ES2247591T3 - Proteasa-3 y 4 de apoptosis similares a la enzima conversora de interleuquina-1 beta. - Google Patents
Proteasa-3 y 4 de apoptosis similares a la enzima conversora de interleuquina-1 beta.Info
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Abstract
SE DESCRIBE INTERLEUKINA-1 BE HUMANA QUE CONVIERTE UNA ENZIMA EN PROTEASAS 3 Y 4 DE APOPTOSIS Y ADN (ARN) QUE CODIFICA DICHOS POLIPEPTIDOS. TAMBIEN SE PROPORCIONA UN PROCEDIMIENTO PARA PRODUCIR DICHOS POLIPEPTIDOS MEDIANTE TECNICAS RECOMBINANTES Y ANTICUERPOS Y ANTAGONISTAS CONTRA DICHOS POLIPEPTIDOS. TAMBIEN SE PROPORCIONAN METODOS DE UTILIZACION DE LOS POLIPEPTIDOS, POR EJEMPLO, COMO UN AGENTE ANTITUMORAL, Y AGENTE ANTIVIRAL, Y ANTICUERPOS Y ANTAGONISTAS CONTRA DICHOS POLIPEPTIDOS POR EJEMPLO, PARA TRATAR LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER, LA ENFERMEDAD DE PARKINSON, ARTRITIS REUMATOIDE Y LESIONES EN LA CABEZA. TAMBIEN SE DESCRIBEN ENSAYOS DE DIAGNOSTICO PARA IDENTIFICAR MUTACIONES EN UNA SECUENCIA DE ACIDO NUCLEICO QUE CODIFICA UN POLIPEPTIDO DE LA PRESENTE INVENCION Y PARA DETECTAR NIVELES ALTERADOS DEL POLIPEPTIDO DE LA PRESENTE INVENCION PARA DETECTAR ENFERMEDADES.
Description
Proteasa-3 y 4 de apoptosis
similares a la enzima conversora de interleuquina-1
\beta.
Esta invención se refiere a polinucleótidos
recientemente identificados, polipéptidos codificados por estos
polinucleótidos, el uso de estos polinucleótidos y polipéptidos,
así como la producción de estos polinucleótidos y polipéptidos. Más
en particular, los polipéptidos de la presente invención son la
proteasa 3 de apoptosis similar a la enzima conversora de la
interleuquina-1 \beta y la proteasa 4 de apoptosis
similar a la enzima conversora de la
interleuquina-1 \beta, algunas veces denominado en
lo sucesivo de forma colectiva como
"ICE-LAP-3 y 4". La invención
también se refiere a la inhibición de la acción de estos
polipéptidos.
Recientemente se ha descubierto que una enzima
conversora de interleuquina-1 \beta (ICE) es
responsable de la escisión de
pro-IL-1\beta en
IL-1\beta madura y activa y también es responsable
de la muerte celular programada (o apoptosis), que es un proceso a
través del cual los organismos eliminan las células no deseadas. La
presente invención se refiere a
ICE-LAP-3 y 4, que están
estructuralmente relacionadas con ICE.
En el nematodo Caenorhabditis elegans, se
ha identificado una ruta genética de muerte celular programada
(Ellis, R.E., y col. Annu. Rev. Cell Biol. 7:663-698
(1991)). Dos genes, ced-3 y
ced-4, son esenciales para que las células de
C. elegans experimenten muerte celular programada (Ellis,
H.M. y Horvitz, H.R. Cell, 44:817-829 (1986)). Las
mutaciones recesivas que eliminan la función de estos dos genes
previenen la muerte celular programada normal durante el desarrollo
de C. elegans. El equivalente en vertebrados conocido de la
proteína ced-3 es ICE. La identidad total de
aminoácidos entre ced-3 e ICE es del 28%, con
una región de 115 aminoácidos (restos 246-360 de
ced-3 y 164-278 de ICE) que
muestra la identidad más alta (43%). Esta región contiene un
pentapéptido conservado, QACRG (restos 356-360 de
ced-3), que contiene una cisteína conocida
por ser esencial para la función de ICE. Los polipéptidos
ICE-LAP-1 y 2 de la presente
invención también tienen el mismo pentapéptido conservado y el
resto de cisteína que es esencial para la función de ICE.
La similitud entre ced-3 e
ICE no sólo sugiere que ced-3 podría
funcionar como una cisteína proteasa sino también que ICE podría
actuar como un gen de muerte celular programada de vertebrados.
ced-3 y el equivalente en vertebrados, ICE,
controlan la muerte celular programada durante el desarrollo
embrionario (Gagliarnini, V. y col., Science,
263:826-828 (1994).
Se ha detectado ARNm de ICE en una diversidad de
tejidos, incluyendo monocitos de sangre periférica, linfocitos de
sangre periférica, neutrófilos de sangre periférica, linfocitos T
de sangre periférica en reposo o activados, placenta, la línea
celular linfoblastoide B CB23 y las células de la línea celular de
leucemia monocítica THP-1 (Cerretti, D.P. y col.,
Science, 256:97-100 (1992)), sugiriendo que ICE
puede tener un sustrato adicional además de
pro-IL-1\beta. Actualmente se
desconoce el sustrato sobre el cual actúa ICE para causar la muerte
celular. Una posibilidad es que pueda existir un homólogo del gen
de muerte celular ced-4 de C. elegans
en vertebrados. De forma alternativa, ICE podría causar
directamente la muerte celular escindiendo proteolíticamente
proteínas que son esenciales para la viabilidad celular.
Se ha encontrado que el gen
bcl-2 de mamíferos protege las células
inmunes denominadas linfocitos del suicidio celular. También,
crmA, un producto protéico del gen del virus de la viruela
de la vaca inhibe la actividad de escisión de la proteína ICE.
De acuerdo con un aspecto de la presente
invención, se proporcionan nuevos polipéptidos maduros, así como
fragmentos, análogos y derivados de los mismos biológicamente
activos y diagnóstica o terapéuticamente útiles. El polipéptido de
la presente invención es de origen humano.
De acuerdo con otro aspecto de la presente
invención, se proporcionan moléculas de ácido nucleico aisladas que
codifican para un polipéptido de la presente invención incluyendo
ARNm, ADN, ADNc, ADN genómico así como análogos y fragmentos de los
mismos biológicamente activos y diagnóstica o terapéuticamente
útiles.
De acuerdo aún con otro aspecto adicional de la
presente invención, se proporcionan procedimientos para producir
estos polipéptidos por técnicas recombinantes que comprenden
cultivar células hospedadoras recombinantes procarióticas y/o
eucarióticas, que contienen una secuencia de ácido nucleico que
codifica un polipéptido de la presente invención, en condiciones
que promueven la expresión de dicha proteína y la posterior
recuperación de dicha proteína.
De acuerdo aún con otro aspecto adicional de la
presente invención, se proporciona un procedimiento para utilizar
estos polipéptidos, o polinucleótido que codifica para estos
polipéptidos con fines terapéuticos, por ejemplo, como un agente
antiviral, un agente antitumoral y para controlar el desarrollo
embrionario y la homeostasis tisular.
De acuerdo aún con otro aspecto adicional de la
invención, también se proporcionan sondas de ácido nucleico que
comprenden moléculas de ácido nucleico de longitud suficiente para
hibridar de forma específica con una secuencia de ácido nucleico de
la presente invención.
De acuerdo aún con un aspecto adicional de la
presente invención, se proporcionan anticuerpos contra estos
polipéptidos.
De acuerdo aún con otro aspecto de la presente
invención, se proporcionan antagonistas de estos polipéptidos, que
pueden usarse para inhibir la acción de estos polipéptidos, por
ejemplo, en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer,
enfermedad de Parkinson, artritis reumatoide, choque séptico y
lesiones de cabeza.
De acuerdo aún con otro aspecto de la presente
invención, se proporcionan ensayos diagnósticos para detectar
enfermedades o susceptibilidad a enfermedades relacionadas con
mutaciones en las secuencias de ácidos nucleicos que codifican para
un polipéptido de la presente invención.
De acuerdo aún con otro aspecto adicional de la
presente invención, se proporciona un procedimiento para utilizar
estos polipéptidos, o polinucleótidos que codifican para estos
polipéptidos, para fines in vitro relacionados con la
investigación científica, por ejemplo, síntesis de ADN y
fabricación de vectores de ADN.
Estos y otros aspectos de la presente invención
serán obvios para los expertos en la materia a partir de los
contenidos de este documento.
Los siguientes dibujos son ilustrativos de las
realizaciones de la invención y no tienen la intención de limitar
el alcance de la invención según se abarca en las
reivindicaciones.
La figura 1 muestra el ADNc y la correspondiente
secuencia de aminoácidos deducida de
ICE-LAP-3. El polipéptido codificado
por la secuencia de aminoácidos mostrada es la forma madura probable
del polipéptido (sin el resto inicial de metionina) y se usa la
abreviatura convencional de una letra para los aminoácidos.
La figura 2 muestra el ADNc y la correspondiente
secuencia de aminoácidos deducida de
ICE-LAP-4. El polipéptido codificado
por la secuencia de aminoácidos mostrada es la forma madura probable
del polipéptido (sin el resto inicial de metionina).
La figura 3 muestra una comparación de secuencia
de aminoácidos entre ICE-LAP-3,
ICE-LAP-4, ICE humana y el gen de
muerte celular de C. elegans ced-3. Las áreas
sombreadas representan coincidencias de aminoácidos entre las
diferentes secuencias.
De acuerdo con un aspecto de la presente
invención, se proporcionan ácidos nucleicos aislados
(polinucleótidos) que codifican para los polipéptidos maduros que
tienen las secuencias de aminoácidos deducidas de las figuras 1 y 2
(ID SEC Nº 2 y 4, respectivamente) o para el polipéptido maduro
codificado por el ADNc de los clones depositados como Depósitos de
la ATCC Nº 75875 y 75873. El Depósito de la ATCC Nº 75875 contiene
en ADNc que codifica ICE-LAP-3 y el
Depósito de la ATCC Nº 75873 contiene el ADNc que codifica para
ICE-LAP-4. El depósito se hizo el 25
de agosto de 1994.
El polinucleótido que codifica para
ICE-LAP-3 puede detectarse en
próstata humana, tumor de endometrio humano, tumor pancreático
humano, tumor de la glándula adrenal humana y amígdala humana. La
ICE-LAP-3 codificada de longitud
completa se descubrió en una biblioteca de ADNc derivada de tumor
de endometrio humano. Estructuralmente está relacionada con la
familia de la enzima conversora de
interleuquina-1\beta. Contiene un marco de lectura
abierto que codifica para una proteína de aproximadamente 341
restos de aminoácidos. La proteína muestra el mayor grado de
homología con el gen de muerte celular de C. elegans
ced-3 que es un homólogo de la enzima conversora de
interleuquina-1\beta humana, con el 68% de
similitud y el 43% de identidad sobre la secuencia de aminoácidos
completa. Debe señalarse que el pentapéptido QACRG está conservado
y se localiza en la posición de aminoácidos
259-263.
El polipéptido que codifica para
ICE-LAP-4 se descubrió en una
biblioteca de ADNc derivado de amígdalas humanas. Ésta relacionado
estructuralmente con la familia ICE. Contiene un marco de lectura
abierto que codifica para una proteína de aproximadamente 277
restos de aminoácidos. La proteína muestra el mayor grado de
homología con el gen de muerte celular de C. elegans
ced-3 con el 29% de identidad y el 46% de
similitud sobre una extensión de 277 aminoácidos. También es
importante el que el pentapéptido QACRG está conservado y se
localiza en la posición amino 161-165.
Los polinucleótidos de la presente invención
pueden estar en forma de ARN o en forma de ADN, incluyendo éste
último ADNc, ADN genómico y ADN sintético. El ADN puede ser de
doble cadena o de cadena sencilla, y si es de cadena sencilla puede
ser la cadena codificadora o la cadena no codificadora
(antisentido). La secuencia codificadora que codifica los
polipéptidos maduros puede ser idéntica a la secuencia codificadora
mostrada en las figuras 1 y 2 (ID SEC Nº 1 y 3) o a la de los clones
depositados, o puede ser una secuencia codificadora diferente cuya
secuencia codificadora, como resultado de la redundancia o de la
degeneración del código genético, codifique para los mismos
polipéptidos maduros y derivados de los mismos, como el ADN de las
figuras 1 y 2 (ID SEC Nº 1 y 3) o el ADNc depositado.
