG-a.
Još jedan cilj predmetnog pronalaska je da se obezbedi postupak za poboljšanje svojstava GH konjugacijom datog proteina u skladu sa postupcima predmetnog
pronalaska.
U sledećem cilju pronalaska, takva jedinjenja su rastvorljiva.
DEFINICIJE
U ovom kontekstu, termin „jedinjenje hormona rasta“ kako se ovde koristi označava hormon rasta sisarskog porekla, kao što je humani, goveđi ili svinjski hormon rasta, i rekombinantni hormon rasta, kao što su rekombinantni humani, goveđi ili svinjski hormon rasta, i varijante, kao i mutante takvih hormona rasta. Kao što se ovde koristi, „GH“ i „jedinjenje hormona rasta“ su uzajamno zamenljivi. Kada je GH varijanta hormona rasta poreklom od sisara, kao što je hGH i rekombinantni hGH, podrazumeva se da je varijanta jedinjenje dobijeno supstitucijom jednog ili više ostataka amino-kiselina hormonom rasta, npr. hGH, sekvence sa drugom prirodnom ili neprirodnom amino-kiselinom; i/ili dodavanjem jedne ili više prirodnih ili neprirodnih aminokiselina hormonu rasta, npr. hGH, sekvence; i/ili brisanjem jednog ili više ostataka amino-kiselina iz hormona rasta, npr. hGH, sekvence, pri čemu bilo koji od ovih koraka opciono može biti praćen daljom derivatizacijom jednog ili više ostataka amino-kiselina. Uglavnom, GH ima najmanje 80% identičnosti sa hGH, i uglavnom, najmanje 10% aktivnosti hormona rasta hGH, kako je određeno u testu (I) (primer 46) ovde.
U ovom kontekstu izraz „albumin vezujući ostatak“, kako je ovde upotrebljen, označava ostatak koji se nekovalentno vezuje za humani serumski albumin. Ostatak koji vezuje albumin vezan za jedinjenje hormona rasta (GH) obično ima afinitet vezivanja prema albuminu humanog seruma koji je ispod oko 10 µM ili čak ispod oko 1 µM. Poznati su rasponi ostataka koji vezuju albumin među linearnim i razgranatim lipohofilnim grupama koje sadrže 12-40atoma ugljenika, jedinjenjima sa skeletom ciklopentanofenantrena i/ili peptidima sa 10-45 ostataka amino-kiselina, itd.
Svojstva vezivanja albumina mogu se meriti površinskom rezonancom plazmona kako je opisano u J. Biol. Chem.
277(38), 35035-35042, (2002).
Izraz „hidrofilni spejcer", kako se ovde koristi, označava odstojnik koji razdvaja jedinjenje hormona rasta i ostatak koji vezuje albumin sa hemijskom grupom koja sadrži najmanje 5 atoma koji nisu vodonik, pri čemu je 30-50% ili N ili O.
U ovom kontekstu, izraz „transaminacija“ i srodni izrazi imaju za cilj da označe reakciju u kojoj se amidni azot u bočnom lancu glutamina razmenjuje sa azotom iz drugog jedinjenja, posebno azotom iz drugog nukleofila koji sadrži azot.
Transglutaminaza (E.C.2.3.2.13) je, takođe, poznata kao protein-glutamin- γ-glutamiltransferaza i katalizuje opštu reakciju
.
<Q'>
Q-C(O)-NH2(akceptor amina) može predstavljati ostatak glutamina koji sadrži peptid ili protein, a Q’-NH2(donor amina) predstavlja nukleofil koji sadrži amin.
Alternativno, Q-C(O)-NH2i Q’-NH2mogu predstavljati akceptor amina i peptid ili protein koji sadrži lizin, respektivno. U predmetnom pronalasku, međutim, Q-C(O)-NH2predstavlja ostatak glutamina koji sadrži hormon rasta i Q’-NH2predstavlja nukleofil koji sadrži amin, kao što je gore navedeno.
Primeri korisnih transglutaminaza uključuju mikrobne transglutaminaze, kao što su npr. one iz Streptomyces mobaraense, Streptomyces cinnamoneum i Streptomyces griseocarneum (svi opisani u US 5.156.956) i iz Streptomyces lavendulae (opisani u US 5.252.469) i Streptomyces ladakanum (JP 2003/199569). Treba napomenuti da su pripadnici nekadašnjeg roda Streptoverticillium sada uključeni u rod Streptomyces (Kaempfer, J. Gen. Microbiol.
137, 1831-1892, (1991)). Ostale korisne mikrobne transglutaminaze su izolovane iz Bacillus subtilis (opisano u US 5.731.183) i iz raznih miksomiceta. Ostali primeri korisnih mikrobnih transglutaminaza su oni otkriveni u WO 96/06931 (npr. transglutaminaza iz Bacilus lydicus) i WO 96/22366. Korisne nemikrobne transglutaminaze uključuju transglutaminazu jetre zamoraca i transglutaminaze iz različitih morskih izvora poput pljosnatice Pagrus major (opisano u EP-0555649) i japanske ostrige Crassostrea gigas (opisano u US 5.736.356).
U ovom kontekstu, izraz „nije dostupan“ ima za cilj da ukaže da nešto nema ili de facto nema u smislu da se do toga ne može doći. Kada je navedeno da funkcionalne grupe nisu dostupne u proteinu koji se konjuguje, namerava se ukazati na to da navedene funkcionalne grupe nema u proteinu ili je, ako postoji, na neki način sprečena da učestvuje u reakcijama. Na primer, data funkcionalna grupa može biti duboko u strukturi proteina tako da je zaštićena od učešća u reakciji. Prepoznato je da to da li je funkcionalna grupa dostupna ili ne zavisi od uslova reakcije. Može se predvideti da, npr. u prisustvu sredstava za denaturaciju ili na povišenim temperaturama, protein se može razviti kako bi izložio inače nedostupne funkcionalne grupe. Treba razumeti da „nedostupan“ znači „nije dostupan pod uslovom reakcije izabranim za određenu reakciju od interesa“.
Izraz „alkan“ ili „alkil“ se odnosi na zasićene, linearne, razgranate i/ili ciklične ugljovodonike. Ako nije naznačeno drugim brojem atoma ugljenika, izraz je namenjen da označi ugljovodonike sa 1 do 30 (oba uključena) atoma ugljenika, kao što su 1 do 20 (oba uključena), kao što su od 1 do 10 (oba uključena), npr. od 1 do 5 (oba uključena). Termini alkil i alkilen odnose se na odgovarajući radikal, odnosno biradikal.
Izraz „C1-6alkil“ odnosi se na ravni lančani ili razgranati zasićeni ugljovodonik koji sadrži od jedan do šest atoma ugljenika. Primeri takvih grupa uključuju 2-propil, 1-butil, 2-butil, 2-metil-2-propil, 2-metil-1-butil i n-heksil.
Izraz „C3-10cikloalkil“ obično se odnosi na ciklopropil, ciklobutil, ciklopentil, cikloheksil, cikloheptil, ciklooktil, ciklononil i ciklodekanil.
Izraz „alken“ ima za cilj da označi linearne, razgranate i/ili ciklične ugljovodonike koji sadrže najmanje jednu dvostruku ugljenik-ugljenik vezu. Ako nije naznačeno sa drugim brojem atoma ugljenika, termin je namenjen da označi ugljovodonike sa 2 do 30 (oba uključena) atoma ugljenika, kao što su 2 do 20 (oba uključena), kao što su od 2 do 10 (oba uključena), npr. od 2 do 5 (oba uključena). Termini alkenil i alkenilen odnose se na odgovarajući radikal, odnosno biradikal, respektivno.
Izraz „alkin“ treba da označi linearne, razgranate i/ili ciklične ugljovodonike koji sadrže najmanje jednu trostruku ugljenik-ugljenik vezu, a može opciono da sadrži jednu ili više dvostrukih ugljenik-ugljenik veza. Ako nije naznačeno drugim brojem atoma ugljenika, izraz je namenjen da ukaže na ugljovodonike sa 2 do 30 (oba uključena) atoma ugljenika, kao što su od 2 do 20 (oba uključena), kao što su od 2 do 10 (oba uključena), npr. od 2 do 5 (oba uključena). Termini alkinil i alkinilen odnose se na odgovarajući radikal, odnosno biradikal, respektivno.
Izraz „homociklično aromatsko jedinjenje“ ima za cilj da označi aromatske ugljovodonike, kao što su benzen i naftalen.
Izraz „heterociklično jedinjenje“ treba da označi ciklično jedinjenje koje sadrži 5, 6 ili 7 atoma u prstenu od kojih su 1, 2, 3 ili 4 heteroatomi izabrani iz N, O i/ili S. Primeri uključuju heterociklična aromatična jedinjenja, kao što su tiofen, furan, piran, pirol, imidazol, pirazol, izotiazol, izooksazol, piridin, pirazin, pirimidin, piridazin, kao i njihovi delimično ili potpuno hidrogenizovani ekvivalenti, kao što su piperidin, pirazolidin, pirolidin, pirolin, imidazolidin, imidazolin i morfolin.
Izrazi „heteroalkani“, „hetero alkeni“ i „hetero alkin“ treba da označe alkane, alkene i alkine kako je gore definisano, pri čemu su jedan ili više heteroatoma ili grupa ubačeni u strukturu datih grupa. Primeri hetero grupa i atoma uključuju -O-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, -C(O)- -C(S)-i -N(R*)-, pri čemu R* predstavlja vodonik ili C1-C6-alkil. Primeri heteroalkana uključuju.
Izraz „radikal“ ili „biradikal“ treba da označi jedinjenje iz kojeg su uklonjeni jedan ili dva atoma vodonika. Kada je izričito navedeno, radikal može, takođe, ukazivati na deo (grupu) koji je formiran formalnim uklanjanjem veće grupe atoma, npr. hidroksila, iz jedinjenja.
Izraz „halogen“ treba da označi članove sedme glavne grupe periodinog sistema, npr. F, Cl, Br i I.
U ovom kontekstu, termin „aril“ treba da označi radikal karbocikličnog aromatičnog prstena ili radikal fuzionisanog aromatičnog prstenastog sistema, pri čemu je najmanje jedan od prstenova aromatičan. Tipične arilne grupe uključuju fenil, bifenilil, naftil i slično.
Izraz „heteroaril” ili „hetaril“, kako se ovde koristi, sam ili u kombinaciji, odnosi se na radikal aromatičnog prstena sa, na primer, 5 do 7 članova atoma, ili na radikal kondenzovanog aromatičnog prstenastog sistema sa na primer od 7 do 18 članova atoma, pri čemu je najmanje jedan prsten aromatičan, sadrži jedan ili više heteroatoma kao atoma u prstenu odabranih između azotnih, kiseoničkih ili sumpornih heteroatoma, pri čemu su N-oksidi i sumpor monoksidi i sumpor dioksidi dopuštene heteroaromatske supstitucije. Primeri uključujufuranil, tienil, tiofenil, pirolil, imidazolil, pirazolil, triazolil, tetrazolil, tiazolil, oksazolil, izoksazolil, oksadiazolil, tiadiazolil, izotiazol, piridinil, piridazinil, pirazinil, pirimidinil, kvinolinil, izokvinolinil, benzofuranil, benzotiofenil, indolil, i indazolil, i slično.
Izraz „konjugat“ kao imenica ima za cilj da označi modifikovani protein, tj. protein sa grupom koja je za njega vezana u cilju modifikacije svojstava datog proteina. Kao glagol, izraz je namenjen da označi proces vezivanja grupe za protein za modifikovanje svojstava datog proteina.
Izraz „pojedinačni cys“ ili „slobodni cistein“ odnosi se na ostatak cisteina koji nije uključen u dvostruku vezu. Protein može, dakle, da sadrži jedan ili više pojedinačnih cys ostataka pored jednog ili više dodatnih disulfidnih mostova, sve dok dati pojedinačni cys ne dovode do unutrašnjih disulfidnih mostova.
Kao što je ovde upotrebljen, izraz „predlek“ označava biohidrolizujuće amide i biohidrolizujuće estre i, takođe, obuhvata a) jedinjenja u kojima je biohidrolizujuća funkcionalnost u takvom predleku obuhvaćena jedinjenjem prema predmetnom pronalasku i b) jedinjenja koja mogu da se oksiduju ili biološki redukuju u datoj funkcionalnoj grupi da bi se dobile lekovite supstance prema predmetnom pronalasku. Primeri ovih funkcionalnih grupa uključuju 1,4-dihidropiridin, N-alkilkarbonil-1,4-dihidropiridin, 1,4-cikloheksadien, terc-butil i slično.
Kao što je ovde upotrebljen, izraz „biohidrolizujući estar“ je estar lekovite supstance (in casu, jedinjenje prema pronalasku) koji ili a) ne ometa biološku aktivnost matične supstance, ali daje ovoj supstanci povoljna svojstva in vivo kao što je vreme delovanja, početak delovanja i slično, ili b) je biološki neaktivan, ali se lako pretvara in vivo podvrgavanjem biološki aktivnom principu. Prednost je, na primer, povećana rastvorljivost ili u tome što se biohidrolizujući estar oralno apsorbuje iz creva i transformiše u jedinjenje prema predmetnom pronalasku u plazmi. Mnogi primeri su poznati u tehnici i uključuju niže alkilne estere (npr., C1-C4), niže aciloksialkilne estre, niže alkoksiaciloksialkilne estre, alkoksiaciloksi estre, alkil-acilamino-alkilne estre i holin estre.
Kao što je ovde upotrebljen, izraz „biohidrolizujući amid“ je amid lekovite supstance (in casu, jedinjenje prema ovom pronalasku) koji ili a) ne ometa biološku aktivnost matične supstance, ali daje ovoj supstanci povoljna svojstva in vivo kao što su vreme delovanja, početak delovanja i slično ili b) je biološki neaktivan, ali se lako pretvara in vivo podvrgavanjem biološki aktivnom principu. Prednost je, na primer, povećana rastvorljivost ili u tome što se biohidrolizujući amid oralno apsorbuje iz creva i transformiše u jedinjenje prema predmetnom pronalasku u plazmi. Mnogi primeri su poznati u tehnici i uključuju na primer niže alkil amide, amide α -aminokiselina, alkoksiacil amide i alkilaminoalkilkarbonil amide.
U ovom kontekstu, izraz „farmaceutski prihvatljiva so“ je namenjen da označi so koja nije štetna za pacijenta. Takve soli uključuju farmaceutski prihvatljive kisele adicione soli, farmaceutski prihvatljive soli metala, amonijum i alkilovane amonijumove soli. Kisele adicione soli obuhvataju soli neorganskih kiselina kao i organske kiseline. Reprezentativni primeri pogodnih neorganskih kiselina uključuju hlorovodoničnu, bromovodoničnu, jodovodoničnu, fosfornu, sumpornu, azotnu kiselinu i slično. Reprezentativni primeri pogodnih organskih kiselina uključuju mravlju, sirćetnu, trihlorsirćetnu, trifluorosirćetnu, propionsku, benzoevu, cinaminsku, limunsku, fumarnu, glikolnu, mlečnu, maleinsku, jabučnu, malonsku, mandelinsku, oksalnu, pikrinsku, pirogrožđanu, salicilnu, sukcinsku, metansulfonsku, etansulfonsku, vinsku, askorbinsku, pamoinsku, bizmetilen salicilnu, etandisulfonsku, glukonsku, citrakonsku, asparaginsku, stearinsku, palmitinsku, EDTA, glikolnu, p-aminobenzoevu, glutaminsku, benzensulfonsku, p-toluensulfonsku kiselinu i slično. Dalji primeri farmaceutski prihvatljivih soli neorganskih ili organskih kiselina za dodavanje uključuju farmaceutski prihvatljive soli navedene u J. Pharm. Sci.
66, 2, (1977). Primeri soli metala uključuju litijumove, natrijumove, kalijumove, magnezijumove soli i slično.
Primeri amonijumovih soli i soli alkiliranog amonijuma uključuju amonijum, metilamonijum, dimetilamonijum, trimetilamonijum, etilamonijum, hidroksietilamonijum, dietilamonijum, butilamonijum, tetrametilamonijum soli i slično.
„Terapeutski efikasna količina“ jedinjenja kao što je ovde korišćeno označava količinu koja je dovoljna za lečenje, ublažavanje ili delimično zaustavljanje kliničkih manifestacija date bolesti ili stanja i njegovih komplikacija. Količina adekvatna da se to i postigne definisana je kao „terapeutski efikasna količina”. Efikasne količine za svaku od navedenih namena zavisiće od težine bolesti ili povrede, kao i ozbiljnosti i opšteg stanja subjekta. Treba razumeti da se određivanje odgovarajuće doze može postići primenom rutinskih eksperimenata, kreiranjem matrice vrednosti i testiranjem različitih tačaka u matrici, što je sve uobičajeno za lekara ili veterinara.
Izraz „tretman“ i „lečenje“, kako se ovde koristi, podrazumeva vođenje i negu pacijenta u svrhu suzbijanja stanja, kao što je bolest ili poremećaj. Izraz je namenjen da obuhvati ceo spektar tretmana za dato stanje od kojeg pacijent pati, kao što je davanje aktivnog jedinjenja da ublaži simptome ili komplikacije, da odloži napredovanje bolesti, poremećaja ili stanja, da se izleči ili eliminiše bolest, poremećaj ili stanje, da ublaži ili oslobodi simptome i komplikacije, i/ili da leči ili eliminiše bolest, poremećaj ili stanje kao i da spreči stanje, pri čemu se prevencija treba shvatiti kao vođenje i briga o pacijentu u cilju borbe protiv bolesti, stanja ili poremećaja, i uključuje davanje aktivnih jedinjenja koja su u pitanju da bi se sprečio nastanak simptoma ili komplikacija. Poželjno je da je pacijent koji se leči sisar; posebno čovek, ali mogu biti i životinje, poput pasa, mačaka, krava, ovaca i svinja.
OPIS PRONALASKA
Predmetni pronalazak se odnosi na stabilan konjugat hormona rasta koji ima formulu (I):
A-W-B-GH (I)
pri čemu GH predstavlja jedinjenje hormona rasta koje ima jednu Cy mutaciju izabranu iz grupe mutacija koje odgovaraju: T3C, P5C, S7C, D11C, H18C, Q29C, E30C, E33C, A34C, Y35C, K38C, E39C, Y42C, S43C, D47C, P48C, S55C, S57C, P59C, S62, E65C, Q69C, E88C, Q91C, S95C, A98C, N99C, S100C, L101C, V102C, Y103C, D107C, S108C, D112C, Q122C, G126C, E129C, D130C, G131C, P133C, T135C, G136C, T142C, D147C, N149C, D154C, A155C, L156C, R178C, E186C, G187C i G190C od hGH (SEQ ID
NO: 1),
A predstavlja ostatak koji vezuje albumin
B predstavlja hidrofilni spejser,
W je hemijska grupa koja vezuje A i B, i
pri čemu je ostatak koji vezuje albumin (A) preko hidrofilnog spejsera (B) povezan sa data GH preko sumpornog ostatka pojedinačne Cys mutacije, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli.
Opisano je da kada su dva ili više ostataka koji vezuju albumin povezani sa jedinjenjem hormona rasta preko hidrofilnog spejsera, tada su takvi ostaci koji vezuju albumin povezani sa jednom Cys mutacijom ako je takva mutacija prisutna ili ako je prisutan samo dodatni disulfidni most, tada je ostatak koji vezuje albumin preko hidrofilnog spejsera je vezan na poziciju u jedinjenju hormona rasta kako je ovde opisano.
U jednoj realizaciji, jedinjenje hormona rasta ima jednu jedinu Cys mutaciju.
U jednoj drugoj realizaciji, jedinjenje hormona rasta ima dve pojedinačne Cys mutacije.
U sledećoj realizaciji, jedinjenje hormona rasta ima jednu jedinu Cys mutaciju i jedan dodatni disulfidni most.
U daljoj realizaciji, GH predstavlja jedinjenje hormona rasta koje sadrži sekvencu amino-kiseline koja ima najmanje 90% identičnosti sa sekvencom amino-kiseline humanog hormona rasta (hGH) (SEQ ID NO: 1). U daljim realizacijama, GH ima najmanje 80%, kao što je najmanje 85%, kao što je najmanje 95% identičnosti sa hGH, kao što je najmanje 96%, kao što je najmanje 97%, kao što je najmanje 98% ili kao što je najmanje 99% identičnosti sa SEQ ID NO: 1. U daljim realizacijama, date identičnosti sa hGH-a povezane su sa najmanje 10%, kao što je najmanje 20%, kao što je najmanje 40%, kao što je najmanje 60%, kao što je najmanje 80% aktivnosti hormona rasta hGH kako je utvrđeno testom I ovde opisanim. Bilo koja varijanta identičnosti sekvence može se kombinovati sa bilo kojom realizacijom aktivnosti, kao što je GH koji ima najmanje 80% identičnosti sa hGH i povezan je sa najmanje 60% aktivnosti hormona rasta hGH; GH koji ima najmanje 90% identičnosti sa hGH i povezan je sa najmanje 40% aktivnosti hormona rasta hGH; GH koji ima najmanje 95% identičnosti sa hGH i povezan je sa najmanje 80% aktivnosti hormona rasta hGH, i tako dalje. Kao što je ovde opisano, HG se može izraziti kao MetHG što ukazuje da sekvenca sadrži dodatni N-terminalni metionin.
U jednoj realizaciji, GH je varijanta hormona rasta u kojoj se uvodi pojedinačna Cys mutacija. U daljim realizacijama, GH predstavlja jedinjenje hormona rasta koje sadrži jednu do pet mutacija pored pojedinačne Cys mutacije.
U sledećoj realizaciji, ostatak koji vezuje albumin preko hidrofilnog spejsera je povezan sa pojedinačnom Cys mutacijom. U jednoj realizaciji, pojedinačna Cys mutacija je pozicija na N-kraju, H1, H2, L2 ili H3 u GH. U daljim realizacijama, pojedinačna Cys mutacija je smeštena na N-kraju, pri čemu je mutacija takva kao bilo koja od T3C, P5C, S7C ili na H1 (što odgovara AA 9-35), mutacija je takva kao bilo koja od D11C, H18C, Q29C, E30C, E33C, A34C, Y35C ili na L1 (što odgovara AA36-71), pri čemu je mutacija takva kao i bilo koja od K38C, E39C, Y42C, S43C, D47C, P48C, S55, S57C, P59C, S62C, E65C, Q69C ili poželjno kao bilo koja od Y42C, S55C, S57C, S62C, Q69C ili na H2, L2 ili H3 (što odgovara AA 72-98, AA 99-106 i AA 107-127), pri čemu je mutacija takva kao bilo koja od E88C, Q91C, S95C, A98C, N99C, S100C, L101C, V102C, Y103C, D107C, S108C, D112C, Q122C i G126C u hGH (SEQ ID NO: 1) ili na L3 ili H4 (odgovara AA128-154 i AA155-184) Na L3 i H4 (128-154 i AA155-184) mutacija je takva kao bilo koja od E129C, D130C, G131C, P133C, T135C, G136C, T142C, D147C, N149C, D154C, A155C, L156C, R178C, V180C ili na C-kraju mutacija je takva kao bilo koja od E186C G187C G190C.
Ako je pojedinačna Cys mutacija prisutna u hGH varijanti, mutacija se nalazi na odgovarajućim ostacima amino-kiselina.
U posebnoj realizaciji GH pojedinačna Cys mutacija je uvedena na poziciji ekvivalentnoj roditeljskom GH koji je ekvivalentan poziciji hGH (SEQ ID NO: 1) izabranoj iz grupe koja se sastoji od: T3, P5, S7, D11, H18, Q29, E30, E33, A34, Y35, K38, E39, Y42, S43, D47, P48, S55, S57, P59, S62, E65, Q69, E88, Q91, S95, A98, N99, S100, L101, V102, Y103, D107, S108, D112, Q122, G126, E129, D130, G131, P133, T135, G136, T142, D147, N149, D154, A155, L156, R178, E186, G187 i G190, kao što je grupa koja se sastoji od: T3, P5, S7, D11, H18, Q29, E30, E33, A34, Y35, E88, Q91, S95, A98, N99, S100, L101, V102, Y103, D107, S108, D112, Q122 i G126, konjugat GH dalje sadrži grupu koja vezuje albumin na bočnom lancu datog pojedinačnog cisteinskog ostatka.
U daljim realizacijama, pojedinačna Cys mutacija je smeštena unutar AA 93-106 u hGH ili odgovarajućim ostacima u hGH varijanti. U daljim posebnim realizacijama, pojedinačna Cys mutacija nalazi se unutar L2, kao što je unutar AA 99-106 ili AA 99-103 ili odgovarajućih ostataka.
Kada je pojedinačna Cys mutacija prisutna u konjugatu jedinjenja hormona rasta iz predmetnog pronalaska, uobičajena pojedinačna Cys mutacija je E30C. Dalja uobičajena pojedinačna Cys mutacija je Y42C. Dalja uobičajena pojedinačna Cys mutacija je S55C. Dalja uobičajena pojedinačna Cys mutacija je S57C. Dalja uobičajena pojedinačna Cys mutacija je S62C. Dalja uobičajena pojedinačna Cys mutacija je Q69C. Dalja uobičajena pojedinačna Cys mutacija je S95C. Dalja uobičajena pojedinačna Cys mutacija je A98C. Dalja uobičajena pojedinačna Cys mutacija je N99C. Dalja uobičajena pojedinačna Cys mutacija je S100C. Dalja uobičajena pojedinačna Cys mutacija je L101C. Dalja uobičajena pojedinačna Cys mutacija je V102C. Dalja uobičajena pojedinačna Cys mutacija je S108C.
Prema kristalnoj strukturi kompleksa rhGH / receptora (PDB: 3HHR), snop se sastoji od četiri glavne spirale: prva spirala (A) od ostataka 9 do 34, druga spirala (B) od ostatka 72 do 92 i od ostatka 94 do 100, treća spirala (C) od ostatka 106 do 128, i četvrta spirala (D) od ostatka 155 do 184 (M. R. Kasimova et. al. J. Mol. Biol.318, 679–695, (2002)). Četiri glavne spirale se nazivaju jezgrom proteina. Ostaci koji nisu deo spiralnih oblasti su definisani kao ostaci petlje i mogu biti deo fleksibilnih regija, petlji, β-okreta, ukosnica i zavojnica. Nešto drugačija lokalizacija spirala je dobijena kada je hGH u kompleksu sa svojim vezujućim proteinima (PDB: 1HWG), što je definicija spirale koja je gore navedena.
Štaviše, pronalazak se odnosi na GH konjugat koji sadrži najmanje jedan uvedeni ostatak cisteina, a ostatak je uveden na poziciju ekvivalentnu poziciji u spirali ili oblasti petlje hGH. Posebno se ostaci amino-kiselina mogu uvesti u površinski izloženu poziciju u oblasti spirale ili petlje koja ima više od 25% svog bočnog lanca izloženog na površini, poželjno više od 50% svog bočnog lanca izloženog na površini, npr. u modelnoj strukturi samog hGH-a ili u složenoj modelnoj strukturi hGH-a na njegova dva molekula receptora. U poželjnoj realizaciji, pozicija u spirali ili petlji je ekvivalentna poziciji izvan mesta vezivanja receptora hGH-a. Površinski izloženi ostaci mogu se identifikovati računarskim hemijskim.algoritmima. Na primer, relativne površinske dostupnosti mogu se izračunati pomoću računarskog programa Quanta 2005 kompanije Accelrys Inc korišćenjem atomskih koordinata iz javno dostupnih struktura (PDB pristupni kodovi 1HGU i 1HWG struktura) i podrazumevanih postavki parametara. Opis osnovnog principa iza algoritma može se naći u B. Lee i F.M. Richards, "The Interpretation of Protein Structures: Estimation of Static Accessibility" J. Mol. Biol. 55, 379-400, (1971).
U daljoj realizaciji, ostatak koji vezuje albumin preko hidrofilnog spejsera je povezan sa GH koji ima dodatni disulfidni most.
U daljoj realizaciji, GH sadrži dodatne disulfidne veze između segmenta petlje i spiralnog segmenta ili unutar segmenta petlje ili između segmenata petlje ili između spiralnih segmenata.
U daljoj realizaciji, GH sadrži dodatnu disulfidnu vezu u kojoj je barem jedan cistein prisutan u segmentu petlje, poput ostataka amino-kiselina 128-154 (L3).
U daljoj realizaciji, GH sadrži dodatnu disulfidnu vezu pri čemu dodatna disulfidna veza povezuje segment petlje sa spiralnim segmentom.
U daljoj realizaciji, GH sadrži dodatnu disulfidnu vezu pri čemu dodatna disulfidna veza povezuje segment petlje sa spiralom B ili spiralom 2 (što odgovara AA 72-98).
U daljoj realizaciji, GH sadrži i dodatnu disulfidnu vezu koja povezuje spiralu 2 (što odgovara AA 72-98) sa petljom 3 (što odgovara AA 128-154).
U daljoj realizaciji, GH sadrži dodatnu disulfidnu vezu između jednog od parova amino-kiselina na pozicijama koje odgovaraju R16C/L117C, A17C/E174C, H21C/M170C, D26C/V102C, D26C/Y103C, N47C/T50C, Q49C/G161C, F54C/Y143C, F54C/S144C, F54C/F146C, S55C/Y143C, S57C/Y143C, I58C/Q141C, I58C/Y143C, I58C/S144C, P59C/Q137C, P61C/E66C, P61C/T67C, S71C/S132C, L73C/S132C, L73C/F139C, R77C/I138C, R77C/F139C, L81C/Q141C, L81C/Y143C, Q84C/Y143C, Q84C/ S144C, S85C/Y143C, S85C/S144C, P89C/F146C, F92C/F146C, F92C/T148C, R94C/D107C, V102C/A105C, L156C/F146C, L156C/T148C i/ili V185C/S188C u SEQ ID NO: 1.
U sledećoj realizaciji, dodatni disulfidni most GH-a je između barem jednog para amino-kiselina na pozicijama koje odgovaraju R16C/L117C, A17C/E174C, H18C/Y143C, H21C/M170C, N47C/T50C, Q49C/G161C, F54C/S144C, F54C/F146C, I58C/Q141C, I58C/S144C, P59C/Q137C, P61C/E66C, P61C/T67C, S71C/S132C, L73C/S132C, L73C/F139C, R77C/I138C, R77C/F139C, L81C/Q141C, L81C/Y143C, Q84C/Y143C, S85C/Y143C, P89C/F146C, F92C/F146C, F92C/T148C, R94C/D107C, V102C/A105C, L156C/F146C, L156C/T148C i/ili V185C/S188C u hGH (SEQ ID NO: 1).
U sledećoj realizaciji, dodatna disulfidna veza je između jednog od parova amino-kiselina na pozicijama koje odgovaraju A17C/E174C, H21C/M170C, D26C/V102C, D26C/Y103C, F54C/Y143C, F54C/S144C, F54C/F146C, S55C/Y143C, S57C/Y143C, I58C/Q141C, I58C/Y143C, I58C/S144C, P59C/Q137C, S71C/S132C, L81C/Y143C, Q84C/Y143C, S85C/Y143C, S85C/S144C, F92C/T148C i/ili R94C/D107C u SEQ ID NO: 1.
U sledećoj realizaciji, dodatna disulfidna veza je između jednog od parova amino-kiselina na pozicijama koje odgovaraju D26C/V102C, D26C/Y103C, S57C/Y143C, I58C/S144C, P59C/Q137C, S71C/S132C, Q84C/Y143C, S85C/Y143C, S85C/S144C, F92C/T148C i/ili R94C/D107C u SEQ ID NO: 1.
U sledećoj realizaciji, dodatna disulfidna veza je između jednog od parova amino-kiselina na pozicijama koje odgovaraju H21C/M170C, D26C/V102C, D26C/Y103C, F54C/Y143C, F54C/S144C, S55C/Y143C, S57C/Y143C, I58C/Q141C, I58C/Y143C, I58C/S144C, P59C/Q137C, S71C/S132C, L81C/Y143C, Q84C/Y143C, S85C/Y143C i/ili S85C/S144C u SEQ ID NO: 1.
U sledećoj realizaciji, dodatna disulfidna veza je između jednog od parova amino-kiselina na pozicijama koje odgovaraju S57C/Y143C, Q84C/Y143C, S85C/Y143C i/ili S85C/S144C u SEQ ID NO: 1. Obično je dodatni disulfidni most Q84C/Y143C.
U daljoj realizaciji, ostatak koji vezuje albumin preko hidrofilnog spejsera je povezan sa GH koji ima pojedinačnu Cys mutaciju i dodatni disulfidni most. Obično, ostatak koji vezuje albumin preko hidrofilnog spejsera vezan je na pojedinačnu Cys mutaciju. U posebnoj realizaciji, GH ima dodatni disulfidni most Q84C/Y143C i pojedinačnu Cys mutaciju L101C, gde je ostatak koji vezuje album vezan preko hidrofilnog spejsera.
U daljim realizacijama, GH ima dodatnu disulfidnu vezu i pojedinačnu Cys mutaciju izabranu iz bilo koje od: T3C, P5C, S7C, D11C, H18C, Q29C, E30C, E33C, A34C, Y35C, K38C, E39C, Y42C, S43C, D47C, P48C, S55C, S57C, P59C, S62, E65C, Q69C, E88C, Q91C, S95C, A98C, N99C, S100C, L101C, V102C, Y103C, D107C, S108C, D112C, Q122C, G126C, E129C, D130C, G131C, P133C, T135C, G136C, T142C, D147C, N149C, D154C, A155C, L156C, R178C, E186C, G187C i G190C, kao što je bilo koja od; T3C, P5C, S7C, D11C, H18C, Q29C, E30C, E33C, A34C, Y35C,E88C, Q91C, S95C, A98C, N99C, S100C, L101C, V102C, Y103C, D107C, S108C, D112C, Q122C i G126C of hGH (SEQ ID NO:1) ili odgovarajući ostaci u hGH varijanti.
U posebnoj realizaciji GH ima dodatnu disulfidnu vezu i jednu Cis mutaciju, a rečena pojedinačna Cis mutacija je uvedena u položaju ekvivalentnom roditeljskom GH koji je ekvivalentan položaju hGH (SEQ ID NO: 1) izabran iz grupe koja se sastoji od: T3, P5, S7, D11, H18, Q29, E30, E33, A34, Y35, K38, E39, Y42, S43, D47, P48, S55, S57, P59, S62, E65, Q69, E88, Q91, S95, A98, N99, S100, L101, V102, Y103, D107, S108, D112, Q122, G126, E129, D130, G131, P133, T135, G136, T142, D147, N149, D154, A155, L156, R178, E186, G187 i G190, poželjno grupa; T3, P5, S7, D11, H18, Q29, E30, E33, A34, Y35,E88, Q91, S95, A98, N99, S100, L101, V102, Y103, D107, S108, D112, Q122 i G126. GH konjugat dalje sadrži grupu koja vezuje albumin u bočnom lancu datog pojedinačnog cisteinskog ostatka.
U daljoj realizaciji, GH sadrži pojedinačnu cys mutaciju i dodatne disulfidne veze između segmenta petlje i spiralnog segmenta ili unutar segmenta petlje ili između segmenata petlje ili između spiralnih segmenata.
U daljoj realizaciji, GH sadrži pojedinačnu cys mutaciju i dodatnu disulfidnu vezu pri čemu je najmanje jedan cistein prisutan u segmentu petlje, kao što je ostatak amino-kiseline 128-154 (L3).
U daljoj realizaciji, GH sadrži pojedinačnu cys mutaciju i dodatnu disulfidnu vezu pri čemu je dodatna disulfidna veza koja povezuje segment petlje, poput ostataka amino-kiselina 128-154, sa spiralnim segmentom, kao što su spirala B ili spirala 2 (što odgovara AA 72-98).
U daljoj realizaciji, GH sadrži pojedinačnu cys mutaciju i dodatnu disulfidnu vezu koja povezuje spiralu 2 (što odgovara AA 72-98) sa petljom 3 (što odgovara AA 128-154).
U daljoj realizaciji, GH sadrži pojedinačnu cys mutaciju i dodatnu disulfidnu vezu između jednog od parova amino-kiselina na pozicijama koje odgovaraju R16C/L117C, A17C/E174C, H21C/M170C, D26C/V102C, D26C/Y103C, N47C/T50C, Q49C/G161C, F54C/Y143C, F54C/S144C, F54C/F146C, S55C/Y143C, S57C/Y143C, I58C/Q141C, I58C/Y143C, I58C/S144C, P59C/Q137C, P61C/E66C, P61C/T67C, S71C/S132C, L73C/S132C, L73C/F139C, R77C/I138C, R77C/F139C, L81C/Q141C, L81C/Y143C, Q84C/Y143C, Q84C/ S144C, S85C/Y143C, S85C/S144C, P89C/F146C, F92C/F146C, F92C/T148C, R94C/D107C, V102C/A105C, L156C/F146C, L156C/T148C i/ili V185C/S188C u SEQ ID NO: 1.
U sledećoj realizaciji, GH sadrži pojedinačnu cys mutaciju i dodatni disulfidni most između najmanje jednog para amino-kiselina na pozicijama koje odgovaraju R16C/L117C, A17C/E174C, H18C/Y143C, H21C/M170C, N47C/T50C, Q49C/G161C, F54C/S144C, F54C/F146C, I58C/Q141C, I58C/S144C, P59C/Q137C, P61C/E66C, P61C/T67C, S71C/S132C, L73C/S132C, L73C/F139C, R77C/I138C, R77C/F139C, L81C/Q141C, L81C/Y143C, Q84C/Y143C, S85C/Y143C, P89C/F146C, F92C/F146C, F92C/T148C, R94C/D107C, V102C/A105C, L156C/F146C, L156C/T148C i/ili V185C/S188C u hGH (SEQ ID NO: 1).
U sledećoj realizaciji, GH sadrži pojedinačnu cys mutaciju i dodatnu disulfidnu vezu između jednog od parova amino-kiselina na pozicijama koje odgovaraju A17C/E174C, H21C/M170C, D26C/V102C, D26C/Y103C, F54C/Y143C, F54C/S144C, F54C/F146C, S55C/Y143C, S57C/Y143C, I58C/Q141C, I58C/Y143C, I58C/S144C, P59C/Q137C, S71C/S132C, L81C/Y143C, Q84C/Y143C, S85C/Y143C, S85C/S144C, F92C/T148C i/ili R94C/D107C u SEQ ID NO: 1.
U sledećoj realizaciji, disulfidna veza je između jednog od parova amino-kiselina na pozicijama koje odgovaraju D26C/V102C, D26C/Y103C, S57C/Y143C, I58C/S144C, P59C/Q137C, S71C/S132C, Q84C/Y143C, S85C/Y143C, S85C/S144C, F92C/T148C i/ili R94C/D107C u SEQ ID NO: 1.
U sledećoj realizaciji, GH obuhvata pojedinačnu cys mutaciju i dodatnu disulfidnu vezu između jednog od parova amino-kiselina na pozicijama koje odgovaraju H21C/M170C, D26C/V102C, D26C/Y103C, F54C/Y143C, F54C/S144C, S55C/Y143C, S57C/Y143C, I58C/Q141C, I58C/Y143C, I58C/S144C, P59C/Q137C, S71C/S132C, L81C/Y143C, Q84C/Y143C, S85C/Y143C i/ili S85C/S144C u SEQ ID NO: 1.
U sledećoj realizaciji, GH obuhvata pojedinačnu cys mutaciju i dodatnu disulfidnu vezu između jednog od parova amino-kiselina na pozicijama koje odgovaraju S57C/Y143C, Q84C/Y143C, S85C/Y143C i/ili S85C/S144C u SEQ ID NO: 1.
