ES2247588T3

ES2247588T3 - Materiales y metodos para el manejo del rechazo hiperagudo en xenotransplantes humanos.

Info

Publication number: ES2247588T3
Application number: ES95907116T
Authority: ES
Inventors: Martin J. Pearse; Robert J. Crawford; Allan J. Robbins; Peter D. Rathjen; Anthony J.F. D'apice
Original assignee: St Vincents Hospital Melbourne Ltd
Current assignee: St Vincents Hospital Melbourne Ltd
Priority date: 1994-01-27
Filing date: 1995-01-27
Publication date: 2006-03-01
Anticipated expiration: 2015-01-27
Also published as: US20040171155A1; DE69534227T2; US6849448B1; AU695373B2; EP0755451A4; ATE296349T1; EP0755451B1; DE69534227D1; EP0755451A1; US5849991A; US7201899B2; AU1544595A; CA2181433A1; CA2181433C; BR9506652A

Abstract

LOS XENOANTICUERPOS PRE-FORMADOS HUMANOS JUEGAN UN IMPORTANTE PAPEL EN LA RESPUESTA DE RECHAZO HIPERAGUDO EN XENOTRANSPLANTACION HUMANA. SE HAN DESCUBIERTOS MATERIALES Y METODOS PARA REMOVER O NEUTRALIZAR TALES ANTICUERPOS. TAMBIEN SE HAN DSCUBIERTO MATERIALES Y METODOS PARA REDUCIR O ELIMINAR LOS EPITOPOS EN LOS ORGANOS DEL DONANTE QUE SON RECONOCIDOS POR TALES ANTICUERPOS. TALES EPITOPOS SE FORMAN COMO RESULTADO DE LA ACTIVIDAD MEDIANTE LA ENZIMA {AL}-1,3-GALACTOSILTRANSFERASA. SE HA DESCUBIERTO EL GEN PORCINO QUE CODIFICA LA {AL}1,3GALACTOSILTRANSFERASA, ASI COMO MATERIALES Y METODOS PARA INACTIVAR ("DEJAR FUERA DE COMBATE") EL GEN DE LA {AL}1,3GALACTOSILTRANSFERASA EN CELULAS DE MAMIFEROS Y EMBRIONES. SE INCLUYEN CONSTRUCCIONES DE ACIDOS NUCLEICOS UTILES PARA INACTIVAR EL GEN DE LA {AL}-1,3-GALACTOSILTRANSFERASA EN UNA CELULA DIANA. TAMBIEN SE HA DESCUBIERTO UN NUEVO FACTOR INHIBIDOR DE LA LEUCEMIA (T-LIF) QUE ES UTIL PARA MANTENER LAS CELULAS EMBRIONICAS MADRE Y CELULAS DE GERMEN PRIMORDIAL EN UN CULTIVO

Description

Materiales y métodos para el manejo del rechazo hiperagudo en xenotransplantes humanos.

Campo de la invención

Esta invención se relaciona generalmente con el campo de la xenotrasplantación. En particular, esta invención se relaciona con métodos y materiales para la reducción o eliminación de la respuesta de rechazo hiperagudo en humanos. Más particularmente, esta invención se relaciona con métodos para tratar suero humano para reducir o eliminar el rechazo hiperagudo. Esta invención también se relaciona con métodos y materiales para generar órganos no humanos que carezcan o que tengan actividad reducida de la \alpha-1,3 galactosil transferasa.

Antecedentes de la invención

Es ampliamente reconocido que existe una escasez aguda a escala mundial de órganos humanos para trasplantación. Esto a pesar de los cambios legislativos y de programas de educación para incrementar la conciencia pública del problema. En los Estados Unidos, por ejemplo, existe una insuficiencia estimada anual de aproximadamente 18.000 riñones/año. En forma similar, en Australia en 1992, solamente 41% de los pacientes renales esperando por una trasplantación recibieron transplantes. En Japón el desequilibrio entre el suministro y la demanda es aún mayor debido a prohibiciones religiosas sobre el uso de órganos de donantes cadavéricos.

Los beneficios de la trasplantación pueden verse comparando las tasas de rehabilitación de pacientes con transplante con aquellos pacientes con diálisis. En Australia y Nueva Zelanda, la mayoría de los pacientes con transplante (60%) son capaces de trabajar o de estudiar tiempo completo con un 10% adicional en trabajo de medio tiempo, mientras que solamente 7% son inaptos para trabajar. En contraste, 23% de los pacientes con diálisis son capaces de trabajar o estudiar tiempo completo, con un 15% involucrados en trabajos de medio tiempo y 20% inaptos para trabajar. El resto están "retirados". Decimoquinto Reporte del Registro de Diálisis y Transplantes en Australia y Nueva Zelanda (ANZDATA). Hospital Queen Elizabeth, Woodville, S.A., APS Disney, ed. (1992).

Los costos financieros directos de una diálisis en Australia y Nueva Zelanda es aproximadamente de \textdollar A45.000/pa-
ciente/año. Además, los costos indirectos debido a desempleo y enfermedad son más altos en pacientes con diálisis y los costos sociales son considerables. La trasplantación genera un gasto aproximadamente de \textdollar A30.000/paciente/año en el primer año y \textdollar A14.000/paciente/año después. Estas estadísticas indican que a) la trasplantación es la terapia óptima para una etapa final de falla renal; b) existe un desabastecimiento de riñones donados; y c) las estrategias presentes dirigidas a incrementar la tasa de transplantes no han sido exitosas. Además, existe una seria escasez de otros órganos transplantables, incluidos corazones, hígados, pulmones y páncreas.

El uso de injertos (transplantes entre especies) es una opción para superar el bajo suministro de órganos humanos para trasplantación. Los injertos no viables, no antigénicos son usados comúnmente en reconstrucción vascular (arterias de bovino) y en cirugía cardiaca (válvulas cardíacas de porcinos). Sin embargo, a pesar de su uso ocasional en el pasado, las barreras inmunológicas han impedido el uso común de injertos viables. Entre 1964 y 1991, se reportaron un total de 27 injertos de primates no humanos a órganos humanos; la supervivencia más larga reportada para un paciente fue de 9 meses. Recientemente fueron realizados dos transplantes de hígado de mandril a humano en prevención de que las nuevas terapias pudieran competir con los problemas de rechazo severo que puedan ocurrir en xenotransplante. Hasta ahora, ha sido reportada la suerte de uno de estos pacientes, y en este caso el rechazo no fue la causa directa de la muerte. Starzl y colaboradores, Baboon-to-Human Liver Transplantation. Lancet 341: 65-71 (1993). Esta experiencia clínica indica que a) los órganos no humanos pueden funcionar y soportar la vida humana; b) los episodios de rechazo pueden revertirse por medio de terapia antirrechazo convencional; y c) los mecanismos de rechazo son similares, en principio, a aquellos de rechazo por transplante alogénico.

Es improbable que los primates sean una fuente satisfactoria de órganos para xenotrasplantación. La mayoría son especies en peligro, criadas lentamente en forma silvestre y pobremente en cautiverio. El mandril es una excepción a estas generalizaciones, pero otras desventajas limitan la utilidad de estas especies. Los mandriles gestan en forma única, tienen períodos de gestación largos, son caros y difíciles de mantener y pueden infectarse por organismos o transportarlos, particularmente virus que son patógenos en humanos. Para corazones y riñones donde el tamaño del órgano puede ser importante, los primates más pequeños son insatisfactorios como donantes para adultos humanos. Finalmente, es probable que el uso de primates haga crecer considerablemente la oposición por parte del público.

Estas dificultades han conducido a un interés renovado en el uso de especies no primates como donadoras de órganos para pacientes humanos. El cerdo es una escogencia ampliamente reconocida para xenotrasplantación en humanos. El diámetro de los eritrocitos en los cerdos (6,5 \mum) y por implicación, su tamaño capilar, son similares a los de los humanos, facilitando la conexión de injertos al sistema circulatorio humano. Las crías de cerdo con buena salud en cautividad, tienen un tiempo de gestación corto y producen grandes camadas. Además, los cerdos pueden ser criados y mantenidos en instalaciones con pocos patógenos, pueden ser criados a cualquier tamaño y no incrementan el nivel de reacción pública asociada con los primates.

Las barreras inmunológicas para utilizar órganos de cerdo en pacientes humanos incluyen a) un fenómeno de rechazo severo ("hiperagudo") inmediato que se desarrolla en minutos o en horas después de la trasplantación, y b) un rechazo agudo declarado que se desarrolla en días o en semanas. Una vez que el fenómeno de rechazo hiperagudo ha sido superado, se espera que sobrevenga un rechazo agudo normal. Se piensa que esta forma de rechazo es similar a aquella experimentada con los transplantes alogénicos (transplantes entre individuos de la misma especie) y debería ser tratable por medio de terapias inmunosupresoras normales.

Se piensa que tanto los "anticuerpos naturales" formados previamente (xenoanticuerpos) como los factores de regulación complementaria en suero humano están involucrados en el proceso de rechazo hiperagudo. Se piensa que el rechazo hiperagudo se inicia cuando los xenoanticuerpos se unen a epítopos sobre el endotelio de un órgano de donante, activando la ruta complementaria clásica.

Sandrin y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci., 90, 11391-11395 (1993) describen que los anticuerpos en suero humano reaccionan predominantemente con los epítopos Gal (\alpha-1,3) Gal encontrados sobre las superficies de células de cerdo y el aislamiento de la \alpha-1,3 galactosiltransferasa de múrido.

Resumen de la invención

Una molécula de ácido nucleico aislada y purificada de la presente invención contiene la secuencia de porcino de ácidos nucleicos descrita en la Figura 4 (SEQ ID NO: 7), que codifica a un polipéptido porcino que tiene actividad de \alpha-1,3 galactosiltransferasa. Las variaciones sobre esta secuencia que pueden ser generadas rutinariamente por un artífice entrenado incluyen a aquellas secuencias que corresponden a la Figura 4 pero que varían dentro del ámbito de degeneración del código genético. Esto es, la presente invención incluye las variantes de la secuencia señaladas en la Figura 4, fácilmente determinadas por el artífice entrenado, que codifican la misma secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia señalada en la Figura 4. La presente invención también incluye una molécula de ácido nucleico aislada y purificada que codifica a una \alpha-1,3 galactosiltransferasa de porcino y que hibridiza bajo condiciones estándar altamente severas con una secuencia complementaria a la secuencia señalada en la Figura 4, o con una secuencia complementaria a una variación de la secuencia señalada en la Figura 4 dentro del ámbito de la degeneración del código genético. Las cadenas complementarias a las secuencias de ácido nucleico anteriormente descritas se determinan fácilmente por métodos estándar, y están dentro del alcance de la presente invención.

Dentro de los parámetros señalados en el párrafo anterior, la presente invención incluye variantes de la secuencia de codificación de la \alpha-1,3 galactosiltransferasa de porcino que conservan las características funcionales del producto del gen nativo. Tales variantes incluyen, por ejemplo, variaciones menores de nucleótidos en la región no traducida 5' o en varias regiones de codificación de la secuencia descrita. Las variaciones menores de aminoácidos derivadas de cambios en las regiones de codificación, que dejan un sitio catalítico \alpha-1,3 galactosiltransferasa funcional, dominio de anclaje de membrana y región troncal como se describa más abajo, están dentro del alcance de la presente invención. Tales variaciones de rutina en las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos pueden ser identificadas por aquellos ordinariamente entrenados en la técnica con base en la información estructural y de secuencia suministrada aquí.

Como se la utiliza aquí, "condiciones altamente severas" son aquellas condiciones de hibridación generalmente entendidas por el experto en la técnica para reflejar condiciones estándar altamente severas como las señaladas en los protocolos ampliamente reconocidos para la hibridación de ácido nucleico. Ver, por ejemplo, Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2^{da} Edición), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), páginas 1.101 - 1.104; 9.47 - 9.58 y 11.45 - 11.57. Generalmente, estas condiciones reflejan al menos un lavado de la membrana de hibridación en SSC entre 0,05x hasta 0,5x con SDS al 0,1% a 65ºC, o condiciones de lavado de severidad equivalente.

La presente invención también incluye una célula huésped transformada con cualquiera de las moléculas de ácido nucleico aisladas y purificadas anteriormente descritas, así como una \alpha-1,3 galactosiltransferasa de porcino codificada por tales moléculas de transformación de ácido nucleico y expresadas a partir de la célula huésped. Los métodos para la transformación apropiada de células huésped y para expresar polipéptidos a partir de tales células huésped, son conocidos en el arte y se describen, por ejemplo, en Sambrook y colaboradores, (1984), páginas 12.2-12.44;
16.3-17-44.

La invención incluye además una construcción de ADN útil para inactivar al gen de la \alpha-1,3 galactosiltransferasa de porcino por inserción de una secuencia deseada de ADN dentro de un sitio de inserción del gen. Como se lo usa aquí, el término "gen de la \alpha-1,3 galactosiltransferasa" incluye los exones que codifican o que potencialmente codifican a la \alpha-1,3 galactosiltransferasa, intrones contiguos a tales exones, y elementos reguladores de tales asociados con tales exones e intrones. La construcción de ADN incluye la secuencia de ADN deseada flanqueada por una primera y una segunda secuencias de homología. Estas primera y segunda secuencias de homología son suficientemente homólogas, respectivamente, a la primera y una segunda secuencias genómicas que flanquean el sitio de inserción para permitir la recombinación homóloga de la construcción de ADN con el gen de la \alpha-1,3 galactosiltransferasa cuando se introduce la construcción de ADN dentro de una célula objetivo que contiene al gen de la \alpha-1,3 galactosiltransferasa de porcino. Preferiblemente, el sitio de inserción está dentro del exón 4, el exón 7, el exón 8 o el exón 9 del gen de la \alpha-1,3 galactosiltransferasa. La secuencia deseada de ADN es preferiblemente un marcador seleccionable, incluido pero no limitado al gen neo^{R}, el gen (hyg^{R}) de resistencia a la hidromicina y el gen de la timidina-quinasa. La secuencia deseada de ADN puede ser confinada a los dos extremos a ambos extremos por elementos FTR ADN, con codones de detención para cada uno de los tres marcos de lectura que están insertados en 3' a la secuencia de deseada de ADN. La presencia de los elementos FRT permiten que el marcador seleccionable sea suprimido de la célula objetivo, y los codones de detención garantizan que el gen de la \alpha-1,3 galactosiltransferasa permanezca inactivo después de la supresión del marcador seleccionable.

La invención incluye además una construcción de ADN útil para inactivar al gen de la \alpha-1,3 galactosiltransferasa de múrido por inserción de la secuencia deseada de ADN dentro de un sitio de inserción del gen. La construcción de ADN incluye la secuencia deseada de ADN flanqueada por la primera y la segunda secuencias de homología. Estas primera y segunda secuencias de homología son suficientemente homólogas, respectivamente, a la primera y segunda secuencias genómicas que flanquean el sitio de inserción para permitir la recombinación homóloga de la construcción de ADN con el gen de la \alpha-1,3 galactosiltransferasa de múrido cuando se introduce la construcción de ADN dentro de una célula que contiene al gen de la \alpha-1,3 galactosiltransferasa de múrido. Preferiblemente, el sitio de inserción está dentro del exón 4, exón 7, exón 8 o exón 9 del gen de la \alpha-1,3 galactosiltransferasa de múrido. La secuencia deseada de ADN es preferiblemente un marcador seleccionable, incluido pero no limitado al gen neo^{R}, al gen hyg^{R} y al gen de la timidina-quinasa. La secuencia deseada de ADN puede ser confinada a ambos extremos por elementos FRT ADN, con codones de detención para cada uno de los tres marcos de lectura que están insertadas en 3' a la secuencia deseada de ADN. La presencia de los elementos FRT permite a los marcadores seleccionables ser suprimidos de la célula objetivo, y los codones de detención aseguran que el gen de la \alpha-1,3 galactosiltransferasa permanezca inactivo después de suprimir al marcador seleccionable.

La invención también incluye métodos para generar células totipotentes de mamífero que tienen al menos un alelo inactivado (no funcional) de la \alpha-1,3 galactosiltransferasa, en donde la célula totipotente se deriva de una especie de mamíferos en cuyos alelos para el gen de la \alpha-1,3 galactosiltransferasa normalmente están presentes y funcionales. Un alelo "funcional" es capaz de ser transcrito y trasladado para producir un polipéptido que tiene una actividad que es la misma o sustancialmente similar que para la \alpha-1,3 galactosiltransferasa nativa. Los métodos incluyen proveer una pluralidad de células caracterizadas como células totipotentes de las especies de mamíferos mencionadas, introduciendo dentro de las células totipotentes una construcción de ácido nucleico efectiva para inactivar al gen de la \alpha-1,3 galactosiltransferasa por inserción de una secuencia deseada de ADN en un sitio de inserción del gen a través de una recombinación homóloga, y luego identificar una célula totipotente que tenga al menos un alelo inactivado de la \alpha-1,3 galactosiltransferasa.

Las células totipotentes pueden incluir, sin limitación, células troncales embriónicas (ES), células germinales primordiales (PGC) y óvulos. Las células pueden ser tomadas a partir de una variedad de especies de mamíferos en cuyos alelos para el gen de la \alpha-1,3 galactosiltransferasa están presentes y funcionales, incluyendo sin limitación al múrido y a especies de porcinos.

La invención incluye además, métodos para generar un mamífero carente de un gen funcional de la \alpha-1,3 galactosiltransferasa, en donde el mamífero pertenece a una especie que tiene un gen funcional de la \alpha-1,3 galactosiltransferasa. Los métodos incluyen proveer una célula totipotente de mamífero que tiene al menos un alelo inactivado de la \alpha-1,3 galactosiltransferasa, en donde la célula totipotente se deriva de las especies de mamíferos mencionadas que tienen un gen funcional de la \alpha-1,3 galactosiltransferasa, manipulando la célula totipotente de tal manera que los descendientes mitóticos de la célula constituyen el todo o parte de un embrión en desarrollo, permitiendo al embrión que se desarrolle a término, obteniendo un único neonato derivado del embrión, y levantando y criando al neonato para obtener un mamífero homocigoto para alelos inactivados de la \alpha-1,3 galactosiltransferasa, esto es, un mamífero en el cual ambos alelos de la \alpha-1,3 galactosiltransferasa están inactivados.

Las células totipotentes pueden incluir, sin limitación, células ES, PGC y óvulos. Las células pueden tomarse de una variedad de especies de mamíferos en cuyos alelos para el gen de la \alpha-1,3 galactosiltransferasa están presentes y funcionales, incluyendo sin limitación al múrido y especies de porcinos. Las células ES y las PGC se manipulan de diferentes maneras tales que sus descendientes mitóticos se encuentran en embriones en desarrollo. Estas manipulaciones pueden incluir, sin limitación, la inyección dentro de embrión en etapa de blastocisto o mórula llegan a incorporarse en el interior de la masa celular del embrión en blastocisto, dando origen a diferentes tipos de células diferenciadas del embrión resultante, incluyendo en algunos casos células de gérmenes. El embrión derivado de tales manipulaciones es una quimera compuesta de células embriónicas normales así como de descendientes mitóticos de las células ES, o PGC. Alternativamente, los embriones quiméricos pueden obtenerse por cocultivo de al menos una célula ES o PGC con un embrión en mórula en el cual la zona pelúcida está suficientemente rota para permitir un contacto directo entre las células ES/PGC y al amenos una célula de la mórula. El embrión interrumpido en la zona pelúcida puede ser un embrión que esté completamente libre de la zona pelúcida. Finalmente, el genoma de una célula ES o PGC puede incorporarse dentro de un embrión fusionando las células ES/PGC con un cigoto enucleado. Tal procedimiento es capaz de generar un embrión no genérico, esto es, un embrión en el cual todos los núcleos son descendientes mitóticos de los núcleos de células ES/PGC fusionadas. Los embriones resultantes se implantan en un receptor hembra, o madre sustituta y se les permite desarrollarse hasta término.

Cuando los óvulos, en forma opuesta a las células ES o a las PGC se inyectan directamente con una construcción de ácido nucleico efectiva para inactivar el gen de la \alpha-1,3 galactosiltransferasa, los óvulos pueden ser manipulados para formar un embrión por implante dentro de un receptor hembra.

La invención incluye también un mamífero, producido a través de intervención humana, que carece de un gen funcional de la \alpha-1,3 galactosiltransferasa. El mamífero pertenece a una especie en la cual el gen de la \alpha-1,3 galactosiltransferasa está normalmente presente y funcional. El mamífero puede ser, sin limitaciones, un ratón o un cerdo.

La invención incluye además una molécula de ácido nucleico aislada y purificada que contiene una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de (1) la secuencia de ácido nucleico descrita en la Figura 26 (SEQ ID NO: 25), (2) una secuencia correspondiente a la secuencia de (1) dentro del alcance de la degeneración del código genético, y (3) una secuencia que codifica T-LIF de múrido y que híbrida bajo condiciones estándar altamente estrictas con una secuencia complementaria a la secuencia de (1) ó (2). Las cadenas complementarias a las secuencias de ácido nucleico anteriormente descritas, se determinan fácilmente por métodos estándar, y se encuentran también dentro del alcance de la presente invención.

La presente invención incluye también una célula huésped transformada con cualquiera de las moléculas de ácido nucleico aisladas y purificadas descritas en el parágrafo anterior, así como un polipéptido T-LIF codificado por tales moléculas transformadoras de ácido nucleico y expresado a partir de la célula huésped.

La invención incluye además una molécula de ácido nucleico aislada y purificada que contiene una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste de (1) la secuencia de ácido nucleico descrita en la Figura 26 (SEQ ID NO: 31), (2) una secuencia correspondiente a la secuencia de (1) dentro del alcance de la degeneración del código genético, y (3) una secuencia que codifica T-LIF humana y que híbrida bajo condiciones estándar altamente estrictas con una secuencia complementaria a la secuencia de (1) ó (2). Las cadenas complementarias a las secuencias de ácido nucleico anteriormente descritas, se determinan fácilmente por métodos estándar, y se encuentran también dentro del alcance de la presente invención.

La presente invención también incluye una célula huésped transformada con cualquiera de las moléculas de ácido nucleico aisladas y purificadas descritas en el parágrafo anterior, así como un polipéptido T-LIF codificado por tales moléculas transformadoras de ácido nucleico y expresado a partir de la célula huésped.

La invención incluye además un método para eliminar o reducir el rechazo hiperagudo de las células de mamífero no primate por suero humano, que incluye añadir, al suero humano, una cantidad fisiológicamente aceptable de galactosa o un sacárido en el cual el carbohidrato terminal es una \alpha galactosa enlazada a la posición 1, antes de la exposición del suero humano a las células de no primate. La cantidad de galactosa o de sacárido añadida es suficiente para reducir o eliminar la respuesta de rechazo hiperaguda. El sacárido puede ser, sin limitación, melibiosa, galactosa \alpha-1,3 galactosa o estaquiosa. Alternativamente, el suero humano puede ser tratado como para ser sustancialmente desocupado de inmunoglobulina, anticuerpos IgM, anti-Gal IgM y anticuerpos IgG, o anticuerpos anti-Gal IgM. La invención incluye además suero humano suero humano tratado por afinidad sustancialmente libra de anticuerpos anti-Gal o de anticuerpos anti-Gal IgM.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una representación gráfica de intensidad de fluorescencia después de la coloración inmunofluorescente de células endoteliales aórticas de porcinos con anticuerpo anti-Gal solo o con anticuerpo anti-Gal que fue preincubado con sacáridos seleccionados

La Figura 2 muestra los resultados de un experimento en el cual la lisis de células endoteliales aórticas de porcinos por medio de suero humano, y purificadas por medio de anticuerpos anti-Gal, fue determinada utilizando un ensayo de liberación ^{51}CR.

La Figura 3 describe trazos fisiográficos de contracciones cubiertas de corazón de rata en presencia de suero humano con o sin sacáridos seleccionados.

La Figura 4 es una comparación de la secuencia de ADNc de la \alpha-1,3 galactosiltransferasa de porcino con las correspondientes secuencias de bovino y de múrido. PGTCD = secuencia de porcino. BOVGSTA = secuencia de bovino. MUSGLYTNG = secuencia de múrido.

La Figura 5 es una comparación de la secuencia de aminoácidos de la \alpha-1,3 galactosiltransferasa de porcino con las correspondientes secuencias de aminoácidos de bovino y de múrido. PGT = secuencia de porcino. BGT = secuencia de bovino. MGT = secuencia de múrido.

La Figura 6 describe los sitios de restricción Sal1 en cuatro clones de fago que se sobreponen expandiendo una porción de la región genómica de la \alpha-1,3 galactosiltransferasa de múrido.

La Figura 7 es un mapa detallado de restricción del subclón p\alphaGT-S5.5 de la \alpha-1,3 galactosiltransferasa de múrido.

La Figura 8 es un mapa detallado de restricción del subclón p\alphaGT-S4.0 de la \alpha-1,3 galactosiltransferasa de múrido.

La Figura 9 es un mapa detallado de restricción del subclón p\alphaGT-S11 de la \alpha-1,3 galactosiltransferasa de múrido.

La Figura 10 es un mapa detallado de restricción del subclón p\alphaGT-S13 de la \alpha-1,3 galactosiltransferasa de múrido.

La Figura 11 es un mapa detallado adicional de restricción del subclón p\alphaGT-S5.5 de la \alpha-1,3 galactosiltransferasa de múrido.

La Figura 12 es un mapa detallado adicional de restricción del subclón p\alphaGT-S4.0 de la \alpha-1,3 galactosiltransferasa de múrido.

La Figura 13 es un diagrama de una construcción para inactivación que porta los fragmentos 4,0 y 5,5 kb Sal1 de p\alphaGT-S5.5 y de p\alphaGT-S4.0 que flanquean el sitio Sal1 del Exón 9.

La Figura 14 describe los fragmentos BgIII de 8,3kb y 6,4 kb que son el diagnóstico para el gen no interrumpido de la \alpha-1,3 galactosiltransferasa y el gen objetivo (inactivado) de la \alpha-1,3 galactosiltransferasa, respectivamente, usando las sondas identificadas en el texto.

La Figura 15 es una representación esquemática de la generación de una construcción para inactivación utilizando el vector p\pmGT-S5.5 como el vector de partida.

La Figura 16 expone la secuencia de nucleótidos de un casete de resistencia a la neomicina utilizado en la construcción de una construcción de ADN para interrumpir al gen \alpha-1,3-GalT en ratones.

La Figura 17 es un diagrama de un ejemplo de una construcción final noqueada que ha sido secuenciada para confirmar la identidad, número de copia y orientación de diversos insertos.

La Figura 18 es un borrón de Southern ADN genómico de diversas líneas de células ES de múrido, transformadas con la construcción para inactivación de la Figura 16, sondeada para revelar los fragmentos de diagnóstico descritos en la Figura 14.

La Figura 19 describe los productos PCR 2largos'' derivados de los genes \alpha-1,3-GalT de tipo silvestre e interrumpidos usando los iniciadores designados.

La Figura 20 es un borrón de Southern de productos PCR largos obtenidos a partir de ratones noqueados y del tipo salvaje.

La Figura 21 describe los productos PCR usados para la identificación del locus GalT interrumpido (objetivo).

La Figura 22 muestra productos PCR generados a partir de ratones que portan alelos GalT interrumpidos (inactivados).

La Figura 23 describe los productos PCR esperados del análisis PCR del ADNc generado a partir del ARNm \alpha-1,3-GalT en ratones normales y noqueados. Los iniciadores de ferroquelatasa y el fragmento PCR representa un control demostrando que ha ocurrido la síntesis de ADNc.

La Figura 24 muestra los fragmentos PCR generados a partir del ADNc obtenido del ARN aislado de Riñón (K), corazón (H) e hígado (L) de un ratón de tipo silvestre (+/+), un ratón heterocigoto para el alelo interrumpido \alpha-1,3-GalT (+/-) y un ratón homocigoto para el alelo interrumpido \alpha-1,3-GalT (-/-).

La Figura 25 es una representación gráfica de la protección relativa de células de bazo, derivadas de ratones noqueados GalT, a partir de la lisis por suero humano.

La Figura 26 es una representación de la secuencia de nucleótidos y de la secuencia de aminoácidos deducida para el T-LIF de múrido.

La Figura 27 es una representación de la secuencia de nucleótidos y de la secuencia de aminoácidos deducida para el T-LIF de humano.

La Figura 28 es un borrón de Western de polipéptidos LIF expresados a partir de células COS transfectadas.

La Figura 29 es un diagrama del plásmido de expresión usado para la transfección de las células COS de la
Figura 27.

La Figura 30 es un borrón de Southern de ADNc amplificado por PCR de células de ES de múrido, usando una sonda específica LIF.

Descripción detallada

La evidencia presentada aquí establece que una porción sustancial de xenoanticuerpos anti-cerdo preformados humanos reconocen a una galactosa terminal específica enlazada sobre la superficie de células endoteliales de cerdo. Como se demostró en experimentos llevados a cabo por los presentes inventores, es posible reducir los títulos de los xenoanticuerpos preformados por adsorción con antígenos inmovilizados que contienen a los epítopos apropiados. Esto conduce a la reducción o eliminación de las respuestas celulares asociadas con la respuesta de rechazo hiperagudo. Recíprocamente, se demuestra que es posible neutralizar tales anticuerpos por medio de adición de antígenos apropiados de carbohidrato a suero humano. Para demostrar la utilidad de estas aproximaciones, fue necesario identificar las fracciones relevantes de carbohidrato y demostrar su eficacia en sistemas de células cultivadas y, muy importante, en órganos enteros. Como tal, se identifica una aproximación para reducir o eliminar la respuesta de rechazo hiperagudo como tratamiento del receptor para eliminar o neutralizar las poblaciones relevantes de anticuerpos.

