ES2978177T3 - Combinación de radio inmunoterapia y conjugados anticuerpo-fármaco para mejorar la terapia contra el cáncer - Google Patents

Combinación de radio inmunoterapia y conjugados anticuerpo-fármaco para mejorar la terapia contra el cáncer Download PDF

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Abstract

En este trabajo se describen composiciones y métodos de uso de conjugados de radionúclido-anticuerpo (para RAIT) y conjugados de fármaco-anticuerpo (ADC). La combinación de RAIT y ADC fue más eficaz que la RAIT sola, el ADC solo o la suma de los efectos de RAIT y ADC. La sinergia inesperada dio como resultado una disminución de la tasa de crecimiento tumoral y un aumento de la supervivencia, con una alta incidencia de supervivencia sin tumor en xenoinjertos de cáncer de páncreas humano Capan-1 en ratones desnudos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Combinación de radio inmunoterapia y conjugados anticuerpo-fármaco para mejorar la terapia contra el cáncer
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Campo de la invención
[0001]La presente invención se relaciona con un anticuerpo anti-Trop-2 RS7 humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo conjugado con un agente citotóxico para uso en el tratamiento del cáncer de páncreas, en donde el tratamiento comprende administrar a un sujeto dicho anticuerpo RS7 anti-Trop-2 humanizado o fragmento de unión a antígeno del mismo conjugado con un agente citotóxico y un anticuerpo mucina anticáncer pancreático PAM4 o fragmento de unión a antígeno del mismo conjugado con un radionúclido; un anticuerpo de mucina anticáncer de páncreas PAM4 o fragmento de unión a antígeno del mismo conjugado con un radionúclido para uso en el tratamiento de cáncer de páncreas, en el que el tratamiento comprende administrar a un sujeto dicho anticuerpo de mucina anticáncer de páncreas PAM4 o fragmento de unión a antígeno del mismo conjugado a un radionúclido y un anticuerpo RS7 anti-Trop-2 humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo conjugado con un agente citotóxico; y una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento del cáncer de páncreas, en la que la composición farmacéutica comprende un anticuerpo anti-Trop-2 RS7 humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo conjugado con un agente citotóxico y un anticuerpo de mucina anti-cáncer de páncreas PAM4 o fragmento de unión a antígeno del mismo conjugado con un radionucleido. La combinación del anticuerpo mucina contra el cáncer de páncreas PAM4 o su fragmento de unión a antígeno conjugado con un radionúclido (RAIT) y el anticuerpo anti-Trop-2 RS7 humanizado o su fragmento de unión a antígeno conjugado con un agente citotóxico (ADC) exhibe un efecto sinérgico y es más eficaz para inducir la muerte de las células cancerosas que RAIT o ADC solos, o la suma de los efectos de RAIT y ADC administrados individualmente.
Técnica relacionada
[0002]El cáncer de páncreas es un crecimiento maligno del páncreas que se produce principalmente en las células de los conductos pancreáticos. Esta enfermedad es la novena forma más común de cáncer, sin embargo, es la cuarta y quinta causa principal de muerte por cáncer en hombres y mujeres, respectivamente. El cáncer de páncreas casi siempre es mortal, con una tasa de supervivencia a cinco años inferior al 3%.
[0003]Los síntomas más comunes del cáncer de páncreas incluyen ictericia, dolor abdominal y pérdida de peso, que, junto con otros factores de presentación, son de naturaleza inespecífica. Por lo tanto, diagnosticar el cáncer de páncreas en una etapa temprana del crecimiento del tumor suele ser difícil y requiere un estudio diagnóstico extenso, que a menudo incluye cirugía exploratoria. La ecografía endoscópica y la tomografía computarizada son los mejores medios no invasivos disponibles en la actualidad para el diagnóstico del cáncer de páncreas. Sin embargo, es difícil la detección fiable de tumores pequeños, así como la diferenciación del cáncer de páncreas de la pancreatitis focal. Actualmente, la gran mayoría de los pacientes con cáncer de páncreas se diagnostican en una etapa tardía, cuando el tumor ya se ha extendido fuera de la cápsula para invadir los órganos circundantes y/o ha hecho metástasis extensamente. Gold y col., Crit. Rev. Oncology/Hematology, 39:147-54 (2001). La detección tardía de la enfermedad es común y el diagnóstico temprano del cáncer de páncreas es poco común en el ámbito clínico.
[0004]Los procedimientos de tratamiento actuales disponibles para el cáncer de páncreas no han conducido a una cura, ni a un tiempo de supervivencia sustancialmente mejorado. La resección quirúrgica ha sido la única modalidad que ofrece posibilidades de supervivencia. Sin embargo, debido a la gran carga tumoral, sólo entre el 10% y el 25% de los pacientes son candidatos para una "resección curativa". Para aquellos pacientes que se someten a un tratamiento quirúrgico, la tasa de supervivencia a cinco años sigue siendo baja, con un promedio de sólo alrededor del 10%.
[0005]Los anticuerpos, en particular los anticuerpos monoclonales (MAbs) y los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos modificados genéticamente, se han probado ampliamente y han demostrado ser valiosos en la detección y el tratamiento de diversos trastornos humanos, incluidos cánceres, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades infecciosas, enfermedades inflamatorias, y enfermedades cardiovasculares [Filpula y McGuire, Exp. Opin. Ther. Patents (1999) 9: 231-245]. La utilidad clínica de un anticuerpo o de un agente derivado de anticuerpo depende principalmente de su capacidad para unirse a un antígeno objetivo específico asociado con un trastorno particular. La selectividad es valiosa para administrar un agente terapéutico, como fármacos, toxinas, citocinas, hormonas, antagonistas hormonales, enzimas, inhibidores de enzimas, oligonucleótidos inhibidores (p. ej., ARNi, ARNip), inmunomoduladores, radionúclidos, agentes antiangiogénicos o agentes proapoptóticos, a un tumor objetivo. Los anticuerpos radiomarcados se han utilizado con cierto éxito en numerosas neoplasias malignas, incluido el cáncer de ovario, el cáncer de colon, el cáncer medular de tiroides y los linfomas.
[0006]Aunque se han aprobado diversos anticuerpos para uso terapéutico humano, incluyendo alemtuzumab, bevacizumab, cetuximab, gemtuzumab, ibritumomab, panitumumab, rituximab, tositumomab y trastuzumab, existe una necesidad en el campo de terapias basadas en anticuerpos más eficaces para pacientes difíciles de tratar cánceres, como el cáncer de páncreas.
[0007]Gold DV et al. (Int. J. Cancer: 109, 618-626 (2004)) informan sobre radio inmunoterapia combinada con anticuerpo PAM4 marcado con 90itrio-DOTA y radio sensibilización con Gemcitabina para el tratamiento de un xenoinjerto de cáncer de páncreas humano.
[0008]El documento US 7.282.567 B2 está relacionado con anticuerpos monoespecíficos, monovalentes y multivalentes, y con anticuerpos multivalentes y multiespecíficos, incluido el anticuerpo PAM4 asociado a tumores.
[0009]Gold DV et al. (Clinical Cancer Research, 1 de septiembre de 2003, vol. 9, no. 10. Pt 2, pp. 3929S-37S) informe sobre radioinmunoterapia de dosis bajas (90Y-PAM4) combinada con gemcitabina para el tratamiento del cáncer de páncreas experimental.
[0010]Gold DV et al. (Int. J. Cancer: 57, 204-210 (1994)) informan sobre la caracterización del anticuerpo monoclonal PAM4 reactivo con una mucina de cáncer de páncreas.
[0011]Gold DV et al. (Int. J. Cancer: 72, 477-485 (1997)) informan sobre la selección de radio inmunoconjugados para la terapia de carcinoma de colon micrometastásico o bien establecido.
[0012]Al-Ejeh F et al. (PlosS ONE, febrero de 2009, vol. 4, no. 2, páginas e4630.1-e4630.13) informan que la quimioterapia tiene sinergia con la radio inmunoterapia dirigida al autoantígeno La en tumores.
[0013]Cardillo TM et al. (Clinical Cancer Research, vol. 7, no. 10, pp. 3186-3192, octubre de 2001) informan sobre la ventaja terapéutica del anticuerpo PAM4 marcado con 90itrio frente a 131yodo en el cáncer de páncreas experimental.
[0014]Govindan SV et al. (Clincal Cancer Research, vol. 15, no. 10, pp. 6052-6061, octubre de 2009) informan sobre la terapia dirigida a CEACAM5 de xenoinjertos de cáncer de colon y páncreas humano con potentes inmunoconjugados de Labetuzumab-SN-38.
[0015]Moon S-J y col. (J. Med. Chem. 2008, 51, págs. 6916-6926) informan sobre conjugados de anticuerpos de 7-etil-10-hidroxicamptotecina (SN-38) para quimioterapia dirigida contra el cáncer.