Los polinucleótidos que codifican para los
polipéptidos maduros de las figuras 1 y 2 (ID SEC Nº 2 y 4) o los
polipéptidos maduros codificados por los ADNc depositados pueden
incluir: sólo la secuencia que codifica el polipéptido maduro; la
secuencia que codifica para el polipéptido maduro y la secuencia
codificadora adicional; la secuencia que codifica para el
polipéptido maduro (y opcionalmente secuencia codificadora
adicional) y la secuencia no codificadora, tal como intrones o
secuencias no codificadoras 5' y/o 3' de la secuencia que codifica
para el polipéptido maduro.
De este modo, la expresión "polinucleótido que
codifica para un polipéptido" abarca un polinucleótido que
incluye sólo la secuencia que codifica para el polipéptido así como
un polinucleótido que incluye secuencia adicional codificadora y/o
no codificadora.
La presente invención además se refiere a
variantes de los polinucleótidos descritos anteriormente en este
documento, que codifican para fragmentos de los polipéptidos que
tienen la secuencia de aminoácidos deducida de las figuras 1 y 2 (ID
SEC Nº 2 y 4) o los polipéptidos codificados por el ADNc de los
clones depositados.
De este modo, la presente invención incluye
polinucleótidos que codifican para los mismos polipéptidos maduros
que se muestran en las Figuras 1 y 2 (ID SEC Nº 2 y 4) o los mismos
polipéptidos maduros codificados por el ADNc de los clones
depositados, así como variantes de estos polinucleótidos cuyas
variantes codifican un fragmento de los polipéptidos de las figuras
1 y 2 (ID SEC Nº 2 y 4) o los polipéptidos codificados por el ADNc
de los clones depositados.
Los polinucleótidos de la presente invención
también pueden tener la secuencia codificadora fusionada en el
mismo marco de lectura con una secuencia que permite la
purificación del polipéptido de la presente invención. La secuencia
marcadora puede ser una etiqueta de hexahistidina suministrada por
un vector pQE-9 para asegurarse de la purificación
de los polipéptidos maduros fusionados con el marcador en el caso
de un hospedador bacteriano o, por ejemplo, la secuencia marcadora
puede ser una etiqueta de hemaglutinina (HA) cuando se usa un
hospedador de mamíferos, por ejemplo, células
COS-7. La etiqueta HA se corresponde con un epítope
derivado de la proteína hemaglutinina de influenza (Wilson, I., y
col., Cell, 37:767 (1984)).
El término "gen" se refiere al segmento de
ADN implicado en la producción de una cadena de polipéptido;
incluye regiones que preceden y siguen a la región codificadora
(líder y remolque) así como secuencias intermedias (intrones) entre
los segmentos codificadores individuales (exones).
Los fragmentos de los genes de longitud completa
de la presente invención pueden usarse como una sonda de
hibridación en una biblioteca de ADNc para aislar el gen de
longitud completa y para aislar otros genes que tienen una alta
similitud de secuencia con el gen o actividad biológica similar.
Las sondas de este tipo tienen preferiblemente al menos 30 bases y
pueden contener, por ejemplo, 50 bases o más. La sonda también puede
usarse para identificar un clon de ADNc correspondiente a un
transcrito de longitud completa y un clon o clones genómicos que
contienen el gen completo incluyendo las regiones reguladoras y
promotoras, exones e intrones. Un ejemplo de una selección
comprende aislar la región codificadora del gen usando la secuencia
de ADN conocida para sintetizar una sonda oligonucleotídica. Los
oligonucleótidos marcados que tienen una secuencia complementaria a
la del gen de la presente invención se usan para seleccionar una
biblioteca de ADNc, ADN genómico o ARNm humano para determinar con
que miembro de la biblioteca hibrida la sonda.
La presente invención se refiere, además, a
polinucleótidos que hibridan con las secuencias descritas
anteriormente en este documento si la identidad entre la secuencias
es de al menos el 70%, preferiblemente al menos el 90% y más
preferiblemente al menos el 95%. La presente invención se refiere
especialmente a polinucleótidos que hibridan en condiciones
astringentes con los polinucleótidos descritos anteriormente en este
documento. Según se usa en este documento, la expresión
"condiciones astrigentes" significa que la hibridación se
produciría sólo si hay una identidad entre las secuencias de al
menos el 95% y preferiblemente al menos el 97%. Los polinucleótidos
que hibridan con los polinucleótidos descritos anteriormente en
este documento en una realización preferida codifican para
polipéptidos que retienen sustancialmente la misma función
biológica o actividad que el polipéptido maduro codificado por los
ADNc de las figuras 1 y 2 (ID SEC Nº 1 y 3) o el o los ADNc
depositados.
De forma alternativa, el polinucleótido puede
tener al menos 20 bases, preferiblemente 30 bases y mas
preferiblemente al menos 50 bases que hibridan con un
polinucleótido de la presente invención y que tiene una identidad
con la misma, como se describe anteriormente en este documento, y
que puede o no retener la actividad. Por ejemplo, estos
polinucleótidos pueden emplearse como sondas para el
polinucleótido, de la ID SEC Nº 1 y 3, por ejemplo, para recuperar
el polinucleótido o como una sonda diagnóstica o como un cebador de
PCR.
De este modo, la presente invención se dirige a
polinucleótidos que tienen al menos un 70% de identidad,
preferiblemente al menos el 90% y más preferiblemente al menos un
95% de identidad con un polinucleótido que codifica el polipéptido
de la ID SEC Nº 2 y 4 así como fragmentos de los mismos, teniendo
estos fragmentos al menos 30 bases y preferiblemente al menos 50
bases y a polipéptidos codificados por estos polinucleótidos.
El o los depósitos referidos en este documento se
mantendrán bajo los términos del Tratado de Budapest en el
Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos con
fines de Procedimiento de Patente. Estos depósitos solamente se
proporcionan para conveniencia de los expertos en la materia y no
son un reconocimiento de que se requiere un depósito bajo la 35
U.S.C. \NAK112. La secuencia de los polinucleótidos contenida en
los materiales depositados, así como la secuencia de aminoácidos de
los polipéptidos codificados por ésta, se incorporan en este
documento como referencia y se regula en el caso de cualquier
conflicto con cualquier descripción de secuencias en este documento.
Puede necesitarse una licencia para fabricar, usar o vender los
materiales depositados y en este documento no se concede esta
licencia.
\newpage
La presente invención se refiere, además, a los
polipéptidos ICE-LAP-3 y 4 que
tienen las secuencias de aminoácidos deducidas de las figuras 1 y 2
(ID SEC Nº 2 y 4) o que tienen la secuencia de aminoácidos
codificada por los ADNc depositados, así como a fragmentos de estos
polipéptidos.
El término "fragmento", cuando se refiere a
los polipéptidos de las figuras 1 y 2 (ID SEC Nº 2 y 4) o a los
codificados por los ADNc depositados, se refiere a polipéptidos que
esencialmente retienen la misma función biológica o actividad de
estos polipéptidos.
Los polipéptidos de la presente invención pueden
ser polipéptidos recombinantes, polipéptidos naturales o
polipéptidos sintéticos, preferiblemente polipéptidos
recombinantes.
El fragmento de los polipéptidos de las figuras 1
y 2 (ID SEC Nº 2 y 4) o los codificados por los ADNc depositados
puede ser (i) uno en el que se sustituyen uno o más restos de
aminoácidos por un resto de aminoácido conservado o no conservado
(preferiblemente un resto de aminoácido conservado) y este resto de
aminoácido sustituido puede estar o no codificado por el código
genético o (ii) uno en el que uno o más restos de aminoácidos
incluyen un grupo sustituyente o (iii) uno en el que el polipéptido
maduro se fusiona con otro compuesto, tal como un compuesto que
aumenta la vida media del polipéptido (por ejemplo,
polietilénglicol) o (iv) uno en que los aminoácidos adicionales se
fusionan con el polipéptido maduro para la purificación del
polipéptido maduro. Se estima que estos fragmentos, derivados y
análogos están dentro del alcance de los expertos en la materia a
partir de los contenidos de este documento.
Los polipéptidos y polinucleótidos de la presente
invención preferiblemente se proporcionan en forma aislada, y
preferiblemente se purifican hasta homogeneidad. El término
"aislado" se refiere a que el material se saca de su ambiente
original (por ejemplo, el ambiente natural si es de origen
natural). Por ejemplo, un polinucleótido o polipéptido de origen
natural presente en un animal vivo no está aislado, pero el mismo
polinucleótido o polipéptido, separado de parte o todos los
materiales coexistentes en el sistema natural está aislado. Estos
polinucleótidos pueden ser parte de un vector y/o estos
polinucleótidos o polipéptidos pueden ser parte de una composición y
continuar aislados, en el sentido de que este vector o composición
no es parte de su ambiente natural.
Los polipéptidos de la presente invención
incluyen el polipéptido de ID SEC Nº 2 y 4 (en particular el
polipéptido maduro) así como polipéptidos que tienen al menos el
70% de similitud (preferiblemente al menos el 70% de identidad) con
el polipéptido de la ID SEC Nº 2 y 4 y más preferiblemente al menos
el 90% de similitud (más preferiblemente al menos el 90% de
identidad) con el polipéptido de las ID SEC Nº 2 y 4, y aún más
preferiblemente al menos el 95% de similitud (aún más
preferiblemente al menos el 95% de identidad) con el polipéptido de
las ID SEC Nº 2 y 4 y también incluyen porciones de estos
polipéptidos que contienen generalmente al menos 30 aminoácidos y
más preferiblemente al menos 50 aminoácidos.
Como es conocido en la técnica la
"similitud" entre dos polipéptidos se determina comparando la
secuencia de aminoácidos y sus aminoácidos conservados sustituidos
de un polipéptido con la secuencia de un segundo polipéptido.
Pueden emplearse fragmentos o porciones de los
polipéptidos de la presente invención para producir el
correspondiente polipéptido de longitud completa mediante síntesis
peptídica; por lo tanto, pueden emplearse los fragmentos como
intermedios para producir los polipéptidos de longitud completa.
Pueden usarse fragmentos o porciones de los polinucleótidos de la
presente invención para sintetizar polinucleótidos de longitud
completa de la presente invención.
La presente invención también se refiere a
vectores que incluyen polinucleótidos de la presente invención,
células hospedadoras que se modifican genéticamente con vectores de
la invención y la producción de polipéptidos de la invención por
técnicas de recombinación.
Las células hospedadoras se modifican
genéticamente (transducidas, transformadas o transfectadas) con los
vectores de esta invención que puede ser, por ejemplo, un vector de
clonación o un vector de expresión. El vector puede estar, por
ejemplo, en forma de un plásmido, una partícula vírica, un fago,
etc. Las células hospedadoras genéticamente modificadas pueden
cultivarse en medios nutritivos convencionales modificados de forma
apropiada para activar promotores, seleccionar transformantes o
amplificar los genes ICE-LAP-3 y 4.
Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares,
son las usadas previamente con la célula hospedadora seleccionada
para la expresión, y serán obvias para el experto en la materia.
Los polinucleótidos de la presente invención
pueden emplearse para producir polipéptidos por técnicas de
recombinación. De este modo, por ejemplo, el polinucleótido puede
incluirse en cualquiera de una diversidad de vectores de expresión
para expresar un polipéptido. Estos vectores incluyen secuencias de
ADN cromosómico, no cromosómico y sintético, por ejemplo, derivados
de SV40; plásmidos bacterianos; ADN de fago; baculovirus; plásmidos
de levaduras; vectores derivados de combinaciones de plásmidos y
ADN de fago, ADN viral tal como vaccinia, adenovirus, virus de la
viruela de las aves de corral y pseudorrabias. Sin embargo, puede
usarse cualquier otro vector siempre que se replique y sea viable
en el hospedador.
La secuencia apropiada de ADN puede insertarse
en el vector por una diversidad de procedimientos. En general, la
secuencia de ADN se inserta en un sitio o sitios de endonucleasa de
restricción apropiados por procedimientos conocidos en la técnica.
Se estima que estos y otros procedimientos están dentro del alcance
de los expertos en la materia.
La secuencia de ADN en el vector de expresión se
une de forma operativa con una secuencia o secuencias de control de
expresión apropiadas (promotor) para dirigir la síntesis del ARNm.