Una aproximación alternativa a xenotransplante sería la eliminación del(los) epítopo(s) relevante(s) en el órgano del donante. Esto podría estar acompañado, por ejemplo, por reducción o eliminación de la expresión del(los) gen(es)
que codifican la maquinaria metabólica responsable de la formación de los epítopos. El epítopo definido por el enlace de la \alpha-1,3 galactosa (llamada el epítopo GAL) se genera por la enzima UDP-galactosa:\beta-D-galactosil-1,4-N-acetil-D-glucosaminida \alpha-1,3 galactosil-transferasa ("\alpha-1,3 galactosiltransferasa" o "\alpha-1,3-GalT"). Esta enzima transfiere galactosa al residuo terminal de galactosa de las cadenas de carbohidrato del tipo de la N-acetil-lactosamina y lactosaminoglicanos. La reacción catalizada por \alpha-1,3-GalT puede resumirse como sigue:

UDP-Gal + Gal\beta-1.4-GlcNAc-R \rightarrow Gal\alpha-1.3-Gal\beta-1.4-GlcNAc-R + UDP

La enzima \alpha-1,3-GalT se encuentra en la mayoría de los mamíferos, pero no está presente en monos ni en humanos del Viejo Mundo. Para propósitos de xenotrasplantación, es significativo que humanos y monos del Viejo Mundo tienen xenoanticuerpos de ocurrencia natural dirigidos contra el epítopo GAL. El uso de órganos de cerdo que carecen del epítopo GAL podría reducir o eliminar el rechazo hiperagudo de tales órganos por receptores humanos. La utilidad de una aproximación tal se apoya en células y órganos completos. Una aproximación para obtener tales órganos sería generar cerdos en los cuales el gen que codifica a la enzima \alpha-1,3-GalT es "noqueada" por recombinación homóloga.

Papel del Epítopo GAL en el Rechazo Hiperagudo

Los presentes inventores tienen anticuerpos purificados de afinidad dirigidos contra el epítopo GAL (anticuerpos anti-GAL) del suero humano. Esto fue acompañado con columnas de afinidad que contienen los epítopos apropiados (por ejemplo, galactosil-galactosa o melibiosa) unidos a una fase sólida. Todos los anti-GAL IgG e IgM fueron obtenidos en una serie de experimentos. En una aproximación alternativa, se obtuvo anti-GAL IgG por paso del suero sobre una columna de afinidad con especificidad para todas las proteínas excepto albúmina e IgG. El producto del lavado de esta columna fue aplicado entonces a una columna de afinidad de galactosil-galactosa y el anti-GAL IgG purificado fue recolectado como el eluato. El anti-GAL IgG obtenido puede ser purificado además por el paso sobre una columna de proteína G, que específicamente enlaza IgG pero ningunos otros isotipos de anticuerpos. Recíprocamente, el lavado a través de las columnas anteriormente descritas puede ser utilizado como fuentes de suero desprovisto de anti-GAL (IgG + IgM) total o de suero desprovisto de anti-GAL IgG en experimentos adicionales. Preferiblemente, las preparaciones de anticuerpo anti-GAL se caracterizan por el contenido de proteína, peso molecular y pureza, y para la clase de anticuerpo y de isotipo.

Para demostrar el papel del epítopo GAL en la respuesta al rechazo hiperagudo, es necesario, primero, establecer que los anticuerpos IgG e IgG anti GAL reaccionan con células y tejido de porcino. Los presentes investigadores investigaron la unión de anticuerpos anti-GAL a las células y tejido de porcino utilizando coloración de inmunofluorescencia. En esta técnica, las preparaciones seleccionadas de anticuerpo humano reaccionan con células intactas de cerdo y luego reaccionan con anticuerpo señal que contiene IgG o IgM anti-humano no humano marcado con isotiocianato de fluoresceína (ITCF). Las células teñidas pueden ser detectadas y cuantificadas con un distribuidor de células activadas por fluoresceína (DCAF) o de otros medios apropiados de detección. Otros métodos para detectar la presencia de un anticuerpo unido a una superficie celular, por ejemplo, a través del uso de reactivos de anticuerpo-señal marcados con enzima, son conocidos por un experto en la técnica.

El anti-GAL total (IgM e IgG), lo mismo que anti-GAL IgG, células teñidas de una línea celular epitelial porcina (PK_{1}) lo mismo que células de una línea celular endotelial aórtica porcina (EAP). Ni el suero desprovisto de anticuerpos anti-GAL (total IgM + IgG), ni el suero desprovisto de anti-GAL IgG dieron coloración detectable. Para investigar más la especificidad de la respuesta es deseable determinar sí la reactividad de los anticuerpos con células porcinas puede ser disminuida o eliminada por exposición previa a una o más moléculas que se sospecha contienen al(los) epítopo(s) en cuestión. En este sentido, los presentes inventores han establecido que la unión del anticuerpo e inhibida por galactosa y por disacáridos que tiene residuos de galactosa terminal en la configuración \alpha1. La coloración no fue inhibida con azúcares que tienen una galactosa terminal en la configuración \beta1\rightarrow4. Estos resultados demuestran la especificidad de la unión del anticuerpo y la capacidad de los azúcares apropiados para inhibir tal
unión.

La reactividad de anticuerpos anti-GAL con células de cerdo cultivadas fue confirmada utilizando secciones de tejido de órganos de cerdo. Nuevamente, utilizando un sistema anticuerpo de señal fluorescente, la coloración fue vista con anti-GAL IgM + IgG total y con anti-GAL IgG purificado pero no con los sueros desprovistos de anticuerpos anti-GAL. La coloración fue particularmente fuerte con endotelio de riñón, corazón e hígado, con endocardio de corazón y con epitelio de conducto biliar. La unión de tejido fue inhibida con melibiosa pero no fue inhibida por otros disacáridos no representativos del epítopo GAL.

Estos datos indican claramente que el epítopo GAL se expresa a altos niveles sobre las células endoteliales de arterias, venas y capilares de riñón, corazón e hígado de porcino. En una situación de injerto, las células endoteliales de estos vasos entran en contacto directo con los anticuerpos anti-GAL en suero humano. Los resultados anteriores son consistentes con la evidencia de que la unión de estos anticuerpos (con activación del complemento acompañante) es un componente clave de la respuesta de rechazo hiperagudo.

Para investigar más las especificidades de los xenoanticuerpos de ocurrencia natural en suero humano dirigidos contras antígenos porcinos, se investigó la capacidad del suero humano para causar aglutinación de los glóbulos rojos de cerdo. Estos estudios revelaron la presencia de altos niveles de tales anticuerpos en suero humano. Además, azúcares tales como melibiosa, estaquiosa, galactosa y fucosa, tienen residuos terminales en la configuración \alpha 1-6, se encontró que inhiben la aglutinación en el rango de \muM hasta mM. Azúcares con otras configuraciones fueron inhibidores solamente en dosis muy altas, donde los efectos observados fueron probablemente debidos a cambios simples en osmolaridad u otros mecanismos no específicos.

Las anteriores investigaciones establecen un papel potencial para los xenoanticuerpos anti-GAL humanos de ocurrencia natural en la destrucción en la destrucción mediada por el complemento que subyace en el rechazo hiperagudo. Sin embargo, es preferible examinar directamente la destrucción mediada por el complemento de células de porcino con miras a confirmar la especificidad del epítopo GAL y de los anticuerpos anti-GAL en el proceso de lisis. Con este fin, los presentes inventores han examinado la capacidad del suero humano para causar lisis de células de porcino.

Para investigar la destrucción de células medidas por un complemento, es necesario emplear uno o más ensayos que suministren datos cuantitativos sobre lisis de células. Preferiblemente, tales ensayos miden un componente secuestrado por la célula que es liberado en el medio por la lisis de la célula medida por un complemento. Tales experimentos deben controlar la relación del complemento en la lisis inducida empleando ambas proteínas complemento nativas, así como al complemento inactivado por el calor. Los presentes inventores han utilizado un ensayo de liberación de ^{51}Cr y un ensayo de liberación de lactato de deshidrogenasa (LDH) para investigar la lisis mediada por el complemento de células epiteliales y endoteliales de porcino por el suero humano.

En el ensayo de liberación de ^{51}Cr, las células de porcino fueron marcadas previamente con ^{51}Cr y luego incubadas en presencia de suero humano inactivado por calor más complemento de conejo (PAE's) o complemento humano en suero humano normal no inactivado por calor (PK_{1}'s). La liberación de ^{51}Cr dentro del medio fue medida con un contador gama después de la adición de fluido de centelleo. En el ensayo de liberación de LDH, las células fueron marcadas con LDH de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega, Estados Unidos). La liberación de LDH dentro del medio fue medida utilizando un formato ELISA, con lectura de absorbancia a 492 nm. Para ambos ensayos, también se probó la capacidad de diferentes azúcares para inhibir la lisis inducida por el complemento.

Se obtuvieron resultados similares con las dos líneas de células de porcino no relacionadas, PAE y PK_{1}, usando ambos tipos de ensayos. Los resultados demuestran claramente que los xenoanticuerpos de ocurrencia natural (NXAB's) son responsables de la iniciación de la lisis inducida por el complemento de las células de porcino. Los presentes inventores han establecido también que los anticuerpos IgM y no los IgG son los responsables de la lisis en el sistema. Además, la inactivación por calor de las preparaciones de complemento previnieron la lisis, proveyendo además evidencia de que la lisis de las células de porcino es un fenómeno que depende del complemento.

Los presentes inventores también han mostrado que la melibiosa, pero no la lactosa, protege a las células de porcino de la lisis. De manera muy importante, se encontró que las concentraciones de azúcar que son efectivas en estos estudios cubrieron el rango fisiológico de azúcar en sangre, esto es, alrededor de 10 mM.

Estos resultados indican que los NXAb's anti-GAL en suero humano normal son los principales responsables de la lisis de las células de porcino. Como tal, la unión de NXAB's anti-GAL a las células endoteliales revistiendo los vasos sanguíneos de un injerto porcino, con la activación concomitante de la cascada de complemento, es probable que sea un componente clave del rechazo hiperagudo de los injertos porcinos. Este sería también el caso con órganos de otras especies discordantes, tales como roedores, ovejas, vacas y cabras, cada una de las cuales tiene genes \alpha-1,3-GaIT en sus respectivos genomas.

Estas conclusiones están soportadas además en un estudio realizado en órganos completos por los presentes inventores. Para este estudio, se utilizaron corazones de ratas aislados y perfundidos para demostrar además la intervención de los xenoanticuerpos anti-GAL en el rechazo hiperagudo. Los corazones de rata fueron conectados a un aparato de perfusión de Langendorf, como se describe en Doring y Dehnert, The Isolated Perfused Heart According to Langendorf, Bionesstechnik-Verlag March GMBH, D7806, Alemania Occidental. Los corazones conectados fueron estabilizados entonces por perfusión con un sistema tampón fisiológico, y perfundidos con el mismo tampón que contiene o melibiosa o lactosa (10 mM). Se añadió entonces plasma humano hasta una concentración final del 13%, y se midió el efecto del azúcar añadido sobre la velocidad del corazón, fuerza de contracción y potencia.

Estos resultados demuestran que en un sistema completo de órgano:

La perfusión con plasma humano no modificado causa la perdida rápida de función.

La perfusión de un corazón de rata con plasma humano en presencia de melibiosa, que compite por unirse con los anticuerpos anti-GAL, prolonga la supervivencia del corazón y su potencia. La lactosa, sin embargo, que no compite por unirse con los anticuerpos anti-GAL, no prolonga la supervivencia del corazón.

La perfusión de un corazón de rata con plasma desocupado de anticuerpos anti-GAL, prolonga la supervivencia del corazón y su potencia.

Si se añaden anticuerpos anti-GAL purificados nuevamente al plasma desocupado de anticuerpo anti-GAL, el corazón pierde rápidamente función.

Los experimentos de los presentes inventores con células cultivadas, tejidos y órganos completos proveen importante confirmación de que los anticuerpos anti-GAL son un elemento crítico en la respuesta de rechazo hiperagudo. Además, los resultados descritos apuntan a diferentes aproximaciones que pueden ser empleadas para eliminar o reducir el rechazo hiperagudo de órganos xenogénicos de mamífero por los humanos.

Por ejemplo, la administración intravenosa del disacárido específico galactosa \alpha 1-3 galactosa bloqueará a los anticuerpos anti-GAL de ocurrencia natural de todas las clases y evitará que se unan a sus epítopos específicos sobre la superficie de las células endoteliales del injerto, previniendo así que ellos inicien o participen en el rechazo hiperagudo. Los resultados de los presentes inventores indican que la concentración de galactosa \alpha 1-3 galactosa requerida para lograr este efecto está en un rango fisiológicamente tolerado. Los experimentos también indican que varios otros carbohidratos pueden ser sustituidos por el disacárido específico. Estos incluyen al monosacárido galactosa y varios otros di, tri o tetrasacáridos en los cuales existe una galactosa \alpha terminal enlazada al siguiente azúcar a través de la posición 1. Estos otros azúcares incluyen, pero no se limitan a, melibiosa y estaquiosa.

Igualmente, previo a xenotransplante, todos o una porción sustancial del IgM total (esto es, IgM de todas las especificaciones) pueden ser removidos del suero del paciente por inmunoabsorción extracorporal. Alternativamente, los anticuerpos anti-GAL de todas las clases pueden ser removidos por inmunoabsorción extracorporal. Más preferiblemente, los anticuerpos anti-GAL IgM preformados en forma natural de los pacientes pueden ser removidos. De esta forma, muchos o la mayoría de los agentes inmunológicos primarios de la respuesta hiperaguda son eliminados, dando como resultado la reducción o la eliminación de la respuesta después de xenotransplante.

El Gen \alpha-1,3 GaIT como un Objetivo para Suprimir al Epítopo GAL

Los presentes inventores han tenido éxito en la clonación de la región de codificación completa del gen \alpha-1,3 GalT. Esto es deseable para la explotación completa del gen en ingeniería genética de cerdos para los propósitos de xenotransplante humano. Los intentos previos para obtener la región de codificación completa del gen porcino, por el conocimiento de los inventores, han fallado en generar las regiones de codificación 5'. Ver, por ejemplo, Dabkowski y colaboradores, Transplant. Proc. 25: 2921 (1993). Los presentes inventores han empleado una aproximación con base en PCR para generar la secuencia total. En el diseño de los iniciadores y de las condiciones experimentales requeridas para obtener las regiones 5' y 3' del gen, los presentes inventores superaron obstáculos teóricos y prácticos para tener éxito.

Los iniciadores fueron seleccionados con base en el análisis cuidadoso de las secuencias publicadas para los genes \alpha-1,3 GaIT de múridos, bovinos y humanos, las únicas secuencias disponibles publicadas para este propósito. Los análisis de los presentes inventores revelaron que en la secuencia reportada del ADNc de bovino, el exón 3 (que está en la región no traducida 5') está perdida. Esto no había sido reportado en la literatura. Por lo tanto, con miras a encontrar las regiones apropiadas para derivar secuencias iniciadoras útiles, las secuencias de ratón y de bovino tienen que ser realineadas. Sin embargo, aún con un realineamiento apropiado, solamente una isla de alrededor de 20 pares de bases (bp) en la región 5' no traducida mostró la homología deseada (19 en vez de 20 bp) para el diseño de un oligonucleótido PCR. El hecho de que las regiones no traducidas 5' de los genes de ratón y de bovino no parezcan sustancialmente relacionadas aún bajo alineación óptima, no debería ser considerado inusual por un artífice normalmente entrenado. Esto es debido a que las regiones no traducidas 5' a menudo no se conservan bien entre las especies. Como tal, la inclinación natural sería a efectuar un análisis poco menos que exhaustivo y concluir que el diseño de oligonucleótidos PCR con base en la homología de esta región fue improbablemente exitoso.

En la región no traducida 3' corriente abajo, la homología es nuevamente por lo menos obvia. Diferentes inserciones y supresiones han sido realizadas con miras a obtener alineación apropiada de las secuencias de ratón y de bovino. Además, para obtener una región de homología apropiada para el diseño de oligonucleótidos PCR, fue necesario seleccionar una región aproximadamente de 200 bp corriente abajo del codón de detención. Finalmente, para lograr que los iniciadores 5' y 3' trabajen adecuadamente, los presentes inventores encontraron necesario dejar caer la temperatura de templado en 9ºC. Estas dificultades técnicas y teóricas para el uso exitoso de una aproximación con base en PCR fueron superadas por los presentes inventores y permitieron que se determinara la secuencia completa de codificación.

El análisis de la secuencia de nucleótidos indica que un equivalente del exón 3 de múrido en la región no traducida 5' no se encuentra en el gen de porcino. La secuencia de porcino es similar a la secuencia de bovino en este sentido. El análisis de la secuencia de aminoácidos demuestra que la estructura del \alpha-1,3-GAL de porcino es similar a aquella de otras glicosiltransferasas, y en particular está muy cercanamente relacionada con los \alpha-1,3-GAL de bovino y de múrido. En cada una de estas enzimas, un corto dominio amino terminal citoplasmático de alrededor de seis residuos precede a un dominio de anclaje en membrana hidrófoba (que se extiende desde los residuos 7 a 22). La región troncal, que sirve como una traba flexible, y el dominio catalítico, que cataliza la síntesis de los enlaces \alpha-1,3-GAL, está localizada en el lumen del Golgi y se extiende desde el aminoácido 23 hacia el carboxilo terminal en el aminoácido 371. El límite preciso entre los dominios troncal y catalítico, no está bien definido. Con base en las características sugeridas de la región troncal, parece ser la región menos conservada y es rica en residuos de glicina y de prolina. Paulson y Colley, J. Biol. Chem. 264: 17615 (1989); Joziasse y colaboradores, J. Biol. Chem. 267: 5534 (1992). El límite troncal/catalítico puede ocurrir alrededor del aminoácido 60.

Para generar construcciones para inactivar genes por recombinación homóloga, se interrumpe el gen preferiblemente dentro de un exón apropiado de codificación por inserción de un fragmento adicional de ADN. Tras el análisis de la longitud completa de la secuencia de ácido nucleico porcino, los presentes inventores han identificado a los exones 4, 7, 8 y 9 como las ubicaciones preferidas para la interrupción del gen por recombinación homóloga. Sin embargo, la identificación de estos exones como sitios preferidos no debería ser considerado como limitante del alcance de la presente invención, así como las interrupciones en los exones 5 y 6 pueden ser útiles en tipos particulares d células o en situaciones en donde al menos se desea la inhibición completa de la expresión del gen \alpha-1,3-GaIT. Además, los elementos reguladores asociados con la secuencia de codificación pueden presentar también objetivos útiles para inactivación.

En una modalidad preferida, se escoge un sitio Sal1 localizado dentro del exón 9 del gen \alpha-1,3-GalT de ratón en los codones 221-222, como el sitio para interrupción de la secuencia de codificación del múrido. Para la interrupción de la secuencia del porcino, se observa que los aminoácidos codificados por los nucleótidos de porcino correspondientes se conservan, aunque no el sitio Sal1. En una modalidad preferida para inactivación del gen de porcino, un sitio Sal1 es modificado genéticamente dentro de la ubicación correspondiente de la secuencia del cerdo para la construcción conveniente de una secuencia noqueada. Sal1 corta raramente únicamente en ADN genómico. Ya que múltiples sitios de restricción pueden ser un problema en la manipulación de grandes fragmentos de ADN, la presencia de un sitio Sal1 en el exón es muy útil ya que no es probable que otros sitios Sal1 estén presentes en otras ubicaciones en las construcciones noqueadas.

Una codificación genética para un marcador seleccionable es generalmente útil para interrumpir el sitio destinado al exón por recombinación homóloga. Preferiblemente, el marcador seleccionable está flanqueado por secuencias homólogas a las secuencias que flanquean al sitio de inserción deseado. Thomas y Capecchi, Cell 51: 503-12 (1987); Capecchi, Trends in Genetics 5: 70-76 (1989). No es necesario para las secuencias que flanquean, que estén inmediatamente adyacentes al sitio de inserción deseado. Se utiliza frecuentemente el gen que imparte resistencia al antibiótico G418 (un derivado de neomicina), aunque otros marcadores de resistencia al antibiótico (por ejemplo, higromicina) también pueden emplearse. Otros sistemas de selección incluyen marcadores de selección negativos tales como el gen de la timidina-quinasa (TK) del herpes simple. Cualquier marcador seleccionable, adecuado para la inclusión en un vector noqueado está dentro del alcance de la presente invención.

Sin embargo, es posible que en algunas circunstancias no sea deseable tener incorporado un gen de resistencia antibiótica expresado dentro de las células de un órgano transplantado. Por lo tanto, en una modalidad preferida, uno o más elementos genéticos están incluidos en la construcción para inactivación que permiten que el gen de resistencia antibiótica sea cortado una vez que la construcción ha sufrido recombinación homóloga con el gen \alpha-1,3-GalT.

El sistema de la recombinasa FLP/FRT de la levadura representa uno de tales juegos de elementos genéticos. O'Gorman y colaboradores, Science 251, 1351-1355 (1991). La recombinasa FLP es una proteína de aproximadamente 45kD de peso molecular. Está codificada por el gen FLP del plásmido de 2 micrones de la levadura Saccharmoyces cerevisiae. La proteína actúa uniéndose al sitio Objetivo de la Recombinasa FLP, o FRT; la región central del FRT es una secuencia de ADN de aproximadamente 34 bp. FLP puede mediar diferentes tipos de reacciones de recombinación incluidas la escisión, inserción e inversión, dependiendo de las orientaciones relativas de los sitios de flanqueo FRT. Si una región de ADN está flanqueada por repeticiones directas del FRT, FLP actuará para cortar al ADN intermedio, dejando solamente un FRT único. Se ha demostrado que FLP funciona en un amplio rango de sistemas, incluidas en las líneas cultivadas de célula de mamífero CV-1 y F9, O'Gorman y colaboradores, Science 251, 1351 (1991), y en células ES de ratón, Jung y colaboradores, Science 259: 984 (1993).

Las células fijadas como objetivo que portan una copia genómica de un gen de resistencia antibiótica flanqueado por repeticiones directas del FRT, son suministradas con la recombinasa FLP por 1) introducción dentro de las células de proteínas FLP parcialmente purificadas por electroporación, o 2) transfección con plásmidos de expresión que contienen al gen FLP. De esta forma, el gen de resistencia antibiótica es suprimido por acción de la FLP recombinasa, y se generan células que contienen al gen inactivado \alpha-1,3-GalT y que están libres del gen exógeno de resistencia antibiótica.

Debido a la relativa infrecuencia de recombinación homóloga en células fijadas como objetivo, la mayoría de tales células portarán solamente un alelo inactivado del gen objetivo. Esto es, la gran mayoría de las células tomadas a través de una ronda sencilla de transformación con un constructor noqueado apropiado serán heterocigotos. Como se lo usa aquí, el término "transformado" se define como la introducción de ADN exógeno dentro de la célula objetivo por cualquier medio conocido por el artífice entrenado. Estos métodos de introducción pueden incluir, sin limitación, transfección, microinyección, infección (por ejemplo, con vectores con base retroviral), electroporación y microbalística. El término "transformado", a menos que se indique otra cosa, no pretende indicar aquí, alteraciones en el comportamiento de la célula y patrones de crecimiento que acompañan la inmortalización, crecimiento independiente de la densidad, transformación maligna o estados similares adquiridos en el cultivo.

Aunque las células heterocigotas pueden ser usadas en los métodos de la presente invención, pueden emplearse diversas manipulaciones para generar células homocigotas en cultivo. Por ejemplo, las células homocigotas pueden ser generadas realizando un segundo procedimiento de recombinación homóloga sobre células heterocigotas para el alelo inactivado. Si las construcciones noqueadas utilizadas en la transformación inicial portaban al gen neo^{R}, puede emplearse una segunda construcción en una segunda vuelta de transformación en la cual se reemplaza al gen neo^{R} con un gen que confiere resistencia a un antibiótico separado (por ejemplo, higromicina). Las células resistentes tanto G418 como a la higromicina pueden ser muestreadas por medio de borrones Southern con miras a detectar "dobles inactivaciones a" (esto es, homocigotos). Ambos genes de resistencia antibiótica pueden ser removidos seguidamente en un procedimiento único utilizando FLP recombinasa. Manteniendo la selección con G418, esta aproximación asegura que la segunda construcción no reemplace simplemente al alelo noqueado previamente, dejando las células heterocigotas.

Alternativamente, el gen neo^{R} puede ser suprimido de una célula heterocigota original usando FLP recombinasa y un segundo procedimiento de inactivación conducido utilizando la construcción que contiene al gen neo^{R} original. La doble inactivación podría ser detectada por medio del análisis Southern. El gen neo^{R} introducido nuevamente podría ser suprimido entonces por medio de la FLP recombinasa. Esta aproximación alternativa no le permite a uno dirigir específicamente la construcción para inactivación hacia el alelo no inactivado. Sin embargo, un muestreo de números apropiados de células fijadas como objetivo puede conducir a la identificación de células homocigotas para el locus inactivado.

Vehículos Celulares para la Incorporación de Construcciones para Inactivación

Para crear anímales que tengan un gen particular inactivado en todas las células, es necesario introducir una construcción para inactivación dentro de las células germinales (esperma u óvulos, esto es, la "línea germinal") de las especies deseadas. Los genes u otras secuencias de ADN pueden ser introducidos dentro de los pronúcleos de óvulos fertilizados por medio de microinyección. Después de la fusión pronuclear, el embrión en desarrollo puede portar al gen introducido en todas sus células somáticas y germinales ya que el cigoto es el progenitor mitótico de todas las células en el embrión. Ya que la inserción fijada como objetivo de una construcción para inactivación es un evento relativamente raro, es deseable generar y muestrear un gran número de animales cuando se emplea tal aproximación. Debido a esto, puede ser ventajoso trabajar con las poblaciones más grandes de células y los criterios de selección que son característicos de sistemas cultivados de células. Sin embargo, para la producción de animales para inactivación a partir de una población inicial de células cultivadas, es necesario que una célula cultivada que contiene a la construcción deseada para inactivación, sea capaz de generar un animal completo. Esto está generalmente acompañado por la colocación de la célula dentro de un medio de desarrollo para el embrión de alguna clase.

Las células capaces de dar lugar a todos los tipos de células de un embrión, incluidas las células germinales, son llamadas de aquí en adelante, células "totipotentes". Las líneas de células totipotentes de múrido (linaje embriónico, o células "ES") han sido aisladas por medio del cultivo de células derivadas de embriones muy jóvenes (blastocistos). Tales células son capaces, por incorporación dentro de un embrión, de diferenciarse en todos los tipos de células, incluidas las células germinales, y pueden ser empleadas para generar animales que carecen de un gen \alpha-1,3-GalT. Esto es, las células cultivadas ES pueden ser transformadas con una construcción para inactivación y las células seleccionadas en las cuales el gen \alpha-1,3-GalT se inactiva a través de la inserción de la construcción, por ejemplo, dentro de un exón apropiado. En realidad, las líneas de células ES, han sido derivadas tanto para ratones como para cerdos. Véase, por ejemplo, Robertson, Embryo-Derived Stem Cell Lines. In: Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach (E.J. Robertson, ed), IRL Press, Oxford (1987); Publicación PCT No. WO/90/03432; Publicación PCT No. 94/26884. Generalmente estas líneas de células deben ser propagadas en un medio que contiene un factor de inhibición de diferenciación (DIF) para prevenir una diferenciación espontánea y la perdida de capacidad mitótica. El Factor Inhibidor de la Leucemia (LIF) es particularmente útil como un DIF. Otros DIF utilizados para prevenir la diferenciación de las células ES incluyen, sin limitación, Oncostatin M (Gearing and Bruce, The New Biologist 4: 61-65 (1992); comunicación personal de A. Smith), interleuquina 6 (IL-6) con receptor IL-6 soluble (sIL-6R) (Taga y colaboradores, Cell 58: 573-81 (1989); comunicación personal de A. Smith), y factor neurotrópico ciliar (CNTF) (Conover y colaboradores, Development 19: 559-65 (1993). Otras citoquinas conocidas pueden funcionar también como DIF's apropiados, solas o en combinación con otros DIF's.

Como un avance útil en el mantenimiento de células ES en un estado no diferenciado, los presentes inventores han identificado una nueva variante de LIF. En contraste con las formas previamente identificadas de LIF, las cuales son extracelulares, esta nueva forma de LIF (de aquí en adelante T-LIF) se localiza intracelularmente. El transcrito fue clonado a partir de células ES de múrido usando la técnica RACE, Frohman y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 85: 8998-9002 (1988), y sujeto a análisis de secuencia. El análisis de la secuencia obtenida de ácidos nucleicos y la secuencia deducida de aminoácidos indica que T-LIF es una forma truncada de la secuencia LIF previamente reportada en la literatura. La expresión del ácido nucleico T-LIF en una célula huésped apropiada produce una proteína de 17 kD que no está glicosilada. Esta proteína es útil para inhibir la diferenciación de las células ES de múrido en cultivo. Se espera que la proteína tenga una actividad similar con las células de porcino, ya que D-LIF de múrido es efectivo para inhibir la diferenciación de las células ES tanto de porcino como de múrido. Los presentes inventores han determinado también la secuencia de la forma humana de T-LIF.