[0016]El documento US 2004/120949 A1 está relacionado con el uso combinado de anticuerpos conjugados con compuestos citotóxicos y radioterapia en la terapia del cáncer.
[0017]El documento US 2005/0025709 A1 está relacionado con péptidos de D-aminoácidos y su uso.
[0018]El documento US 4.867.962 A está relacionado con métodos para aumentar la cantidad relativa de agentes terapéuticos o de diagnóstico unidos a anticuerpos administrados a tejidos diana in vivo en comparación con la cantidad de dichos agentes administrados a tejidos no diana.
[0019]El documento US 2003/0232011 A1 está relacionado con un método para tratar el cáncer, en el que se usa más de un agente terapéutico, teniendo cada uno de los agentes terapéuticos diferentes capacidades de destrucción de tumores, y en el que los agentes terapéuticos se administran a los sitios del tumor. utilizando métodos combinados de focalización y prefocalización.
RESUMEN
[0020]El problema subyacente a la presente invención se resuelve mediante el objeto de las reivindicaciones independientes adjuntas; se pueden tomar formas de realización preferidas de las reivindicaciones dependientes adjuntas.
[0021]Más específicamente, el problema subyacente a la presente invención se resuelve en un primer aspecto mediante un anticuerpo anti-Trop-2 RS7 humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo conjugado con un agente citotóxico, para su uso en un método de tratamiento del cáncer de páncreas, que comprende:
a) administrar a un sujeto con cáncer de páncreas el anticuerpo anti-Trop-2 o un fragmento de unión a antígeno del mismo conjugado con un agente citotóxico, en el que el anticuerpo anti-Trop-2 o fragmento del mismo comprende las secuencias de cadena ligera CDR CDR1 (<k>A<s>QDVSIAVA, SEQ ID NO: 7); CDR2 (SASYRYT, SEQ ID NO: 8); y CDR3 (QQHYITPLT, SEQ ID NO: 9) y las secuencias CDR de cadena pesada CDR1 (NYGMN, SEQ ID NO: 10); CDR2 (WINTYTGEPTYTDDFKG, SEQ ID NO. 11) y CDR3 (GGFGSSYWYFDV, SEQ ID NO: 12), en donde el agente citotóxico es SN-38 conjugado al anticuerpo o fragmento de unión al antígeno mediante el enlazador CL2A, en donde la estructura del inmunoconjugado es MAb-CL2A-SN-38
; y
b) administrar a dicho sujeto un anticuerpo mucina anticáncer pancreático PAM4 o un fragmento de unión a antígeno del mismo conjugado con un radionúclido, en el que el anticuerpo mucina anticáncer pancreático o un fragmento del mismo comprende las secuencias de la región determinante de la complementariedad luminosa (CDR) CDR1 (SASSSVSSSYLY, SEQ ID NO: 1); CDR2 (STSNLAS, SEQ ID NO: 2); y CDR3 (HQWNRYPYT, SEQ ID NO: 3); y las secuencias CDR de cadena pesada CDR1 (SYVLH, SEQ ID NO: 4); CDR2 (YINPYNDGTQYNEKFKG, SEQ ID NO: 5) y CDR3 (GFGGSYGFAY, SEQ ID NO: 6), y en donde el radionucleido es 90Y.
[0022]Más específicamente, el problema subyacente a la presente invención se resuelve en un segundo aspecto mediante un anticuerpo mucina anticáncer pancreático PAM4 o un fragmento de unión a antígeno del mismo conjugado con un radionúclido, para uso en un método de tratamiento del cáncer de páncreas que comprende:
a) administrar a un sujeto con cáncer de páncreas un anticuerpo RS7 anti-Trop-2 humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo conjugado con un agente citotóxico, en el que el anticuerpo anti-Trop-2 o fragmento del mismo comprende las secuencias CDR de cadena ligera CDR1 (KASQDVSIAVA, SEQ ID NO: 7); CDR2 (SASYRYT, SEQ ID NO: 8); y CDR3 (QQHYITPLT, SEQ ID NO: 9) y las secuencias de CDR de cadena pesada CDR1 (NYGMN, SEQ ID NO: 10); CDR2 (WINTYTGEPTYTDDFKG, SEQ ID NO. 11) y CDR3 (GGFGSSYWYFDV, SEQ ID NO: 12), en donde el agente citotóxico es SN-38 conjugado con el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno mediante el enlazador CL2A, en el que la estructura del inmunoconjugado es MAb-CL2A-SN-38
; y
b) administrar a dicho sujeto el anticuerpo de mucina contra el cáncer de páncreas o su fragmento de unión a antígeno conjugado con un radionúclido, en el que el anticuerpo de mucina contra el cáncer de páncreas o su fragmento comprende las secuencias de la región determinante de la complementariedad luminosa (CDR) CDR1 (SASSSVSSSYLY, SEQ ID NO: 1); CDR2 (STSNLAS, SEQ ID NO: 2); y CDR3 (HQWNRYPYT, SEQ ID NO: 3); y las secuencias CDR de cadena pesada CDR1 (SYVLH, SEQ ID NO: 4); CDR2 (YINPYNDGTQYNEKFKG, SEQ ID NO: 5) y CDR3 (GFGGSYGFAY, SEQ ID NO: 6), y en donde el radionucleido es 90Y.
[0023]Más específicamente, el problema subyacente a la presente invención se resuelve en un tercer aspecto mediante una composición farmacéutica, que comprende
a) un anticuerpo RS7 anti-Trop-2 humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo conjugado con un agente citotóxico, en el que el anticuerpo anti-Trop-2 o fragmento del mismo comprende las secuencias CDR de cadena ligera CDR1 (KASQDVSIAVA, SEQ ID NO: 7); CDR2 (SASYRYT, SEQ ID NO: 8); y CDR3 (QQHYITPLT, SEQ ID NO: 9) y las secuencias de cadena pesada CDR CDR1 (NYGMN, SEQ ID NO: 10); CDR2 (WINTYTGEPTYTDDFKG, SEQ ID NO. 11) y CDR3 (GGFGSSYWYFDV, SEQ ID NO: 12), en donde el agente citotóxico es SN-38 conjugado con el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno mediante el enlazador CL2A, en el que la estructura del inmunoconjugado es MAb-CL2A-SN-38
; y
b) un anticuerpo mucina contra el cáncer de páncreas PAM4 o un fragmento de unión a antígeno del mismo conjugado con un radionúclido, en el que el anticuerpo mucina contra el cáncer de páncreas o un fragmento del mismo comprende las secuencias de la región determinante de la complementariedad ligera (CDR) CDR1 (SASSSVSSSYLY, SEQ ID NO: 1); CDR2 (STSNLAS, SEQ ID NO: 2); y CDR3 (HQWNRYPYT, SEQ ID NO: 3); y las secuencias CDR de cadena pesada CDR1 (SYVLH, SEQ ID NO: 4); CDR2 (YINPYNDGTQYNEKFKG, SEQ ID NO: 5) y CDR3 (GFGGSYGF<a>Y, SEQ ID NO: 6), y en donde el radionúclido es 90Y, y en donde la composición farmacéutica es para uso en un método para tratar el cáncer de páncreas.
[0024]En una forma de realización del primer, segundo y tercer aspecto, el anticuerpo anti-Trop-2 o fragmento del mismo y el anticuerpo mucina anticáncer pancreático o fragmento del mismo se administran de forma secuencial o simultánea.
[0025]En una forma de realización del primer, segundo y tercer aspecto, el anticuerpo anti-Trop-2 o fragmento del mismo y el anticuerpo mucina anticáncer pancreático o fragmento del mismo se conjugan entre sí.
[0026]En una forma de realización del primer, segundo y tercer aspecto, el anticuerpo anti-Trop-2 o fragmento del mismo y el anticuerpo mucina anticáncer de páncreas o fragmento del mismo se conjugan entre sí mediante la técnica de acoplamiento y bloqueo (DNL).
[0027]En una forma de realización del primer, segundo y tercer aspecto, el anticuerpo mucina contra el cáncer de páncreas o un fragmento del mismo es un anticuerpo quimérico, humanizado o humano o un fragmento del mismo.
[0028]En una forma de realización del primer, segundo y tercer aspecto, el anticuerpo mucina anticáncer pancreático se une al 80 % o más del adenocarcinoma pancreático invasivo humano, neoplasia mucinosa papilar intraductal, lesiones PanIN-1A, PanIN-1 B y PanIN-2 y no se une al tejido pancreático humano normal.
[0029]En diversas formas de realización de la invención como se define en las reivindicaciones, la presente invención se refiere a la terapia de combinación con anticuerpos radiomarcados y anticuerpos conjugados con fármaco. La terapia combinada se utiliza en el tratamiento del cáncer de páncreas. En formas de realización preferidas de la invención como se define en las reivindicaciones, la combinación de anticuerpos radiomarcados y conjugados con fármaco es más eficaz que el anticuerpo radiomarcado solo, el anticuerpo conjugado con fármaco solo o la suma de los efectos de los anticuerpos radiomarcados y conjugados con fármaco administrados individualmente.