Como ejemplos representativos de estos promotores pueden
mencionarse: las LTR de retrovirus, por ejemplo, promotores de VSR,
VIH, HTLVI, CMV o SV40, el lac o trp de E.
coli, el promotor P_{L} del fago lambda y otros promotores
conocidos que controlan la expresión de genes en células
procarióticas o eucarióticas o en sus virus. Sin embargo, también
pueden usarse señales celulares, por ejemplo, el promotor de la
actina \beta humana. El vector de expresión puede contener un
sitio de unión al ribosoma para el inicio de la traducción y un
terminador de la transcripción. El vector también puede incluir
secuencias apropiadas para amplificar el número de copias del
gen.
Además, los vectores de expresión preferiblemente
contienen uno o más genes marcadores seleccionables para
proporcionar un rasgo fenotípico para la selección de células
hospedadoras transformadas tal como resistencia a la dihidrofolato
reductasa o a neomicina para cultivos de células eucarióticas o
tales como resistencia a tetraciclina o a ampicilina en E.
coli.
Puede emplearse el vector que contiene la
secuencia de ADN apropiada como se ha descrito anteriormente en
este documento, así como una secuencia promotora o de control
apropiada, para transformar un hospedador apropiado y permitir al
hospedador expresar la proteína.
Como ejemplos representativos de hospedadores
apropiados, pueden mencionarse: células bacterianas, tales como
E. coli, Bacillus subtilis, Streptomyces, Salmonella
typhimurium; células fúngicas, tales como levaduras; células de
insectos tales como Drosophila y Spodoptera Sf9;
adenovirus; células animales tales como CHO, COS, HEK 293 o
melanoma Bowes; células vegetales, etc. Se estima que la selección
de un hospedador apropiado está dentro del alcance de los expertos
en la materia a partir de los contenidos de este documento.
Más en particular, la presente invención también
incluye construcciones recombinantes que comprenden una o más de las
secuencias ampliamente descritas anteriormente. Las construcciones
comprenden un vector, tal como un plásmido o un vector viral,
dentro del cual se ha insertado una secuencia, en orientación
directa o inversa. En un aspecto preferido de esta realización, la
construcción además comprende secuencias reguladoras, incluyendo,
por ejemplo, un promotor unido de forma operativa a la secuencia.
Los expertos en la materia conocen un gran número de vectores y
promotores adecuados que están disponibles en el mercado. A modo de
ejemplo, se proporcionan los siguientes vectores Bacterianos:
pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pbs, pD10,
phagescript, psiX174, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16a, pNH18A,
pNH46A (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3,
pKKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia). Eucarióticos:
pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene), pSVK3, pBPV; pMSG,
pSVL (Pharmacia). Sin embargo, puede usarse cualquier otro plásmido
o vector siempre que se replique y sea viable en el hospedador.
Las regiones promotoras pueden seleccionarse a
partir de cualquier gene deseado usando vectores CAT (cloranfenicol
transferasa) u otros vectores con marcadores seleccionables. Dos
vectores apropiados son pKK232-8 y pCM7. Los
promotores bacterianos especialmente mencionados incluyen lacl,
lacZ, T3, T7, gpt, lambda P_{R}, P_{L} y trp. Los promotores
eucarióticos incluyen el promotor inmediatamente temprano de CMV,
timidina quinasa de VHS, los promotores temprano y tardío de SV40,
las LTR de retrovirus y metalotionina-I de ratón.
La selección del vector y del promotor apropiado está dentro del
nivel del experto en la materia.
En una realización particular, la presente
invención se refiera a células hospedadoras que contienen las
construcciones descritas anteriormente. La célula huésped puede ser
una célula eucariótica superior, tal como una célula de mamífero, o
una célula eucariótica inferior, tal como una célula de levadura, o
la célula hospedadora puede ser una célula procariótica, tal como
una célula bacteriana. La introducción de la construcción en la
célula hospedadora puede efectuarse mediante transfección con
fosfato cálcico, transfección mediada con
DEAE-Dextrano, lipofección o electroporación (Davis,
L., Dibner, M. Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology,
(1986)).
Las construcciones en células hospedadoras pueden
usarse de manera convencional para producir el producto génico
codificado por la secuencia recombinante. De forma alternativa, los
polipéptidos de la invención puede producirse de forma sintética
por sintetizadores de péptidos convencionales.
Las proteínas maduras pueden expresarse en
células de mamífero, levaduras, bacterias u otras células bajo el
control de promotores apropiados. Pueden también emplearse los
sistemas de traducción sin células para producir estas proteínas
usando ARN derivados de las construcciones de ADN de la presente
invención. Los vectores de clonación y expresión apropiados para su
uso con hospedadores procarióticos y eucarióticos se describen en
Sambrook y col., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Segunda
Edición, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), cuya descripción se
incorpora en este documento como referencia.
La transcripción de ADN que codifica los
polipéptidos de la presente invención por eucariotas superiores se
aumenta insertando una secuencia potenciadora en el vector. Los
potenciadores son elementos de ADN que actúan en cis, normalmente de
aproximadamente 10 a 300 pb que actúan sobre un promotor aumentado
su transcripción. Los ejemplos incluyen el potenciador de SV40 en
el último sitio del origen de replicación de 100 a 270 pb, un
potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador
de polioma del sitio retrasado del origen de replicación y
potenciadores de adenovirus.
\newpage
En general, los vectores de expresión
recombinante incluirán orígenes de replicación y marcadores
seleccionables que permitan la transformación de la célula
hospedadora, por ejemplo, el gen de resistencia a ampicilina del gen
TRP1 de E. coli y S. cerevisiae y un promotor
derivado de un gen altamente expresado para dirigir la transcripción
de una secuencia estructural secuencia abajo. Estos promotores
puede derivar de operones que codifican enzimas glicolíticas tales
como 3-fosfoglicerato quinasa (PGK), factor
\alpha, fosfatasa ácida o proteínas de choque térmico, entre
otros. La secuencia estructural heteróloga se ensambla en una fase
apropiada con las secuencias de inicio y terminación de la
traducción, y preferiblemente, una secuencia líder capaz de dirigir
la secreción de la proteína traducida al espacio periplásmico o al
medio extracelular. De forma opcional, la secuencia heteróloga
puede codificar una proteína de fusión que incluye un péptido de
identificación del extremo N-termina que imparte o
da características deseadas, por ejemplo estabilización o
purificación simplificada del producto recombinante expresado.
Los vectores de expresión útiles de uso en
bacterias se construyen insertando una secuencia de ADN estructural
que codifica una proteína deseada junto con señales de iniciación y
terminación de traducción adecuadas en fase de lectura operativa
con un promotor funcional. El vector comprenderá uno o más
marcadores fenotípicos seleccionables y un origen de replicación
para asegurar el mantenimiento del vector y para, si se desea,
proporcionar la amplificación en el hospedador. Entre los
hospedadores procarióticos adecuados se incluyen E. coli,
Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium y diversas especies
de los géneros Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus,
aunque también pueden emplearse otros como elección.
Como ejemplo representativo pero no limitante,
los vectores de expresión útiles para su uso en bacterias pueden
comprender un marcador seleccionable y un origen de replicación
bacteriano derivados de plásmidos disponibles en el mercado que
comprende elementos genéticos del vector de clonación bien conocido
pBR322 (ATCC 37017). Estos vectores comerciales incluyen, por
ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals,
Uppsala, Sweden) y GEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, USA). Estas
secciones del "esqueleto" de pBR322 se combinan para ser
expresados con un promotor apropiado y la secuencia
estructural.
Tras transformar una cepa del hospedador adecuada
y crecer la cepa del hospedador hasta una densidad celular
apropiada, se induce el promotor seleccionable por medios
apropiados (por ejemplo, cambio de temperatura o inducción química)
y las células se cultivan durante un período adicional.
Las células se recogen típicamente por
centrifugación, se lisan por medios físicos o químicos y se retiene
el extracto en bruto resultante para su purificación adicional.
Las células microbianas empleadas en la expresión
de proteínas pueden lisarse por cualquier procedimiento
conveniente, incluyendo ciclos de congelación y descongelación,
sonicación, rotura mecánica o uso de agentes de lisis celular, estos
procedimientos son bien conocidos por los expertos en la
materia.
También pueden emplearse sistemas de cultivo de
diversas células de mamíferos para expresar la proteína
recombinante. Los ejemplos de sistemas de expresión de mamíferos
incluyen las líneas COS-7 de fibroblastos de riñón
de mono, descritos por Gluzman, Cell, 23:175 (1981) y otras líneas
celulares capaces de expresar un vector compatible, por ejemplo,
las líneas celulares C127, 3T3, CHO, HeLa y BHK. Los vectores de
expresión de mamíferos pueden comprender un origen de replicación,
un promotor y potenciador adecuados, un sitio de poliadelinación,
sitios de donadores y aceptores de ayuste, secuencias de
terminación de la transcripción y secuencias no transcritas
flanqueantes 5'. También pueden usarse secuencias de ADN derivadas
de los sitios de ayuste y poliadelinación de SV40 para proporcionar
los elementos génicos no transcritos requeridos.
Los polipéptidos
ICE-LAP-3 e
ICE-LAP-4 pueden recuperarse y
purificarse a parir de cultivos de células recombinantes por
procedimientos que incluyen precipitación con sulfato amónico o
etanol, extracción ácida, cromatografía de intercambio aniónico o
catiónico, cromatografía en fosfocelulosa, cromatografía de
interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía en
hidroxilapatita y cromatografía en lecitina. Pueden usarse, si son
necesarias, etapas de replegamiento de proteínas para completar la
configuración de la proteína madura. Finalmente, puede emplearse
cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para las etapas de
purificación final.
Los polipéptidos de la presente invención pueden
ser un producto natural purificado, un producto de procedimientos
sintéticos químicos o producido por técnicas de recombinación a
partir de un hospedador procariótico o eucariótico (por ejemplo,
por células bacterianas, de levaduras, de plantas superiores y de
mamífero en cultivo). Dependiendo del hospedador empleado en un
procedimiento de producción de recombinación, los polipéptidos de la
presente invención pueden estar o no glicosilados. Los polipéptidos
de la invención también pueden incluir un resto del aminoácido
metionina inicial.
Los polipéptidos
ICE-LAP-3 y 4 pueden emplearse para
tratar la muerte celular programada controlada de forma anómala. La
muerte celular programada controlada de forma anómala puede ser una
causa subyacente de cánceres debido a la tasa anómala de
crecimiento celular. Por lo tanto, puesto que los genes
ICE-LAP están implicados en la muerte celular
programada, pueden usarse para dirigirse a células no deseadas, por
ejemplo, células cancerígenas. También pueden usarse los
polipéptidos ICE-LAP-3 y 4 para
controlar el desarrollo de vertebrados y la homeostasis tisular,
debido a su capacidad apoptótica. Los polipéptidos
ICE-LAP-3 y 4 también se pueden usar
para superar muchas infecciones virales superando la supresión de
la muerte celular programada, ya que la muerte celular programada
puede ser uno de los mecanismos principales de defensa antiviral de
las células.
También pueden emplearse
ICE-LAP-3 y 4 para tratar trastornos
relacionados con la inmunodepresión, tales como SIDA, dirigiendo
las células infectadas por virus hacia la muerte celular.
La presente invención se refiere además a un
proceso de selección de compuestos para identificar antagonistas de
los polipéptidos ICE-LAP-3 y 4 de la
presente invención. Un ejemplo de este ensayo comprende la
combinación de ICE-LAP-3 y 4 y un
compuesto agonista potencial con su sustrato en condiciones que
permitan la acción del sustrato y determinar si el compuesto
previene la escisión del sustrato por
ICE-LAP-3 ó 4.
Los antagonistas potenciales incluyen un
anticuerpo, o en algunos casos, un oligopéptido, que se une al
polipéptido. De forma alternativa, un antagonista potencial puede
ser una proteína estrechamente relacionada que se une al sustrato,
sin embargo, son formas inactivas del polipéptido y por tanto,
previenen la acción del polipéptido de la presente invención.
Otro antagonista potencial es una construcción
antisentido preparada usando tecnología antisentido. La tecnología
antisentido puede usarse para controlar la expresión génica por
medio de la formación de triple hélice o de ADN o ARN antisentido,
ambos procedimientos se basan en la unión de un polinucleótido al
ADN o ARN. Por ejemplo, la porción codificadora 5' de la secuencia
polinucleotídica, que codifica para los polipéptidos maduros de la
presente invención, se usa para diseñar un oligonucleótido de ARN
antisentido de aproximadamente 10 a 40 pares de bases de longitud.