Rastvorljivost hidrofilnog spejsera (B) može se opisati njegovom logP vrednošću. LogP, poznat i kao koeficijent razdvajanja, je logaritam odnosa odnosa koncentracije jedinjenja u dve faze smeše dva rastvarača koji se ne mešaju u ravnoteži. Obično je jedan od rastvarača voda dok je drugi izabran između oktan-l-ola, hloroforma, cikloheksana i propilen glikol dipelargonata (PGDP). LogP vrednosti izmerene u ovim različitim rastvaračima pokazuju razlike uglavnom zbog efekata vezivanja vodonika. Oktanol može donirati i prihvatati vodonične veze dok je cikloheksan inertan. Hloroform može donirati vodonične veze dok PGDP može da samo ih prihvati. LogP vrednosti mogu se meriti standardnim postupcima poznatim u stanju tehnike.
U jednoj realizaciji predmetnog pronalaska, hidrofilni spejser ima LogP ispod 0, kao što je ispod 0,5 bilo u oktan-l-olu, hloroformu, cikloheksanu i propilen glikol dipelargonatu (PGDP).
U sledećoj realizaciji, hidrofilni spejser ima logP ispod -1 bilo u oktan-l-olu, hloroformu, cikloheksanu i propilen glikol dipilargonatu (PGDP).
Alternativno, LogP vrednost može se izračunati kao mLogP i/ili cLogP za deo veziva albumina ili deo hidrofilnog spejsera korišćenjem objavljenih algoritama (T. Fujita; J. Iwasa and C. Hansch, J. Am. Chem. Soc.86, 5175-5180, (1964) "A New Substituent Constant, Pi, Derived from Partition Coefficients", C. A. Lipinski et al. Advanced Drug Delivery Reviews, 23, 3-25, (1997) "Experimental and Computational Approaches to Estimate Solubility and Permeability in Drug Discovery and Development Settings" and I. Moriguchi, S. Hirono, I. Nakagome, H. Hirano, Chem.
Pharm. Bull.42, 976-978, (1994) "Comparison of Reliability of logP Values for Drugs Calculated by Several Methods").
U jednoj realizaciji predmetnog pronalaska, hidrofilni spejser (B) ima mLogP <0.
U daljoj realizaciji, jedinjenje hormona rasta (GH) vezano je za jedan ostatak koji vezuje albumin preko hidrofilnog spejsera (B).
U daljoj realizaciji, jedinjenje hormona rasta (GH) vezano je za jedan ostatak koji vezuje albumin preko hidrofilnog spejsera (B), kuplovanog sa slobodnim cisteinom u jedinjenju hormona rasta (GH).
U drugoj realizaciji, jedinjenje hormona rasta (GH) je vezan za dva ostatka koji vezuju albumin preko jednog ili dva hidrofilna spejsera. Prema tome, u jednom primeru je jedan ostatak koji vezuje albumin vezan preko jednog hidrofilnog spejsera (B) sa pojedinačnom Cys mutacijom, a drugi ostatak koji se vezuje albumin je vezan preko jednog hidrofilnog spejsera (B') za glutamin na poziciji 40 ili poziciji141; ili alternativno, dva ostatka koji vezuju albumin su vezani preko jednog hidrofilnog spejsera (B) na pojedinačnu Cys mutaciju ili na glutamin na poziciji 40, poziciji 141 ili N-kraju. U još jednoj realizaciji, jedinjenje hormona rasta (GH) je vezano na tri ostatka koji vezuju albumin preko jednog ili više hidrofilnih spejsera.
U jednoj realizaciji, hidrofilni spejser sadrži najmanje jedan motiv OEG, radikal 8-amino-3,6-dioksoktanske kiseline, tj. -NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-C(O)-. U sledećoj posebnoj realizaciji, hidrofilni spejser sadrži najmanje dva OEG motiva. Orijentacija takvih OEG motiva je u jednoj realizaciji takva da je –C(O)- najbliže jedinjenju hormona rasta, ali ne povezuje jedinjenje hormona rasta i linker veziva albumina i -NH- je najbliže ostatku koji vezuje albumin. U dodatnim realizacijama, koje sadrže dva OEG motiva, dva motiva imaju identičnu orijentaciju ili različitu orijentaciju. U jednoj realizaciji, dva takva OEG motiva nalaze se jedan pored drugog, dok su u alternativnim realizacijama takvi OEG motivi su razdvojeni jednim ili više kovalentno vezanih atoma.
U jednoj realizaciji, hidrofilni spejser sadrži najmanje jedan ostatak glutaminske kiseline. Amino-kiselina glutaminske kiseline sadrži dve grupe karboksilne kiseline. Njena gama-karboksi grupa može se koristiti za formiranje amidne veze sa epsilon-amino grupom lizina, ili sa amino grupom OEG molekula, ako postoji, ili sa amino grupom drugog Glu ostatka, ako postoji. Alfa-karboksi grupa može alternativno da se koristi za formiranje slične amidne veze sa epsilon-amino grupom lizina, ili sa amino grupom OEG molekula, ako postoji, ili sa amino grupom drugog Glu ostatka, ako postoji. Amino grupa Glu s druge strane formira amidnu vezu sa karboksilnom grupom albuminski vezujućeg ostatka ili sa karboksilnom grupom molekula OEG, ako je prisutan, ili sa gama-karboksi grupom ili alfa karboski grupom drugog Glu, ako je prisutan. Povezanost amino grupe jednog Glu sa gama-karboksi grupom drugog Glu može se nazvati „gama-Glu“ motivom.
U jednom aspektu, hidrofilni spejser sadrži najmanje jedan kombinovani OEG-Glu motiv (-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-C(O)NH-CH(C(O)OH)-(CH2)2-C(O)-) ili najmanje jedan kombinovani Glu-OEG motiv (-NH-CH(C(O)OH)-(CH2)2-C(O)NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-C(O)-) ili ovakve kombinacije, gde se u takvim Glu-OEG i OEG-Glu motivima mogu odvojiti jednim ili više atoma kovalentno ili direktno vezanim jedni s drugima amidnom vezom Glu-a stvarajući gama-Glu.
U daljoj realizaciji, GH predstavlja jedinjenje hormona rasta koje sadrži sekvencu amino-kiseline koja ima najmanje 90% identičnosti sa sekvencom amino-kiseline humanog hormona rasta (hGH) (SEQ ID NO: 1). U daljim realizacijama, GH ima najmanje 80%, kao što je najmanje 85%, kao što je najmanje 95%, kao što je najmanje 96%, kao što je najmanje 97%, kao što je najmanje 98% ili kao što je najmanje 99% identičnosti sa hGH (SEQ ID NO: 1). U daljim realizacijama, date identičnosti sa hGH-a povezani su sa najmanje 10%, kao što je najmanje 20%, kao što je najmanje 40%, kao što je najmanje 60%, kao što je najmanje 80% aktivnosti hormona rasta hGH kako je utvrđeno testom I ovde opisanim. Bilo koja realizacija identičnosti sekvence može se kombinovati sa bilo kojom realizacijom aktivnosti, kao što je GH koji ima najmanje 80% identičnosti sa hGH i povezan je sa najmanje 60% aktivnosti hormona rasta hGH; GH koji ima najmanje 90% identičnosti sa hGH i povezan je sa najmanje 40% aktivnosti hormona rasta hGH; GH koji ima najmanje 95% identičnosti sa hGH i povezan je sa najmanje 80% aktivnosti hormona rasta hGH, i tako dalje.
U daljim realizacijama, GH konjugata ima pojedinačnu Cys mutaciju izabranu od bilo koje od pojedinačne Cys mutacije na N-kraju, H1, H2, L2 ili H3 oblastima GH. U daljim takvim realizacijama, pojedinačna Cys mutacija je smeštena na N-kraju, pri čemu je mutacija takva kao bilo koja od T3C, P5C, S7C ili na H1 (što odgovara AA 9-35), mutacija je takva kao bilo koja od D11C, H18C, Q29C, E30C, E33C, A34C, Y35C ili na L1 (što odgovara AA36-71), pri čemu je mutacija takva kao i bilo koja od K38C, E39C, Y42C, S43C, D47C, P48C, S55, S57C, P59C, S62C, E65C, Q69C ili poželjno kao bilo koja od Y42C, S55C, S57C, S62C, Q69C ili na H2, L2 ili H3 (što odgovara AA 72-98, AA 99-106 i AA 107-127), pri čemu je mutacija takva kao bilo koja od E88C, Q91C, S95C, A98C, N99C, S100C, L101C, V102C, Y103C, D107C, S108C, D112C, Q122C i G126C u hGH (SEQ ID NO: 1) ili na L3 ili H4 (što odgovara AA128-154 i AA155-184) Na L3 i H4 (128-154 i AA155-184) mutacija je takva kao bilo koja od E129C, D130C, G131C, P133C, T135C, G136C, T142C, D147C, N149C, D154C, A155C, L156C, R178C, V180C ili na C-kraju mutacija je takva kao bilo koja od E186C G187C G190.
Ako je pojedinačna Cys mutacija prisutna u hGH varijanti, mutacija se nalazi na odgovarajućim ostacima amino-kiselina.
Dalje realizacije uključuju GH konjugate gde je pojedinačna cys mutacija u GH izabrana iz bilo koje od: T3C, P5C, S7C, D11C, H18C, Q29C, E30C, E33C, A34C, Y35C, K38C, E39C, Y42C, S43C, D47C, P48C, S55C, S57C, P59C, S62, E65C, Q69C, E88C, Q91C, S95C, A98C, N99C, S100C, L101C, V102C, Y103C, D107C, S108C, D112C, Q122C, G126C, E129C, D130C, G131C, P133C, T135C, G136C, T142C, D147C, N149C, D154C, A155C, L156C, R178C, E186C, G187C i G190C, kao bilo koji od; T3C, P5C, S7C, D11C, H18C, Q29C, E30C, E33C, A34C, Y35C,E88C, Q91C, S95C, A98C, N99C, S100C, L101C, V102C, Y103C, D107C, S108C, D112C, Q122C i G126C od hGH (SEQ ID NO: 1).
U još daljim realizacijama, pojedinačna Cys mutacija je smeštena unutar AA 93-106 u hGH ili na odgovarajućim ostacima u hGH varijanti. U daljim posebnim realizacijama, pojedinačna Cys mutacija nalazi se unutar L2, kao što je unutar AA 99-106 ili AA 99-103 ili na odgovarajućim ostacima.
Ostatak koji veže albumin (A) je izabran iz
pri čemu * označava vezivanje na B preko W.
U daljoj realizaciji, W ima formulu
-W7-Y-,
pri čemu
Y je -(CH2)I7-C3-10-cikloalkil-W8- ili valentna veza, I7 je 0-6,
W7je izabrano iz -C(O)NH-, -NHC(O)-, -C(O)NHCH2-, -CH2NHC(O)-,
-C(O)NHS(O)2-, -S(O)2NHC(O)-, -OC(O)NH-, -NHC(O)O-,
-C(O)CH2-, -CH2C(O)-, -C(O)CH=CH-, -CH=CHC(O)-,
-(CH2)s3-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, ili je valentna veza; pri čemu s3 je 0 ili 1,
W8je izabrano iz -C(O)NH-, -NHC(O)-, -C(O)NHCH2-, -CH2NHC(O)-,
-C(O)NHS(O)2-, -S(O)2NHC(O)-, -OC(O)NH-, -NHC(O)O-,
-C(O)CH2-, -CH2C(O)-, -C(O)CH=CH-, -CH=CHC(O)-,
-(CH2)s4-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, ili je valentna veza; pri čemu s4 je 0 ili 1.
U daljim realizacijama, B sadrže ili se sastoje od jednog ili više OEG i/ili gama-Glu motiva kao što je gore opisano.
U daljoj realizaciji, B ima formulu
-X1-X2-X3-X4-pri čemu
X1je -W1-[(CHR<1>)I1-W2]m1-{[(CH2)n1E1]m2-[(CHR<2>)I2-W3]m3}n2-,
X2je -[(CHR<3>)I3-W4]m4-{[(CH2)n3E2]m5-[(CHR<4>)I4-W5]m6}n4-, X3je -[(CHR<5>)I5-W6]m7-,
X4je F-D1-(CH2)I6-D2-,
I1, I2, I3, I4, I5 i I6 su nezavisno izabrani iz 0-16,
m1, m3, m4, m6 i m7 su nezavisno izabrani iz 0-10, m2 i m5 su nezavisno izabrani 0-25,
n1, n2, n3 i n4 su nezavisno izabrani 0-16,
F je aril, hetaril, pirolidin-2,5-dion ili valentna veza, pri čemu aril i
hetarilne grupe su opciono supstituisane halogenom, -CN, -OH, -C (O) OH,
-C(O)NH2, -S(O)2OH ili C1-6-alkilom,
R<1>, R<2>, R<3>, R<4>i R<5>su nezavisno izabrani iz vodonika, -C(O)OH,
-C(O)NH2, -S(O)OH, -S(O)2OH, -NH-C(=NH)-NH2, C1-6-
alkil, aril ili hetaril; pri čemu su alkilne, arilne i hetarilne grupe opciono supstituisane halogenom, -C(O)OH, -C(O)NH2, -S(O)OH, -S(O)2OH, -CN ili -OH,
D1, D2, E1 i E2 su nezavisno izabrani iz -O-, -N(R<6>)-, -N(C(O)R<7>)- ili su valentna veza; pri čemu R<6>i R<7>nezavisno predstavljaju vodonik ili C1-6-alkil,
W1do W5su nezavisno izabrani iz -C(O)NH-, -NHC(O)-,
-C(O)NHCH2-, -CH2NHC(O)-, -C(O)NHS(O)2-, -
S(O)2NHC(O)-, -OC(O)NH-, -NHC(O)O-, -C(O)CH2-,
-CH2C(O)-, -C(O)CH=CH-, -CH=CHC(O)-, -(CH2)s2-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, ili su valentna veza; pri čemu s2 je 0 ili 1,
W6je izabran iz -C(O)NH-, -NHC(O)-, -C(O)NHCH2-, -CH2NHC(O)-,
-C(O)NHS(O)2-, -S(O)2NHC(O)-, -OC(O)NH-, -NHC(O)O-,
-C(O)CH2-, -CH2C(O)-, -C(O)CH=CH-, -CH=CHC(O)-,
-(CH2)s1-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -NHC(O)C1-6-alkil, -C(O)NHC1-6-alkil ili je valentna veza; pri čemu s1 je 0 ili 1 i C1-6-alkil grupa je opciono supstituisana sa okso, prolidin-2,5-dionom,
-NHC(O)CH*CH2COOH ili -NHC(O)CH2CH*COOH; pri čemu (*) označava tačku vezivanja atoma ugljenika CH za X4.
U daljoj realizaciji I1, I2, I3, I4, I5 i I6 su nezavisno 0-6.
U daljoj realizaciji m1, m3, m4, m6 i m7 su nezavisno 0-6.
U daljoj realizaciji m2 i m5 su nezavisno 0-10.
U daljoj realizaciji n1, n2, n3 i n4 su nezavisno 0-10.
U daljoj realizaciji D1 and D2 su nezavisno izabrani iz -O- ili -N(R<6>)- ili valentne veze.
U daljoj realizaciji E1 and E2 su nezavisno izabrani iz -O- ili -N(R<6>)- ili su valentne veze.
U daljoj realizaciji W1do W8su nezavisno izabrani iz grupe koja se sastoji od -C(O)NH-, -NHC(O)-, -CH2NHC(O)-, -C(O)NHS(O)2-, -S(O)2NHC(O)-,
-NHC(O)C1-6-alkil, -C(O)NHC1-6-alkil ili su valentne veze; pri čemu je alkil grupa opciono supstituisana sa okso, pirolidin-2,5-dionom, -NHC(O)CH*CH2COOH ili -NHC(O)CH2CH*COOH; pri čemu (*) označava tačku vezivanja atoma ugljenika CH za X4.
U daljoj realizaciji, R<1>, R<2>, R<3>, R<4>i R<5>su nezavisno izabrani iz vodonika, -C(O)OH, -C(O)NH2, -S(O)2OH ili C1-6-alkila; pri čemu je C1-6-alkil grupa opciono supstituisana sa -C(O)OH, -C(O)NH2ili -S(O)2OH.
U daljoj realizaciji, -{[(CH2)n1E1]m2-[(CHR<2>)I2-W3]m3}n2-i
-{[(CH2)n3E2]m5-[(CHR<4>)I4-W5]m6}n4-, pri čemu E1 i E2 su -O-, izabrani su iz
O
pri čemu * treba da označi tačku vezivanja, tj. otvorenu vezu.
U daljoj realizaciji, X4je valentna veza i W6je izabrano iz ili pirolidin-2,5-diona, -NHC(O)CH*CH2COOH ili -NHC(O)CH2CH*COOH pri čemu (*) označava tačku vezivanja od atoma ugljenika iz CH za GH.
U daljoj realizaciji, B je izabrano iz
U daljoj realizaciji, konjugat GH je izabran iz
,
O OH
.
U jednoj realizaciji, konjugat hormona rasta ima formulu (I):
A-W-B-GH (I)
pri čemu
GH predstavlja jedinjenje hormona rasta sa pojedinačnom Cys mutacijom i dodatnim disulfidnim mostom,
B predstavlja hidrofilni odstojnik
W je hemijska grupa koja vezuje A i B, i
A predstavlja ostatak koji vezuje albumin
pri čemu je ostatak koji vezuje albumin (A) preko hidrofilnog spejsera (B) vezan na GH preko sumpornog ostatka pojedinačne Cys mutacije ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili njegovih farmaceutski prihvatljivih soli.
U daljoj realizaciji, GH predstavlja jedinjenje hormona rasta koje sadrži sekvencu amino-kiseline koja ima najmanje 90% identičnosti sa sekvencom amino-kiseline humanog hormona rasta (hGH) (SEQ ID NO: 1). U daljim realizacijama, GH ima najmanje 80%, kao što je najmanje 85%, kao što je najmanje 95%, kao što je najmanje 96%, kao što je najmanje 97%, kao što je najmanje 98% ili kao što je najmanje 99% identičnosti sa hGH (SEQ ID NO: 1). U daljim realizacijama, date identičnosti sa hGH su povezane sa najmanje 10%, kao što je najmanje 20%, kao što je najmanje 40%, kao što je najmanje 60%, kao što je najmanje 80% aktivnosti hormona rasta hGH kako je utvrđeno testom I ovde opisanim. Bilo koja realizacija identičnosti sekvence može se kombinovati sa bilo kojom realizacijom aktivnosti, kao što je GH koji ima najmanje 80% identičnosti sa hGH i povezan je sa najmanje 60% aktivnosti hormona rasta hGH; GH koji ima najmanje 90% identičnosti sa hGH i povezan je sa najmanje 40% aktivnosti hormona rasta hGH; GH koji ima najmanje 95% identičnosti sa hGH i povezan je sa najmanje 80% aktivnosti hormona rasta hGH, i tako dalje.
U daljim realizacijama, GH konjugata ima dodatnu disulfidnu vezu i pojedinačnu Cys mutaciju izabranu iz bilo koje od pojedinačnnih Cys mutacija na N-kraju, H1, H2, L2 ili H3 oblastima GH. U daljim takvim realizacijma, pojedinačna Cys mutacija je smeštena na N-kraju, a mutacija je takva kao što je bilo koja od T3C, P5C, S7C ili u H1 (što odgovara AA 9-35), mutacija je takva kao što je bilo koja od D11C, H18C, Q29C, E30C, E33C, A34C, Y35C ili u L1 (što odgovara AA36-71), pri čemu je mutacija takva kao što je i bilo koja od K38C, E39C, Y42C, S43C, D47C, P48C, S55, S57C, P59C, S62C, E65C, Q69C ili poželjno bilo koja od Y42C, S55C, S57C, S62C, Q69C ili u H2, L2 ili H3 (što odgovara AA 72-98, AA 99-106 i AA 107-127), pri čemu je mutacija takva kao što je bilo koja od E88C, Q91C, S95C, A98C, N99C, S100C, L101C, V102C, Y103C, D107C, S108C, D112C, Q122C i G126C od hGH (SEQ ID NO: 1), ili u L3 ili H4 (što odgovara AA128-154 i AA155-184) U L3 i H4 (128-154 i AA155-184) mutacija je takva kao što je bilo koja od E129C, D130C, G131C, P133C, T135C, G136C, T142C, D147C, N149C, D154C, A155C, L156C, R178C, V180C ili na C-kraju mutacija je takva kao što je bilo koja od E186C G187C G190C.
Ako je pojedinačna Cys mutacija prisutna u hGH varijanti, mutacija se nalazi u odgovarajućim ostacima amino-kiselina.
Sledeće realizacije uključuju konjugate GH koji imaju dodatnu disulfidnu vezu a pojedinačna cys mutacija u GH je izabrana iz bilo kojeg od: T3C, P5C, S7C, D11C, H18C, Q29C, E30C, E33C, A34C, Y35C, K38C, E39C, Y42C, S43C, D47C, P48C, S55C, S57C, P59C, S62, E65C, Q69C, E88C, Q91C, S95C, A98C, N99C, S100C, L101C, V102C, Y103C, D107C, S108C, D112C, Q122C, G126C, E129C, D130C, G131C, P133C, T135C, G136C, T142C, D147C, N149C, D154C, A155C, L156C, R178C, E186C, G187C i G190C, kao što je bilo koji od; T3C, P5C, S7C, D11C, H18C, Q29C, E30C, E33C, A34C, Y35C,E88C, Q91C, S95C, A98C, N99C, S100C, L101C, V102C, Y103C, D107C, S108C, D112C, Q122C i G126C od hGH (SEQ ID NO: 1).
U još daljim realizacijama, pojedinačna Cys mutacija je smeštena unutar AA 93-106 na hGH ili odgovarajućim ostacima kod hGH varijanti. U daljim posebnim realizacijama, pojedinačna Cys mutacija nalazi se unutar L2, kao što je unutar AA 99-106 ili AA 99-103 ili na odgovarajućim ostacima.
U sledećoj realizaciji, dodatna disulfidna veza može biti dodatna disulfidna veza između segmenta petlje i spiralnog segmenta ili unutar segmenta petlje ili između segmenata petlje ili između spiralnih segmenata.
U sledećoj realizaciji, GH sadrži pojedinačnu cys mutaciju i dodatnu disulfidnu vezu pri čemu je najmanje jedan cistein prisutan u segmentu petlje, kao iz ostataka amino-kiselina 128-154 (L3).
U sledećoj realizaciji, GH sadrži sadrži pojedinačnu cys mutaciju i dodatnu disulfidnu vezu pri čemu dodatna disulfidna veza koja povezuje segment petlje, kao iz ostataka amino-kiselina 128-154, sa spiralnim segmentom, kao što su spirala B ili spirala 2 (što odgovara AA 72-98).
U daljoj realizaciji, GH konjugata sadrži pojedinačnu cys mutaciju i dodatnu disulfidnu vezu koja povezuje spiralu 2 (koja odgovara AA 72-98) sa petljom 3 (što odgovara AA 128-154).
U daljoj realizaciji, GH konjugata sadrži pojedinačnu cys mutaciju i dodatnu disulfidnu vezu između jednog od parova amino-kiselina na pozicijama koje odgovaraju R16C/L117C, A17C/E174C, H21C/M170C, D26C/V102C, D26C/Y103C, N47C/T50C, Q49C/G161C, F54C/Y143C, F54C/S144C, F54C/F146C, S55C/Y143C, S57C/Y143C, I58C/Q141C, I58C/Y143C, I58C/S144C, P59C/Q137C, P61C/E66C, P61C/T67C, S71C/S132C, L73C/S132C, L73C/F139C, R77C/I138C, R77C/F139C, L81C/Q141C, L81C/Y143C, Q84C/Y143C, Q84C/ S144C, S85C/Y143C, S85C/S144C, P89C/F146C, F92C/F146C, F92C/T148C, R94C/D107C, V102C/A105C, L156C/F146C, L156C/T148C i/ili V185C/S188C u SEQ ID NO: 1.
U daljoj realizaciji, dodatni disulfidni most je između najmanje jednog od parova amino-kiselina na pozicijama koje odgovaraju R16C/L117C, A17C/E174C, H18C/Y143C, H21C/M170C, N47C/T50C, Q49C/G161C, F54C/S144C, F54C/F146C, I58C/Q141C, I58C/S144C, P59C/Q137C, P61C/E66C, P61C/T67C, S71C/S132C, L73C/S132C, L73C/F139C, R77C/I138C, R77C/F139C, L81C/Q141C, L81C/Y143C, Q84C/Y143C, S85C/Y143C, P89C/F146C, F92C/F146C, F92C/T148C, R94C/D107C, V102C/A105C, L156C/F146C, L156C/T148C i/ili V185C/S188C u hGH (SEQ ID NO: 1).
U daljoj realizaciji, GH konjugata sadrži pojedinačnu cys mutaciju i dodatnu disulfidnu vezu između jednog para amino-kiselina na pozicijama koje odgovaraju A17C/E174C, H21C/M170C, D26C/V102C, D26C/Y103C, F54C/Y143C, F54C/S144C, F54C/F146C, S55C/Y143C, S57C/Y143C, I58C/Q141C, I58C/Y143C, I58C/S144C, P59C/Q137C, S71C/S132C, L81C/Y143C, Q84C/Y143C, S85C/Y143C, S85C/S144C, F92C/T148C i/ili R94C/D107C u SEQ ID NO: 1.
U daljoj realizaciji, dodatna disulfidna veza je između jednog od parova amino-kiselina na pozicijama koje odgovaraju D26C/V102C, D26C/Y103C, S57C/Y143C, I58C/S144C, P59C/Q137C, S71C/S132C, Q84C/Y143C, S85C/Y143C, S85C/S144C, F92C/T148C i/ili R94C/D107C u SEQ ID NO: 1.
U daljoj realizaciji, dodatna disulfidna veza je između jednog od parova amino-kiselina na pozicijama koje odgovaraju H21C/M170C, D26C/V102C, D26C/Y103C, F54C/Y143C, F54C/S144C, S55C/Y143C, S57C/Y143C, I58C/Q141C, I58C/Y143C, I58C/S144C, P59C/Q137C, S71C/S132C, L81C/Y143C, Q84C/Y143C, S85C/Y143C i/ili S85C/S144C u SEQ ID NO: 1.
U daljoj realizaciji, dodatna disulfidna veza je između jednog od parova amino-kiselina na pozicijama koje odgovaraju S57C/Y143C, Q84C/Y143C, S85C/Y143C i/ili S85C/S144C u SEQ ID NO: 1.
U daljoj realizaciji, GH sadrži jednu mutaciju cisteina na L2 i dodatnu disulfidnu vezu koja povezuje segment petlje, kao što je amino-kiselinski ostatak 128-154 (H3), sa spiralnim segmentom, kao što su spirala B ili spirala 2 (što odgovara AA 72-98).
U jednoj realizaciji, GH sadrži kombinaciju mutacija izabranih iz sledeće grupe: A98C/Q84C/Y143C, A98C/S85C/Y143C, A98C/S85C/S144C, N99C/Q84C/Y143C, N99C/S85C/Y143C, N99C/S85C/S144C, S101C/Q84C/Y143C, S101C/S85C/Y143C, S101C/S85C/S144C, L101C/Q84C/Y143C, L101C/S85C/Y143C, L101C/S85C/S144C, C102C/Q84C/Y143C, C102C/S85C/Y143C i C102C/S85C/S144C.
Ostatak koji vezuje albumin (A) je izabran iz
pri čemu * označava vezivanje za B preko W.
U daljoj realizaciji, W ima formulu
-W7-Y-,
pri čemu
Y je (CH2)I7-C3-10-cikloalkil-W8- ili je valentna veza, I7 je 0-6,
W7je izabrano iz -C(O)NH-, -NHC(O)-, -C(O)NHCH2-, -CH2NHC(O)-,
-C(O)NHS(O)2-, -S(O)2NHC(O)-, -OC(O)NH-, -NHC(O)O-,
-C(O)CH2-, -CH2C(O)-, -C(O)CH=CH-, -CH=CHC(O)-,
-(CH2)s3-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, ili je valentna veza; pri čemu s3 je 0 ili 1,
W8je izabrano iz -C(O)NH-, -NHC(O)-, -C(O)NHCH2-, -CH2NHC(O)-,
-C(O)NHS(O)2-, -S(O)2NHC(O)-, -OC(O)NH-, -NHC(O)O-,
-C(O)CH2-, -CH2C(O)-, -C(O)CH=CH-, -CH=CHC(O)-, -(CH2)s4-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, ili je valentna veza; pri čemu s4 je 0 ili 1.
U daljim realizacijama, B sadrže ili se sastoje od jednog ili više OEG i/ili gama-Glu motiva, kao što je gore opisano.
U daljoj realizaciji, B ima formulu
-X1-X2-X3-X4-pri čemu
X1je -W1-[(CHR<1>)I1-W2]m1-{[(CH2)n1E1]m2-[(CHR<2>)I2-W3]m3}n2-,
X2je -[(CHR<3>)I3-W4]m4-{[(CH2)n3E2]m5-[(CHR<4>)I4-W5]m6}n4-, X3je -[(CHR<5>)I5-W6]m7-,
X4je F-D1-(CH2)I6-D2-,
I1, I2, I3, I4, I5 i I6 su nezavisno izabrani iz 0-16,
m1, m3, m4, m6 i m7 su nezavisno izabrani iz 0-10, m2 i m5 su nezavisno izabrani iz 0-25,
n1, n2, n3 i n4 su nezavisno izabrani iz 0-16,
F je aril, hetaril, pirolidin-2,5-dion ili valentna veza, pri čemu arilne i
hetarilne grupe su opciono supstituisane halogenom, -CN, -OH, -C (O) OH,
-C(O)NH2, -S(O)2OH ili C1-6-alkilom,
R<1>, R<2>, R<3>, R<4>i R<5>su nezavisno izabrani iz vodonika, -C(O)OH,
-C(O)NH2, -S(O)OH, -S(O)2OH, -NH-C(=NH)-NH2, C1-6-
alkil, aril ili hetaril; pri čemu alkil, aril i hetaril grupe su opciono supstituisane halogenom, -C(O)OH, -C(O)NH2, -S(O)OH, -S(O)2OH, -CN ili -OH,
D1, D2, E1 i E2 su nezavisno izabrani iz -O-, -N(R<6>)-, -N(C(O)R<7>)- ili
valentna veza; pri čemu R<6>i R<7>nezavisno predstavljaju vodonik ili C1-6-alkil,
W1do W5su nezavisno izabrani iz -C(O)NH-, -NHC(O)-,
-C(O)NHCH2-, -CH2NHC(O)-, -C(O)NHS(O)2-, -
S(O)2NHC(O)-, -OC(O)NH-, -NHC(O)O-, -C(O)CH2-,
-CH2C(O)-, -C(O)CH=CH-, -CH=CHC(O)-, -(CH2)s2-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, ili su valentne veze; pri čemu s2 je 0 ili 1,
W6je izabrano iz -C(O)NH-, -NHC(O)-, -C(O)NHCH2-, -CH2NHC(O)-,
-C(O)NHS(O)2-, -S(O)2NHC(O)-, -OC(O)NH-, -NHC(O)O-,
-C(O)CH2-, -CH2C(O)-, -C(O)CH=CH-, -CH=CHC(O)-,
-(CH2)s1-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -NHC(O)C1-6-alkila, -C(O)NHC1-6-alkila ili je valentna veza; pri čemu s1 je 0 ili 1 i C1-6-alkil grupa je opciono supstituisana sa okso, pirolidin-2,5-dionom,
-NHC(O)CH*CH2COOH ili -NHC(O)CH2CH*COOH; pri čemu ( * ) označava tačku vezivanja od atoma ugljenika iz CH za X4.
U daljoj realizaciji, I1, I2, I3, I4, I5 i I6 su nezavisno 0-6.
U daljoj realizaciji, m1, m3, m4, m6 i m7 su nezavisno 0-6.
U daljoj realizaciji, m2 i m5 su nezavisno 0-10.
U daljoj realizaciji, n1, n2, n3 i n4 su nezavisno 0-10.
U daljoj realizaciji, D1 i D2 su nezavisno izabrani iz -O- ili -N(R<6>)- ili su valentne veze.
U daljoj realizaciji, E1 i E2 su nezavisno izabrani iz -O- ili -N(R<6>)- ili su valentne veze.
U daljoj realizaciji, W1do W8su nezavisno izabrani iz grupe koja se sastoji od -C(O)NH-, -NHC(O)-, -CH2NHC(O)-, -C(O)NHS(O)2-, -S(O)2NHC(O)-,
-NHC(O)C1-6-alkila, -C(O)NHC1-6-alkila ili su valentna veza; pri čemu je alkil grupa opciono supstituisana sa okso, pirolidin-2,5-dionom, -NHC(O)CH*CH2COOH ili -NHC(O)CH2CH*COOH; pri čemu ( * ) označava tačku vezivanja od atoma ugljenika iz CH za X4.
U daljoj realizaciji, R<1>, R<2>, R<3>, R<4>i R<5>su nezavisno izabrani iz vodonika, -C(O)OH, -C(O)NH2, -S(O)2OH ili C1-6alkila; pri čemu C1-6-alkil grupa je opciono supstituisana sa -C(O)OH, -C(O)NH2ili -S(O)2OH.
U daljoj realizaciji, -{[(CH2)n1E1]m2-[(CHR<2>)I2-W3]m3}n2-i
-{[(CH2)n3E2]m5-[(CHR<4>)I4-W5]m6}n4-, pri čemu E1 i E2 su -O-, su iza
,
pri čemu je * namenjena da označi tačku vezivanja, tj. otvorenu vezu.
U sledećoj realizaciji, X4je valentna veza i W6je izabran između pirolidin-2,5-diona, -NHC(O)CH*CH2COOH ili -NHC(O)CH2CH*COOH pri čemu (*) označava tačku vezivanja iz atoma ugljenika CH na GH.
U sledećoj realizaciji B je izabran iz
U sledećoj realizaciji GH konjugat je izabran iz Ċ
Obično, konjugat predmetnog pronalaska ima jedan ostatak koji vezuje albumin (A) povezan preko hidrofilnog spejsera (B), kao što je jedan hidrofilni spejsera (B), za jedinjenje hormona rasta (GH).
Međutim, jedinjenje hormona rasta (GH) može biti vezano za dva ostatka koji vezuju albumin preko hidrofilnog spejsera.
Otkriveno je da konjugat hormona rasta može imati formulu (II):
A-W-B-GH-B’-W’-A’ (II)
pri čemu
GH predstavlja jedinjenje hormona rasta sa pojedinačnom Cys mutacijom,
B i B' su nezavisno hidrofilni spejseri povezani sa sumpornim ostatkom Cys mutacije,
W je hemijska grupa koja vezuje A i B,
W' je hemijska grupa koja vezuje A’ i B',
A i A’ nezavisno predstavljaju ostatak koji vezuje albumin i
njegove farmaceutski prihvatljive soli.
Dalje, otkriveno je da konjugat hormona rasta može imati formulu (II):
A-W-B-GH-B’-W’-A’ (II)
pri čemu
GH predstavlja jedinjenje hormona rasta sa dodatnim disulfidnim mostom,
B i B' su nezavisno hidrofilni spejseri,
W je hemijska grupa koja vezuje A i B,
W' je hemijska grupa koja vezuje A’ i B',
A i A’ nezavisno predstavljaju ostatak koji vezuje albumin i
njegove farmaceutski prihvatljive soli.
Otkriveno je da konjugat hormona rasta može imati formulu (II):
A-W-B-GH-B’-W’-A’ (II)
pri čemu
GH predstavlja jedinjenje hormona rasta sa jednom Cys mutacijom i dodatnim disulfidnim mostom,
B i B' su nezavisno hidrofilni spejseri povezani sa sumpornim ostatkom Cys mutacije,
W je hemijska grupa koja vezuje A i B,
W' je hemijska grupa koja vezuje A’ i B',
A i A’ nezavisno predstavljaju ostatak koji vezuje albumin i
njegove farmaceutski prihvatljive soli.
U konjugatu formule (II), kao što je opisano gore, W' je izabran iz istih grupa kao W, A' je izabran iz istih grupa kao A i B' je izabran iz istih grupa kao B, i podrazumeva se da W i W', A i A', i B i B' su nezavisno izabrani iz bilo koje od dotičnih grupa kako je ovde definisano. Prema tome, bilo koja realizacija W, A i B ovde je takođe realizacija W', A' i B '. Dalje, bilo koja od ovde opisanih realizacija odnosi se nezavisno i na konjugate formule (I) i (II), kao i na njihov široki aspekt i realizacije kada je to pogodno.
Gornja ostvarenja kao i realizacije koje će biti opisane u daljem tekstu treba posmatrati kao upućivanje na bilo koji od ovde opisanih aspekata, kao i na bilo koju od ovde opisanih realizacija, osim ako nije specificirano da se jedna realizacija odnosi na određeni aspekt ili aspekte ovaj pronalazak.
U jednoj realizaciji, GH je varijanta hGH, pri čemu se podrazumeva da je varijanta jedinjenje dobijeno supstitucijom jednog ili više ostataka amino-kiseline u hGH sekvenci drugom prirodnom ili neprirodnom amino-kiselinom; i/ili dodavanjem jedne ili više prirodnih ili neprirodnih amino-kiselina u hGH sekvencu; i/ili brisanjem jednog ili više ostataka amino-kiseline iz hGH sekvence, pri čemu bilo koji od ovih koraka opciono može biti praćen daljom derivatizacijom jednog ili više ostataka amino-kiselina.
U daljoj realizaciji, GH predstavlja jedinjenje hormona rasta koje sadrži sekvencu amino-kiselina koja ima najmanje 90% identičnosti sa sekvencom amino-kiseline humanog hormona rasta (hGH) (SEQ ID NO: 1). U daljim realizacijama, GH ima najmanje 80%, kao što je najmanje 85%, kao što je najmanje 95%, kao što je najmanje 96%, kao što je najmanje 97%, kao što je najmanje 98% ili kao što je najmanje 99% identičnosti sa hGH (SEQ ID NO: 1). U daljim realizacijama, date identičnosti hGH-a povezane su sa najmanje 10%, kao što je najmanje 20%, kao što je najmanje 40%, kao što je najmanje 60%, kao što je najmanje 80% aktivnosti hormona rasta hGH kako je utvrđeno testom I ovde opisanim. Bilo koja realizacija identičnosti sekvence može se kombinovati sa bilo kojom realizacijom aktivnosti, kao što je GH koji ima najmanje 80% identičnosti sa hGH i povezan je sa najmanje 60% aktivnosti hormona rasta hGH; GH koji ima najmanje 90% identičnosti sa hGH i povezan je sa najmanje 40% aktivnosti hormona rasta hGH; GH koji ima najmanje 95% identičnosti sa hGH i povezan je sa najmanje 80% aktivnosti hormona rasta hGH, i tako dalje.
U daljim realizacijama, B sadrže ili se sastoje od jednog ili više OEG i/ili gama-Glu motiva, kao što je gore opisano.