Para generar un animal para inactivación, se identifican las células ES que tienen al menos un alelo \alpha-1,3-GalT inactivado y se incorporan dentro de un embrión en desarrollo. Esto puede realizarse a través de una inyección dentro de la cavidad del blastocisto de un embrión en etapa de blastocisto de múrido, por medio de inyección dentro de un embrión en etapa de mórula, por medio de cocultivo de células ES con un embrión en etapa de mórula, o a través de fusión de la célula ES con un cigoto enucleado. El embrión resultante es levantado hasta la madurez sexual y criado con miras a obtener animales, todas de cuyas células (incluidas las células germinales) portan el alelo \alpha-1,3-GalT inactivado. Si la célula original ES fue heterocigota para el alelo \alpha-1,3-GalT inactivado, varios de estos animales deben ser criados unos con otros con miras a generar animales homocigotos para el alelo inactivado.

Aunque la microinyección directa de ADN dentro de los óvulos no genera los grandes números de eventos de recombinación obtenidos a través de la transfección de grandes números de células cultivadas, sin embargo, la inyección directa de óvulos puede ser una aproximación útil ya que esto evita las manipulaciones especiales (ver más arriba) requeridas para transformar una célula cultivada en un animal. Esto es debido a que los óvulos fertilizados son, por supuesto, en extremo esencialmente "totipotentes" -esto es, capaces de desarrollarse en un adulto sin una manipulación sustancial adicional diferente a la implantación en una madre sustituta. Para mejorar la probabilidad de recombinación homologa cuando los óvulos son directamente inyectados con construcciones para inactivación, es útil incorporar al menos 8 kb de ADN homólogo dentro de la construcción objetivo. Además, también es útil preparar las construcciones para inactivación a partir de ADN isogénico. Por ejemplo, para la inyección de óvulos de porcino, es útil preparar las construcciones a partir del ADN aislado a partir del pecarí cuyo esperma es empleado para fertilizar los óvulos utilizados para la inyección.

Los embriones derivados de los óvulos microinyectados pueden ser muestreados para eventos de recombinación homóloga en diferentes formas. Por ejemplo, si el gen GalT se interrumpe por una región de codificación que produce un producto génico detectable (por ejemplo, fluorescente) entonces los óvulos inyectados se cultivan hasta la etapa de blastocisto y se analizan por la presencia del polipéptido indicador. Los embriones con células que fluorescen, por ejemplo, son implantados entonces en una madre sustituta y se les permite desarrollarse hasta término. Alternativamente, a los óvulos inyectados se les permite desarrollarse y los lechones resultantes son analizados por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o PCR por transcripción reversa (RT/PCR) para la evidencia de recombinación homóloga.

Caracterización de los Animales en Inconsciencia

Los animales tiene ya sea uno (heterocigotos) o dos (homocigotos) genes GalT inactivados se caracterizan por confirmar las alteraciones esperadas en la expresión del gen y en el efecto fenotípico. Por ejemplo, el ARNm GalT debería estar ausente de los animales homocigotos para inactivación. Esto puede confirmarse, por ejemplo, con PCR de transcripción reversa (RT-PCR) utilizando iniciadores específicos apropiados GalT. Además, pueden llevarse a cabo varias pruebas para evaluar la expresión del epítopo GAL en animales homocigotos para inactivación. Por ejemplo, los anticuerpos anti-GAL y Lectina IB_{4} (que tiene una afinidad exclusiva por residuos terminales \alpha-D-galactosil) pueden ser utilizados en varios ensayos o formatos inmunohistológicos para probar la presencia del epítopo GAL en una disposición de tejidos. Como otra indicación del estado del epítopo GAL, puede probarse la lisis de células por suero humano por medio del uso de un ensayo de liberación de ^{51}Cromo.

Ejemplo 1 Purificación de Afinidad de Anticuerpos Anti-GAL Humanos

Los anticuerpos anti-GAL fueron purificados a partir de suero AB normal inactivado por calor (de CS1, Parkville, Victoria, Australia) utilizando los siguientes grupos de procedimientos.

A. Preparación de anticuerpos totales anti-GAL (IgG+IgM)

Los siguientes procedimientos se realizan a 4ºC.

Desalinizar de 15-30 ml de suero (en lotes de 3 ml) por medio del paso a través de una columna preequilibrada (20 ml de tampón de aplicación: K_{2}HPO_{4} 20 mM, NaCl 30 mM, pH 8) Econo Pac 10DG (Bio-Rad, Richmond, Estados Unidos). Alternativamente, para preparaciones a gran escala se desaliniza exhaustivamente por medio de diálisis contra el tampón de aplicación.

Lavar la columna con alícuotas de 4 ml de tampón de aplicación. Recolectar y reunir los eluatos de la columna.

Aplicar el suero desalinizado reunido a una columna preequilibrada (20 ml de tampón de aplicación) Synsorb 115 (galactosil-galactosa; Chembiomed, Alberta, Canadá) o columna de afinidad D(+) Melibiosa-Agarosa (Sigma) (5 ml-50 ml dependiendo del rendimiento requerido).

Recolectar lo que atraviesa y (parcialmente desocupado de anti-GAL) y aplicarlo nuevamente a la columna. Repetir 3 veces el proceso para asegurarse de la remoción completa de los anticuerpos anti-GAL. El lavado del tercer paso a través de la columna Synsorb se recolecta y se ajusta al volumen original del suero con solución salina regulada con fosfato (PBS) pH 7 + azida al 0,05%. Este se usa como una fuente de suero al cual se le ha eliminado el anticuerpo anti-GAL.

Lavar la columna con PBS pH 8 hasta que el eluato sea proteína libre (O.D. 280 nm = 0).

Eluir los anticuerpos anti-GAL con KSCN 3,5 M, pH 7,5. Recolectar fracciones de 4 ml, determinar el O.D. 280 y reunir las fracciones de pico (usualmente 1-6).

Concentrar los anticuerpos anti-GAL utilizando conos de ultrafiltración CF25 (Amicon, Danvers, EE.UU) Añadir 7 ml de las fracciones reunidas que contienen anticuerpos anti-GAL al cono de giro y centrifugar (2.000 RPM, 10 min, 4ºC). Llenar nuevamente el cono y centrifugar nuevamente hasta que el volumen se reduce a 3-5 ml.

Para diluir el KSCN, ajustar el volumen a 7 ml con PBS y centrifugar (2.000 RPM, 10 min, 4ºC). Repetir el proceso 10 veces más.

Remover la muestra que contiene anticuerpos anti-GAL del cono, utilizando una pipeta plástica; enjuagar el cono con PBS pH 7 + azida al 0,05%.

B. Preparación de anticuerpos anti-GAL IgG

Los siguientes procedimientos se realizan a 4ºC.

1. Desalinizar de 15-30 ml de suero (en lotes de 3 ml) por medio del paso a través de una columna preequilibrada (20 ml de tampón de aplicación: K_{2}HPO_{4} 20 mM, NaCl 30 mM, pH 8) Econo Pac 10DG (Bio-Rad, Richmond, EE.UU). Alternativamente, para preparaciones a gran escala desalinizar exhaustivamente por medio de diálisis contra el tampón de aplicación.

Aplicar suero desalinizado a una columna preequilibrada (30 ml de tampón de aplicación) Affi-Blue (Bio-Rad, Richmond, EE.UU) (Affi-Blue enlasa a todas las proteínas excepto a la albúmina y a IgG).

Lavar la columna con 20 ml de tampón de aplicación para eluir la fracción enriquecida en IgG.

Aplicar la fracción enriquecida con IgG a una columna de afinidad (5 ml) preequilibrada (20 ml de tampón de aplicación, pH 8,0) Synsorb 115 (galactosil-galactosa; Chembiomed, Alberta, Canadá).

Recolectar lo que atraviesa y aplicarlo nuevamente a la columna. Repetir 3 veces el proceso para asegurar la remoción completa de los anticuerpos anti-GAL. El lavado del tercer paso a través de la columna Synsorb se recolecta y se ajusta el volumen al volumen original del suero con PBS pH 7 + azida al 0,05%. Esto se usa como una fuente de control de IgG al cual se le ha eliminado el anticuerpo anti-GAL.

En algunos casos el IgG anti-GAL fue purificado adicionalmente utilizando una columna de proteína G, la cual enlaza eficientemente al IgG pero no a otros isotipos de anticuerpos. IgG fue eluido entonces de la columna de proteína G usando glicina pH 2,4.

Todas las preparaciones de anticuerpo anti-GAL fueron analizadas para lo siguiente:

El contenido de proteína fue determinado usando el método colorimétrico de Bradford (Bradford, M.M 1976, Anal. Biochem. 72: 248-254), utilizando IgG humano purificado como el estándar.

El peso molecular y la pureza fueron determinadas utilizando electroforesis en gel de poliacrilamida de acuerdo al método descrito por Laemli, Nature (Londres) 227: 680 (1970) y se detectó la proteína en los geles por medio de coloración plateada utilizando un juego de reactivos estándar (Amershan, Reino Unido).

La clase de anticuerpo y de isotipo fueron determinados por medio de inmunodifusión radial utilizando técnicas estándar como lo expusieron Rose y colaboradores (eds.), Manual of Clinical Laboratory Immunology, American Society for Microbiology, Washington, D.C. Se encontró que las preparaciones anti-GAL IgG contenían todas las subclases.

Ejemplo 2 Reactividad de los Anticuerpos IgG y Anti-GAL IgM y del Suero Agotado con Células y Tejidos de Porcinos I. Células

La reactividad de los anticuerpos IgG y anti-GAL IgM fue evaluada utilizando ya sea células endoteliales aórticas de porcino (Preparadas por los inventores como se describe más abajo) o la línea celular epitelial de porcino LLCPK_{1} (PK_{1}), obtenidas de la American Type Culture Collection (ATCC), Acceso No. CRL 1392.

\newpage

A. Aislamiento y cultivo de células endoteliales aórticas de porcino (PAE)

Se obtuvo el tipo de sangre de los cerdos (Utilizando reactivos de tipificación humana) para identificar a los cerdos "tipo O", esto es, cerdos no reactivos con anticuerpos a los antígenos A o B de glóbulos rojos humanos. Las aortas de los cerdos "tipo O" fueron cortadas y transportadas luego sobre hielo desde el matadero al laboratorio. Las PAE fueron aisladas por tratamiento con colagenasa como lo describen Gimbrone y colaboradores, J. Cell Biol. 60: 673-84 (1974). Las PAE fueron cultivadas en medio RPMI que contenía 10º de suero fetal de ternera (FCS), suplementado con 150 \mug/ml de suplemento de células endoteliales (Sigma) y 50 \mug/ml de heparina (Sigma). Las células fueron identificadas como células endoteliales por su morfología típica de guijarro y su inmunorreactividad con anticuerpos Factor VIII, identificados utilizando inmunofluorescencia. En todos los ensayos escritos más abajo, las PAE fueron utilizadas entre la 8^{ava} y la 12^{ava} pasadas.

B. Cultivo de tejidos: Mantenimiento de las líneas celulares PK-1 y PAE

Todos los cultivos de tejido fueron realizados en una cámara de flujo laminar, utilizando técnicas apropiadas para el cultivo estéril de tejidos. Todos los reactivos para el cultivo de tejidos, a menos que se indique otra cosa, fueron adquiridos a CSL, Melbourne, Australia. Los medios fueron constituidos de la siguiente manera:

Medio de Cultivo PK-1
DMEM (Cytosystems, Castle Hill, Australia)	500 ml
FCS (CSL, Melbourne, Australia)	37,5 ml
Glutamina (200 mM) (Cytosystems)	5 ml
Hepes (1M) (CSL)	7,5 ml
Penicilina (CSL)	0,5 ml (10^{5} U/ml final)
Estreptomicina (CSL)	0,5 ml (10^{5} U/ml final)

\vskip1.000000\baselineskip

PAE - Medio de Cultivo:
RPMI (CSL)	90 ml
FCS (CSL)	10 ml
Suplemento de Células endoteliales	1,5 ml
(3 mg/ml) (Sigma)
Heparina (10 mg/ml) (CSL)	0,5 ml

El suplemento de células endoteliales fue adquirido a Sigma Chem. Co. (St. Louis, Missouri, EE.UU) en forma de polvo liofilizado, resuspendido en HBBS estéril, y alícuotas de 3 ml almacenadas a 4ºC.

Heparina (Sigma, Missouri, EE:UU) (10 mg/ml)	- disuelto en PBS
(0,22 \mum)	- filtro esterilizado
Tampón de Hanks Cytosystens	- adquirido a

Los siguientes procedimientos generales fueron utilizados en la propagación de las líneas celulares.

Eliminar el medio viejo.

Enjuagar las células dos veces con PBS estéril.

Añadir 3 ml de TED (tripsina 0,05 M, EDTA 0,53 M, Gibco, NY, EE.UU).

Incubar por 10 min en incubadora de CO_{2} a 37ºC.

Añadir 7 ml de RPMI con FCS al 10%.

Resuspender las células y transferir a un tubo estéril de 10 ml.

Centrifugar durante 5 min a 1200 RPM, descartar el sobrenadante.

Resuspender las células en RPMI con Suero Bovino de Newborn (NBS) al 10% y repetir la centrifugación.

Resuspender las células en 1 ml de DMEM (PK-1) o en RPMI (PAE) (con aditivos, como se describió antes).

Añadir 10 ml de medio y el volumen apropiado de suspensión de células para lograr la dilución deseada por cada botella para cultivo de tejido de 75 cm^{2}, y retornar a la incubadora humidificada de CO_{2}.

C. Coloración de anticuerpos y análisis de las FACS

Añadir 2 ml de TED a una botella de 75 cm^{2} que contiene PK-1 o las PAE, e incubar a temperatura ambiente durante 10 min.

Añadir RPMI más FCS al 10% (5 ml) para neutralizar a la tripsina.

Precipitado de células por centrifugación (700 g, 5 min, 4ºC).

Lavar las células por resuspensión y centrifugación en Tampón de Hanks (x2).

Precipitado de células por centrifugación (700 g, 5 min, 4ºC).

Resuspender el precipitado de células en tampón de Hanks que contiene anticuerpos anti-GAL purificados, suero libre de GAL o IgG libre de GAL e incubado a 4ºC durante 60 min. Todos los anticuerpos fueron utilizados sin diluir, o diluidos 1:2 ó 1:4 en tampón de Hanks.

Añadir 1 ml de Tampón de Hanks, precipitado de células por centrifugación y aspirar el sobrenadante.

Resuspender el precipitado en IgG Fab2 o IgM Fab2 anti-humano de oveja marcado FITC (Silenus, Hawthorn, Australia) diluido 1:80 en Tampón de Hanks.

Incubar durante 30 min a 4ºC.

Lavar tres veces con tampón de Hanks; resuspender el precipitado del lavado final en 0,5 ml de tampón de Hanks.

Analizar las muestras teñidas utilizando FACScan II (Becton Dickinson) de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

La especificidad de la unión del anticuerpo anti-GAL con las células de porcino se determinó examinando la capacidad de los azucares de diferentes estructuras para inhibir la unión del anticuerpo. En estos estudios de competición, los anticuerpos anti-GAL fueron incubados previamente con azúcar (0,1 M) a 37ºC durante 30 min antes de añadirlo a las células.

D. Resultados

Utilizando inmunofluorescencia, se encontró que el anti-GAL total (IgM & IgG) y el IgG anti-GAL purificado y teñido ambas células PK-1 y las PAE. Por otro lado ni el suero libre de anticuerpo anti-GAL total ni el suero libre de IgG anti-GAL dieron coloración detectable sobre este medio. La coloración con IgM y/o IgG anti-GAL fue inhibida con galactosa purificada y con disacáridos que tienen residuos terminales de galactosa en la configuración \alpha1 tal como la melibiosa (6-O-\alpha-D-galactopiranosil-D-glucosa) y estaquiosa (\alpha-D-Gal-[1->6]-\alpha-D-Glc-[1->2]-\beta-D-Fru). La coloración no se inhibió con azúcares tales como lactosa (4-O-\beta-D-galactopiranocil-\alpha-D-glucosa), que tienen un residuo terminal de galactosa, pero en una configuración \beta1\rightarrow4. Los resultados de tal experimento se representan en la Figura 1. Las PAE fueron coloreadas con anticuerpo anti-GAL solamente (GAL:PBS) o con anticuerpo anti-GAL que había sido previamente incubado ya sea con melibiosa (GAL:MELIBIOSA), galactosa (GAL:GALACTOSA) o lactosa (GAL:LACTOSA). La coloración del anticuerpo anti-GAL fue aproximadamente 10 veces menor en las muestras que contenían melibiosa y galactosa, pero no fue significativamente afectada por la
lactosa.

II. Tejidos A. Métodos

El riñón de cerdo fue fijado en formalina y deshidratado antes de embeberlo en Paraplast. El corazón y el hígado de cerdo fueron fijados en fijador de peryodato de paraformaldehído-lisina y congelación rápida en compuesto O.C.T. para embeber (10,24% p/p de alcohol polivinílico, 4,26% p/p de polietilénglicol, 85,50% p/p de ingredientes no reactivos; Tissue Tek®, Miles, Inc., Elkhart, Indiana, EE.UU). Secciones de cuatro \mum de espesor de corazón e hígado de cerdo y secciones de 2 \mum de espesor de riñón, fueron incubadas con anticuerpos anti-GAL purificados (no diluidos, 1:2 y 1:4) durante 60 min, y luego incubadas con un fragmento F(ab') de inmunoglobina anti-humana de oveja conjugada con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Silenius Laboratories, Hawthorn, Australia) (1:100) durante 30 min, o un IgG anti-humano de conejo conjugada con peroxidasa (Dakopatts, Glostrup, Dinamarca) (1:50) durante 60 min. Las secciones de control fueron analizadas por autofluorescencia, con el anticuerpo secundario solamente, o con el IgG libre de anti-GAL, o suero normal de cerdo como el anticuerpo primario. No se detectó coloración. La especificidad de los anticuerpos anti-GAL fue analizada por medio de secciones incubadas previamente de corteza renal de cerdo con una variedad de azúcares, incluidos melibiosa, lactosa, sacarosa y glucosa a 0,1 M.

B. Resultados

Como con los análisis realizados sobre las células de cerdo utilizando inmunofluorescencia, IgM + IgG anti-GAL total, IgG anti-GAL purificado, pero no los sueros libres de IgM y/o IgG anti-GAL, colorearon todos los tejidos de cerdo examinados. Los parámetros individuales de coloración variaron de órgano a órgano como se muestra abajo:

Inmunocoloración de los Tejidos de Cerdo con Anticuerpos Anti-GAL
Tejido	Reactividad Anti-GAL	Intensidad de Coloración
Riñón	Túbulos enroscados proximales y distales	Variable
	Endotelio: Sinusoides intertubulares	Variable
	Endotelio: Arterias y venas	Fuerte
	Capilares glomerulares	Variable
Corazón	Endotelio: Arterias, venas, capilares	Fuerte
	Endocardio	Fuerte
	Miocardio	Perinuclear
Hígado	Ductos biliares pequeños (células de revestimiento)	Fuerte
	Endotelio: Arterias y venas	Negativa
	Sinusoides intertubulares

La especificidad de la unión de los anticuerpos anti-GAL fue analizada sobre secciones de corteza renal de cerdo por medio de inhibición con melibiosa, lactosa, sacarosa y glucosa 0,1 M. La reactividad de los anticuerpos anti-GAL con los bordes en escobilla del túbulo proximal se redujo hasta cerca del fondo por medio de incubación previa del anticuerpo con melibiosa, pero no se inhibió con los otros sacáridos.

Ejemplo 3 Hemoaglutinación de RBC de cerdo por suero humano: Estudios de inhibición por azúcar

Los métodos utilizados para investigar la hemoaglutinación de los glóbulos rojos de cerdo (RBC) por el suero humano, fueron adaptados de los métodos descritos por Galili, J. Exp. Med. 160:1579-81 (1984) y Svenson, Immunol. 96:785-789 (1966).

I. Métodos A. Preparación de Medios/Soluciones

Albúmina de Suero Humano (HSA) (CSL, Melbourne, Australia) (5 mg/ml) se disolvió en PBS, se filtró a través de filtro esterilizante, y se almacenó a 4ºC.

Preparación de azúcares:

- Se prepararon soluciones patrón 1M de azúcar disolviendo la cantidad indicada en 100 ml de PBS. Se añadió azida de sodio (0,02%) y se almacenaron las soluciones a 4ºC.

\alpha-Lactosa (4-O-\beta-D-galactopiranosil-\alpha-D-glucosa	36,0 g
D(+)galactosa	18,0 g
Estaquiosa (\alpha-D-gal-[1->6]-\alpha-D-Glc-[1->2]-(\beta-D-Fru)	66,6 g
Melibiosa (6-O-\alpha-D-galactopiranosil-D-glucosa)	34,2 g
Sacarosa (\alpha-D-Glucopiranosil \beta-D-fructofuranósido)	34,2 g
D-(+)-Glucosa	18,0 g
A-D-(+)-Fucosa(6-Deoxi-D-galactopiranosa)	16,4 g

Todos los azúcares fueron adquiridos a Sigma (St. Louis, Missouri, EE.UU). Las soluciones de azúcar se diluyeron en PBS a la concentración apropiada requerida.

B. Preparación de los RBC de cerdo

La sangre heparinizada de cerdo (Animal Resources, Clayton, Australia) se centrífuga a 800 RPM durante 10 min hasta precipitar el RBC.

Se lava el precipitado de RBC por medio de resuspensión en PBS (10 ml) y se centrifuga nuevamente (repetido 3 veces). Después del lavado final, se resuspende el precipitado de RBC en 10 ml de PBS.

Se prepara una solución al 0,5% de los RBC por medio de la adición de 50 \mul de solución de RBC (de la etapa 2 anterior) a 10 ml de PBS que contenían 0,5 g/100 ml de HSA.

C. Preparación de las placas de microtitulación de 96 pozos (Titretek, EE.UU)

Añadir 25 \mul de PBS a cada pozo.

Añadir 25 \mul de suero AB humano reunido (CSL, Melbourne, Australia) a la columna 1 y diluir en forma serial removiendo 25 \mul de la columna 1 y añadirlos a la columna 2, luego repetir removiendo secuencialmente y añadiendo 25 \mul de, y a cada pozo a través de la placa, descartando finalmente 25 \mul de la columna 11 y sin añadir suero a la columna 12.

Añadir 25 \mul de solución de azúcar a cada fila en concentraciones decrecientes en las filas de abajo. No se añaden soluciones de azúcar en la fila final.

Incubar a 4ºC durante la noche y luego a 37ºC durante 30 min.

Añadir 50 \mul de RBC de cerdo al 0,5% a cada pozo; agitar en remolino e incubar a temperatura ambiente durante 2 horas. Determinar visualmente la aglutinación.

II. Resultados

El suero humano causó la aglutinación de los RBC de cerdo a un título entre 1/32-1/64, que es consistente con la presencia de altos niveles de xenoanticuerpo de ocurrencia natural (NXAb) en suero humano. Para examinar la especificidad de la respuesta en NXAb, se realizaron estudios de inhibición con azúcar. Se encontraron azúcares tales como melibiosa, estaquiosa, galactosa y fucosa que tienen residuos de galactosa terminal en la configuración \alpha1-6 que inhiben la aglutinación en el rango desde \muM hasta mM. Los azúcares con otras estructuras, tales como lactosa y sacarosa, fueron inhibitorios solamente cuando se utilizaron concentraciones muy altas. A estas altas concentraciones, los efectos observados son más probablemente no específicos, debido, por ejemplo, a cambios en osmolaridad. Los resultados se resumen más abajo:

Hemoaglutinación RBC de cerdo por suero humano: Inhibición por azúcar
Azúcar	Enlace	Concentración Inhibitoria
Melibiosa	Gal \alpha1-6Glc	5x10^{-4} M
Estaquiosa	Gal \alpha1-6Gal	2x10^{-3} M
Galactosa		2x10^{-3} M
Fucosa	6-Desoxi-\alpha-L-Gal	1x10^{-3} M
Lactosa	Gal\beta1-4-Glc	>10^{-1} M
Sacarosa	\alpha-D-Glc-\beta-D-Fruc	>10^{-1} M

Ejemplo 4 Inhibición de lisis inducida por suero humano de células de porcino por azúcares

La habilidad del suero humano para causar la lisis de las células de porcino fue examinada utilizando tanto células epiteliales de cerdo (PK_{1}) como epiteliales aórticas (PAE), el aislamiento y cultivo de las cuales se describe en el Ejemplo 2. La lisis de las células se determinó usando o ensayos de liberación de ^{51}Cromo como el descrito por Cerottini y Brunner, Nature New Biol. 273:272, 1972 o el ensayo de liberación de LDH Cytotox de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Promega, EE.UU).

I. Métodos A. Ensayo de Liberación de ^{51}Cromo 1. Preparación de células

Tripsinizar un frasco confluente de células. En promedio, se obtienen aproximadamente 3x10^{6} de células PAE y aproximadamente 3x10^{7} células PK_{1} por botella de 10 ml. se requieren alrededor de 1x10^{5} células por cada pozo en el Ensayo de Liberación de ^{51}Cr.

Lavar las células 4 veces en 10 ml de RPMI (no FCS); Rotar a 1200 rpm durante 5 min.

Resuspender las células en 100 \muL de RPMI (con 10% de FCS inactivado por calor; ver más abajo).

2. Células marcadoras con ^{51}Cr

Combinar en un tubo de 10 ml: Células en 195 \mul de RPMI/10% FCS (inactivado por calor); 5 \mul de ^{51}Cr (120 \muCi)

Incubara 37ºC durante 2 h.

Añadir 2 ml de RPMI/10% FCS (inactivado por calor).

Centrifugar las células a través de una capa de FCS (inactivado por calor) para remover el exceso de marcador.

Extender suavemente las células marcadas sobre una almohadilla de 4 ml de FCS utilizando una pipeta Pasteur.

Centrifugar a 700g durante 5 min a 4ºC.

Remover el sobrenadante teniendo en cuenta de no disturbar el precipitado de células.

Resuspender el precipitado en RPMI/10% FCS (inactivado por calor) alrededor de 3x10^{7} células/ml.

3. Condiciones del ensayo

Para las PAE, se usó complemento de conejo como la fuente de complemento, ya que el ensayo de liberación de ^{51}Cr no era suficientemente sensible para detectar la lisis cuando se usó complemento humano, una fuente menos "activa". En contraste, con el ensayo LDH, que es significativamente más sensible se uso suero humano normal (NHS) como la fuente de complemento.

A cada pozo de ensayo de una placa de 96 pozos con fondo en forma de V, añadir:

- 100 \mul de células marcadas

- 10-50 \mul de NHS (inactivado por calor) (5-25% del final)

- Complemento:

: Las PAE: 50 \mul de complemento absorbido de conejo (25% final)

: PK_{1}: 10-40 \mul de NHS (5-25% del final)

- 50 \mul de anticuerpo (anti-GAL total (IgG + IgM, IgG anti-GAL, suero libre de anticuerpo anti-GAL, o IgG libre de anticuerpo anti-GAL)

ajustar el volumen a 200 \mul con RPMI/10% FCS (inactivado por calor) si se requiere

Incubar las placas a 37ºC durante 3 h.

Centrifugar las placas a 1000 rpm durante 5 min para precipitar las células.

Remover 100 \mul de sobrenadante de cada pozo y transferirlos a un tubo contador gama.

Añadir 3 ml de fluido de centelleo y medir la liberación de ^{51}Cr utilizando un contador gama (Packard Instrument Company, Illinois, EE.UU)

(Para determinar la liberación máxima, añadir 100 \mul de Triton X-100 al 8% compuesto por RPMI/10% FCS (inactivado por calor) a 100 \mul de células marcadas)

(Nota: cada reacción se hace por cuadruplicado)

4. Cálculo del % de lisis

% \ Lisis = \frac{\text{cpm Experimental} - \text{cpm Liberación Espontánea}}{\text{cpm Liberación Máx.} - \text{cpm Liberación Espontánea}} x 100

5. Inhibición por azúcar de la citotoxicidad celular inducida por el complemento

En una placa de pruebas de 96 pozos, mezclar lo siguiente:

-: 50 \mul de células marcadas

-: 50 \mul de complemento

(las PAE: células de bazo de cerdo absorbidas por el complemento; las PK_{1}: NHS)

-: x \mul de azúcar (concentración final de azúcar: 10^{-1} a 10^{-3} M)

-: y \mul de NHS (inactivados por calor) - concentración final 5-20%)

-: llevar a volumen de 200 \mul con RPMI

Ordenamiento de Placas:

	Placa 1	Placa 2
	5%	10%	15%	20%
Filas:	1-4	5-8	1-4	5-8

Columnas:

1. Liberación Espontánea

2. Liberación Máxima

3. Melibiosa

4. Lactosa

B. Ensayo de Liberación de LDH 1. Procedimientos Generales

Preparar células para el ensayo de Liberación de ^{51}Cr, y marcadas con LDH de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Ensayo de liberación de LDH no radiactivo Cytotox, Promega, EE.UU)

A cada pozo de la placa de 96 pozos añadir (cada reacción realizada por cuadruplicado):

-: 25 \mul de células marcadas

-: 5-20 \mul de NHS

-: x \mul de azúcar (concentración final d azúcar: 10^{-1} a 10^{-3} M)

-: RPMI/10% FCS (inactivado por calor), a un volumen total de 100 \mul

Incubar las placas a 37ºC durante 3 h.