Se diseña un oligonucleótido de ADN que sea complementario de una
región del gen implicada en la transcripción (triple hélice, véase
Lee y col., Nucl. Acids Res., 6:3073 (1979); Cooney y col.,
Science, 241:456 (1988) y Dervan y col., Science, 251: 1360 (1991)),
previniendo así la transcripción y la producción de
ICE-LAP-3 y 4. El oligonucleótido de
ARN antisentido hibrida in vivo con el ARNm y bloquea la
traducción de la molécula de ARNm al polipéptido
ICE-LAP-3 y 4 (Antisentido, Okano,
J. Neurochem., 56:560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense
Inhibitors of Gene Expresión, CRC Press, Boca Raton, FL (1988)).
Los oligonucleótidos descritos anteriormente también pueden
suministrarse a células que pueden expresar in vivo el ARN o
ADN antisentido para inhibir la producción de
ICE-LAP 3 y 4.
Los antagonistas potenciales incluyen una
molécula pequeña que se une y ocupa el sitio catalítico de los
polipéptidos haciendo así inaccesible el sitio catalítico para el
sustrato de modo que se previene la actividad biológica normal. Los
ejemplos de moléculas pequeñas incluyen, pero no de forma limitante,
péptidos pequeños y moléculas similares a péptidos.
Los antagonistas pueden emplearse para tratar la
muerte celular necrótica no programada relacionada con enfermedades
cardiovasculares, ictus, traumatismos y otras enfermedades
degenerativas donde una regulación anómala de
ICE-LAP-3 y 4 puede llevar a la
muerte celular patológica, por ejemplo, trastornos relacionados con
inmunodepresión, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y
artritis reumatoide.
También pueden emplearse los antagonistas para
tratar enfermedades con base inmunológica de pulmón y vías
respiratorias, sistema nervioso central, ojos y oídos,
articulaciones, huesos, sistema cardiovascular y sistemas
gastrointestinal y urogenital. Los antagonistas pueden emplearse en
una composición con un vehículo farmacéuticamente aceptable, por
ejemplo, como se describe a continuación en este documento.
Los polipéptidos de la presente invención y los
compuestos antagonistas pueden emplearse en combinación con un
vehículo farmacéutico adecuado. Estas composiciones comprenden una
cantidad terapéuticamente eficaz del polipéptido o antagonista y un
vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Este vehículo
incluye, pero no de forma limitante, solución salina, solución
salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones
de los mismos. La formulación debe adecuarse al modo de
administración.
La invención también proporciona un paquete o kit
farmacéutico que comprende uno o más recipientes cargados con uno o
más de los ingredientes de las composiciones farmacéuticas de la
invención. Puede haber una advertencia asociada con este recipiente
o recipientes en la forma prescrita por una agencia gubernamental
que regula la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos o
biológicos, reflejando dicha advertencia la aprobación de la
agencia de fabricación, uso o venta para su administración en
humanos. Además, pueden emplearse los polipéptidos o antagonistas de
la presente invención junto con otros compuestos terapéuticos.
Las composiciones farmacéuticas pueden
administrarse de forma conveniente tal como por vía intravenosa,
intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intranasal o
intradérmica. IC-LAP-3 y 4 se
administran en una cantidad eficaz para tratamiento y/o profilaxis
de la indicación específica. En general,
ICE-LAP-3 y 4 se administrarán en
una cantidad de al menos 10 \mug/kg de peso corporal, y en la
mayoría de los casos se administrará en una cantidad que no exceda
de 8 mg/kg de peso por día. En la mayoría de los casos, la dosis es
de aproximadamente 10 \mug/kg a aproximadamente 1 mg/kg de peso
corporal diario, teniendo en cuenta las vías de administración,
síntomas, etc.
Los polipéptidos también pueden emplearse de
acuerdo con la presente invención, para la expresión de estos
polipéptidos in vivo, lo que a menudo se denomina como
"terapia génica".
De este modo, por ejemplo, pueden modificarse por
ingeniería genética células de un paciente con un polinucleótido
(ADN o ARN) que codifica un polipéptido ex vivo,
proporcionándose después las células modificadas a un paciente para
ser tratado con el polipéptido. Estos procedimientos son bien
conocidos en la técnica. Por ejemplo, las células pueden
modificarse por ingeniería genética mediante procedimientos
conocidos en la técnica usando una partícula retroviral que
contiene ARN que codifica un polipéptido de la presente
invención.
De forma similar, las células pueden modificarse
in vivo por ingeniería genética para la expresión de un
polipéptido in vivo, por ejemplo, por procedimientos
conocidos en la técnica. Como se conoce en la técnica, puede
administrarse a un paciente una célula productora para la producción
de una partícula retroviral que contiene ARN que codifica el
polipéptido de la presente invención para la modificación genética
de células in vivo y para la expresión del polipéptido in
vivo. Estos y otros procedimientos para administrar un
polipéptido de la presente invención por este procedimiento deben
ser obvios para los expertos en la materia a partir de los
contenidos de la presente invención. Por ejemplo, el vehículo de
expresión para modificar células genéticamente puede ser distinto de
un retrovirus, por ejemplo, un adenovirus que puede usarse para
modificar las células in vivo tras la combinación con un
vehículo de suministro adecuado.
Los retrovirus a partir de los cuales pueden
derivar los vectores plasmídicos retrovirales mencionados
anteriormente incluyen, pero no de forma limitante, el virus de la
leucemia murina de Moloney, virus de la necrosis del bazo,
retrovirus tales como el virus del sarcoma de Rous, el virus del
sarcoma de Harvey, virus de la leucosis aviar, virus de la
leucemia del simio gibón, virus de la inmunodeficiencia humana,
adenovirus, virus del sarcoma mieloproliferativo y virus del tumor
mamario. En otra realización, el vector plasmídico retroviral
deriva del virus de la leucemia murina de Moloney.
El vector incluye uno o más promotores. Los
promotores adecuados que pueden emplearse incluyen, pero no de
forma limitante, la LTR retroviral, el promotor de SV40 y el
promotor del citomegalovirus humano (CMV) descrito en Miller y col.,
Biotechniques, Vol. 7, Nº 9, 980-990 (1989)
o cualquier otro promotor (por ejemplo, promotores celulares tales
como promotores celulares eucarióticos que incluyen, pero no de
forma limitante, los promotores de la histona, pol III y
\beta-actina. Otros promotores virales que pueden
emplearse incluyen, pero no de forma limitante, promotores de
adenovirus, promotores de la timidina quinasa (TK) y promotores del
parvovirus B19. La selección de un promotor adecuado será obvia
para los expertos en la materia a partir de los contenidos de este
documento.
La secuencia de ácido nucleico que codifica el
polipéptido de la presente invención está bajo el control de un
promotor adecuado. Los promotores adecuados que pueden emplearse
incluyen, pero no de forma limitante, promotores adenovirales, tales
como el promotor tardía principal adenoviral, o promotores
heterólogos, tales como el promotor de citomegalovirus (CMV); el
promotor del virus sincitial respiratorio (RSV); promotores
inducibles, tales como el promotor MMT, el promotor de la
metalotionina; promotores de choque térmico; el promotor de la
albúmina; el promotor de ApoAI; promotores de globina humana;
promotores de la timidina quinasa viral; tales como el promotor de
la timidina quinasa del herpes simple; LTR retrovirales (incluyendo
las LTR retrovirales descritas anteriormente en este documento); el
promotor de la \beta-actina y los promotores de
hormonas humanas del crecimiento. El promotor también puede ser el
promotor nativo que controla el gen que codifica el
polipéptido.
El vector plasmídico retroviral se emplea para
transducir líneas celulares empaquetadoras para formar líneas
celulares productoras. Los ejemplos de células empaquetadoras que
pueden transfectarse incluyen, pero no de forma limitante, las
líneas celulares PE501, PA317, \Psi-2,
\Psi-AM, PA12, T19-14X,
VT-19-17-H2,
\PsiCRE, \PsiCRIP, GP+E-86, GP+envAm12 y DAN
como se describe en Miller, Human Gene Therapy, Vol. 1, pág.
5-14 (1990), que se incorpora en este documento como
referencia en su integridad. El vector puede translucirse en las
células empaquetadoras a través de cualquier medio conocido en la
técnica. Estos medios incluyen, pero no de forma limitante,
electroporación, le uso de liposomas y precipitación con CaPO_{4}.
En una alternativa, el vector plasmídico retroviral puede
encapsularse en un liposoma, o unirse con un lípido y administrarse
después a un hospedador.
La línea celular productora genera partículas
infecciosas del vector retroviral que incluyen la secuencia de
ácido o ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos. Estas
partículas del vector retroviral pueden emplearse después para
transducir células eucarióticas, in vitro o in vivo.
Las células eucarióticas transducidas expresarán la secuencia o
secuencias de ácido nucleico que codifican el polipéptido. Las
células eucarióticas que pueden translucirse incluyen, pero no de
forma limitante, células troncales embrionarias, células de
carcinoma embrionario, así como células troncales hematopoyéticas,
hepatocitos, fibroblastos, mioblastos, queratinocitos, células
endoteliales y células epiteliales bronquiales.
Esta invención también se refiere al uso de los
genes de la presente invención como diagnóstico. La detección de
una forma mutada de los genes permitirá el diagnóstico de una
enfermedad o susceptibilidad a una enfermedad que se produce por la
subexpresión del polipéptido de la presente invención.
Los individuos portadores de mutaciones en los
genes de ICE-LAP-3 y 4 humanas
pueden detectarse a nivel de ADN por una diversidad de técnicas.
Pueden obtenerse ácidos nucleicos para diagnóstico a partir de
células del paciente, incluyendo, pero no de forma limitante,
sangre, orina, saliva, biopsias de tejido y material de autopsia. El
ADN genómico puede usarse directamente para la detección o puede
amplificarse enzimáticamente usando PCR (Saiki y col., Nature,
324:163-166 (1986)) antes del análisis. También
puede usarse ARN o ADNc para el mismo fin. Como ejemplo, pueden
usarse cebadores de PCR complementarios del ácido nucleico que
codifica un polipéptido de la presente invención para identificar y
analizar mutaciones. Por ejemplo, pueden detectarse deleciones e
inserciones por un cambio en el tamaño del producto amplificado en
comparación con el genotipo normal. Pueden identificarse mutaciones
puntuales hibridando el ADN amplificado con ARN de
ICE-LAP-3 y 4 o alternativamente,
secuencias de ADN antisentido de
ICE-LAP-3 y 4 marcadas
radiactivamente Pueden distinguirse perfectamente secuencias
coincidentes a partir de dupletes no coincidentes por digestión con
RNAsa y por diferencias en las temperaturas de fusión.
Las diferencias de secuencia entre el gen de
referencia y los genes que tienen mutaciones pueden revelarse por
el procedimiento de secuenciación directa del ADN. Además, los
segmentos de ADN clonados pueden emplearse como sondas para detectar
segmentos de ADN específicos. La sensibilidad de este procedimiento
se potencia mucho cuando se combina con PCR. Por ejemplo, se usa un
cebador de secuenciación con un producto de PCR de doble cadena y
una molécula molde de cadena sencilla generada por una PCR
modificada. La determinación de la secuencia se realiza por
procedimientos convencionales con nucleótido marcado radiactivamente
o por procedimientos de secuenciación automática con etiquetas
fluorescentes.
Puede obtenerse un ensayo genético basado en
diferencias de secuencia de ADN detectando la alteración de la
movilidad electroforética de los fragmentos de ADN en geles con o
sin agentes desnaturalizantes. Pueden visualizarse pequeñas
deleciones e inserciones de secuencia mediante electroforesis en
gel de alta resolución. Los fragmentos de ADN de secuencias
diferentes pueden distinguirse en geles desnaturalizantes de
formamida en gradiente en los que se retardan las movilidades de los
fragmentos de ADN diferentes en el gel en posiciones diferentes de
acuerdo con sus temperaturas de fusión específica o de fusión
parcial (véase, por ejemplo, Myers y col., Science, 230:1242
(1985)).
Los cambios de secuencia en localizaciones
específicas también pueden ponerse de manifiesto por ensayos de
protección de nucleasa, tales como protección de ARNasa y S1 o el
procedimiento de escisión química (por ejemplo, Cotton y col., PNAS,
USA, 85:4397-4401 (1985)).