U daljoj realizaciji konjugata formule (I) ili (II), hidrofilni spejser B ima formulu
-X1-X2-X3-X4-pri čemu
X1je -W1-[(CHR<1>)I1-W2]m1-{[(CH2)n1E1]m2-[(CHR<2>)I2-W3]m3}n2-,
X2je -[(CHR<3>)I3-W4]m4-{[(CH2)n3E2]m5-[(CHR<4>)I4-W5]m6}n4-, X3je -[(CHR<5>)I5-W6]m7-,
X4je F-D1-(CH2)I6-D2-,
I1, I2, I3, I4, I5 i I6 su nezavisno izabrani iz 0-16,
m1, m3, m4, m6 i m7 su nezavisno izabrani iz 0-10, m2 i m5 su nezavisno izabrani iz 0-25,
n1, n2, n3 i n4 su nezavisno izabrani iz 0-16,
F je aril, hetaril, pirolidin-2,5-dion ili valentna veza, pri čemu arilne i
hetarilne grupe su opciono supstituisane halogenom, -CN, -OH, -C(O)OH,
-C(O)NH2, -S(O)2OH ili C1-6-alkilom,
R<1>, R<2>, R<3>, R<4>i R<5>su nezavisno izabrani iz vodonika, -C(O)OH,
-C(O)NH2, -S(O)OH, -S(O)2OH, -NH-C(=NH)-NH2, C1-6-
alkila, arila ili hetarila; pri čemu alkilne, arilne i hetarilne grupe opciono su supstituisane halogenom, -C(O)OH,
-C(O)NH2, -S(O)OH, -S(O)2OH, -CN ili -OH,
D1, D2, E1 i E2 su nezavisno izabrani iz -O-, -N(R<6>)-, -N(C(O)R<7>)- ili su valentna veza; pri čemu R<6>i R<7>nezavisno predstavljaju vodonik ili C1-6-alkil,
W1do W5su nezavisno izabrani iz -C(O)NH-, -NHC(O)-,
-C(O)NHCH2-, -CH2NHC(O)-, -C(O)NHS(O)2-, -
S(O)2NHC(O)-, -OC(O)NH-, -NHC(O)O-, -C(O)CH2-,
-CH2C(O)-, -C(O)CH=CH-, -CH=CHC(O)-, -(CH2)s2-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, ili su valentna veza; pri čemu s2 je 0 ili 1,
W6je izabrano iz -C(O)NH-, -NHC(O)-, -C(O)NHCH2-, -CH2NHC(O)-,
-C(O)NHS(O)2-, -S(O)2NHC(O)-, -OC(O)NH-, -NHC(O)O-,
-C(O)CH2-, -CH2C(O)-, -C(O)CH=CH-, -CH=CHC(O)-,
-(CH2)s1-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -NHC(O)C1-6-alkila, -C(O)NHC1-6-alkila ili je valentna veza; pri čemu s1 je 0 ili 1 i alkilna grupa je opciono supstituisana sa okso, pirolidin-2,5-dionom, -NHC(O)CH*CH2COOH ili
-NHC(O)CH2CH*COOH; pri čemu ( * ) označava tačku vezivanja od atoma ugljenika iz CH za X4.
U daljoj realizaciji, W1je izabrano iz -C(O)NH-, -NHC(O)-, -C(O)NHCH2-, -CH2NHC(O)-, -C(O)NHS(O)2-, -S(O)2NHC(O)- ili je valentna veza. Obično, W1je izabrano iz -C(O)NH-, -NHC(O)- ili -C(O)NHS(O)2-.
U daljoj realizaciji, W2je izabrano iz -C(O)NH-, -NHC(O)-, -C(O)NHCH2-, -CH2NHC(O)-, -C(O)NHS(O)2-, -S(O)2NHC(O)- ili je valentna veza. Obično, W2je izabrano iz -C(O)NH-, -NHC(O)- ili -C(O)NHS(O)2-.
U daljoj realizaciji, W3je izabrano iz -C(O)NH-, -NHC(O)-, -C(O)NHCH2-, -CH2NHC(O)-, -C(O)NHS(O)2-, -S(O)2NHC(O)- ili je valentna veza. Obično, W3je izabrano iz -C(O)NH-, -NHC(O)- ili -C(O)NHS(O)2-.
U daljoj realizaciji, W4je izabrano iz -C(O)NH-, -NHC(O)-, -C(O)NHCH2-, -CH2NHC(O)-, -C(O)NHS(O)2-, -S(O)2NHC(O)- ili je valentna veza. Obično, W4je izabrano iz -C(O)NH-, -NHC(O)- ili -C(O)NHS(O)2-.
U daljoj realizaciji, W5je izabrano iz -C(O)NH-, -NHC(O)-, -C(O)NHCH2-, -CH2NHC(O)-, -C(O)NHS(O)2-, -S(O)2NHC(O)- ili je valentna veza. Obično, W5je izabrano iz -C(O)NH-, -NHC(O)- ili -C(O)NHS(O)2-.
U daljoj realizaciji, W6je izabrano iz -C(O)NH-, -NHC(O)-, -CH2NHC(O)-,
-C(O)NHS(O)2-, -S(O)2NHC(O)-, -NHC(O)C1-6-alkila, -C(O)NHC1-
6-alkila ili je valentna veza; pri čemu alkilna grupa opciono je supstituisana sa pirolidin-2,5-dionom, -NHC(O)CH*CH2COOH ili -NHC(O)CH2CH*COOH; pri čemu ( * ) označava tačku vezivanja atoma ugljenika CH za X4. Obično, W6je izabran iz -C(O)NH-, -NHC(O)-,
-C(O)NHS(O)2- ili -NHC(O)C1-6-alkila.
U daljoj realizaciji, D1, D2, F su sve valentne veze, l6 je 0, a W6 je izabran iz ili pirolidin-2,5-diona, -NHC(O)CH*CH2COOH ili -NHC(O)CH2CH*COOH pri čemu ( * ) označava tačku vezivanja atoma CH za GH.
U daljoj realizaciji R<1>je izabran iz vodonika, -C(O)OH, -C(O)NH2, -S(O)2OH ili C1-6-alkila; pri čemu alkilna grupa opciono je supstituisana sa -C(O)OH, -C(O)NH2, -S(O)2OH. Obično, R<1>je izabran iz -C(O)OH, -C(O)NH2, ili C1-6-alkyla; pri čemu alkilna grupa opciono je supstituisana sa -C(O)OH, -C(O)NH2, ili -S(O)2OH.
U daljoj realizaciji R<2>je izabran iz vodonika, -C(O)OH, -C(O)NH2, -S(O)2OH ili C1-6-alkila; pri čemu alkilna grupa opciono je supstituisana sa -C(O)OH, -C(O)NH2, -S(O)2OH. Obično, R<2>je izabran iz -C(O)OH, -C(O)NH2, ili C1-6-alkila; pri čemu alkilna grupa opciono je supstituisana sa -C(O)OH, -C(O)NH2, ili -S(O)2OH.
U daljoj realizaciji R<3>je izabran iz vodonika, -C(O)OH, -C(O)NH2, -S(O)2OH ili C1-6-alkila; pri čemu alkilna grupa opciono je supstituisana sa -C(O)OH, -C(O)NH2, -S(O)2OH. Obično, R<3>je izabran iz -C(O)OH, -C(O)NH2, ili C1-6-alkila; pri čemu alkilna grupa opciono je supstituisana sa -C(O)OH, -C(O)NH2, ili -S(O)2OH.
U daljoj realizaciji R<4>je izabran iz vodonika, -C(O)OH, -C(O)NH2, -S(O)2OH ili C1-6-alkila; pri čemu alkilna grupa opciono je supstituisana sa -C(O)OH, -C(O)NH2, -S(O)2OH. Obično, R<4>je izabran iz -C(O)OH, -C(O)NH2, ili C1-6-alkila; pri čemu alkilna grupa opciono je supstituisana sa -C(O)OH, -C(O)NH2, ili -S(O)2OH.
U daljoj realizaciji R<5>je izabran iz vodonika, -C(O)OH, -C(O)NH2, -S(O)2OH ili C1-6-alkila; pri čemu alkilna grupa opciono je supstituisana sa -C(O)OH, -C(O)NH2, -S(O)2OH. Obično, R<5>je izabran iz -C(O)OH, -C(O)NH2, ili C1-6-alkila; pri čemu alkilna grupa opciono je supstituisana sa -C(O)OH, -C(O)NH2, ili -S(O)2OH.
U daljoj realizaciji E1 je izabran iz -O- or -N(R<6>)-ili je valentna veza. Obično, E1 je izabran iz -O-.
U daljoj realizaciji E2 je izabran iz -O- ili -N(R<6>)-, ili je valentna veza. Obično, E2 je izabran iz -O-.
U daljoj realizaciji, E1 i E2 su oba -O-.
U daljoj realizaciji, E1 i E2 su oba -N(R<6>)-.
U daljoj realizaciji, F je fenil, pirolidin-2,5-dion ili valentna veza.
U daljoj realizaciji, D1 je izabran iz -O- ili -N(R<6>)- ili je valentna veza. Obično, D1 je izabran iz -N(R<6>)-.
U daljoj realizaciji D2 je izabran iz -O- ili -N(R<6>)-ili je valentna veza. Obično, D1 je izabran iz –N(R<6>)-.
U daljoj realizaciji, I1 je 0-6, kao što je 0, 1, 2, 3, 4, 5 ili 6.
U daljoj realizaciji, I2 je 0-6, kao što je 0, 1, 2, 3, 4, 5 ili 6.
U daljoj realizaciji, I3 je 0-6, kao što je 0, 1, 2, 3, 4, 5 ili 6.
U daljoj realizaciji, I4 je 0-6, kao što je 0, 1, 2, , 4, 5 ili 6. U daljoj realizaciji, I5 je 0-6, kao što je , 1, 2, 3, 4, 5 or 6.
U daljoj realizaciji, I6 je 0-6, kao što je 0, 1, 2, , 4, 5 ili 6.
U daljoj realizaciji m1 je 0-6, kao što je 0, 1, 2, , 4, 5 ili 6.
U daljoj realizaciji, m2 je 0-10, kao što je 0, 1, 2, , 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili10.
U daljoj realizaciji, m3 je 0-5, kao što je 0, 1, 2, , 4, 5 ili 6.
U daljoj realizaciji, m4 je 0-5, kao što je 0, 1, 2, , 4, 5 ili 6.
U daljoj realizaciji, m5 je 0-10, kao što je 0, 1, 2, , 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10.
U daljoj realizaciji, m6 je 0-5, kao što je 0, 1, 2, , 4, 5 ili 6.
U daljoj realizaciji, m7 je 0-5, kao što je 0, 1, 2, , 4, 5 ili 6.
U daljoj realizaciji, n1 je 0-10, kao što je 0, 1, 2, , 4, 5 ili 6.
U daljoj realizaciji, n2 je 0-10, kao što je 0, 1, 2, , 4, 5 ili 6.
U daljoj realizaciji, n3 je 0-10, kao što je 0, 1, 2, , 4, 5 ili 6.
U daljoj realizaciji, n4 je 0-10, kao što je 0, 1, 2, 3, 4, 5 ili 6.
U daljoj realizaciji, X1je –W1-[(CHR<1>)I1-W2]m1-{[(CH2)n1O]m2-[(CHR<2>)I2-W3]m3}n2- i X2je -[(CHR<3>)I3-W4]m4-{[(CH2)n3O]m5-[(CHR<4>)I4-W5]m6}n4-, pri čemu -{[(CH2)n1O]m2-[(CHR<2>)I2-W3]m3}n2- i -{[(CH2)n3O]m5-[(CHR<4>)I4-W5]m6}n4- su izabrani iz,
pri čemu je * namenjena da označi tačku vezivanja, tj. otvorenu vezu.
U daljoj realizaciji, molarna masa datog hidrofilnog spejsera je u opsegu od 80 Daltona (D) do 1500 D ili u opsegu od 300 D do 1100 D.
U još jednoj realizaciji, W ima formulu
-W7-Y-,
pri čemu
Y je -(CH2)I7-C3-10-Cikloalkil-W8- ili je valentna veza,
I7 je 0-6,
W7je izabran iz -C(O)NH-, -NHC(O)-, -C(O)NHCH2-, -CH2NHC(O)-,
-C(O)NHS(O)2-, -S(O)2NHC(O)-, -OC(O)NH-, -NHC(O)O-,
-C(O)CH2-, -CH2C(O)-, -C(O)CH=CH-, -CH=CHC(O)-,
-(CH2)s3-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)- ili je valentna veza; pri čemu s3 je 0 ili 1,
W8je izabran iz -C(O)NH-, -NHC(O)-, -C(O)NHCH2-, -CH2NHC(O)-,
-C(O)NHS(O)2-, -S(O)2NHC(O)-, -OC(O)NH-, -NHC(O)O-,
-C(O)CH2-, -CH2C(O)-, -C(O)CH=CH-, -CH=CHC(O)-,
-(CH2)s4-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)- ili je valentna veza; pri čemu s4 je 0 ili 1.
U jednoj realizaciji W, Y je -(CH2)I7-cikloheksil-W8-. U daljoj realizaciji, Y je valentna veza.
U jednoj realizaciji, W7je izabran iz -C(O)NH-, -NHC(O)-, -C(O)NHCH2-, -CH2NHC(O)-, -C(O)NHS(O)2-, -S(O)2NHC(O)- ili je valentna veza. Obično, W7je izabran iz -C(O)NH-, -NHC(O)-, ili -C(O)NHS(O)2.
U daljoj realizaciji W8je izabran iz -C(O)NH-, -NHC(O)-, -C(O)NHCH2-, -CH2NHC(O)-, -C(O)NHS(O)2-, -S(O)2NHC(O)- ili je valentna veza. Obično, W8je izabran iz -C(O)NH-, -NHC(O)-, ili -C(O)NHS(O)2.
U daljoj realizaciji l7 je 0 ili 1.
U sledećoj realizaciji hidrofilni spejser B predmetnog pronalaska izabran iz
<O>
pri čemu je * namenjena da označi tačku vezivanja, tj. otvorenu vezu.
Ostatak koji vezuje albumin (supstituent A u formuli (I) ili (II) gore) vezan za jedinjenje hormona rasta iz predmetnog pronalaska je lipofilni ostatak, koji se nekovalentno vezuje za albumin. Obično, ostatak koji vezuje albumin je negativno naelektrisan pri fiziološkom pH i ima afinitet vezivanja prema albuminu humanog seruma koji je ispod oko 10 µM ili čak ispod oko 1 µM.
U daljoj realizaciji jedinjenja hormona rasta iz predmetnog pronalaska, ostatak koji vezuje albumin je izabran iz ravnolančane alkilne grupe, razgranate alkilne grupe, grupe koja ima grupu ω-karboksilne kiseline ili izoster ω-karboksilne kiseline. Obično, ostatak koji vezuje albumin ima od 6 do 40 atoma ugljenika. U daljoj realizaciji, ostatak koji vezuje albumin ima od 8 do 26 atoma ugljenika. U daljoj realizaciji, ostatak koji vezuje albumin ima od 8 do 20 atoma ugljenika.
U daljoj realizaciji, A ima 14 do 26 atoma ugljenika i sadrži grupu ω-karboksilne kiseline. U daljoj realizaciji, A ima 14 do 26 atoma ugljenika i sadrži izoter ω-karboksilne kiseline, kao što je tetrazol.
Ostatak koji veže albumin (A) je izabran od
pri čemu * označava vezivanje na B preko W.
Hidrofilni spejser (B) se poželjno uvodi na poziciju jedinjenja hormona rasta (GH) selektivno da bi se moglo kontrolisati da li jedan ili dva ostatka koji vežu albumin (A) treba ugraditi u jedinjenje hormona rasta. Hidrofilni spejser (B) može da bude vezan za bočni lanac aminokiseline GH jedinjenja. Takav bočni lanac amino-kiseline može biti hemijski modifikovan bočni lanac amino-kiseline GH jedinjenja. Drugi, takav bočni lanac amino-kiselina može biti enzimski modifikovan bočni lanac amino-kiseline GH jedinjenja. Poželjno, transglutaminaza se koristi da se uvede hidrofilni spejser na ostatak glutamina na poziciji koja odgovara poziciji 40 ili poziciji 141 u SEQ ID NO: 1. Drugi način selektivnog uvođenja hidrofilnog razmaka je na N-terminalnom ostatku jedinjenja hormona rasta, kao što je hGH (SEQ ID NO: 1).
U konjugatu hormona rasta formule (I), fragment A-W-B može biti ravan ili razgranat. U jednom aspektu, A-W-B nije linearni peptid.
Otkriveno je da ostatak koji vezuje albumin preko hidrofilnog spejsera je vezan na ostatak glutamina na poziciji koja odgovara poziciji 40 u SEQ ID NO: 1.
Otkriveno je da ostatak koji vezuje albumin preko hidrofilnog spejsera je vezan na ostatak glutamina na poziciji koja odgovara poziciji 141 u SEQ ID NO: 1.
Otkriveno je da ostatak koji vezuje albumin preko hidrofilnog spejsera je vezan za N-terminalni ostatak jedinjenja hormona rasta, kao što je hGH (SEQ ID NO: 1).
Otkriveno je da ostatak koji vezuje albumin preko hidrofilnog spejsera je vezan za ostatak glutamina na poziciji koja odgovara poziciji 40, poziciji 141 i na N-terminalnom ostatku jedinjenja hormona rasta, kao što je hGH (SEQ ID NO: 1 ).
Konjugati hormona rasta predmetnog pronalaska suizabrani iz,
U daljem aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na konjugat hormona rasta koji sadrži jedinjenje hormona rasta (GH) vezano za ostatak koji vezuje albumin preko hidrofilnog spejsera ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so za upotrebu u terapiji. Dalje, u konjugatu hormona rasta predmetnog pronalaska GH, ostatak koji vezuje albumin i hidrofilni spejser su izabrani iz bilo koje od gornjih realizacija, naročito konjugat hormona rasta ima formulu (I) ili (II).
U daljem aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži konjugat hormona rasta koji sadrži jedinjenje hormona rasta (GH) vezano za ostatak koji vezuje albumin preko hidrofilnog spejsera, ili farmaceutski prihvatljivu so, opciono u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijentom.
Izraz „identičnost“ kao što je poznato u tehnici, odnosi se na odnos između sekvenci dva ili više proteina, što je određeno poređenjem sekvenci. U nauci, „identičnost“, takođe, označava stepen srodnosti sekvenci između proteina, koji je određen brojem podudaranja između niza dva ili više ostataka amino-kiselina. „Identičnost“ meri procenat identičnih podudaranja između manje od dve ili više sekvenci sa poravnanjem praznina (ako ih ima) obrađen određenim matematičkim modelom ili računarskim programom (tj., „algoritmi“). Identičnost srodnih proteina može se lako izračunati poznatim postupcima. Takvi postupci uključuju one opisane u Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991; i Carillo et al., SIAM J. Applied Math., 48, 1073, (1988).
Poželjni postupci za određivanje identičnosti projektovani su tako da daju najveće podudaranje između ispitivanih sekvenci. Postupci za utvrđivanje identičnosti opisani su u javno dostupnim računarskim programima.
Poželjni postupci računarskog programa za određivanje identičnosti između dve sekvence uključuju programski paket GCG, uključujući GAP (Devereux et al., Nucl. Acid. Res., 12, 387, (1984)); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), BLASTP, BLASTN i FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215, 403-410, (1990)). Program BLASTKS javno je dostupan kod Nacionalnog centra za biotehnološke informacije (NCBI) i drugih izvora (BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul et al., supra). Dobro poznati algoritam Smit-Vaterman, takođe se može koristiti za utvrđivanje identičnosti.
Na primer, korišćenjem kompjuterskog algoritma GAP (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), dva proteina za koja će se odrediti procentualna identičnost sekvence su poravnati za optimalno podudaranje njihovih amino-kiselina („podudarni raspon“, kako je utvrđeno algoritmom). Rezultat za razmake (koja se izračunava kao 3 x prosečna dijagonala; „prosečna dijagonala“ je prosek dijagonale uporedne matrice koja se koristi; „dijagonala“ je rezultat ili broj dodeljen svakom savršenom podudaranju amino-kiselina prema određenoj uporednoj matrici) i razlika za produženje razmaka (koja je obično {frakcija (1/10)} puta rezultat za razmake), kao i uporedna matrica kao što su PAM 250 ili BLOSUM 62 koriste se zajedno sa algoritmom. Standardna uporedna matrica (vidi Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, suppl. 3, (1978) za PAM 250 uporednu matricu;
Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89, 10915-10919, (1992) za BLOSUM 62 uporednu matricu) je, takođe, korišćeno od strane algoritma.
Poželjni parametri za upoređivanje proteinskih sekvenci uključuju sledeće:
Algoritam: Needleman et al., J. Mol. Biol, 48, 443-453, (1970); Uporedna matrica: BLOSUM 62 od Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10915-10919, (1992); Rezultat razmaka: 12, Rezultat dužine razmaka: 4, Prag sličnosti: 0.
GAP program je koristan sa gore navedenim parametrima. Navedeni parametri su zadati parametri za poređenje proteina (zajedno sa bez rezultata za krajnje praznine) koristeći GAP algoritam.
Jedinjenja predmetnog pronalaska imaju poboljšana farmakološka svojstva u poređenju sa odgovarajućim nekonjugovanim hormonom rasta, koji se, takođe, naziva matično jedinjenje. Primeri takvih farmakoloških svojstava uključuju funkcionalni in vivo poluživot, imunogenost, bubrežnu filtraciju, zaštitu od proteaze i vezivanje albumina.
Izraz „funkcionalni in vivo poluživot“ koristi se u svom redovnom značenju, tj. vreme u kojem je 50% biološke aktivnosti konjugata GH ili GH još uvek prisutan u telu/ciljnom organu, odnosno vreme u kome aktivnost GH ili GH konjugata iznosi 50% njegove početne vrednosti. Kao alternativa određivanju funkcionalnog in vivo poluživota, „in vivo poluživot u plazmi“ može se odrediti, tj. vreme u kojem 50% GH ili GH konjugata cirkuliše u plazmi ili krvotoku pre nego što se isprazni. Određivanje poluživota u plazmi je često jednostavnije od određivanja funkcionalnog poluživota, a veličina poluživota u plazmi obično je dobar pokazatelj veličine funkcionalnog in vivo poluživota.
Alternativni izrazi za poluživot u plazmi uključuju poluživot u serumu, poluživot u cirkulaciji, poluživot cirkulacije, klirens u serumu, klirens u plazmi i klirens poluživota.
Izraz „povećan“ kako se koristi u vezi s funkcionalnim in vivo poluživotom ili poluživotom u plazmi koristi se da označi da je relevantni poluživot GH konjugata statistički značajno povećan u odnosu na onaj matičnog GH, kako je određeno pod uporedivim uslovima. Na primer, relevantni poluživot može biti povećan za najmanje oko 25%, kao što je najmanje oko 50%, npr. za najmanje oko 100%, 150%, 200%, 250% ili 500%. U jednoj realizaciji, jedinjenja predmetnog pronalaska pokazuju povećanje perioda poluživota od najmanje oko 5 h, poželjno najmanje oko 24 sata, poželjnije najmanje oko 72 sata, i najpoželjnije najmanje oko 7 dana, u odnosu na poluživot roditeljskog GH.
Merenje in vivo poluživota u plazmi može se izvesti na više načina kao što je opisano u literaturi. Povećanje in vivo poluživota u plazmi može se kvantifikovati kao smanjenje klirensa (CL) ili kao povećanje srednjeg vremena zadržavanja (MRT). Konjugovani GH predmetnog pronalaska za koji je CL smanjen na manje od 70%, kao što je manje od 50%, manje od 20%, manje od 10% CL matičnog GH kako je određeno u pogodnom ispitivanju se smatra da ima povećan in vivo poluživot u plazmi. Konjugovani GH predmetnog pronalaska za koju je MRT povećano na više od 130%, kao što je više od 150%, kao što je više od 200%, kao što je više od 500% MRT matičnog GH u odgovarajućem testu, smatra se da ima produženi in vivo poluživot u plazmi. Klirens i prosečno vreme zadržavanja mogu se proceniti u standardnim farmakokinetičkim studijama upotrebom odgovarajućih životinja za testiranje. U okviru svojih mogućnosti, stručnjak u tehnici će da odabere odgovarajuću životinju za testiranje za dati protein. Testovi na ljudima, naravno, predstavljaju krajnji test. Odgovarajuće životinje za testiranje uključuju normalne Sprag-Dauli mužjake pacova, miševe i cinomolgus majmune. Obično se miševima i pacovima ubrizgavaju u jednom potkožnom bolusu, dok se majmunima mogu ubrizgati u jednom potkožnom bolusu ili u jednoj i.v. dozi. Ubrizgana količina zavisi od životinje za testiranje. Nakon toga, uzorci krvi se uzimaju u periodu od jednog do pet dana, što je odgovarajuće za procenu CL i MRT. Uzorci krvi su pogodno analizirani ELISA tehnikama.
Izraz „Imunogenost“ jedinjenja odnosi se na sposobnost jedinjenja, kada se daje čoveku, da izazove brišući imuni odgovor, bilo da je humoralni, ćelijski ili oboje. U bilo kojoj ljudskoj podpopulaciji može biti pojedinaca koji pokazuju osetljivost na davanje određenih proteina. Imunogenost se može meriti kvantifikovanjem prisustva antitela hormona rasta i/ili T-ćelija koje odgovaraju na hormon rasta kod osetljive jedinke, korišćenjem konvencionalnih postupaka poznatih u tehnici. U jednoj realizaciji, konjugovani GH predmetnog pronalaska pokazuje smanjenje imunogenosti kod osetljive jedinke za najmanje oko 10%, poželjno najmanje oko 25%, poželjnije najmanje oko 40% i najpoželjnije najmanje oko 50%, u odnosu na imunogenost za tog pojedinca za matični GH.Izraz „proteazna zaštita“ ili „zaštićena proteazom“ kao što je ovde korišćen, namerava da ukaže na to da je konjugovani GH predmetnog pronalaska otporniji na peptidazu ili proteazu u plazmi nego što je matični GH. Poznato je da enzimi proteaze i peptidaze u plazmi učestvuju u razgradnji proteina u cirkulaciji, kao što su npr. cirkulišući peptidni hormoni, poput hormona rasta. Takva proteazna zaštita može se meriti postupkom iz Primera A koji je ovde opisan.
Hormon rasta može biti podložan degradaciji na primer trombinom, plazminom, subtilizinom i himotripsinu sličnom serinskom proteinazom. Testovi za određivanje degradacije ovih proteaza su opisani u J. Biotech., 65, 183, (1998). U jednoj realizaciji, brzina hidrolize GH konjugata je manja od 70%, kao što je manja od 40%, kao što je manja od 10% od one matičnog GH.
Najobilnija komponenta proteina u cirkulišućoj krvi sisara je serumski albumin koji je normalno prisutan u koncentraciji od približno 3 do 4,5 grama na 100 mililitara pune krvi. Albumin u serumu je protein krvi od oko 65.000 daltona koji ima nekoliko važnih funkcija u sistemu krvotoka. Funkcioniše kao prenosnik raznih organskih molekula koje se nalaze u krvi, kao glavni prenosilac različitih metabolita poput masnih kiselina i bilirubina kroz krv, i zahvaljujući svom obilju, kao osmotski regulator cirkulišuće krvi. Serumski albumin ima poluživot duži od jedne nedelje, a jedan pristup povećanju poluživota proteina u plazmi je konjugacija na protein grupe sa koja se vezuje za serumski albumin. Svojstvo vezivanja albumina može se odrediti kao što je opisano u J. Med. Chem., 43, 1986, (2000).
Konjugati hormona rasta formule (I) ili (II) vrše aktivnost hormona rasta i mogu se kao takvi koristiti u lečenju bolesti ili stanja koja će imati koristi od povećanja količine hormona rasta koji cirkuliše. Posebno, pronalazak obezbeđuje postupak za lečenje nedostatka hormona rasta (GHD); Turnerovog sindroma; Prader-Villijevog sindroma (PWS); Noonanovog sindroma; Daunovog sindroma; hronične bolesti bubrega, juvenilnog reumatoidnog artritisa; cistične fibroze, HIV infekcije kod dece koja su lečena HAART tretmanom (deca sa HIV / HALS-om); niske dece koja su rođena niska (kratka) za gestacijsku dob (SGA); niskog rasta kod dece rođene sa vrlo malom težinom na rođenju (VLBW), ali SGA; skeletne displazije; hipohondroplazije; ahondroplazije; idiopatskog kratkog rasta (ISS); GHD kod odraslih; preloma na ili kod dugih kostiju, poput tibije, fibule, butne kosti, nadlaktice, radijusa, ulne, klavikule, matakarpeje, matatarseje i prstiju; lomove na ili kod spužvastih kostiju, poput lobanje, baze šake i baze stopala; pacijenata nakon operacije tetive ili ligamenta npr. ruke, kolena ili ramena; pacijenata koji imaju ili prolaze distrakcijsku osteogenezu; pacijenata nakon zamene kuka ili pršljena, popravka meniskusa, fuzije kičme ili fiksacije proteze, kao što su one za kolena, kukove, ramena, lakat, zglob ili vilicu; pacijenata u koje je fiksiran materijal za osteosintezu, kao što su šrafovi, zavrtnji i ploče; pacijenata sa nezaraslim ili lošim zarastanjem preloma; pacijenti nakon osteotomije, npr. tibije ili prvog nožnog prsta; pacijenata nakon implantacije transplantata; degeneracije zglobne hrskavice u kolenu izazvane traumom ili artritisom; osteoporoze kod pacijenata sa Turnerovim sindromom; osteoporoze kod muškaraca; odraslih pacijenata na hroničnoj dijalizi (APCD); kardiovaskularne bolesti povezane s lošom ishranom kod APCD; preokreta kaheksije kod APCD; raka kod APCD; hronične opstruktivne bolesti pluća kod APCD; HIV kod APCD; starije osobe sa APCD; hronične bolesti jetre kod APCD, sindroma umora kod APCD; Kronove bolesti; oslabljene funkcije jetre; muškaraca sa HIV infekcijom; sindroma kratkog creva; centralne gojaznosti; Sindroma lipodistrofije povezanog sa HIV-om (HALS); muške neplodnosti; pacijenata nakon većih elektivnih operacija, detoksikacije od alkohola/lekova ili neurološke traume; starenje; krhkih starijih; osteoartritisa; povredom oštećene hrskavice; erektilne disfunkcije; fibromijalgije; poremećaja pamćenja; depresije; traumatske povrede mozga; subarahnoidnog krvarenja; vrlo male porođajne težine; metaboličkog sindroma; glukokortikoidne miopatije; ili niskog rasta usled glukokortikoidnog lečenja kod dece, a postupak obuhvata davanje pacijentu kome je potrebno terapeutski efikasnue količine konjugata hormona rasta prema formuli (I) ili (II).
U sledećem aspektu, pronalazak pruža postupak za ubrzanje zarastanja mišićnog tkiva, nervnog tkiva ili rana; ubrzanje ili poboljšanje protoka krvi u oštećenom tkivu; ili smanjenje brzine infekcije u oštećenom tkivu, pri čemu postupak uključuje davanje pacijentu kome je potrebno efikasne količine terapeutski efikasne količine konjugata hormona rasta formule (I) ili (II).
U daljoj realizaciji, pronalazak se odnosi na upotrebu konjugata hormona rasta formule (I) ili (II) u proizvodnji za bolesti koje imaju koristi od povećanja nivoa hormona rasta u plazmi, kao što su bolesti pomenute gore.
Uobičajena parenteralna doza je u rasponu od10<-9>mg/kg do oko 100 mg/kg telesne težine po primeni.
Uobičajene doze za davanje su od oko 0,0000001 do oko 10 mg/kg telesne težine po primeni. Tačna doza će zavisiti od npr. indikacije, medikamenta, učestalosti i načina davanja, pola, starosti i opšteg stanja subjekta koji treba da se tretira, prirode i ozbiljnosti stanja koje se tretira, željenog efekta lečenja i drugih faktora koji su očigledni osobi stručnoj u tehnici.
Uobičajene učestalosti doziranja su dva puta dnevno, jednom dnevno, dvodnevno, dva puta nedeljno, jednom nedeljno ili sa još dužim intervalima doziranja. Zbog produženog poluživota fuzionisanih proteina predmetnog pronalaska, režim doziranja sa dugim intervalima doziranja, kao što su dva puta nedeljno, jednom nedeljno ili sa još dužim intervalima doziranja, je posebna realizacija ovog pronalaska.
Mnoge bolesti se leče korišćenjem više od jednog leka u lečenju, bilo davanjem istovremeno ili sekvencijalno. Zbog toga je u obuhvatu predmetnog pronalaska upotreba konjugata hormona rasta formule (I) ili (II) u terapijskim postupcima za lečenje jedne od gore navedenih bolesti u kombinaciji sa jednim ili više drugih terapeutski aktivnih jedinjenja koja se obično koriste u lečenju navedenih bolesti. Po analogiji, takođe je u obuhvatu predmetnog pronalaska upotreba konjugata hormona rasta formule (I) ili (II) u kombinaciji sa drugim terapeutski aktivnim jedinjenjima koja se obično koriste u lečenju jedne od gore navedenih bolesti u proizvodnji leka za datu bolest.
Opšti postupci
Konjugacija enzima:
U pripremi konjugata hormona rasta prema ovom pronalasku, obično barem jedna od kovalentnih veza uspostavljena u pripremi A-W-B-GH konjugata formule (I) se dobija upotrebom enzima kao što je ilustrovano u dole navedenim primerima. Takav enzim može biti izabran iz grupe koja se sastoji od transglutaminaza, serinskih proteaza i cisteinskih proteaza. Obično, dati enzim je transglutaminaza. Takva transglutaminaza može, na primer, biti izabrana iz grupe koja se sastoji od mikrobnih transglutaminaza, tkivnih transglutaminaza i faktora XIII i njihovih varijanti. U drugoj realizaciji, dati enzim je cisteinska proteaza. Konjugat hormona rasta iz predmetnog pronalaska može se pripremiti mnogim različitim postupcima, a neograničavajući primeri su prikazani u daljem tekstu.
Predmetni pronalazak, takođe, obezbeđuje postupke za dobijanje A-W-B-GH konjugata formule (I).
Transglutaminaza
Kao što je gore navedeno, najmanje jedna kovalentna veza uspostavljena u pripremi konjugata A-W-B-GH ovog pronalaska može se pripremiti upotrebom transglutaminaze. Transglutaminaze mogu da uključuju mikrobne transglutaminaze kao što su one izolovane od vrste Streptomices; S. mobaraense, S. cinnamoneum, S. griseocarneum (US5156956), S. lavendulae (US5252469) i S. ladakanum (JP2003/199569). Ostale korisne mikrobne transglutaminaze su izolovane iz Bacillus subtilis (opisane u US5731183) i iz različitih Mikomiceta. Ostali primeri korisnih mikrobnih transglutaminaza su oni opisani u WO1996/06931 (npr. transglutaminaza iz Bacilus lydicus) i WO1996/22366, oba od kojih su. Korisne nemikrobne transglutaminaze uključuju transglutaminazu jetre zamoraca i transglutaminaze iz različitih morskih izvora poput pljosnatic Pagrus major (opisane u EP0555649) i japanske ostrige Crassostrea gigas (opisano u US5736356).
Funkcionalni analozi i njihovi derivati, takođe, mogu biti korisni.
Obično, TGase koja se koristi u postupcima ovog pronalaska je mikrobna transglutaminaza. U jednoj realizaciji, TGase je iz S. mobaraense ili njene varijante, na primer kako je opisano u WO2007/020290 i WO2008/020075. U drugoj realizaciji, TGase je iz S. ladakanum ili njene varijante, na primer kako je opisano u WO2008/020075.
Konjugacija GH sa A-W-B prema predmetnom pronalasku može se postići modifikacijom posredovanom TGase-om koja vodi do selektivne promene na specifičnim pozicijama lizina (Lys) ili glutamina (Gln) u sekvenci jedinjenja GH zavisno od supstrata koji se koristi. Upotreba amina kao supstrata dovešće do modifikacije glutamina, dok će primena primarnih amida dovesti do modifikacije Lizina. hGH (SEQ ID NO: 1) ima 9 lizinskih ostataka na pozicijama 38, 41, 70, 115, 140, 145, 158, 168 i 172 i 13 ostataka glutamina na pozicijama 22, 29, 40, 46, 49, 68, 69, 84, 91, 122, 137, 141 i 181, mada nisu svi od njih lako dostupni za modifikaciju, niti su pogodni za modifikacije, jer će to dovesti do smanjene potencija vezivanja za protein koji vezuje hormon rasta, što dovodi do smanjene biološke aktivnosti. Rendgenski snimak kristalne strukture između hGH i njegovog vezujućeg proteina (pdb: 3HHR) otkriva da najmanje 4 lizina (38, 41, 168 i 172) učestvuju u vezivanju za vezujući protein i potencijalno samo za jedan glutamin (Gln 46). Ovo čini glutamine atraktivnijima kao metama za selektivno uvođenje linkera veznika albumina. Ova strukturalna razmatranja su dodatno podržana nalazima koje su saželi N. Chene et al u Reprod. Nutr. Develop. 29, 1-25 (1989) gde se zaključuje da je nađeno da hemijske modifikacije koje utiču na lizine imaju negativan uticaj na in vivo biološku aktivnost i na sposobnost vezivanja za jetrene receptore GH.
Hemija I (Nije prema patentnim zahtevima)
U jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na dobijanje konjugata hormona rasta formule (I) pri čemu se jedinjenje GH tretira grupom koja modifikuje svojstvo koristeći hemiju koja katalizuje TGase-u. U početku se aldehidna ili ketonska funkcionalnost uspostavlja reakcijom u dva koraka upotrebom amino alkohola koji se zatim tretiraju perjodatom da bi se stvorio aldehidna ili keto funkcionalnost oksidativnim cepanjem. Primeri amino alkohola uključuju 1,3-diamino-2-propanol i 1-amino-2,3-dihidroksipropan.
U daljem aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na dobijanje konjugata hormona rasta formule (I) koji obuhvata tretman aldehida ili ketona koji je dobijen iz GH jedinjenja sa anilinom dobijenim iz grupe koja modifikuje svojstva ili heteroarilnog amina kako bi se dobio amin (III�IV).
U jednoj realizaciji, aldehid dobijen iz GH jedinjenja je tretiran anilinom koji je dobijen grupom koja modifikuje svojstvo ili heteroarilaminom.
Izraz „aldehid (ili keton) koji je izveden od GH jedinjenja“ ili „aldehid ili keton izveden iz jedinjenja GH“ namerava da označi GH jedinjenje za koje je kovalentno vezana aldehidna ili ketonska funkcionalna grupa, ili jedinjenje GH na kome generisana je aldehidna ili ketonska funkcionalna grupa. Dobijanje aldehida izvedenih iz GH jedinjenja, kao što je jedinjenje (III) prikazano u daljem tekstu, dobro je poznato stručnjacima u tehnici, i bilo koji od ovih poznatih postupaka može se koristiti za pripremu GH jedinjenja dobijenog od jedinjenja aldehida (III) potrebnog za realizaciju ovde opisanog pronalaska.
U jednoj realizaciji, konjugat A-W-B-GH (IV) se priprema kao što je prikazano u daljem tekstu:
Enzimska reakcija posredovana TGase-om sa GH (I) rezultira modifikacijom Gln na poziciji 141 i/ili 40, čime se dobija (II). Modifikovani GH (II) je tretiran perjodatom da bi se cepao amino-alkohol da bi se dobio aldehid izveden iz GH (III). Konjugacija GH aldehida (III) sa A-W-B1- NH2nastaje reduktivnom alkilacijom (III �IV). Reduktivna alkilacija kao što je ovde prikazano dobro je poznata u tehnici i daje GH jedinjenja (IV) modifikovanih u položaju Gln(141) i/ili 40.
Hemija II (Nije prema patentnim zahtevima)
U jednoj realizaciji, konjugat A-W-B-GH je pripremljen korišćenjem reduktivne aminacije na GH-ovom N-kraju, kao što je prikazano u nastavku:
(V) (V) Konjugacija GH u A-W-B1-CHO nastaje reduktivnom alkilacijom (GH �V). Reduktivna alkilacija kao što je prethodno prikazano u tehnici je dobro poznata za modifikaciju N-kraju GH.
Hemija III
U jednoj realizaciji, konjugat A-W-B-GH se priprema kao što je prikazano u daljem tekstu:
(VI) (VII) (IX) (IX)
Pri čemu je ostatak cisteina opciono zaštićen kao mešoviti disulfid (VI) (GH-S-S-R), pri čemu je R mala organska grupa. Primeri mešanih disulfida mogu da uključuju
disulfide između cistamina (R = -CH2CH2NH2); cistein (R = -CH2CH(C(O)OH)NH2); homocistein (R = -CH2CH2CH(C(O)OH)NH2); i glutation (R = -CH2CH(C(O)NH-CH2C(O)OH)NH-C(O)CH2CH2CH(C(O)OH)NH2).