Centrifugar las placas a 1500 rpm durante 5 min.

Remover 50 \mul de sobrenadante de cada pozo (teniendo cuidado de no remover ninguna célula) y transferir a una placa de ELISA que contiene 50 \mul de mezcla de sustrato (preparada de acuerdo a las instrucciones del fabricante).

Cubrir la placa e incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 min.

Añadir 50 \mul de solución de detención a cada pozo, usando pipeta multicanal.

Leer la absorbancia a 492 nm.

2. Controles

Liberación espontánea (sin anticuerpo o complemento)

-: 25 \mul de células marcadas

-: 75 \mul de RPMI/10% FCS (inactivado por calor)

Liberación máxima

-: 25 \mul de células marcadas

-: 50 \mul de Tritón X-100 al 16%

-: 25 \mul de RPMI/10% FCS (inactivado por calor)

3. Cálculo del % de Lisis

% \ Lisis = \frac{\text{Liberación experimental} - \text{(cpm liberación espontánea} + \text{cpm azúcar})}{\text{Liberación Máxima} - \text{(cpm liberación espontánea} + \text{cpm azúcar)}} x 100

4. Diseño Experimental

Placa 1
Columnas:	1. liberación espontánea	Filas: 1-4; células + sin azúcar
	2. liberación máxima	5-8: sin células + sin azúcar
	3. 5% de suero
	4. 10% de suero
	5. 25% de suero
	6. RF10 solamente

\vskip1.000000\baselineskip

Placa 2	melibiosa
Placa 3	galactosa
Placa 4	lactosa
Placa 5	sacarosa
Placas 6-9	igual que las placas 2-5 pero sin añadir células

\vskip1.000000\baselineskip

	Concentración de Azúcar
Columnas	1-2	1 \times 10^{-1}M	Filas	1-2	0% suero
	3-4	5 \times 10^{-2}M		3-4	5% suero
	5-6	1 \times 10^{-2}M		5-6	10% suero
	7-8	5 \times 10^{-3}M		7-8	25% suero
	9-10	2 \times 10^{-3}M
	11-12	1 \times 10^{-3}M

5. Preparación de Complemento de Conejo Absorbido por el Bazo de Cerdo

Cortar el bazo de cerdo (obtenido del matadero local) en pequeños pedazos y preparar una suspensión de células sencillas por medio del paso a través de un tamiz fino de metal

Precipitar las células por centrifugación a 700 g, 7 min a 4ºC.

Resuspender el precipitado de células en RPMI/10% FCS y repetir la centrifugación.

Resuspender en RPMI/10% FCS/10% dimetilsulfóxido (DMSO).

Conteo de células y almacenamiento de alícuotas congeladas (3 x 10^{9} células/alícuota).

-: usar una alícuota para cada absorción.

Para la absorción, descongelar y centrifugar a 600 g, 5 min a 4ºC y remover el sobrenadante que contiene al DMSO.

Lavar dos veces con RPMI/10% FCS (10 ml).

Resuspender el precipitado de células en complemento de conejo; mezclar (agitador mecánico) 2 h a 4ºC.

Centrifugar a 600 g, 5 min a 4ºC y remover el sobrenadante que contiene al complemento de conejo; almacenar a 4ºC.

II. Resultados

Se obtuvieron resultados comparables con ambos tipos de células (las PAE y las PK_{1}) utilizando ambos ensayos de lisis. Los resultados de un experimento típico de lisis se representan en la Figura 2, en el cual la lisis de las PAE por suero humano y purificadas por anticuerpos anti-GAL, se determinó usando el ensayo de liberación de ^{51}Cr. Se obtuvieron también resultados comparables con células PK_{1} usando el ensayo de liberación de ^{51}Cr y con ambas líneas de células usando el ensayo de liberación de LDH. Los resultados de estos ensayos pueden resumirse como sigue:

1. Los xenoanticuerpos (NXAb) en suero humano en presencia del complemento, son capaces de lisar las células de porcino. La lisis se incrementa con el incremento de las concentraciones de suero.

2. Absorción previa de NHS con células de bazo de cerdo (que remueve al NXAb): No lisis

3. Uso del complemento inactivado por calor: No lisis

4. Uso de NHS libre de anticuerpo anti-GAL: No lisis

5. Uso de anticuerpos anti-GAL totales purificados (IgG + IgM): Lisis

Uso de IgG anti-GAL purificado: No lisis

Uso de anticuerpos anti-GAL totales purificados (IgG + IgM) y ditiotetreitol (DTT): No lisis. (DTT es un agente de reducción que rompe la estructura multimérica de los anticuerpos IgM sin afectar a los IgG).

Estos resultados juntos demuestran que los anticuerpos anti-GAL son responsables de la lisis observada. Los anticuerpos anti-GAL totales (IgG + IgM) tratados con el anticuerpo IgG anti-GAL purificado fallaron en producir lisis, indicando que los anticuerpos IgM, pero no IgG, son agentes causantes en este sistema. Los intentos preliminares para verificar esta observación, utilizando IgM preparado ya sea en forma cruda por medio de fraccionamiento por euglobulina o por cromatografía de afinidad de \alpha-IgM, no fueron exitosos. Los inventores creen que esto refleja la inactivación de la IgM durante la preparación, en vez de una verdadera reflexión de la capacidad del IgM anti-GAL para causar lisis de las células de porcino. La inactivación por calor del complemento previno la lisis, indicando que la lisis de las células de porcino es un fenómeno dependiente del complemento.

El efecto de añadir los azúcares disacáridos melibiosa (Gal \alpha1\rightarrow6 Gal) y lactosa (Gal \beta1\rightarrow4 Glu sobre la lisis de las PAE por suero humano, fue evaluado usando el ensayo de liberación de LDH no radiactivo Cytotox. Las PAE fueron incubadas en presencia de 50% de suero humano como la fuente de xenoanticuerpo y de complemento, junto con diferentes concentraciones de cada azúcar (1 mM hasta 100 mM). Bajo estas condiciones, la melibiosa, que tiene la configuración Gal \alpha1\rightarrow6 Gal, pero no la lactosa, que tiene la fracción terminal Gal en una configuración \beta1\rightarrow4, protegió a las células de cerdo de la lisis.

Ejemplo 5 Inhibición del Daño Inducido por Suero Humano a Corazones de Rata por Azúcares

El modelo de corazón aislado prefundido ex vivo de Langendorf, fue utilizado para demostrar además la implicación de los xenoanticuerpos anti-GAL en el rechazo hiperagudo.

I. Métodos A. Preparación y almacenamiento de Plasma Humano

1. Centrifugar sangre humana fresca a 3000 rpm, 10 min, 4ºC para remover los glóbulos rojos (RBC).

2. Remover el plasma.

3. Centrifugar el plasma a 10.000 rpm, 10 min, 4ºC para remover célula remanente; decantar el plasma.

4. Añadir 2,5 ml de EDTA 0,1 M pH 7,30 por cada 50 ml de plasma.

5. Almacenar alícuotas de 50 ml a -70ºC.

6. Para el plasma inactivado por calor, calentar a 56ºC durante 60 min, luego centrifugar a 2500 rpm durante 10 min.

B. Evaluación de la Actividad del Complemento

Antes de ser usado e el modelo ex vivo, tanto el plasma inactivado por calor como el de control, fueron analizados por la actividad del complemento. La actividad clásica del complemento fue determinada por hemólisis usando a los RBC en ovejas sensibilizadas como lo describen Harrison y Lachman, en: Weir y colaboradores (eds.), Handbook of Experimental Immunology and Immunochemistry, 4ª edición, Blackwell Scientific Publications (1986). Se determinó una ruta alternativa de actividad del complemento usando el ensayo hemolítico de conejo como lo describen Serrais y colaboradores, J. Immunol. Meth. 140: 93-100 (1991). El ensayo fue realizado en tampón que contenía EGTA y MgCl_{2}. El EGTA que la al Ca^{++}, inhibiendo así la ruta clásica. Se requiere al Mg^{++} para la activación y el ensamblaje de CdbBb, la ruta alternativa de la C3 convertasa.

C. Preparación de Plasma para Perfusiones de Corazón

El plasma preparado a partir de diferentes paquetes de sangre se descongela a 37ºC, se reúne y se filtra (malla de acero de 100 \mum, filtros Millipore de 8,0 \mum y 4,5 \mum, secuencialmente). Se añadió CaCl_{2} a 0,58 mg/ml de plasma, y se conservó al plasma sobre hielo hasta estar listo para perfusión.

D. Modelo de Corazón de Roedor Prefundido Aislado Ex Vivo

1. Anestesiar las ratas con Nembutal (1 \mul de pentobarbitona de sodio (60 mg/ml)/g de peso corporal) y los ratones con éter.

2. Exponer quirúrgicamente el corazón e inyectar heparina (Porcine Mucous, 10.000 U/ml) en la vena femoral (ratas: 0,3 ml inyectados).

3. Remover el corazón y colocarlo en tampón de Krebs-Henseleit enfriado con hielo que contiene heparina (0,2 ml/50 ml de tampón).

Tampón de Krebs-Henseleit:

-: NaCl 119 mM

-: NaHCO_{3} 25 mM

-: KCl 4,6 mM

-: MgSO_{4}.7 H_{2}O 1,2 mM

-: CaCl_{2}.2 H_{2}O 1,3 mM

-: KH_{2}PO_{4} 1,2 mM

-: glucosa 11 mM

-: BSA 0,25% (v/v).

Conectar la aorta a la cánula del aparato de perfusión de Langendorf y atarla firmemente. El aparato fue montado por los presentes inventores de acuerdo a los requerimientos experimentales del modelo de corazón de Langendorf como se describe en Doring & Dehnerrt, The Isolated Perfused Herat According to Langendorf, Bionesstechnik-Verlag March GMBH, D7806, Alemania Occidental.

Prefundir con el tampón de Krebs-Henseleit (preparado fresco cada día), que se burbujea continuamente con carbógeno (95% de O_{2}, 5% de CO_{2}) a una presión de 100 mmHg a 37ºC.

Unir un gancho, conectado a un transductor (Fisiógrafo MK-111-S, Narco Bio-Systems) a la cúspide del corazón.

Prefundir el corazón durante 20 min con tampón de Krebs-Henseleit para permitir al corazón que se estabilice (volumen del depósito: 270 ml).

Añadir plasma (precalentado a 37ºC) como sigue:

-: a los 20 minutos, añadir 10 ml de plasma (= 5% de plasma)

-: a los 25 minutos, añadir 10 ml de plasma (= 9% de plasma)

-: a los 30 minutos, añadir 10 ml de plasma (= 13% de plasma)

Hacer seguimiento al corazón durante otros 30 min y registrar el flujo del corazón y la velocidad de la contracción.

E. Perfusión de azúcar

1. Estabilizar el corazón en tampón de Krebs-Henseleit durante 30 min como se describió antes.

2. Añadir 2,5 ml de solución patrón de azúcar de 1,08 M al depósito; volumen total = 270 ml; concentración final de azúcar = 10 mM.

3. Permitir al corazón estabilizarse durante 10 min, luego añadir plasma (de control o inactivado por calor) de acuerdo al esquema descrito antes.

4. Registrar el latido del corazón y la velocidad de flujo.

F. Preparación a Gran Escala de Plasma Libre de anticuerpo anti-GAL

(todas las manipulaciones se realzan a 4ºC)

1. Iniciar con 200 ml de plasma humano recientemente preparado; se someten 100 ml al vaciamiento; 100 ml se utilizan como control no tratado del mismo paciente, retirados el mismo día; almacenar a 4ºC.

2. Filtrar el plasma secuencialmente a través de tamices metálicos de 100 \mum y 8 \mum, y finalmente a través de un filtro Millipore de 0,45 \mum; diluir hasta 1000 ml con PBS, pH 8,0.

3. Concentrar hasta 200 ml usando un cartucho Amicon enrollado en espiral (remueve la sal).

4. Equilibrar la columna de sefarosa melibiosa (40 ml) con PBS, pH 8,0 (10 volúmenes de columna).

5. Pasada el plasma a través de la columna de sefarosa melibiosa, recolectar lo que corrió a través de ella y almacenarlo a -70ºC (= plasma parcialmente desocupado).

6. Lavar la columna con PBS, pH 8,0 (10 volúmenes de columna) hasta que el O.D. (280 nm) del eluato, sea aproximadamente cero.

7. Combinar el plasma parcialmente desocupado y el eluato del lavado; concentrar hasta 200 ml (concentrador en espiral de Amicon).

8. Eluir la fracción de anticuerpo anti-GAL con clorhidrato de guanidina 4 M, pH 6,4 (2 volúmenes de columna).

9. Regenerar la columna con PBS (10 volúmenes de columna).

10. Repetir el proceso completo dos veces más, esto es, el pasaje del plasma a través de la columna de melibiosa, lavar, eluir la fracción de anticuerpo anti-GAL y regenerar la columna:

11. Para la fracción libre de anticuerpo anti-GAL:

- combinar el eluato de la columna de sefarosa melibiosa con lo que corrió a través de ella en el lavado final

- ajustar el volumen a 5 litros con tampón de Krebs-Henseleit y añadir EDTA hasta 10 mM, ajustar el pH hasta 7,0

- concentrar nuevamente hasta el volumen original (concentrador en espiral de Amicon); alícuota (35 ml) y almacenar a -70ºC.

12. Para la fracción de anticuerpo anti-GAL:

- combinar las fracciones de anticuerpo anti-GAL eluidas, diluir hasta 5 litros con tampón de Krebs-Hensenleit y añadir EDTA hasta 10 mM.

- concentrar nuevamente hasta 10 ml (concentrador en espiral de Amicon); alícuota (1 ml) y almacenar a -70ºC.

13. La fracción libre de anticuerpo anti-GAL y la fracción purificada de anticuerpo anti-GAG para:

Reactividad anti-GAL: Usarlas como reactivos primarios para coloración de células de porcino (las PK_{1}). Detectar la coloración como se describe en el Ejemplo 2, arriba. Analizar las muestras coloreadas usando un FACScan II (Becton Dickinson), de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

Contenido de proteína: Determinar usando el método colorimétrico de Bradford, Anal. Biochem. 72: 248-54 (1976), con IgG humano purificado como el estándar.

Concentración de electrolito: El día de la perfusión, se analiza también al plasma libre de anticuerpos anti-GAL para determinar los niveles de calcio, magnesio y potasio usando un autoanalizador de electrolitos (Olympus); los niveles de cada uno se ajustan hasta el estado normal como se requiere.

II. Resultados

Los corazones de rata fueron conectados al aparato de Langendorf y luego estabilizados por perfusión con tampón de Krebs-Henseleit por 10 min, y luego otros 10 min adicionales con el mismo tampón que contenía o melibiosa o lactosa (10 mM). Se añadió entonces plasma humano en etapas como se describió antes hasta una concentración final del 13%, y se evaluó el efecto del azúcar añadido sobre la función cardiaca. Los parámetros medidos fueron la velocidad del corazón, la amplitud (fuerza) de contracción y la potencia (Figura 3).

En presencia de suero humano solamente (señal menor) el corazón dejó esencialmente de latir en minutos. Se obtuvieron los mismos resultados si se añadía lactosa. En presencia de melibiosa (señal superior) o de plasma libre de anticuerpo anti-GAL, sin embargo, el corazón fue capaz de mantener un latido fuerte. Cuando el anticuerpo anti-GAL purificado fue añadido nuevamente al plasma libre de anticuerpo anti-GAL, el corazón dejó de latir nuevamente en minutos.

Ejemplo 6 Caracterización del Gen \alpha-1,3-GalT de Porcino

Los ADNc que codifican al \alpha-1,3-GalT de porcino fueron generados por medio de la tecnología de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). El ARN total de hígado de cerdo fue aislado por medio de homogenización de rebanadas de hígado en tiocianato de guanidinio 7 M como lo describen Chomczynski & Sacchi, Anal. Biochem 162, 156-159 (1987); Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2^{da} Edición), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Dieciséis \mug del ARN, junto con 1 \mug de oligo iniciador dT, fueron desnaturalizados por calor durante 5 minutos a 65ºC antes de ser transcritos en ADNc usando la transcriptasa reversa del virus de mieloblastosis aviar (AMV) en una reacción en 100 \mul llevada a cabo a 37ºC durante 90 minutos. Tres \mul de la reacción de síntesis de ADNc fueron utilizados en posteriores amplificaciones por PCR. Los procedimientos generales usados para la generación de ADNc se encuentran en Sambrook y colaboradores (1989), supra.

Los iniciadores para PCR fueron sintetizados utilizando tecnología de fosforamidita, en un sintetizador de ADN de Applied Biosystems. La secuencia de los iniciadores PCR se basó en la identificación de las regiones conservadas dentro de las secuencias publicadas para los genes \alpha-1,3-GalT de múrido y de bovino. Joziasse y colaboradores, J. Biol. Chem. 264: 14290-97 (1989); Joziasse y colaboradores, Biol. Chem. 267: 5534-5541 (1992). Todos los iniciadores fueron sintetizados con enlazadores EcoR1 en el extremo 5' para fácil clonación. En el siguiente listado de los iniciadores utilizados en el presente estudio, las posiciones de los nucleótidos que varían entre las secuencias de bovino y de múrido están subrayadas en forma sencilla; las posiciones de los nucleótidos que varían entre las secuencias de bovino y de humano se subrayan en forma doble.

: Iniciador Exón 2 (hacia delante):

: 5'-GTGAATTCAGCCCTGCCTCCTTCTGCAG-3'

: (SEQ ID NO: 1)

Designación:

\hskip2cm

GTE2F - -28 - mer

-: 1 diferencia b/w bovino & múrido

-: no hay secuencia disponible para el exón 2 humano

: Iniciador Exón 4 (hacia delante):

: 5'-GTGAATTCAGGAGAAAATAATGAATGTC-3'

: (SEQ ID NO: 2)

Designación:

\hskip2cm

GTE4F - -28 - mer

: - 1 diferencia b/w bovino & múrido

: - no hay secuencia disponible para el exón 2 humano

\vskip1.000000\baselineskip

: Iniciador Exón 9 (hacia atrás)

: 5'-GTGAATTCGGGATCTGCCTTGTACCACC-3'

: (SEQ ID NO: 3)

Designación:

\hskip2cm

GTE9R - -28 - mer

: - 3 diferencias b/w bovino & múrido

: - 1 diferencia b/w bovino & humano

\vskip1.000000\baselineskip

: Iniciador 3' - UTR (hacia atrás):

: 5'-GTGAATTCGAAATCACTGGGAATTTACA-3'

: (SEQ ID NO: 4)

Designación:

\hskip2cm

GT3UR - -28 - mer

: - no hay diferencias b/w bovino & múrido

: - no hay diferencias b/w bovino & humano

\vskip1.000000\baselineskip

: Iniciador Exón 9 (hacia delante):

: 5'-AGGAATTCAGCATGATGCGCATGAAGAC-3'

: (SEQ ID NO: 5)

Designación:

\hskip2cm

GTE9F - -28 - mer

: - no hay diferencias b/w bovino & múrido

: - 3 diferencias b/w bovino & humano

\vskip1.000000\baselineskip

: Iniciador PoliA (hacia atrás): 5'-TTGAATTCTTTTTTTTTTTTV*N**-3'

: (SEQ ID NO: 6) * V = A o C o G; ** N = A o C o G o T

: (el iniciador incluye todas las variantes de nucleótido para V y N)

Designación:

\hskip2cm

APATR - 23 – mer

Las condiciones PCR utilizadas para generar fragmentos de ADNc de \alpha-1,3-GalT de porcino fueron las siguientes:

1) Para GTE2F + GTE9R y GTE4F + GTE9R: calentar a 94ºC (60 segundos); luego proceder con 35 reiteraciones (ciclos) de las siguientes tres etapas: (1) 94ºC, 40 segundos, (2) 57ºC, 50 segundos, y (3) 72ºC, 80 segundos.

2) Para GTE9F + GT3UR: calentar a 94ºC (120 segundos); luego proceder con 35 ciclos de: (1) 94ºC, 40 segundos, (2) 48ºC, 45 segundos, y (3) 72ºC, 60 segundos.

Los fragmentos de PCR fueron subclonados dentro de pBluescript II KS+ restringido por EcoR1 (Stratagene, Cat, # 2 12206) y la secuencia de ADN fue determinada usando el método de terminación de cadena. La secuencia de ADN fue armada y analizada usando DNASIS-Mac v2.01 (Hitachi).

La secuencia de nucleótidos del \alpha-1,3-GalT de porcino (SEQ ID NO. 7) y la secuencia derivada de aminoácidos (SEQ ID NO: 10) de la enzima se muestran en las Figuras 4 y 5. Un único marco amplio de lectura abierta se extiende desde la metionina iniciadora en el nucleótido 91 hasta un codón de detención localizado en el nucleótido 1204. La secuencia que rodea a la metionina putativa iniciadora conforma el consenso de la secuencia eucariótica de iniciación. Kozak, Cell 44, 283-92 (1986).

Se compara a la secuencia de ADNc de porcino con las correspondientes secuencias de múrido (SEQ ID NO: 9) y bovino (SEQ ID NO: 8) en la Figura 4. La ubicación de los intrones dentro del gen de múrido también es conocida. Joziasse y colaboradores, J. Biol. Chem. 267: 5534 (1992). Esta alineación demuestra que el exón 3, localizado dentro de la región no traducida 5' del gen de ratón, no se encuentra ni en los ADNc de porcino ni de bovino. La identidad completa de la secuencia entre las secuencias de codificación son como sigue:

cerdo comparado con ratón: - 75,02% (no se consideró al exón 3)

cerdo comparado con bovino: - 85,15%

Las secuencias de aminoácidos de las enzimas del \alpha-1,3-GalT de porcino (SEQ ID NO: 10), múrido (SEQ ID NO: 12) y bovino (SEQ ID NO: 11) son descritas en la Figura 5. Las ubicaciones de los intrones también son conocidas, con base en sus posiciones dentro del gen de ratón (Joziasse y colaboradores, 1992). Este alineamiento ilustra que las homologías completas de aminoácidos son:

cerdo comparado con ratón: 71,98%

cerdo comparado con bovino: 82,87%

bovino comparado con ratón: 73,72%

Ejemplo 7 Identificación de Sitios Potenciales para interrumpir al Gen \alpha-1,3-GalT

La escogencia de los presentes inventores de un sitio para interrumpir al gen \alpha-1,3-GalT ha estado influenciada por diferentes características del gen y su expresión. En particular, se han detectado varios ARNm para el \alpha-1,3-GalT en el ratón. Joziasse y colaboradores, J. Biol. Chem. 267: 5534 (1992). Estos ARNm son productos de eventos de eventos de empale alternativo en los cuales los exones 5 y/o 6 pueden ser suprimidos. Por lo tanto, estos exones no son sitios apropiados de interrupción en el ratón, ya que una copia que codifica a una enzima funcional \alpha-1,3-GalT presumiblemente podría formarse cuando los exones 5 ó 6 se empalman. Además, los presentes inventores han aislado dos diferentes clases de clones de ADNc del \alpha-1,3-GalT del cerdo - una que incluye al exón 5 y una con el exón 6 suprimido. Es posible que los ARNm, con o sin el exón 6, estén formados también por empalmes alternativos en el cerdo. Así, por experimentos iniciales, los presentes inventores no han escogido a estos exones como sitios para la interrupción.

La inserción de un fragmento de ADN de interrupción dentro del exón 4 (que codifica al dominio terminal citoplasmático NH_{2} y al dominio de anclaje de membrana; ver la Figura 5) alteraría la producción de una copia que codifica a un \alpha-1,3-GalT activo. Por lo tanto, este exón es un sitio apropiado para romper al gen \alpha-1,3-GalT. En forma similar, los exones 7 y 8, que codifican a la región terminal NH_{2} del dominio catalítico, son sitios de ruptura adecuados. La inserción de un fragmento de interrupción de ADN dentro de estos exones prevendría la síntesis de un dominio catalítico activo.

Un sitio preferido para interrumpir al gen del ratón está localizado en un sitio Sal1 encontrado dentro del exón 9 del gen \alpha-1,3-GalT de ratón, en los codones 221 + 22 (ver Figura 5). Este sitio se posiciona a 150 aminoácidos del COOH terminal, dentro del dominio catalítico. El gen de ratón dentro de las construcciones de los presentes inventores para recombinación homóloga, se interrumpe en este sitio Sal1. Los aminoácidos codificados por nucleótidos en este sitio Sal1 se conservan en las secuencias de cerdo y de bovino, aunque el sitio Sal1 por si mismo no. La construcción de un sitio Sal1 en esta posición en el gen del cerdo (por ejemplo, para mutagénesis in vitro) proporciona una construcción útil para inactivar al gen.

Ejemplo 8 Escogencia de un Fragmento de ADN para Interrumpir al Gen \alpha-1,3-GalT

Los presentes inventores han usado tanto al gen de resistencia a la neomicina (neo^{R}) y al gen de resistencia a la higromicina (hyg^{R}) para interrumpir al gen \alpha-1,3-GalT. En un grupo de construcciones para "inactivación", los genes neo^{R} e hyg^{R} están enlazados al promotor de quinasa fosfoglicerato del múrido (PGK) (Adra y colaboradores, Gene
60: 65-74 (1987) y ambos están ribeteados por secuencias polienlazantes que incluyen sitios de restricción para EcoRV y Clal.

En otra construcción, la expresión del gen neo^{R} está dirigida por un promotor de virus polioma alterado (PMCl: Thomas y Cappechi, Cell 51: 503-12 (1987)). En esta construcción, los presentes inventores han dirigido el problema de incluir un gen de resistencia antibiótica dentro del genoma de órganos para transplante. Esto es, en algunas circunstancias puede no ser deseable tener genes que confieren resistencia a los antibióticos presentes en el órgano que va a ser transplantado. El sistema FLP/FRT recombinasa de levaduras ha sido utilizado para eliminar al gen neo^{R} de la secuencia que interrumpe al gen \alpha-1,3-GalT.

En una construcción de la presente invención, el gen neo^{R} esta ribeteado a ambos extremos, el 5' y el 3' por elementos FTR ADN. Además, los codones de detención para cada uno de los tres marcos de lectura han sido insertados en 3' al gen neo^{R}, y estos codones de detención, junto con una secuencia única FRT, permanecerán dentro del gen \alpha-1,3-GalT después de que el gen neo^{R} ha sido cortado por FLP. Las células destinadas que portan una copia genómica del gen neo flanqueado por repeticiones directas del FRT, podrían ser suministradas con la recombinasa FLP en dos formas:

1) Introducción dentro de las células de una proteína FLP parcialmente purificada

La proteína FLP (0,1 - 10 \mug) se introduce (se transfecta) aproximadamente en 10^{7} células, usando condiciones estándar de electroporación. Las células se depositan en cajas de cultivo de tejido gelatinizadas en un medio apropiado, en dilución suficiente para obtener colonias individuales. Se toman aproximadamente 200 de estas colonias para análisis adicionales.

2) Transfección con plásmidos que contienen al gen FLP

Se construye un plásmido que contiene al gen FLP bajo el control de un promotor capaz de conducir la expresión de FLP, por ejemplo, el promotor 6-16 inducible por interferón humano, de acuerdo con métodos estándar. Porter y colaboradores, EMBO J. 7: 85 (1988). Se transfectan aproximadamente 10 \mug del plásmido de expresión de FLP en aproximadamente 10^{7} células usando condiciones de electroporación estándar. Con un plásmido que contiene al promotor humano 6-16, se añaden aproximadamente 500 unidades/ml de interferón, con miras a inducir la expresión de FLP. Las células se tratan entonces como en (1), más arriba.

El procedimiento para inactivar al gen \alpha-1,3-GalT en las células ES usando una construcción que contiene FRT es:

electroporar la construcción completa dentro de las células ES

seleccionar células neo^{R}, e identificar aquellas células que tienen un gen \alpha-1,3-GalT interrumpido

suprimir al gen neo^{R} usando recombinasa FLP, como se describió antes; las células se prueban para el evento de escisión como sigue.

Primero, se prueban las muestras de cada línea celular seleccionada para la ausencia del gen neo^{R} por tratamiento con el químico G418. Las células morirán en presencia aproximadamente de 200 \mug/ml de G418, a menos que el gen neo^{R} esté aún presente en el genoma. Las líneas celulares que son sensibles a G418, se prueban entonces además para confirmar que haya ocurrido la escisión de neo^{R}. Esto se hace por medio del análisis de Southern o análisis por PCR, ambos descritos en Sambrook y colaboradores (1989). Para el análisis de Southern, se aísla al ADN genómico de las células, digerido con una enzima de restricción apropiada, sometido a electroforesis en gel de agarosa, y el ADN digerido se transfiere a una membrana. El ADN se híbrida con una sonda marcada, la marca se detecta (por ejemplo, con una película de rayos X o por desarrollo de color), y el patrón de bandas indica si ha habido un evento de escisión o no en la línea celular. Para el análisis por PCR, el ADN genómico se aísla de las células y se lo somete a reacción PCR con iniciadores oligonucleótidos apropiados.

Después de la confirmación de la escisión, las células ES manipuladas o las PGC son usadas para generar animales quiméricos.