[0030]Preferiblemente, los anticuerpos de uso se unen específicamente a células cancerosas, con poca o ninguna unión a células normales o no neoplásicas. Más preferiblemente, los anticuerpos se unen a las primeras etapas del cáncer, como PanIN-1A y 1B y PanIN-2 en el caso del cáncer de páncreas. Lo más preferiblemente, los anticuerpos se unen a 80 a 90 % o más de adenocarcinoma de páncreas invasivo humano, neoplasia mucinosa papilar intraductal, lesiones PanIN-1A, PanIN-1B y PanIN-2, pero no al tejido pancreático humano normal.
[0031]En una forma de realización específica de la invención como se define en las reivindicaciones, el anticuerpo radiomarcado puede ser un anticuerpo PAM4 humanizado (ver, por ejemplo, la patente de EE.UU. n° 7.282.567), que comprende la región determinante de la complementariedad de la luz (CDR) CDR1 (SASSSVSSSYLY, SEQ ID NO:1); CDR2 (STSNLAS, SEQ ID NO:2); y CDR3 (HQWNRYPYT, SEQ ID NO:3); y las secuencias CDR de cadena pesada CDR1 (SYVLH, SEQ ID NO:4); CDR2 (YINPYNDGTQYNEKFKG, SEQ ID NO:5) y CDR3 (GFGGSYGFAY, SEQ ID NO:6). Como se analiza más adelante, se conocen varios radionucleidos terapéuticos de uso para el tratamiento del cáncer y cualquiera de dichos radionucleidos conocidos puede conjugarse con el anticuerpo de interés. En una forma de realización más preferida, el anticuerpo radiomarcado es 90Y-hPAM4 (clivatuzumab tetraxetan).
[0032]De acuerdo con la invención como se define en las reivindicaciones, el anticuerpo conjugado con fármaco es un anticuerpo RS7 humanizado (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. n° 7.238.785), que comprende las secuencias CDR de cadena ligera CDR1 (KASQDVSIAVA, SEQ ID NO :7); CDR2 (SASYRYT, SEQ ID NO:8); y CDR3 (QQHYITPLT, SEQ ID NO:9) y las secuencias de CDR de cadena pesada CDR1 (NYGMN, SEQ ID NO:10); CDR2 (WINTYTGEPTYTDDFKG, SEQ ID NO: 11) y CDR3 (GGFGSSYWYFDV, SEQ ID NO: 12). Como se analiza más adelante, se conocen varios fármacos quimioterapéuticos de uso para el tratamiento del cáncer y cualquiera de dichos fármacos conocidos puede conjugarse con el anticuerpo de interés. De acuerdo con la invención tal como se define en las reivindicaciones, el anticuerpo conjugado con fármaco es SN-38-hRS7.
[0033] En ejemplos alternativos, los anticuerpos pueden ser anticuerpos murinos, quiméricos, humanizados o humanos que se unen al mismo determinante antigénico (epítopo) que un anticuerpo PAM4 que comprende las secuencias de la región determinante de la complementariedad ligera (CDR) CDR1 (Sa SSSVSSSYLY, SEQ ID NO :1); CDR2 (STSNLAS, SEQ ID NO:2); y CDR3 (HQWNRYPYT, SEQ ID NO:3); y las secuencias CDR de cadena pesada CDR1 (SYVLH, SEQ ID NO:4); CDR2 (YINPYNDGTQYNEKFKG, SEQ ID NO:5) y CDR3 (GFGGSYGFAY, SEQ ID NO:6); o que se unen al mismo epítopo que un anticuerpo RS7 que comprende las secuencias CDR de cadena ligera CDR1 (KASQDVSIAVA, SEQ ID NO:7); CDR2 (SASYRYT, SEQ ID NO:8); y CDR3 (QQHYITPLT, SEQ ID NO:9) y las secuencias de CDR de cadena pesada CDR1 (NYGMN, SEQ ID NO:10); CDR2 (WINTYTGEPTYTDDFKG, SEQ ID NO:11) y CDR3 (GGFGSSYWYFDV, SEQ ID NO:12). Los anticuerpos que se unen al mismo determinante antigénico pueden identificarse mediante una variedad de técnicas conocidas en la técnica, tales como mediante estudios de unión competitiva.
[0034] En formas de realización preferidas de la invención como se define en las reivindicaciones, el anticuerpo radiomarcado y el anticuerpo conjugado con fármaco se administran como restos de anticuerpo separados, ya sea de forma secuencial o simultánea. Sin embargo, en formas de realización alternativas de la invención como se define en las reivindicaciones, el anticuerpo radiomarcado y el anticuerpo conjugado con fármaco, o fragmentos de los mismos, pueden administrarse como un anticuerpo biespecífico. En formas de realización alternativas preferidas de la invención como se define en las reivindicaciones, el anticuerpo biespecífico puede producirse mediante la técnica de acoplamiento y bloqueo (DNL), como se analiza con más detalle a continuación.
[0035] Aunque de acuerdo con la invención, tal como se define en las reivindicaciones, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos se conjugan respectivamente con un radionúclido y un fármaco quimioterapéutico, el experto se dará cuenta de que se conocen otros agentes terapéuticos anticancerígenos en la técnica y se pueden usar además del radionucleido y/o fármaco en cuestión. Otros agentes terapéuticos conocidos incluyen toxinas, inmunomoduladores (tales como citocinas, linfocinas, quimiocinas, factores de crecimiento y factores de necrosis tumoral), hormonas, antagonistas hormonales, enzimas, oligonucleótidos (tales como ARNip o ARNi), agentes terapéuticos fotoactivos, agentes antiangiogénicos y agentes proapoptóticos. Los agentes terapéuticos pueden comprender una o más copias del mismo agente terapéutico o también combinaciones de diferentes agentes terapéuticos. Los agentes terapéuticos pueden conjugarse con los anticuerpos en cuestión o administrarse por separado antes, simultáneamente con o después de los anticuerpos en cuestión.
[0036] En una forma de realización preferida de la invención como se define en las reivindicaciones, el agente terapéutico es un agente citotóxico, tal como un fármaco o una toxina. También se prefiere que el fármaco se seleccione del grupo que consiste en mostazas nitrogenadas, derivados de etilenimina, alquilsulfonatos, nitrosoureas, gemcitabina, triazenos, análogos del ácido fólico, antraciclinas, taxanos, inhibidores de la COX-2, análogos de pirimidina, análogos de purina, antibióticos, inhibidores de enzimas., epipodofilotoxinas, complejos de coordinación de platino, alcaloides de la vinca, ureas sustituidas, derivados de metilhidrazina, supresores adrenocorticales, antagonistas hormonales, endostatina, taxoles, camptotecinas, SN-38, doxorrubicinas y sus análogos, antimetabolitos, agentes alquilantes, antimitóticos, agentes antiangiogénicos, inhibidores de tirosina quinasa, inhibidores de mTOR, inhibidores de la proteína de choque térmico (HSP90), inhibidores de proteosoma, inhibidores de HDAC, agentes proapoptóticos, metotrexato, CPT-11 y una combinación de los mismos.
[0037] En otra forma de realización preferida de la invención como se define en las reivindicaciones, el agente terapéutico es una toxina seleccionada del grupo que consiste en ricina, abrina, toxina alfa, saporina, ribonucleasa (RNasa), DNasa I, enterotoxina estafilocócica-A, proteína antiviral de hierba carmín, gelonina, toxina diftérica, exotoxina de Pseudomonas y endotoxina de Pseudomonas y combinaciones de las mismas. O un inmunomodulador seleccionado del grupo que consiste en una citoquina, un factor de crecimiento de células madre, una linfotoxina, un factor hematopoyético, un factor estimulante de colonias (CSF), un interferón (IFN), eritropoyetina, trombopoyetina y combinaciones de los mismos.