Proces derivatizacije koristi linker koji vezuje albumin A-W-B1-LG, pri čemu LG predstavljaju neorgansku odlazeću grupu kao što su -Cl, -Br, -I ili organsku odlazeću grupu kao što su mezilat ili tozilat. Konjugacija GH sa A-W-B1-LG nastaje nukleofilnom supstitucijom (VII�IX).
Hemija IV
U jednoj realizaciji, konjugat A-W-B-GH se priprema kao što je prikazano u daljem tekstu:
ys (XI) (VII) (XI)
GH jedinjenje sa uklonjenom Cys zaštitom (VII) dobijeno iz gore navedenog (VI) može da reaguje sa malimidom supstituisanim linkerom veziva albumina (X) dajući GH konjugat A-W-B1- NHC(O)CH2CH2-pirolidin-2,5-dion-3-GH (XI).
pri čemu hidrofilni spejser B1 ima formulu
-X1-X2-X3-X4-pri čemu
X1je -W1-[(CHR<1>)I1-W2]m1-{[(CH2)n1E1]m2-[(CHR<2>)I2-W3]m3}n2-,
X2je -[(CHR<3>)I3-W4]m4-{[(CH2)n3E2]m5-[(CHR<4>)I4-W5]m6}n4-, X3je -[(CHR<5>)I5]m7-,
X4je valentna veza,
I1, I2, I3, I4, i I5 nezavisno su izabrani iz 0-16, m1, m3, m4, m6 i m7 nezavisno su izabrani iz 0-10, m2 i m5 nezavisno su izabrani iz 0-25,
n1, n2, n3 i n4 nezavisno su izabrani iz 0-16,
R<1>, R<2>, R<3>, R<4>i R<5>nezavisno su izabrani iz vodonika, -C(O)OH,
-C(O)NH2, -S(O)OH, -S(O)2OH, -NH-C(=NH)-NH2, C1-6-
alkila, arila ili hetarila; pri čemu su alkilne, arilne i hetarilne grupe opciono supstituisane halogenom, -C(O)OH, -C(O)NH2, -S(O)OH, -S(O)2OH, -CN ili -OH,
E1 i E2 su nezavisno izabrani iz -O-, -NR<6>-, -N(COR<7>)- ili su valentna veza; pri čemu R<6>i R<7>nezavisno predstavljaju vodonik ili C1-6-alkil,
W1to W5su nezavisno izabrani iz (O)NH-, -NHC(O)-, -
C(O)NHCH2-, -CH2NHC(O)-, -C(O)NHS(O)2-, -
S(O)2NHC(O)-, -OC(O)NH-, -NHC(O)O-, -C(O)CH2-,
-CH2C(O)-, -C(O)CH=CH-, -CH=CHC(O)-, -(CH2)s2-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)- ili su valentna veza; pri čemu s2 je 0 ili 1.
Hemija V
U jednoj realizaciji, konjugat A-W-B-GH je pripremljen kako je prikazano u daljem tekstu:
(XIV) (XV) (XV)
Veziva za albumine mogu biti vezana za pojedinačne cys GH derivate korišćenjem S-nitrozil reakcije kao što je opisano u WO2009/024791.
GH jedinjenje sa uklonjenom Cys zaštitom (VII) podvrgnuto je S-nitrozilaciji dodavanjem donora NO, kao što je DEA NOnat (Sigma Aldrich). Nitrozilirani pojedinačni cys GH (XII) zatim reaguje sa vezivom albumina supstituisanim alil aminom (XIII) što daje oksim (XIV) koji posle hidrolize daje GH konjugat A-W-B1-C(O)NHCH2C(O)CH2-Cys GH (XV)
pri čemu hidrofilni spejser B1 ima formulu
-X1-X2-X3-X4-pri čemu
X1je -W1-[(CHR<1>)I1-W2]m1-{[(CH2)n1E1]m2-[(CHR<2>)I2-W3]m3}n2-,
X2je -[(CHR<3>)I3-W4]m4-{[(CH2)n3E2]m5-[(CHR<4>)I4-W5]m6}n4-, X3je -[(CHR<5>)I5]m7-,
X4je valentna veza,
I1, I2, I3, I4, i I5 nezavisno su izabrani iz 0-16, m1, m3, m4, m6 i m7 nezavisno su izabrani iz 0-10, m2 i m5 nezavisno su izabrani iz 0-25,
n1, n2, n3 i n4 nezavisno su izabrani iz 0-16,
R<1>, R<2>, R<3>, R<4>i R<5>su nezavisno izabrani iz vodonika, -C(O)OH,
-C(O)NH2, -S(O)OH, -S(O)2OH, -NH-C(=NH)-NH2, C1-6-
alkila, arila ili hetarila; pri čemu su alkilne, arilne i hetarilne grupe opciono supstituisane halogenom, -C(O)OH, -C(O)NH2, -S(O)OH, -S(O)2OH, -CN ili -OH,
E1 i E2 su nezavisno izabrani iz -O-, -N(R<6>)-, -N(C(O)R<7>)- ili su valentne veze; pri čemu R<6>i R<7>nezavisno predstavljaju vodonik ili C1-6-alkil,
W1do W5nezavisno su izabrani iz -C(O)NH-, -NHC(O)-,
-C(O)NHCH2-, -CH2NHC(O)-, -C(O)NHS(O)2-, -
S(O)2NHC(O)-, -OC(O)NH-, -NHC(O)O-, -C(O)CH2-,
-CH2C(O)-, -C(O)CH=CH-, -CH=CHC(O)-, -(CH2)s2-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)- ili su valentna veza; pri čemu s2 je 0 ili 1.
Bliski odnos sa prirodnim peptidom se generalno smatra prednošću uterapijskim intervencijama koje uključuju primenu varijanti ili analoga ovog prirodnog peptida jer se smanjuje rizik od stvaranja npr. bilo kakvih neželjenih antitela.
GH se može modifikovati na njihovom C-kraju upotrebom karboksipeptidaze Y (EC. 3.4.16.5) i pogodnih modifikovanih supstrata kako je opisano u WO2007/093594. Postupak u dva koraka koji su opisali B. Peschke et al. “C-Terminally PEGylated GH derivatives” Bioorg. Med. Chem. 15, 4382-4395, (2007), pri čemu je C terminalni alanin enzimski izmenjen sa (4-acetilbenzoil)lizinom, posle čega sledi reakcija sa derivatima albuminskog veznika prema pronalasku.
FARMACEUTSKE KOMPOZICIJE
Druga svrha je da se osigura farmaceutska kompozicija koja sadržikonjugat hormona rasta predmetnog pronalaska, kao što je konjugat hormona rasta formule (I) ili (II), koji je prisutan u koncentraciji od 10<-15>mg/mL do 200 mg / mL, kao što je npr. 10<-10>mg/mL do 5 mg/mL i pri čemu data kompozicija ima pH od 2,0 do 10,0. Kompozicija može dalje da sadrži farmaceutske ekscipijense, kao što je sistem pufera, konzervansi, sredstva za toničnost, sredstva za heliranje, stabilizatori i surfaktanti. U jednoj realizaciji pronalaska farmaceutska kompozicija je vodena kompozicija, tj. kompozicija koja sadrži vodu. Takva kompozicija je uobičajeno rastvor ili suspenzija. U sledećoj realizaciji pronalaska, farmaceutska kompozicija je vodeni rastvor. Izraz „vodena kompozicija“ je definisan kao kompozicija koja sadrži najmanje 50% w/w vode. Slično tome, izraz „vodeni rastvor“ je definisan kao rastvor koji sadrži najmanje 50% w/w vode, a izraz „vodena suspenzija“ je definisan kao suspenzija koja sadrži najmanje 50% w/w vode.
U sledećoj realizaciji, farmaceutska kompozicija je zamrzavanjem sušena kompozicija u koju lekar ili pacijent dodaje pre upotrebe rastvarače i/ili razblaživače.
U sledećoj realizaciji farmaceutska kompozicija je osušena kompozicija (na primer npr. sušena smrzavanjem ili osušena raspršivanjem) spremna za upotrebu bez prethodnog rastvaranja.
U daljem aspektu, pronalazak se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži vodeni rastvor konjugata hormona rasta, poput konjugata hormona rasta formule (I) ili (II), i pufer, pri čemu je navedeni GH konjugat prisutan u koncentraciji od 0,1-100 mg/mL ili više, i pri čemu dati sastav ima pH od oko 2,0 do oko 10,0.
U drugoj realizaciji predmetnog pronalaska, pH kompozicije je izabran sa liste koja se sastoji iz 2,0; 2,1; 2,2; 2,3; 2,4; 2,5; 2,6; 2,7; 2,8; 2,9; 3,0; 3,1; 3,2; 3,3; 3,4; 3,5; 3,6; 3,7; 3,8; 3,9; 4,0; 4,1; 4,2; 4,3; 4,4; 4,5; 4,6; 4,7; 4,8; 4,9; 5,0; 5,1; 5,2; 5,3; 5,4; 5,5; 5,6; 5,7; 5,8; 5,9; 6,0; 6,1; 6,2; 6,3; 6,4; 6,5; 6,6; 6,7; 6,8; 6,9; 7,0; 7,1; 7,2; 7,3; 7,4; 7,5; 7,6; 7,7; 7,8; 7,9; 8,0; 8,1; 8,2; 8,3; 8,4; 8,5; 8,6; 8,7; 8,8; 8,9; 9,0; 9,1; 9,2; 9,3; 9,4; 9,5; 9,6; 9,7; 9,8; 9,9; i 10,0.
U sledećoj realizaciji predmetnog pronalaska pufer je izabran iz grupe koja se sastoji od natrijum acetata, natrijum karbonata, citrata, glicilglicina, histidina, glicina, lizina, arginina, natrijum dihidrogen fosfata, dinatrijum hidrogen fosfata, natrijum fosfata i tris(hidroksimetil)-aminometana, bicina, tricina, jabučne kiselina, sukcinata, maleinske kiseline, fumarne kiseline, vinske kiseline, asparaginske kiseline ili njihovih smeša. Svaki od ovih specifičnih pufera predstavlja alternativnu realizaciju pronalaska.
U sledećoj realizaciji predmetnog pronalaska, kompozicija dalje sadrži farmaceutski prihvatljiv konzervans. U sledećoj realizaciji predmetnog pronalaska, konzervans je izabran iz grupe koja se sastoji od fenola, o-krezola, m-krezola, p-kresola, metil-p-hidroksibenzoata, propil-p-hidroksi-benzoata, 2-fenoksietanola, butil phidroksibenzoata, 2 -feniletanola, benzil alkohola, hlorobutanola i tiomerozala, bronopola, benzoeve kiseline, imiduree, hloroheksidina, natrijum dehidroacetata, hlorokrezola, etil p-hidroksibenzoata, benzetonijum hlorida, hlorfenesina (3-(p-hlorfenoksi)propan-1,2-diol) ili njihovih smeša. U sledećoj realizaciji predmetnog pronalaska, konzervans je prisutan u koncentraciji od 0,1 mg/mL do 20 mg/mL. U sledećoj realizaciji predmetnog pronalaska, konzervans je prisutan u koncentraciji od 0,1 mg/mL do 5 mg/mL. U sledećoj realizaciji predmetnog pronalaska, konzervans je prisutan u koncentraciji od 5 mg/mL do 10 mg/mL. U sledećoj realizaciji predmetnog pronalaska, konzervans je prisutan u koncentraciji od 10 mg/mL do 20 mg/mL. Svaki od ovih specifičnih konzervanasa predstavlja alternativnu realizaciju pronalaska. Upotreba konzervansa u farmaceutskim kompozicijama dobro je poznata stručnjaku u tehnici. Radi praktičnosti pogledajte Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20<th>edition, 2000.
U daljoj realizaciji predmetnog pronalaska, kompozicija dalje sadrži izotonično sredstvo. U daljoj realizaciji predmetnog pronalaska, izotonično sredstvo je izabrano iz grupe koja se sastoji od soli (npr. natrijum hlorida), šećera ili šećernog alkohola, amino-kiseline (npr. L-glicin, L-histidin, arginin, lizin, izoleucin, asparaginska kiselina, triptofan, treonin),
alditola (npr. glicerol (glicerin), 1,2-propandiol (propilenglikol), 1,3-propandiol, 1,3-butandiol) polietilen glikol (npr. PEG 400) ili njihovih smeša. Bilo koji šećer, kao što su mono-, di- ili polisaharidi, ili vodotopivi glukani, uključujući, na primer, fruktozu, glukozu, manozu, sorbozu, ksilozu, maltozu, laktozu, saharozu, trehalozu, dekstran, pululan, dekstrin, ciklodekstrin, rastvorljivi skrob hidroksietilni skrob i karboksimetilceluloza-Na mogu se koristiti. U jednoj realizaciji, šećerni aditiv je saharoza. Šećerni alkohol je definisan kao C4-C8 ugljovodonik koji ima najmanje jednu -OH grupu i uključuje, na primer, manitol, sorbitol, inozitol, galakititol, dulcitol, ksilitol i arabitol. U jednoj realizaciji, aditiv šećernog alkohola je manitol. Gore spomenuti šećeri ili šećerni alkoholi mogu se koristiti pojedinačno ili u kombinaciji. Ne postoji fiksno ograničenje korišćene količine, sve dok su šećer ili šećerni alkohol rastvorljivi u tečnom preparatu i ne utiču negativno na stabilizujuće efekte dobijene postupcima predmetnog pronalaska. U jednoj realizaciji, koncentracija šećera ili šećernog alkohola je između oko 1 mg/mL i oko 150 mg/mL. U daljoj realizaciji predmetnog pronalaska, izotonično sredstvo je prisutno u koncentraciji od 1 mg/mL do 50 mg/mL. U daljoj realizaciji predmetnog pronalaska, izotonično sredstvo je prisutno u koncentraciji od 1 mg/mL do 7 mg/mL. U daljoj realizaciji predmetnog pronalaska, izotonično sredstvo je prisutno u koncentraciji od 8 mg/mL do 24 mg/mL. U daljoj realizaciji predmetnog pronalaska, izotonično sredstvo je prisutno u koncentraciji od 25 mg/mL do 50 mg/mL. Svako od ovih specifičnih izotoničnih sredstava predstavlja alternativnu realizaciju pronalaska. Upotreba izotoničnog sredstva u farmaceutskim kompozicijama dobro je poznata stručnjaku u tehnici. Radi praktičnosti pogledajte Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20<th>edition, 2000.
U daljoj realizaciji predmetnog pronalaska, kompozicija dalje sadrži helatno sredstvo. U daljoj realizaciji predmetnog pronalaska, helatno sredstvo je izabrano iz soli etilendiamintetrasirćetne kiseline (EDTA), limunske kiseline i asparaginske kiseline i njihovih smeša. U daljoj realizaciji predmetnog pronalaska, helatno sredstvo je prisutno u koncentraciji od 0,1 mg/mL do 5 mg/mL. U daljoj realizaciji predmetnog pronalaska, helatno sredstvo je prisutno u koncentraciji od 0,1 mg/mL do 2 mg/mL. U daljoj realizaciji predmetnog pronalaska, helatno sredstvo je prisutno u koncentraciji od 2 mg/mL do 5 mg/mL. Svako od ovih specifičnih helatnih sredstava predstavlja alternativnu realizaciju pronalaska. Upotreba helatnog sredstva u farmaceutskim kompozicijama je dobro poznata stručnjaku u tehnici. Radi praktičnosti pogledajte Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20<th>edition, 2000.
U daljoj realizaciji predmetnog pronalaska, kompozicija dalje sadrži stabilizator. Upotreba stabilizatora u farmaceutskim kompozicijama dobro je poznata poznata stručnjaku u tehnici. Radi praktičnosti pogledajte Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20<th>edition, 2000.
Preciznije, kompozicije predmetnog pronalaska su stabilizovane tečne farmaceutske kompozicije čije terapeutski aktivne komponente uključuju protein koji eventualno pokazuje stvaranje agregata tokom skladištenja u tečnim farmaceutskim kompozicijama. Pod „stvaranjem agregata“ podrazumeva se fizička interakcija između molekula proteina koja rezultira stvaranjem oligomera, koji mogu ostati rastvorljivi, ili velikih vidljivih agregata koji se talože iz rastvora. Pod „tokom skladištenja“ podrazumeva se tečna farmaceutska kompozicija ili kompozicija koja kada je jednom pripremljena nije odmah data subjektu. Umesto toga se, nakon pripreme, pakuje za čuvanje, bilo u tečnom obliku, u zamrznutom stanju, ili u osušenom obliku radi kasnije rekonstitucije u tečni oblik ili drugi oblik pogodan za davanje subjektu. Pod „osušenim oblikom“ podrazumeva se tečna farmaceutska kompozicija ili kompozicija osušena zamrzavanjem (tj., liofilizacijom; videti, na primer, Williams and Polli, J. Parenteral Sci. Technol.,38, 48-59, (1984)), osušena raspršivanjem (videti Masters (1991) in Spray-Drying Handbook (5<th>ed; Longman Scientific and Technical, Essez, U.K.), pp. 491-676;
Broadhead et al. Drug Devel. Ind. Pharm. 18, 1169-1206, (1992); and Mumenthaler et al., Pharm. Res., 11, 12-20, (1994)), ili osušena vazduhom (Carpenter and Crowe, Cryobiology25, 459-470, (1988); and Roser, Biopharm. 4, 47-53, (1991)). Formiranje proteina tokom skladištenja tečne farmaceutske kompozicije može negativno uticati na biološku aktivnost tog proteina, što ima za rezultat gubitak terapijske efikasnosti farmaceutske kompozicije. Pored toga, formiranje agregata može izazvati druge probleme, kao što su začepljenje cevi, membrana ili pumpi kada se farmaceutska kompozicija koja sadrži proteine daje putem infuzionog sistema.
Farmaceutske kompozicije pronalaska mogu dalje da sadrže količinu baze amino-kiselina dovoljnu da smanji stvaranje agregata od strane proteina tokom skladištenja kompozicije. Pod „bazom amino-kiselina“ podrazumeva se amino-kiselina ili kombinacija amino-kiselina, pri čemu je bilo koja data amino-kiselina prisutna ili u svom slobodnom baznom obliku ili u obliku soli. Kada se koristi kombinacija amino-kiselina, sve amino-kiseline mogu biti prisutne u svojim slobodnim baznim oblicima, sve mogu biti u obliku soli, ili neke mogu biti prisutne u slobodnim baznim oblicima, dok su druge prisutne u njihovim oblicima soli . U jednoj realizaciji aspektu, amino-kiseline koje se koriste u pripremi kompozicija predmetnog pronalaska su one koje nose naelektrisani bočni lanac, kao što su arginin, lizin, asparaginska kiselina i glutaminska kiselina. Bilo koji stereoizomer (tj. L ili D izomer ili njihove smeše) određene amino-kiseline (metionin, histidin, arginin, lizin, izoleucin, asparaginska kiselina, triptofan, treonin i njihove smeše) ili kombinacije ovih stereoizomera ili glicin ili organska baza kao što je imidazol, mogu biti prisutni u farmaceutskim kompozicijama pronalaska sve dok je određena amino-kiselina ili organska baza prisutna ili u obliku slobodne baze ili u obliku soli. U jednoj realizaciji se koristi L-stereoizomer amino-kiseline. U jednoj realizaciji se koristi L-stereo izomer. Kompozicije predmetnog pronalaska mogu takođe da budu formulisane sa analozima ovih amino-kiselina. Pod „analogom aminokiselina“ podrazumeva se derivat amino-kiseline koja se prirodno pojavljuje koja postiže željeni efekat na smanjenje stvaranja agregata od strane proteina tokom skladištenja tečnih farmaceutskih kompozicija pronalaska.
Pogodni analozi arginina uključuju, na primer, aminoguanidin, ornitin i N-monoetil L-arginin, pogodni analozi metionina uključuju etionin i butionin, a pogodni analozi cisteina uključuju S-metil-L cistein. Kao i kod drugih amino-kiselina, analozi amino-kiselina su ugrađeni u kompozicije bilo u njihovom slobodnom baznom obliku, bilo u obliku soli. U daljoj realizaciji predmetnog pronalaska, amino-kiseline ili analozi amino-kiselina se koriste u koncentraciji, koja je dovoljna da spreči ili odloži agregaciju proteina.
U daljoj realizaciji predmetnog pronalaska, metionin (ili drugi sumporni amino-kiseline ili analozi aminokiseline) može se dodati da inhibira oksidaciju metioninskih ostataka do metionin sulfoksida kada je protein koji deluje kao terapeutsko sredstvo protein koji sadrži najmanje jedan ostatak metionina koji je podložan takvoj oksidaciji. Pod „inhibiranjem“ podrazumeva se minimalno nakupljanje metioninskih oksidacionih vrsta tokom vremena. Inhibiranje oksidacije metionina rezultira većim zadržavanjem proteina u njegovom pravilnom molekularnom obliku. Može se koristiti bilo koji stereoizomer metionina (L ili D izomer) ili bilo koja njihova kombinacija. Količina koja se dodaje treba biti količina dovoljna da inhibira oksidaciju ostataka metionina tako da je količina metionin sulfoksida prihvatljiva za regulatorne agencije. Obično to znači da kompozicija ne sadrži više od oko 10% do oko 30% metionin sulfoksida.
Uopšteno govoreći, ovo se može dobiti dodavanjem metionina tako da se odnos metionina koji je dodat ostacima metionina kreće od oko 1:1 do oko 1000: 1, kao što je 10:1 do oko 100:1.
U daljoj realizaciji predmetnog pronalaska, kompozicija dalje sadrži stabilizator izabran iz grupe polimera visoke molekularne mase ili jedinjenja niske molekularne mase. U daljoj realizaciji predmetnog pronalaska, stabilizator je izabran od polietilen glikola ((npr. PEG 3350), polivinil alkohola (PVA), polivinilpirolidona, karboksi- / hidroksiceluloze ili njihovih derivata (npr. HPC, HPC-SL, HPC-L i HPMC), ciklodekstrini, supstance koje sadrže sumpor kao monotioglicerol, tioglikolna kiselina i 2-metiltioetanol, i različite soli (e.g. natrijum-hlorid). Svaki od ovih specifičnih stabilizatora predstavlja alternativnu realizaciju pronalaska.
Farmaceutske kompozicije mogu, takođe, da sadrže dodatna stabilizujuća sredstva koja dodatno povećavaju stabilnost terapeutski aktivnog proteina u njima.
Stabilizujuća sredstva od posebnog interesa za ovaj pronalazak uključuju metionin i EDTA, koji štite protein od oksidacije metionina, i nejonsko površinski aktivno sredstvo koje štiti protein od agregacije povezane sa zamrzavanjem-otapanjem ili mehaničkim cepanjem.
U daljoj realizaciji predmetnog pronalaska, kompozicija dalje sadrži surfaktant U daljoj realizaciji predmetnog pronalaska, surfaktant je izabran iz detergenata, etoksilovanog ricinusovog ulja, poliglikolizovanih glicerida, acetilovanih monoglicerida, estara masnih kiselina sorbitana, polioksipropilenpolioksietilen blok polimera (npr. poloksameri kao što su Pluronic<®>F68, poloksamer 188 i 407, Triton X-100), estara masne kiseline polioksietilen sorbitana, derivata polioksietilena i polietilena, kao što su alkilovani i alkoksilovani derivati (tweens, npr. Tween-20, Tween-40, Tween-80 i Brij-35), monogliceridi ili njihovi etoksilovani derivati, diglicerida ili njihovih polioksietilenskih derivata, alkohola, glicerola, lektina i fosfolipida (npr. fosfatidil serin, fosfatidil holin, fosfatidil etanolamin, fosfatidil inozitol, difosfatidil glicerol i sfingomijelin), derivata fosfolipida (npr. dipalmitoil fosfatidna kiselina) i lizofospholipida (npr. palmitoil lizofosfatidil-L-serin i 1-acil-sn-glicero-3-fosfatni estri etanolamina, holina, serina ili treonina) i alkila, alkoksila (alkil estar), alkoksi (alkil etar)- derivati lizofosfatidila i fosfatidilholina, npr.] lauroil i miristoil derivati lizofosfatidilholina,
dipalmitoilfosfatidilholina i modifikacije grupe polarne glave, odnosno holini, etanolamina, fosfatidna kiselina, serini, threonini, glicerol, inozitol, i pozitivno naelektrisanih DODAC, DOTMA, DCP, BISHOP, lizofosfatidilserina i lizofosfatidiltreonina, i glicerofosfolipida (npr. cefalini), gliceroglikolipida (npr. galaktopiranzoid), sfingoglikolipida (npr. ceramidi, gangliozidi), dodecilfosfoholina, lizolekitina kokošjih jaja, derivata fuzidinske kiseline (npr. natrijum taurodihidrofusidat, itd.) masne kiseline dugih lanaca i njihove soli C6-C12(npr. oleinska kiselina i kaprilna kiselina), acilkarnitina i derivata, N<α>-aciliranih derivata lizina, arginina ili histidina, ili acilirani derivati bočnog lanca lizina ili arginina, N<α>-aciliranih derivata dipeptida koji sadrže bilo koju kombinaciju lizina, arginina ili histidina i neutralnu ili kiselu amino-kiselinu, N<α>-aciliranog derivata tripeptida koji sadrži bilo koju kombinaciju neutralne amino-kiseline i dve naelektrisane aminokiseline, DSS (dokusat natrijum, CAS reg. broj [577-11-7]), dokusat kalcijum, CAS registarski broj [128-49-4]), dokusat kalijum, CAS registarski broj [7491-09-0]), SDS (natrijum dodecil sulfat ili natrijum lauril sulfat), natrijum kaprilata, holne kiseline ili njenih derivata, žučne kiseline i njenih soli i konjugata glicina ili taurina, ursodeoksiholne kiseline, natrijum-holata, natrijumdeoksilata, natrijum-tauroholata, natrijum-glikoholata, N-heksadecil-N,N-dimetil-3-amonio-1-propanesulfonata, anjonskih (alkil-aril-sulfonati) monovalentnih surfaktanata, cviterjonskih surfaktanata (npr. N-alkil-N,N-dimetilamonio-1-propanesulfonati, 3-holamido-1-propildimetilamonio-1-propanesulfonata), katjonskih surfaktanata (četvrtinske amonijum baze) (e.g. cetiltrimetilamonijev bromid, cetilpiridinijum hlorid), nejonskih surfaktanata (npr. dodecil β-D-glukopiranozid), poloksamini (npr. Tetronic), koji su tetrafunkcionalni blok kopolimeri izvedeni iz sekvencijalnog dodavanja propilen oksida i etilen oksida etilendiaminu, ili surfaktant može biti izabran iz grupe derivata imidazolina, ili njihovih smeša. Svaki od ovih specifičnih surfaktanata predstavlja alternativnu realizaciju ovog pronalaska.
Upotreba surfaktanata u farmaceutskim kompozicijama dobro je poznata stručnjaku u tehnici. Radi praktičnosti pogledajte Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20<th>edition, 2000.
Moguće je da drugi sastojci mogu biti prisutni u farmaceutskom sastavu ovog pronalaska. Takvi dodatni sastojci mogu da uključuju sredstva za vlaženje, emulgatore, antioksidante, sredstva za povećanje volumena, modifikatore toničnosti, helatna sredstva, metalne jone, uljane nosače, proteine (npr. albumin iz humanog seruma, želatin ili proteine) i cviterjon (npr. amino-kiselina kao što je betain, taurin, arginin, glicin, lizin i histidin). Takvi dodatni sastojci, naravno, ne bi trebalo da negativno utiču na ukupnu stabilnost farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska.
Farmaceutske kompozicije koje sadrže konjugat hormona rasta prema ovom pronalasku mogu se dati pacijentu kome je potreban takav tretman na više mesta, na primer, na lokalnim mestima, na primer, na koži i sluzokoži, na mestima koja zaobilaze apsorpciju, na primer , davanje u arteriju, venu, srce i na mestima koja uključuju apsorpciju, na primer, unošenje u kožu, ispod kože, u mišiće ili abdomena.
Davanje farmaceutskih kompozicija prema pronalasku može biti preko nekoliko načina primene, na primer, jezično, podjezično, bukalno, u ustima, oralno, u stomaku i crevima, nazalno, plućno, na primer, kroz bronhiole i alveole ili njihova kombinacija, epidermalno, dermalno, transdermalno, vaginalno, rektalno, preko očiju, na primer kroz konjuktivu, uretalno i parenteralno za pacijente kojima je potreban takav tretman.
Kompozicije predmetnog pronalaska mogu se primeniti u više doznih oblika, na primer, u obliku rastvora, suspenzija, emulzija, mikroemulzija, višestruke emulzije, pene, melema, paste, gipsa, masti, tableta, obloženih tableta, ispiranja, kapsula, na primer, tvrde želatinske kapsule i meke želatinske kapsule, čepića, rektalnih kapsula, kapi, gelova, sprejeva, praška, aerosola, inhalatora, kapi za oči, masti za oči, ispiranja za oči, vaginalnih pesara, vaginalnih prstenova, vaginalne masti, rastvora za injekcije, in situ transformišućih rastvora, na primer in situ geliranje, in situ podešavanje, in situ taloženje, in situ kristalizacija, rastvora za infuziju i implantata.
Kompozicije predmetnog pronalaska mogu se dalje kombinovati ili vezivati, na primer, kroz kovalentne, hidrofobne i elektrostatičke interakcije, nosač lekova, sistem za isporuku lekova i napredni sistem za davanje lekova da bi se dodatno poboljšala stabilnost konjugata hormona rasta, povećala bioraspoloživost, povećavala rastvorljivost, smanjili štetni efekti, postigla hronoterapija dobro poznata stručnjacima u tehnici i povećao odgovor pacijenta ili bilo koja kombinacija istih. Primeri nosača, sistema za dostavu lekova i naprednih sistema za dostavu lekova uključuju polimere, na primer celulozu i derivate, polisaharide, na primer dekstran i derivate, skrob i derivate, poli(vinil alkohol), akrilatne i metakrilatne polimere, polilaktičku i poliglikolnu kiselinu i blok njihovih kopolimera, polietilen glikole, proteinske nosače, na primer albumin, gelove, na primer, termogelirajući sistemi, na primer, kopolimerne blok sisteme dobro poznate stručnjacima, micele, lipozome, mikrosfere, nanočestice, tečne kristale i njihove disperzije, L2 fazu i njene disperzije, dobro poznate stručnjacima u tehnici koji poznaju fazno ponašanje u lipidno-vodenim sistemima, polimerne micele, višestruke emulzije, samoemulgatore, samomikroemulgatore, ciklodekstrine i njihove derivate i dendrimere.
Kompozicije predmetnog pronalaska su korisne u kompozicijama čvrstih supstanci, polučvrstih soli, praška i rastvora za plućnu primenu konjugata hormona rasta, korišćenjem, na primer, inhalatora za odmerenu dozu, inhalatora za suvi prah i nebulizatora, a sve su to uređaji dobro poznati stručnjacima u tehnici.
Kompozicije predmetnog pronalaska su posebno korisne u kompozicijama kontrolisanih, zadržanih, produženih, retardiranih sistema i sistema za sporo otpuštanje lekova. Preciznije, kompozicije su korisne u kompozicijama parenteralnog sistema za kontrolisano oslobađanje i sa produženim oslobađanjem (oba sistema koja vode do višestrukog smanjenja broja primena), dobro poznatih stručnjacima u tehnici. Još poželjniji su sistemi sa kontrolisanim oslobađanjem i produženim oslobađanjem koji se primenjuju potkožno. Bez ograničavanja obuhvata ovog pronalaska, primeri korisnog sistema i kompozicija za kontrolisano oslobađanje su hidrogelovi, masni gelovi, tečni kristali, polimerni miceli, mikrosfere, nanočestice, Postupci za proizvodnju sistema sa kontrolisanim oslobađanjem korisnog za kompozicije predmetnog pronalaska uključuju kristalizaciju, kondenzaciju, kokristalizaciju, taloženje, kotaloženje, emulgiranje, disperziju, homogenizaciju pod visokim pritiskom, inkapsulaciju, sušenje raspršivanjem, mikrokapsulaciju, koacervaciju, razdvajanje faza, isparavanje rastvarača da bi se proizvele mikrosfere, ekstruzija i superkritični tečni procesi. Opšta referenca je u odnosu na Handbook of Pharmaceutical Controlled Release (Wise, D.L., ed. Marcel Dekker, New York, 2000) i Drug and the Pharmaceutical Sciences vol. 99: Sastav i isporuka proteina (MacNally, E.J., ed. Marcel Dekker, New York, 2000).
Parenteralno davanje može biti izvedeno supkutanom, intramuskularnom, intraperitonealnom ili intravenskom injekcijom pomoću šprica, opciono šprica nalik olovci.
Alternativno, parenteralna primena može biti izvedena pomoću infuzione pumpe. Sledeća opcija je kompozicija koja može biti rastvor ili suspenzija za primenu konjugata hormona rasta u obliku nazalnog ili plućnog spreja. Kao još dodatna opcija, farmaceutske kompozicije koji sadrže konjugat hormona rasta pronalaska mogu se, takođe, prilagoditi transdermalnoj primeni, npr. primeni injekcijom bez igle ili iz flastera, opcionalno jontoforeznog flastera, ili transmukoznog, npr. bukalno.
Izraz „stabilizovana kompozicija“ se odnosi na kompoziciju sa povećanom fizičkom stabilnošću, povećanom hemijskom stabilnošću ili povećanom fizičkom i hemijskom stabilnošću.
Izraz „fizička stabilnost“ proteinske kompozicije se odnosi na sklonost proteina da formira biološki neaktivne i/ili nerastvorljive agregate proteina kao rezultat izlaganja proteina termomehaničkom naprezanju i/ili interakciji sa destabilizujućim interfejsima i površinama, kao što su hidrofobne površine i interfejsi. Fizička stabilnost vodenih proteinskih kompozicija se procenjuje pomoću vizuelne inspekcije i/ili merenja zamućenosti nakon izlaganja preparata ispunjenog u pogodnim posudama (npr. patronama ili bočicama) mehaničkom/fizičkom naprezanju (npr. mešanju) na različitim temperaturama tokom različitog vremenskog trajanja. Vizuelna kontrola kompozicija vrši se na oštrom usmerenom svetlu sa tamnom pozadinom. Zamućenost kompozicije je okarakterisana vizuelnim rezultatom koji određuje stepen zamućenosti, na primer na skali od 0 do 3 (kompozicija koja ne pokazuje zamućenost odgovara vizuelnoj oceni 0, a kompozicija koja pokazuje vizuelnu zamućenost na dnevnoj svetlosti odgovara vizuelnom rezultatu 3).
Kompozicija je klasifikovana kao fizički nestabilna u pogledu agregacije proteina, kada pokazuje vizuelnu zamućenost na dnevnom svetlu. Alternativno, zamućenost kompozicije može se proceniti jednostavnim merenjem zamućenosti koje je dobro poznato stručnjaku. Fizička stabilnost vodenih proteinskih kompozicija može se, takođe, proceniti korišćenjem spektroskopskog agensa ili probe konformacionog statusa proteina. Proba je poželjno mali molekul koji se preferentno vezuje za nenativni konformer proteina. Jedan primer male molekularne spektroskopske probe proteinske strukture je tioflavin T. Tioflavin T je fluorescentna boja koja se široko koristi za detekciju amiloidnih fibrila. U prisustvu fibrila, a možda i drugih proteinskih konfiguracija, tioflavin T dovodi do novog maksimuma ekscitacije na oko 450 nm i pojačane emisije na oko 482 nm kada se vezuje za oblik fibrilnog proteina.
Nevezani tioflavin T je u suštini nefluorescentan na talasnim dužinama.
Ostali mali molekuli mogu se koristiti kao sonde za promenu strukture proteina iz nativnih u nenativna stanja. Na primer, sonde za „hidrofobne oblasti“ koje imaju prednost da se vežu na izložene hidrofobne oblasti proteina. Hidrofobni oblasti su uglavnom duboko unutar tercijarne strukture proteina u njegovom izvornom stanju, ali postaju izloženi kada se protein počne razbijati ili denaturirati. Primeri ovih malih molekularnih, spektroskopskih sondi su aromatična, hidrofobna bojila, poput antracena, akridina, fenantrolina ili slično. Ostale spektroskopske sonde su kompleksi metal - amino-kiselina, poput kompleksa metala kobalta hidrofobnih amino-kiselina, poput fenilalanina, leucina, izoleucina, metionina i valina ili slično.
Izraz „hemijska stabilnost“ proteinske kompozicije, kako je ovde upotrebljen, odnosi se na hemijske promene u kovalentnoj strukturi proteina, što dovodi do stvaranja hemijskih proizvoda degradacije sa potencijalno manjom biološkom potentnošću i/ili potencijalno povećanim imunogenim svojstvima u poređenju sa strukturom prirodnog proteina. Različiti proizvodi hemijske degradacije mogu da se formiraju u zavisnosti od tipa i prirode prirodnog proteina i sredine kojoj je protein izložen. Eliminacija hemijske razgradnje najverovatnije se ne može u potpunosti izbeći, a sve veće količine proizvoda hemijske razgradnje često se vide tokom skladištenja i upotrebe proteinskog sastava, kao što je dobro poznato stručnjaku u tehnici. Većina proteina je podložna deamidaciji, procesu u kome se amidna grupa bočnog lanca u glutaminilnim ili asparaginilnim ostacima hidrolizuje da bi se formirala slobodna karboksilna kiselina. Drugi putevi degradacije uključuju stvaranje transformacionih proizvoda visoke molekulske mase gde su dva ili više proteinskih molekula kovalentno vezani jedan za drugi preko transamidacije i/ili interakcije disulfida što dovodi do stvaranja kovalentno vezanih dimera, oligomera i polimerskih proizvoda degradacije (Stability of Protein Pharmaceuticals, Ahern. T.J. & Manning M.C., Plenum Press, New York 1992).
Oksidacija (npr. metioninskih ostataka) može se pomenuti kao druga varijanta hemijske degradacije. Hemijska stabilnost proteinske kompozicije može se proceniti merenjem količine proizvoda hemijske degradacije u različitim vremenskim tačkama nakon izlaganja različitim uslovima okoline (formiranje proizvoda degradacije se često može ubrzati, na primer, povećanjem temperature). Količina svakog pojedinačnog proizvoda degradacije se često određuje razdvajanjem proizvoda degradacije u zavisnosti od veličine i/ili naelektrisanja molekula korišćenjem različitih tehnika hromatografije (e.g. SEC-HPLC i/ili RP-HPLC).
Prema tome, kao što je prethodno naznačeno, „stabilizovana kompozicija“ odnosi se na kompoziciju sa povećanom fizičkom stabilnošću, povećanom hemijskom stabilnošću ili povećanom fizičkom i hemijskom stabilnošću. Uopšteno, kompozicija mora biti stabilna tokom upotrebe i skladištenja (u skladu sa preporučenom upotrebom i uslovima skladištenja) do isteka roka trajanja.
U jednoj realizaciji predmetnog pronalaska, farmaceutska kompozicija koja sadrži konjugat hormona rasta formule (I) ili (II) je stabilna više od 6 nedelja tokom upotrebe i više od 3 godine skladištenja.
U drugoj realizaciji predmetnog pronalaska, farmaceutska kompozicija koja sadrži konjugat hormona rasta formule (I) ili (II) je stabilna više od 4 nedelje tokom upotrebe i više od 3 godine skladištenja.
U daljoj realizaciji predmetnog pronalaska, farmaceutska kompozicija koja sadrži konjugat hormona rasta formule (I) ili (II) je stabilna više od 4 nedelje tokom upotrebe i više od dve godine skladištenja.
U još daljoj realizaciji predmetnog pronalaska, farmaceutska kompozicija koja sadrži konjugat hormona rasta formule (I) ili (II) je stabilna više od 2 nedelje tokom upotrebe i više od dve godine skladištenja.
Izrazi „a“ i „an“ i „the“ (u engleskom jeziku) i slične oznake koji se koriste u kontekstu opisivanja pronalaska treba da budu tumačeni tako da obuhvataju jedninu i množinu (tj. jedan ili više), osim ako je ovde drugačije naznačeno ili jasno suprotstavljeno kontekstom.