De este modo, la detección de una secuencia de
ADN específica puede alcanzarse por procedimientos tales como la
hibridación, protección de ARNasa, escisión química, secuenciación
directa de ADN o el uso de enzimas de restricción (por ejemplo,
Polimorfismos de longitud de Fragmentos de Restricción (RFLP) y
transferencias de tipo Southern de ADN genómico.
Además de por electroforesis en gel y
secuenciación de ADN más convencionales, también pueden detectarse
mutaciones por análisis in situ.
La presente invención también se refiera a un
ensayo diagnóstico para detectar niveles alterados de proteínas
ICE-LAP-3 y 4 en diversos tejidos.
Los ensayos usados para detectar los niveles de
ICE-LAP-3 y 4 en una muestra
derivada de un hospedador son bien conocidos por los expertos en la
materia e incluyen radioinmunoensayos, ensayos de unión
competitiva, análisis por transferencia tipo Western y,
preferiblemente, un ensayo de ELISA. Un ensayo de ELISA
inicialmente comprende preparar un anticuerpo específico para el
antígeno ICE-LAP-3 y 4,
preferiblemente un anticuerpo monoclonal. Además, se prepara un
anticuerpo indicador contra el anticuerpo monoclonal. Al anticuerpo
indicador se le une un reactivo detectable tal como radiactividad,
fluorescencia o, en este ejemplo, una enzima peroxidasa de rábano
picante. Ahora se retira una muestra de un hospedador y se incuba
en un soporte sólido, por ejemplo, una placa de poliestireno, que se
une a las proteínas de la muestra. Después, se recubre cualquier
sitio de unión a proteína libre de la placa incubando con una
proteína no específica, tal como albúmina sérica bovina. A
continuación se incuba la placa con el anticuerpo monoclonal
durante el tiempo en el cual los anticuerpos monoclonales se unen a
cualquier proteína ICE-LAP-3 y 4
unida a la placa de poliestireno. Se lava con tampón todo el
anticuerpo monoclonal sin unir. Ahora se pone en la placa el
anticuerpo indicador unido a la peroxidasa de rábano picante dando
lugar a la unión del anticuerpo indicador a cualquier anticuerpo
monoclonal unido a ICE-LAP-3 y 4. A
continuación se lava el anticuerpo indicador sin unir. Después se
añade a la placa los sustratos de la peroxidasa y la cantidad de
color desarrollada en un periodo de tiempo determinado es una
medida de la cantidad de proteína
ICE-LAP-3 y 4 presente en un
volumen determinado de muestra de pacientes cuando se compara con
una curva convencional.
Puede emplearse un ensayo de competición en el
que los anticuerpos específicos para
ICE-LAP-3 y 4 se unen a un soporte
sólido, se pasan sobre el soporte sólido ICE-LAP 3
y 4 marcados y una muestra derivada del hospedador, y la cantidad de
marcaje detectado unido al soporte sólido puede correlacionarse con
la cantidad de ICE-LAP-3 y 4 en la
muestra.
Las secuencias de la presente invención también
pueden valorarse mediante identificación cromosómica. La secuencia
es específicamente dirigida y puede hibridar con una localización
en particular de un cromosoma humano individual. Además, hay una
necesidad actual para identificar sitios en particular del
cromosoma. Actualmente hay disponible pocos reactivos para marcar
cromosomas basados en datos de secuencia actuales (polimorfismos
repetidos) para marcar localizaciones cromosómicas. El mapeo de ADN
de cromosomas según la presente invención en una primera etapa
importante para correlacionar las secuencias con genes asociados
con enfermedades.
Brevemente, pueden mapearse las secuencias en
cromosomas preparando cebadores de PCR (preferiblemente de
15-25 pb) a partir de ADNc. El análisis por
ordenador de la región no 3' traducida del gen se usa para
seleccionar rápidamente cebadores que no abarquen más de uno exón
del ADN genómico, lo que complicaría el procedimiento de
amplificación. Después, estos cebadores se usan para la selección
por PCR de híbridos de células somáticas que contienen cromosomas
humanos individuales. Sólo los híbridos que contienen el gen humano
correspondiente con el cebador producirán un fragmento
amplificado.
\newpage
El mapeo por PCR de híbridos de células somáticas
es un procedimiento rápido para asignar un ADN en particular con un
cromosoma en particular. Usando la presente invención con los mismos
cebadores oligonucleotídicos, pueden obtenerse sublocalizaciones
con paneles de fragmentos de cromosomas específicos o mezclas de
clones genómicos grandes de manera análoga. Otras estrategias de
mapeo que pueden usarse de forma similar para mapear su cromosoma
incluyen la hibridación in situ, la prefiltración con
cromosomas marcados clasificados por flujo y preselección por
hibridación de construcciones de bibliotecas de ADNc específicas de
cromosomas.
Puede usarse la hibridación con fluorescencia
in situ (FISH) de un clon de ADNc para una dispersión
cromosómica en metafase para proporcionar una localización
cromosómica precisa en una etapa. Esta técnica puede usarse con ADNc
que tiene al menos 0 ó 60 bases. Para una revisión de esta técnica,
véase Verma y col., Human Chromosomes: a Manual of Basic
Techniques, Pergamon Press, Nueva York (1988).
Una vez que se ha mapeado una secuencia en una
localización cromosómica precisa, puede correlacionarse la posición
física de la secuencia en el cromosoma con los datos del mapa
genético. Estos datos se encuentran, por ejemplo, en V. McKusick,
Mendelian Inheritance in Man (disponible online a través de la Johns
Hopkins University Welch Medical Library). Después se identifica la
relación entre genes y enfermedades que se han mapeado en la misma
región cromosómica por medio de análisis de ligamiento (herencia
conjunta de genes físicamente adyacentes).
A continuación, es necesario determinar las
diferencias en la secuencia de ADNc o genómico entre individuos
afectados y no afectados. Si se observa una mutación en alguno o en
todos los individuos afectados pero no en ningún individuo normal,
entonces probablemente la mutación puede ser el agente causante de
la enfermedad.
Con la resolución actual de las técnicas de mapeo
físico o mapeo genético, un ADNc localizado de forma precisa en una
región cromosómica asociada con la enfermedad podría ser un gen de
entre 50 a 500 genes potencialmente causales.(Esto supone una
resolución de mapeo de 1 megabase y de un gen por 20 kb).
Pueden usarse los polipéptidos, sus fragmentos o
las células que los expresan como inmunógeno para producir
anticuerpos contra estos. Estos anticuerpos pueden ser, por
ejemplo, anticuerpos policlonales o monoclonales. La presente
invención también incluye anticuerpos quiméricos, de cadena única y
humanizados, así como fragmentos Fab, o el producto de una
biblioteca de expresión de Fab. Pueden usarse diversos
procedimientos conocidos en la técnica para la producción de estos
anticuerpos y fragmentos.
Los anticuerpos generados contra los polipéptidos
correspondientes con una secuencia de la presente invención pueden
obtenerse por inyección directa de los polipéptidos en un animal o
administrando los polipéptidos a un animal, preferiblemente no
humano. El anticuerpo obtenido de esta forma se unirá entonces a los
mismos polipéptidos. De esta manera, puede usarse incluso una
secuencia que codifica sólo un fragmento de los polipéptidos para
generar anticuerpos que se unen a los polipéptidos nativos
completos. Después, pueden usarse estos anticuerpos para aislar el
polipéptido a partir del tejido que expresa este polipéptido.
Para la preparación de anticuerpos monoclonales,
puede usarse cualquier técnica que proporcione anticuerpos
producidos por cultivos de líneas celulares continuos. Los ejemplos
incluyen la técnica de hibridoma (Kohler y Milstein, 1975, Nature,
256:495-497), la técnica de triomas, la técnica de
hibridoma de célula B humana (Kozbor y col., 1983, Immunology Today
4:72) y la técnica de hibridoma-EBV para producir
anticuerpos monoclonales humanos (Cole y col., 1985, en Monoclonal
Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. pág.
77-96).
Las técnicas descritas para la producción de
anticuerpos de cadena única (Patente de EE.UU. 4.946.778) pueden
adaptarse para producir anticuerpos de cadena única contra los
productos polipeptídicos inmunogénicos de esta invención. También,
pueden usarse ratones transgénicos para expresar anticuerpos
humanizados contra productos polipeptídicos inmunogénicos de esta
invención.
La presente invención se describirá además en
referencia a los ejemplos siguientes; sin embargo, se entiende que
la presente invención no se limita a estos ejemplos. Todas las
partes o cantidades, siempre que no se especifique otra cosa, son
por peso.
Para facilitar la comprensión de los siguientes
ejemplos se describirán ciertos procedimientos y/o términos que
aparecen con frecuencia.
Los "plásmidos" se designan con una p
minúscula precedida y/o seguida de letras mayúsculas y/o números.
Los plásmidos iniciales o de partida de este documento están
disponibles en el mercado, públicamente disponibles o en una base no
restringida, o pueden construirse a partir de plásmidos disponibles
de acuerdo con procedimientos publicados. Además, en la técnica se
conocen plásmidos equivalentes a los descritos y serán obvios para
los expertos en la materia.
La "digestión" del ADN se refiere a la
escisión catalítica del ADN con una enzima de restricción que actúa
sólo en ciertas secuencias del ADN. Las diversas enzimas de
restricción usadas en este documento están disponibles en el mercado
y se usan sus condiciones de reacción, cofactores y otros
requerimientos conocidas por los expertos en la técnica. Con fines
analíticos, se usa típicamente 1 \mug de plásmido o un fragmento
de ADN con aproximadamente 2 unidades de enzima en aproximadamente
20 \mul de solución tampón. Para el fin de aislar fragmentos de
ADN para la construcción del plásmido, se digieren típicamente de 5
a 50 \mug de ADN con 20 a 250 unidades de enzima en un volumen
mayor. El fabricante especifica los tampones adecuados y las
cantidades de sustrato para enzimas de restricción particulares.
Generalmente, se usan tiempos de incubación de aproximadamente 1
hora a 37ºC, pero pueden variar según las indicaciones del
proveedor. Tras la digestión, la reacción se somete a electroforesis
directamente en un gel de poliacrilamida para aislar el fragmento
deseado.
La separación por tamaños de los fragmentos
escindidos se realiza usando un gel de poliacrilamida al 8 por
ciento descrito por Goeddel, D y col., Nucleic Acids Res., 8:4057
(1980) o geles de agarosa (0,5 - 1,5%).
Los "oligonucleótidos" se refieren a un
polidesoxinucleótido de cadena sencilla o a dos cadenas
polidesoxinucleotídicas complementarias que pueden sintetizarse
químicamente. Estos oligonucleótidos sintéticos no tienen fosfato en
5' y, de este modo, no se ligarán con otro oligonucleótido sin
añadir un fosfato con un ATP en presencia de una quinasa. Se ligará
un oligonucleótido sintético con un fragmento que no se haya
desfosforilado.
El "ligamiento" se refiere al procedimiento
para formar enlaces fosfodiester entre dos fragmentos de ácido
nucleico de doble cadena (Maniatis, T., y col., Id., pág. 146).
Siempre que no se estipule otra cosa, el ligamiento se realizará
usando tampones conocidos y condiciones con 10 unidades de ADN
ligasa de T4 ("ligasa") por 0,5 \mug de cantidades
aproximadamente equimolares de los fragmentos de ADN que se van a
ligar.
Siempre que no se establezca otra cosa, la
transformación se realizó como se describe en el procedimiento de
Graham., F y Van der Eb, A., Virology, 52:456-457
(1973).