[0038] En otras formas de realización preferidas de la invención como se define en las reivindicaciones, el agente terapéutico es un radionucleido seleccionado del grupo que consiste en 111In, 177Lu, 212Bi, 213Bi, 211At, 62Cu, 67Cu, 90Y, 125I, 131I, 32P, 33P, 47Sc, 111Ag, 67Ga, 142Pr, 153Sm, 161Tb, 166Dy, 166Ho, 186Re, 188Re, 189Re, 212Pb, 223Ra, 225Ac, 59Fe, 75Se, 77As, 89Sr, 99Mo, 105Rh, 109Pd, 143Pr, 149Pm, 169Er, 194Ir, 198Au, 199Au y 211Pb. También se prefieren los radionucleidos que se desintegran sustancialmente con partículas emisoras de Auger. Por ejemplo, Co-58, Ga-67, Br-80m, Tc-99m, Rh-103m, Pt-109, In-111, Sb-119, 1-125, Ho-161, Os-189m e Ir-192. Las energías de desintegración de los nucleidos emisores de partículas beta útiles son preferentemente <1.000 keV, más preferentemente <100 keV y lo más preferentemente <70 keV. También se prefieren radionucleidos que se desintegran sustancialmente con la generación de partículas alfa. Dichos radionucleidos incluyen, entre otros: Dy-152, At-211, Bi-212, Ra-223, Rn-219, Po-215, Bi-211, Ac-225, Fr-221, At-217, Bi-213 y Fm-255. Las energías de desintegración de los radionucleidos emisores de partículas alfa útiles son preferentemente de 2.000 a 10.000 keV, más preferentemente de 3.000 a 8.000 keV y lo más preferentemente de 4.000 a 7.000 keV. Otros posibles radioisótopos de uso incluyen 11C, 13N, 15O, 75Br, 198Au, 224Ac, 1261133177Br 113mIn 95Ru 97Ru 103Ru 1°5Ru 1°7Hg 203Hg 121mJe 122mJe 125mTe 165jm 167jm 168jm 197Pt 109Pd 105Rh, 142Pr, 143Pr, 161Tb, 166Ho, 199Au, 57Co, 58Co, 51Cr, 59Fe, 75Se, 201Tl, 225Ac, 76Br, 169Yb y similares. En otras formas de realización, el agente terapéutico es un agente terapéutico fotoactivo seleccionado del grupo que consiste en cromógenos y colorantes.
[0039] Alternativamente, el agente terapéutico es una enzima seleccionada del grupo que consiste en malato deshidrogenasa, nucleasa estafilocócica, delta-V-esteroide isomerasa, alcohol deshidrogenasa de levadura, alfaglicerofosfato deshidrogenasa, triosa fosfato isomerasa, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, asparaginasa., glucosa oxidasa, beta-galactosidasa, ribonucleasa, ureasa, catalasa, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, glucoamilasa y acetilcolinesterasa. Tales enzimas se pueden usar, por ejemplo, en combinación con profármacos que se administran en forma relativamente no tóxica y la enzima convierte en el sitio diana en un agente citotóxico. En otras alternativas, un fármaco puede convertirse en una forma menos tóxica mediante enzimas endógenas en el sujeto, pero puede reconvertirse en una forma citotóxica mediante la enzima terapéutica.
[0040] En otras formas de realización alternativas de la invención como se define en las reivindicaciones, se pueden utilizar adicionalmente anticuerpos anti-TAA distintos de PAM4 y/o RS7. Preferiblemente, el anticuerpo o fragmento del mismo se une a un antígeno asociado a tumor seleccionado del grupo que consiste en CA19.9, DUPAN2, SPAN1, Nd2, B72.3, CC49, CEA (CEACAM5), CEACAM6, Lea, el antígeno de Lewis Le(y), CSAp, factor de crecimiento similar a la insulina (ILGF), glicoproteína epitelial-1 (EGP-1), glicoproteína epitelial-2 (EGP-2), CD80, factor de crecimiento placentario (P<i>GF), anhidrasa carbónica IX, tenascina, IL -6, HLA-DR, CD40, CD74 (p. ej., milatuzumab), CD138 (syndecan-1), MUC-1, MUC-2, MUC-3, MUC-4, MUC-5ac, MUC-16, MUC-17, TAG-72, EGFR, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factores de angiogénesis (p. ej., VEGF y PIGF), productos de oncogenes (p. ej., bcl-2, Kras, p53), cMET, HER2/neu y antígenos asociados con cáncer gástrico y cáncer colorrectal.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0041]
FIG. 1.Imágenes de fusión PET/CT de un paciente con cáncer de páncreas metastásico inoperable tratado con 90Y-hPAM4 fraccionado más gemcitabina, antes de la terapia (lado izquierdo) y después de la terapia (lado derecho). El círculo indica la ubicación de la lesión primaria, que muestra una disminución significativa en la intensidad de la PET/CT después del tratamiento.
FIG. 2.Imágenes PET en 3D de un paciente con cáncer de páncreas metastásico inoperable tratado con 90YhPAM4 fraccionado más gemcitabina, antes de la terapia (lado izquierdo) y después de la terapia (lado derecho). Las flechas señalan las ubicaciones de la lesión primaria (a la derecha) y las metástasis (a la izquierda), cada una de las cuales muestra una disminución significativa en la intensidad de la imagen PET después del tratamiento con hPAM4 radiomarcado más gemcitabina.
FIG. 3.Actividad terapéutica de un tratamiento único de tumores CaPan1 establecidos (~0,4 cm3) con 0,15 pCi de 90Y hPAM4 IgG, o 0,25 o 0,50 pCi de 90Y-IMP-288 predirigido a TF10.
FIG. 4.Efecto de la potenciación con gemcitabina de la terapia PT-RAIT.
FIG. 5.Efecto de la combinación de cetuximab con gemcitabina y PT-RAIT.
FIG.6.Eficacia terapéutica de (Q)-hRS7 demostrada en un modelo de xenoinjerto humano Calu-3 para inhibir el crecimiento tumoral(A)y aumentar la MST(B).Se inocularon ratones desnudos por vía subcutánea con 1 x 107 células Calu-3. Cuando los tumores alcanzaron aproximadamente 0,15 cm3, los ratones fueron tratados con una dosis intravenosa única de 50 pg o dos inyecciones de 25 pg administradas con siete días de diferencia. Los animales de control recibieron solución salina.
FIG. 7ilustra(A)la estructura de SN-38 bifuncional (CL2A-SN-38);(B)un esquema sintético para preparar CL2ASN-38; y(C)un esquema de conjugación para unir CL2A-SN-38 a un anticuerpo.
FIG. 8compara la eficacia terapéutica de hRS7-SN-38 solo, 90Y-hPAM4 solo y la combinación de hRS7-SN-38 y 90Y-hPAM4, a 75 pCi o 130 pCi.
FIG.9ilustra la toxicidad, medida como % de pérdida de peso, de RAIT solo y ADC solo versus la combinación de RAIT más ADC.
FIG. 10compara los efectos de RAIT y ADC simultáneos con la administración secuencial de los dos tratamientos.
FIG. 11muestra los efectos de RAIT y ADC realizados con el mismo anticuerpo (hPAM4).
FIG. 12indica las eficacias comparativas de diferentes conjugados de anticuerpos de SN-38.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Definiciones
[0042]A menos que se especifique lo contrario, "un" o "una" significa uno o más.
[0043]Como se usa en el presente documento, "aproximadamente" significa más o menos 10%. Por ejemplo, "alrededor de 100" incluiría cualquier número entre 90 y 110.
[0044]Un anticuerpo, como se describe en el presente documento, se refiere a una molécula de inmunoglobulina de longitud completa (es decir, de origen natural o formada mediante procesos recombinatorios de fragmentos de genes de inmunoglobulina normales) (por ejemplo, un anticuerpo IgG) o una inmunológicamente activa (es decir, que se une específicamente) porción de una molécula de inmunoglobulina, como un fragmento de anticuerpo.
[0045]Un fragmento de anticuerpo es una porción de un anticuerpo tal como F(ab')2, Fab', Fab, Fv, sFv y similares. Independientemente de la estructura, un fragmento de anticuerpo se une al mismo antígeno que reconoce el anticuerpo de longitud completa. El término "fragmento de anticuerpo" también incluye fragmentos aislados que consisten en regiones variables de anticuerpos, tales como los fragmentos "Fv" que consisten en regiones variables de las cadenas pesada y ligera y moléculas polipeptídicas de cadena sencilla recombinantes en las que se encuentran regiones variables ligeras y pesadas. conectados por un enlazador peptídico ("proteínas scFv").
[0046]Un anticuerpo quimérico es una proteína recombinante que contiene los dominios variables que incluyen las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de un anticuerpo derivado de una especie, preferiblemente un anticuerpo de roedor, mientras que los dominios constantes de la molécula de anticuerpo se derivan de los de un anticuerpo humano. Para aplicaciones veterinarias, los dominios constantes del anticuerpo quimérico pueden derivarse de los de otras especies, como un gato o un perro.
[0047]Un anticuerpo humanizado es una proteína recombinante en la que las CDR de un anticuerpo de una especie; por ejemplo, un anticuerpo de roedor, se transfieren desde las cadenas variables pesada y ligera del anticuerpo de roedor a dominios variables pesados y ligeros humanos (por ejemplo, secuencias de regiones estructurales). Los dominios constantes de la molécula de anticuerpo se derivan de los de un anticuerpo humano. En determinadas formas de realización, se puede sustituir un número limitado de residuos de aminoácidos de la región estructural del anticuerpo original (de roedor) en las secuencias de la región estructural del anticuerpo humano.