Izlistavanje raspona vrednosti ovde je samo da služi kao skraćeni metod pojedinačnog pozivanja na svaku odvojenu vrednost koja spada u raspon, osim ako nije navedeno drugačije, a svaka odvojena vrednost je uključena u specifikaciju kao da je ovde pojedinačno navedena. Ako nije drugačije navedeno, sve tačne vrednosti date ovde su reprezentativne za odgovarajuće približne vrednosti mpr. sve tačne ogledne vrednosti koje se daju u vezi sa određenim faktorom ili merenjima mogu se smatrati da pružaju odgovarajuće približno merenje, modifikovano sa „oko“, gde je to potrebno).
Svi ovde opisani postupci mogu se izvesti u bilo kom pogodnom redosledu osim ako nije ovde navedeno drugačije ili ako nije na drugi način jasno suprotstavljeno kontekstu.
Upotreba bilo kog i svih primera ili jezika primera (npr., „kao što je“) ovde je predviđena samo za bolje razjašnjavanje pronalaska.
Citiranje patentnih dokumenata u ovom dokumentu vrši se samo radi praktičnosti i ne odražava bilo kakav pogled na validnost, patentabilnost i/ili izvodljivost takvih patentnih dokumenata.
Lista realizacija koje opisuju pronalazak, ali ne čine njegov deo, data je u daljem tekstu.
Lista realizacija (nije prema patentnim zahtevima) Realizacija 1: Konjugat hormona rasta koji sadrži jedinjenje hormona rasta (GH) koje ima
a) pojedinačnu Cys mutaciju,
b) dodatni disulfidni most, ili
c) pojedinačnu Cys mutaciju i dodatni disulfidni most, pri čemu je ostatak koji vezuje albumin preko hidrofilnog spejsera vezan sa datim GH, ili
njihovom farmaceutski prihvatljivom soli.
2. Konjugat realizacije 1, pri čemu GH predstavlja jedinjenje hormona rasta koje sadrži sekvencu aminokiseline koja ima najmanje 80% identičnosti sa sekvencom amino-kiseline humanog hormona rasta (hGH) (SEQ ID NO: 1), kao što je najmanje 80% , najmanje 85%, najmanje 90% ili najmanje 95% identitičnosti sa hGH, ili GH je hGH (SEQ ID NO: 1).
3. Konjugat realizacije 1, pri čemu GH ili GH konjugat ima najmanje 80% aktivnosti hormona rasta hGH.
4. Konjugat bilo koje realizacije 1-3, naznačen time što je ostatak koji vezuje albumin preko hidrofilnog spejsera vezan za GH koji ima pojedinačnu Cys mutaciju.
5. Konjugat realizacije 4, pri čemu je pojedinačna Cys mutacija pozicionirana u bilo kojoj od regija odabranih između N-kraja, H1, H2, L2 ili H3 od GH.
6. Konjugat realizacije 5, pri čemu GH ima pojedinačnu Cys mutaciju izabranu iz bilo koje od T3C, P5C, S7C, D11C, H18C, Q29C, E30C, E33C, A34C, Y35C,E88C, Q91C, S95C, A98C, N99C, S100C, L101C, V102C, Y103C, D107C, S108C, D112C, Q122C i G126C.
7. Konjugat bilo koje realizacije 1-3, naznačen time što je ostatak koji vezuje albumin preko hidrofilnog spejsera vezan za GH koji ima dodatni disulfidni most.
8. Konjugat realizacije 7, pri čemu dodatna disulfidna veza je između segmenta petlje i spiralnog segmenta ili unutar segmenta petlje ili između segmenata petlje ili između spiralnih segmenata.
9. Konjugat bilo koje realizacije 7-8, pri čemu GH sadrži dodatnu disulfidnu vezu u kojoj je barem jedan cistein prisutan u segmentu petlje, poput ostataka amino-kiselina 128-154 (L3).
10. Konjugat bilo koje realizacije 7-9, pri čemu GH sadrži dodatnu disulfidnu vezu pri čemu dodatna disulfidna veza povezuje segment petlje sa spiralnim segmentom, kao što su spirala B ili H2.
11. Konjugat bilo koje realizacije 7-10, pri čemu dodatna disulfidna veza povezuje L3 sa H2.
12. Konjugat bilo koje realizacije 7-11, pri čemu je dodatni disulfidni most između najmanje jednog para amino-kiselina na pozicijama koje odgovaraju R16C/L117C, A17C/E174C, H21C/M170C, D26C/V102C, D26C/Y103C, N47C/T50C, Q49C/G161C, F54C/Y143C, F54C/S144C, F54C/F146C, S55C/Y143C, S57C/Y143C, I58C/Q141C, I58C/Y143C, I58C/S144C, P59C/Q137C, P61C/E66C, P61C/T67C, S71C/S132C, L73C/S132C, L73C/F139C, R77C/I138C, R77C/F139C, L81C/Q141C, L81C/Y143C, Q84C/Y143C, Q84C/S144C, S85C/Y143C, S85C/S144C, P89C/F146C, F92C/F146C, F92C/T148C, R94C/D107C, V102C/A105C, L156C/F146C, L156C/T148C i/ili V185C/S188C u hGH (SEQ ID NO: 1), kao što Q84C/Y143C.
13. Konjugat bilo koje realizacije 1-3, naznačen time što je ostatak koji vezuje albumin preko hidrofilnog spejsera povezan sa GH koji ima pojedinačnu Cys mutaciju i dodatni disulfidni most.
14. Konjugat iz realizacije 13, pri čemu GH ima jednu Cys mutaciju izabranu iz bilo koje od T3C, P5C, S7C, D11C, H18C, Q29C, E30C, E33C, A34C, Y35C, Y42C, S55C, S57C, S62C, Q69C, E88C, Q91C, S95C, A98C, N99C, S100C, L101C, V102C, Y103C, D107C, S108C, D112C, Q122C i G126C.
15. Konjugat bilo koje realizacije 13-14, pri čemu je dodatna disulfidna veza između petljeg segmenta i spiralnog segmenta ili unutar segmenta petlje ili između segmenata petlje ili između spiralnih segmenata.
16. Konjugat bilo koje realizacije 13-15, pri čemu GH sadrži dodatnu disulfidnu vezu u kojoj je barem jedan cistein prisutan u segmentu petlje, poput ostataka aminokiselina 128-154 (L3).
17. Konjugat bilo koje realizacije 13-16, pri čemu GH sadrži dodatnu disulfidnu vezu, pri čemu je dodatna disulfidna veza koja povezuje segment petlje, sa spiralnim segmentom, kao što su spirala B ili H2.
18. Konjugat bilo koje realizacije 13-17, pri čemu dodatna disulfidna veza povezuje segment petlje, poput ostataka amino-kiselina 128-154 (L3), sa spiralom B ili H2.
19. Konjugat bilo koje realizacije 13-18, pri čemu je dodatni disulfidni most između najmanje jednog para aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju R16C/L117C, A17C/E174C, H21C/M170C, D26C/V102C, D26C/Y103C, N47C/T50C, Q49C/G161C, F54C/Y143C, F54C/S144C, F54C/F146C, S55C/Y143C, S57C/Y143C, I58C/Q141C, I58C/Y143C, I58C/S144C, P59C/Q137C, P61C/E66C, P61C/T67C, S71C/S132C, L73C/S132C, L73C/F139C, R77C/I138C, R77C/F139C, L81C/Q141C, L81C/Y143C, Q84C/Y143C, Q84C/S144C, S85C/Y143C, S85C/S144C, P89C/F146C, F92C/F146C, F92C/T148C, R94C/D107C, V102C/A105C, L156C/F146C, L156C/T148C i/ili V185C/S188C u hGH (SEQ ID NO: 1), kao što je Q84C/Y143C.
20. Konjugat bilo koje od realizacije 1-19, pri čemu je ostatak koji vezuje albumin izabran iz
pri čemu * označava vezanje na hidrofilni spejser preko hemijske grupe koja povezuje ostatak koji veže albumin i hidrofilni spejser.
21. Konjugat bilo koje realizacije 1-20, pri čemu hemijska grupa koja povezuje ostatak koji vezuje albumin i hidrofilni spejser ima formulu
-W7-Y-,
pri čemu
Y je -(CH2)I7-C3-10-cikloalkil-W8- ili valentna veza, I7 je 0-6,
W7je izabrano iz -C(O)NH-, -NHC(O)-, -C(O)NHCH2-, -CH2NHC(O)-,
-C(O)NHS(O)2-, -S(O)2NHC(O)-, -OC(O)NH-, -NHC(O)O-,
-C(O)CH2-, -CH2C(O)-, -C(O)CH=CH-, -CH=CHC(O)-,
-(CH2)s3-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)- ili valentna veza; pri čemu s3 je 0 ili 1,
W8je izabrano iz -C(O)NH-, -NHC(O)-, -C(O)NHCH2-, -CH2NHC(O)-,
-C(O)NHS(O)2-, -S(O)2NHC(O)-, -OC(O)NH-, -NHC(O)O-,
-C(O)CH2-, -CH2C(O)-, -C(O)CH=CH-, -CH=CHC(O)-,
-(CH2)s4-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)- ili valentna veza; pri čemu s4 je 0 ili 1.
22. Konjugat bilo koje realizacije 1-21, pri čemu hidrofilni spejser ima formulu
-X1-X2-X3-X4-pri čemu
X1je -W1-[(CHR<1>)I1-W2]m1-{[(CH2)n1E1]m2-[(CHR<2>)I2-W3]m3}n2-,
X2je -[(CHR<3>)I3-W4]m4-{[(CH2)n3E2]m5-[(CHR<4>)I4-W5]m6}n4-, X3je -[(CHR<5>)I5-W6]m7-,
X4je F-D1-(CH2)I6-D2-,
I1, I2, I3, I4, I5 i I6 nezavisno su izabrani iz 0-16,
m1, m3, m4, m6 i m7 nezavisno su izabrani iz 0-10, m2 i m5 nezavisno su izabrani iz 0-25,
n1, n2, n3 i n4 nezavisno su izabrani iz 0-16,
F je aril, hetaril, pirolidin-2,5-dion ili valentna veza, pri čemu arilne i
hetarilne grupe su opciono supstituisane halogenom, -CN, -OH, -C(O)OH,
-C(O)NH2, -S(O)2OH ili C1-6-alkilom,
R<1>, R<2>, R<3>, R<4>i R<5>su nezavisno izabrani od vodonika, -C(O)OH,
-C(O)NH2, -S(O)OH, -S(O)2OH, -NH-C(=NH)- NH2, C1-6-
alkila, arila ili hetarila; pri čemu su alkilne, arilne i hetarilne grupe opciono supstituisane halogenom, -C(O)OH, -C(O)NH2, -S(O)OH, -S(O)2OH, -CN ili -OH,
D1, D2, E1 i E2 nezavisno su izabrani iz -O-, -N(R<6>)-, -N(C(O)R<7>)- ili su
valentna veza; pri čemu R<6>i R<7>nezavisno predstavljaju vodonik ili C1-6-alkil,
W1do W5nezavisno su izabrani iz -C(O)NH-, -NHC(O)-,
-C(O)NHCH2-, -CH2NHC(O)-, -C(O)NHS(O)2-, -
S(O)2NHC(O)-, -OC(O)NH-, -NHC(O)O-, -C(O)CH2-,
-CH2C(O)-, -C(O)CH=CH-, -CH=CHC(O)-, -(CH2)s2-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)- ili valentna veza; pri čemu s2 je 0 ili 1,
W6je izabrano iz -C(O)NH-, -NHC(O)-, -C(O)NHCH2-, -CH2NHC(O)-,
-C(O)NHS(O)2-, -S(O)2NHC(O)-, -OC(O)NH-, -NHC(O)O-,
-C(O)CH2-, -CH2C(O)-, -C(O)CH=CH-, -CH=CHC(O)-,
-(CH2)s1-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -NHC(O)C1-6-alkila, -C(O)NHC1-6-alkila ili valentna veza; pri čemu s1 je 0 ili 1 i C1-6-alkil grupa je opciono supstituisana sa okso, pirolidin-2,5-dionom,
-NHC(O)CH*CH2COOH ili -NHC(O)CH2CH*COOH; pri čemu ( * ) označava tačku vezivanja atoma ugljenika iz CH za X4.
23. Konjugat bilo koje realizacije 1-22, pri čemu je X4valentna veza i W6je izabran iz bilo pirolidin-2,5-diona, -NHC(O)CH*CH2COOH ili
-NHC(O)CH2CH*COOH pri čemu ( * ) označava tačku vezivanja atoma ugljenika iz CH za GH.
24. Konjugat realizacije 22, pri čemu je hidrofilni spejser izabran iz
25. Konjugat hormona rasta u kojem konjugat hormona rasta ima formulu (I):
A-W-B-GH (I)
Pri čemu
GH predstavlja jedinjenje hormona rasta sa jednom Cys mutacijom,
B predstavlja hidrofilni spejser povezan sa sumpornim ostatkom Cys mutacije,
W je hemijska grupa koja vezuje A i B, i
A predstavlja ostatak koji vezuje albumin; i
njihove farmaceutski prihvatljive soli.
26. Konjugat realizacije 25, pri čemu GH predstavlja jedinjenje hormona rasta koje sadrži sekvencu aminokiseline koja ima najmanje 80% identičnosti sa sekvencom amino-kiseline humanog hormona rasta (hGH) (SEQ ID NO: 1), kao što je najmanje 80% , najmanje 85%, najmanje 90% ili najmanje 95% identičnosti sa hGH, ili GH je hGH (SEQ ID NO: 1).
27. Konjugat realizacije 25, pri čemu GH ili GH konjugat ima najmanje 80% aktivnosti hormona rasta kod hGH.
28. Konjugat bilo koje od realizacija 25-27, pri čemu je pojedinačna Cys mutacija pozicionirana u bilo kojoj od regija izabranih iz N-kraja, H1, H2, L2 ili H3 GH-a.
29. Konjugat bilo koje realizacije 25-28, pri čemu GH ima jednu Cys mutaciju izabranu iz bilo kojeg od: T3C, P5C, S7C, D11C, H18C, Q29C, E30C, E33C, A34C, Y35C,E88C, Q91C, S95C, A98C, N99C, S100C, L101C, V102C, Y103C, D107C, S108C, D112C, Q122C i G126C.
30. Konjugat bilo koje realizacije 25-29, pri čemu je A izabran iz
pri čemu * označava vezanje na B preko W.
31. Konjugat bilo koje realizacije 25-30, pri čemu W ima formulu
-W7-Y-,
pri čemu
Y je -(CH2)I7-C3-10-cikloalkil-W8- ili valentna veza, I7 je 0-6,
W7je izabrano iz -C(O)NH-, -NHC(O)-, -C(O)NHCH2-, -CH2NHC(O)-,
-C(O)NHS(O)2-, -S(O)2NHC(O)-, -OC(O)NH-, -NHC(O)O-,
-C(O)CH2-, -CH2C(O)-, -C(O)CH=CH-, -CH=CHC(O)-,
-(CH2)s3-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)- ili valentna veza; pri čemu s3 je 0 ili 1,
W8je izabrano iz -C(O)NH-, -NHC(O)-, -C(O)NHCH2-, -CH2NHC(O)-,
-C(O)NHS(O)2-, -S(O)2NHC(O)-, -OC(O)NH-, -NHC(O)O-,
-C(O)CH2-, -CH2C(O)-, -C(O)CH=CH-, -CH=CHC(O)-,
-(CH2)s4-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)- ili valentna veza; pri čemu s4 je 0 ili 1.
32. Konjugat bilo koje realizacije 25-31, pri čemu B ima formulu
-X1-X2-X3-X4-pri čemu
X1je -W1-[(CHR<1>)I1-W2]m1-{[(CH2)n1E1]m2-[(CHR<2>)I2-W3]m3}n2-,
X2je -[(CHR<3>)I3-W4]m4-{[(CH2)n3E2]m5-[(CHR<4>)I4-W5]m6}n4-, X3je -[(CHR<5>)I5-W6]m7-,
X4je F-D1-(CH2)I6-D2-,
I1, I2, I3, I4, I5 i I6 nezavisno su izabrani iz 0-16,
m1, m3, m4, m6 i m7 nezavisno su izabrani iz 0-10, m2 i m5 nezavisno su izabrani iz 0-25,
n1, n2, n3 i n4 nezavisno su izabrani iz 0-16,
F je aril, hetaril, pirolidin-2,5-dion ili valentna veza, pri čemu arilne i
hetarilne grupe su opciono supstituisane halogenom, -CN, -OH, -C(O)OH,
-C(O)NH2, -S(O)2OH ili C1-6-alkilom,
R<1>, R<2>, R<3>, R<4>i R<5>su nezavisno izabrani iz vodonika, -C(O)OH,
-C(O)NH2, -S(O)OH, -S(O)2OH, -NH-C(=NH)-NH2, C1-6-
alkila, arila ili hetarila; pri čemu su alkilne, arilne i hetarilne grupe opciono supstituisane halogenom -C(O)OH, -C(O)NH2, -S(O)OH, -S(O)2OH, -CN ili -OH,
D1, D2, E1 i E2 su nezavisno izabrani iz -O-, -N(R<6>)-, -N(C(O)R<7>)- ili su
valentna veza; pri čemu R<6>i R<7>nezavisno predstavljaju vodonik ili C1-6-alkil,
W1do W5nezavisno su izabrani iz -C(O)NH-, -NHC(O)-,
-C(O)NHCH2-, -CH2NHC(O)-, -C(O)NHS(O)2-, -
S(O)2NHC(O)-, -OC(O)NH-, -NHC(O)O-, -C(O)CH2-,
-CH2C(O)-, -C(O)CH=CH-, -CH=CHC(O)-, -(CH2)s2-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, ili su valentna veza; pri čemu s2 je 0 ili 1,
W6je izabrano iz -C(O)NH-, -NHC(O)-, -C(O)NHCH2-, -CH2NHC(O)-,
-C(O)NHS(O)2-, -S(O)2NHC(O)-, -OC(O)NH-, -NHC(O)O-,
-C(O)CH2-, -CH2C(O)-, -C(O)CH=CH-, -CH=CHC(O)-,
-(CH2)s1-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -NHC(O)C1-6-alkila, -C(O)NHC1-6-alkila ili je valentna veza; pri čemu s1 je 0 ili 1 i C1-6-alkilna grupa je opciono supstituisana sa okso, pirolidin-2,5-dionom,
-NHC(O)CH*CH2COOH ili -NHC(O)CH2CH*COOH; pri čemu ( * ) označava tačku vezivanja atoma ugljenika CH na X4.
33. Konjugat prema bilo kojoj od realizacija 25-32, pri čemu
I1, I2, I3, I4, I5 i I6 nezavisno su 0-6,
m1, m3, m4, m6 i m7 nezavisno su 0-6,
m2 i m5 nezavisno su 0-10, i
n1, n2, n3 i n4 nezavisno su 0-10.
34. Konjugat bilo koje realizacije 25-33, pri čemu su D1 i D2 nezavisno izabrani iz -O- ili -N(R<6>)- ili su valentne veze.
35. Konjugat bilo koje realizacije 25-34, pri čemu su E1 i E2 nezavisno izabrani iz -O- ili -N(R<6>)- ili su valentne veze.
36. Konjugat bilo koje realizacije 25-35, pri čemu su W1do W8nezavisno izabrani iz grupe koja se sastoji od - C(O)NH-, -NHC(O)-, -CH2NHC(O)-, -C(O)NHS(O)2-,
-S(O)2NHC(O)-, -NHC(O)C1-6-alkila, - C(O)NHC1-6-alkila ili su valentna veza; pri čemu je alkilna grupa opciono supstituisana sa okso, pirolidin-2,5-dionom, NHC(O)CH*CH2COOH ili -NHC(O)CH2CH*COOH; pri čemu (*) označava tačku vezivanja atoma ugljenika CH za X4.
37. Konjugat bilo koje realizacije 25-36, pri čemu R<1>, R<2>, R<3>, R<4>i R<5>nezavisno su odabrani iz vodonika, , -C(O)OH, -C(O)NH2, -S(O)2OH ili C1-6-alkila; pri čemu je alkinal grupa opciono supstituisana sa -C(O)OH, -C(O)NH2ili - S(O)2OH.
38. Konjugat bilo koje realizacije 25-37, pri čemu su -{[(CH2)n1E1]m2-[(CHR<2>)I2-W3]m3}n2- i -{[(CH2)n3E2]m5-[(CHR<4>)I4-W5]m6}n4-, pri čemu su E1 i E2 -O-, izabrani iz
H H
, i O O
O
pri čemu je * namenjena da označi tačku vezivanja, tj. otvorenu vezu.
39. Konjugat bilo koje realizacije 25-38, pri čemu X4je valentna veza i W6je izabrano iz bilo pirolidin-2,5-diona, -NHC(O)CH*CH2COOH ili
-NHC(O)CH2CH*COOH pri čemu (*) označava tačku vezivanja atoma ugljenika CH na GH.
40. Konjugat bilo koje realizacije 25-39, pri čemu je B izabran iz
41. Konjugat bilo koje realizacije 25-40, pri čemu je dato jedinjenje izabrano iz
,
O OH
.
42. Konjugat hormona rasta pri čemu konjugat hormona rasta ima formulu (I):
A-W-B-GH (I)
Pri čemu
GH predstavlja jedinjenje hormona rasta koje ima dodatni disulfidni most,
B predstavlja hidrofilni spejser,
W je hemijska grupa koja vezuje A i B, i
A predstavlja ostatak koji vezuje albumin; i
njihove farmaceutski prihvatljive soli.
43. Konjugat realizacije 42, pri čemu GH predstavlja jedinjenje hormona rasta koje sadrži sekvencu aminokiselina koja ima najmanje 80% identičnosti sa sekvencom amino-kiseline humanog hormona rasta (hGH) (SEQ ID NO: 1), kao što je najmanje 80% , najmanje 85%, najmanje 90% ili najmanje 95% identičnosti sa hGH, ili GH je hGH (SEQ ID NO: 1).
44. Konjugat realizacije 42, pri čemu GH ili GH konjugati imaju najmanje 80% aktivnosti hormona rasta hGH.
45. Konjugat realizacije 44, pri čemu se aktivnost meri u in vitro BAF testu (test I)
46. Konjugat bilo koje realizacije 42-45, pri čemu GH sadrži dodatne disulfidne veze između segmenta petlje i spiralnog segmenta ili unutar segmenta petlje ili između segmenata petlje ili između spiralnih segmenata.
47. Konjugat bilo koje realizacije 42-46, pri čemu GH sadrži dodatnu disulfidnu vezu pri čemu je barem jedan cistein prisutan u segmentu petlje, poput ostataka aminokiselina 128-154 (L3).
48. Konjugat bilo koje realizacije 42-47, pri čemu GH sadrži dodatnu disulfidnu vezu pri čemu dodatna disulfidna vezu koja povezuje segment petlje, sa spiralnim segmentom, kao što su spirala B ili spirala 2.
49. Konjugat bilo koje realizacije 42-48, pri čemu GH sadrži dodatnu disulfidnu vezu pri čemu dodatna disulfidna veza povezuje L3 (128-154), sa spiralom B ili spiralom 2.
50. Konjugat bilo koje realizacije 42-49, pri čemu je dodatni disulfidni most između najmanje jednog para aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju R16C/L117C, A17C/E174C, H21C/M170C, D26C/V102C, D26C/Y103C, N47C/T50C, Q49C/G161C, F54C/Y143C, F54C/S144C, F54C/F146C, S55C/Y143C, S57C/Y143C, I58C/Q141C, I58C/Y143C, I58C/S144C, P59C/Q137C, P61C/E66C, P61C/T67C, S71C/S132C, L73C/S132C, L73C/F139C, R77C/I138C, R77C/F139C, L81C/Q141C, L81C/Y143C, Q84C/Y143C, Q84C/S144C, S85C/Y143C, S85C/S144C, P89C/F146C, F92C/F146C, F92C/T148C, R94C/D107C, V102C/A105C, L156C/F146C, L156C/T148C i/ili V185C/S188C u hGH (SEQ ID NO: 1), kao što su Q84C/Y143C.
51. Konjugat bilo koje realizacije 42-50, pri čemu je A izabran iz
pri čemu * označava vezanje na B preko W.
52. Konjugat bilo koje realizacije 42-51, pri čemu W ima formulu
-W7-Y-,
pri čemu
Y je -(CH2)I7-C3-10-cikloalkil-W8- ili valentna veza, I7 je 0-6,
W7je izabrano iz -C(O)NH-, -NHC(O)-, -C(O)NHCH2-, -CH2NHC(O)-,
-C(O)NHS(O)2-, -S(O)2NHC(O)-, -OC(O)NH-, -NHC(O)O-,
-C(O)CH2-, -CH2C(O)-, -C(O)CH=CH-, -CH=CHC(O)-,
-(CH2)s3-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)- ili je valentna veza; pri čemu s3 je 0 ili 1,
W8je izabrano iz -C(O)NH-, -NHC(O)-, -C(O)NHCH2-, -CH2NHC(O)-,
-C(O)NHS(O)2-, -S(O)2NHC(O)-, -OC(O)NH-, -NHC(O)O-,
-C(O)CH2-, -CH2C(O)-, -C(O)CH=CH-, -CH=CHC(O)-, -(CH2)s4-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)- ili je valentna veza; pri čemu s4 je 0 ili 1.
53. Konjugat bilo koje realizacije 42-52, pri čemu B ima formulu
-X1-X2-X3-X4-pri čemu
X1je -W1-[(CHR<1>)I1-W2]m1-{[(CH2)n1E1]m2-[(CHR<2>)I2-W3]m3}n2-,
X2je -[(CHR<3>)I3-W4]m4-{[(CH2)n3E2]m5-[(CHR<4>)I4-W5]m6}n4-, X3je -[(CHR<5>)I5-W6]m7-,
X4je F-D1-(CH2)I6-D2-,
I1, I2, I3, I4, I5 i I6 nezavisno su izabrani iz 0-16,
m1, m3, m4, m6 i m7 nezavisno su izabrani iz 0-10, m2 i m5 nezavisno su izabrani iz 0-25,
n1, n2, n3 i n4 nezavisno su izabrani iz 0-16,
F je aril, hetaril, pirolidin-2,5-dion ili valentna veza, pri čemu arilne i
hetarilne grupe su opciono supstituisane halogenom, -CN, -OH, -C(O)OH,
-C(O)NH2, -S(O)2OH ili C1-6-alkilom,
R<1>, R<2>, R<3>, R<4>i R<5>su nezavisno izabrani iz vodonika, -C(O)OH,
-C(O)NH2, -S(O)OH, -S(O)2OH, -NH-C(=NH)-NH2, C1-6-
alkila, arila ili hetarila; pri čemu su alkilne, arilne i hetarilne grupe opciono supstituisane halogenom, -C(O)OH, -C(O)NH2, -S(O)OH, -S(O)2OH, -CN ili -OH,
D1, D2, E1 i E2 su nezavisno izabrani iz -O-, -N(R<6>)-, -N(C(O)R<7>)- ili su
valentna veza; pri čemu R<6>i R<7>nezavisno predstavljaju vodonik ili C1-6-alkil,
W1do W5su nezavisno izabrani iz -C(O)NH-, -NHC(O)-,
-C(O)NHCH2-, -CH2NHC(O)-, -C(O)NHS(O)2-, -
S(O)2NHC(O)-, -OC(O)NH-, -NHC(O)O-, -C(O)CH2-,
-CH2C(O)-, -C(O)CH=CH-, -CH=CHC(O)-, -(CH2)s2-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)- ili su valentna veza; pri čemu s2 je 0 ili 1,
W6je izabrano iz -C(O)NH-, -NHC(O)-, -C(O)NHCH2-, -CH2NHC(O)-,
-C(O)NHS(O)2-, -S(O)2NHC(O)-, -OC(O)NH-, -NHC(O)O-,
-C(O)CH2-, -CH2C(O)-, -C(O)CH=CH-, -CH=CHC(O)-,
-(CH2)s1-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -NHC(O)C1-6-alkila, -C(O)NHC1-6--alkila ili je valentna veza; pri čemu s1 je 0 ili 1 i C1-6-alkilna grupa je opciono supstituisana sa okso, pirolidin-2,5-dionom, -NHC(O)CH*CH2COOH ili -NHC(O)CH2CH*COOH; pri čemu (*) označava tačku vezanja atoma ugljenika CH na X4.
54. Konjugat bilo koje realizacije 42-53, pri čemu
I1, I2, I3, I4, I5 i I6 nezavisno su 0-6,
m1, m3, m4, m6 i m7 nezavisno su 0-6,
m2 i m5 nezavisno su 0-10, and
n1, n2, n3 i n4 nezavisno su 0-10.
55. Konjugat bilo koje realizacije 42-54, pri čemu su D1 i D2 nezavisno izabrani iz -O- ili -N(R<6>)- ili su valentne veze.
56. Konjugat bilo koje realizacije 42-55, pri čemu su E1 i E2 nezavisno izabrani iz -O- ili -N(R<6>)- ili su valentne veze.
57. Konjugat bilo koje realizacije 42-56, pri čemu su W1do W8nezavisno izabrani iz grupe koja se sastoji od -C(O)NH-, -NHC(O)-, -CH2NHC(O)-, -C(O)NHS(O)2-,
-S(O)2NHC(O)-, -NHC(O)C1-6-alkila ili -C(O)NHC1-6-alkila ili su valentna veza; pri čemu je alkilna grupa opciono supstituisana sa okso, pirolidin-2,5-dionom, -NHC(O)CH*CH2COOH ili
-NHC(O)CH2CH*COOH; pri čemu (*) označava tačku vezivanja atoma ugljenika CH na X4.
58. Konjugat bilo koje realizacije 42-57, pri čemu R<1>, R<2>, R<3>, R<4>i R<5>nezavisno su izabrani iz vodonika, , -C(O)OH, -C(O)NH2, -S(O)2OH ili C1-6-alkila; pri čemu je alkilna grupa opciono supstituisana sa -C(O)OH, -C(O)NH2ili -S(O)2OH.
59. Konjugat bilo koje realizacije 42-58, pri čemu su -{[(CH2)n1E1]m2-[(CHR<2>)I2-W3]m3}n2- i -{[(CH2)n3E2]m5-[(CHR<4>)I4-W5]m6}n4-, pri čemu su E1 i E2 -O-, izabrani iz
H H
, i O O
O
pri čemu je * namenjena da označi tačku vezivanja, tj. otvorenu vezu.
60. Konjugat bilo koje realizacije 42-59, pri čemu je B izabran iz
61. Konjugat bilo koje realizacije 42-60, pri čemu je A preko B vezan za ostatak glutamina na poziciji koja odgovara poziciji 40, poziciji 141 u hGH SEQ ID NO: 1, ili N-terminalnom ostatku jedinjenja hormona rasta .
62. Konjugat bilo koje realizacije 42-61, pri čemu je dato jedinjenje izabrano iz
O OH
. O OH
63. Konjugat hormona rasta pri čemu konjugat hormona rasta ima formulu (I):
A-W-B-GH (I)
pri čemu
GH predstavlja jedinjenje hormona rasta sa jednom Cys mutacijom i dodatnim disulfidnim mostom,
B predstavlja hidrofilni spejser povezan sa sumpornim ostatkom Cys mutacije,
W je hemijska grupa koja vezuje A i B, i
A predstavlja ostatak koji vezuje albumin; i
njihove farmaceutski prihvatljive soli.
64. Konjugat realizacije 63, pri čemu GH predstavlja jedinjenje hormona rasta koje sadrži sekvencu aminokiseline koja ima najmanje 80% identičnosti sa sekvencom amino-kiseline humanog hormona rasta (hGH) (SEQ ID NO: 1), kao što je najmanje 80% , najmanje 85%, najmanje 90% ili najmanje 95% identičnosti sa hGH, ili GH je hGH (SEQ ID NO: 1).
65. Konjugat realizacije 64, pri čemu GH ili GH konjugat ima najmanje 80% aktivnosti hormona rasta hGH.
66. Konjugat bilo koje realizacije 63-65, pri čemu je pojedinačna Cys mutacija pozicionirana u bilo kojoj regiji izabranoj iz N-kraja, H1, H2, L2 ili H3 GH-a.
67. Konjugat bilo koje realizacije 63-66, pri čemu GH ima jednu Cys mutaciju izabranu iz bilo koje od: T3C, P5C, S7C, D11C, H18C, Q29C, E30C, E33C, A34C, Y35C, K38C, E39C, Y42C, S43C, D47C, P48C, S55C, S57C, P59C, S62, E65C, Q69C, E88C, Q91C, S95C, A98C, N99C, S100C, L101C, V102C, Y103C, D107C, S108C, D112C, Q122C, G126C, E129C, D130C, G131C, P133C, T135C, G136C, T142C, D147C, N149C, D154C, A155C, L156C, R178C, E186C, G187C i G190C, kao što je bilo koja od T3C, P5C, S7C, D11C, H18C, Q29C, E30C, E33C, A34C, Y35C,E88C, Q91C, S95C, A98C, N99C, S100C, L101C, V102C, Y103C, D107C, S108C, D112C, Q122C i G126C.
68. Konjugat bilo koje realizacije 63-67, pri čemu je dodatna disulfidna veza između segmenta petlje i spiralnog segmenta ili unutar segmenta petlje ili između segmenata petlje ili između spiralnih segmenata.
69. Konjugat bilo koje realizacije 63-68, pri čemu GH sadrži dodatnu disulfidnu vezu u kojoj je barem jedan cistein prisutan u segmentu petlje, poput ostataka aminokiselina 128-154 (L3).
70. Konjugat bilo koje realizacije 63-69, pri čemu dodatna disulfidna veza povezuje segment petlje, sa spiralnim segmentom, kao što je H2.
71. Konjugat bilo koje realizacije 63-70, pri čemu dodatna disulfidna veza povezuje L3 sa spiralom H2.
72. Konjugat bilo koje realizacije 63-71, pri čemu je dodatni disulfidni most između najmanje jednog para aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju R16C/L117C, A17C/E174C, H21C/M170C, D26C/V102C, D26C/Y103C, N47C/T50C, Q49C/G161C, F54C/Y143C, F54C/S144C, F54C/F146C, S55C/Y143C, S57C/Y143C, I58C/Q141C, I58C/Y143C, I58C/S144C, P59C/Q137C, P61C/E66C, P61C/T67C, S71C/S132C, L73C/S132C, L73C/F139C, R77C/I138C, R77C/F139C, L81C/Q141C, L81C/Y143C, Q84C/Y143C, Q84C/S144C, S85C/Y143C, S85C/S144C, P89C/F146C, F92C/F146C, F92C/T148C, R94C/D107C, V102C/A105C, L156C/F146C, L156C/T148C i/ili V185C/S188C u hGH (SEQ ID NO: 1), kao što su Q84C/Y143C.
73. Konjugat bilo koje realizacije 63-72, pri čemu je A izabrano iz
pri čemu * označava vezivanje na B preko W.
74. Konjugat bilo koje realizacije 63-73, pri čemu W ima formulu
-W7-Y-,
pri čemu
Y je -(CH2)I7-C3-10-cikloalkil-W8- ili valentna veza, I7 je 0-6,
W7je izabrano iz -C(O)NH-, -NHC(O)-, -C(O)NHCH2-, -CH2NHC(O)-,
-C(O)NHS(O)2-, -S(O)2NHC(O)-, -OC(O)NH-, -NHC(O)O-,
-C(O)CH2-, -CH2C(O)-, -C(O)CH=CH-, -CH=CHC(O)-,
-(CH2)s3-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)- ili je valentna veza; pri čemu s3 je 0 ili 1,
W8je izabrano iz -C(O)NH-, -NHC(O)-, -C(O)NHCH2-, -CH2NHC(O)-,
-C(O)NHS(O)2-, -S(O)2NHC(O)-, -OC(O)NH-, -NHC(O)O-,
-C(O)CH2-, -CH2C(O)-, -C(O)CH=CH-, -CH=CHC(O)-, -(CH2)s4-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)- ili je valentna veza; pri čemu s4 je 0 ili 1.
75. Konjugat bilo koje realizacije 63-74, pri čemu B ima formulu
-X1-X2-X3-X4-pri čemu
X1je -W1-[(CHR<1>)I1-W2]m1-{[(CH2)n1E1]m2-[(CHR<2>)I2-W3]m3}n2-,
X2je -[(CHR<3>)I3-W4]m4-{[(CH2)n3E2]m5-[(CHR<4>)I4-W5]m6}n4-, X3je -[(CHR<5>)I5-W6]m7-,
X4je F-D1-(CH2)I6-D2-,
I1, I2, I3, I4, I5 i I6 nezavisno su izabrani iz 0-16,
m1, m3, m4, m6 i m7 nezavisno su izabrani iz 0-10, m2 i m5 nezavisno su izabrani iz 0-25,
n1, n2, n3 i n4 nezavisno su izabrani iz 0-16,
F je aril, hetaril, pirolidin-2,5-dion ili valentna veza, pri čemu arilne i
hetarilne grupe su opciono supstituisane halogenom, -CN, -OH, -C(O)OH,
-C(O)NH2, -S(O)2OH or C1-6-alkilom,
R<1>, R<2>, R<3>, R<4>i R<5>su nezavisno izabrani iz vodonika, -C(O)OH,
-C(O)NH2, -S(O)OH, -S(O)2OH, -NH-C(=NH)-NH2, C1-6-
alkila, arila ili hetarila; pri čemu alkilne, arilne i hetarilne grupe su opciono supstituisane sa halogenom, -C(O)OH, -C(O)NH2, -S(O)OH, -S(O)2OH, -CN ili -OH, D1, D2, E1 i E2 su nezavisno izabrani iz -O-, -N(R<6>)-, -N(C(O)R<7>)- ili su
valentna veza; pri čemu R<6>i R<7>nezavisno predstavljaju vodonik ili C1-6-alkil,
W1do W5su nezavisno izabrani iz -C(O)NH-, -NHC(O)-,
-C(O)NHCH2-, -CH2NHC(O)-, -C(O)NHS(O)2-, -
S(O)2NHC(O)-, -OC(O)NH-, -NHC(O)O-, -C(O)CH2-,
-CH2C(O)-, -C(O)CH=CH-, -CH=CHC(O)-, -(CH2)s2-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)- ili su valentna veza; pri čemu s2 je 0 ili 1,
W6je izabrano iz -C(O)NH-, -NHC(O)-, -C(O)NHCH2-, -CH2NHC(O)-,
-C(O)NHS(O)2-, -S(O)2NHC(O)-, -OC(O)NH-, -NHC(O)O-,
-C(O)CH2-, -CH2C(O)-, -C(O)CH=CH-, -CH=CHC(O)-,
-(CH2)s1-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -NHC(O)C1-6-alkila, -C(O)NHC1-6-alkila ili je valentna veza; pri čemu s1 je 0 ili 1 i C1-6-alkilna grupa je opciono supstituisana sa okso, pirolidin-2,5-dionom, -NHC(O)CH*CH2COOH ili -NHC(O)CH2CH*COOH; pri čemu ( * ) označava tačku vezivanja atoma ugljenika CH na X4.
76. Konjugat bilo koje realizacije 63-75, pri čemu
I1, I2, I3, I4, I5 i I6 nezavisno su 0-6,
m1, m3, m4, m6 i m7 nezavisno su 0-6,
m2 i m5 nezavisno su 0-10, and
n1, n2, n3 i n4 nezavisno su 0-10.
77. Konjugat bilo koje realizacije 63-75, pri čemu su D1 i D2 nezavisno izabrani iz -O- ili - N(R<6>)- ili su valentna veza.
78. Konjugat bilo koje realizacije 63-77, pri čemu su E1 i E2 nezavisno izabrani iz -O- ili - N(R<6>)- ili su valentna veza.