Ejemplo 9 La Preparación de las Construcciones de ADN para Interrumpir al gen \alpha-1,3-GalT en Ratones

El reconocimiento génico (recombinación homóloga) es más eficiente si los fragmentos clonados de ADNc usados para reconocimiento son aislados de la línea celular que se utiliza para inactivar al gen (esto es, el ADN es "isogénico"). Por lo tanto, el ADN fue aislado de la línea celular ES E14 (Hooper y colaboradores, Nature 326: 292-95 (1987)) y usado para construir una biblioteca genómica de ratón. El ADN fue digerido parcialmente con la enzima de restricción Sau 3ª, y se aislaron los fragmentos entre 12 kb y 20 kb de tamaño por medio de fraccionamiento en gradiente de glicerol. El ADN fraccionado por tamaño fue ligado dentro del sitio Bam H1 de \lambdaEMBL3 (Sambrook y colaboradores, 1989, supra), y empacado in vitro para formar partículas fago lambda. La librería lambda fue depositada por medio de infección de células huésped PMC103 de cepa E. coli (Doherty y colaboradores, Gene 124: 29-35 (1993)) con una densidad de 4 x 10^{4} fagos por placa. Se utilizó un clon de ADNc bovino, de alrededor de 900 bp de longitud y que contiene una porción del gen \alpha-1,3-GalT que corresponde a los exones 7-9, para probar un total de 5,6x10^{5} fagos recombinantes independientes. Cuatro clones que se superponen que contienen las secuencias del gen \alpha-1,3-GalT, fueron aislados y purificados. Los sitios de restricción Sal1 dentro de estos clones fueron mapeados (Figura 6), y los fragmentos Sal1 de 4,0 kb, 5,5 kb, 11 kb y 12 kb de dos d estos clones (\lambda3 y \lambda5) fueron subclonados dentro de pBlueScript KS+ (Stratagene) o pUBS (pUC19 que porta al polienlazador pBlueScript KS+) para facilitar un mapeo detallado o sitios de restricción.

Estos cuatro subclones (designados como p\alphaGT-S4.0, p\alphaGT-S5.5, p\alphaGT-S11 y p\alphaGT-S13) fueron mapeados para los sitios de restricción con enzimas de restricción BamHI, EcoRI, HindIII, Xbal, Xhol, Kpnl, Sacl, SacII, EcoRV, PstI, SmaI, NotI y BgIII. p\alphaGT-S4.0 y p\alphaGT-S5.5 también fueron revisados por los sitios de restricción PvuI, PvuII, Ndel y SphI. Los mapas detallados de restricción de los 4 subclones fueron sacados de estos datos (Figuras 7-12).

Sobre la base de estos mapas se concibió una estrategia de inactivación. Básicamente la estrategia es la de insertar un gen de resistencia (ya sea neo^{R} o hyg^{R}) dentro del sitio Sal1 que cae dentro del exón 9. La construcción de inactivación porta los fragmentos Sall de 4,0 y 5,5 kb de p\alphaGT-S4.0 y p\alphaGT-S5.5 que flanquean al sitio SalI del Exón 9 (Figura 13). El muestreo de los eventos de recombinación homóloga puede entonces llevarse a cabo usando un fragmento de ADN que representa a la región genómica pero que está colocado fuera del ADN incluido en la construcción de inactivación, esto es, fuera de los 9,5 kb cubiertos por p\alphaGT-S4.0 y p\alphaGT-S5.5. Se utiliza un fragmento de EcoR1/Xmnl de 0,7 kb de p\alphaGT-S11 para muestrear las manchas de Southern del ADN de la célula ES digerida con BgIII para eventos de recombinación homóloga. Una banda de 8,3 kb debería aparecer sobre estos Southern cuando el gen interrumpido \alpha-1,3-GalT es probado con este fragmento EcoR1/Xmnl (Figura 14). La inserción del gen neo^{R} después de un evento de recombinación homóloga, dará lugar a una banda de 6,4 kb, debido a la presencia de un sitio BgIII flanqueando justamente al sitio SalI del Exón 9 dentro de la construcción de inactivación. Así, la presencia de la banda de 6,4 kb es un diagnóstico para un evento de recombinación homóloga.

Para llevar a cabo esta estrategia, los presentes inventores prepararon una serie de construcciones de inactivación. La generación de una construcción tal se esboza en detalle en la Figura 15. El vector p\alphaGT-S5.5, que porta al fragmento de 5,5 kb inmediatamente 3' al sitio SalI del Exón 9, fue escogido como el vector de partida. p\alphaGT-S5.5 fue digerido con EcoRV y CLAI, generando un vector con un extremo romo y un extremo compatible con ClaI. Un fragmento de 1,3 kb que porta al gen neo^{R} que dirige al promotor PMCI flanqueado por los sitios FRT fue escindido del plásmido pNeo2FRT (previamente construido por los presentes inventores) por digestión con BamHI, rellenando el sitio de restricción y luego digiriendo con Clal para generar un fragmento con un extremo romo y un extremo compatible con Clal. La secuencia de nucleótidos de este fragmento de 1,3 kb es suministrada en la Figura 16 (SEQ ID NO. 13). Este fragmento fue ligado entonces dentro del p\alphaGT-S5.5 digerido con Clal/EcoRV, la mezcla ligada fue transformada y las colonias fueron muestreadas con recombinantes. Se recuperó una colonia que contenía al fragmento Neo^{R} insertado dentro de EcoRV/Clal de p\alphaGT-S5.5, con base en el patrón de restricción después de la digestión con las enzimas de diagnóstico de restricción Clal, EcoRV, Xbal y EcoR1. Esta construcción fue denominada PNeo\alphaGT6.8.

pNeo\alphaGT6.8 fue digerida con Smal, generando un vector con extremos romos. El fragmento Sal1 de 4,0 kb fue cortado de p\alphaGT-S4.0 y los extremos llenados. Este fragmento fue ligado entonces dentro de p\alphaGT-S5.5 digerido con Smal, la mezcla ligada fue transformada y las colonias fueron muestreadas por recombinantes. Se recuperaron cuatro colonias que contenían al fragmento SaII de 4,0 kb insertado en los sitios SmaI de pNeo\alphaGT6.8 con la porción 5' del Exón 9 yaciendo cerca de la porción 3' del exón en las cercanías del fragmento SaII de 5,5 kb. La identidad y orientación del inserto fue confirmada por medio del patrón de restricción después de la digestión con las enzimas de diagnóstico de restricción Xbal, EcoRI, HindIII, BamHI, EcoRV y otras. Esta construcción fue denominada pNeo\alphaGT10.8.

pNeo\alphaGT10.8 fue digerida con Clal, generando un vector con extremos compatibles con Clal. Dos oligómeros complementarios que fueron sintetizados, cuando fueron Templados, generaron un ligador que contenía codones de terminación de traducción en los tres marcos de lectura y en un sitio BgIII. El ligador fue ligado dentro del pNeo\alphaGT10.8 digerido con Clal, la mezcla ligada fue transformada y las colonias fueron muestreadas por recombinantes. Se recuperaron muchas colonias que contenían al ligador insertado en los sitios Clal dentro de pNeo\alphaGT10.8 con base en el patrón de restricción después de la digestión con las enzimas de diagnóstico de restricción BgIII, Cla y BgIII/NotI. Esta construcción ha sido secuenciada para confirmar la identidad, número de copia y orientación del inserto. Esta construcción es llamada pNeo\alphaGT10.8B (Figura 17).

Ejemplo 10 Células ES - Materiales Generales y Condiciones de Trabajo para los Métodos

Los procedimientos para el aislamiento y el cultivo de todas las líneas de células (líneas celulares troncal embriónica, germinal primordial y fibroblasto fetal) requieren condiciones asépticas para prevenir el crecimiento de organismos contaminantes:

1. Se limpian las superficies de todas las mesas de laboratorio y los equipos con etanol al 70% antes de ser usados.

2. Todos los instrumentos quirúrgicos se someten a autoclave antes de ser usados.

3. El agua para la preparación de los medios y para la limpieza de la cristalería es de alta calidad (esto es, agua Milli-Q, preparada pasándola a través de un sistema de agua ultrapura Milli-Q (Millipore).

4. La cristalería se esteriliza con calor seco o se somete a autoclave después de una limpieza rigurosa con agua Milli-Q después de usarla.

5. Todo el trabajo con cultivo de tejidos se realiza bajo condiciones de flujo laminar (Estación de trabajo de flujo laminar horizontal filtrado con Hepa).

6. Todos los medios se filtran hasta esterilidad (filtro desechable de 22 \mum) antes de usarlos.

Se utilizan antibióticos para minimizar el riesgo de contaminación bacterial (Penicilina, Estreptomicina y Gentamicina para bacterias; Nistatina para hongos).

Preparación de Medios/Soluciones

Medio modificado de águila de Dulbeccos (DMEM)
10,0 G	DMEM en polvo-Gibco
\hskip0.5cm (Puede usarse la formulación con baja glucosa o con alta glucosa,
\hskip0.5cm con o sin piruvato; se incluye L-glutamina)
1,0 litro	Agua Milli-Q
3,7 g	NaHCO_{3}
Agitar lentamente hasta disolución
Ajustar pH \sim 7,2
Filtrar en forma estéril (después de la filtración estéril llevar el pH a 7,4)
Conservar a 4ºC

Medio celular STO
83,0 ml	DMEM
15,0 ml	Suero fetal bovino al 15% (FBS); analizar el lote antes de usar
1,0 ml	Penicilina/Estreptomicina 1
1,0 ml	Glutamina 1:100 (si se necesita) (ver nota más abajo)

Medio celular STO

Filtrar en forma estéril y conservar a 4ºC

Nota: Llenar el medio completo (medio DMEM) (STO o ES) con glutamina.

* \begin{minipage}[t]{150mm} Esta etapa se requiere solamente si el medio tiene más de una semana - 10 días, ya que la glutamina se descompone después de este tiempo. \end{minipage}

Medio celular es con o sin LIF
hasta 100,0 ml	DMEM
15,0 ml	15% FBS (lote probado antes de usarlo; ver más abajo)
1,0 ml	(a partir de un patrón de 0,01 M) \beta-mercaptoetanol (concentración final 0,1 mM)
1,0 ml	Penicilina/Estreptomicina 1:100
0-1,0 ml	Glutamina 1:100 (si se necesita)
1,0 ml	Nistatina 1:100
0-2,5 ml	\begin{minipage}[t]{128mm} LIF recombinante de múrido (desde 4x10^{4} U/ml; patrón de 1000 U/ml); actividad probada utilizando Ensayo LIF (ver más abajo) \end{minipage}
0,4 ml	\hskip0.5cm Gentamicina
1,0 ml	\hskip0.5cm Nucleótidos
1,0 ml	\hskip0.5cm Aminoácidos no esenciales

Solución antibiótica penicilina/estreptomicina (1:100)

-: Commonwealth Serum Laboratories, Australia; Catálogo No. 05081901

Penicilina G - 5000 U/ml

Sulfato de Estreptomicina - 5000 \mug/ml.

Solución de mitomicina-C

2,0 mg de Mitomicina-C (Sigma Chemical Co. (Sigma''), Catálogo No. M0503)

200,0 ml de Medio Celular STO

Filtrar en forma estéril, dividir en 20x, alícuotas de 10 ml y almacenar a -20ºC.

Solución salina tamponada de fosfato (PBS)
Para 100 ml de Agua Milli-Q:
	(conteniendo Ca^{++} y Mg^{++})	(libre de Ca^{++} y Mg^{++})
NaCl	0,89	0,80
KCl	0,02	0,02
KH_{2}PO_{4}	0,02	0,02
Na_{2}HPO_{4}.12H_{2}O	0,289	1,115
CaCl_{2}.2H_{2}O	0,14	-
MgCl_{2}.6H_{2}O	0,01	-
Piruvato de Na	0,0036	-
D-glucosa	0,1 g	-

Ajustar a pH 7,4 y filtrar en forma estéril

(PBS libre de Ca^{++} y Mg^{++} se adquirió con ICN Cell Bilogy and Tissue Culture, Cat. No. 18-604-54).

Tripsina/verseno (TV) solución de trabajo (TV x 1)

: En PBS (libre de Ca^{++} y Mg^{++}):

0,25% (p/v) de tripsina (liofilizada)

0,04% (p/v) de EDTA o EGTA

A 1 litro de agua Milli-Q añadir lo siguiente:

Tripsina en polvo (Porcino, Difco)	2,5 g
EDTA o EGTA	0,4 g
NaCl	7,0 g
Na_{2}HPO_{4}.12H_{2}O	0,3 g
KH_{2}PO_{4}	0,24 g
KCl	0,37 g
D-glucosa	1,0 g
Tris	3,0 g
Rojo de Fenol	1,0 ml

Ajustar a pH 7,6, filtrar en forma estéril, alícuota y almacenar congelado.

EGTA: Ácido etilén-glicol-bis(\beta-amino-etil éter)N,N,N',N^{-}tetra-acético. Ácido[etilén-bis(oxietilén nitrilo)]tetra-acético.

EDTA: Ácido Etilendiaminotetracético.

Usar ya sea EDTA o EGTA. Se prefiere EGTA ya que es menos dañoso para las células ES/PGC.

Solución de trabajo de gelatina

: 0,1% de gelatina en Agua Milli-Q.

Disolver gelatina por calentamiento a 60ºC.

Filtrar en forma estéril cuando aún está caliente.

Para gelatinizar la placa de cultivo de tejido:

: 1. Cubrir las cajas con solución, dejar durante 30 minutos

: 2. Aspirar la gelatina y dejar que la caja se seque al aire.

\vskip1.000000\baselineskip

Solución patrón de nucleósido
Agua Milli-Q	100 ml
Adenosina (Sigma)	80 mg
Guanosina (Sigma)	85 mg
Citidina (Sigma)	73 mg
Uridina (Sigma)	73 mg
Timidina (Sigma)	24 mg

: 1. Disolver por calentamiento a 37ºC.

: 2. Filtrar en forma estéril y tomar alícuota mientras está caliente.

: 3. Almacenar a 4ºC o a -20ºC.

: 4. Descongelar los nucleótidos para usarlos en el medio de células ES los nucleótidos salen de la solución al descongelar, calentar a 37ºC para resolubilizar antes de usar.

Aminoácidos no esenciales (1:100)

-: Commonwealth Serum Laboratories, Australia; Catálogo No. 09751301.

Concentrar 100x para un medio esencial mínimo (Eagle): (Se añade 1,0 ml a 100 ml de Medio de Células ES).

\vskip1.000000\baselineskip

Mg/10 ml de H_{2}O milli-Q
Glicina	7,5
L-Alanina	8,9
L-Asparagina. H_{2}O	15,0
L-Ácido Aspártico	13,3
1-Ácido Glutámico	14,7
L-Prolina	11,5
L-Serina	10,5

Medio de cultivo de Whitten
KCl	0,0356
KH_{2}PO_{4}	0,0162
MgSO_{4}.7H_{2}O	0,0294
NaCl	0,4
NaHCO_{3}	0,2106
Glucosa	0,1
Piruvato de Na	0,0036
Lactato de Ca.5H_{2}O	0,0527
Lactato de Na	0,2416 ml
H_{2}O Milli-Q	100 ml

La solución se ajusta a una miliosmolaridad final de 250-280 por medio de la adición de H_{2}O o NaCl. Filtrar en forma estéril y almacenar a 4ºC por dos semanas.

Solución de trabajo:
10 ml	Medio de Whitten
1,5 g	Fracción V de BSA (Miles Pentex, Diagnostic división, Kankakee, II., EE.UU;
	Código No. 81-001-4)

Filtrar en forma estéril y equilibrar en 5% de O_{2}:5% de CO_{2}:90% de N_{2} a 39,5ºC, humedad del 95%.

Ensayos con lotes de FBS

Los lotes de FBS varían en su habilidad para soportar el crecimiento de las células ES, y en la habilidad para mantener el estado no diferenciado de tales células. El siguiente procedimiento se usa para identificar los lotes adecuados de FBS. Usar células ES de entre 2 & 20 pasadas:

Día 1	Empalmar las colonias ES y colocarlas en cajas sin células alimentadoras pero con LIF.
	Incubar durante 3 días.
Día 4	Tripsinizar para separar colonias y células. Contar las células y dispensarlas en cajas
	gelatinizadas de 6 cm que contienen Medio Celular ES y LIF (no se añade suero) como
	sigue:

Número de Caja	No. de Células	Lote de Suero de Control FBS
		(Lote Probado)
Suero no Inactivado		A	B
1	2	250	5 ml	-	-
3	4	250	-	5 ml	-
5	6	250	-	-	5 ml
7	8	2000	5 ml	-	-
9	10	2000	-	5 ml	-
11	12	2000	-	-	5 ml
Suero Inactivado, como control (56ºC durante 15 min)
13	14	250	5 ml	-	-
15	16	250	-	5 ml	-
17	18	250	-	-	5 ml
19	20	2000	5 ml	-	-
21	22	2000	-	5 m	-
23	24	2000	-	-	5 ml

Hay placas de duplicado para cada tratamiento.

: Incubar cajas de baja densidad durante 5 días.

: Incubar cajas de alta densidad durante 3 días.

Día 7 Fijar las células de alta densidad y colorear con hematoxilina.

Día 9 Fijar las células de baja densidad y colorear por fosfatasa alcalina.

Ensayo LIF

Se usa este procedimiento para evaluar la potencia del Factor Inhibidor de Leucemia (LIF).

Día 1	Empalmar una caja de confluente de células STO de 10 cm en cinco cajas. Incubar
	durante 2-3 días en medio STO.
Día 3/4	Cuando las células sean confluentes, reemplazar el medio con DMEM + 10% FBS.
	Incubar por 3 días.
Día 6/7	Recolectar el medio acondicionado (CM) y almacenar a 4ºC.
*Preparar cultivos de células ES de baja densidad como se describió antes.

Caja	No. Células	C.M.	Medio	1000 U/ml LIF	Medio w/o LIF	Contenido que se
						Presume de LIF
1,2,3	250	0,1 ml	4,9 ml	-	-	200 U/ml
4,5,6	250	0,25 ml	4,75 ml	-	-	500 U/ml
7,8,9	250	0,5 ml	4,5 ml	-	-	1000 U/ml
10,11,12	250	1,0 ml	4,0 ml	-	-	2000 U/ml
13,14,15	250	-	-	5 ml	-
16,17,18	250	-	-	-	5 ml

Hay placas por triplicado para cada tratamiento.

Fijar y colorear por fosfatasa alcalina.

Preparación de Capas de Células Alimentadoras de Fibroblastos

Las células embrionarias pluripotentes se cultivan in vitro sobre una capa de células de fibroblasto fetal. Las células de fibroblasto permiten un amplio rango de factores necesarios para el crecimiento de células embrionarias pluripotentes (por ejemplo, factores de crecimiento, citoquinas, factores que son esenciales para mantener la pluripotencia de las células ES).

Aislamiento de fibroblastos fetales de porcino

1. Remover los fetos de porcino en desarrollo (preferiblemente entre 16-30 días de desarrollo) de los úteros por disección aséptica.

2. Remover la capa de piel de los fetos.

3. Hacer disección de los tejidos blandos evitando las vísceras en desarrollo. El tejido blanco (que contiene fibroblasto) se encuentra justo bajo la capa de piel.

4. Lavar el tejido diseccionado en PBS (libre de Ca^{++} y Mg^{++}). Centrifugar a 1000 rpm por 5 min.

5. Remover el sobrenadante.

6. Incubar el tejido en Solución de Trabajo de Tripsina/Verseno por 20 min.

7. Disociar las células por medio de pipeteo vigoroso. Centrifugar a 1000 rpm por 5 min.

8. Remover el sobrenadante.

Resuspender las células en Medio Celular STO. Permitir que los grupos de grandes células se asienten.

Depositar las células de las placas dentro del sobrenadante (esto es, los grupos de grandes células no están incluidos) sobre las placas gelatinizadas de cultivo d tejido. Incubar las células en una atmósfera de 5% de CO_{2}, 95% de aire (37,5ºC, humedad del 95%) hasta que aparezca una capa confluente de células de fibroblasto (\sim 4-5 días).

Puede continuarse con el paso de células para incrementar el número de células, o pueden congelarse las células o inactivarse para uso adicional.

Cultivo de capas alimentadoras de fibroblasto fetal de patrones congelados

Diferentes tipos diferentes de alimentadores de ratón (células STO) y fibroblastos fetales de bovino y de porcino pueden usarse para formar capas alimentadoras. Estas incluyen:

(1) Células alimentadoras STO de ratón Bradley/Baylor que han sido modificadas para expresar LIF humano (obsequio de Allan Bradley, Institute for Molecular Genetics, Baylor College of Medicine, Texas Medical Center, Houston, Texas, EE.UU).

(2) Células alimentadoras STO de ratón Robertson/Columbia que han sido modificadas para expresar LIF de múrido (obsequio de Elizabeth Robertson, Columbia University, New York, EE.UU).

(3) Diferentes líneas de fibroblasto fetal de porcino.

(4) Diferentes líneas de fibroblasto fetal de bovino.

(las líneas de fibroblasto de (3) y (4) fueron derivadas por los presentes inventores usando los procedimientos descritos arriba).

El procedimiento para producir capas alimentadoras es como sigue:

1. Lavar una caja de cultivo de tejido (curado de tejido) de 10 cm con solución de gelatina/agua Milli-Q durante 30 min.

2. Aspirar la solución de gelatina y permitir a la caja secarse al aire.

3. Añadir 10 ml de medio celular STO a un tubo de centrífuga 15 ml.

4. Remover las células de la capa alimentadora congeladas en un medio de congelación de un contenedor con N_{2} líquido.

5. Descongelar la células calentando el vial en las manos o en un baño de agua a 37ºC.

6. Transferir las células STO a un medio en un tubo de centrífuga.

7. Centrifugar a 1000 rpm por 5 min.

8. Resuspender las células en 10 ml de medio y transferir a una caja de cultivo de tejidos tratada con gelatina.

9. Incubar a 37ºC por 3 días.

Desdoblamiento de fibroblastos fetales/de las células STO de la capa alimentadora

Este procedimiento es utilizado par expandir el número de células de un único plato/placa confluente; las células se separan de la placa confluente y se transfieren a placas frescas con densidades subconfluentes.

1. Gelatinizar cinco cajas de cultivo de tejido de 10 cm.

2. Examinar las células incubadas STO bajo el microcopio y revisar la confluencia.

3. Si la monocapa alimentadora de STO es confluente (células que cubren el fondo de la caja, o cerca de él), lavar suavemente con PBS (libre de Ca^{++} y Mg^{++}) durante 1 min.

4. Aspirar el PBS y añadir 1 ml de Solución de Trabajo de Tripsina/Verseno durante 1 min 8º hasta que las células comiencen a separarse). Revisar bajo el microscopio.

5. Separar la células por medio de pipeteo vigoroso, añadir 1,0 ml de medio Celular STO (esto es, una relación de 1:1 de medio de Células STO:Solución de Trabajo de Tripsina/Versano) para neutralizar la tripsina, y transferir a un tubo de centrífuga que contiene 10-15 ml de medio de Células STO. Lavar las células restantes sobre una caja con algo de medio celular STO del tubo. Centrifugar a 1000 rpm durante 5 min, aspirar el sobrenadante, resuspender el precipitado en 1 ml de medio Celular STO. Resuspender las células para hacer una suspensión sencilla. Completar hasta 50 ml con medio celular STO.

6. Dispensar 10 ml en cada una de las cinco cajas de cultivo de tejido e incubar hasta confluencia (\sim 3 días).

Inactivación de las capas alimentadoras

Los presentes inventores usan dos métodos alternativos para inactivar las capas alimentadoras, que detienen las células de la división:

(1) Tratamiento con Mitomicina

1.: Revisar en las cajas la confluencia de los fibroblastos fetales/células STO.

2.: Descongelar la solución de mitomicina-C y usarla no diluida.

3.: Aspirar el medio celular STO de la placa alimentadora de células.

4.: Añadir una alícuota de 10 ml de mitomicina-C a la placa e incubar a 37ºC durante1-3 horas.

5.: Aspirar la mitomicina-C, lavar las células en 1x PBS (sin Ca^{++} o Mg^{++}) durante 1 min.

6.: Aspirar el PBS y añadir 1 ml de solución de tripsina durante 1 min.

7.: Separar las células por medio de un pipeteo vigoroso y transferir a un medio celular STO en un tubo de centrífuga.

8.: Centrifugar a 1000 rpm durante 5 min.

9.: Resuspender el precipitado de células en 1 ml de Medio Celular ES.

10.: Depositar en cajas en preparación por adición de células ES.

(2) Irradiación Gama

1.: Revisar la confluencia en las cajas del fibroblasto fetal/células STO.

2.: Células de tripsina dentro de una sola suspensión celular.

3.: Irradiar células (300 rads) en medio celular STO.

4.: Centrifugar a 1000 rpm durante 5 min.

5.: Resuspender el precipitado en 1 ml de Medio Celular ES.

6.: Transferir las células a las cajas gelatinizadas de cultivo de tejido con Medio Celular ES y colocarlas en incubadora a 37ºC hasta que las células se adhieran a la caja. NOTA: si las células no son confluentes, hacer un conteo usando un hemocitómetro y sembrar 5x10^{4} células en 1 ml de medio por pozo de una placa Nunc de 4 pozos. Una caja de 10 cm de células inactivadas puede dividirse en:

Diez placas de 4 pozos (placas de cultivo de tejido Nunc), u Ocho cajas de cultivo de tejido de 3,5 cm, o

: Tres cajas de cultivo de 6 cm, o

: Dos cajas de cultivo de 20 cm.

Demostración de Totipotencia A. Inyección de Blastocisto

La capacidad de las líneas de células embrionarias para formar animales quiméricos por línea germinal es una prueba concluyente de su totipotencia. Esto puede lograrse por medio de experimentos de inyección de blastocisto, usando técnicas para diferentes especies de mamíferos, sustancialmente las mismas que aquellas establecidas para el ratón. Ver Ejemplo 14 más abajo. Ver también, por ejemplo, Bradley, Production and Analysis of Chimeric Mice, en: Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach (E. J. Robertson, ed.), IRL Press, Oxford, pgs. 113-52 (1987). Sin embargo, para las manipulaciones de porcino, el pipeteador debe ser algo más largo así como los embriones de porcino son más grandes que los embriones de ratón.

B. Cocultivo de Células ES/PGC y Embriones en Mórula

Los embriones en la etapa de mórula de desarrollo se recolectan quirúrgicamente a partir de animales superovulados. Para los embriones de porcino, por ejemplo, se rompe la zona pelúcida usando una solución de Ácido Tirodes y las células ES/PGC se cultivan en presencia de la mórula que ha sido rota en la zona pelúcida. Las células ES/PGC se adhieren a las células expuestas de la mórula y, después del cultivo durante la noche en medio de Whitten, los embriones se transfieren a recipientes sincronizados. Preferiblemente, la mórula rota en la zona pelúcida esta completamente libre de la zona pelúcida. Sin embargo, este no necesita ser el caso mientras que las células ES/PGC puedan ganar acceso directo a al menos algunas de las células de la mórula.

C. Inyección de Mórula

Las células ES y las PGC pueden ser inyectadas dentro de un embrión en mórula antes de la formación de la cavidad blastocística. La técnica es similar a la de inyección de blastocito. Las células ES o las PGC se sacan en una pipeta de inyección, que es insertada en lo profundo de la zona pelúcida. Entonces, se expelen las células de tal manera que ellas entren en contacto con las células del embrión en mórula. La mórula inyectada se cultiva luego durante la noche en medio de Whitten (porcino) o de otro medio apropiado para permitir la formación del blastocisto.

D. Transferencia Nuclear y Clonación de Embriones

Las células ES y las PGC pueden fusionarse a cigotos enucleados que se han derivado por maduración in vitro, cultivo in vitro, fertilización in vitro o recolección quirúrgica. Después de la fusión exitosa, los embriones pueden transferirse a recipientes sincronizados. Los oocitos de porcino recolectados in vivo o in vitro, por ejemplo, se manipulan en medio de Whitten suplementado con 1,5% de BSA Fracción V y 7 \mug/ml de citocalasina B (Sigma). Se utiliza una micropipeta sesgada para remover la placa de metafase del oocito. Se inserta una única célula ES o PGC (después de tratamiento con tripsina para formar una suspensión de una única célula) a través de la zona usando una micropipeta sesgada, de tal manea que la célula entre en contacto con la membrana plasmática del oocito. La fusión se logra en un campo de corriente alterna de 28 V/cm, seguido por un pulso de corriente continua de 80 V/cm de 100 microsegundos de duración. Después de la fusión observada, los embriones se incuban a 39ºC en 5% de CO_{2}, 5% de O_{2}, 90% de N_{2} en microgotas de medio de Whitten suplementado con 1,5% de BSA, hasta la transferencia a un recipiente sincronizado.

Ejemplo 11 Cultivo de Célula ES de Múrido

Las células ES son capaces de diferenciarse espontáneamente en muchos tipos diferentes de células, y las condiciones de cultivo que previenen esta diferenciación son críticas para el paso continuo de estas células en forma no diferenciada, capaz de contribuir a ratones quiméricos.

I. Condiciones de cultivo

Las células ES crecen en cajas de cultivo de células de polietileno tratadas con gelatina al 0,1% (elaborada en PBS o en agua Milli-Q) durante 10 minutos. Una capa alimentadora de fibroblastos inactivados mitóticamente proporciona una fuente de citoquinas. Los hidroblastos son o fibroblastos primario de embrión de ratón (PMEF), o fibroblastos STO, una línea inmortal. El medio utilizado es DMEM suplementado con glucosa, aminoácidos y nucleósidos. Robertson, Embryo-Derived Stem Cell Lines. En: Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach (E. J. Robertson, ed.), IRL Press, Oxford (1987). A este medio se le añade LIF (concentración final de 10^{3} U/ml Esgro, AMRAD). Se añade 15% de FBS. El lote de FBS se escoge con base en su capacidad para soportar en crecimiento de células ES con bajos niveles de diferenciación (esto es, solamente células individuales raras sufren diferenciación). Las células ES crecen en una atmósfera de 5-10% de CO_{2} a 37ºC.