[0048]Un anticuerpo humano es, por ejemplo, un anticuerpo obtenido de ratones transgénicos que han sido "diseñados" para producir anticuerpos humanos específicos en respuesta a una exposición antigénica. En esta técnica, se introducen elementos de los loci de las cadenas pesadas y ligeras humanas en cepas de ratones derivados de líneas de células madre embrionarias que contienen alteraciones específicas de los loci de las cadenas pesadas y ligeras endógenas murinas. Los ratones transgénicos pueden sintetizar anticuerpos humanos específicos para antígenos particulares, y los ratones pueden usarse para producir hibridomas secretores de anticuerpos humanos. Green et al., Nature Genet, describen métodos para obtener anticuerpos humanos a partir de ratones transgénicos.
7:13 (1994), Lonberg et al., Nature 368:856 (1994), y Taylor et al., Int. Inmune. 6:579 (1994). También se puede construir un anticuerpo completamente humano mediante métodos de transfección genética o cromosómica, así como tecnología de presentación en fagos, todos los cuales son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990) para la producción de anticuerpos humanos y fragmentos de los mismosin vitro,a partir de repertorios de genes de dominio variable de inmunoglobulina de donantes no inmunizados. En esta técnica, los genes del dominio variable del anticuerpo se clonan en marco en un gen de la proteína de cubierta mayor o menor de un bacteriófago filamentoso y se muestran como fragmentos de anticuerpo funcionales en la superficie de la partícula del fago. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN monocatenario del genoma del fago, las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo también dan como resultado la selección del gen que codifica el anticuerpo que exhibe esas propiedades. De esta forma, el fago imita algunas de las propiedades de la célula B. La presentación en fagos se puede realizar en una variedad de formatos; para su revisión, véase, por ejemplo, Johnson y Chiswell, Current Opinion in Structural Biology 3:5564-571 (1993). Los anticuerpos humanos también pueden generarse mediante células B activadasin vitro.Véase la patente de EE.UU. Nos 5.567.610 y 5.229.275.
[0049]Un agente terapéutico es un compuesto, molécula o átomo que se administra por separado, simultáneamente o secuencialmente con un resto de anticuerpo o se conjuga con un resto de anticuerpo, es decir, anticuerpo o fragmento de anticuerpo, o un subfragmento, y es útil en el tratamiento de una enfermedad. Ejemplos de agentes terapéuticos incluyen anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, fármacos, toxinas, nucleasas, hormonas, inmunomoduladores, agentes proapoptóticos, agentes antiangiogénicos, compuestos de boro, agentes fotoactivos o colorantes y radioisótopos. Los agentes terapéuticos de uso se describen con más detalle a continuación.
[0050]Un inmunoconjugado es un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o proteína de fusión conjugado con al menos un agente terapéutico y/o de diagnóstico.
[0051]Un anticuerpo multiespecífico es un anticuerpo que puede unirse simultáneamente a al menos dos dianas que tienen una estructura diferente, por ejemplo, dos antígenos diferentes, dos epítopos diferentes en el mismo antígeno o un hapteno y/o un antígeno o epítopo. Los anticuerpos multiespecíficos y multivalentes son construcciones que tienen más de un sitio de unión y los sitios de unión son de diferente especificidad.
[0052] Un anticuerpo biespecífico es un anticuerpo que puede unirse simultáneamente a dos objetivos diferentes. Los anticuerpos biespecíficos (bsAb) y los fragmentos de anticuerpos biespecíficos (bsFab) pueden tener al menos un brazo que se une específicamente a, por ejemplo, un antígeno asociado a tumor y al menos otro brazo que se une específicamente a un conjugado dirigible que porta un efecto terapéutico o de diagnóstico. agente. Se puede producir una variedad de proteínas de fusión biespecíficas mediante ingeniería molecular.
Anticuerpo PAM4
[0053] Varios ejemplos de la divulgación se refieren a anticuerpos que reaccionan con una selectividad muy alta con el cáncer de páncreas en contraposición a los tejidos pancreáticos normales o benignos. Los anticuerpos anticáncer de páncreas y sus fragmentos se generan preferentemente contra una preparación de mucina cruda procedente de un tumor del páncreas humano, aunque se pueden utilizar mucinas parcialmente purificadas o incluso purificadas. Un ejemplo no limitante de dichos anticuerpos es el anticuerpo PAM4.
[0054] El anticuerpo PAM4 murino (mPAM4) se desarrolló empleando mucina de cáncer de páncreas derivada del carcinoma de páncreas humano RIP-1 xenoinjertado como inmunógeno. (Gold et al., Int. J. Cancer, 57:204-210, 1994). Los estudios de reactividad cruzada de anticuerpos y de tinción inmunohistoquímica indican que el anticuerpo PAM4 reconoce un epítopo único y novedoso en un antígeno de cáncer de páncreas diana. Los estudios de tinción inmunohistoquímica (véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. n° 7.282.567), han demostrado que el MAb PAM4 se une a un antígeno expresado por células cancerosas de mama, páncreas y otras células cancerosas, con unión limitada al tejido humano normal; sin embargo, la expresión más alta suele ser en células de cáncer de páncreas. Por tanto, los anticuerpos PAM4 son relativamente específicos del cáncer de páncreas y se unen preferentemente a las células de cáncer de páncreas. El anticuerpo PAM4 reacciona con un epítopo diana que puede internalizarse. Este epítopo se expresa principalmente por antígenos asociados con el cáncer de páncreas y no con pancreatitis focal o tejido pancreático normal. Los estudios de localización y terapia utilizando un MAb PAM4 radiomarcado en modelos animales han demostrado eficacia terapéutica y focalización en tumores(Id.).
[0055] El anticuerpo PAM4 exhibe varias propiedades que lo convierten en un buen candidato para aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico clínico. El anticuerpo PAM4 aparentemente reconoce un epítopo de un antígeno de cáncer de páncreas que es distinto de los epítopos reconocidos por anticuerpos contra el cáncer de páncreas no PAM4 (CA19.9, DUPAN2, SPAN1, Nd2, CEACAM5, CEACAM6, B72.3, anti-Lea, y otros antígenos anti-Lewis)(Id.).Los anticuerpos adecuados para su uso en combinación o junto con el anticuerpo PAM4 incluyen, por ejemplo, CA19.9, DUPAN2, SPAN1, Nd2, B72.3, CC49, anti-CEACAM5, anti-CEACAM6, anti-Lea, anti-HLA-DR, anti-CD40, anti-CD74, anti-CD138 y anticuerpos definidos por el antígeno de Lewis Le(y), o anticuerpos contra el antígeno p específico del colon (CSAp), MUC-1, MUC-2, MUC-3, MUC-4, MUC-5ac, MUC-16, MUC-17, EGP-1, EGP-2, HER2/neu, EGFR, factores de angiogénesis (p. ej., VEGF y PIGF), factor de crecimiento similar a la insulina (ILGF), tenascina, factor de crecimiento derivado de plaquetas e IL-6, así como productos de oncogenes (bcl-2, Kras, p53), cMET y anticuerpos contra sustancias de necrosis tumoral, tales como los descritos en las patentes de Epstein et al. (Patentes de Estados Unidos Nos 6.071.491, 6.017.514, 5.019.368 y 5.882.626). Dichos anticuerpos serían útiles para complementar la reactividad del anticuerpo PAM4 con el cáncer de páncreas. Estos y otros agentes terapéuticos podrían actuar sinérgicamente con el anticuerpo PAM4, cuando se administran antes, junto con o después de la administración del anticuerpo PAM4.
[0056] Formas de realización preferidas de la invención, tal como se define en las reivindicaciones, pueden implicar el uso de un anticuerpo PAM4 humanizado. Debido a que el huésped humano puede reconocer los anticuerpos monoclonales no humanos como una proteína extraña y las inyecciones repetidas pueden provocar reacciones de hipersensibilidad dañinas, la humanización de secuencias de anticuerpos murinos puede reducir la respuesta inmune adversa que los pacientes pueden experimentar. Para los anticuerpos monoclonales de origen murino, esto a menudo se denomina respuesta de anticuerpo humano anti-ratón (HAMA). Preferiblemente, algunos residuos humanos en las regiones estructurales del anticuerpo PAM4 humanizado o fragmentos del mismo se reemplazan por sus homólogos murinos. También se prefiere que se use una combinación de secuencias estructurales de dos anticuerpos humanos diferentes para V<h>. Los dominios constantes de la molécula de anticuerpo se derivan de los de un anticuerpo humano.
Anticuerpo RS7
[0057] El anticuerpo RS7 es una IgG1 murina generada contra una preparación de membrana cruda de un carcinoma pulmonar de células escamosas primario humano. (Stein et al., Cancer Res. 50: 1330, 1990). El anticuerpo RS7 reconoce una glicoproteína de 46-48 kDa, caracterizada como grupo 13. (Stein et al., Int. J. Cancer Supp. 8:98-102, 1994) El antígeno fue designado como EGP-1 (glucoproteína epitelial-1), pero también se lo conoce como T rop-2.