79. Konjugat bilo koje realizacije 63-78, pri čemu su W1do W8nezavisno izabrani iz grupe koja se sastoji od -C(O)NH-, -NHC(O)-, -CH2NHC(O)-, -C(O)NHS(O)2-,
-S(O)2NHC(O)-, -NHC(O)C1-6-alkila ili -C(O)NHC1-6-alkila ili su valentna veza; pri čemu je alkilna grupa opciono supstituisana sa okso, pirolidin-2,5-dionom, -NHC(O)CH*CH2COOH ili
-NHC(O)CH2CH*COOH; pri čemu (*) označava tačku vezanja atoma ugljenika CH za X4.
80. Konjugat bilo koje realizacije 63-79, pri čemu R<1>, R<2>, R<3>, R<4>i R<5>nezavisno su izabrani iz vodonika C(O)OH, -C(O)NH2, -S(O)2OH ili C1-6-alkila; pri čemu je alkilna grupa opciono supstituisana sa -C(O)OH, -C(O)NH2ili -S(O)2OH.
81. Konjugat bilo koje realizacije 63-80, pri čemu -{[(CH2)n1E1]m2-[(CHR<2>)I2-W3]m3}n2- i -{[(CH2)n3E2]m5-[(CHR<4>)I4-W5]m6}n4-, pri čemu E1 i E2 su -O-, su izabrani iz
H H
, i O O
O
pri čemu je * namenjena da označi tačku vezivanja, tj. otvorenu vezu.
82. Konjugat bilo koje realizacije 63-81, pri čemu je X4valentna veza i W6je izabran iz bilo pirolidin-2,5-diona, -NHC(O)CH*CH2COOH ili
-NHC(O)CH2CH*COOH pri čemu (*) označava tačku vezivanja atoma ugljenika CH za GH.
83. Konjugat bilo koje realizacije 63-82, pri čemu je B izabran iz
84. Konjugat bilo koje realizacije 1-83, pri čemu je jedan ostatak koji vezuje albumin (A) preko hidrofilnog spejsera (B) vezan za dati GH.
85. Konjugat bilo koje realizacije 63-84, pri čemu je dato jedinjenje izabrano iz
86. Konjugat bilo koje realizacije 1-85, pri čemu hidrofilni spejser ima mLogP <0.
87. Konjugat bilo koje realizacije 1-86, pri čemu je molarna masa datog hidrofilnog spejsera u opsegu od 80 D do 1500 D ili u opsegu od 300 D do 1100 D.
88. Konjugat bilo koje realizacije 1-87, pri čemu ostatak koji vezuje albumin je lipofilni ostatak.
89. Konjugat bilo koje realizacije 1-88, pri čemu se dati ostatak koji vezuje albumin vezuje nekovalentno za albumin.
90. Konjugat bilo koje realizacije 1-89, pri čemu je dati ostatak koji vezuje albumin negativno naelektrisan na fiziološkom pH.
91. Konjugat bilo koje realizacije 1-90, pri čemu dati ostatak koji vezuje albumin ima afinitet vezivanja prema albuminu iz humanog seruma koji je ispod oko 10 µM ili ispod oko 1 µM.
92. Konjugat bilo koje realizacije 1-91, pri čemu je ostatak koji vezuje albumin izabran iz ravnolančane alkilne grupe, razgranate alkilne grupe, grupe koja ima grupu ω-karboksilne kiseline ili izoster ω-karboksilne kiseline.
93. Konjugat bilo koje realizacije 1-92, pri čemu ostatak koji vezuje albumin ima od 6 do 40 atoma ugljenika, od 8 do 26 atoma ugljenika ili od 8 do 20 atoma ugljenika.
94. Konjugat bilo koje realizacije 1-93, pri čemu ostatak koji vezuje albumin je peptid, poput peptida koji sadrži manje od 40 ostataka amino-kiselina.
95. Konjugat bilo koje realizacije 1-94, pri čemu su dva ostatka koji vezuju albumin (A) preko hidrofilnog spejsera (B) povezana sa datim GH.
96. Konjugat bilo koje realizacije 1-95 za upotrebu u terapiji.
97. Farmaceutska kompozicija koja sadrži konjugat prema bilo kojoj od realizacija 1-95, i najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv ekscipijent.
98. Farmaceutska kompozicija iz realizacije 97, pri čemu se data kompozicija može primenjivati jezično, podjezično, bukalno, u ustima, oralno, u želucu i crevima, nazalno, plućno, epidermalno, dermalno, transdermalno i parenteralno.
99. Postupak lečenja nedostatka hormona rasta (GHD), postupak obuhvata davanje pacijentu kome je potrebno efektivne količine terapeutski efikasne količine konjugata iz bilo koje od realizacija 1-95.
100. Postupak lečenja Turnerovog sindroma; Prader-Vilijevog sindroma (PVS); Noonanovog sindroma; Daunovog sindroma; hronične bolesti bubrega, juvenilnog reumatoidnog artritisa; cistične fibroze, HIV infekcija kod dece koja su lečena HAART-om (deca sa HIV/HALS); niske dece koja su rođena niska (kratka) za gestacijsku dob (SGA); niskog rasta kod dece rođene sa vrlo malom težinom na rođenju (VLBV), ali SGA; skeletne displazije; hipohondroplazije; ahondroplazije; idiopatskog niskog rasta (ISS); GHD kod odraslih; preloma/fraktura duge kosti, poput tibije, fibule, butne kosti, nadlaktice, radijusa, ulne, klavikule, matakarpeje, matatarseje i prstiju; frakture sunđerastih kostiju, poput lobanje, baze šake i baze stopala; pacijenata nakon operacije tetive ili ligamenta, npr. ruku, kolena ili ramena; pacijenti koji imaju ili prolaze kroz distrakcijsku oteogenezu; pacijenata nakon zamene kuka ili diska, obnavljanja meniskusa, fuzije kičme ili fiksacije proteze, kao što su za kolena, kukove, ramena, lakat, zglob ili vilicu; pacijenti u koje je fiksiran materijal za osteosintezu, kao što su šrafovi, zavrtnji i ploče; pacijenata sa nesraslim ili loše zaraslim prelomima; pacijenti nakon osteatomije, npr. tibije ili prvog nožnog prsta; pacijenata nakon implantacije transplantata; degeneracije zglobne hrskavice u kolenu izazvane traumom ili artritisom; osteoporoze kod pacijenata sa Turnerovim sindromom; osteoporoze kod muškaraca; odraslih pacijenata na hroničnoj dijalizi (APCD); kardiovaskularnih bolesti povezanih s lošom ishranom kod APCD; preokret kaheksije kod APCD; raka kod APCD; hronične opstruktivne bolesti pluća kod APCD; HIV kod APCD; starije osobe sa APCD; hronične bolest jetre kod APCD, sindroma umora kod APCD; Kronove bolesti; oslabljene funkcija jetre; muškaraca sa HIV infekcijom; sindroma kratkog creva; centralne gojaznosti; Sindroma lipodistrofije povezane sa HIV-om (HALS); muške neplodnosti; pacijenata nakon većih elektivnih operacija, detoksikacije alkoholom/lekovima ili neurološke traume; starenja; krhkih starijih; osteoartritisa; povredom oštećene hrskavice; erektilne disfunkcije; fibromijalgije; poremećaja pamćenja; depresije; traumatske povrede mozga; subarahnoidno krvarenje; vrlo male porođajne težine; metaboličkog sindroma; glukokortikoidne miopatije; niskog rasta usled glukokortikoidnog lečenja, ubrzanje zarastanja mišićnog tkiva, nervnog tkiva ili rana; ubrzanje ili poboljšanje protoka krvi u oštećenom tkivu; ili smanjenje brzine infekcije u oštećenom tkivu, pri čemu postupak uključuje davanje pacijentu kome je to potrebno efikasne količine terapeutski efikasne količine konjugata iz bilo koje od realizacija 1-95.
101. Upotreba konjugata prema bilo kojoj realizaciji 1-95 za proizvodnju leka za lečenje nedostatka hormona rasta (GHD).
102. Upotreba konjugata prema bilo kojoj realizaciji 1-95 za proizvodnju leka za lečenje Turnerovog sindroma; Prader-Vilijevog sindroma (PVS); Noonanovog sindroma; Daunovog sindroma; hronične bolesti bubrega, juvenilnog reumatoidnog artritisa; cistične fibroze, HIV infekcija kod dece koja su lečena HAART-om (deca sa HIV/HALS); niske dece koja su rođena niska (kratka) za gestacijsku dob (SGA); niskog rasta kod dece rođene sa vrlo malom težinom na rođenju (VLBV), ali SGA; skeletne displazije; hipohondroplazije; ahondroplazije; idiopatskog niskog rasta (ISS); GHD kod odraslih; preloma/fraktura duge kosti, poput tibije, fibule, butne kosti, nadlaktice, radijusa, ulne, klavikule, matakarpeje, matatarseje i prstiju; frakture sunđerastih kostiju, poput lobanje, baze šake i baze stopala; pacijenata nakon operacije tetive ili ligamenta, npr. ruku, kolena ili ramena; pacijenti koji imaju ili prolaze kroz distrakcijsku oteogenezu; pacijenata nakon zamene kuka ili diska, obnavljanja meniskusa, fuzije kičme ili fiksacije proteze, kao što su za kolena, kukove, ramena, lakat, zglob ili vilicu; pacijenti u koje je fiksiran materijal za osteosintezu, kao što su šrafovi, zavrtnji i ploče; pacijenata sa nesraslim ili loše zaraslim prelomima; pacijenti nakon osteatomije, npr. tibije ili prvog nožnog prsta; pacijenata nakon implantacije transplantata; degeneracije zglobne hrskavice u kolenu izazvane traumom ili artritisom; osteoporoze kod pacijenata sa Turnerovim sindromom; osteoporoze kod muškaraca; odraslih pacijenata na hroničnoj dijalizi (APCD); kardiovaskularnih bolesti povezanih s lošom ishranom kod APCD; preokret kaheksije kod APCD; raka kod APCD; hronične opstruktivne bolesti pluća kod APCD; HIV kod APCD; starije osobe sa APCD; hronične bolest jetre kod APCD, sindroma umora kod APCD; Kronove bolesti; oslabljene funkcija jetre; muškaraca sa HIV infekcijom; sindroma kratkog creva; centralne gojaznosti; Sindroma lipodistrofije povezane sa HIV-om (HALS); muške neplodnosti; pacijenata nakon većih elektivnih operacija, detoksikacije alkoholom/lekovima ili neurološke traume; starenja; krhkih starijih; osteoartritisa; povredom oštećene hrskavice; erektilne disfunkcije; fibromijalgije; poremećaja pamćenja; depresije; traumatske povrede mozga; subarahnoidno krvarenje; vrlo male porođajne težine; metaboličkog sindroma; glukokortikoidne miopatije; niskog rasta usled glukokortikoidnog lečenja, ubrzanje zarastanja mišićnog tkiva, nervnog tkiva ili rana; ubrzanje ili poboljšanje protoka krvi u oštećenom tkivu; ili smanjenje brzine infekcije u oštećenom tkivu.
103. Jedinjenje formule (III)
A-W-B1-U (III)
pri čemu A predstavlja ostatak koji vezuje albumin,
B1 predstavlja hidrofilni spejser,
W je hemijska grupa koja vezuje A i B1, a U predstavlja konjugirajući deo.
104. Jedinjenje prema realizaciji 103, pri čemu su A i W definisani kao u bilo kojoj od gornjih realizacija.
105. Jedinjenje prema realizaciji 103 ili realizaciji 104, pri čemu U sadrži ili se sastoji od arila, heterarila, supstituisanog malimida ili pirolidin-2,5-diona, kao što je -NHC(O)CH2CH2-pirolidin-2,5-dion.
106. Jedinjenje prema realizaciji 103 ili realizaciji 104, pri čemu U sadrži D1-(CH2)I6-D2, pri čemu su D1 i D2 nezavisno odabrani od -O-, -N(R6)-,
-NC(O)R7- ili su valentna veza; pri čemu R6 i R7 nezavisno predstavljaju vodonik ili C1-6-alkil.
107. Jedinjenje prema realizaciji 103 ili realizaciji 104, pri čemu U sadrži ili se sastoji od odlazeće grupe, kao što su Cl, Br, I, -OH, -OS(O)2Me, -OS(O)2CF3, -Ots.
108. Jedinjenje prema realizacijama 107, pri čemu odlazeća grupa je jedinjenje halogena izabran iz Cl, Br i I, poželjno Br.
109. Jedinjenje prema realizaciji 103 ili realizaciji 104, pri čemu U sadrži ili se sastoji od alil amina (H2C=CH-CH2-NH2), kao što je – C(O)NHCH2-CH=CH2.
110. Jedinjenje prema realizaciji 103 ili realizaciji 104, pri čemu U sadrži ili se sastoji od amina, kao što je -NH2.
111. Jedinjenje prema bilo kojoj realizaciji 103-110, pri čemu je terapeutsko jedinjenje polipeptid.
112. Jedinjenje prema bilo kojoj realizaciji 103-110, pri čemu terapeutsko jedinjenje je polipeptid sa jednim slobodnim cistinom.
113. Jedinjenje prema realizaciji 103 ili realizaciji 104, pri čemu U sadrži ili se sastoji od aldehida, kao što je -CHO.
114. Jedinjenje prema bilo kojoj realizaciji 103-113, pri čemu hidrofilni spejser B1 ima formulu
-X1-X2-X3-X4-pri čemu
X1je -W1-[(CHR<1>)I1-W2]m1-{[(CH2)n1E1]m2-[(CHR<2>)I2-W3]m3}n2-,
X2je -[(CHR<3>)I3-W4]m4-{[(CH2)n3E2]m5-[(CHR<4>)I4-W5]m6}n4-, X3je -[(CHR<5>)I5]m7-,
X4je valentna veza,
I1, I2, I3, I4, i I5 nezavisno su izabrani iz 0-16, m1, m3, m4, m6 i m7 nezavisno su izabrani iz 0-10, m2 i m5 nezavisno su izabrani iz 0-25,
n1, n2, n3 i n4 nezavisno su izabrani iz 0-16, R<1>, R<2>, R<3>, R<4>i R<5>nezavisno su izabrani iz vodonika, -C(O)OH,
-C(O)NH2, -S(O)OH, -S(O)2OH, -NH-C(=NH)-NH2, C1-6-
alkila, arila ili hetarila; pri čemu su alkilne, arilne i hetarilne grupe opciono supstituisane halogenom, -C(O)OH, -C(O)NH2, -S(O)OH, -S(O)2OH, -CN ili -OH,
E1 i E2 su nezavisno izabrani iz -O-, -N(R<6>)-, -N(C(O)R<7>)- ili su valentne veze; pri čemu R<6>i R<7>nezavisno predstavljaju vodonik ili C1-6-alkil,
W1do W5nezavisno su izabrani iz -C(O)NH-, -NHC(O)-,
-C(O)NHCH2-, -CH2NHC(O)-, -C(O)NHS(O)2-, -
S(O)2NHC(O)-, -OC(O)NH-, -NHC(O)O-, -C(O)CH2-,
-CH2C(O)-, -C(O)CH=CH-, -CH=CHC(O)-, -(CH2)s2-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)- ili su valentna veza; pri čemu s2 je 0 ili 1.
PRIMERI
Skraćenice:
amu = jedinica atomske mase
CV = zapremina kolone
hr(s) = sat(i)
Hz = herc
L = litar(a)
M = molar
mbar = millibar
mg = miligram(i)
min. = minuta
mL = mililitar(a)
mM = milimolar
mm = milimetar(a)
mmol = millimol(a)
nmol = nanomol(a)
mol = mol(a)
µL = mikrolitri
N = normal
nm = nanometar(a)
sec = sekund(i)
ppm = delova po milionu
ESI = electrosprajna jonizacija i.v. = intravenski
m/z = odnos masa / naelektrisanje MS = masena spektrometrija HPLC = tečna hromatografija pod visokim pritiskom RP = reverzna faza
HPLC-MS = tečna hromatografija pod visokim pritiskom -masena spektrometrija
NMR = Nuklearno magnetno rezonantna spektroskopija p.o. = oralno
rt ili RT = sobna temperatura
s.c. = supkutano
tr = vreme zadržavanja
Boc = terc butiloksikarbonil
O-t-Bu = terc butil estar
t-Bu = terc butil
Boc-4-ABZ-OH = 4-terc-Butoksikarbonilamino-benzoeva kiselina
DCM = dihlormetan, CH2Cl2, metilenhlorid
DIC = diizopropilkarbdiimid
DIPEA = N,N-diizopropiletilamin
DMF = N,N -dimetilformamid
DMSO = dimetilsulfoksid
DTT = ditiotreitol
EDAC = 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)karbodiimid hidrohlorid
Et2O = dietil etar
EtOAc = etil acetat
Fmoc = 9H-fluoren-9-ilmetoksikarbonil
Fmoc-Glu-O-t-Bu = N-Fmoc-glutaminska kiselina-1-t-butil estar
Fmoc-Lys(Mtt)-OH = (S)-6-[(Difenil-p-tolil-metil)-amino]-2-(9H-fluoren-9-ilmetoksikarbonilamino)-heksanska kiselna
Fmoc-OEG-OH = (2[2-(Fmoc-amino)etoksi]etoksi)sirćetna kiselina
OEG = (2[2-(amino)etoksi]etoksi)acetil
Fmoc-Thx-OH = N-Fmoc-trans-4-aminometilcikloheksankarboksilna kiselina
H2O = voda
HOBt = 1-Hidroksibenzotriazol
MeCN = acetonitril
MeOH = metanol
MTP = 3-metil-tio-1-propanol
NaCl = natrijum hlorid
NaOH = natrijum hidroksid
NMP = N-metilpirolidin-2-on
OEG = (2[2-(amino)etoksi]etoksi)sirćetna kiselina
TFA = trifulorosirćetna kiselina
THF = tetrahidrofuran
TIS = triizopropilsilan
CDCl3= deuterio hloroform
CD3OD = tetradeuterio metanol
DMSO-d6= heksadeuterio dimetilsulfoksid
TNBS = trinitrobenzensulfonska kiselina
TSTU = O-(N-Sukcinimidil)-1,1,3,3-tetrametil uranijum tetrafluoroborat
U primerima se, takođe, koriste sledeći opšti postupci: Opšti postupak za dobijanje hGH jedinjenja.
Gen koji kodira jedinjenje hormona rasta ubačen je rekombinantno u vektor plazmida. Odgovarajući E.coli soj je naknadno transformisan pomoću plazmidnog vektora. Varijante hGH ili GH mogu se eksprimovati N-terminalnim metioninom ili kao MEAE fuzija iz koje se zatim odvaja MEAE sekvenca.
Ćelijski stok je pripremljen u 25% glicerola i čuvan na -80°C. Osnovni soj glicerola inokuliran je u LB ploče i potom inkubiran preko noći na 37°C. Sadržaj svake ploče je ispran LB medijumom i razblažen u 500 mL LB medijuma za eksprimovanje. Kulture su inkubirane na 37°C uz mućkanje pri 220 obrtaja/min sve dok nije dostignut OD6000,6.
Uspešna indukcija je izvedena korišćenjem 0,2 mM IPTG na 25°C tokom 6 sati. Ćelije su konačno sakupljene centrifugiranjem.
Ćelije su zatim suspendovane u 10 mM Tris-HCl, pH = 9,0 koji sadrži 0,05% Tween 20, 2,5 mM EDTA, 10 mM cisteamina i 4M uree i razbijene korišćenjem ćelijskog razbijača pri 30kPSI. Supernatant je sakupljen centrifugiranjem i potom podvrgnut hromatografskom prečišćavanju.
Prečišćavanje je obavljeno korišćenjem hromatografije razmene jona i hidrofibne interakcije, posle čega je uklonjena peptidna oznaka korišćenjem humane dipeptidil peptidaze I (hDPPI) eksprimovane iz CHO ćelije. Konačno prečišćavanje je postignuto izoprecipitacijom i hromatografijom razmene jona. Prečišćavanje se, takođe, može postići primenom hromatografije razmene jona, hidrofobne interakcione hromatografije, afinitetne hromatografije, hromatografije za isključivanje veličine i tehnika razdvajanja zasnovanih na membrani poznatih stručnjaku u tehnici.
Hemijska karakterizacija proteina prečišćenih jedinjenja hormona rasta.
Netaknuti prečišćeni protein je analiziran pomoću MALDI-MS. Posmatrana masa je odgovarala teorijskoj masi dobijenoj iz sekvence amino-kiseline.
Očekivana vezivanja disulfidne veze mogu se demonstrirati mapiranjem peptida upotrebom tripsina i AspN varenja, nakon čega sledi MALDI-MS analiza varenja pre i posle redukcije disulfidnih veza sa DTT.
Test za merenje brzine razgradnje proteaza konjugata jedinjenja GH i hGH
Jedinjenje od interesta je vareno odgovarajućom proteazom (Tripsin, Himotripsin, Pepsin, Elastaza, Faktor VIIa, Faktor Xa, Proteinaza K, Karboksi peptidaza, DPPIV, Neutralna endopeptidaza, Granzim B, Prolin-endopeptidaza, Stafilokok peptidaza I, Termolizin, Trombin, Arg-C proteinaza, Asp-N endopeptidaza, Kaspaza 1-10, Klostripain, Enterokinaza, Glutamil endopeptidaza, Granzim B, LysC, LysN, Prolin-endopeptidaza i Stafilokokna peptidaza I ili ekstrakti tkiva) u odgovarajućem puferu (npr. PBS ili amonijum bikarbonat) na 37°C do 24 sata. Proteolitička razgradnja je procenjena HPLC testom.
Proteolitičko varenje:
100 µL rastvora ispitivanog jedinjenja u 1 mg/mL u puferu amonijum bikarbonata se razlaže enzimima do 24 sata na 37 ºC. Poduzorci se uzimaju u različitim vremenskim tačkama, a proteolitička reakcija se zaustavlja zakiseljavanjem uzorka 10 puta razblaživanjem u 1% TFA. Ovi razblaženi uzorci se analiziraju pomoću HPLC obrnute faze da bi se procenio stepen proteolitičkog varenja.
HPLC postupak:
10 µL gornjeg rastvora ubrizgava se u obrnutu fazu Vydac kolonu C4 2 ×150 mm eluirano linearnim gradijentom od 0,1% TFA u vodi do 100% acetonitrila koji sadrži 0,1% TFA tokom perioda od 30 min pri brzini protoka od 0,2 ml/min. Detekcija vrhova se vrši pri UV apsorpciji od 214 nm.
Procenat (%) netaknutog jedinjenja u vremenskoj tački t = T izračunava se iz područja vrha u vremenskoj tački t = T (AT) i površine vrha pri t = 0 (A0) kao (AT/A0) ×100%.
Procenat (%) netaknutog jedinjenja izračunava se nasuprot vremena, korišćenjem GraphPad Prims softvera ver. 5.01. Poluživot (T1⁄2) se izračunava kao jednofazno propadanje, takođe, pomoću GraphPad Prism softvera. Primeri enzima koji se mogu koristiti su elastaza (Sigma iz svinjskog pankreasa) i kimotripsin (Roche sekvencioniranje). Primer pufera je 50 mM amonijum bikarbonata, pH = 8,5.
Kapilarna elektroforeza:
Kapilarna elektroforeza izvedena je korišćenjem Agilent Technologies 3DCE sistema (Agilent Technologies). Prikupljanje podataka i obrada signala izvedeni su korišćenjem Agilent Technologies 3DCE ChemStation. Kapilar je bio 64,5 cm (56,0 cm efikasne dužine) 50 µm i.d.
„Kapilar produženog svetlosnog puta“ iz Agilenta. UV detekcija je izvedena na 200 nm (16 nm Bw, referenca 380 nm i 50 nm Bw). Tekući elektrolit bio je fosfatni pufer 50 mM pH 7 (postupak A). Kapilar je uslovljen sa 0,1M NaOH tokom 3 min, zatim sa Milli-Q vodom tokom 2 min i sa elektrolitom tokom 3 min. Nakon svakog kruga, kapilar je ispran milli-Q vodom u trajanju od 2 min, zatim fosfornom kiselinom u trajanju od 2 min i sa mili-Q vodom u trajanju od 2 min. Hidrodinamička injekcija izvedena je na 50 mbar tokom 4,0 sek. Voltaža je bila 25 kV. Temperatura kapilara je bila 30<o>C, a vreme trajanja je bilo 10,5 min.
Maldi-Tof masena spektrometrija:
Molekularne mase su određene pomoću instrumenta Autoflex Maldi-Tof (Bruker). Uzorci su pripremljeni korišćenjem alfa-cijano-4-hidroksi-cinaminske kiseline kao matrice.
RP-HPLC:
RP-HPLC analiza izvedena je na sistemu Agilent 1100 korišćenjem Vydac 218TP54 4,6 mm x 250 mm 5 µm C-18 silika kolone (The Separations Group, Hesperia). Detekcija je bila UV zračenjem pri 214 nm, 254 nm, 280 nm i 301 nm. Kolona je izbalansirana sa 0,1% trifluorosirćetne kiseline / H2O, a uzorak je eluiran pogodnim gradijentom od 0 do 90% acetonitrila nasuprot 0,1% trifluorosirćetne kiseline / H2O.
LC-MS:
LC-MS analiza izvedena je na PE-Sciex API 100 ili 150 masenom spektrometru opremljenom sa dve mikro-pumpe Perkin Elmer serije 200, Perkin Elmer Series 200 autosamplerom, Applied Biosystems 785A UV detektorom i detektorom raspršivanja svetlosti Sedex 75. Waters Xterra 3,0 mm x 50 mm 5 μ C-18 silika kolona je eluirana pri 1,5 ml/min na sobnoj temperaturi. Uravnotežena je sa 5% MeCN / 0,1% TFA / H2O i eluirana je 1,0 min sa 5% MeCN / 0,1% TFA / H2O, a zatim sa linearnim gradijentom do 90% MeCN / 0,1% TFA / H2O tokom 7 min. Detekcija je bila pomoću UV detekcije na 214 nm i raspršivanjem svetlosti. Deo eluata u koloni je unet u interfejs za jonski sprej na PE-Sciex API 100 masenom spektrometru. Raspon mase 300 - 2000 amu skeniran je svake 2 sekunde tokom ciklusa.
Kvantifikacija proteina:
Koncentracije proteina su procenjene merenjem apsorbancije na 280 nm korišćenjem NanoDrop ND-1000 UV-spektrofotometra.
Enzimatsko mapiranje peptida za određivanje mesta derivatizacije:
Mapiranje peptida je izvršeno upotrebom Asp-N varenja redukovanog i alkiliranog proteina. Prvo je protein tretiran DTT i jodoacetamidom, prema standardnim postupcima. Alkilirani proizvod je prečišćen pomoću HPLC. Nakon toga, alkilirani prečišćeni proizvod je digestiran preko noći endoproteazom Asp-N (Boehringer) pri
odnosu enzimi:supstrat od 1:100. Digestirani proizvod je razdvojen pomoću HPLC korišćenjem C-18 kolone i standardnim TFA/MeCN sistemom pufera. Dobijena peptidna mapa je upoređena sa mapom nederivatizovanog hGH i frakcije sa različitim vremenima zadržavanja su sakupljene i dalje analizirane korišćenjem Maldi-tof masene spektrometrije. SDS stranica:
SDS poliakrilamidna gel elektroforeza izvedena je korišćenjem NuPAGE 4% - 12% Bis-Tris gelova (Invitrogen NP0321BOX). Gelovi su obojeni srebrom (Invitrogen LC6100) ili Kumasi obojeni (Invitrogen LC6065) i gde je relevantno, takođe, obojeni za PEG barijum jodidom kao što je opisao M. M. Kurfurst u Anal. Biochem. 200(2), 244-248, (1992).
Proteinska hromatografija:
Proteinska hromatografija izvedena je na Äkta Ekplorer hromatografskom sistemu i kolonama iz GE Health Care. Razmena anjona je izvršena korišćenjem Q-Sepharose HP 26/10 kolone. Početni pufer je bio 20 mM trietanolaminskog pufera pH 8,5, a eluirajući pufer je početni pufer 0,2 M NaCl. Jedinjenja su obično eluirana gradijentom od 0-75% eluiranog pufera preko 15 zapremina kolone. Razmenjivanje odsoljavanja i pufera je izvršeno pomoću kolone HiPrep 26/10.
TNBS test
Pripremljen je rastvor 10% DIPEA u DMF (rastvor 1) i rastvor 1 M vodenog TNBS (rastvor 2). Nekoliko kuglica smole stavljeno je u malu epruvetu i dodato je 1-3 kapi svakog rastvora (1 i 2). Nakon kraćeg mešanja, smeša je ostavljena na sobnoj temperaturi 10 min. a kuglice su pregledane. Intenzivno narandžaste ili crvene perle ukazuju na pozitivne rezultate (tj. prisustvo slobodnih amina); žute ili blago narandžaste perle ukazuju na blago pozitivne, a bezbojne perle su negativne.
LogP izračunavanje
LogP vrednosti mogu se izračunati kao mLogP i/ili cLogP za deo veziva albumina i/ili deo hidrofilnog spejsera korišćenjem objavljenih algoritama (J. Am. Chem. Soc., 86,5175-5180, (1964) "A New Substituent Constant, Derived from Partition Coefficients", C. A. Lipinski et al. Advanced Drug Delivery Reviews, 23, 3-25 (1997), "Experimental and Computational Approaches to Estimate Solubility and Permeability in Drug Discovery and Development Settings" i I. Moriguchi, S. Hirono, I. Nakagome, H. Hirano, Chem. and Pharm. Bull., 42, 976-978, (1994) "Comparison of Reliability of logP Values for Drugs Calculated by Several Methods". Ovde se clogP - Pomona College logP (koeficijent podele oktanol/voda) izračunava sa Sybyl 7.0 iz Tripos-a (http://www.tripos.com) verzija 4.2 algoritma clogP i verzija 22 njegove pridružene fragmentirane baze podataka koju pruža BioByte Corp (http://www.biobyte.com/).
Priprema veziva albumina
Primer 1
4-(1H-Tetrazol-16-il-heksadekanoilsulfamoil)butanoil-OEG-
Jedinjenje (I) je sintetizovano na čvrstom nosaču prema šemi 1, u 1mM skali primenom standardne Fmoc-peptidne hemije na sintetizeru ABI433. Peptid je sakupljen na Fmoc-Lys(MTT)-Vang smoli korišćenjem Fmoc-OEG-OH i Fmoc-Glu-OtBu zaštićenih amino-kiselina. 4-(16-1H-tetrazol-5-ilheksadekanoilsulfamoil) buterna kiselina je ručno spojena korišćenjem DIC/NHS u DCM/NMP, 2 ekv. preko noći, TNBS test je pokazao da je reakcija završena. Smola je zatim tretirana sa 50 ml DCM/TFA/TIS/vode (94:2:2:2) u protočnom rasporedu sve dok žuta boja nije nestala, ~ 20 min. praćeno ispiranjem i neutralizacijom sa DIPEA/DMF. Brom sirćetna kiselina (4 mM) u DCM/NMP (1:1) aktivirana je 1 mM smeše NHS i DIC, profiltrirana i dodata u smolu uz dodavanje još 1 mM DIPEA. Nakon 1 sata reakcija je završena. Smola je tretirana sa 80 mL TFA/TIS/vode (95:2,5:2,5) tokom 1 sata. Uparava se mlazom N2, istaloži dodavanjem Et2O i ispira sa Et2O i osuši. Sirovi proizvod je prečišćen preparativnom HPLC (2 ciklusa), sa gradijentom od 30-80% 0,1 TFA/MeCN u odnosu na 0,1% TFA u vodi. Frakcije su sakupljene i liofilizovane sa ~ 50% MeCN dajući jedinjenje (I).
TOF-MS: masa 1272,52 (M+1)
Shema 1
Primer 2
Na sličan način kao što je opisano gore u Primeru 1, sledeće jedinjenje je pripremljeno korišćenjem Fmoc-Lys(Mtt)-OH i Vang smole.
O OH
TOF-MS: masa 536,52 (M+1)
Primer 3
Na sličan način kao što je opisano gore u Primeru 1, sledeće jedinjenje je pripremljeno korišćenjem Fmoc-Lys(Mtt)-OH i Vang smole.
TOF-MS: masa 810,80 (M+1)
Primer 4
Na sličan način kao što je opisano gore u Primeru 1, sledeće jedinjenje je pripremljeno korišćenjem Fmoc-Lys(Mtt)-OH i Vang smole.
TOF-MS: mass 844.84 (M+1)
Primer 5
Na sličan način kao što je opisano gore u Primeru 1, sledeće jedinjenje je pripremljeno korišćenjem Fmoc-Lys(Mtt)-OH i Vang smole.
TOF-MS: masa 1151,27 (M+1)
Primer 6
Na sličan način kao što je opisano gore u Primeru 1, sledeće jedinjenje je pripremljeno korišćenjem Fmoc-Lys(Mtt)-OH i Vang smole.
TOF-MS: masa 1272,30 (M+1)
Primer 7
Na sličan način kao što je opisano gore u Primeru 1, sledeće jedinjenje je pripremljeno korišćenjem Fmoc-Lys(Mtt)-OH i Vang smole.
TOF-MS: masa 984,01 (M+1)
Primer 8
Na sličan način kao što je opisano gore u Primeru 1, sledeće jedinjenje je pripremljeno korišćenjem Fmoc-Lys(Mtt)-OH i Vang smole.
TOF-MS: masa 882,95 (M+1)
Primer 9
Na sličan način kao što je opisano gore u Primeru 1, sledeće jedinjenje je pripremljeno korišćenjem Fmoc-Lys(Mtt)-OH i Vang smole.
TOF-MS: masa 782,74 (M+1)
Primer 10
Na sličan način kao što je opisano gore u Primeru 1, sledeće jedinjenje je pripremljeno korišćenjem Fmoc-Lys(Mtt)-OH i Vang smole.
TOF-MS: masa 1127,14 (M+1)
Primer 11
Na sličan način kao što je opisano gore u Primeru 1, sledeće jedinjenje je pripremljeno korišćenjem Fmoc-Lys(Mtt)-OH, jodosirćetne kiseline i Vang smole.
TOF-MS: masa 1174,14 (M+1)
Primer 12
Na sličan način kao što je opisano gore u Primeru 1, sledeće jedinjenje je pripremljeno korišćenjem Fmoc-Lys(Mtt)-OH, hlorosirćetne kiseline i Vang smole.
TOF-MS: masa 1061,89 (M+1)
Primer 13
(19-karboksinonadekanoil)-
malimido-propionilamino]propoksi}etoksi)etoksi]propil} amide (II)
O OH
(II)
2-hlorotritil smola (2,0 g, 2,6 mmol) je bubrena u DCM u trajanju od 0,5 sata. Dodat je rastvor 4,7,10-trioksa-1,13-diamina u DCM (30 mL). Smola je mešana na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. Smola je isprana jednom sa DCM, zatim je dodat rastvora DIPEA: MeOH: DCM (15 mL:15 mL:20 mL). Smola je mućkana 0,5 sata, zatim isprana tri puta sa DCM. Fmoc-Glu (OtBu)-OH, Fmoc-Glu-OtBu i FmocThexOH su zatim povezani sekvencijalno standardnom hemijom peptida, kao što sledi: 0,5 M rastvor Fmoc-AA-OH/DIC/HOBt u NMP (11,7 ml) - pomešan je i nakon 2 min. dodat smoli.
Smola je mućkana 45 min. na rt. i zatim isprana sa 5xNMP i 5xDCM. Dodat je rastvor Ac2O/DIPEA/NMP (1:1:5) i smola je mešana na sobnoj temperaturi 10 min. Smola je isprana (5xNMP i 5xDCM). Smola je zatim tretirana sa 30% piperidinom u NMP 2x10 min. i konačno isprana sa 5xNMP i 5xDCM. Peptidu je zatim dodato 0,25 M rastvora eikosandiadne kiseline (6 ekv.) koji sadrži 0,125 M HOAt (3 ekv.), 0,125 M DIC (3 ekv.) i 0,125 M lutidina (3 ekv.). Smola je mućkana 2 sata na sobnoj temperaturi posle ispiranja sa 5xNMP i 8xDCM. Proizvod je odvojen od smole korišćenjem 10% TFA-DCM tokom 20 minuta. Smola je filtrirana i tretirana još jednom sa 10% TFA-DCM tokom dodatnih 20 min. Kombinovani filtrati su sakupljeni i upareni do suva.
Suvi proizvod odozgo je rastvoren u DMF (6 ml) i dodat je 3 maleimidopropionska kiselina aktivirana TSTU-om (prethodno napravljena reakcijom TSTU sa 3 maleimidopropionskom kiselinom u DMF (2 mL) tokom 45 minuta) i DIPEA (200 µL). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom jednog sata. Reakciona smeša je uparena do suva i ostatak je rastvoren u 95% TFA-MilliQ vodi i mešan na sobnoj temperaturi u trajanju od 20 min. Smeša je uparena do suva. U ostatak je dodato najmanje vode da se istaloži čvrsta supstanca. Talog je filtriran i rekristalizovan iz MeCN. Kristali su sakupljeni i isprani ekstenzivno sa Et2O dajući jedinjenje (II) kao belu čvrstu supstancu.
TOF-MS: masa 1094,39 (M+1).
Primer 14
Na sličan način kao što je gore opisano u Primeru 1 i prikazano u shemi 2, sledeće jedinjenje je pripremljeno korišćenjem Boc-Gly-PAM smole kao polaznog materijala i mono-terc-butil-arahidinske kiseline, 4- Boc-aminobenzoeve kiseline, Fmoc-Thx-OH, Fmoc-OEG-OH, Fmoc-Glu (O-t-Bu)-OH, Fmoc-Glu(OH)-t-Bu zaštićene amino-kiseline. Nakon blage deprotekcije, peptidni proizvod je odcepljen od smole korišćenjem 2,2-dimetoksietilamina nakon čega je usledila deacetalizacija korišćenjem TFA koji daje vezivo albumina (IV).
TOF-MS: masa 1128,38 (M+1)
Shema 2:
1) TFA 1) Fmoc-OEG-OH 1) Fmoc-OEG-OH 1) Fmoc-Glu(Ot-Bu)-OH
Boc-Gly-PAM H2N-Gly-PAM H2N-OEG-OEG-Gly-PAM NH2-Glu-OEG-OEG-Gly-PAM 2) DMF HOBPti,p DeIrCi,d NinMP HOPBipt,e DriICdi,n NMP HOPBit,p DerICid,i NnMP
2) P 2) 2) P
Primer 15
Na sličan način kao što je opisano u Primeru 14, sledeće jedinjenje je pripremljeno korišćenjem Boc-Gly-PAM smole kao polaznog materijala i mono-terc-butil-arahidinske kiseline, 4-Boc-aminobenzoeve kiseline, Fmoc-Thx-OH, Fmoc-OEG-OH, Fmoc-Glu(O-t-Bu)-OH, Fmoc-Glu(OH)-t-Bu zaštićene amino-kiseline. Nakon blage deprotekcije, peptidni porizvod je odcepljen od smole korišćenjem 2,2-dimetoksieetilamina nakon čega je usledila deacetalizacija korišćenjem TFA koji daje vezivo albumina (V).
O OH O OH
(V)
TOF-MS: Rt = 15,2 min, masa = 967,11 (M+1)
Primer 16
Na sličan način kao što je opisano u Primeru 14, jedinjenje (VI) je pripremljeno korišćenjem Fmoc-Lys(Mtt)-Vang smole kao polaznog materijala i mono-terc-butiloktadekandiojske kiseline, Boc-Ser(t-Bu)-OH, Fmoc-OEG-OH, Fmoc-Glu(O-t-Bu)-OH i oksidovane Fmoc-Cys-OH zaštićene amino-kiseline. Peptidni proizvod je odcepljen od smole korišćenjem 2,5% TIS, 2,5% H2O u THF tokom 3 sata i prečišćen preparativnom HPLC:
Kolona : 2 cm C18
Eluent A : 0,1 % TFA i Milli-Q voda
Eluent B : 0,1 % TFA i MeCN
Početni % B: 40 %
Krajnji % B: 75 %
Gradijent : 5 min. sa 10% MeCN, 5-10 min. do početnog % B tokom 51 min., 5 min. sa krajnjim % B 10% MeCN oko 1 sat Frakcije su analizirane pomoću LC-MS-TOF.