II. Paso de rutina

Las células ES deben ser pasadas frecuentemente para prevenir que las colonias crezcan mucho y se diferencien. Esto se logra dividendo las células en una proporción de 1:10 a 1:40, cada dos a cuatro días.

Ejemplo 12 Manipulación Genética de Células

Los procedimientos generales expuestos en este Ejemplo proporcionan lineamientos que son fácilmente adaptables a situaciones experimentales individuales que pueden emplear, por ejemplo, diferentes líneas de células o equipo suministrado por diferentes fabricantes. Este Ejemplo también suministra procedimientos específicos utilizados y los resultados obtenidos en la generación de un grupo de líneas celulares ES de ratón en la cuales el gen \alpha 1-3 galactosiltransferasa fue alterado por recombinación homologa. Los procedimientos generales proporcionados en este Ejemplo se adaptan a células ES de ratón. Sin embrago, los procedimientos son sustancialmente similares para las células ES de porcino.

I. Introducción de ADN en células es por medio de electroporación

A. Recubrir el número requerido de placas con gelatina al 0,1% (en PBS o en agua Milli-Q). (Usualmente placas de 2 x 6 pozos y una placa de 8 pozos)

B. Descongelar 10^{7} fibroblastos embriónicos en DMEES (equivalente a Medio Celular ES); inactivado por irradiación a 3000 Rad.

C. Recuento de células irradiadas, centrifugar y resuspender en DMEES a 10^{6} células/ml.

D. Aspirar la gelatina de las placas y sembrar las células: 7 x 10^{5} células/pozo (placa de 6 pozos) en 2,5 ml de medio; 7 x 10^{4} células/pozo (placa de 24 pozos) en 1 ml de medio. Incubar a 37ºC, 5-10% de CO_{2} durante 3-4 horas.

E. Lavar las células ES en 5 ml (frasco de 250 ml) de PBS-EGTA y permitir que permanezcan a temperatura ambiente durante 4 minutos.

F. Remover el PBS, añadir 5 ml de tripsina (CSL) y dejar a temperatura ambiente durante 2-4 minutos. Lavar las células, añadir 10 ml de DMEES y contar. Se necesitan aproximadamente entra 5 x 10^{6} y 2 x 10^{7} células ES para los experimentos.

G. Centrifugar las células y resuspender en 10 ml de PBS. Centrifugar nuevamente y resuspender en 540 \mul de PBS. Diluir 50 \mul en 10 ml de DMEES y cultivar para determinar la eficiencia de la siembra.

H. Añadir 5-10 \mug de ADN a las células en 10 \mul de PBS (volumen total 500 \mul) y transferir a una cubeta estéril de electroporación (por ejemplo, BioRad).

I. Electroporar a 0,22 kV, 500 \muFD (el tiempo constante debe ser -8,4). Esto se logra usando una unidad BioRad Gene Pulser (Catálogo BioRad No. 1652078) con extensor de capacitancia (Catálogo BioRad No. 1652087), o dispositivo similar.

J. Resuspender en 10 ml de DMEES con pipeteo constante para romper los agregados de ADN de las células lisadas.

K. Centrifugar las células y resuspenderlas en 5 ml de DMEES.

L. Tomar 50 \mul, añadir 50 \mul de solución de azul de tripano y hacer recuento para la viabilidad.

M. Cultivar por medio de siembra en placa por dilución para determinar la eficiencia de la siembra.

II. Selección de condiciones

Las células ES que no expresan un gen de resistencia a la neomicina se las mata selectivamente por medio de tratamiento con G418 a 200-500 \mug/ml de medio. El medio que contiene antibiótico se cambia diariamente. También se trata a una población de células que no ha sido electroporada con miras a ver como responden las células genuinamente sensibles al tratamiento con G418. Después de 6 a 10 días, las células resistentes al antibiótico se harán evidentes como colonias sanas. Esas células tendrán que ser transformadas por la construcción objetivo y pueden ser muestreadas por recombinación homologa (esto es muestreadas por el gen objetivo versus la integración aleatoria).

Las colonias resistentes son tomadas de la caja de selección con una pipeta de boca y dispersadas en una suspensión celular única. La mitad de estas células se congelan aparte mientras que la otra mitad se expande y se utiliza para determinar si ha ocurrido o no recombinación homóloga. Si las colonias son pequeñas, es preferible a veces expandir la colonia completa en una placa de 24 pozos, y luego congelar la mitad mientras se expande más la otra mitad para análisis genético.

III. Escoger las colonias de células es para análisis genético después de la selección

A. Método 1

Congelamiento da la mitad de las colonias

1. El día antes de la escogencia de la colonia:

Recubrir el número requerido de placas con gelatina al 0,1% (en PBS). Se escogen dos placas por 24 colonias: una placa es para congelamiento y la otra es para expansión clónica. Iniciar con placas de 20 x 24 pozos.

Recuento de los fibroblastos irradiados, centrifugar y resuspender en DMEES.

Aspirar la gelatina de 10 placas y sembrar \sim 10^{5} (pueden usarse tan pocas como 5 x 10^{4}) células/pozo en 1 ml de DMEES. Incubar a 37ºC, 10% de CO_{2} durante la noche (o un mínimo de 1 hora).

Aspirar la gelatina de las otras 10 placas.

2. El día de la escogencia de la colonia:

Cambiar el medio de las células ES antes y en forma regular durante la escogencia (para remover las células flotantes).

Halar las pipetas pasteur introducidas. Utilizar una pipeta fresca después de cada 24 colonias. La punta deseada es de alrededor de la mitad del diámetro de una colonia, con el estrangulamiento por encima de 1-2 cm. La punta debe ser perpendicular y delgada. (Nota: después de retirar la pipeta, frote el vidrio en el punto deseado de rompimiento con vidrio recientemente empatado, luego dóblela).

Marque los recipientes de multipuntas para:

: 1 PBS-EGTA

: 2 Tripsina-Verseno

: 3 DMEES

: 4 2 x Mezcla de congelación (DMSO al 20% en FCS).

Usando una pipeta multicanal, dispensar 50 \mul de PBS-EGTA en 24 pozos de una placa de 96 pozos.

Al microscopio: conectar la pipeta pasteur finamente empatada a la boca del tubo de la pipeta. Saque la colonia de la placa y transferirla (en un volumen mínimo) a un pozo de la placa de 96 pozos. Expeler el contenido de la pipeta; las burbujas sirven como guía de ubicación. Escoja 24 colonias o tantas como sea posible en <10-15 min (preferiblemente un múltiplo de 6).

De vuelta en la cámara: Añada 100 \mul de tripsina a cada pozo usando una pipeta multicanal) y deje a temperatura ambiente durante 2 min.

Pipetear y descargar 10-15X para dispersar las células, luego añada 100 \mul de DMEES. (Esto debe hacerse dentro de 4-6 min después de la adición de tripsina).

Dividir la suspensión de células entre placas para congelación y para expansión usando una pipeta de 12 canales con cada segunda punta empotrada. Transferir 125 \mul a una placa gelatinizada de 24 pozos (para congelación); los restantes \sim125 \mul se transfieren a una placa de 24 pozos con capa alimentadora (para ADN). Las placas se marcan y se alinean cuidadosamente para asegurarse de que un clon vaya al mismo pozo de cada bandeja.

Añadir 125 \mul 2X de mezcla congelada a cada pozo sobre la placa de congelación, mezclar bien por medio de movimiento en remolino.

Sellar en bolsa de cierre hermético o bolsa plástica y colocar en congelador a -70ºC en una cubeta plástica equilibrada. Intercalar las placas con láminas plásticas.

Incubar las placas de expansión hasta que haya suficientes células para análisis genotípico.

A. Método 2

Congelación después de expansión de 24 pozos

1. El día antes de escoger la colonia:

Recubrir el número requerido de placas con gelatina al 0,1% (en PBS). Iniciar con placas de 10 x 24 pozos.

Recuento de los fibroblastos irradiados, centrifugar y resuspender en DMEES.

Aspirar la gelatina de las placas y sembrar \sim 10^{5} células/pozo en 1 ml de DMEES. Incubar a 37ºC, 10% de CO_{2} durante la noche (o un mínimo de 1 hora).

\newpage

2. En el día de la escogencia de la colonia:

Escoger las colonias como se describió para la mitad de ellas (método 1, más arriba) pero en vez de dividir la suspensión de células entre las placas de congelación y de expansión, la suspensión completa de células va a la placa de expansión.

Después de 3-4 días (con cambios diarios del medio) las células habrán crecido suficientemente para ser congeladas. Trabajando en una placa a la vez (con práctica pueden manejarse de a dos), aspirar el medio de cada pozo. Saturar con PBS/EGTA durante 4 minutos. Mientras tanto, colocar las puntas a las pipetas para encajar los canales alternos de una pipeta multicanal de doce puestos. Aspirar el PBS.

Añadir 100 \mul de tripsina (usando una pipeta multicanal y alternando los canales) y dejar a temperatura ambiente durante 2 minutos.

Pipetear y descargar 10-15X para dispersar las células, de la primera fila, cambiar las puntas, luego añadir 100 \mul de DMEES. Repetir para cada fila (esto debe hacerse dentro de los 6 minutos después de la adición de tripsina).

Usando una pipeta de 12 canales con cada segunda punta empotrada, transferir 125 \mul a una placa gelatinizada de 24 pozos (para congelar). Las células restantes serán expandidas para ADN. Es crucial q las placas sean marcadas y alineadas cuidadosamente para asegurar que las bandejas en congelación correspondan con las bandejas en expansión.

Añadir 1 ml de DMEES a la bandeja de expansión (habrán suficientes células alimentadoras para dar buena eficiencia de sembrado). Incubar durante 3-4 días hasta que haya suficientes células para análisis genotípico.

IV. Descongelación de los clones de células es congeladas en placas de 24 pozos

Las células que han sido identificadas por tener la alteración genética deseada se recuperan de un duplicado de placa congelada a -70ºC. La placa es tomada de la cabina de flujo laminar y removida de la bolsa plástica. Cada pozo es llenado con medio caliente, y se añaden las células alimentadoras al(los) pozo(s) de interés. La placa se coloca en una incubadora a 37ºC durante 60 minutos, luego se reemplaza el medio. Las colonias aparecerán después de dos o tres días. Esas colonias se expanden para el establecimiento de nuevos patrones de congelación, y se analizan para 1) análisis de cariotipo; 2) confirmación de la alteración genética deseada; 3) infección por micoplasma; y 4) capacidad para formar quimeras.

Ejemplo 13 Producción de Células ES de Ratón para Inactivación Usando la Construcción pNEO\alphaGT10.8B I. Transformación

Un total de 1 x 10^{7} células ES E14 fueron electroporadas con 5 \mul de ADN de pNEO\alphaGT10.8B 1 \mug/\mul (linealizado por digestión con Xhol) (ver Ejemplo 9 y Figura 17). La electroporación se llevo a cabo en 600 \mul en una cubeta ancha a 25 \muF, 350 V durante 0,5 milisegundos. Se recuperaron las células en 6 ml de medio completo ES y se sembraron en cajas petri de 6 x 100 mm, cada una conteniendo una capa alimentadora de células Neo^{R} STO.

Las células fueron cultivadas en medio completo ES durante 3 días y luego se sustituyó el medio que contenía 200-350 \mug/ml de G418. Este medio se cambió cada segundo día. Después de 9 días las colonias Neo^{R} fueron suficientemente grandes para ser identificadas y recuperadas. Se añadieron las colonias que fueron escogidas en 20 \mul de PBS y en 20 \mul de solución de tripsina. Se añadieron cuarenta \mul del medio acondicionado con BRL al 60% en el medio completo ES. Se transfirieron alícuotas de 40 \mul a pozos sencillos de cada una de las dos placas de 24 pozos. Una placa contenía una capa alimentadora de células STO en 100 \mul de medio completo ES. Se añadieron 140 \mul de mezcla de congelación 2x de DMSO a esta placa, que fue almacenada a -80ºC cada uno de los pozos de la segunda placa de 24 pozos contenía 1 ml del medio acondicionado con BRL al 60% en medio completo ES. Esta placa se incubó a 37ºC hasta que las colonias fueron confluentes.

II. Confirmación de la recombinación homóloga

Se aspiró el medio de las colonias confluentes y se añadieron 400 \mul de tampón de lisis (Tris 10 mM pH 7,8, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, SDS al 1%, y 500 \mug/ml de Proteinasa K). Las células fueron lisadas a 37ºC durante la noche, extraídas con 400 \mul 1:1 fenol/cloroformo y transferidas a tubos Eppendorf que contenían 1 ml de etanol al 95% y NaAc 0,2 M. Se precipitó el ADN por centrifugación a 13000 RPM en una centrífuga Eppendorf, se lavó el precipitado dos veces con etanol al 80% y se redisolvió en 30 \mul de agua.

Se utilizó el análisis de Southern (ver, por ejemplo, Sambrook y colaboradores, supra) para identificar los clones de células ES donde había ocurrido recombinación homóloga en el extremo 3' de la construcción. Se digirieron alícuotas de 15 \mul de ADN con 20 unidades de la enzima de restricción BgIII de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Después de la incubación a 37ºC durante la noche, se realizó electroforesis al ADN a través de un gel de agarosa al 0,8% (en un tampón de Tris de acetato, EDTA) a 1-2 V/cm durante la noche, usando 750 ng de ADN lambda digerido con HindIII como marcadores. El ADN fue transferido a una membrana de nylon Zetaprobe utilizando un secador al vacío Hybaid con un vacío de 80 cm de HG durante 1 hora.

La membrana se prehibridizó en una botella de hibridación Hybaid en 10 ml de la siguiente mezcla de hibridación durante 3 horas a 65ºC:

: Na_{2}HPO_{4} 0,25 M pH 7,2

: SDS al 7%

: EDTA 1 mM

: 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón

: PEG al 10%

Se preparó una sonda de ADN marcada en forma radioactiva utilizando un juego de oligo marcación gigaprime BRESATEC (Catálogo No. GPK-1) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Se marcaron aproximadamente 50 ng de un fragmento de ADN EcoRI/Xmnl de 0,7 kb desde más allá del la terminal 3' de la construcción pNeo\alphaGT10.8B (ver el Ejemplo 9 y la Figura 17) con ^{32}P-dATP con una actividad específica de 5 x 10^{8} cpm/ \mug. Se añadió la sonda desnaturalizada a la membrana de prehibridación en la botella de Hybaid y se incubó durante la noche a 65ºC.

La membrana fue removida de la botella de Hybaid, lavada con 0,5xSSC, SDS al 0,1% precalentado a 65ºC, y luego lavada 2-3 veces con 0,1xSSC, SDS al 0,1% a 65ºC durante 30 minutos para cada lavada. El exceso de humedad fue secado entonces de la membrana, la membrana fue envuelta en un envoltorio plástico y expuesta a una pantalla generadora de fósforo durante 16 horas hasta 3 días. La imagen fue observada sobre un generador de fósforo Imagequant.

Los resultados se muestran en la Figura 18, que es un borrón de Southern de ADN de las líneas celulares ES 15 probadas con el fragmento de diagnóstico de ADN de EcoRI/Xmnl descrito antes y en el Ejemplo 9. Se observa la banda de 6,4 kb, diagnóstica para un evento de recombinación homóloga en el gen \alpha 1-3 galactosiltransferasa (\alpha 1-3 Gal T) (ver Ejemplo 9), en 6 de las 15 líneas de células ES 15 examinadas. Todas las 6 líneas celulares inactivadas parecen ser heterocigotas para el alelo inactivado ya que la banda de 8,3 kb, diagnóstico para el gen \alpha-1,3-Gal T ininterrumpido (ver Ejemplo 9), también estaba presente en todos los 6 carriles.

Dos líneas celulares, designadas de aquí en adelante como "8D1" y "7C2", fueron escogidas para análisis adicionales. Se identificó por medio del análisis de Southern que las líneas celulares 8D1 y 7C2 contenían un alelo \alpha-1,3-Gal T, donde la recombinación homóloga había ocurrido en el límite 3' de la construcción.

Se utilizó entonces PCR de cadena larga para determinar si había ocurrido o no recombinación homóloga en el 5' de la construcción dentro de estas líneas celulares. Se utilizaron dos juegos de iniciadores en experimentos separados de PCR:

1) Iniciadores de Tipo Silvestre

MGT-Koex8F y MGT-KOR1 abarcan al intrón entre los exones 8 & 9, y amplifican un fragmento de 5,5 kb del gen \alpha-1,3-GalT de tipo silvestre (Figura 19)

: Secuencias:

: MGT-KOex8F

: 5'-CTGGAAAAGTACTACGCCACACAGAAACTCA-3'

: (SEQ ID NO: 14)

: (Nucleótidos 1014-1046 en la Figura 4)

: MGT-KOR1

: 5'-AGCCAGAGTAATAGTGTCAAGTTTCCATCACAA-3'

: (SEQ ID NO: 15)

: (Nucleótidos 1779-1811 en la Figura 4)

2) Iniciadores de inactivación

MGT-Koex8F y MGT-KONeoR abarcan del axón 8 al casete del gen Neo^{R} en el alelo de "inactivación" y amplifican un fragmento de 5,5 kb del alelo de inactivación (Figura 19)

: Secuencia:

: MGT-KONeoR

: 5'-GCCACACGCGTCACCTTAATATGCCAAGTGGAC-3'

: (SEQ ID NO: 16)

: (Nucleótidos 323-355; Figura 16).

Cada reacción contenía \sim 100 ng de ADN genómico como una plantilla en un volumen de reacción de 50 \mul y contenía Tris HCl 25 mM (pH 9,1), (NH_{4})_{2}SO_{4} 16 mM, dNTPs 250 \muM, MgCl_{2} 3,5 mM, 100 ng de cada uno de los iniciadores, 2 unidades de Taq polimerasa y 0,25 unidades de Pfu polimerasa. Las reacciones fueron calentadas a 94ºC durante 1 min, luego 45 ciclos de 94ºC durante 15 segundos, 68ºC por 6 min, seguido por una etapa sencilla de 72ºC durante 10 min. Los ADN genómicos de las líneas celulares ES putativas de "inactivación" de ratones CBA/C (homocigotas para el alelo \alpha-1,3-Gal T tipo silvestre) fueron amplificados en reacciones separadas usando cada juego de iniciadores. Se analizó una alícuota de 10 \mul de cada PCR por medio borrones de Southern (Sambrook y colaboradores, 1989).

Los resultados se ilustran en la Figura 20:

Iniciadores de inactivación:

Un fragmento de 5,5 kb que híbrida al casete del gen Neo^{R} de 1,3 kb (Figura 16) se generó a partir del ADN 7C2 (Figura 20, senda 4) y el ADN 8D1 (no mostrado). Esta banda no fue generada a partir de CBA/ADNc (Figura 20; senda 3).

Iniciadores de tipo silvestre:

Un fragmento de 5,5 kb que hidrida a la sonda del gen \alpha-1,3-Gal T (aislado por digestión con Sal I de p\alphaGT-S4.0) se generó a partir de 7C2 y de los CBA/ADNc (Figura 20; sendas 1 y 2 respectivamente) y ADN 8D1 (no mostrado). Este producto no híbrido a la sonda del gen Neo^{R}. Estos resultados demuestran que la recombinación homóloga había ocurrido en el límite 5' de la construcción en las líneas celulares 8D1 & 7C2.

Ejemplo 14 Generación de Animales que Portan un Genoma Celular ES

Los procedimientos suministrados en este Ejemplo se adaptan para células ES de ratón. Sin embargo, la estrategia general es sustancialmente la misma para células ES de porcino y las PGC.

I. Preparación de células es por inyección

Las células ES se dividen entre los pozos de una placa de 24 pozos con densidades celulares de 1:2, 1:4, 1:8 y 1:16, con relación a la densidad inicial, dos y tres días antes de la inyección. Los cultivos más vigorosos y menos diferenciados se escogen con base en la morfología.

II. Inyección de embriones y producción de ratones quiméricos

Los embriones de ratón se recolectan ya sea de ratones hembra superovulados o naturalmente apareados, aproximadamente 3,5 días después del apareamiento. Después del cultivo durante la noche en medio M16 (Bradley, Production and Analysis of Chimaeras. En: Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells. A Practical Approach (E. J. Robertson, ed.) IRL Press, Oxford, pgs. 113-52 (1987)), aquellos que habían cavitado para formar blastocistos se microinyectaron con alrededor de 12 a 20 células ES. Este procedimiento de microcirugía se realiza con instrumentos empatados a capilares de vidrio, y la inyección se controla con una jeringa micrométrica con base en dispositivos hidráulicos. Se usa un microscopio invertido equipado con contraste de interferencia diferencial para ver el procedimiento.

Después de la inyección, los blastocistos se transfieren a los úteros de ratones hembra seudopreñados. Los ratones quiméricos se identifican por medio de la contribución del recubrimiento de color de las células ES. Los ratones quiméricos muestran el color de recubrimiento del agutí derivado de los blastocistos huésped, y de la contribución de la chinchilla por las células ES. Los ratones quiméricos se generaron de la células ES que portan al alelo interrumpido \alpha-1,3-Gal T (incluidas las células 8D1, 7C2) por inyección en los blastocistos C57B1/6J x CBA F2. La habilidad de los ratones quiméricos individuales para trasmitir las características de las células ES a través de la línea germinal, fue estimada por medio del análisis de la isomerasa de fosfato de glucosa (Gpi) de esperma (Bradley, supra, (1987)); Mann y colaboradores, J. Reprod & Fert. 99, 505-512 (1993). La isomerasa del fosfato de glucosa cataliza la interconversión del fosfato-6-glucosa a fosfato-6-fructosa. Los ratones tienen un locus Gpi estructural sencillos con dos alelos principales Gpi 1A y Gpi 1B. Gpi 1A codifica a una proteína que aparece como una banda de migración catódicamente lenta durante la electroforesis, y se presenta en cepas tales como BALB/c y C129. (Las células ES utilizadas aquí se derivaron de ratones de la cepa 129). Gpi 1B determina a una enzima que se mueve más rápido que Gpi 1A y se presenta en la cepa silvestre y en cepas tales como C57 y CBA (utilizadas aquí para derivar a los blastocistos
huésped).

Los heterocigotos tienen las dos bandas de los padres más una banda intermedia que indica la estructura dimérica de la enzima. Las formas electroforéticas múltiples ocasionalmente observadas, son debidas a la oxidación de los grupos sulfhidrilo y no debido a la expresión específica del tejido. En ratones quiméricos, la relación de Gpi 1A (derivada de la cepa 129) a Gpi 1B (derivada del blastocisto huésped) indican la proporción de células con el genotipo de las células ES dentro de tejidos diferentes. La aparición de Gpi 1A (derivada de las células ES) en el esperma, sugiere que el ratón es capaz de transmitir el genotipo de la célula ES a través de la línea germinal.

III. Generación de ratones homocigotos para el cambio genético introducido en las células ES

Los ratones quiméricos con esperma derivada de las células ES fueron apareados con ratones BALB/c. La descendencia con el genotipo 129/Ola X BALB/c (esto es, heterocigotos para el genotipo celular ES) es gris. La mitad de estos ratones grises se esperaba que portaran el alelo interrumpido. Los ratones heterocigotos para el alelo interrumpido fueron identificados por medio de análisis PCR del ADN genómico obtenido de la sangre.

Para generar ratones homocigotos por el gen inactivado \alpha-1,3-Gal T, los ratones heterocigotos fueron apareados entre ellos. Un cuarto de la descendencia se esperó que fuera homocigota por el gen interrumpido. Los homocigotos fueron identificados por medio de análisis PCR del ADN genómico obtenido de la sangre. La estrategia PCR se basó en la inserción de un gen Neo^{R} en el sitio Sal I del exón 9 del gen \alpha-1,3-Gal T (Figura 13).

Iniciadores de tipo silvestre:

E9F:

\hskip1.5cm

5'-TCAGCATGATGCGCATGAAGAC-3'

: (SEQ ID NO: 17)

(Homólogo a la secuencia alrededor de 40 a 60 bp 5' del sitio Sal I del exón 9,correspondiente a los nucleótidos 1257-1278; Figura 4)

E9R2:

\hskip1.5cm

5'-TGGCCGCGTGGTAGTAAAAA-3'

: (SEQ ID NO: 18)

(Homólogo a una región alrededor de 175 a 195 bp 3' del sitio Sal I del exón 9, correspondiente a los nucleótidos 1511-1492; Figura 4).

El tamaño esperado del fragmento generado del alelo de tipo silvestre es de 255 bp (Figura 21). Estos iniciadores también pueden generar potencialmente un fragmento PCR de 1596 bp del alelo interrumpido. En la práctica, este fragmento no se generó cuando ambos, el alelo de tipo silvestre y el alelo interrumpido estaban presentes, probablemente debido a que el producto más pequeño de 255 bp se amplificó preferencialmente.

Iniciadores para inactivación:

NeoF1:

\hskip1.5cm

5'-TCTTGACGAGTTCTTCTGAG-3'

: (SEQ ID NO:19)

(correspondiente a los nucleótidos 1170-1189; Figura 16) E9R2: (El mismo iniciador descrito antes para detectar al alelo de tipo silvestre)

El tamaño esperado del fragmento es de 364 bp (Figura 21).

Los ratones crecieron hasta la edad del destete y fueron desangrados por la cola. Se les añadió alrededor de 10 U/ml de Heparina de sodio. La amplificación por PCR se realizó sobre 1 \mul de sangre heparinizada (\sim10^{4} células nucleadas) en un volumen de reacción de 50 \mul que contenía Tris-Acetato 100 mM pH 8,8, MgCl_{2} 3,5 mM, dNTPs 0,2 mM, y 2 unidades de Tth ADN polimerasa. Cada reacción contenía tanto al iniciador de tipo silvestre como al iniciador de inactivación en una concentración de 2 ng/\mul para cada de ellos. Para asegurarse de que la Tth polimerasa no fuera inhibida por sangre heparinizada, cada reacción fue realizada por duplicado.

Una de las reacciones fue patronada con dos muestras de ADN:

: i) 10 fg (\sim 600 moléculas) del plásmido linealizado de inactivación pNeo\alphaGT10.8B.

: ii) 1 fg (\sim 1000 moléculas) de un producto RT-PCR de 983 bp que incluye al Exón 9.

La otra reacción no fue patronada. Por lo tanto, se establecieron dos reacciones PCR separadas para cada muestra de sangre. Además, se condujeron reacciones de control PCR con la plantilla de ADN no genómico y con o sin patrones. Cada mezcla de reacción se calentó a 94ºC durante 3 min, luego se incubó por 40 ciclos a 94ºC durante 40 segundos, 53ºC durante 40 segundos, y 72ºC durante 40 segundos. Se hicieron electroforesis a las alícuotas de 5 \mul de cada mezcla de reacción sobre un gel de agarosa al 3%, y se visualizaron los fragmentos de ADN sobre una caja de luz UV después de colorear con bromuro de etidio. El ADN del plásmido pUC19 digerido con HpaII fue utilizado para marcadores.

Los resultados del análisis por PCR para tres ratones, y un control de "no ADN", se muestran en la Figura 22. Para el ratón # 42, los iniciadores de inactivación generaron una banda de 364 bp solamente en la reacción patrón +. Los iniciadores de tipo silvestre generaron una banda de 255 bp en las reacciones de patrón + de patrón -. Estos resultados demuestran que el ratón # 42 es homocigoto para el alelo de tipo silvestre. Para el ratón # 43, los iniciadores de tipo silvestre generaron una banda de 255 bp solamente en la reacción patrón +. Los iniciadores de inactivación generaron una banda de 364 bp en las reacciones de patrón + y de patrón -. Estos resultados demuestras que el ratón # 43 es homocigoto para el alelo interrumpido. Para el ratón # 44, los iniciadores de inactivación generaron una banda de 364 bp en las reacciones de patrón + y de patrón -. Los iniciadores de tipo silvestre generaron una banda de 255 bp en las reacciones de patrón + y de patrón -. Estos resultados demuestran que el ratón # 44 es homocigoto para el alelo interrumpido. En las reacciones de control por PCR, no fue evidente un producto cuando no se incluyo una platilla. Los productos PCR de 364 bp y de 255 bp fueron evidentes cuando pNeo\alphaGT10.8B y el ADN del Exón 9 RT-PCR fueron las únicas plantillas incluidas en las reacciones de control.

Ejemplo 15 Caracterización de los Ratones Homocigotos de Inactivación I. Ausencia de ARNm Gal T en ratones de inactivación Gal T A. Aislamiento de ARN

Se extrajo el ARN total utilizando el juego RNAzol^{TM}B (BIOTECX Laboratories, Inc., 6023 South Loop East, Houston, Texas 77033, EE.UU), suministrado por Bresatec. Este procedimiento de extracción se basa en el método descrito por Chomczynski y colaboradores, Anal. Biochem. 162: 156-159 (1987), e involucra homogenización en una solución de guanidina/fenol, una extracción con cloroformo, 2 precipitaciones con isopropanol, y lavados con EtOH al 75%. El ARN se almacenó como un precipitado en EtOH a -20ºC y se cuantificó midiendo la absorción a una longitud de onda de 260 nm en agua. La integridad y la cuantificación se confirmaron por electroforesis en agarosa/formaldehído. Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Segunda Edición. (1989).