[0058] Trop-2 es una proteína transmembrana de tipo I y se ha clonado a partir de células tanto humanas (Fornaro et al., Int J Cancer 1995; 62:610-8) como de ratón (Sewedy et al., Int J Cancer 1998; 75:324-30). Además de su papel como transductor de señales de calcio asociado a tumores (Ripani et al., Int J Cancer 1998;76:671-6), se demostró que la expresión de Trop-2 humano es necesaria para la tumorigénesis y la invasividad de las células de cáncer de colon que podría reducirse eficazmente con un anticuerpo policlonal contra el dominio extracelular de Trop-2 (Wang et al., Mol Cancer Ther 2008;7:280-5).
[0059]El creciente interés en Trop-2 como diana terapéutica para cánceres sólidos (Cubas et al., Biochim Biophys Acta 2009;1796:309-14) está atestiguado por informes adicionales que documentaron la importancia clínica de Trop-2 sobreexpresado en mama (Huang et al., Clin Cancer Res 2005;11:4357-64), colorrectal (Ohmachi et al., Clin Cancer Res 2006;12:3057-63; Fang et al., Int J Colorectal Dis 2009;24: 875-84), y carcinomas de células escamosas orales (Fong et al., Modern Pathol 2008;21:186-91). Es particularmente notable la evidencia más reciente de que las células basales de la próstata que expresan altos niveles de Trop-2 están enriquecidas para una actividad similar a un tallo in vitro e in vivo (Goldstein et al., Proc Natl Acad Sci EE.<u>U. 2008;105:20882-7).
[0060]Los estudios de citometría de flujo y tinción inmunohistoquímica han demostrado que el MAb RS7 detecta antígeno en una variedad de tipos de tumores, con unión limitada al tejido humano normal. (Stein et al., 1990) EGP-1 se expresa principalmente en carcinomas tales como carcinomas de pulmón, estómago, vejiga urinaria, mama, ovario, útero y próstata. Los estudios de localización y terapia utilizando MAb RS7 murino radiomarcado en modelos animales han demostrado eficacia terapéutica y focalización de tumores (Stein et al., 1990; Stein et al., 1991).
[0061]Se ha demostrado una fuerte tinción de RS7 en tumores de pulmón, mama, vejiga, ovario, útero, estómago y próstata. (Stein et al., Int. J. Cancer 55:938, 1993) Los casos de cáncer de pulmón comprendían tanto carcinomas de células escamosas como adenocarcinomas.(Id.)Ambos tipos de células se tiñeron fuertemente, lo que indica que el anticuerpo RS7 no distingue entre clases histológicas de carcinoma de pulmón de células no pequeñas.
[0062]El MAb RS7 se internaliza rápidamente en las células diana (Stein et al., 1993). La constante de tasa de internalización para RS7 MAb es intermedia entre las constantes de tasa de internalización de otros dos MAb de internalización rápida, que han demostrado ser útiles para la producción de inmunotoxinas.(Id.)Está bien documentado que la internalización de conjugados de inmunotoxina es un requisito para la actividad antitumoral. (Pastan et al., Cell 47:641, 1986) La internalización de inmunoconjugados de fármacos se ha descrito como un factor importante en la eficacia antitumoral. (Yang et al., Proc. Nat'l Acad. Sci EE.UU. 85: 1189, 1988) Por tanto, el anticuerpo RS7 exhibe varias propiedades importantes para aplicaciones terapéuticas.
Preparación de anticuerpos
[0063]MAbs se pueden aislar y purificar a partir de cultivos de hibridoma mediante una variedad de técnicas bien establecidas. Dichas técnicas de aislamiento incluyen cromatografía de afinidad con Proteína A o Proteína G Sefarosa, cromatografía de exclusión por tamaño y cromatografía de intercambio iónico. Véase, por ejemplo, Coligan en las páginas 2.7.1-2.7.12 y 2.9.1-2.9.3. Véase también Baines et al., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)", en METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, VOL. 10, páginas 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992). Después de la generación inicial de anticuerpos contra el inmunógeno, los anticuerpos pueden secuenciarse y prepararse posteriormente mediante técnicas recombinantes. La humanización y quimerización de anticuerpos murinos y fragmentos de anticuerpos son bien conocidas por los expertos en la técnica, como se analiza a continuación.
Anticuerpos quiméricos
[0064]Un anticuerpo quimérico es una proteína recombinante en la que las regiones variables de un anticuerpo humano han sido reemplazadas por las regiones variables de, por ejemplo, un anticuerpo de ratón, incluidas las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) del anticuerpo de ratón. Los anticuerpos quiméricos exhiben una inmunogenicidad disminuida y una mayor estabilidad cuando se administran a un sujeto. Las técnicas generales para clonar dominios variables de inmunoglobulina murina se describen, por ejemplo, en Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 6: 3833 (1989). Las técnicas para construir anticuerpos quiméricos son bien conocidas por los expertos en la técnica. Como ejemplo, Leung et al., Hybridoma 13:469 (1994), produjeron una quimera LL2 combinando secuencias de ADN que codifican los dominios V<k>y V<h>de LL2 murino, un anticuerpo monoclonal anti-CD22, con los respectivos dominios de regiones constantes humanas k e IgG1.
Anticuerpos humanizados
[0065]Las técnicas para producir MAb humanizados son bien conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Jones et al., Nature 321:522 (1986), Riechmann et al., Nature 332:323 (1988), Verhoeyen et al., Science 239: 1534 (1988), Carter et al., Proc. Nat'l Acad. EE.UU. 89: 4285 (1992), Sandhu, Crit. Biotech 12: 437 (1992)., J. Immun 150: 2844 (1993)). Un anticuerpo monoclonal quimérico o murino puede humanizarse transfiriendo las CDR de ratón de las cadenas variables pesadas y ligeras de la inmunoglobulina de ratón a los dominios variables correspondientes de un anticuerpo humano. Las regiones estructurales (FR) de ratón en el anticuerpo monoclonal quimérico también se reemplazan con secuencias de FR humanas. Como la simple transferencia de CDR de ratón a FR humanas a menudo da como resultado una reducción o incluso una pérdida de la afinidad del anticuerpo, podría ser necesaria una modificación adicional para restaurar la afinidad original del anticuerpo murino. Esto se puede lograr mediante la sustitución de uno o más residuos humanos en las regiones FR con sus homólogos murinos para obtener un anticuerpo que posea una buena afinidad de unión a su epítopo. Véase, por ejemplo, Tempest et al., Biotechnology 9:266 (1991) y Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988). Los residuos preferidos para la sustitución incluyen residuos de FR que están ubicados dentro de 1, 2 o 3 angstroms de una cadena lateral de un residuo de CDR, que están ubicados adyacentes a una secuencia de CDR o que se predice que interactuarán con un residuo de CDR.
Anticuerpos humanos
[0066]Se conocen en la técnica métodos para producir anticuerpos completamente humanos utilizando enfoques combinatorios o animales transgénicos transformados con loci de inmunoglobulina humana (por ejemplo, Mancini et al., 2004, New Microbiol. 27:315-28; Conrad y Scheller, 2005, Comb Chem. High Throughput Screen 8:117-26; También se puede construir un anticuerpo completamente humano mediante métodos de transfección genética o cromosómica, así como tecnología de presentación en fagos, todos los cuales son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990). Se espera que tales anticuerpos completamente humanos presenten incluso menos efectos secundarios que los anticuerpos quiméricos o humanizados y funcionenin vivocomo anticuerpos humanos esencialmente endógenos.
[0067]En una alternativa, la técnica de presentación en fagos se puede usar para generar anticuerpos humanos (por ejemplo, DantasBarbosa et al., 2005, Genet. Mol. Res. 4:126-40). Los anticuerpos humanos pueden generarse a partir de humanos normales o de humanos que presentan un estado patológico particular, como el cáncer (Dantas-Barbosa et al., 2005). La ventaja de construir anticuerpos humanos a partir de un individuo enfermo es que el repertorio de anticuerpos circulantes puede estar sesgado hacia anticuerpos contra antígenos asociados a enfermedades.
[0068]En un ejemplo no limitante de esta metodología, Dantas-Barbosa et al. (2005) construyeron una biblioteca de presentación en fagos de fragmentos de anticuerpos Fab humanos de pacientes con osteosarcoma. Generalmente, el ARN total se obtuvo de linfocitos sanguíneos circulantes(Id.).Se clonaron Fab recombinantes a partir de los repertorios de anticuerpos de cadena p, y y k y se insertaron en una biblioteca de presentación en fagos (Id.). Los<a>R<n>se convirtieron en ADNc y se usaron para preparar bibliotecas de ADNc de Fab usando cebadores específicos contra las secuencias de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera (Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222:581-97). La construcción de la biblioteca se realizó según Andris-Widhopf et al. (2000, en: Phage Display Laboratory Manual, Barbas et al. (eds), 1.a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, págs. 9.1 a 9.22). Los fragmentos Fab finales se digirieron con endonucleasas de restricción y se insertaron en el genoma del bacteriófago para crear la biblioteca de presentación en fagos. Dichas bibliotecas pueden seleccionarse mediante métodos estándar de presentación en fagos, como se conoce en la técnica. La presentación en fagos se puede realizar en una variedad de formatos; para su revisión, véase, por ejemplo, Johnson y Chiswell, Current Opinion in Structural Biology 3:5564-571 (1993).