Željene frakcije su sakupljene, podeljene u ležišta i liofilizovane dajući jedinjenje (VI)
TOF-MS: Rt = 6,3 min, masa = 955,1 (M+1)
Oksidacija (VI):
MTP-rastvor:
3-Metil-tio-1-propanol (290 mg) rastvoren u 4 mL 25 mM HEPES, pH = 7,00
Perjodni rastvor:
96 mg NaIO4rastvoreno u 2 mL Milli-Q vode
Rastvoru jedinjenja (VI) u Milli-Q vodi (1 mL) je dodat MTP rastvor (3,6 mL) perjodni rastvor (560 µL) i pH je podešen na 9,5 sa jednom kapi 1N NaOH.
Reakciona bočica je prekrivena tankom folijom i mešana 1 sat na RT. Dodatni deo
perjodnog rastvora (560 uL) je dodat i reakciona smeša je ostavljena 4,5 sata na sobnoj temperaturi. Dobijena smeša je provedena kroz dve NAP kolone da bi se oslobodila od NaIO4. Kolone su prethodno isprane sa 25 mM HEPES-a (5 x 2,5 ml) pH = 7,0.
Uzorak (2,5 ml) se primenjuje na svaku kolonu i eluira sa 3,5 ml 25 mM HEPES-a, pH = 7,00. 2 x 3,5 mL je sakupljeno ukupno - 10,5 mL sadrži keto-aldehida (VII) koji je direktno korišćen za konjugaciju sa GH analogom.
TOF-MS: masa = 924,08 (M+1)
Primer 17
4-(1H-Tetrazol-16-il-heksadekanoilsulfamoil)butanoil-OEG-
(VIII)
jedinjenje (VIII) sintetizovano je na čvrstom nosaču prema shemi 3. Fmoc zaštićena Rink-amidna smola (2,2 g, 0,6 mMol/g) se odmerava u bocu. Smola je ostavljena da nabubri sa NMP (3 x 30 mL) tokom 2 sata. Smola je mešana sa 25% piperidinom u NMP (30 ml) tokom 10 min. Smola je isušena i tretirana sa 25% piperidinom u NMP (30 ml) tokom 1 sata, a zatim drenirana i isprana sa NMP (6 x 30 ml). Fmoc-Lys(Mtt)-OH i HOBt su izvagani u bocu, rastvoreni u brom fenol plavoj boji u NMP (30 mL, 0,5 mM). Ovaj rastvor je dodat gornjoj, isušenoj smoli, posle čega je dodat DIC.
Reakcija je mućkana na sobnoj temperaturi tokom 21 sata. Smola je isušena i isprana NMP (6 x 30 ml), a zatim isprana sa DCM (3 x 30 ml). Smola je tretirana heksafluorizopropanolom (20 mL) tokom 10 min. Mućkana 10 min. Smola je isušena i isprana sa DCM (3 x 30 mL). Smola je tretirana heksafluorizopropanolom (20 mL) tokom 10 min ponovo i mućkana 10 min. Smola je isušena i isprana sa DCM (3 x 30 ml), a zatim je isušena i isprana NMP (3 x 30 ml).
4-(Boc-amino)benzoeva kiselina i HOBt su izmereni u bocu, rastvoreni u brom fenol plavoj boji u NMP (30 mL, 0,5 mM). Ovaj rastvor je dodat gornjoj, isušenoj smoli, posle čega je dodat DIC. Reakcija je mućkana na sobnoj temperaturi. Smola je isušena i isprana NMP (6 x 30 mL). Smola je mućkana sa 25% piperidinom u NMP (10 ml) tokom 10 min.
Smola je isušena i tretirana sa 25% piperidinom u NMP (10 ml) tokom 1 sata, a zatim isušena i isprana sa NMP (6 x 15 ml). Fmoc-OEG-OH i HOBt su izmereni u bocu, rastvoreni u brom fenol plavoj boji u NMP (15 mL, 0,5 mM). Ovaj rastvor je dodat isušenoj smoli, posle čega je dodat DIC. Reakcija je mućkana na sobnoj temperaturi tokom 23 sata. Smola je isušena i isprana NMP (6 x 15 mL). Smola je mešana sa 25% piperidinom u NMP (10 ml) tokom 10 min. Smola je drenirana i tretirana sa 25% piperidinom u NMP (10 ml) tokom 1 sata, a zatim isušena i isprana sa NMP (6 x 15 ml). Fmoc-Glu-O-t-Bu i HOBt su izmereni u bocu, rastvoreni u brom fenol plavoj boji u NMP (15 mL, 0,5 mM). Ovaj rastvor je dodat isušenoj smoli, posle čega je dodat DIC. Reakcija je mućkana na sobnoj temperaturi tokom 18 sati. Smola je isušena i isprana NMP (6 x 15 mL). Smola je mućkana sa 25% piperidinom u NMP (10 ml) tokom 10 min. Smola je isušena i tretirana sa 25% piperidinom u NMP (10 ml) tokom 1 sata, a zatim isušena i isprana sa NMP (6 x 15 ml). Fmoc-Glu-O-t-Bu i HOBt su izmereni u bocu, rastvoreni u 15 ml 0,5 mM brom fenol plave boje u NMP. Ovaj rastvor je dodat isušenoj smoli, posle čega je dodat DIC. Reakcija je mućkana na sobnoj temperaturi tokom 18 sati. Smola je isušena i isprana NMP (6 x 15 mL). Smola je mešana sa 25% piperidinom u NMP (10 ml) tokom 10 min. Smola je isušena i tretirana sa 25% piperidinom u NMP (10 ml) tokom 1 sata, a zatim isušena i isprana sa NMP (6 x 15 ml). Fmoc-OEG-OH i HOBt su izmereni u bocu, rastvoreni u brom fenol plavoj boji u NMP (15 mL, 0,5 mM). Ovaj rastvor je dodat isušenoj smoli, posle čega je dodat DIC. Reakcija je mućkana na sobnoj temperaturi. Smola je isušena i isprana NMP (6 x 15 mL). Smola je mućkana sa 25% piperidinom u NMP (10 ml) tokom 10 min. Smola je isušena i tretirana sa 25% piperidinom u NMP (10 ml) tokom 1 sata, a zatim isušena i isprana sa NMP (6 x 15 ml).
4-(16-1H-Tetrazol-5-il-hekadelanoilsulfamoil)buterna kiselina i HOBt su izmereni u bocu, rastvoreni u brom fenol plavoj boji u NMP (15 mL, 0,5 mM). Ovaj rastvor je dodat isušenoj smoli nakon čega je dodat DIC. Reakcija je mućkana na sobnoj temperaturi tokom 21 sata. Smola je isušena i isprana NMP (6 x 15 ml), a zatim isušena i isprana sa DCM (6 x 15 ml). Smola je odcepljena smešom 95% TFA u vodi (10 mL) DCM (0,25 mL) i TIS (0,25 mL). Smola je mućkana 2 sata na sobnoj temperaturi i filtrirana u ledeno hladnom Et2O (75 mL). Dobijeni talog je izolovan centrifugiranjem, praćenim ispiranjem sa Et2O (3x) i sušen u vakuumu 48 sati, čime je dobijeno 300 mg sirovog jedinjenja (VIII).
Sirovo jedinjenje (VIII) je prečišćeno na preparativnom HPLC (GILSON), 30-> 80% MeCN. Sakupljene frakcije su uparene do suva i ostatak rastvoren u H2O/MeCN 1:1 i sušen zamrzavanjem tokom noći, dajući 170 mg jedinjenja(VIII). TOF-MS: Rt = 4,7 min, masa 1268,71 (M+1)
Shema 3.
Primer 18
Na sličan način kao što je opisano gore u Primeru 17, sledeće jedinjenje je pripremljeno korišćenjem Fmoc-Lys(Mtt)-OH i Vang smole.
TOF-MS: masa 1124,33 (M+1)
Primer 19
Na sličan način kao što je opisano gore u Primeru 17, sledeće jedinjenje je pripremljeno korišćenjem Fmoc-Lys(Mtt)-OH i Rink amidne smole.
TOF-MS: masa 1333,64 (M+1)
Primer 20
Na sličan način kao što je opisano gore u Primeru 17, sledeće jedinjenje je pripremljeno korišćenjem Fmoc-Lys(Mtt)-OH i Rink amidne smole.
TOF-MS: masa 1320,67 (M+1)
Primer 21
Na sličan način kao što je opisano gore u Primeru 17, sledeće jedinjenje je pripremljeno korišćenjem Fmoc-Lys(Mtt)-OH i Rink amidne smole.
TOF-MS: masa 2114,64 (M+1)
Primer 22
Na sličan način kao što je opisano gore u Primeru 17, sledeće jedinjenje je pripremljeno korišćenjem Fmoc-Lys(Mtt)-OH i Rink amidne smole.
HO O , TOF-MS: masa 1534,82 (M+1)
Primer 23
Na sličan način kao što je opisano gore u Primeru 17, sledeće jedinjenje je pripremljeno korišćenjem Fmoc-Lys(Mtt)-OH i Rink amidne smole.
NH2,
TOF-MS: masa 823,05 (M+1)
Primer 24
Na sličan način kao što je opisano gore u Primeru 17, sledeće jedinjenje je pripremljeno korišćenjem Fmoc-Lys(Mtt)-OH i Vang smole.
NH2, TOF-MS: masa 980,22 (M+1)
Primer 25
Na sličan način kao što je opisano gore u Primeru 17, sledeće jedinjenje je pripremljeno korišćenjem Fmoc-Lys(Mtt)-OH i Rink amidne smole.
NH2,
TOF-MS: masa 851,10 (M+1)
Primer 26
Na sličan način kao što je opisano gore u Primeru 17, sledeće jedinjenje je pripremljeno korišćenjem Fmoc-Lys(Mtt)-OH i Rink amidne smole.
TOF-MS: masa 1258,51 (M+1)
Primer 27
Na sličan način kao što je opisano gore u Primeru 17, sledeće jedinjenje je pripremljeno korišćenjem Fmoc-Lys(Mtt)-OH i Vang smole.
TOF-MS: masa 1269,49 (M+1)
Primer 28
Na sličan način kao što je opisano gore u Primeru 17, sledeće jedinjenje je pripremljeno korišćenjem Fmoc-Lys(Mtt)-OH i Rink amidne smole.
TOF-MS: masa 841,04 (M+1)
Primer 29
Na sličan način kao što je opisano gore u Primeru 17, sledeće jedinjenje je pripremljeno korišćenjem Fmoc-Lys(Mtt)-OH i Rink amidne smole.
TOF-MS: masa 863,07 (M+1)
Primer 30
Na sličan način kao što je opisano gore u Primeru 17, sledeće jedinjenje je pripremljeno korišćenjem Fmoc-Lys(Mtt)-OH i Rink amidne smole.
TOF-MS: masa 855,07 (M+1)
Primer 31
Na sličan način kao što je opisano gore u Primeru 17, sledeće jedinjenje je pripremljeno korišćenjem Fmoc-Lys(Mtt)-OH i Rink amidne smole.
TOF-MS: masa 883,12 (M+1)
Primer 32
Na sličan način kao što je opisano gore u Primeru 17, sledeće jedinjenje je pripremljeno korišćenjem Fmoc-Lys(Mtt)-OH i Rink amidne smole.
TOF-MS: masa 1123,35 (M+1)
Primer 33
Na sličan način kao što je opisano gore u Primeru 17, sledeće jedinjenje je pripremljeno korišćenjem Fmoc-Lys(Mtt)-OH i Rink amidne smole.
TOF-MS: Rt = 4,7 min, masa 1267,45 (M+1)
Primer 34
Na sličan način kao što je opisano gore u Primeru 17, sledeće jedinjenje je pripremljeno korišćenjem Fmoc-Lys(Mtt)-OH i Rink amidne smole.
TOF-MS: masa 1310,67 (M+1)
Primer 35
Na sličan način kao što je opisano gore u Primeru 17, sledeće jedinjenje je pripremljeno korišćenjem Fmoc-Lys(Mtt)-OH i Rink amidne smole.
OH TOF-MS: masa 1308,58 (M+1)
Primer 36
Na sličan način kao što je opisano gore u Primeru 17, sledeće jedinjenje je pripremljeno korišćenjem FMOC-Glu(ODmab)-OH i 2-hlortritil hloridne smole.
TOF-MS: masa 1235,56 (M+1)
Primer 37
Na sličan način kao što je opisano gore u Primeru 17, sledeće jedinjenje je pripremljeno korišćenjem FMOC-Glu(ODmab)-OH i 2-hlortritil hloridne smole.
TOF-MS: masa 1173,40 (M+1)
Primer 38
Na sličan način kao što je opisano gore u Primeru 17, sledeće jedinjenje je pripremljeno korišćenjem Fmoc-Lys(Mtt)-OH i Rink amidne smole.
NH2,
TOF-MS: masa 703,93 (M+1)
Primer 39
Na sličan način kao što je opisano gore u Primeru 17, sledeće jedinjenje je pripremljeno korišćenjem Fmoc-Lys(Mtt)-OH i Rink amidne smole.
TOF-MS: masa 689,90 (M+1)
Primer 40
Na sličan način kao što je opisano gore u Primeru 17, sledeće jedinjenje je pripremljeno korišćenjem FMOC-Glu(ODmab)-OH i 2-hlortritil hloridne smole.
TOF-MS: masa 1182,34 (M+1)
Primer 41
17-[(S)-3-(2-{2-[(2-{2-[(5-Aminopentilkarbamoil)metoksi]etoksi}etilkarbamoil)-metoksi]etoksi}etilkarbamoil)-1-karboksi-propilkarbamoil]-heptadekanska kiselina:
N-tert-butoksikarbonil kadaverin (24,3 mg; 0,12 mmol) je dodat u rastvor 17-((S)-1-Karboksi-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-diokso-pirolidin-1-iloksikarbonilmetoksi)
etoksi]etilkarbamoil}metoksi)etoksi]etilkarbamoil}propilkar bamoil)-heptadekanske kiseline (100 mg; 0,12 mmol) i DIPEA (46,68 mg; 0,36 mmol) u THF (2,0 ml). Reakciona smeša je mešana tokom noći na sobnoj temperaturi, a zatim koncentrovana u vakuumu. Ostatak je rastvoren u smeši vode (5 ml) i THF (2 ml), i prečišćen preparativnom HPLC (RP18 kolona). Frakcije koje sadrže Boc-zaštićeni spojni proizvod se skupljaju i suše. Ostatak je rastvoren u 50% TFA-DCM (4 ml) i mešan tokom 1 sata na sobnoj temperaturi, zatim koncentrovan u vakuumu da bi se dobilo 54 mg (55%) materijala iz naslova kao njegova so trifluorosirćetne kiseline.
TOF-MS: masa 815,5 (M+1)
Pripreme GH albumin vezivnih jedinjenja:
Primer 42 (nije prema patentnim zahtevima)
Upotreba transglutaminaze za pričvršćivanje drške na GH prethodno je opisana u WO2005/070468 i može se koristiti u skladu sa predmetnim pronalaskom za vezivanje albuminskog veziva. TGase koja se koristi je mikrobna transglutaminaza iz Streptoverticillium mobaraense prema US5156956. Opšti postupak je opisan u gornjem odeljku Hemija I.
1. Spajanje transaminovanog i oksidovanog GH jedinjenja (I) sa vezivom albumina (II)
Pripremljen je sledeći rastvor:
Pufer A: Trietanolamin (119 mg, 0,8 mmol) je rastvoren u vodi (40 ml) i pH je podešen na 8,5.
(A) Transaminacija hGH (III) sa 1,3-diamino-2-propanolom
O TGase O
Gln<40/141>Gln<40/141>
III IV
U sledećem koraku, transaminovanom GH (III) se dodaje perjodat. Oksidacija se obično vrši na niskoj temperaturi, kao što je 4-10°C tokom 30 min. opciono u mraku. Perjodat može oksidirati meteoninske ostatke u GH u njihove odgovarajuće ostatke meteonin sulfoksida. Da bi se smanjio rizik od oksidacije, organski tioetri malih molekula mogu se dodati tokom perjodatne oksidacije. Pogodan organski tioetar je 3-metiltiopropan-1-ol, ali stručnjak će moći da predloži i druge.
Oksidacija transaminovanog GH jedinjenja (IV):
O O
Gln<40/141>Gln<40/141>
I V I
Promena pufera se može izvršiti kako bi se dobio rastvor kiseline potreban za efikasno smanjenje natrijum-cijanoborohidrida. Obično se koristi višak A-W-B1-NH2 amina, a natrijum cijanborhidrid se može dodati u manjim količinama tokom vremena.
Pripremljeni su sledeći rastvori:
Pufer A: Trietanolamin (119 mg, 0,8 mmol) je rastvoren u vodi (40 ml) i pH je podešen na 8,5.
Buffer B: 3-metiltiopropanol (725 mg, 7,1 mmol) je rastvoren u puferu A (10 mL).
Pufer C: HEPES (5,96 g) je rastvoren u vodi (1,0 L) i pH je podešen na 7,0
Perjodat: NaIO4(48,1 mg, 0,225 mmol) je rastvoren u vodi (1,0 mL).
Rastvoru (IV) (10 mg, 0,5 µmol) je dodat pufer B (0,2 mL), a zatim rastvor perjodata (0,03 mL). Posle 20 min. hladne inkubacije, smeša je dijalizirana 4 puta sa puferom C. Ostatak je koncentrovan na 1 mL.
(C) Redukciona aminacija (I) albuminskim vezivom (II)
Gln<40/141>Gln<40/141>
I VI
Može se koristiti albuminsko vezivo (II) kako je opisano u primerima 17 do 40.
Konačni rastvor iz (B) (1 mL, 10 mg, 0,45 µmol (I)) je pomešan sa rastvorom II veziva albumina (2 mL, 10 mg, 0,3 µmol) u 25 mM HEPES puferu pH 7,0 i dobijena smeša je lagano rotirana na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. Posle 1 sata, NaCNBH3(100 µL rastvora NaCNBH3(20 mg) u vodi (0,5 mL) je dodat u delovima. Smeša se drži na sobnoj temperaturi u mraku 18-24 sata.
Kasnija reakcija može se izvesti na sledeći način:
Rastvor oksidovanog transaminovanog GH dodaje se rastvor linkera veziva albumina u smeši AcOH (1,5 mL) i 50 mM MES (0,5 mL) pri pH 6,00. Dobijena reakciona smeša je lagano mućkana na RT tokom 30 minuta i u to vreme je dodat rastvor NaCNBH3(15 µL, (22 mg NaCNBH3rastvoreno u 500 µL Milli-Q vode AcOH (15 µL)))). Uzorak je prekriven tankom folijom i mešan tokom noći na RT.
Konjugat se može izolovati hromatografijom anjonske razmene na sledeći način:
Sirćenta kiselina se uklanja puferom koji se menja čistom vodom (3X) pomoću Amicon Ultra15 uređaja (Ultracel 10K epruvete) centrifugiranjem pri 4000 obrtaja/min. tokom 3 x 8 min. Smeši se zatim menja pufer do 20 mM TEA, pH: 8,50 pomoću Amicon filtera i razblažuje se do krajnje zapremine od 50 ml sa 20 mM TEA, pre nego što se prebaci u HiLoad Q Sepharose, 26/10 kolonu. Kolona je u početku isprana sa 20 mM TEA, pH 8,50 (pufer A), a zatim je eluirana sa 20 mM TEA, 500 mM NaCl, pH 8,50 (pufer B) korišćenjem gradijenta 0-100% (B) preko 20 CV, sa brzinom protoka od 2 mL/min. Sakupljenim frakcijama je pufer izmenjen 5 puta do 10 mM amoniumibikarbonatnog pufera u čistoj vodi pomoću Amicon Ultra15 uređaja (Ultracel 10K epruvete) centrifugiranjem pri 4000 obrtaja/min. tokom 3 x 8 min
Korišćenje albuminskog veziva iz Primera 18 daće sledeće jedinjenje
42,1 (nije prema patentnim zahtevima)
O
, O OH O
TOF-MS: masa 23301,63
Sledeće jedinjenje je pripremljeno korišćnjeme albuminskog veziva iz Primera 41
42,2 (nije prema patentnim zahtevima)
TOF-MS: masa 23727,6245
Rastvoru hGH (1 mg, 45 nmol) i 17-[(S)-3-(2-{2-[(2-{2-[(5-aminopentilkarbamoil) metoksi]etoksi}etilkarbamoil)metoksi] etoksi}etilkarbamoil)-1-karboksi-propilkarbamoil] heptadekanojska kiselina (2,10 mg; 2250 nmol) u 20 mM trietanolamina (1000 ul; pH 8,5) je dodata TGase (0,12 nmol; Streptoverticillium mobaraense). Reakciona smeša se inkubira na 25°C tokom 146 sati, nakon čega se dobije dvostruko derivatizovani hGH analog gornje formule.
Primer 43 (nije prema patentnim zahtevima)
1. Spajanje GH jedinjenja (I) na N-kraju sa vezivom albumina (IV)
(A) Reduktivna alkilacija (I) sa aldehidom veziva albumina (IV)
(I) (VI)
Postupak derivacije, kao što je prikazano gore, koristi albumin vezujući linker A-W-B, pri čemu B ima funkciju terminalnog aldehida. Konjugacija hGH sa A-W-B-CHO nastaje reduktivnom alkilacijom (hGH � VI). Primer reduktivne alkilacije je ovde prikazan i ona je dobro poznata u stanju tehnike i daje hGH jedinjenja modifikovana na N-terminalnim pozicijama.
Dobijeno je albuminsko vezivo (IV) kao što je opisano u Primeru 14.
43,0 (nije prema patentnim zahtevima)
hGH[Q84C, Y143C] (23 mg) je rastvoren u Hepes puferu (2,3 mL 0,25 mM pH 7,0).
(2 mg,
vidi primer 14 gore) je tretiran sa TFA (50 µL) u trajanju od 6 min. i uparen do suva u vakuumu. Ostatak je uklonjen sa EtOH (200 µL) i uparen do suva u vakuumu. Ostatak je rastvoren u DMF (100 µL) i dodat u hGH rastvor. Talog je formiran i ponovo rastvoren dodatkom DMF (1 mL). Nakon 1 sata, rastvor NaCNBH3(20 mg, u 0,5 ml MeCN (230 µL)) je dodat u delovima i ostavljen 20 sati. Reakcija je ugašena dodatkom AcOH (2 mL) i razblažena sa vodom do ukupne zapremine 20 mL i prečišćena je preparativnoj HPLC na C18 koloni sa gradijentom 0,1% TFA u MeCN od 40-80% naspram 0,1% TFA u vodi. Poslednji vrh eluiranja je sakupljen, razblažen od 70% MeCN do 10% sa vodom i liofilizovan dajući
TOF-MS: Rt = 15,25 min, masa = 23150
Na sličan način kao što je opisano gore, sledeće jedinjenje je pripremljeno korišćenjem albuminskog veziva iz Primera 16.
43,1 (nije prema patentnim zahtevima)
TOF-MS: Rt = 15,2 min, masa = 23033
Na sličan način kao što je opisano gore, sledeće jedinjenje je pripremljeno korišćenjem albuminskog veziva iz Primera 15.
43,2 (nije prema patentnim zahtevima)
TOF-MS: Rt = 15 min, masa = 22989,1
Primer 44
1. Spajanje GH jedinjenja (VII) koje ima unutrašnji slobodni pojedinačni cys sa vezivom albumina (VIII)
1) Oslobađanje slobodnog Cys GH (VII) redukcijom disulfida (VI) pogodnim selektivnim redukcionim sredstvom:
2) Alkiliranje slobodnog Cys GH (VII) sa halogenom aktiviranim vezivom albumina (VIII) što daje Cys konjugovano GH jedinjenje (IX)
Cys GH
(VI) (VII) (IX)
44,1
Priprema hGH[L101C] (VII):
hGH[L101C] kao što je dobijeno gore, ima deo svog slobodnog cisteina blokiran glutationom i cistaminom. Deblokiranje je izvršeno enzimski koristeći glutaredoksin II (Grx2) u uravnotežnom puferu koji sadrži GSH i GSSG. Deblokirani hGH[L101C] odvojen je od GSH/GSSG niske molekulske mase izmenjenim puferom na koloni Sephadex G25.
Konjugacija veziva albumina (VIII) sa hGH[L101C] (VII):
Albuminsko vezivo iz primera 5 (78 mg, 5 ekv.) je rastvoreno u 170 ml HEPES/EDTA pufera sa 5% hidroksipropilß-ciklodekstrinom i dodat je MTP (2,1 mL, 1%) i 0,5 M NaCl (6,34 g).
U ovu smešu je dodat koncentrovani hGH[L101C] (1 ekv, 46 mL) i smeša je ostavljena preko noći na RT. Rastvor je preko noći postao zamućen. Kako je HPLC pokazao nereagovani polazni materijal, još 5 ekv. veziva albumina iz primera 5 je dodato rastvoreno u minimumu NMP. Dobijena smeša je mešana na RT dodatnih 16 sati.
Prečišćavanje:
Korišćeni puferi:
Pufer A.
20 mM Trietanolamin (TEA) 10% Etilen glikol
5,96 g trietanolamin
200 mL etilen glikol
MQ voda dodata u 2 L.
pH podešena na 8,5 sa 1N HCl
Pufer B:
20 mM Trietanolamin (TEA) 1,0 M NaCl 10% Etilen glikol 5,96 g trietanolamin
116,88 g NaCl
200 mL ethylen glycol
MQ voda dodata u 2 L.
pH podešena na 8,5 sa 1N HCl
Reakcijski pufer je promenjen u TEA-pufer A sa etilen glikolom na koloni Sephadex tokom 3 ciklusa:
Kolona: 50/30 Sephadex G25 fina
Pufer A:
Protok: 10 ml/min
Temp: RT (frakcije prikupljane na 12°C)
Frakcije: 30 mL po frakciji
Željene frakcije su prikupljene, stavljene u ležišta i prečišćene na Q Sepharose koloni:
Kolona: 26/10 Q Sepharose HP
Pufer A:
Pufer B:
Gradijent 1: 0-10 % Puffer B preko 1 CV
Gradijent 2: 10-40 % pufer B preko 20 CV
Gradijent 3: 40-100 % Pufer B preko 1 CV
Protok: 8 ml/min
Temp: RT (frakcije prikupljene na RT)
Frakcije: 5 mL po frakciji
Željene frakcije su sakupljene, stavljene u ležšta i puferi izmenjeni do 10 mM amonijum-bikarbonata pH 8,0 na koloni Sephadex G25:
Kolona: 50/30 Sephadex G25 fina
Pufer A: 10 mM Amonijumbikarbonata pH 8,0
Protok: 10 mL/min
Temp: RT (frakcije prikupljene na 12 °C)
Frakcije: 30 mL po frakciji
Pet frakcija je sakupljeno i zamrznuto.
Ležišta su analizirana MS i viđene su velike količine dimera (MS 44491.7).
Zamrznute bočice su rastvorene u puferu A i ponovo prečišćene na novoj Q Sepharose koloni:
Kolona: 26/10 Q Sepharose HP
Pufer A:
Pufer B:
Gradijent 1: 0-10 % Pufer B preko 1 CV
Gradijent 2: 10-40 % pufer B preko 20 CV
Gradijent 3: 40-100 % Pufer B preko 1 CV
Protok: 8 mL/min
Temp: RT (frakcije prikupljene na RT)
Frakcije: 5 mL po frakciji
Frakcije se skupljaju i uklanjaju se soli / izmenjuju puferi do 10 mM amoniumicikarbonata ultrafiltracijom. Ležište je koncentrovano do 25 ml i kvantifikovano pomoću RP-HPLC i MS-TOF:
TOF-MS: Rt = 16,15 min, masa = 23315,96
Sledeća jedinjenja su pripremljena korišćenjem istog postupka.
44,2
TOF-MS: Rt = 15,27 min, masa = 23148
44,7
, O OH
TOF-MS: Rt = 15,05 min, masa = 23097,76
O OH
TOF-MS: Rt = 15,24 min, masa = 22676,8
Primer 45
1. Kuplovanje GH jedinjenja (VII) koje ima unutrašnji slobodni pojedinačni cys sa vezivom albumina (X)
1) Alkilacija slobodnog Cys GH (VII) maleimidno supstituisanim vezivom albumina (X) koja daje Cys konjugovano GH jedinjenje (XI)
(VII) (XI)
Deprotektovano Cys GH jedinjenje (VII) kako je dobijeno gore u Primeru 44, može reagovati sa maleimidno supstituisanim linkerom veziva albumina (X) dajući GH konjugat A-W-B1-NHC(O)CH2CH2-pirolidin-2,5-dion-3-hGH (XI) pri čemu je B1 definisan kao što je gore opisano u Hemiji IV.
Konjugacija maleimidno funkcionalizovanog veziva albumina (X) sa hGH L101C
Korak (a) deblokiranje ostatka cisteina
Glutationom / cisteaminom blokirani Cys hGH (VI) enzimski je deblokiran korišćenjem glutaredoksina II (Grx2) u uravnoteženom puferu koji sadrži GSH i GSSG. Deblokirani Cys hGH (VII) odvojen je od nisko molekularnog GSH/GSSG izmenjenim puferom na Sephadex G25 koloni.
Korak (b) kuplovanja na maleimidom funkcionalizovano albumin vezivo (X)
Maleimidno funkcionalizovano vezivo albumina (X) je rastvoreno u puferu koji sadrži 5% hidroksipropil-ßciklodekstrina. Rastvor je zatim dodat u deblokirani Cys hGH (VII) i ostavljen je da reaguje tokom noći na sobnoj temperaturi.
Posle konjugacije, konjugovani protein je prečišćen na Q Sepharose HiLoad koloni u 20 mM trietanolaminskom puferu koji sadrži 10% etilen glikola pri pH 8,5 korišćenjem gradijenta natrijum hlorida. Sakupljene frakcije su izvučene i prenesene u 10 mM amonijum bikarbonat korišćenjem G25 kolone i liofilizovane.
TOF-MS: Rt = 16,20 min, masa = 23339,7 45,5
TOF-MS: Rt = 16,5 min, masa = 23366 45,9
TOF-MS: Rt = 17 min, masa = 23353,9 45,13
TOF-MS: Rt = 17,2 min, masa = 23365,9
Primer 46
Ispitivanje (I) BAF-3GHR test za određivanjem aktivnosti hormona rasta
BAF-3 ćelije (mišja pro-B limfoidna ćelijska linija izvedena iz koštane srži) su u početku bile IL-3 zavisni za rast i preživljavanje. IL-3 aktivira JAK-2 i STAT koji su isti posrednici. GH se aktivira nakon stimulacije. Nakon transfekcije receptora humanog hormona rasta, ćelijska linija se pretvorila u ćelijsku liniju zavisnu od hormona rasta. Ovaj klon se može koristiti za procenu uticaja različitih uzoraka hormona rasta na preživljavanje BAF-3GHR.
BAF-3GHR ćelije gaje se u mediju za gladovanje (medijum za kulturu bez hormona rasta) tokom 24 sata na 37
<0>C, 5% CO2.
Ćelije su isprane i ponovo suspendovane u mediju za gladovanje i zasejane su u ploče. 10 μL ćelija jedinjenja hormona rasta ili humanog hormona rasta u različitim koncentracijama ili kontroli se dodaje ćelijama, a ploče se inkubiraju 68 sati na 37<0>C, 5% CO2.
AlamarBlue ® se dodaje u svako ležište i ćelije se zatim inkubiraju još 4 sata. AlamarBlue ® je redoksni indikator, a smanjuje se reakcijama urođenim u ćelijskom metabolizmu i, samim tim, omogućava indirektnu meru održivog broja ćelija.
Konačno, metabolička aktivnost ćelija se meri u čitaču fluorescentnih ploča. Apsorbancija u uzorcima izražena je u % ćelija koje nisu stimulisane jedinjenjem hormona rasta ili kontrolom, a iz krivulje koncentracijareakcija može se izračunati aktivnost (količina jedinjenja koje stimuliše ćelije sa 50%).
In vitro potentnost jedinjenja 45.4 u testu BAF-3 hGH receptora prikazana je u tabeli 1 u daljem tekstu.
Stabilnost proteaze jedinjenja 45.5 je određena kao što je opisano u opštem postupku
inkubiranjem jedinjenja tokom 4 sata sa himotripsinom ili elastazom. Izmeren je procenat netaknutog GH jedinjenja i rezultati su uneti u tabelu 1.
Tabela 1. Podaci koji se odnose na jedinjenje 45,4
Primer 47
Farmakokinetika
Farmakokinetika jedinjenja iz primera je ispitivana kod muških Sprak Dauli pacova nakon intravenske (i.v.) i supkutane (s.c.) primene pojedinačne doze.
Ispitna jedinjenja su razblažena do krajnje koncentracije od 1 mg/mL u puferu za razblaživanje koji se sastoji od: Glicina 20 mg/mL, manitola 2 mg/mL, NaHCO32,5 mg/mL, pH podešen na 8,2.
Ispitivana jedinjenja su proučavana za mužjaka Sprak Dauli pacova težine 250 g. Ispitivana jedinjenja se primenjuju kao jedna injekcija ili i.v. u repnu venu ili s.c. u vrat sa iglom od 25 G u dozi od 60 nmol/kg telesne težine.
Za svako ispitivano jedinjenje, uzorkovanje krvi vrši se prema sledećem rasporedu predstavljenom u tabeli 2.
Tabela 2. Raspored uzorkovanja krvi za svako jedinjenje iz ispitivanja.
U svako vreme uzorkovanja, 0,25 ml krvi uzima se iz repne vene pomoću igle od 25 G. Krv je uzorkovana u epruvetu obloženu EDTA i smeštena na ledu do centrifugiranja na 1200 x G tokom 10 min na 4°C. Plazma se prenosi u Micronic epruvetu i čuva na -20°C do analize. Koncentracije ispitivanog jedinjenja određuju se testom ELISA sendviča korišćenjem poliklonalnog antitela na hGH zamorčeta kao hvatača i biotiniliranog proteina koji vezuje hGH (rastvorljivi deo humanog GH receptora) kao detektora. Granica detekcije testa bila je 0,2 nM.
Nekompartmentalna farmakokinetička analiza se vrši na srednjim profilima koncentracije i vremena svakog ispitivanog jedinjenja korišćenjem WinNonlin Professional (Pharsight Inc., Mountain View, CA, USA). Procene farmakokinetičkog parametra terminalnog poluživota (t1⁄2) i srednje vreme zadržavanja (MRT) se izračunavaju.
Tabela 3. Poluživot (t1⁄2) i srednje vreme zadržavanja (MRT) jedinjenja GH iz primera u Sprak Dauli pacovima nakon edne doze i.v. i s.c. rimene.
Bioraspoloživost iz primera 45.4 je procenjena na 48,3%. Vreme do maksimalne koncentracije u plazmi (t max) nakon supkutane primene bilo je 8,0 sati. Cmax je bio 1670 i 151 nM nakon i.v. i s.c. primene, respektivno.
Koncentracija ekstrapolirane plazme u nultom vremenu nakon i.v. primene koncentracija bila je 1710 nM.
Primer 48
Potentnost in vitro i poluživot niza jedinjenja su određeni kao što je gore opisano. Konjugati jedinjenja su identični, ali su povezani preko alternativnog cisteina koji je uveden mutacijom kako je opisano u tabeli 4.
Tabela 4. In vitro potentnost i poluživoti (t1⁄2).
Primer 49
In vivo studija odgovora na dozu kod pacova Sprag Dauli kojima je uklonjena hipofiza
Odnos doza-odgovor in vivo proučava se kod mužjaka pacova Sprag Dauli kojima je uklonjena hipofiza. Pacov kom je uklonjena hipofiza je dobro poznat i priznat životinjski model nedostatka hormona rasta, gde se ne dešava proizvodnja hormona rasta nakon hirurškog uklanjanja hipofize. Ovo, takođe, dovodi do niskog nivoa cirkulacije inzulinu sličnog faktora rasta-1 (IGF-1), još jedne važne kliničke karakteristike nedostatka hormona rasta kod ljudi.
Hipofizektomija se izvodi na muškim pacovima starim 4 nedelje težine 90-100 g. Životinje koje su ulazile u ispitivanje 3-4 nedelje posle operacije težine su 100-110 g. Životinjama sa povećanjem telesne težine većim od 10% tokom 3-4 nedelje nakon operacije nije dozvoljeno da uđu u studiju.
Studije reakcije na dozu se izvode korišćenjem pet nivoa doze jedinjenja 45.4 od 1-150 nmol/pacov.
Bazni nivoi IGF-1 u plazmi kod pacova Sprag Dauli kojima je uklonjena hipofiza bili su oko 80-100 ng/mL u svim grupama za doziranje. Nakon jedne doze, nivo IGF-1 brzo se povećao na 800-1000 ng/mL prvog dana, gotovo nezavisno od doze. Nivoi IGF-1 u plazmi ponovo su opadali tokom narednih dana, u zavisnosti od doze, a najbrži pad primećen sa najnižom dozom i najsporiji pad sa najvišom dozom. Pri najvišoj dozi, nivo IGF-1 u plazmi je održavan na 800-900 ng/mL tokom 3 dana pre nego što je počeo brže da opada. Nivoi koncentracije IGF-1 u plazmi su povišeni u poređenju sa kontrolnom grupom nosača za sve grupe za doziranje do 3. dana. Za grupe za doziranje od 10 nmol, 50 nmol i 150 nmol on je povišen tokom čitave studije (7 dana).
Primer 50
Nestajanje
Pretpostavlja se da je brzina apsorpcije povezana sa sposobnošću molekula da prođe uske spojeve potkožnih kapilara, svojstva koja se odnose na veličinu molekula. PEG-hGH sa PEG od 40 kDa ima prividnu molekulsku masu (mw) od 150 do 250 kDa. Molekul hGH sa kovalentno vezanim albuminom ima mw = 87 kDa, dok će molekul hGH sa nekovalentnim vezanim albuminom biti disociran od albuminskog dela vremena i tako će imati mw = 22 kDa. Vreme provedeno u disociranom stanju zavisiće od afiniteta grupe koja vezuje albumin. Stoga bi brzina apsorpcije takvih jedinjenja trebalo da bude brža nego za PEG-hGH, a stopa bi trebalo da se povećava upotrebom grupa koje vezuju albumine i koje imaju niži afinitet prema albuminu.
Ispitivani rastvori su razblaženi u standardnom puferu koji se sastoji od: Glicina 20 mg/mL, manitola 2 mg/mL, NaHCO32,4 mg/mL, pH podešen na 8,2.
Jodinacija sa<125>I sprovedena je pomoću Chemistry & Isotope Lab. Novo Nordiska A/S. Konačna radioaktivna formulacija je imala specifičnu radioaktivnu aktivnost od 3 µCi/mL i obezbeđena je u 3 mL penkalo punjenjima.
Rastvori su čuvani na 2-8°C dok nisu upotrebljeni.
Stopa nestajanja za odabrana jedinjenja izmerena je kod pet ženki svinja ukršenog LYD-a. Svinje su izvagane, izgladnjene i dat im je poseban „svinjski kaput“ kako bi nosile gama brojač i predajnik i stavljene su pojedinačne boksove pre početka studije.
Sve svinje nisu hranjene tokom 18 sati pre
ispitivanja.
Životinjama je dozirana (60 nmol) supkutano na levoj i desnoj strani vrata, respektivno, sa Novopen3<®>i NovoFine<®>28G iglom sa fiksnim crnim graničnikom igle.
Dubina ubrizgavanja bila je 5 mm.
Nestajanje radioaktivnih depoa mereno je prenosnom opremom u trajanju od oko 24-48 sati.
Za svaku pojedinačnu životinju, rezultati su predstavljeni kao AUC (0-45 sati) kao što je prikazano u tabeli 5.