B. RT-PCR

La síntesis de la primera cadena de ADNc involucró:

- el templado de 2 \mug de ARN total de riñón, corazón o hígado con 120 ng de oligoiniciador dT (Gibco BRL, M-MLV Reverse Trasncriptase Kit) a 65ºC durante 5 min en 5 \mul de Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM (pH 8).

- transcripción reversa a 37ºC durante 1-2 horas en un volumen final de reacción de 20 \mul utilizando el M-MLV Reverse Trasncriptase Kit (Gibco BRL). Cada reacción contenía DTT 5 mM, 1 \mug/\mul de BSA, dNTPS 1 mM, 40 U de inhibidor de RNAse placentario humano (Bresatec), 200 U de M-MLV Reverse Transcriptase y el tampón asociado RTase en una concentración 1X.

C. Análisis por PCR del ADNc

Se detectó el ADNc de \alpha-1,3-Gal T por amplificación PCR de una plantilla de ADNc oligo iniciada dT. El fracaso para generar este fragmento PCR, junto con los resultados de control por PCR, indican que el ARNm de \alpha-1,3-Gal T estaba ausente de la preparación de ARN. Para demostrar que los iniciadores de \alpha-1,3-Gal T soportaron la amplificación de la plantilla de \alpha-1,3-Gal T, cada reacción se montó por duplicado, y una de las reacciones se patronó con 0,1 fg (\sim 100 moléculas) de un producto de ADNc de \alpha-1,3-Gal T de ratón de 983 bp (generado por iniciadores 7F y mGT-3UR, expandiendo el exón 7 hasta la región 3' no traducida). Como un segundo control para demostrar que la síntesis de ADNc había ocurrido se generó un fragmento PCR de ferroquelatasa de la plantilla de ADNc.

1. Iniciadores:

Iniciadores para detectar al ADNc de \alpha-1,3-Gal T:

7F:

\hskip1.5cm

5'-TGGAGATCGCATTGAAGAGC-3'

\hskip4.6cm

(SEQ ID NO: 20)

(correspondiente a los nucleótidos 889-911 dentro del exón 7 (Figura 4))

9R2:

\hskip1.5cm

5'-TGGCCGCGTGGTAGTAAAAA-3'

\hskip4.6cm

(SEQ ID NO: 21)

(correspondiente a los nucleótidos 1492-1511 dentro del exón 9 (Figura 4)).

Se esperaba que los iniciadores 7F y 9R2 generaran un fragmento de \sim619 bp (Figura 23) de la plantilla de ADNc. Estos iniciadores no generarán un fragmento del ADN genómico posiblemente presente en la preparación de ADNc, ya que los iniciadores abarcan dos intrones grandes.

mGT-3UR:

\hskip1.5cm

5'-GGGTTTTGGTTTTGATTGTT-3'

\hskip5.6cm

(SEQ ID NO: 22)

(correspondiente a los nucleótidos 1866-1888 dentro de la región 3' no traducida; Figura 4)

Este iniciador fue utilizado con el iniciador 7F para generar el fragmento de ADN usado en los patrones de control PCR.

Los iniciadores para detectar el ADNc de ferroquelatasa de ratón (enlazadores EcoRI, subrayados:

FC-F:

\hskip1.5cm

5'-CTGAATTCATGTTAAACATGGGAGGCCCC-3'

\hskip5cm

(SEQ ID NO: 23)

(correspondiente a los nucleótidos 215-235, Taketani y colaboradores, J. Biol. Chem. 265: 19377-80 (1990)).

gFC-R:

\hskip1.5cm

5'-CTGAATTCTGCCCACTCCCTGCCGATG-3'

\hskip5cm

(SEQ IS NO: 24)

(correspondiente a los nucleótidos 898-908, Taketani y colaboradores, J. Biol. Chem. 265: 19377-80 (1990)).

Se esperaba que estos iniciadores generara un fragmento de 709 bp (Figura 23). Estos iniciadores no generarán un fragmento de ADN genómico posiblemente presente en la preparación de ADNc, ya que los iniciadores abarcan cinco intrones.

Los volúmenes de reacción fueron de 50 \mul, consistiendo de 4 \mul de la primera cadena de la reacción de síntesis de ADNc, 100 ng de cada iniciador, MgCl_{2} 2mM, dNTPS 03 mM, 2 U de Taq-Polimerasa (Bresatec) y tampón Tag de reacción (Bresatec) en concentración 1X. Las reacciones fueron calentadas a 94ºC durante 2 min, luego 29 ciclos de 94ºC durante 15 segundos, 58ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 1 min seguido por una única etapa de 72ºC durante 4 min y 4ºC durante 5 min. Se hizo electroforesis a una alícuota de 10 \mul de cada PCR sobre gel de agarosa al 2% y se visualizaron fragmentos de ADN sobre una caja de luz UV después de colorear al gel con bromuro de etidio.

La Figura 24 muestra los fragmentos PCR generados a partir del ARN aislado de riñón (K), corazón (H) e hígado (L) de un ratón de tipo silvestre, y de ratones heterocigotos u homocigotos para el alelo interrumpido \alpha-1,3-Gal T. La Figura 24 (i) muestra que el fragmento de ferroquelatasa de 709 bp se generó a partir de cada una de las preparaciones de ADNc, indicando que la plantilla de ADNc se produjo a partir de la reacción de transcripción inversa, y estaba disponible para los iniciadores génicos \alpha-1,3-Gal T. El fragmento \alpha-1,3-Gal T de 629 bp estaba presente en cada una de la reacciones patronadas con el producto ADNc de \alpha-1,3-Gal T de 983 bp (Figura 24 (ii)), indicando que había ocurrido la amplificación de la plantilla (patrón) de ADNc de \alpha-1,3-Gal T.

En las reacciones que no fueron patronadas (Figura 24 (iii)), se detectó el fragmento de \alpha-1,3-Gal T de 619 bp en los ADNc sintetizados a partir de los ARN de tipo silvestre y heterocigotos. Esto indica que el ARNm de \alpha-1,3-Gal T esta presente en el riñón, el corazón y el hígado de los ratones de tipo silvestre y heterocigotos. El fragmento de 619 bp no fue detectado en las reacciones no patronadas de inactivación de homocigoto, indicando que el ARNm de \alpha-1,3-Gal T no se sintetiza en los ratones homocigotos de inactivación.

II. Ensayo para la expresión del epítopo GAL en ratones homocigotos de inactivación utilizando anticuerpos anti-GAL con clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) A. Soluciones

Las soluciones 1 a 5 son isotónicas 10x.

NaCl 1,68 M (948,21 g/l) Secar las sales durante la noche en horno caliente antes de pesarlas.

KCl 1,68 M (125 g/l) Secar las sales durante la noche en horno caliente antes de pesarlas.

CaCl_{2} 1,12 M (165 g/l de CaCl_{2}.2H_{2}O) Secar las sales durante la noche en horno caliente antes de pesarlas.

MgSO_{4} 1,68 M (414 g/l de MgSO_{4}.7H_{2}O) No secar en horno caliente,

Tampón de fosfato de potasio pH 7,2:

KH_{2}PO_{4} 1,68 M (229 g/l).

K_{2}HPO_{4} 1,12 M (226 g/l de K_{2}HPO_{4}.3H_{2}O o 195 g/l de K_{2}HPO_{4}).

El tampón de fosfato de potasio se prepara mezclando volúmenes iguales de las soluciones a) y b). Para ajustar el pH del tampón, remover una pequeña muestra, diluir 1:50 y leer en un pH metro.

6. Tampón Hepes 1 M (CSL, Melbourne, Australia).

7. KDS BSS:

Añadir soluciones patrón en el siguiente orden a agua bidestilada (DDW):

Patrón	Proporción de las Soluciones
DDW	1210
NaCl	121
KCl	3
CaCl_{2}	3
MgSO_{4}	1
Tampón de fosfato de potasio	2
Hepes	20

\vskip1.000000\baselineskip

Filtrar en forma estéril, almacenar a 4ºC.

8. KDS/BSS/2%hsa/0,02% azida:

KDS/BSS	244,5 ml
Albúmina de suero humano (CSL, Melbourne, Australia)	5 ml
10% de azida de Na en MT-PBS	0,5 ml

\vskip1.000000\baselineskip

9. Dilución FITC: Diluir 7.5 \mul de FITC-IgG a 600 \mul con KDS/BSS

10. Tampón de lisis de glóbulos rojos:

: NH_{4}Cl 0,168 M en agua bidestilada

11. Paraformaldehído al 4% (PFA).

\newpage

Soluciones:
A.	NaH_{2}PO_{4}.2H_{2}O	22,6
B.	NaOH	g/l
C.	Paraformaldehido al 40%:	25,2
	\hskip0.3cm 1) 4 g de paraformaldehído (BDH, Kilsyth, Australia, # 29447) di-	g/l
	sueltos en 10 ml de agua bidestilada. Calentar a 70ºC durante 2 horas
	sobre agitador en cabina para humos y se añaden unas pocas gotas de
	NaOH 2 M hasta que la solución se hace clara.
	\hskip0.3cm 2) Se añaden luego 0,54 g de glucosa.
	\hskip0.3cm 3) Almacenar a temperatura ambiente en un frasco de seguridad
D.	vidrio claro.
E.	\hskip0.3cm Añadir al tiempo 83 ml de A + 17 ml de B
	\hskip0.3cm Solución finas de fijación de PFA al 4%: 90 ml de D + 10 ml de
	C. pH 7,4-7,6; ajustar el pH con HCl 1 M.

Solución Salina Balanceada de Hanks (libre de Ca y Mg) (HBBS):

KCl	400 mg
KH_{2}PO_{4}	60 mg
NaCl	8 g
NaHCO_{3}	350 mg
Na_{2}HPO_{4}.2H_{2}O	68 mg
Glucosa	1 g
H_{2}O	hasta 1 litro

Ajustar a pH 7,0; filtrar en forma estéril.

13. Fragmentos (FITC) F(ab)2 de isotiocianato de fluoresceína IgG e IgM anti-humano de oveja (Silenus, Hawthorn, Australia):

B. Métodos

1. Ratones para sangrado de ojo, recolectar 300-400 \mul en un tubo Eppendorf preenfriado, almacenar sobre hielo, añadir 20 mg/ml de EDTA para obtener una concentración final de 2 mg/ml.

2. Transferir la sangre (incluidos los controles humanos apropiados) a un tubo plano de 10 ml y añadir 10 ml de tampón para lisis de glóbulos rojos (NH_{4}Cl 0,168 M) precalentado a 42ºC; incubar durante varios minutos o hasta que las células se hayan lisado.

3. Precipitar las células por centrifugación (800 x g, 7 min, 4ºC).

4. Resuspender las células en 10 ml de KDS/BSS/2%HSA/0,02%NaN_{3}.

5. Precipitar las células como anteriormente; repetir las etapas 4 & 5.

6. Resuspender las células en 1000 \mul de KDS/BSS/2%HSA/0,1%NaN_{3}; transferir alícuotas a tubos FACS de fondo en V.

7. Precipitar las células como anteriormente.

8. Resuspender las células en 100 \mul de KDS/BSS/2%HSA/0,1%NaN_{3}

9. Añadir 50 \mul de anticuerpo anti-GAL purificado (ver Ejemplo 1, más arriba), suero humano normal (NHS) o HBBS/2%HSA/0,1%NaN_{3} e incubar 45 min.

10. Añadir 2 ml de KDS/BSS/2%HSA/0,02%NaN_{3}; centrifugar las células como anteriormente.

11. Añadir 50 \mul a una dilución 1:80 de un fragmento FITC F(ab)2 de IgG o IgM anti-humano de oveja (Silenus).

12. Añadir 2 ml de KDS/BSS/2%HSA/0,02%NaN_{3}; centrifugar las células como anteriormente.

Resuspender las células en 300 \mul de KDS/BSS/2%HSA/0,02%NaN_{3}.

Transferir las muestras a tubos plásticos FACS de fondo redondo y añadir 3 \mul de yoduro de propidio (100 \mug/ml); las muestras están listas ahora para el análisis; conservar sobre hielo.

Analizar en un escáner FACS de Beckman utilizando composiciones de linfocitos en sangre periférica.

C. Resultados

Los resultados de estos experimentos se dan a continuación:

	Fluorescencia de canal medio (escala log)	Fluorescencia de canal de pico (escala log)
Ratón 129 (Normal)	9	9
PBL + FITC anti-IgG
solo (control negativo)
Ratón 19 PBL	197	286
(tipo silvestre)
GAL IgG
Ratón 21 PBL (GAL	22	15
de Inactivación)
GAL IgG

Ratón 129 (Normal)	7	1
PBL + FITC anti-IgM
solo (control negativo)
Ratón 19 PBL	185	167
(tipo silvestre)
GAL IgM

Ratón 21 PBL (GAL	34	18
de Inactivación)
GAL IgM
Ratón 129 (Normal)	8	9
PBL + FITC anti-IgG
solo (control negativo)
Ratón 129 PBL	120	328
(Normal) GAL IgG
Ratón 9 PBL (GAL	10	9
de Inactivación)
GAL IgG

Los resultados del enlazamiento anti-Gal de humano con linfocitos humanos de sangre periférica (control negativo) no se muestran pero fueron negativos. Estos experimentos demuestran que losanticuerpos anti-Gal (IgG e IgM) de humano se enlazan a los glóbulos rojos periféricos de los ratones homocigotos para la inactivación de la \alpha 1,3 galactosiltransferasa (ratón 21 y ratón 9), muy débilmente si acaso. Esto confirma la carencia esperada del epítopo de la galactosa \alpha 1,3 galactosa (GAL) en tales ratones. En contraste, los glóbulos rojos periféricos de ratones normales (ratón 129 y ratón 19) de la misma cepa, muestran un enlazamiento claro de los anticuerpos anti-Gal.

III. Ensayos para la expresión del epítopo GAL en ratones homocigotos para inactivación usando lectina IB_{4} con FACS

La lectina IB_{4} tiene una afinidad exclusiva por los residuos terminales \alpha-D-galactosil, y se demuestra más abajo que es útil para la caracterización de los ratones para inactivación.

A. Soluciones

1. paraformaldehído al 4% (ver más arriba)

2. Tonicidad de ratón PBS (MT-PBS)

Na_{2}HPO_{4}	2,27 g
Na_{2}HPO_{4}.2H_{2}O	0,62 g
NaCl	8,7 g

: Llevar a un litro con DDW.

3. Tampón para Remover las Células Muertas (DCRB):

: - 4,5 g de Sorbitol

: - 7,6 g de Monohidrato de glucosa, (6,93 g si es anhidro)

: - 12,5 ml de KDS/BSS

: - Llevar hasta 100 ml con DDW

: - Filtrar, almacenar a 4ºC

: - Abrir solamente bajo condiciones estériles

4. KDS/BSS (Tonicidad de Ratón, Solución Salina Balanceada de Hepes Tamponado pH 7,2) (ver más arriba).

5. Tampón para lisis de glóbulos rojos (ver más arriba).

6. KDS/BSS/2%HSA/0,02%azida (ver más arriba).

7. Solución Salina Balanceada de Hanks (libre de Ca y Mg) (ver más arriba).

B. Métodos

1. Remover el bazo, sostenerlo con fórceps curvados y recolectar los esplenocitos por medio de inyección con una aguja doblada calibre 27 a 90ºC, inyectando (jeringa de 2,5 ml) 100-200 \mul de tampón dentro del bazo, dos o tres veces. Usando la superficie plana de la aguja doblada, masajear las células hacia fuera de los agujeros hechos en el bazo. Repetir las inyecciones y remover las células hasta que no queden células en la cápsula.

2. Transferir los esplenocitos a un tubo de 10 ml y centrifugar para precipitar las células (500 x g, 7 min, 4ºC).

3. Remover el sobrenadante y añadir 3 ml de tampón precalentado a 42ºC para lisis de glóbulos rojos; incubar por varios minutos o hasta que las células hayan lisado. Reforzar con 1 ml de HIFCS (suero fetal de ternera inactivado por calor) y dejarlo sobre hielo durante 5 min. completar hasta 10 ml con KDS BSS/10%HIFCS.

4. Centrifugar como anteriormente.

5. Resuspender las células en 3 ml de tampón para remoción de células muertas; mezclar bien con una pipeta.

6. Pasar a través de una pipeta de vidrio tapada con algodón y recolectar las células en un tubo de 10 ml. No fuerce las células a través suyo, permita que drenen por gravedad.

7. Reforzar las células con 1 ml de BSS/10%HIFCS.

8. Centrifugar como anteriormente.

9. Remover el sobrenadante.

10. Centrifugar como anteriormente; repetir las etapa 4 & 5.

11. Añadir 0,5 ml de paraformaldehído frió al 4% (PFA).

12. Incubar sobre hielo durante 5 min mezclando intermitentemente.

13. Añadir 2 ml de HBBS enfriado sobre hielo y centrifugar como anteriormente.

14. Repetir los lavados con 2 ml y luego con 1 ml de HBBS.

15. Resuspender las células en 100 \mul de KDS/BSS/2%HSA/0,1% de NaN_{3}; transferir a tubos FACS con fondo en forma de V.

Añadir lectina FITC IB_{4} (Sigma, Catálogo No. L 2895), 50 \mul a 20 \mug/ml, o 50 \mul de HBBS; incubar sobre hielo durante 30 min.

Añadir 2 ml de KDS/BSS/2%HSA/0,1% de NaN_{3}; centrifugar las células como anteriormente.

Resuspender las células en 300 \mul de KDS/BSS/2%HSA/0,1% de NaN_{3}.

Transferir las muestras a tubos plásticos FACS fondo redondo; las muestras están listas ahora para análisis; conservar sobre hielo.

Analizar sobre un escáner FACS utilizando composiciones de linfocitos de sangre periférica.

C. Muestras

1. Esplenocitos solos de ratón 129.

2. Esplenocitos + lectina IB_{4} de ratón 129.

3. PBL humano solo.

4. PBL humano + lectina IB_{4}.

D. Resultados

Los resultados de estos experimentos se muestran más abajo

\vskip1.000000\baselineskip

	Canal de fluorescencia	Canal de fluorescencia	Canal de fluorescencia
	media (escala log)	mediana (escala log)	de pico (escala log)
Esplenocitos solamente	1	1	1
(autofluorescencia)
ratón 19 (tipo silvestre)	252	58	16
esplenocitos
Ratón 21 (ratón para	3	2	1
inactivación) esplenocitos

Los resultados demuestran que la lectina IB_{4} se une a las células de bazo del gen homocigoto \alpha 1,3 galactosiltransferasa de ratón (ratón 21) objetivo (Gal inactivado), muy débilmente si acaso. Esto confirma la carencia esperada del epítopo de la galactosa \alpha 1,3 galactosa (GAL) en tales ratones. En contraste, los glóbulos rojos periféricos de un ratón norma (ratón 19) de la misma cepa, se une fuertemente a la lectina IB_{4}.

IV. Evaluación inmunohistológica de tejidos de ratón por la presencia del epítopo GAL utilizando anticuerpos anti-GAL A. Reactivos

1. TBS: solución salina tamponada Tris

NaCl	8 g
KCl	0,2 g
Tris básico	3 g

- Disolver en 800 ml de agua destilada. Ajustar el pH a 8,0 con HCl 1 M. Ajustar el volumen a 1 L. Esterilizar por autoclavado. Almacenar a temperatura ambiente.

2. Tampón de bloqueo:

-: TBS + albúmina de suero bovino al 2% (BSA) + suero de conejo al 10%.

3. Conjugados de peroxidasa:

Peroxidasa (POD) DAKO (Dinamarca) conjugada a IgG anti-humano de conejo (fragmento) y peroxidasa (POD) DAKO (Dinamarca) conjugada a IgM anti-humano de conejo (fragmento).

Los conjugados fueron ambos separadamente preabsorbidos sobre 10% de polvo de hígado de ratón a 4ºC durante la noche luego centrifugado a 18.000 x g durante 10 min en una Biofuge y luego a 30 psi durante 30 min en una airfuge de Beckman. Los anti-sueros conjugados fueron diluidos 1/50 en 2% de tampón de bloqueo (TBS + 2% BSA + 2% suero de conejo) con 16% de suero normal de ratón.

4. Preparación del polvo de hígado de ratón:

Como modificación de los Anticuerpos, A Laboratory Manual Ed Harber and David Lane, Cold Spring Harbour Laboratories (1988) pg 663:

Preparar una suspensión fina de hígado de ratón en solución salina tamponada de fosfato con tonicidad de ratón (MT-PBS). Triturar el hígado a través de un tamiz con un embolo de 5 ml. Descartar cualquier tejido fibroso. Debe resuspenderse un gramo de tejido en aproximadamente 1 ml de MT-PBS.

Transferir la suspensión salina/de tejido sobre hielo durante 5 min.

Añadir 8 ml de acetona (\sim20ºC) (Univar 6, Ajas Chemicals) durante 10 minutos. Mezclar vigorosamente. Incubar sobre hielo durante 30 min con mezcla vigorosa ocasional.

Recolectar el precipitado por centrifugación a 10000 g (9000 rpm en una centrífuga refrigerada superveloz Sorvall RC-5B). Centrifugar por 10 min.

Resuspender el precipitado con acetona fresca (-20ºC) y mezclar vigorosamente. Permitir que permanezca sobre hielo durante 10 min.

Centrifugar a 10000 g durante 10 min. Transferir el precipitado a un pedazo de papel filtro limpio. Esparcir el precipitado y permitir que se seque al aire a temperatura ambiente.

Después que el precipitado se seca, transferirlo a un contenedor hermético. Remover cualquier pedazo grande que no forme un polvo fino. Desecar y almacenar a 4ºC.

El rendimiento es aproximadamente de 10-20% del peso húmedo original. Para usar los polvos en acetona, añádalo hasta una concentración final del 1%. Incubar durante 30 min a 4ºC.

Centrifugue a 10000 g durante 10 min (13000 rpm en una Biofuge).

5. DAB/H_{2}O_{2}/Imidazol:

Sustrato de peroxidasa: Tetrahidrocloruro de 3, 3'-diaminobencidina (DAB) (Sigma, Missouri)

-: 1 tableta de DAB (sacarla del refrigerador 10 min antes de usar).

-: 1 tableta de urea H_{2}O_{2} (Sigma, Missouri).

-: Añadir a 15 ml de Tris HCl, pH 7,6 + imidazol 0,01 M (0,0102 g), (Sigma, Missouri).

-: Preparar inmediatamente antes de usar.

6. Tris Hcl:

: 1,211 g de Tris en 200 ml de agua bidestilada pH 7,6.

7. Fuentes de suero animal:

Los sueros de ratón y conejo se obtuvieron en casa (Hospital San Vicente, Departamento de Inmunología Clínica). El suero de oveja se obtuvo en la Clínica y Hospital Veterinario de la Universidad de Melbourne, Werribee, Australia.

8. Hematoxilina Harris:

Hematoxilina C.I. 75290 (BDII, Poole, U.K. # 34037)	10 g
Etanol absoluto	200 ml
Alumbre de potasio	200 g
Agua bidestilada	2000 ml
Ácido acético glacial	80 ml

Preparación:

1. Disolver la hematoxilina en etanol absoluto.

2. Calentar para disolver el alumbre en agua bidestilada.

3. Mezclar las soluciones 1 y 2.

4. Añadir inmediatamente antes de usar, 80 ml de yodato de sodio al 1% y 80 ml de ácido acético glacial.

9. Agua Corriente de Scott:

Bicarbonato de sodio	14 g
MgSO_{4}	80 g
Agua corriente	4 litros

B. Métodos

1. Cortar secciones de 4 \mum del tejido relevante sobre un crióstato.

2. El tejido debe estar libre de grietas.

3. Secar al aire las rebanadas durante 30 min.

4. Aplicar tampón de bloqueo al 10% a temperatura ambiente en cámara húmeda, 60 min.

5. Remover el anticuerpo de bloqueo con tejido elaborado hasta punto fino.

6. Aplicar el primer anticuerpo, anti-GAL, o el tampón de bloqueo al 2% como control, 50 \mu, asegurándose que no contenga burbujas de aire e incubar a temperatura ambiente en cámara húmeda durante 30 min.

7. Lavar con solución salina tamponada Tris (TBS) 3 veces con lavados de 2 minutos.

8. Aplicar el segundo anticuerpo 1:50 en peroxidasa (POD) conjugada IgG e IgM anti-humana de conejo (DAKO, Dinamarca); incubar 30 min a temperatura ambiente en cámara húmeda.

9. Lavar con solución salina tamponada Tris (TBS) 3 veces con lavados de 3 minutos.

10. Lavar con TBS como anteriormente.

11. Incubar DAB/H_{2}O_{2}/imidazol durante 10 min.

12. Lavar en agua.

13. Colorear con hematoxilina C-10 seg.

14. Lavar en agua.

15. Colocar en agua corriente de Scott durante 15 seg.

16. Lavar en agua.

17. Lavar en alcohol absoluto (x 3) (Univar 214, Ajax Chemicals).

18. Lavar en xileno absoluto (x 3) (Univar 577, Ajax Chemicals).

19. Recubrir por deslizamiento usando una máquina automática para recubrir por deslizamiento (Tissue Tek).

Controles:

: Solamente tampón + POD conjugado a IgM anti-humano de conejo (negativo).

: Solamente tampón + POD conjugado a IgG anti-humano de conejo (negativo).

: Riñón humano (negativo)Corteza renal de cerdo (positivo).

C. Resultados

\vskip1.000000\baselineskip

Riñón

	Glomérulos	Endotelio	Comentarios
Ratón 129 anti-IgM	Positivo	Positivo
Ratón 9 anti-IgM	Negativo	Negativo	Coloración adventicia débil
Ratón 21 anti-IgM	Negativo	Negativo	Coloración adventicia débil
Ratón 129 anti-IgG	Positivo	Positivo
Ratón 9 anti-IgG	Negativo	Negativo
Ratón 21 anti-IgG	Negativo	Negativo
POD conjugado a anticuerpo	Todo Negativo	Todo Negativo

\vskip1.000000\baselineskip

Estos resultados indican que los anticuerpos IgG e IgM anti-Gal humano no se unen al tejido de riñón de los ratones (ratón 21 y ratón 9) del gen objetivo de \alpha 1,3 galactosil transferasa (Gal de inactivación). Esto confirma la carencia en los ratones objetivo (de inactivación) del epítopo de galactosa \alpha 1,3 galactosa (GAL) en el gen. En contraste, estos anticuerpos reaccionan fuertemente con el endotelio de los vasos sanguíneos y los glomérulos de un ratón normal de la misma cepa (129).

V. Examen inmunohistológico de tejidos de ratón usando lectina IB_{4} A. Reactivos

1. Tampón de bloqueo: TBS + 2% BSA + 10% suero de oveja.

2. FITC IB_{4} (Sigma, Missouri, EE.UU #L-2895) 1 mg diluido en 1 ml de HBBS para dar una solución patrón, luego diluir hasta volumen final de 20 \mug/ml en TBS + 2% BSA + 2% suero de oveja.

\newpage

3. Peroxidasa anti-FITC.

Fragmentos POD Fab anti-fluoresceína de Boehringer; dilución 1/300 en tampón de bloqueo al 2%.

4. DAB/H_{2}O_{2}/Imidazol- ver más arriba.

5. Tris HCl- ver más arriba.

6. Fuentes de suero animal- ver más arriba.

7. Hematoxilina de Harris- ver más arriba.

8. Agua Corriente de Scott- ver más arriba.

B. Métodos

1. Preparación de Secciones; igual que en la Sección 4B, etapas 1-7 más arriba.

2. Aplicar 50 \mul de FITC conjugado IB_{4}.

(Sigma # 1-2894) 20 \mug/ml, incubar en una cámara húmeda durante 30 min.

3. Lavar con TBS, 3 min (x 3).

4. Aplicar 50 \mul por oxidasa conjugada a fragmentos anti-FITC Fab (Boehringer Mannheim), diluida 1:3- con TBS + 2% BSA + 2% suero de oveja. Incubar durante 30 min en cámara húmeda.