[0069]Los anticuerpos humanos también pueden generarse mediante células B activadasin vitro.Véanse las patentes de EE.UU. números 5.567.610 y 5.229.275. El experto en la técnica se dará cuenta de que estas técnicas son ejemplares y que se puede utilizar cualquier método conocido para producir y seleccionar anticuerpos o fragmentos de anticuerpos humanos.
[0070]En otra alternativa, se pueden usar animales transgénicos que han sido modificados genéticamente para producir anticuerpos humanos para generar anticuerpos contra esencialmente cualquier objetivo inmunogénico, usando protocolos de inmunización estándar. Green et al., Nature Genet, describen métodos para obtener anticuerpos humanos a partir de ratones transgénicos. 7:13 (1994), Lonberg et al., Nature 368:856 (1994), y Taylor et al., Int. Inmune. 6:579 (1994). Un ejemplo no limitante de dicho sistema es el XenoMouse® (por ejemplo, Green et al., 1999, J. Immunol. Methods 231:11-23) de Abgenix (Fremont, CA). En XenoMouse® y animales similares, los genes de anticuerpos de ratón han sido inactivados y reemplazados por genes de anticuerpos humanos funcionales, mientras que el resto del sistema inmunológico del ratón permanece intacto.
[0071]El XenoMouse® se transformó con YAC (cromosomas artificiales de levadura) configurados en línea germinal que contenían porciones de los loci IgH e Igkappa humanos, incluida la mayoría de las secuencias de la región variable, junto con genes accesorios y secuencias reguladoras. El repertorio de regiones variables humanas puede usarse para generar células B productoras de anticuerpos, que pueden procesarse para dar hibridomas mediante técnicas conocidas. Un XenoMouse® inmunizado con un antígeno diana producirá anticuerpos humanos mediante la respuesta inmune normal, que pueden recolectarse y/o producirse mediante técnicas estándar analizadas anteriormente. Hay disponibles una variedad de cepas de XenoMouse®, cada una de las cuales es capaz de producir una clase diferente de anticuerpo. Se ha demostrado que los anticuerpos humanos producidos transgénicamente tienen potencial terapéutico, al tiempo que conservan las propiedades farmacocinéticas de los anticuerpos humanos normales (Green et al., 1999). El experto se dará cuenta de que las composiciones y métodos reivindicados no se limitan al uso del sistema XenoMouse® sino que pueden utilizar cualquier animal transgénico que haya sido modificado genéticamente para producir anticuerpos humanos.
Anticuerpos conocidos y antígenos diana
[0072]Como se analizó anteriormente, los anticuerpos inmunoconjugados son útiles para el tratamiento del cáncer de páncreas. Sin embargo, el experto se dará cuenta de que la divulgación no está tan limitada y puede aplicarse a otros tipos de cáncer o incluso a otros estados patológicos. Los ejemplos no limitantes incluyen enfermedades malignas, enfermedades cardiovasculares, enfermedades infecciosas, enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunes, enfermedades de disfunción inmune (por ejemplo, enfermedad de injerto contra huésped o rechazo de trasplante de órganos) o enfermedades neurológicas. Los antígenos diana ejemplares de uso para el tratamiento de dichas enfermedades pueden incluir anhidrasa carbónica IX, CCCL19, CCCL21, CSAp, CD1, CD1a, CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD11A, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, IGF-1R., CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD29, CD30, CD32b, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD45, CD46, CD52, CD54, CD55, CD59, CD64, CD66a-e, CD67, CD70, CD74., CD79a, CD80, CD83, CD95, CD126, CD133, CD138, CD147, CD154, CXCR4, AFP, PSMA, CEACAM5, CEACAM6, B7, ED-B de fibronectina, Factor H, FHL-1, Flt-3, receptor de folato, GROB, HMGB-1, factor inducible por hipoxia (HIF), HM1.24, factor de crecimiento similar a la insulina-1 (ILGF-1), IFN-y, IFN-a, IFN-p, IL-2, IL-4R, IL-6R, IL-13R, IL-15R, IL-17R, IL-18R, IL-6, IL-8, IL-12, IL-15, IL-17, IL-18, IL-25, IP-10, MAGE, mCRP, MCP-1, MIP-1A, MIP-1B, MIF, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5, NCA-95, NCA-90, Ia, HM1.24, EGP-1, EGP-2, HLA-DR, tenascina, Le(y), RANTES, T101, TAC, antígeno Tn, antígenos de Thomson-Friedenreich, antígenos de necrosis tumoral, TNF-a, receptor TRAIL (R1 y R2), VEGFR, EGFR, PlGF, factores del complemento C3, C3a, C3b, C5a, C5 y un producto oncogén.
[0073]En ciertos ejemplos, tales como el tratamiento de tumores, los anticuerpos de uso pueden dirigirse a antígenos asociados a tumores. Estos marcadores antigénicos pueden ser sustancias producidas por un tumor o pueden ser sustancias que se acumulan en el sitio del tumor, en las superficies de las células tumorales o dentro de las células tumorales. Entre dichos marcadores asociados a tumores se encuentran los descritos por Herberman, "Immunodiagnosis of Cancer", en Fleisher ed., "The Clinical Biochemistry of Cancer", página 347 (American Association of Clinical Chemists, 1979) y en la patente de EE.UU. Nos 4.150.149; 4.361.544; y 4.444.744. Los informes sobre antígenos asociados a tumores (TAA) incluyen Mizukami et al., (2005, Nature Med. 11:992-97); Hatfield et al., (2005, Curr. Cancer Drug Targets 5:229-48); Vallbohmer et al. (2005, J. Clin. Oncol. 23:3536-44); y Ren et al. (2005, Ann. Surg. 242:55-63).
[0074]Herberman, supra, ha clasificado los marcadores asociados a tumores en varias categorías que incluyen antígenos oncofetales, antígenos placentarios, antígenos asociados a virus oncogénicos o tumorales, antígenos asociados a tejidos, antígenos asociados a órganos, hormonas ectópicas y antígenos normales o variantes de los mismos. Ocasionalmente, se usa ventajosamente una subunidad de un marcador asociado a tumores para generar anticuerpos que tienen una mayor especificidad tumoral, por ejemplo, la subunidad beta de la gonadotropina coriónica humana (HCG) o la región gamma del antígeno carcinoembrionario (CEA), que estimulan la producción. de anticuerpos que tienen una reactividad cruzada muy reducida con sustancias no tumorales como se describe en la patente de EE.UU. Nos 4.361.644 y 4.444.744.
[0075]Otro marcador de interés es el activador transmembrana y el interactor CAML (TACI). Véase Yu et al. Nat. Immunol. 1:252-256 (2000). Brevemente, TACI es un marcador de neoplasias malignas de células B (p. ej., linfoma). TACI y el antígeno de maduración de células B (BCMA) están unidos por el homólogo del factor de necrosis tumoral, un ligando inductor de proliferación (APRIL). APRIL estimula la proliferación in vitro de células B y T primarias y aumenta el peso del bazo debido a la acumulación de células Bin vivo.APRIL también compite con Ta l L-I (también llamado BLyS o BAFF) por la unión al receptor. BCMA y TACI solubles previenen específicamente la unión de APRIL y bloquean la proliferación de células B primarias estimulada por APRIL. BCMA-Fc también inhibe la producción de anticuerpos contra la hemocianina de lapa californiana y Pneumovax en ratones, lo que indica que la señalización de APRIL y/o TALL-I a través de BCMA y/o TACI son necesarias para la generación de inmunidad humoral. Por lo tanto, APRIL-TALL-I y BCMA-TACI forman una vía de dos ligandos y dos receptores implicada en la estimulación de la función de las células B y T.
[0076]Cuando la enfermedad implica un linfoma, leucemia o un trastorno autoinmune, los antígenos diana pueden seleccionarse del grupo que consiste en CD4, CD5, CD8, CD14, CD15, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD33, CD37, CD38, CD40, CD40L, CD46, CD52, CD54, CD67, CD74, CD79a, CD80, CD126, CD138, CD154, B7, MUC1, Ia, Ii, HM1.24, HLA-DR, tenascina, VEGF, PlGF, fibronectina ED-B, un oncogén, un producto oncogén, CD66ad, antígenos de necrosis, IL-2, T101, TAG, IL-6, MIF, TRAIL-R1 (DR4) y TRAIL-R2 (DR5).