La secuencia de ADN que codifica
ICE-LAP-3, ATCC Nº 75875,
inicialmente se amplifica usando cebadores oligonucleotídicos de PCR
correspondientes con las secuencias 5' de la proteína
ICE-LAP-3 procesada (sin la
secuencia del péptido señal) y las secuencias 3' del vector para el
gen ICE-LAP-3. Se añaden nucleótidos
adicionales correspondientes a
ICE-LAP-3 a las secuencias 5' y 3',
respectivamente. El cebador oligonucleotídico 5' tiene la secuencia
5' GATCGGATCCATGCGTGCGGGGACACGGGTC 3' (ID SEC Nº 5) y
contiene un sitio para la enzima de restricción Bam HI (subrayado)
seguido de 18 nucleótidos de la secuencia codificadora de
ICE-LAP-3 empezando por el supuesto
aminoácido terminal del codón de la proteína procesada. La
secuencia 3', 5'
GTACTC
TAGATCATTCACCCTGGTGGAGGAT 3' (ID SEC Nº 6) contiene secuencias complementarias con un sitio Xba I (subrayado) seguido de 21 nucleótidos de ICE-LAP-3. Los sitios para enzimas de restricción corresponden con los sitios de enzimas de restricción del vector de expresión en bacterias pQE-9 (Qiagen, Inc. 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA 91311). pQE-9 codifica la resistencia a antibióticos (Amp^{r}), un origen de replicación bacteriano (ori), un operador promotor regulable por IPTG (P/O), un sitio de unión al ribosoma (RBS), una etiqueta 6-His y sitios para enzimas de restricción. Después, pQE-9 se digiere con Bam HI y Xba I. Las secuencias amplificadas se ligan en pQE-9 y se insertan en marco con la secuencia que codifica la etiqueta de histidina y el RBS. Después, se usa la mezcla de ligamiento para transformar E. coli disponible de Qiagen con la marca comercial M15/rep 4 por el procedimiento descrito en Sambrook, J. y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1989). M15/rep 4 contiene múltiples copias del plásmido pREP4, que expresa el represor lacl y también confiere resistencia a kanamicina (Kan^{r}). Se identifican los transformantes por su capacidad para crecer en placas de LB y se seleccionan las colonias resistentes a ampicilina/kanamicina. Se aísla el plásmido de ADN y se confirma por análisis de restricción. Los clones que contienen las construcciones deseadas se crecen durante la noche (O/N) en cultivo líquido en medio LB suplementado tanto con Amp (100 \mug/ml) como con Kan (25 \mug/ml). El cultivo O/N se usa para inocular un cultivo mayor a una proporción de 1:100 a 1:250. Las células se crecen hasta una densidad óptica a 600 nm (D.O.^{600}) de entre 0,4 y 0,6. Después se añade IPTG ("isopropil-B-D-tiogalacto-piranosido") a una concentración final de 1 mM. El IPTG induce, mediante la inactivación del represor lacl, el desbloqueo de P/O llevando a una expresión génica aumentada. Las células se crecen durante 3 a 4 horas más. Después, las células se recogen por centrifugación. El sedimento celular se solubiliza en el agente caotrópico Guanidina HCl 6 Molar. Tras la clarificación, se purifica la ICE-LAP-3 solubilizada de esta solución por cromatografía en una columna de Niquel-Quelato en condiciones que permiten la unión fuerte mediante proteínas que contiene la etiqueta 6-His (Hochuli, E y col., J. Chromatography 411:177-184 (1984)). La ICE-LAP-3 (95% pura) se eluye de la columna en guanidina HCl 6 molar pH 5,0 y para el fin de la renaturalización, se ajusta a guanina HCl 3 molar, fosfato sódico 100 mM, glutation (reducido) 10 mmolar y glutation (oxidado) 2 mmolar. Tras la incubación en esta solución durante 12 horas, la proteína se dializó frente a fosfato sódico 10 mmolar.
TAGATCATTCACCCTGGTGGAGGAT 3' (ID SEC Nº 6) contiene secuencias complementarias con un sitio Xba I (subrayado) seguido de 21 nucleótidos de ICE-LAP-3. Los sitios para enzimas de restricción corresponden con los sitios de enzimas de restricción del vector de expresión en bacterias pQE-9 (Qiagen, Inc. 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA 91311). pQE-9 codifica la resistencia a antibióticos (Amp^{r}), un origen de replicación bacteriano (ori), un operador promotor regulable por IPTG (P/O), un sitio de unión al ribosoma (RBS), una etiqueta 6-His y sitios para enzimas de restricción. Después, pQE-9 se digiere con Bam HI y Xba I. Las secuencias amplificadas se ligan en pQE-9 y se insertan en marco con la secuencia que codifica la etiqueta de histidina y el RBS. Después, se usa la mezcla de ligamiento para transformar E. coli disponible de Qiagen con la marca comercial M15/rep 4 por el procedimiento descrito en Sambrook, J. y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1989). M15/rep 4 contiene múltiples copias del plásmido pREP4, que expresa el represor lacl y también confiere resistencia a kanamicina (Kan^{r}). Se identifican los transformantes por su capacidad para crecer en placas de LB y se seleccionan las colonias resistentes a ampicilina/kanamicina. Se aísla el plásmido de ADN y se confirma por análisis de restricción. Los clones que contienen las construcciones deseadas se crecen durante la noche (O/N) en cultivo líquido en medio LB suplementado tanto con Amp (100 \mug/ml) como con Kan (25 \mug/ml). El cultivo O/N se usa para inocular un cultivo mayor a una proporción de 1:100 a 1:250. Las células se crecen hasta una densidad óptica a 600 nm (D.O.^{600}) de entre 0,4 y 0,6. Después se añade IPTG ("isopropil-B-D-tiogalacto-piranosido") a una concentración final de 1 mM. El IPTG induce, mediante la inactivación del represor lacl, el desbloqueo de P/O llevando a una expresión génica aumentada. Las células se crecen durante 3 a 4 horas más. Después, las células se recogen por centrifugación. El sedimento celular se solubiliza en el agente caotrópico Guanidina HCl 6 Molar. Tras la clarificación, se purifica la ICE-LAP-3 solubilizada de esta solución por cromatografía en una columna de Niquel-Quelato en condiciones que permiten la unión fuerte mediante proteínas que contiene la etiqueta 6-His (Hochuli, E y col., J. Chromatography 411:177-184 (1984)). La ICE-LAP-3 (95% pura) se eluye de la columna en guanidina HCl 6 molar pH 5,0 y para el fin de la renaturalización, se ajusta a guanina HCl 3 molar, fosfato sódico 100 mM, glutation (reducido) 10 mmolar y glutation (oxidado) 2 mmolar. Tras la incubación en esta solución durante 12 horas, la proteína se dializó frente a fosfato sódico 10 mmolar.
La secuencia de ADN que codifica
ICE-LAP-4, ATCC Nº 75873,
inicialmente se amplifica usando cebadores oligonucleotídicos de PCR
correspondientes con las secuencias 5' de la proteína
ICE-LAP-4 procesada (sin la
secuencia del péptido señal) y las secuencias 3' del vector para el
gen ICE-LAP-4. Se añaden nucleótidos
adicionales correspondientes a
ICE-LAP-4 a las secuencias 5' y 3',
respectivamente. El cebador oligonucleotídico 5' tiene la secuencia
5' GATCGGATCCATGGAGAACACTGAAAACTCA 3' (ID SEC Nº 7) y
contiene un sitio para la enzima de restricción Bam HI (subrayado)
seguido de 18 nucleótidos de la secuencia codificadora de
ICE-LAP-4 empezando por el supuesto
aminoácido terminal del codón de la proteína procesada. La
secuencia 3', 5' GTACTCTA
GATTAGTGAAAAATAGAGTTC 3' (ID SEC Nº 8) contiene secuencias complementarias a un sitio Xba I (subrayado) seguido de 21 nucleótidos de ICE-LAP-4. Los sitios para enzimas de restricción corresponden con los sitios de enzimas de restricción del vector de expresión en bacterias pQE-9 (Qiagen, Inc. 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311). pQE-9 codifica la resistencia a antibióticos (Amp^{r}), un origen de replicación bacteriano (ori), un operador promotor regulable por IPTG (P/O), un sitio de unión al ribosoma (RBS), una etiqueta 6-His y sitios para enzimas de restricción. Después, pQE-9 se digiere con Bam HI y Xba I. Las secuencias amplificadas se ligan en pQE-9 y se insertan en marco con la secuencia que codifica la etiqueta de histidina y el RBS. Después, se usa la mezcla de ligamiento para transformar E. coli disponible de Qiagen con la marca comercial M15/rep 4 por el procedimiento descrito en Sambrook, J. y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1989). M15/rep 4 contiene múltiples copias del plásmido pREP4, que expresa el represor lacl y también confiere resistencia a kanamicina (Kan^{r}). Se identifican los transformantes por su capacidad para crecer en placas de LB y se seleccionan las colonias resistentes a ampicilina/kanamicina. Se aísla el plásmido de ADN y se confirma por análisis de restricción. Los clones que contienen las construcciones deseadas se crecen durante la noche (O/N) en cultivo líquido en medios LB suplementados tanto con Amp (100 \mug/ml) como con Kan (25 \mug/ml). El cultivo O/N se usa para inocular un cultivo mayor a una proporción de 1:100 a 1:250. Las células se crecen hasta una densidad óptica a 600 nm (D.O.^{600}) de entre 0,4 y 0,6. Después se añade IPTG ("isopropil-B-D-tiogalacto piranosido") a una concentración final de 1 mM. El IPTG induce, mediante la inactivación del represor lacl, el desbloqueo de P/O llevando a una expresión génica aumentada. Las células se crecen durante 3 a 4 horas más. Después, las células se recogen por centrifugación. El sedimento celular se solubiliza en el agente caotrópico Guanidina HCl 6 Molar. Tras la clarificación, se purifica la ICE-LAP-4 solubilizada de esta solución por cromatografía en una columna de Niquel-Quelato en condiciones que permiten la unión fuerte mediante proteínas que contiene la etiqueta 6-His (Hochuli, E y col., J. Chromatography 411:177-184 (1984)). La ICE-LAP-4 (95% pura) se eluye de la columna en guanidina HCl 6 molar pH 5,0 y para el fin de la renaturalización, se ajusta a guanina HCl 3 molar, fosfato sódico 100 mM, glutation (reducido) 10 mmolar y glutation (oxidado) 2 mmolar. Tras la incubación en esta solución durante 12 horas, la proteína se dializó frente a fosfato sódico 10 mmolar.
GATTAGTGAAAAATAGAGTTC 3' (ID SEC Nº 8) contiene secuencias complementarias a un sitio Xba I (subrayado) seguido de 21 nucleótidos de ICE-LAP-4. Los sitios para enzimas de restricción corresponden con los sitios de enzimas de restricción del vector de expresión en bacterias pQE-9 (Qiagen, Inc. 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311). pQE-9 codifica la resistencia a antibióticos (Amp^{r}), un origen de replicación bacteriano (ori), un operador promotor regulable por IPTG (P/O), un sitio de unión al ribosoma (RBS), una etiqueta 6-His y sitios para enzimas de restricción. Después, pQE-9 se digiere con Bam HI y Xba I. Las secuencias amplificadas se ligan en pQE-9 y se insertan en marco con la secuencia que codifica la etiqueta de histidina y el RBS. Después, se usa la mezcla de ligamiento para transformar E. coli disponible de Qiagen con la marca comercial M15/rep 4 por el procedimiento descrito en Sambrook, J. y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1989). M15/rep 4 contiene múltiples copias del plásmido pREP4, que expresa el represor lacl y también confiere resistencia a kanamicina (Kan^{r}). Se identifican los transformantes por su capacidad para crecer en placas de LB y se seleccionan las colonias resistentes a ampicilina/kanamicina. Se aísla el plásmido de ADN y se confirma por análisis de restricción. Los clones que contienen las construcciones deseadas se crecen durante la noche (O/N) en cultivo líquido en medios LB suplementados tanto con Amp (100 \mug/ml) como con Kan (25 \mug/ml). El cultivo O/N se usa para inocular un cultivo mayor a una proporción de 1:100 a 1:250. Las células se crecen hasta una densidad óptica a 600 nm (D.O.^{600}) de entre 0,4 y 0,6. Después se añade IPTG ("isopropil-B-D-tiogalacto piranosido") a una concentración final de 1 mM. El IPTG induce, mediante la inactivación del represor lacl, el desbloqueo de P/O llevando a una expresión génica aumentada. Las células se crecen durante 3 a 4 horas más. Después, las células se recogen por centrifugación. El sedimento celular se solubiliza en el agente caotrópico Guanidina HCl 6 Molar. Tras la clarificación, se purifica la ICE-LAP-4 solubilizada de esta solución por cromatografía en una columna de Niquel-Quelato en condiciones que permiten la unión fuerte mediante proteínas que contiene la etiqueta 6-His (Hochuli, E y col., J. Chromatography 411:177-184 (1984)). La ICE-LAP-4 (95% pura) se eluye de la columna en guanidina HCl 6 molar pH 5,0 y para el fin de la renaturalización, se ajusta a guanina HCl 3 molar, fosfato sódico 100 mM, glutation (reducido) 10 mmolar y glutation (oxidado) 2 mmolar. Tras la incubación en esta solución durante 12 horas, la proteína se dializó frente a fosfato sódico 10 mmolar.