5. Lavar con TBS, 3 min (x 3).

6. Procesar para microscopía - igual que en la Sección IVB etapas 14-22.

\vskip1.000000\baselineskip

Controles
1.	Solamente tampón + POD anti-FITC	(negativo)
2.	Riñón humano	(negativo)
3.	Corteza renal de cerdo	(positivo)

\vskip1.000000\baselineskip

Muestras 1^{er} Experimento
1.	Ratón 129 SV	ratón normal	corazón hígado riñón pulmón
2.	ratón 6	tipo silvestre	corazón hígado riñón pulmón
3.	ratón 7	heterocigoto para inactivación	corazón hígado riñón pulmón
4.	ratón 9	heterocigoto para inactivación	corazón hígado riñón pulmón

\vskip1.000000\baselineskip

Muestras 2^{do} Experimento
1.	ratón 19	tipo silvestre	corazón hígado riñón pulmón
2.	ratón 20	heterocigoto para inactivación	corazón hígado riñón pulmón
3.	ratón 21	heterocigoto para inactivación	corazón hígado riñón pulmón

C. Resultados

Riñón
	Glomérulos	Endotelio
Humano	Negativo	Negativo
Cerdo	Positivo	Positivo
Ratón 129	Positivo	Positivo
Ratón 6	Positivo	Positivo
Ratón 7	Positivo	Positivo
Ratón 9	Negativo	Negativo
Ratón 19	Positivo	Positivo
Ratón 20	Positivo	Positivo
Ratón 21	Negativo	Negativo
Anti-FITC solamente	Todo negativo	Todo negativo

Hígado
	Glomérulos	Endotelio
Ratón 129	Positivo	Positivo
Ratón 6	Positivo	Positivo
Ratón 7	Positivo	Positivo
Ratón 9	Negativo	Negativo
Ratón 19	Positivo	Positivo
Ratón 20	Positivo	Positivo
Ratón 21	Negativo	Negativo
anti-FITC solamente	Todo negativo	Todo negativo

Corazón
	Endotelio	Perinuclear	Endomiocardio
Ratón 129	Positivo	Positivo	Positivo
Ratón 6	Positivo	Positivo	Positivo
Ratón 7	Positivo	Positivo	Positivo
Ratón 9	Negativo	Negativo	Negativo
Ratón 19	Positivo	Positivo	Positivo
Ratón 20	Positivo	Positivo	Positivo
Ratón 21	Negativo	Negativo	Negativo
anti-FITC solamente	Todo negativo	Todo negativo	Todo negativo

Pulmón
	Endotelio	Bronquios	Parenquima
Ratón 129	Positivo	Positivo	Positivo
Ratón 6	Positivo	Positivo	Positivo
Ratón 7	Positivo	Positivo	Positivo
Ratón 9	Negativo	Negativo	Negativo
Ratón 19	Positivo	Positivo	Positivo
Ratón 20	Positivo	Positivo	Positivo
Ratón 21	Negativo	Negativo	Negativo
anti-FITC solamente	Todo negativo	Todo negativo	Todo negativo

Estos resultados indican que la lectina IB_{4} no se une al tejido de riñón, corazón, hígado o pulmón de los ratones homocigotos (ratón 21 y ratón 9) objetivo del gen de la \alpha 1,3 galactosiltransferasa (GAL de inactivación). Esto confirma la carencia en los ratones objetivo (de inactivación) del epítopo galactosa \alpha 1,3 galactosa (GAL) en el gen. En contraste, estos anticuerpos reaccionan fuertemente con los tejidos de un ratón normal y de los ratones heterocigoto para inactivación (ratón 129, ratón 6, ratón 7, ratón 19, ratón 20) de la misma cepa.

V. Resistencia de las células de bazo de ratones para inactivación a la lisis por suero humano

La lisis de células de bazo por suero humano fue analizada a través del uso de un ensayo de liberación de ^{51}cromo. Ver en general el Ejemplo 4, más arriba.

A. Preparación de esplenocitos de Ratón - Shortman, K.J. y colaboradores, Immunological

Methods, 1: 273-287 (1972):

- Diseccionar el bazo, evitando dañar las membranas exteriores y remover cuidadosamente tejido mesentérico y grasa.

- Colocar en caja de petri, con 1 ml de RPMI 160 (Gibco BRL)/10% de suero fetal de ternera inactivado por calor (HI-FCS). (Inactivación por calor = 40 min a 56ºC).

- Desgarra suavemente las células en la caja de petri, recolectar y centrifugar a 500 g, 5 min, 4ºC.

- Remover RPMI/10% HIFCS, resuspender suavemente las células en 3 ml de NH_{4}Cl (0,168 M), usando una pipeta Pasteur.

(Usar pipetas Pasteur o pipetas de boca ancha para todos los procedimientos de resuspensión y transferencia)

- Transferir a un tubo de 10 ml, reforzar con 1 ml de HIFCS, colocar sobre hielo, 5 min.

- Transferir el sobrenadante a un tubo limpio, centrifugar a 500 x g, 7 min, 4ºC

- Descartar el sobrenadante, resuspender las células en 3 ml de tampón para remoción de células muertas, mezclar bien con pipeta.

- Pasar a través de tapón de algodón en pipeta de vidrio (por gravedad, no fuerce), recolectar las células en un tubo de 10 ml.

- Reforzar las células con 1 ml de HIFCS.

- Centrifugar a 500 x g, 7 min, 4ºC.

- Remover el sobrenadante, resuspender las células en 50 \mul de RPMI, 10% HIFCS. Almacenar las células sobre hielo.

B. Preparación de suero

Humano - Recolectar sangre entera de una reserva de donantes normales; permitir que permanezca a temperatura ambiente durante 2 horas.

Exprimir la tela con un "Varilla naranja"; Agitar, remover y reunir el suero. Almacenar la mitad a -70ºC en alícuotas de 3 ml (suero humano normal); inactivar por calor la otra mitad, ver más abajo.

Suero fetal de ternera - adquirido a Gibco BRL, y almacenar a -20ºC.

1.: Añadir 5 \mul de células a 95,0 \mul de RPMI, 10% HIFCS.

2.: Remover 10 \mul de células, añadir 10 \mul de Acridina Naranja/Solución Et Br, (Lee, S.K. y colaboradores, Eur J. Immunol. 1975. 5: 259-262).

3.: Recuento de células, (viables = verde, muertas = naranja).

4.: La viabilidad de las células debe ser aprox. Del 90-100%.

5.: Calcular el número de células.

D. Marcación con ^{51}Cromo

Tipo de Célula	Condiciones de incubación
	Tiempo	Cantidad de ^{51}Cr/10^{7} células
Células preparadas en formas fresca:	\sim 2 horas	\sim 150-300 \muCl
(por ejemplo, esplenocitos o linfocitos)
Células Cultivadas:	\sim 1 hora	\sim 100 \muCl

Marcación:

Combinar:

- células (2 X 10^{7}).

- Cromato de Sodio (^{51}Cr) en solución de NaCl al 0,9% (el volumen añadido depende del tipo de célula como se indicó antes y de la actividad específica del Cromato de Sodio (^{51}Cr)).

- RPMI/2% HIFCS hasta un total de 200 \mul.

Incubar a 37ºC por el tiempo mostrado más arriba con agitación suave cada 15 min.

E. Lavado

- Colocar 4 ml de HIFCS en un tubo de 10 ml y cuidadosamente efectuar la reacción de marcación en capas sobre la superficie con un movimiento en remolino, centrifugar 5 min, 500 x g, 4ºC.

- Remover las dos capas superiores con un movimiento circular cuidadoso usando una pipeta de vidrio.

- Precipitar la suspensión de células a través de otros 4 ml de HIFCS.

- Resuspender el precipitado de células en 1 ml de RPMI/2% HIFCS, almacenar sobre hielo.

F. Ensayo de Liberación

- Efectuar el ensayo en placa de microtitulación de 96 pozos (ICN-FLOW).

- El ensayo debe hacerse por cuadruplicado.

- El ensayo se efectúa en un volumen total de 180 \mul. Ensayo:

\newpage

	NHS	*HI-NHS	16% SDS	Células	RPMI/2% HIFCS
Liberación Máx.	-		22,5 \mul	25 \mul	42,5
Liberación espontánea	-	90 \mul		\hskip0.7cm 25	\mul
5% NHS	9 \mul	90		\hskip0.7cm 25	65
10% NHS	18	81		\hskip0.7cm 25	\mul
20% NHS	36	72		\hskip0.7cm 25	65
30% NHS	54	54		\hskip0.7cm 25	65
40% NHS	72	36		\hskip0.7cm 25	65
50% NHS	90	18		\hskip0.7cm 25	65
					65
		-			65
* HI = Inactivado por calor

- Todos los volúmenes indicados están en \mul.

- Los componentes de la reacción se añaden a la placa en orden: RPMI, Suero y células marcadas con ^{51}Cr.

- Cubrir la placa con sellador para placa.

- Incubar, 4 horas, 37ºC.

- Centrifugar la placa, 1500 rpm, 5 min.

- Remover el sellador para placa, remover 80 \mul de cada pozo, hacer recuento del cromo liberado en contador gama.

- Calcular la lisis específica para cada pozo de acuerdo con la fórmula:

% \ Espec\text{í}fico \ de \ Lisis = \frac{(\text{cpm ensayo} - \text{cpm liberación espontánea}) \ X \ 100}{(\text{cpm liberación máxima} - \text{cpm liberación espontánea})}

Calcular la media y la desviación estándar para cada punto experimental. Graficar el % de suero Humano (eje X) contra el % Específico de lisis (eje Y) para cada tipo de célula (tipo silvestre, heterocigota para inactivación y homocigota para inactivación).

Los resultados de estos experimentos se describen en la Figura 25. Los resultados indican que las células de bazo de un ratón homocigoto para inactivación son relativamente resistentes a la lisis por suero humano, en comparación con las células de bazo derivadas de ratones heterocigotos para el alelo interrumpido o de los ratones de tipo silvestre.

Ejemplo 16 Generación de Animales para Inactivación A Través de Microinyección de Óvulos

Los animales transgénicos rutinariamente se generan por microinyección de ADN dentro de los pronúcleos de óvulos fertilizados. Generalmente esta tecnología resulta en una integración aleatoria del transgén en el genoma. Sin embargo, la tecnología transgénica convencional a resultado en recombinación homóloga entre el transgén inyectado y el gen endógeno. Ver, por ejemplo, Brinster y colaboradores, Proc. Nat. Acad. Sci. EE.UU 86: 1087-91 (1989). Más adelante se describen los procedimientos para inactivación del gen \alpha-1,3-Gal T en cerdos a través de microinyección de óvulos con construcciones para reconocimiento génico.

I. Construcciones para reconocimiento génico

La frecuencia de recombinación homóloga en embriones se mejora si las construcciones de reconocimiento génico se preparan con ADN isogénico. Por lo tanto las construcciones para "inactivación" se preparan a través de ADN aislado del cerdo utilizado para fertilizar los oocitos usados para microinyección. Los clones para cada uno de los alelos \alpha-1,3-Gal T se identifican utilizando la longitud del fragmento de restricción para la identificación de polimorfirmo y el secuenciamiento de ADN. Las construcciones para reconocer ambos alelos se hacen interrumpiendo la secuencia de identificación del exón 9, ya sea por supresión o por inserción de un fragmento homólogo de ADN. Las construcciones contienen al menos 8 kb de ADN homólogo para promover una recombinación homóloga eficiente.

Pueden usarse varias aproximaciones para detectar los eventos de reconocimiento génico, dependiendo de las estrategias utilizadas en el diseño de las construcciones para inactivación. Varias de tales aproximaciones, y las correspondientes estrategias para la construcción de las construcciones, se suministran más abajo:

PCR de ADN genómico

El ADN homólogo sobre un costado de fragmento de ADN para interrupción, se construye para ser menor a 1 kb, permitiendo la amplificación PCR de un fragmento corto de diagnóstico. (La amplificación de fragmentos pequeños es generalmente relativamente eficiente).

b) Transcripción inversa/PCR

Se hace una supresión de alrededor de 100 bp dentro del exón 9, permitiendo la síntesis de un ARNm acortado de \alpha-1,3-Gal T en células correctamente reconocidas. El ARNm acortado se detecta por RT/PCR, utilizando iniciadores que amplifican un fragmento que se extiende desde el exón 8 y que abarcan al sitio de supresión.

c) Expresión del Gen de la Proteína Fluorescente Verde (GFP)

GFP es una proteína de la medusa bioluminiscente Aequorea visctoria. Esta absorbe luz azul (395 nm) y fluoresce para emitir luz verde (509 nm). GFP es un marcador útil para expresión génica. Chafie y colaboradores, Green Fluorescent Protein as a Marker for Gene Expresión. Science 263: 802-5 (1994). El gen \alpha-1,3-Gal T se interrumpe dentro del exón 9 por inserción en la estructura de la región de codificación GFP. La expresión del gen GFP (con fluorescencia resultante en 509 nm) es conducida por el promotor génico \alpha-1,3-Gal T en células correctamente reconocidas.

II. Generación de embriones por microinyección

Los embriones fertilizados se generan como lo describen Nottle y colaboradores, (1993). Proc. Aust. Soc. For Reproductive Biot. 26, 33. El protocolo involucra:

El esperma del cerdo que suministra el ADN para la construcción de reconocimiento se recolecta y se almacena congelado en N_{2}.

Superovulación de lechonas donantes:

Las lechonas se aparean al segundo celo, y abortan entre los días 25-40 de la gestación para sincronizar los siguientes ciclos de celo. El aborto se logra por medio de inyección intramuscular de 1 mg de cloprostenol (una prostaglandina F2\alpha análoga) seguida de una segunda inyección de 0,5 mg 24 horas después. Las lechonas superovulan por inyección de 1000 i.u. de gonadotropina coriónica equina (eCG) o de gonadotropina de suero de yegua preñada al momento de la segunda inyección de cloprostenol, y una inyección posterior 72 horas después de 500 i.u. de gonadotropina coriónica humana (hCG).

c) Fertilización

Las lechonas superovuladas se inseminan artificialmente 20-30 horas después de la inyección de hCG seguida de una segunda inseminación 2-4 horas después, con semen del cerdo que provee el ADN para la construcción de reconocimiento.

d) Recolección de Embriones

Los embriones se recolectan quirúrgicamente 50-56 horas después de la inyección de hCG antes de la fusión de los pronúcleos. Los oviductos se lavan con 15-20 ml de tampón salino de fosfato que contiene 1% de suero fetal de ternera. Los embriones unicelulares se recuperan por búsqueda en los lavados del oviducto utilizando un microscopio de baja magnificación.

III. Microinyección de embriones

Los embriones se centrifugan a 12000 x g durante 8 min para estratificar al citoplasma y permitir que los pronúcleos sean visualizados, y se mantienen en Medio Esencial Mínimo de Dulbecco con Hepes 25 mM y 5 mg/ml de albúmina de suero bovino. Los pronúcleos se inyectan, utilizando óptica de contraste de interferencia diferencial, con 4-10 picolitros de ADN (10 ng/\mul) en PBS. El reconocimiento génico con ADN isogénico se maximiza por coinyección de ambas construcciones alélicas derivadas del cerdo dentro de los pronúcleos del macho.

IV. Transferencia de los embriones inyectados a las lechonas destinatarias

Los ciclos de celo de las lechonas destinatarias se sincronizan con aquellos de las donantes. Las destinatarias se aparean y abortan usando el protocolo descrito antes, y se inyectan con 500 i.u. de eCG. Los embriones inyectados se transfieren quirúrgicamente (20-40 por oviducto) a las destinatarias en el mismo día en que ellos se recolectan de las lechonas donantes.

\newpage

V. Muestreo para recombinación homóloga

Los recombinantes homólogos pueden detectarse por medio del análisis del tejido de los lechones nacidos. Los procedimientos de muestreo involucran tecnología PCR, la estrategia precisa que depende del diseño de la construcción de reconocimiento génico. Debido a que muchas de las moléculas de ARNm de \alpha-1,3-Gal T se sintetizan a partir de un único gen \alpha-1,3- Gal T en células de expresión, la aproximación RT/PCR puede ser más sensible que la amplificación por PCR del ADN genómico. La estrategia de muestreo RT/PCR depende de la transcripción exitosa del gen interrumpido y de la relativa estabilidad del ARNm acortado.

Alternativamente, las construcciones que promueven la expresión de genes heterólogos (por ejemplo: GFP) en células correctamente reconocidas permiten el muestreo de los embriones en la etapa de blastocisto por el marcador de expresión génica (esto es: la expresión de GFP puede detectarse midiendo la fluorescencia dentro de los blastocistos a 509 nm). Los embriones microinyectados se cultivan in vitro hasta el desarrollo de los blastocistos, se muestrean por fluorescencia, y los embriones fluorescentes se transfieren a los destinatarios.

Ejemplo 17 Una variante nueva del factor de inhibición de leucemia (LIF)

Los reportes previos han demostrado la existencia de dos formas del LIF de múrido. La forma original (del transcrito D) fue expresada y comercializada por AMRAD Corporation Ltd (Kew Victoria, Australia). El producto derivado de la proteína de este transcrito (de ahora en adelante "D-LIF") es vendido comercialmente por AMRAD como "ESGRO^{TM}". Otra forma de LIF (de ahora en adelante "M-LIF") derivada de un transcrito alternativo, se describe en la Solicitud de Patente Estadounidense No. 07/994.099 y en Rathjen y colaboradores, Cell 62: 1105-14 (1990). Los presente inventores han encontrado ahora un tercer transcripto de LIF (de ahora en adelante "T-LIF") que se encuentra en las células ES y en las líneas celulares derivadas del teratocarcinoma humano, tal como las líneas celulares derivadas del teratocarcinoma GCT 27 descrito por Pera y colaboradores, Differentiation 42: 10 (1989).

La proteína LIF se la encuentra intracelularmente en contraste con las otras dos forma de LIF que son ambas extracelulares. El transcripto fue clonado utilizando la técnica RACE PCR (ver más abajo)a partir de células ES de múrido y de las líneas celulares derivadas del teratocarcinoma humano GCT 27, y secuenciado utilizando métodos estándar. La presencia del transcripto T-LIF fue confirmada por los análisis PCR del ARNm de células ES y protección RNA'ase sobre al ARN del GCT 27. El transcripto contiene un primer exón nuevo, localizado en el primer intrón del gen LIF, empalmando a las secuencias conocidas del exón 2 y del exón 3. La secuencia de nucleótidos de ratón (SEQ ID NO: 25) y la secuencia deducida de aminoácidos (SEQ ID NO: 26) se exponen en la Figura 26. La secuencia de nucleótidos humanos (SEQ ID NO: 31) y la secuencia deducida de aminoácidos (SEQ ID NO: 32) se exponen en la Figura 27.

Cuando se expresan en un sistema de expresión de células COS, el transcripto T-LIF de múrido produce una proteína de 17 kD no glicosilada (D-LIF se glicoliza en el Golgi durante el proceso de secreción) (Figura 28). La traducción de T-LIF se inicia en el primer codón de iniciación de la estructura (ATG) en el exón 2 para producir una proteína de 158 aminoácidos. La proteína es 45 aminoácidos más corta que la proteína de D-LIF no procesada, y 22 aminoácidos más corta que el producto maduro de D-LIF generado por el rompimiento de la secuencia de señal. Debido a que la proteína de T-LIF no contiene una secuencia de señal, no sale de la célula y no está glicosilada. La forma T de LIF es eficiente en la prevención de la diferenciación de las células ES en cultivo.

Métodos Clonación del ADNc por raza

El ARN citoplasmático (10 \mug) de las células Es de múrido CP1 (Bradley y colaboradores, Nature 309: 255-56 (1984) se transcribió en forma inversa a partir del oligonucleótido 5'-ACACGGTACTTGTTGGCA-3' (SEQ ID NO: 27), que se híbrida a los residuos 500-484 del ADNc del LF de múrido. Se añadió el ARN a 20 pmol de iniciador y a 2 \mul de tampón 10x para templado (Tris-HCl 500 mM (pH 8,0), MgCl_{2} 60 mM, KCl 400 mM) en un volumen total de 16 \mul, calentado a 85ºC durante 5 min, y enfriado lentamente hasta temperatura ambiente. La reacción de elongación se llevó a cabo como lo describen Forman y colaboradores. (Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU 85: 8998-9002 (1988)). El exceso de oligonucleótido fue removido por filtración en gel a través de 2 ml por una columna Sephacryl S-400 (Pharmacia) equilibrada con 0,05 x TE (TE = Tris-HCl 10 mM pH 7,6, EDTA 10 mM). Se reunieron fracciones de 50 \mul correspondientes al pico radioactivo de ADNc, se concentraron por centrifugación al vacío y se resuspendieron en 23 \mul de H_{2}O. Para la adición de una cola de nucleótidos al extremo 3' del ADNc con residuos dG, se añadieron 3 \mul de dGTP 10 mM y 6 \mul de tampón para la adición de la cola de nucleótidos 5X (Bethesda Research Laboratories) y se incubó la mezcla a 37ºC durante 60 min, y luego a 70ºC durante 15 min. Después de la precipitación con alcohol se resuspendió la plantilla ADNc en 500 \mul de H_{2}O.

La PRC fue llevada a cabo utilizando un oligonucleótido específico de LIF de ratón, 5'-TTCTGGTCCCGGGTGATATTGGTCA-3' (residuos 389-365) (SEQ ID NO: 28), y un oligonucleótido ancla, 5'-CCATGGCCTCGAGGGCC
CCCCCCCCCCCC-3' (SEQ ID NO: 29). La PCR fue realizada en un volumen final de 50 \mul que contenían 7 \mul de la plantilla de ADNc y 34 pmol de cada oligonucleótido. Las condiciones de reacción fueron las recomendadas por Perkin-Elmer Cetus, con una concentración final de MgCl_{2} de 1,5 mM. El ADN fue desnaturalizado antes de la adición de la Taq polimerasa (Perkin-Elmer Cetus) calentando la mezcla de reacción a 94ºC durante 5 min. Cada ciclo PCR (35 en total) consistió en la desnaturalización durante 2 min a 94ºC, templado durante 2 min a 55ºC, y elongación durante 3 min a 72ºC. Después del final de la elongación (30 min a 72ºC), las muestras fueron precipitadas en alcohol digeridas con SmaI y Xhol y analizadas por medio de electroforesis en gel de agarosa. Se purificó el ADN de los geles de agarosa utilizando Geneclean y se clonó en TST7 19U (Stratagene) digerido con SaII y SmaI. Los plasmido recombinantes apropiados fueron purificados por el método rápido de ebullición.

El secuenciamiento bicatenadio se realizó con Sequenase versión 2.0 (USB) de acuerdo con las recomendaciones de los fabricantes.

Ensayo biológico de la actividad de LIF

Un cultivo de células ES de múrido no diferenciado (MBL5; Pease y colaboradores, Dev. Biol. 141: 344-52 (1990), entre las pasadas 15 y 30) se tripsiniza y se convierte en una suspensión celular simple. Las células se precipitan por centrifugación y se resuspenden en Medio Celular ES completo sin LIF (DMEM (sin Hepes), 10% FCS, BME 1 mM, glutamina 1mM). Las células se siembran entonces en placas de microtitulación de 24 pozos a 5 x 10^{2} células/pozo de 16 mm que contiene 1 ml de Medio Celular ES sin LIF.

El marco de lectura abierta completa T-LIF se reconstruyó a partir del producto PCR y se insertó en el vector de expresión de las células COS, pXMT2 como lo describen Rathjen y colaboradores, Cell 62: 1105-14 (1990). El plásmido utilizado para la transfección de células COS se muestra en la Figura 29. Las células COS se transfectaron por electroporación. Los sobrenadantes de las células COS que expresan T-LIF fueron añadidos a las anteriores células ES en varias diluciones (1/5, 1/10, 1/50, 1/100, 1/500, 1/1000) y se incubaron durante 4 días en una incubadora con 10% de CO_{2}. Los controles usaron sobrenadantes de las células COS que expresan D-LIF (pDR1, Rathjen y colaboradores, Cell 62: 1105-14 (1990)).

La actividad de LIF se evaluó como presente si las células ES se parecían morfológicamente después de 4 días, y son diferentes de los controles incubados sin ninguna forma de LIF. Las células ES también se colorean por la fosfatasa alcalina cuando las células ES no diferenciadas son positivas para este marcador.

Aunque T-LIF se produce intracelularmente un número suficiente de células lisan para dar cantidades significativas de actividad de LIF en el cultivo de los sobrenadantes. Si las células COS que expresan T-LIF s lisan, se libera más actividad de LIF.

Detección por PCR del transcripto T-LIF

La PCR fue llevada a cabo sobre ADNc de células ES (preparado como se describió antes excepto por que el ADNc no fue adicionado a la cola de nucleótidos con dG). Las condiciones PCR fueron las descritas antes excepto por que se utilizó MgCl_{2} 2 mM en las reacciones se utilizaron los oligonucleótidos 5'-CACCTTTCGCTTTCCT-3' (SEQ ID NO: 30) y 5'-TTCTGGTCCCGGGTGATATTGGTCA-3' (SEQ ID NO:28) a 80 picogramos/reacción. Los productos de la reacción PCR fueron precipitados en etanol como se describió antes, separados electroforéticamente sobre gel de agarosa al 2% y transferidos a una membrana de nylon para detección utilizando hibridación Southern (Figura 30). La sonda fue el transcripto D-LIF de longitud completa aislada de pDR1 (Rathjen y colaboradores, Cell 62: 1105-14 (1990). El experimento de control se diseña para detectar todos los transcriptos LIF que utilizan iniciadores internos 5'-TTCTGGTCCCGGGTGATATTGGTCA-3' (SEQ ID NO: 28) y 5'-CTGTTGGTTCTGCACTGGA-3' (SEQ ID NO: 33).

Claims

1. Una construcción de ADN útil para inactivar al gen de la \alpha-1,3 galactosiltransferasa de porcino por la inserción de una secuencia deseada de ADN en un sitio de inserción de dicho gen, que contiene dicha secuencia deseada de ADN flanqueada por una primera y una segunda secuencias de homología siendo dichas primera y segunda secuencias de homología, respectivamente, suficientemente homólogas a la primera y segunda secuencias genómicas que flanquean a dicho sitio de inserción para permitir la recombinación homóloga de dicha construcción de ADN con dicho gen de \alpha-1,3 galactosiltransferasa de porcino cuando dicha construcción de ADN se introduce en una célula de porcino que tiene a dicho gen de \alpha-1,3 galactosiltransferasa.

2. La construcción de ADN de la reivindicación 1, en donde dicho sitio de inserción esta dentro del exón 4, exón 7, exón 8 o el exón 9 del gen de la \alpha-1,3 galactosiltransferasa de porcino.

3. La construcción de ADN de la reivindicación 1, en donde dicha secuencia deseada de ADN se selecciona del grupo que consiste del gen neo^{R}, del gen hyg^{R} y del gen timidina quinasa.

4. La construcción de ADN de la reivindicación 3, en donde dicha secuencia deseada de ADN esta limitada a los extremos 5' y 3' por los elementos FTRADN, y en donde los codones de detección para cada uno de los tres marcos de lectura han sido insertados 3' a la secuencia deseada de ADN.

5. Un método para generar una célula totipotente de mamífero no humano que tiene al menos un alelo inactivado \alpha-1,3 galactosiltransferasa, dicha célula totipotente derivada de una especie de mamífero no humano que tiene un gen funcional \alpha-1,3 galactosiltransferasa, que comprende:

proveer una pluralidad de células caracterizadas como células totipotentes de dicha especie de mamífero no humano;

introducir dentro de dichas células totipotentes una construcción de ácido nucleico efectiva para inactivar a dicho gen \alpha-1,3 galactosiltransferasa por inserción de una secuencia deseada de ADN en un sitio de inserción de dicho gen a través de recombinación homóloga; y

identificar una célula totipotente que tenga al menos un alelo inactivado \alpha-1,3 galactosiltransferasa.

6. El método de la reivindicación 5 en el cual dicha célula totipotente es una célula ES de porcino.

7. El método de la reivindicación 5 en el cual dicha célula totipotente es una PGC de porcino.

8. El método de la reivindicación 5 en el cual dicha célula totipotente es un óvulo de porcino.

9. Un método para generar un mamífero no humano que carece de un gen funcional \alpha-1,3 galactosiltransferasa, dicho mamífero no humano perteneciendo a una especie que tiene un gen funcional \alpha-1,3 galactosiltransferasa, que comprende:

proveer una célula totipotente de mamífero no humano que tiene al menos un alelo inactivado \alpha-1,3 galactosiltransferasa, dicha célula totipotente derivada de una especie de mamífero no humano que tiene un gen funcional \alpha-1,3 galactosiltransferasa;

manipular dicha célula totipotente en forma tal que los descendientes mitóticos de dicha célula constituyen el todo o parte de un embrión en desarrollo;

recuperar un neonato derivado de dicho embrión; y

levantar y criar a dicho neonato para obtener un homocigoto de mamífero no humano para dicho alelo inactivado \alpha-1,3 galactosiltransferasa.

10. El método de la reivindicación 9, en donde dicha célula totipotente es una célula ES de porcino y dicha manipulación comprende inyectar dicha célula ES en la cavidad del blastocisto de un blastocisto de porcino e implantar dicho blastocisto inyectado en una hembra destinataria porcina.

11. El método de la reivindicación 9, en donde dicha célula totipotente es una célula ES de porcino y dicha manipulación comprende inyectar dicha célula ES en una mórula de porcino.

12. El método de la reivindicación 9, en donde dicha célula totipotente es una célula ES de porcino y dicha manipulación comprende el cocultivo de dicha célula ES con una mórula de porcino rota en la zona pelúcida.

13. El método de la reivindicación 9, en donde dicha célula totipotente es una célula ES de porcino y dicha manipulación comprende la fusión de dicha célula ES con un cigoto enucleado de porcino.

14. El método de la reivindicación 9, en donde dicha célula totipotente es un óvulo de porcino, y dicha manipulación comprende implantar dicho óvulo en una hembra destinataria porcina.

15. Un mamífero no humano que carece de un gen funcional \alpha-1,3 galactosiltransferasa, dicho mamífero perteneciendo a la especia que contiene un gen funcional \alpha-1,3 galactosiltransferasa, dicho mamífero no humano producido por el método de la reivindicación 9.

16. El mamífero no humano de la reivindicación 15, en donde dicho mamífero es un cerdo.

17. Un mamífero no humano de ocurrencia no natural que carece de un gen funcional \alpha-1,3 galactosiltransferasa, dicho mamífero no humano perteneciendo a la especie que tiene un gen funcional \alpha-1,3 galactosiltransferasa.

18. El mamífero de la reivindicación 17 en donde dicho mamífero es un cerdo.