Potentnost in vitro, poluživoti i dalje karakteristike niza jedinjenja su određene kao što je gore opisano i prikazane u tabeli 5.
Tabela 5. Odlike jedinjenja.
Primer 51
In vivo studija na svinjama
Da bi se dodatno potvrdila funkcionalnost hGH albuminskih konjugata prema pronalasku, odabrana su tri jedinjenja za dodatna farmakokinetička ispitivanja kod svinja. Jedinjenja koja su jednaka jedinjenjima 44.1, 44.4 i 44.5 su pripremljena konjugirajući vezivo albumina sa hGH varijantom nakon uklanjanja oznake za prečišćavanje MAEA.
Ispitivana jedinjenja su razblažena do krajnje koncentracije od 100 nmol/mL u standardnom puferu (20 mg/mL glicina, 2 mg/mL manitola, 2,4 mg mL NaHCO3, pH podešen na 8,2). Dvadeset četiri mužjaka Gotingen svinja starosti 5 meseci i težine 9-12 kg su korišćena u istraživanju. Svako ispitivano jedinjenje je bilo dozirano na osam životinja sa četiri patuljaste svinje koje su primile intravenski bolus i četiri životinje koje su primile potkožno davanje.
Intravenske injekcije su davane kroz 24 G Venflon u uho.
Doza je data kao bolus tokom najviše 5 sekundi, a zatim je dato 2 mL 0,9% NaCl. Potkožne injekcije su davane sa desne strane vrata, otprilike 5-7 cm od uha i 7-9 cm od sredine vrata. Svaka životinja dobila je jednu dozu ispitivanog jedinjenja od 10 nmol/kg. Uzorci krvi su uzeti od svake životinje u sledećim vremenskim tačkama: Pre doze, 0,08, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 18, 24, 48, 72, 96, 120, 168, 240 i 336 sati posle injekcije. Plazma je izolovana iz svakog uzorka krvi i čuvana na -20°C pre analize za ispitivano jedinjenje. Podaci o koncentraciji u plazmi i vremenu analizirani su nekompartmentalnim farmakokinetičkim postupkom.
Tabela 6. Procene farmakokinetičkog parametra nakon subkutane primene jedne doze od 10 nmol/kg.
Srednja vrednost ± SD u ()
Tabela 6 prikazuje ključne farmakokinetičke parametre za tri ispitivana jedinjenja. AUC / doza je procena izloženosti ispitivanih jedinjenja prilagođenoj dozi. T1⁄2je terminalni poluživot ispitivanih jedinjenja nakon završetka apsorpcione faze. MRT je srednje vreme zadržavanja ispitivanih jedinjenja koje odgovara vremenu koje je prosečni molekul ispitivanog jedinjenja u telu. MAT je odgovarajuće srednje vreme apsorpcije i procena je prosečnog vremena u kojem je molekul u fazi apsorpcije. F je apsolutna bioraspoloživost ispitivanih jedinjenja u odnosu na intravensku primenu.

Claims (20)

  1. PATENTNI ZAHTEVI 1. Konjugat hormona rasta koji ima formulu (I): A-W-B-GH (I) pri čemu GH predstavlja jedinjenje hormona rasta kojiima jednu Cys mutaciju izabranu iz grupe mutacija koje odgovaraju: T3C, P5C, S7C, D11C, H18C, Q29C, E30C, E33C, A34C, Y35C, K38C, E39C, Y42C, S43C, D47C, P48C, S55C, S57C, P59C, S62, E65C, Q69C, E88C, Q91C, S95C, A98C, N99C, S100C, L101C, V102C, Y103C, D107C, S108C, D112C, Q122C, G126C, E129C, D130C, G131C, P133C, T135C, G136C, T142C, D147C, N149C, D154C, A155C, L156C, R178C, E186C, G187C IG190C of hGH (SEQ ID NO: 1) B predstavlja hidrofilni spejser W je hemijska grupa koja vezuje A i B, i A predstavlja ostatak koji vezuje albumin izabran iz
    pri čemu * označava vezivanje za B preko W pri čemu je ostatak koji vezuje albumin (A) preko hidrofilnog spejsera (B) povezan sa GH preko sumpornog ostatka pojedinačne Cys mutacije, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli.
  2. 2. Konjugat prema zahtevu 1, naznačen time što je jedna Cys mutacija izabrana iz bilo koje od: T3C, P5C, S7C, D11C, H18C, Q29C, E30C, E33C, A34C, Y35C, E88C, Q91C, S95C, A98C, N99C, S100C, L101C, V102C, Y103C, D107C, S108C, D112C, Q122C i G126C u hGH (SEQ ID NO: 1).
  3. 3. Konjugat prema zahtevu 1, naznačen time što je jedna Cys mutacija izabrana iz bilo koje od: E88C, Q91C, S95C, A98C, N99C, S100C, L101C, V102C, Y103C, D107C, S108C, D112C, Q122C i G126C u hGH (SEQ ID NO: 1).
  4. 4. Konjugat prema zahtevu 1, naznačen time što je jedna Cys mutacija L101C.
  5. 5. Konjugat prema bilo kom od prethodnih zahteva 1-4, naznačen time što GH ima dodatni disulfidni most.
  6. 6. Konjugat prema zahtevu 5, naznačen time što GH ima dodatni disulfidni most između najmanje jednog para aminokiselina na pozicijama koje odgovaraju R16C/L117C, A17C/E174C, H21C/M170C, D26C/V102C, D26C/Y103C, N47C/T50C, Q49C/G161C, F54C/Y143C, F54C/S144C, F54C/F146C, S55C/Y143C, S57C/Y143C, I58C/Q141C, I58C/Y143C, I58C/S144C, P59C/Q137C, P61C/E66C, P61C/T67C, S71C/S132C, L73C/S132C, L73C/F139C, R77C/I138C, R77C/F139C, L81C/Q141C, L81C/Y143C, Q84C/Y143C, Q84C/S144C, S85C/Y143C, S85C/S144C, P89C/F146C, F92C/F146C, F92C/T148C, R94C/D107C, V102C/A105C, L156C/F146C, L156C/T148C i/ili V185C/S188C u hGH (SEQ ID NO: 1).
  7. 7. Konjugat prema bilo kom od prethodnih zahteva 5 i 6, naznačen time što najmanje jedan od cisteina dodatnog disulfidnog mosta je prisutan u segmentu petlje, kao oni iz ostataka amino-kiselina 128-154 (L3).
  8. 8. Konjugat prema zahtevu 7, naznačen time što dodatni disulfidni most povezuje L3 sa spiralom 2.
  9. 9. Konjugat prema bilo kom od prethodnih zahteva 1-8, naznačen time što GH ima najmanje 95% identičnosti sa hGH (SEQ ID 1).
  10. 10. Konjugat prema bilo kom od prethodnih zahteva 2-9, naznačen time što W ima formulu -W7-Y-, pri čemu Y je -(CH2)I7-C3-10-cikloalkil-W8- ili valentna veza, I7 je 0-6, W7je izabrano iz -C(O)NH-, -NHC(O)-, -C(O)NHCH2-, -CH2NHC(O)-, -C(O)NHS(O)2-, -S(O)2NHC(O)-, -OC(O)NH-, - NHC(O)O-, -C(O)CH2-, -CH2C(O)-, -C(O)CH=CH-, - CH=CHC(O)-, -(CH2)s3-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, ili valentna veza; naznačen time što s3 je 0 ili 1, W8je izabrano iz -C(O)NH-, -NHC(O)-, -C(O)NHCH2-, -CH2NHC(O)-, -C(O)NHS(O)2-, -S(O)2NHC(O)-, -OC(O)NH-, - NHC(O)O-, -C(O)CH2-, -CH2C(O)-, -C(O)CH=CH-, - CH=CHC(O)-, -(CH2)s4-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, ili valentna veza; naznačen time što s4 je 0 ili 1.
  11. 11. Konjugat prema bilo kom od prethodnih zahteva 2-10, naznačen time što B ima formulu -X1-X2-X3-X4-pri čemu X1je -W1-[(CHR<1>)I1-W2]m1-{[(CH2)n1E1]m2-[(CHR<2>)I2-W3]m3}n2-, X2je -[(CHR<3>)I3-W4]m4-{[(CH2)n3E2]m5-[(CHR<4>)I4-W5]m6}n4-, X3je -[(CHR<5>)I5-W6]m7-, X4je F-D1-(CH2)I6-D2-, I1, I2, I3, I4, I5 i I6 nezavisno su izabrani iz 0-16, kao što je iz 0-6 m1, m3, m4, m6 i m7 nezavisno su izabrani iz 0-10, kao što je iz 0-6 m2 i m5 nezavisno su izabrani iz 0-25, kao što je iz 0-10 n1, n2, n3 i n4 nezavisno su izabrani iz 0-16, kao što je iz 0-10 F je aril, hetaril, pirolidin-2,5-dion ili valentna veza, naznačeno time što arilne i hetarilne grupe su opciono supstituisane sa halogenom, -CN, -OH, -C(O)OH, -C(O)NH2, -S(O)2OH ili C1-6-alkilom, R<1>, R<2>, R<3>, R<4>i R<5>nezavisno su izabrani iz hidrogena, -C(O)OH, -C(O)NH2, -S(O)OH, -S(O)2OH, -NH-C(=NH)- NH2, C1-6-alkil, aril ili hetaril; naznačen time što alkilne, arilne i hetarilne grupe su opciono supstituisane sa halogenom, -C(O)OH, -C(O)NH2, -S(O)OH, -S(O)2OH, -CN ili -OH, D1, D2, E1 i E2 su nezavisno izabrani iz -O-, -N(R<6>)-, -N(C(O)R<7>)- ili su valentna veza; naznačen time što R<6>i R<7>nezavisno predstavljaju vodonik ili C1-6-alkil, W1do W5su nezavisno izabrani iz -C(O)NH-, - NHC(O)-, -C(O)NHCH2-, -CH2NHC(O)-, - C(O)NHS(O)2-, -S(O)2NHC(O)-, -OC(O)NH-, -NHC(O)O-, -C(O)CH2-, -CH2C(O)-, -C(O)CH=CH-, - CH=CHC(O)-, -(CH2)s2-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, ili su valentna veza; naznačeni time što s2 je 0 ili 1, W6je izabrano iz -C(O)NH-, -NHC(O)-, -C(O)NHCH2-, -CH2NHC(O)-, -C(O)NHS(O)2-, -S(O)2NHC(O)-, -OC(O)NH-, - NHC(O)O-, -C(O)CH2-, -CH2C(O)-, -C(O)CH=CH-, - CH=CHC(O)-, -(CH2)s1-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)-, -NHC(O)C1-6-alkila, -C(O)NHC1-6-alkila ili je valentna veza; naznačen time što s1 je 0 ili 1 i C1-6-alkilna grupa je opciono supstituisana sa okso, pirolidin-2,5-dionom, -NHC(O)CH*CH2COOH ili -NHC(O)CH2CH*COOH; pri čemu ( * ) označava tačku vezivanja atoma ugljenika CH na X4.
  12. 12. Konjugat prema zahtevu 11, naznačen time što su D1 i D2 nezavisno izabrani iz -O- ili -N(R<6>)- ili su valentna veza.
  13. 13. Konjugat prema zahtevi 11 ili 12, naznačen time što su E1 i E2 nezavisno izabrani iz -O- ili -N(R<6>)- ili su valentna veza.
  14. 14. Konjugat prema bilo kom od zahteva 10-13, naznačen time što su W1do W8nezavisno izabrani iz grupe koja se sastoji od -C(O)NH-, -NHC(O)-, -CH2NHC(O)-, -C(O)NHS(O)2-, -S(O)2NHC(O)-, -NHC(O)C1-6-alkila ili -C(O)NHC1-6-alkila ili su valentna veza; naznačen time što je alkilna grupa opciono supstituisana sa okso, pirolidin-2,5-dionom, -NHC(O)CH*CH2COOH ili -NHC(O)CH2CH*COOH; pri čemu ( * ) označava tačku vezivanja atoma ugljenika CH na X4.
  15. 15. Konjugat prema bilo kom od zahteva 11-14, naznačen time što R<1>, R<2>, R<3>, R<4>i R<5>nezavisno izabrani iz grupe vodonika, -C(O)OH, -C(O)NH2, -S(O)2OH ili C1-6-alkila; naznačen time što je alkilna grupa opciono supstituisana -C(O)OH, -C(O)NH2ili -S(O)2OH.
  16. 16. Konjugat prema bilo kom od zahteva 11-15, naznačen time što je X4valentna veza a W6je izabrani iz ili pirolidin-2,5-diona, -NHC(O)CH*CH2COOH ili -NHC(O)CH2CH*COOH pri čemu ( * ) označava tačku vezivanja atoma ugljenika CH na GH.
  17. 17. Konjugat prema bilo kom od zahteva 2-16, naznačen time što je B izabrano iz
  18. 18. Konjugat prema zahtevu 1, naznačen time što je dati konjugat izabran iz
    ,
  19. 19. Konjugat prema zahtevu 1, naznačen time što je dati konjugat izabran iz ,
    ,
    ,
    O OH .
  20. 20. Konjugat prema zahtevu 1, naznačen time što je dati konjugat izabran iz
    .
RSP20191198 2010-01-22 2011-01-24 Hormoni rasta sa produženom in-vivo efikasnošću RS59459B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US29730510P 2010-01-22 2010-01-22
EP10151405 2010-01-22
PCT/EP2011/050923 WO2011089255A1 (en) 2010-01-22 2011-01-24 Growth hormones with prolonged in-vivo efficacy
EP11705470.0A EP2525834B1 (en) 2010-01-22 2011-01-24 Growth hormones with prolonged in-vivo efficacy

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS59459B1 true RS59459B1 (sr) 2019-11-29

Family

ID=42075933

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RSP20191198 RS59459B1 (sr) 2010-01-22 2011-01-24 Hormoni rasta sa produženom in-vivo efikasnošću

Country Status (20)

Country Link
US (5) US9695226B2 (sr)
EP (1) EP2525834B1 (sr)
JP (2) JP5875527B2 (sr)
KR (1) KR101813595B1 (sr)
CN (6) CN118767116A (sr)
AU (1) AU2011208625C1 (sr)
BR (1) BR112012018116B1 (sr)
CA (1) CA2787890C (sr)
FI (1) FIC20210013I1 (sr)
FR (1) FR21C1029I2 (sr)
HU (1) HUS2100029I1 (sr)
IL (1) IL220605A (sr)
MX (2) MX380749B (sr)
NO (1) NO2021023I1 (sr)
PL (1) PL2525834T3 (sr)
RS (1) RS59459B1 (sr)
RU (1) RU2605627C2 (sr)
SI (1) SI2525834T1 (sr)
TW (1) TWI508737B (sr)
WO (1) WO2011089255A1 (sr)

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011015649A1 (en) * 2009-08-06 2011-02-10 Novo Nordisk Health Care Ag Growth hormones with prolonged in-vivo efficacy
MX338357B (es) 2010-01-22 2016-04-13 Novo Nordisk Healthcare Ag Compuestos estables de la hormona de crecimiento.
RS59459B1 (sr) * 2010-01-22 2019-11-29 Novo Nordisk Healthcare Ag Hormoni rasta sa produženom in-vivo efikasnošću
AU2013263349B2 (en) 2012-05-17 2016-09-08 Extend Biosciences, Inc Carriers for improved drug delivery
WO2014060512A1 (en) * 2012-10-17 2014-04-24 Novo Nordisk Health Care Ag Fatty acid acylated amino acids for growth hormone delivery
US11045523B2 (en) 2013-04-05 2021-06-29 Novo Nordisk Healthcare Ag Formulation of growth hormone albumin-binder conjugate
GB201315335D0 (en) 2013-08-29 2013-10-09 Of Singapore Amino diacids containing peptide modifiers
WO2015036553A1 (en) 2013-09-16 2015-03-19 Novo Nordisk Health Care Ag Thiol functionalized polymers
EP3079722B1 (en) * 2013-12-13 2021-03-24 Novo Nordisk Health Care AG Method for thioether conjugation of proteins
US9789197B2 (en) 2014-10-22 2017-10-17 Extend Biosciences, Inc. RNAi vitamin D conjugates
US9616109B2 (en) 2014-10-22 2017-04-11 Extend Biosciences, Inc. Insulin vitamin D conjugates
WO2016065042A1 (en) 2014-10-22 2016-04-28 Extend Biosciences, Inc. Therapeutic vitamin d conjugates
MA41580A (fr) * 2015-01-23 2017-11-29 Novartis Ag Conjugués d'acides gras de l'apeline synthétique présentant une demi-vie améliorée
CA3183289A1 (en) 2015-09-08 2017-03-16 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Novel human serum albumin mutant
US10286079B2 (en) 2015-09-22 2019-05-14 The Regents Of The University Of California Modified cytotoxins and their therapeutic use
CA2998528A1 (en) 2015-09-22 2017-03-30 The Regents Of The University Of California Modified cytotoxins and their therapeutic use
EP3355931B1 (en) 2015-10-01 2024-06-26 Novo Nordisk A/S Protein conjugates
JP2017165713A (ja) 2016-03-14 2017-09-21 Ｊｃｒファーマ株式会社 血清アルブミン−２０ｋ成長ホルモン融合タンパク質
US20240228573A9 (en) 2019-10-17 2024-07-11 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Method for producing fusion protein of serum albumin and growth hormone
WO2021085518A1 (ja) 2019-10-30 2021-05-06 Ｊｃｒファーマ株式会社 血清アルブミンと成長ホルモンの融合蛋白質を含有する水性医薬組成物
CN115960246B (zh) * 2021-10-13 2026-04-28 北京志道生物科技有限公司 一种重组环状人生长激素-Fc融合蛋白及其应用
KR20250075704A (ko) 2022-09-30 2025-05-28 익스텐드 바이오사이언시즈, 인크. 장기-지속형 부갑상선 호르몬
CN115845079B (zh) * 2022-11-24 2023-07-18 武汉禾元生物科技股份有限公司 一种重组人血清白蛋白与重组人生长激素的偶联物及其制备方法
JP7823234B2 (ja) * 2023-05-12 2026-03-03 ノヴォ ノルディスク アー／エス 長時間作用型成長ホルモン受容体拮抗薬およびその使用
CN118955671A (zh) * 2023-05-15 2024-11-15 上海多米瑞生物技术有限公司 补体抑制剂及其制备方法和用途

Family Cites Families (130)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8504099D0 (en) 1985-02-18 1985-03-20 Wellcome Found Physiologically active substances
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
GB8610551D0 (en) 1986-04-30 1986-06-04 Hoffmann La Roche Polypeptide & protein derivatives
JPH0665280B2 (ja) 1987-03-04 1994-08-24 味の素株式会社 タンパクゲル化剤及びそれを用いるタンパクのゲル化方法
EP0355460B1 (en) 1988-08-24 2000-12-27 American Cyanamid Company Stabilization of somatotropins by modification of cysteine residues utilizing site directed mutagenesis or chemical derivatization
US5079230A (en) 1988-09-12 1992-01-07 Pitman-Moore, Inc. Stable bioactive somatotropins
EP0397834B1 (en) 1988-10-28 2000-02-02 Genentech, Inc. Method for identifying active domains and amino acid residues in polypeptides and hormone variants
US5534617A (en) 1988-10-28 1996-07-09 Genentech, Inc. Human growth hormone variants having greater affinity for human growth hormone receptor at site 1
US6780613B1 (en) 1988-10-28 2004-08-24 Genentech, Inc. Growth hormone variants
ATE193541T1 (de) 1989-03-20 2000-06-15 Gen Hospital Corp Insulinotropes hormon
US5101018A (en) 1989-06-12 1992-03-31 International Minerals & Chemical Corp. Method for recovering recombinant proteins
DE3930696A1 (de) 1989-09-14 1991-03-28 Hoechst Ag Gallensaeurederivate, verfahren zu ihrer herstellung, verwendung als arzneimittel
ATE164852T1 (de) 1990-01-24 1998-04-15 Douglas I Buckley Glp-1-analoga verwendbar in der diabetesbehandlung
US5545618A (en) 1990-01-24 1996-08-13 Buckley; Douglas I. GLP-1 analogs useful for diabetes treatment
DK0458064T3 (da) 1990-05-04 1998-04-27 American Cyanamid Co Stabilisering af somatotropiner ved modificering af cysteinrester
US5951972A (en) 1990-05-04 1999-09-14 American Cyanamid Company Stabilization of somatotropins and other proteins by modification of cysteine residues
JP2849773B2 (ja) 1990-08-27 1999-01-27 天野製薬株式会社 ストレプトミセス属由来のトランスグルタミナーゼの製造法
DK220890D0 (da) 1990-09-14 1990-09-14 Ole Buchardt Fremgangsmaade til fremstilling af c-terminalt amiderede peptider
CA2095633C (en) 1990-12-03 2003-02-04 Lisa J. Garrard Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
JP3267293B2 (ja) 1990-12-03 2002-03-18 ジェネンテク，インコーポレイテッド 改変された結合性を有する変異タンパク質の豊富化法
IT1251895B (it) 1991-09-27 1995-05-26 Eniricerche Spa Mutanti dell'ormone della crescita umano e loro impiego
DE69333718T2 (de) 1992-01-14 2005-12-01 Ajinomoto Co., Inc. Gen, das für eine Fisch-Transglutaminase kodiert
DK0955062T3 (da) 1992-07-31 2007-09-17 Genentech Inc Vandig formulering indeholdende humant væksthormon
ZA936811B (en) 1992-10-28 1995-03-15 Upjohn Co Somatotropin modifications
US5359030A (en) 1993-05-10 1994-10-25 Protein Delivery, Inc. Conjugation-stabilized polypeptide compositions, therapeutic delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same
US5736356A (en) 1994-01-28 1998-04-07 Ajinomoto Co., Inc. Transglutaminase originating from Crassostrea gigas
NZ291414A (en) 1994-08-26 1998-05-27 Novo Nordisk As Microbial transglutaminases and methods of production using fungi and dna constructs
EP0785276A4 (en) 1994-09-29 2002-01-09 Ajinomoto Kk MODIFICATION OF A PEPTIDE AND A PROTEIN
DE4437604A1 (de) 1994-10-21 1996-04-25 Basf Ag Konjugate aus einem Poly- oder Oligopeptid und einer niedermolekularen lipophilen Verbindung
CA2208730A1 (en) 1995-01-19 1996-07-25 Novo Nordisk A/S Transglutaminases from oomycetes
JP3669390B2 (ja) 1995-02-09 2005-07-06 味の素株式会社 バチルス属細菌由来のトランスグルタミナーゼ
US5869602A (en) 1995-03-17 1999-02-09 Novo Nordisk A/S Peptide derivatives
DK0851925T3 (da) 1995-09-21 2005-11-28 Genentech Inc Humane Væksthormonvarianter
US20020077461A1 (en) 1996-04-24 2002-06-20 Soren Bjorn Pharmaceutical formulation
IL128332A0 (en) 1996-08-30 2000-01-31 Novo Nordisk As GLP-1 derivatives
EP0929576A1 (en) 1996-08-30 1999-07-21 Novo Nordisk A/S Glp-2 derivatives
US6268343B1 (en) 1996-08-30 2001-07-31 Novo Nordisk A/S Derivatives of GLP-1 analogs
US6458924B2 (en) 1996-08-30 2002-10-01 Novo Nordisk A/S Derivatives of GLP-1 analogs
CN1231675A (zh) 1996-09-26 1999-10-13 味之素株式会社 修饰的生理活性蛋白及含有该蛋白的药物组合物
US5985627A (en) 1997-02-28 1999-11-16 Carlsberg Laboratory Modified carboxypeptidase
JPH1156378A (ja) 1997-06-11 1999-03-02 Nippon Chem Res Kk 変異型ヒト成長ホルモンとその用途
ES2332931T3 (es) 1997-06-25 2010-02-15 Merck Serono Sa Analogos de hormonas glicoproteinicas entrelazadas por disulfuro, su preparacion y uso.
ES2297889T3 (es) 1997-07-14 2008-05-01 Bolder Biotechnology, Inc. Derivados de hormona de crecimiento y proteinas relacionadas.
JPH1192499A (ja) 1997-09-22 1999-04-06 Sumitomo Pharmaceut Co Ltd ヒト成長ホルモン変異体
US6136536A (en) 1997-10-29 2000-10-24 Genetics Institute, Inc. Rapid generation of stable mammalian cell lines producing high levels of recombinant proteins
EP1056774A1 (en) 1998-02-27 2000-12-06 Novo Nordisk A/S N-terminally truncated glp-1 derivatives
JP2003522099A (ja) 1998-02-27 2003-07-22 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ 遅延作用プロファイルを有するｇｌｐ−１のｇｌｐ−１誘導体及びエキセンジン
JP2002506792A (ja) 1998-02-27 2002-03-05 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ Ｎ末端修飾ｇｌｐ−１誘導体
EP1061946B1 (en) 1998-02-27 2004-04-28 Novo Nordisk A/S Glp-1 derivatives with helix-content exceeding 25 %, forming partially structured micellar-like aggregates
EP1060192A2 (en) 1998-02-27 2000-12-20 Novo Nordisk A/S Glp-2 derivatives with helix-content exceeding 25 %, forming partially structured micellar-like aggregates
US6656922B2 (en) 1998-05-28 2003-12-02 Mediplex Corporation, Korea Oral delivery of macromolecules
US6358705B1 (en) 1998-07-16 2002-03-19 Novo Nordisk A/S Method of making proteins in transformed yeast cells
CZ295044B6 (cs) 1998-12-07 2005-05-18 Societe De Conseils De Recherches Et D'application Analogy GLP-1, mající kyselinu aminoizomáselnou na pozicích 8 a 35, jejich použití a farmaceutické prostředky je obsahující
BR0010750A (pt) 1999-05-17 2002-02-26 Conjuchem Inc Peptìdeos insulinotrópicos de longa duração
US6309663B1 (en) 1999-08-17 2001-10-30 Lipocine Inc. Triglyceride-free compositions and methods for enhanced absorption of hydrophilic therapeutic agents
EP1198565A1 (en) 1999-07-07 2002-04-24 Maxygen Aps A method for preparing modified polypeptides
EP1076066A1 (en) 1999-07-12 2001-02-14 Zealand Pharmaceuticals A/S Peptides for lowering blood glucose levels
US6528486B1 (en) 1999-07-12 2003-03-04 Zealand Pharma A/S Peptide agonists of GLP-1 activity
GB2355009A (en) 1999-07-30 2001-04-11 Univ Glasgow Peptides conjugated to bile acids/salts
US20040001827A1 (en) 2002-06-28 2004-01-01 Dennis Mark S. Serum albumin binding peptides for tumor targeting
WO2001051071A2 (en) 2000-01-11 2001-07-19 Novo Nordisk A/S Transepithelial delivery of glp-1 derivatives
CA2739933A1 (en) 2000-02-11 2001-08-16 Bayer Healthcare Llc Factor vii or viia-like molecules
EP2213743A1 (en) 2000-04-12 2010-08-04 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
IL152804A0 (en) 2000-05-16 2003-06-24 Bolder Biotechnology Inc Methods for refolding proteins containing free cysteine residues
US20020142964A1 (en) 2000-11-02 2002-10-03 Nissen Torben Lauesgaard Single-chain polypeptides
IL155812A0 (en) 2000-12-07 2003-12-23 Lilly Co Eli Glp-1 fusion proteins
US20060183197A1 (en) * 2001-01-11 2006-08-17 Andersen Kim V Variant growth hormone molecules conjugated with macromolecules compounds
AU2002219021A1 (en) * 2001-01-11 2002-07-24 Maxygen Aps Variant growth hormone molecules conjugated with macromolecular compounds
FR2819810B1 (fr) 2001-01-23 2004-05-28 Pf Medicament Peptides non glycosyles derives de la proteine g du vrs et leur utilisation dans un vaccin
US6858580B2 (en) 2001-06-04 2005-02-22 Nobex Corporation Mixtures of drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
ES2331909T3 (es) 2001-06-14 2010-01-20 The Scripps Research Institute Factor viii estabilizado con enlaces disulfuro modificados geneticamente.
WO2003002136A2 (en) 2001-06-28 2003-01-09 Novo Nordisk A/S Stable formulation of modified glp-1
EP1423136A4 (en) 2001-08-10 2007-07-25 Epix Pharm Inc POLYPEPTIDE CONJUGATES WITH EXTENDED CIRCULAR HALF TIME
AR036711A1 (es) 2001-10-05 2004-09-29 Bayer Corp Peptidos que actuan como agonistas del receptor del glp-1 y como antagonistas del receptor del glucagon y sus metodos de uso farmacologico
EP1444262A2 (en) 2001-11-12 2004-08-11 University of Wales College of Medicine Growth hormone variations in humans and their uses
WO2003044056A2 (en) 2001-11-20 2003-05-30 Pharmacia Corporation Chemically-modified human growth hormone conjugates
JP2003199569A (ja) 2001-12-17 2003-07-15 Food Industry Research & Development Inst ストレプトベルティシリウム・ラダカヌムのトランスグルタミナーゼ遺伝子及び該遺伝子によってコードされるトランスグルタミナーゼ
FR2836382B1 (fr) 2002-02-28 2004-08-13 Biomerieux Sa Nouveaux agents de couplages, leurs conjugues, ainsi que l'utilisation de ces conjugues dans des methodes de diagnostic
AU2003278807A1 (en) 2002-03-01 2004-08-13 Bracco International B.V. Kdr and vegf/kdr binding peptides and their use in diagnosis and therapy
CA2480858A1 (en) 2002-04-10 2003-10-23 Eli Lilly And Company Treatment of gastroparesis
WO2003093465A1 (en) 2002-04-30 2003-11-13 Maxygen Holdings Ltd. FACTOR VII OR VIIa POLYPEPTIDE VARIANTS
DE60332358D1 (de) 2002-09-09 2010-06-10 Hanall Pharmaceutical Co Ltd Protease-resistente modifizierte interferon alpha polypeptide
DE602004025205D1 (de) 2003-02-19 2010-03-11 Ipsen Pharma Glp-1-analoga
BRPI0409976A (pt) 2003-05-09 2006-05-09 Novo Nordisk As composto, métodos para retardar a progressão de igt diabetes do tipo 2, para retardar a progressão de diabetes do tipo 2 para diabetes que requer insulina, para tratar obesidade ou prevenir excesso de peso para regular o apetite para induzir saciedade, para prevenir ganho de peso após se ter tido sucesso em perder peso, para aumentar dispêndio de energia, para tratar uma doença ou estado e para tratar bulimia, composição farmacêutica, e, uso de um composto
WO2005014049A2 (en) 2003-08-08 2005-02-17 Novo Nordisk A/S Synthesis and application of new structural well defined branched polymers as conjugating agents for peptides
CN100444898C (zh) 2003-09-19 2008-12-24 诺沃挪第克公司 治疗肽的清蛋白结合型衍生物
EP1667724A2 (en) 2003-09-19 2006-06-14 Novo Nordisk A/S Albumin-binding derivatives of therapeutic peptides
BR122019021416A2 (sr) * 2003-09-19 2019-12-21
RU2401276C2 (ru) 2003-09-19 2010-10-10 Ново Нордиск А/С Производные глюкагон-подобного пептида-1 (glp-1)
JP2008502301A (ja) 2003-10-10 2008-01-31 ノボ　ノルディスク　アクティーゼルスカブ ペプチドの抱合
ATE461217T1 (de) 2003-12-18 2010-04-15 Novo Nordisk As Glp-1-verbindungen
EP1696962A2 (en) 2003-12-18 2006-09-06 Novo Nordisk A/S Novel glp-1 analogues linked to albumin-like agents
US20070105770A1 (en) 2004-01-21 2007-05-10 Novo Nordisk A/S Transglutaminase mediated conjugation of peptides
ES2642214T3 (es) 2004-01-21 2017-11-15 Novo Nordisk Health Care Ag Conjugación de péptidos mediante transglutaminasa
BRPI0507169A (pt) 2004-02-02 2007-06-26 Ambrx Inc polipeptìdeos do hormÈnio de crescimento humano modificados e seu usos
BRPI0508798A (pt) 2004-04-07 2007-09-04 Ares Trading Sa formulação lìquida de hormÈnio de crescimento, composição farmacêutica, forma de apresentação da formulação lìquida de hormÈnio de crescimento e uso da formulação lìquida de hormÈnio de crescimento
US7906137B2 (en) 2004-05-21 2011-03-15 Mediplex Corporation, Korea Delivery agents for enhancing mucosal absorption of therapeutic agents
CA2572770A1 (en) 2004-07-08 2006-01-19 Novo-Nordisk A/S Polypeptide protracting tags comprising a tetrazole moiety
US20090176967A1 (en) 2004-08-02 2009-07-09 Novo Nordisk Healthcare A/G Conjugation of FVII
WO2006037810A2 (en) 2004-10-07 2006-04-13 Novo Nordisk A/S Protracted glp-1 compounds
US7998930B2 (en) 2004-11-04 2011-08-16 Hanall Biopharma Co., Ltd. Modified growth hormones
CN103520735B (zh) 2004-12-22 2015-11-25 Ambrx公司 包含非天然编码的氨基酸的人生长激素配方
US8603972B2 (en) 2005-03-18 2013-12-10 Novo Nordisk A/S Extended GLP-1 compounds
TWI362392B (en) 2005-03-18 2012-04-21 Novo Nordisk As Acylated glp-1 compounds
EP1863537A2 (en) 2005-03-18 2007-12-12 Novo Nordisk A/S Dimeric peptide agonists of the glp-1 receptor
MX2007015676A (es) 2005-06-15 2008-02-20 Novo Nordisk Healthcare Ag Conjugacion de la hormona de crecimiento mediada por transglutaminasa.
ES2553160T3 (es) 2005-06-17 2015-12-04 Novo Nordisk Health Care Ag Reducción y derivatización selectivas de proteínas Factor VII transformadas por ingeniería que comprenden al menos una cisteína no nativa
US20090117640A1 (en) 2005-08-18 2009-05-07 Novo Nordisk Health Care Ag Transglutaminase Variants with Improved Specificity
US8293708B2 (en) 2005-08-30 2012-10-23 Novo Nordisk Health Care A/G Liquid formulations N-terminal serine of pegylated growth hormone
CN1939534B (zh) 2005-09-27 2010-12-01 长春金赛药业股份有限公司 含有人生长激素或人粒细胞巨噬细胞刺激因子的用于治疗损伤和溃疡的外用制剂
AU2007215566A1 (en) 2006-01-19 2007-08-23 Ambrx, Inc. Non-natural amino acid polypeptides having modulated immunogenicity
JP5486809B2 (ja) 2006-02-14 2014-05-07 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アーゲー Ｃ末端におけるポリペプチドの結合
BRPI0713963A2 (pt) * 2006-07-07 2012-11-27 Novo Nordisk Healthcare Ag conjugados de proteìna e métodos para sua preparação
ES2745411T3 (es) 2006-07-27 2020-03-02 Wang Nai Fang Compuestos y composiciones de arilsulfanilo para administración de agentes activos
WO2008020075A1 (en) 2006-08-18 2008-02-21 Novo Nordisk Health Care Ag Transglutaminase variants with improved specificity
BRPI0716261A2 (pt) 2006-08-31 2013-08-06 Novartis Ag composiÇÕes farmacÊuticas compreendendo hch para distribuiÇço oral
US20080095837A1 (en) 2006-08-31 2008-04-24 Emisphere Technologies, Inc. Human growth hormone formulations
US8383852B2 (en) 2007-02-16 2013-02-26 Emisphere Technologies, Inc. Compounds having a cyclic moiety and compositions for delivering active agents
GB0716328D0 (en) 2007-08-21 2007-10-03 Univ Bath Detection and functionalisation of S-nitrosylated polypeptides
WO2009030771A1 (en) 2007-09-05 2009-03-12 Novo Nordisk A/S Peptides derivatized with a-b-c-d- and their therapeutical use
MX2011000847A (es) 2008-08-06 2011-02-25 Novo Nordisk Healthcare Ag Proteinas conjugadas con eficacia prolongada in vivo.
WO2010029107A1 (en) 2008-09-09 2010-03-18 Novo Nordisk Health Care Ag Growth hormone conjugate with increased stability
ES2561208T3 (es) * 2008-09-12 2016-02-25 Novo Nordisk A/S Método de acilación de un péptido o una proteína
MX2011007736A (es) 2009-01-22 2011-09-06 Novo Nordisk Healthcare Ag Compuestos de hormona del crecimiento estables.
ES2401965T3 (es) 2009-02-19 2013-04-25 Novo Nordisk A/S Modificación de Factor VIII
WO2011015649A1 (en) 2009-08-06 2011-02-10 Novo Nordisk Health Care Ag Growth hormones with prolonged in-vivo efficacy
MX338357B (es) 2010-01-22 2016-04-13 Novo Nordisk Healthcare Ag Compuestos estables de la hormona de crecimiento.
RS59459B1 (sr) 2010-01-22 2019-11-29 Novo Nordisk Healthcare Ag Hormoni rasta sa produženom in-vivo efikasnošću
ES2582590T3 (es) 2010-02-16 2016-09-13 Novo Nordisk A/S Método de purificación
US11045523B2 (en) 2013-04-05 2021-06-29 Novo Nordisk Healthcare Ag Formulation of growth hormone albumin-binder conjugate

Also Published As

Publication number Publication date
BR112012018116A2 (pt) 2018-05-08
RU2012134975A (ru) 2014-02-27
AU2011208625C1 (en) 2022-08-18
BR112012018116B1 (pt) 2022-06-21
AU2011208625A1 (en) 2012-07-19
SI2525834T1 (sl) 2019-10-30
EP2525834A1 (en) 2012-11-28
CA2787890C (en) 2020-01-14
TW201127397A (en) 2011-08-16
TWI508737B (zh) 2015-11-21
CA2787890A1 (en) 2011-07-28
CN102834109A (zh) 2012-12-19
RU2605627C2 (ru) 2016-12-27
CN118767116A (zh) 2024-10-15
US8779109B2 (en) 2014-07-15
JP2016026204A (ja) 2016-02-12
IL220605A (en) 2017-09-28
CN106139158B (zh) 2024-06-21
US20120309944A1 (en) 2012-12-06
MX380749B (es) 2025-03-12
MX345736B (es) 2017-02-14
JP5875527B2 (ja) 2016-03-02
FR21C1029I1 (fr) 2021-08-27
FIC20210013I1 (fi) 2021-05-21
CN118767115A (zh) 2024-10-15
US20200102568A1 (en) 2020-04-02
HUS2100029I1 (hu) 2021-09-28
JP2013518038A (ja) 2013-05-20
CN106139158A (zh) 2016-11-23
PL2525834T3 (pl) 2020-10-19
WO2011089255A1 (en) 2011-07-28
KR20130028053A (ko) 2013-03-18
US20190203213A1 (en) 2019-07-04
FR21C1029I2 (fr) 2023-06-16
EP2525834B1 (en) 2019-07-17
CN103002918B (zh) 2016-05-04
CN102834109B (zh) 2016-01-20
NO2021023I1 (no) 2021-05-26
AU2011208625B2 (en) 2014-05-08
US9695226B2 (en) 2017-07-04
US20170239362A1 (en) 2017-08-24
CN118767117A (zh) 2024-10-15
KR101813595B1 (ko) 2017-12-29
CN103002918A (zh) 2013-03-27
US20140107324A1 (en) 2014-04-17
MX2012008000A (es) 2012-08-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2525834B1 (en) Growth hormones with prolonged in-vivo efficacy
EP2461831B1 (en) Growth hormones with prolonged in-vivo efficacy
JP2008543297A (ja) トランスグルタミナーゼを介した成長ホルモンのコンジュゲート
ES2745484T3 (es) Hormonas de crecimiento con eficacia prolongada in vivo
AU2013204527A1 (en) Growth hormones with prolonged in-vivo efficacy
ES2703388T3 (es) Hormonas de crecimiento con eficacia prolongada in vivo