La expresión de un plásmido,
ICE-LAP-3 HA, deriva de un vector
pcDNAI/Amp (Invitrogen) que contiene: 1) el origen de replicación de
SV40, 2) el gene de resistencia a ampicilina, 3) el origen de
replicación de E. coli, 4) el promotor de CMV seguido de una
región polienlazadora, un intrón de SV40 y un sitio de
poliadenilación. Se clonó un fragmento de ADN que codificaba el
precursor de ICE-LAP-3 completo y
una etiqueta HA fusionados en marco a su extremo 3', en la región
polienlazadora del vector, por tanto, la expresión de la proteína
recombinante está dirigida por el promotor de CMV. La etiqueta HA
se corresponde con un epítope derivado de la proteína hemaglutinina
del virus de la influenza como se describe previamente (I. Wilson,
H. Niman, R. Heighten, A. Cherenson, M. Connolly y R. Lerner, 1984,
Cell 37, 767). La inclusión de la etiqueta HA en una proteína diana
permite la detección fácil de la proteína recombinante con un
anticuerpo que reconoce el epítopo HA.
La estrategia de construcción del plásmido se
describe como sigue:
La secuencia de ADN que codifica
ICE-LAP-3, ATCC Nº 75875, se
construyó por PCR sobre la ICE-LAP-3
de longitud completa usando dos cebadores: el cebador 5', 5'
GACTATGCGTGCGGGGACACGG 3' (ID SEC Nº 9) que contiene el sitio de
inicio de la traducción de
ICE-LAP-3, ATG, seguido de 5
nucleótidos de la secuencia codificadora de
ICE-LAP-3 empezando por el codón de
iniciación; la secuencia 3'; 5'
AATCAAGCGTAGTCTGG
GACGTCGTATGGGTATTCACCCTGGTGGAGGATTTG3' (ID SEC Nº 10) que contiene el codón de terminación de la traducción, la etiqueta HA y los últimos 21 nucleótidos de la secuencia que codifica ICE-LAP-3 (sin incluir el codón de terminación). Por tanto, el producto de PCR contiene la secuencia codificadora de ICE-LAP-3 seguida de la etiqueta HA fusionada en marco y un codón de terminación de la traducción próximo a la etiqueta HA. El fragmento de ADN amplificado por PCR se ligó con pcDNAI/Amp por ligamiento de extremos romos. La mezcla de reacción se transformó en la cepa SURE de E. coli (disponible en Stratagene Cloning Systems, 11099 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037), el cultivo transformado se sembró sobre placas de medios con ampicilina y se seleccionaron las colonias resistentes. Se aisló el plásmido de ADN de los transformantes y se examinó la presencia del fragmento correcto por análisis de restricción. Para la expresión de la ICE-LAP-3 recombinante, se transfectaron células COS con el vector de expresión por el procedimiento de DEAE-DEXTRANO (J. Sambrook, E. Pritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1989)). La expresión de la proteína ICE-LAP-3 HA se detectó por marcaje radiactivo y por el procedimiento de inmunoprecipitación (E. Harlow, D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988)). Las células se marcaron durante 8 horas con ^{35}S-cisteína dos días después de la transfección. Después, se recogieron los medios de cultivo y se lisaron las células con detergente (tampón RIPA (NaCl 150 mM, NP-40 al 1%, SDS al 0,1%, NP-40 al 1%, DOC al 0,5%, Tris 50 mM, pH 7,5) (Wilson, I. y col., Id. 37:767 (1984)). Tanto el lisado celular como los medios de cultivo se precipitaron con un anticuerpo monoclonal específico de HA. Las proteínas precipitadas se analizaron en geles de SDS-PAGE al 15%.
GACGTCGTATGGGTATTCACCCTGGTGGAGGATTTG3' (ID SEC Nº 10) que contiene el codón de terminación de la traducción, la etiqueta HA y los últimos 21 nucleótidos de la secuencia que codifica ICE-LAP-3 (sin incluir el codón de terminación). Por tanto, el producto de PCR contiene la secuencia codificadora de ICE-LAP-3 seguida de la etiqueta HA fusionada en marco y un codón de terminación de la traducción próximo a la etiqueta HA. El fragmento de ADN amplificado por PCR se ligó con pcDNAI/Amp por ligamiento de extremos romos. La mezcla de reacción se transformó en la cepa SURE de E. coli (disponible en Stratagene Cloning Systems, 11099 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037), el cultivo transformado se sembró sobre placas de medios con ampicilina y se seleccionaron las colonias resistentes. Se aisló el plásmido de ADN de los transformantes y se examinó la presencia del fragmento correcto por análisis de restricción. Para la expresión de la ICE-LAP-3 recombinante, se transfectaron células COS con el vector de expresión por el procedimiento de DEAE-DEXTRANO (J. Sambrook, E. Pritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1989)). La expresión de la proteína ICE-LAP-3 HA se detectó por marcaje radiactivo y por el procedimiento de inmunoprecipitación (E. Harlow, D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988)). Las células se marcaron durante 8 horas con ^{35}S-cisteína dos días después de la transfección. Después, se recogieron los medios de cultivo y se lisaron las células con detergente (tampón RIPA (NaCl 150 mM, NP-40 al 1%, SDS al 0,1%, NP-40 al 1%, DOC al 0,5%, Tris 50 mM, pH 7,5) (Wilson, I. y col., Id. 37:767 (1984)). Tanto el lisado celular como los medios de cultivo se precipitaron con un anticuerpo monoclonal específico de HA. Las proteínas precipitadas se analizaron en geles de SDS-PAGE al 15%.
La expresión de un plásmido,
ICE-LAP-4 HA, deriva de un vector
pcDNAI/Amp (Invitrogen) que contiene: 1) el origen de replicación de
SV40, 2) el gene de resistencia a ampicilina, 3) el origen de
replicación de E. coli, 4) el promotor de CMV seguido de una
región polienlazadora, un intrón de SV40 y un sitio de
poliadenilación. Se clonó un fragmento de ADN que codifica el
precursor de ICE-LAP-4 completo y
una etiqueta HA fusionada en marco a su extremo 3', en la región
polienlazadora del vector, por tanto, la expresión de la proteína
recombinante está dirigida por el promotor CMV. La etiqueta HA se
corresponde con un epítope derivado de la proteína hemaglutinina del
virus de la influenza como se describe previamente (I. Wilson, H.
Niman, R. Heighten, A. Cherenson, M. Connolly y R. Lerner, 1984,
Cell 37, 767). La inclusión de la etiqueta HA en nuestra proteína
diana permite la detección fácil de la proteína recombinante con un
anticuerpo que reconoce el epítope HA.
La estrategia de construcción del plásmido se
describe como sigue:
La secuencia de ADN que codifica
ICE-LAP-4, ATCC Nº 75873, se
construyó por PCR sobre la ICE-LAP-4
de longitud completa usando dos cebadores: el cebador 5', 5'
ACCATGGAGAACACTGAAAAC 3' (ID SEC Nº 11) que contiene el sitio de
inicio de la traducción de
ICE-LAP-4, ATG, seguido de 15
nucleótidos de la secuencia codificadora de
ICE-LAP-4 empezando por el codón de
iniciación; la secuencia 3', 5'
AATCAAGCGTAGTCTG
GGACGTCGTATGGGTAGTGATAAAAATAGAGTTCTTT 3' (ID SEC Nº 12) que contiene el codón de terminación de la traducción, la etiqueta HA y los últimos 21 nucleótidos de la secuencia que codifica ICE-LAP-4 (sin incluir el codón de terminación). Por tanto, el producto de PCR contiene la secuencia codificadora de ICE-LAP-4 seguida de la etiqueta HA fusionada en marco y un codón de terminación de la traducción próximo a la etiqueta HA. El fragmento de ADN amplificado por PCR se ligó con pcDNAI/Amp por ligamiento de extremos romos. La mezcla de reacción se transformó en la cepa SURE de E. coli (disponible en Stratagene Cloning Systems, 11099 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037), el cultivo transformado se sembró sobre placas de medios con ampicilina y se seleccionaron las colonias resistentes. Se aisló el plásmido de ADN de los transformantes y se examinó la presencia del fragmento correcto por análisis de restricción. Para la expresión de la ICE-LAP-4 recombinante, se transfectaron células COS con el vector de expresión por el procedimiento de DEAE-DEXTRANO (J. Sambrook, E. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1989)). La expresión de la proteína ICE-LAP-4 HA se detectó por marcaje radiactivo y por el procedimiento de inmunoprecipitación (E. Harlow, D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988)). Las células se marcaron durante 8 horas con ^{35}S-cisteína dos días después de la transfección. Después, se recogieron los medios de cultivo y se lisaron las células con detergente (tampón RIPA (NaCl 150 mM, NP-40 al 1%, SDS al 0,1%, NP-40 al 1%, DOC al 0,5%, Tris 50 mM, pH 7,5) (Wilson, I. y col. Id. 37:767 (1984)). Tanto el lisado celular como los medios de cultivo se precipitaron con un anticuerpo monoclonal específico de HA. Las proteínas precipitadas se analizaron en geles de SDS-PAGE
al 15%.
GGACGTCGTATGGGTAGTGATAAAAATAGAGTTCTTT 3' (ID SEC Nº 12) que contiene el codón de terminación de la traducción, la etiqueta HA y los últimos 21 nucleótidos de la secuencia que codifica ICE-LAP-4 (sin incluir el codón de terminación). Por tanto, el producto de PCR contiene la secuencia codificadora de ICE-LAP-4 seguida de la etiqueta HA fusionada en marco y un codón de terminación de la traducción próximo a la etiqueta HA. El fragmento de ADN amplificado por PCR se ligó con pcDNAI/Amp por ligamiento de extremos romos. La mezcla de reacción se transformó en la cepa SURE de E. coli (disponible en Stratagene Cloning Systems, 11099 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037), el cultivo transformado se sembró sobre placas de medios con ampicilina y se seleccionaron las colonias resistentes. Se aisló el plásmido de ADN de los transformantes y se examinó la presencia del fragmento correcto por análisis de restricción. Para la expresión de la ICE-LAP-4 recombinante, se transfectaron células COS con el vector de expresión por el procedimiento de DEAE-DEXTRANO (J. Sambrook, E. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1989)). La expresión de la proteína ICE-LAP-4 HA se detectó por marcaje radiactivo y por el procedimiento de inmunoprecipitación (E. Harlow, D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988)). Las células se marcaron durante 8 horas con ^{35}S-cisteína dos días después de la transfección. Después, se recogieron los medios de cultivo y se lisaron las células con detergente (tampón RIPA (NaCl 150 mM, NP-40 al 1%, SDS al 0,1%, NP-40 al 1%, DOC al 0,5%, Tris 50 mM, pH 7,5) (Wilson, I. y col. Id. 37:767 (1984)). Tanto el lisado celular como los medios de cultivo se precipitaron con un anticuerpo monoclonal específico de HA. Las proteínas precipitadas se analizaron en geles de SDS-PAGE
al 15%.
Se realizó un análisis de transferencia de tipo
Northern para examinar los niveles de expresión de
ICE-LAP-3 en tejidos humanos. Se
aislaron muestras de ARN celular total con el sistema RNAzol^{TM}
B (Biotecx Laboratories, Inc. 6023 South Loop East, Houston, TX
77033). Se separaron aproximadamente 10 \mug de ARN total aislado
a partir de cada tejido humano especificado en un gel de agarosa al
1% y se transfirieron a un filtro de nailon (Sambrook, Fritsch y
Maniatis, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press (1989)). La
reacción de marcaje se realizó de acuerdo con el kit
Prime-It de Stratagene con 50 ng de fragmento de
ADN. El ADN marcado se purificó con una columna
Select-G-50 (5
Prime-3 Prime, Inc. 5603 Arapahoe Road, Boulder, CO
80303). Después, el filtro se hibridó con el gen
ICE-LAP-3 de longitud completa
marcado radiactivamente a 1.000.000 de cpm/ml en NaPO_{4} 0,5 M,
pH 7,4 y SDS al 7% durante la noche a 65ºC. Tras lavar dos veces a
temperatura ambiente y dos veces a 60ºC con 0,5xSSC, SDS al 0,1%,
después el filtro se expuso durante la noche a -70ºC con una
pantalla intensificadora. El ARN mensajero de
ICE-LAP-3 abunda en el hígado.
Se realizó un análisis de transferencia de tipo
Northern para examinar los niveles de expresión de
ICE-LAP-4 en tejidos humanos. Se
aislaron muestras de ARN celular total con el sistema RNAzol^{TM}
B (Biotecx Laboratories, Inc. 6023 South Loop East, Houston, TX
77033). Se separaron aproximadamente 10 \mug de ARN total aislado
a partir de cada tejido humano especificado en un gel de agarosa al
1% y se transfirieron a un filtro de nailon (Sambrook, Fritsch y
Maniatis, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press (1989)). La
reacción de marcaje se realizó de acuerdo con el kit
Prime-It de Stratagene con 50 ng de fragmento de
ADN. El ADN marcado se purificó con una columna
Select-G-50 (5
Prime-3 Prime, Inc. 5603 Arapahoe Road, Boulder, CO
80303). Después, el filtro se hibridó con el gen
ICE-LAP-4 de longitud completa
marcado radiactivamente a 1.000.000 de cpm/ml en NaPO_{4} 0,5 M,
pH 7,4 y SDS al 7% durante la noche a 65ºC. Tras lavar dos veces a
temperatura ambiente y dos veces a 60ºC con 0,5xSSC, SDS al 0,1%,
después el filtro se expuso durante la noche a -70ºC con una
pantalla intensificadora. El ARN mensajero de
ICE-LAP-3 abunda en el hígado.
Los fibroblastos se obtuvieron a partir de
biopsia de piel de un sujeto. El tejido resultante se colocó en
medio de cultivo tisular y se separó en trozos pequeños. Los
pequeños trozos del tejido se colocan en una superficie mojada de
una botella de cultivo tisular, se colocan aproximadamente diez
piezas en cada botella. Se le da la vuelta a la botella, se cierra
fuertemente y se deja a temperatura ambiente durante una noche.
Tras 24 horas a temperatura ambiente, la botella se invierte y los
trozos de tejido permanecen fijos al fondo de la botella y se añade
medio recién preparado (por ejemplo, medio F12 de Ham, con FBS al
10%, penicilina y estreptomicina). Después, éste se incuba a 37ºC
durante aproximadamente una semana. En este tiempo, se añade medio
recién preparado y posteriormente, se cambia cada varios días. Tras
dos semanas más de cultivo, aparece una monocapa de fibroblastos.
La monocapa se tripsiniza y se escala a botellas más grandes.
Se digiere pMV-7 (Kirschmeier,
P.T. y col., DNA, 7:219-25 (1988)) flanqueado por
las regiones repetidas terminales largas del virus del sarcoma
murino de Moloney, con EcoRI y HindIII y posteriormente se trata
con fosfatasa intestinal de ternera. El vector lineal se fracciona
en un gel de agarosa y se purifica usando perlas de vidrio.
El ADNc que codifica un polipéptido de la
presente invención se amplifica usando cebadores de PCR que se
corresponden con las secuencias terminales 5' y 3', respectivamente.
El cebador 5' contiene un sitio EcoRI y el cebador 3' además
incluye un sitio HindIII. Se añaden conjuntamente cantidades iguales
del esqueleto lineal del virus del sarcoma murino de Moloney y del
fragmento EcoRI y HindIII amplificado, en presencia de la ADN
ligasa de T4. La mezcla resultante se mantiene en condiciones
apropiadas para el ligamiento de los dos fragmentos. La mezcla de
ligamiento se usa para transformar la bacteria HB101, que después
se coloca en placas de agar que contienen kanamicina con el fin de
confirmar que el vector tiene el gen de interés insertado de forma
adecuada.
Las células empaquetadoras anfotrópicas pA317 o
GP+am12 se crecen en cultivo tisular hasta densidad confluente en
Medio de Eagles Modificado por Dulbecco (DMEM) con suero de ternera
al 10% (CS), penicilina y estreptomicina. Después, se añade el
vector MSV al medio que contiene el gen y las células empaquetadoras
se transducen con el vector. Ahora las células producen partículas
virales infecciosas que contiene el gen (ahora las células
empaquetadoras se denominan como células productoras).
Se añade medio recién preparado a las células
productoras transducidas, y posteriormente, el medio se recoge de
una placa de 10 cm de células productoras confluyentes. El medio
usado, que contiene las partículas virales infecciosas, se filtra a
través de un filtro de milipore para retirar las células productoras
desprendidas y después se usa este medio para infectar las células
fibroblastos. Se retira el medio de una placa subconfluyente de
fibroblastos y rápidamente se sustituye por el medio de las células
productoras. Se retira este medio y se sustituye por medio recién
preparado. Si el valor del virus es alto, entonces todos los
fibroblastos estarán prácticamente infectados y no se requiere
selección. Si el valor es muy bajo, entonces es necesario usar un
vector retroviral que tiene un marcador seleccionable, tal como
neo o his.
Después, se inyectan los fibroblastos modificados
por ingeniería genética en el hospedador, solos o tras haber
crecido hasta la confluencia en perlas de microvehículo cytodex 3.
Ahora los fibroblastos producen el producto proteico.
Son posibles numerosas modificaciones y
variaciones de la presente invención a la vista de los contenidos
anteriores y, por tanto, dentro del alcance de las reivindicaciones
adjuntas, la invención puede ponerse en práctica de forma diferente
a lo que se ha descrito en particular.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: HE, y col.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Proteasa-3 y 4 de apoptosis similares a la enzima que convierte interleuquina-1 beta.
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 12
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: CARELLA, BYRNE, BAIN, GILFILLAN, CECCHI, STEWART y OLSTEIN
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 6 BECKER FARM ROAD
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: ROSELAND
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: NUEVA JERSEY
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAIS: ESTADOS UNIDOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 07068
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMATO LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: DISQUETE de 3,5 pulgadas
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PS/2
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: WORD PERFECT 5.1
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: Presentada con la presente
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 08/334.251
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 11/1/94
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL MANDATARIO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: FERRARO, GREGORY D.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 36.134
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 325800-???
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 201-994-1700
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: 201-994-1744
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1371 PARES DE BASES
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: SENCILLA
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(3) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 341 AMINOÁCIDOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: AMINOÁCIDO
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
(4) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1159 PARES DE BASES
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: SENCILLA
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
(5) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 277 AMINOÁCIDOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: AMINOÁCIDO
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAL 2
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 4:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 PARES DE BASES
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: SENCILLA
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATCGGATCC ATGCGTGCGG GGACACGGGT C
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 PARES DE BASES
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: SENCILLA
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTACTCTAGA TCATTCACCC TGGTGGAGGA T
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 PARES DE BASES
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: SENCILLA
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGATCGGATCC ATGGAGAACA CTGAAAACTC A
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 PARES DE BASES
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: SENCILLA
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTACTCTAGA TTAGTGATAA AAATAGAGTT C
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 PARES DE BASES
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: SENCILLA
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGACTATGCGT GCGGGGACAC GG
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 53 PARES DE BASES
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: SENCILLA
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAATCAAGCGT AGTCTGGGAC GTCGTATGGG TATTCACCCT GGTGGAGGAT TTG
\hfill53
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 21 PARES DE BASES
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: SENCILLA
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACCATGGAGA ACACTGAAAA C
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 53 PARES DE BASES
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ÁCIDO NUCLEICO
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: SENCILLA
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: LINEAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAATCAAGCGT AGTCTGGGAC GTCGTATGGG TAGTGATAAA AATAGAGTTC TTT
\hfill53
Claims (20)
1. Un polinucleótido seleccionado entre el grupo
compuesto por:
(a) polinucleótidos que codifican al menos la
forma madura del polipéptido quetiene la secuencia de aminoácidos
deducida mostrada en la ID SEC Nº 2 o ID SEC Nº 4;
(b) polinucleótidos que tiene la secuencia
codificadora mostrada en la ID SEC Nº 1 o ID SEC Nº 3 que codifican
al menos la forma madura del respectivo polipéptido;
(c) polinucleótidos que codifican el polipéptido
que tiene la secuencia de aminoácidos de al menos la forma madura
del polipéptido codificado por el ADNc contenido en ATCC 75875 o en
ATCC 75873;
(d) polinucleótidos que tienen la secuencia
codificadora del ADNc contenido en ATCC 75875 o en ATCC 75873 que
codifican al menos la forma madura del respectivo polipéptido;
(e) polinucleótidos que codifican un fragmento de
un polipéptido codificado por un polinucleótido de una cualquiera
de (a) a (d), en el que dicho fragmento tiene actividad cisteína
proteasa;
(f) polinucleótidos cuya cadena complementaria
hibrida en condiciones astringentes con un polinucleótido definido
en una cualquiera de (a) a (e) y que codifica un polipéptido que
tiene actividad cisteína proteasa; y
(g) polinucleótidos que codifican polipéptidos al
menos el 90% idénticos al polipéptido que tiene la secuencias de
aminoácidos deducida mostrada en la ID SEC Nº 2 o en ID SEC Nº
4.
o la cadena complementaria de este
polinucleótido.
2. El polinucleótido de la reivindicación 1 que
es ADN.
3. El ADN de la reivindicación 2 que es ADN
genómico.
4. El polinucleótido de la reivindicación 1 que
es ARN.
5. Un vector que contiene el polinucleótido de
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
6. El vector de la reivindicación 5 en el que el
polinucleótido está operativamente unido a las secuencias de
control de la expresión permitiendo la expresión en células
hospedadoras procarióticas o eucarióticas.
7. Una célula hospedadora modificada
genéticamente con el vector de la reivindicación 5 ó 6.
8. Un procedimiento para producir un polipéptido
que tiene actividad cisteína proteasa que comprende: cultivar la
célula hospedadora de la reivindicación 7 y recuperar del cultivo
el polipéptido codificado por dicho polinucleóti-
do.
do.
9. Un procedimiento para producir células capaces
de expresar un polipéptido que tiene actividad cisteína proteasa
que comprende células modificadas genéticamente con el vector de
la reivindicación 5 ó 6.
10. Un polipéptido que tiene la secuencia de
aminoácidos codificada por un polinucleótido de una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 4 u obtenible por el procedimiento de la
reivindicación 8.
11. Un anticuerpo contra el polipéptido de la
reivindicación 10.
12. Una molécula de ácido nucleico que hibrida
específicamente en condiciones astringentes de hibridación con un
polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
13. Un antagonista/inhibidor del polipéptido de
la reivindicación 10, en el que dicho antagonista/inhibidor es un
anticuerpo o una construcción antisentido, que hibrida con el
transcrito del polinucleótido de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4.
14. Una composición farmacéutica que comprende el
polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, el
polipéptido de la reivindicación 10 o el antagonista de la
reivindicación 13 y, de forma opcional, un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
15. Una composición diagnóstica que comprende el
polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, la
molécula de ácido nucleico de la reivindicación 12 o el anticuerpo
de la reivindicación 11.
\newpage
16. Uso del polipéptido de la reivindicación 10 o
del polinucléotido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4
para la preparación de una composición farmacéutica para el
tratamiento de trastornos relacionados con inmunodepresión, para
controlar el desarrollo embrionario o la homeostasis o útil como
agente antiviral o antitumoral.
17. Uso del antagonista de la reivindicación 13
para la preparación de una composición farmacéutica para el
tratamiento de la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson,
artritis reumatoide, choque séptico, lesiones de cabeza,
enfermedades cardiovasculares relacionadas con muerte celular
necrótica no programada, ictus, traumatismo, trastornos
relacionados con inmunodepresión, trastornos con base inmunológica
del pulmón y de las vías respiratorias, sistema nervioso central,
ojos, oídos, articulaciones, huesos, sistema cardiovascular, el
sistema gastrointestinal o el urogenital.
18. Un procedimiento in vitro para
diagnosticar una enfermedad o susceptibilidad a una enfermedad
relacionada con una subexpresión de un polipéptido de la
reivindicación 10 que comprende determinar una mutación en una
secuencia de ácido nucleico de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4 que codifica para dicho polipéptido.
19. Un procedimiento de diagnóstico que comprende
analizar la presencia del polipéptido de la reivindicación 10 en una
muestra derivada de un hospedador.
20. Un método para identificar compuestos que
inhiben el polipéptido de la reivindicación 10 que comprende:
(a) poner en contacto el polipéptido de la
reivindicación 10 con el sustrato
prointerleuquina-1\beta y un compuesto en
condiciones en las que el polipéptido normalmente escinde al
sustrato; y
(b) determinar si el compuesto inhibe el
polipéptido detectando la ausencia de sustrato escindido.
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