[0077]El experto se dará cuenta de que se puede utilizar cualquier anticuerpo o fragmento conocido en la técnica que tenga especificidad de unión para un antígeno diana asociado con un estado o afección patológica. Dichos anticuerpos conocidos incluyen, entre otros, hR1 (anti-IGF-1R, solicitud de patente de EE.UU. n.° de serie 12/772.645, presentada el 12/03/10) hPAM4 (mucina contra el cáncer de páncreas, patente de EE.UU. n.° 7.282.567), hA20 (anti-CD20, patente de EE.UU. n.° 7.251.164), hA19 (anti-CD19, patente de EE.UU. n.° 7.109.304), hIMMU31 (anti-AFP, patente de EE.UU. n.° 7.300.655), hLL1 (anti-CD74, patente de EE.UU. n.° 7.312.318), hLL2 (antiCD22, patente de EE.UU. n.° 7.074.403), hMu-9 (anti-CSAp, patente de EE.UU. n.° 7.387.773), hL243 (anti-HLA-DR, patente de EE.UU. n.° 7.612.180), hMN-14 (anti- CEACAM5, patente de EE.UU. n.° 6.676.924), hMN-15 (anti-CEACAM6, patente de EE.UU. n.° 7.662.378, solicitud de patente de EE.UU. n.° de serie 12/846.062, presentada el 29/7/10), hRS7 (antiEGP-1, patente n° 7.238.785), hMN-3 (anti-CEACAM6, patente de EE.UU. n° 7.541.440), Ab124 y Ab125 (anti-CXCR4, patente de EE.UU. n° 7.138.496).
[0078]Se conocen en la técnica varios otros anticuerpos de uso (por ejemplo, patentes de EE.UU. Nos 5.686.072; 5.874.540; 6.107.090; 6.183.744; 6.306.393; 6.653.104; 6.730.300; 6.899.864; 6.926.893; 6.962.702; 7.238.786;
7.282.567; 7.300.655; 7.312.318; 7.585.491; 7.642.239 y publicación de solicitud de patente de EE.UU. 20060193865).
[0079]Los anticuerpos de uso pueden obtenerse comercialmente a partir de una amplia variedad de fuentes conocidas. Por ejemplo, una variedad de líneas de hibridoma secretoras de anticuerpos están disponibles en la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Una gran cantidad de anticuerpos contra diversos objetivos de enfermedades, incluidos, entre otros, antígenos asociados a tumores, se han depositado en la ATCC y/o se han publicado secuencias de regiones variables y están disponibles para su uso en los métodos y composiciones reivindicados. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. no 7.312.318; 7.282.567; 7.151.164; 7.074.403 7.060.802 7.056.509; 7.049.060; 7.045.132; 7.041.803 7.041.802 7.041.293 7.038.018; 7.037.498; 7.012.133 7.001.598 6.998.468; 6.994.976; 6.994.852; 6.989.241 6.974.863 6.965.018 6.964.854; 6.962.981; 6.962.813 6.956.107 6.951.924; 6.949.244; 6.946.129; 6.943.020 6.939.547 6.921.645 6.921.645; 6.921.533; 6.919.433 6.919.078 6.916.475; 6.905.681; 6.899.879; 6.893.625 6.887.468 6.887.466 6.884.594; 6.881.405; 6.878.812 6.875.580 6.872.568; 6.867.006; 6.864.062; 6.861.511 6.861.227 6.861.226 6.838.282; 6.835.549; 6.835.370 6.824.780 6.824.778; 6.812.206; 6.793.924; 6.783.758 6.770.450 6.767.711 6.764.688; 6.764.681; 6.764.679 6.743.898 6.733.981; 6.730.307; 6.720,15; 6.716.966; 6.709.653; 6.693.176; 6.692.908; 6.689.607; 6.689.362 6.689.355 6.682.737; 6.682.736; 6.682.734; 6.673.344; 6.653.104; 6.652.852; 6.635.482; 6.630.144; 6.610.833 6.610.294 6.605.441; 6.605.279; 6.596.852; 6.592.868; 6.576.745; 6.572;856; 6.566.076; 6.562.618; 6.545.130 6.544.749 6.534.058; 6.528.625; 6.528.269; 6.521.227; 6.518.404; 6.511.665; 6.491.915; 6.488.930; 6.482.598 6.482.408 6.479.247; 6.468.531; 6.468.529; 6.465.173; 6.461.823; 6.458.356; 6.455.044; 6.455.040, 6.451.310 6.444.206 6.441.143; 6.432.404; 6.432.402; 6.419.928; 6.413.726; 6.406.694; 6.403.770; 6.403.091; 6.395.276 6.395.274 6.387.350 6.383.759; 6.383.484; 6.376.654; 6.372.215; 6.359.126; 6.355.481; 6.355.444; 6.355.245 6.355.244 6.346.246 6.344.198; 6.340.571; 6.340.459; 6.331.175; 6.306.393; 6.254.868; 6.187.287; 6.183.744 6.129.914 6.120.767 6.096.289; 6.077.499; 5.922.302; 5.874.540; 5.814.440; 5.798.229; 5.789.554; 5.776.456 5.736.119 5.716.595; 5.677.136; 5.587.459; 5.443.953, 5.525.338. Estos son sólo ejemplos y en la técnica se conoce una amplia variedad de otros anticuerpos y sus hibridomas. El experto se dará cuenta de que se pueden obtener secuencias de anticuerpos o hibridomas secretores de anticuerpos contra casi cualquier antígeno asociado a una enfermedad mediante una simple búsqueda en las bases de datos de ATCC, NCBI y/o USPTO de anticuerpos contra una diana de interés asociada a una enfermedad seleccionada. Los dominios de unión a antígeno de los anticuerpos clonados pueden amplificarse, escindirse, ligarse en un vector de expresión, transfectarse en una célula huésped adaptada y usarse para la producción de proteínas, usando técnicas estándar bien conocidas en la técnica.
Fragmentos de anticuerpos
[0080]Los fragmentos de anticuerpo son porciones de unión a antígeno de un anticuerpo, tales como F(ab')2, Fab', F(ab)2, Fab, Fv, sFv, scFv y similares. Mediante técnicas conocidas se pueden generar fragmentos de anticuerpos que reconocen epítopos específicos. Los fragmentos F(ab')2, por ejemplo, pueden producirse mediante digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo. Estos y otros métodos se describen, por ejemplo, en Goldenberg, patente de EE.UU. Nos 4.036.945 y 4.331.647 y referencias contenidas en las mismas. Véase también Nisonoff et al., Arch Biochem. Biophys. 89: 230 (1960); Porter, Biochem. J. 73: 119 (1959), Edelman et al., en METHODS IN ENZYMOLOGY VOL. 1, página 422 (Academic Press 1967), y Coligan en las páginas 2.8.1-2.8.10 y 2.10.-2.10.4. Alternativamente, se pueden construir bibliotecas de expresión Fab' (Huse et al., 1989, Science, 246:1274-1281) para permitir una identificación rápida y sencilla de fragmentos Fab' monoclonales con la especificidad deseada.
[0081]Una molécula Fv de cadena única (scFv) comprende un dominio V<l>y un dominio VH. Los dominios V<l>y VH se asocian para formar un sitio de unión objetivo. Estos dos dominios están además unidos covalentemente mediante un enlazador peptídico (L). Una molécula scFv se indica como V<l>-L-VH si el dominio V<l>es la parte N-terminal de la molécula scFv, o como VH-L-V<l>si el dominio VH es la parte N-terminal de la molécula scFv. Los métodos para preparar moléculas scFv y diseñar conectores peptídicos adecuados se describen en las patentes de EE.UU. n° 4.704.692, patente de EE.UU. 4.946.778, R. Raag y M. Whitlow, "Single Chain Fvs". FASEB Vol 9:73-80 (1995) y R. E. Bird y B. W. Walker, Single Chain Antibody Variable Regions, TIBTECH, Vol 9: 132-137 (1991).
[0082]Otros fragmentos de anticuerpos, por ejemplo, fragmentos de anticuerpos de dominio único, se conocen en la técnica, y pueden usarse en las construcciones reivindicadas. Los anticuerpos de dominio único (VHH) pueden obtenerse, por ejemplo, de camellos, alpacas o llamas mediante técnicas de inmunización estándar. (Ver, por ejemplo, Muyldermans et al., TIBS 26:230-235, 2001; Yau et al., J Immunol Methods 281:161-75, 2003; Maass et al., J Immunol Methods 324:13-25, 2007). El VHH puede tener una potente capacidad de unión a antígeno y puede interactuar con nuevos epítopos que son inaccesibles a los pares<v>H-V<l>convencionales. (Muyldermans et al., 2001). La IgG sérica de alpaca contiene aproximadamente un 50% de anticuerpos IgG (HCAb) de cadena pesada de camélido únicamente (Maass et al., 2007). Las alpacas se pueden inmunizar con antígenos conocidos, como el TNF-a, y se pueden aislar VHH que se unen al antígeno diana y lo neutralizan (Maass et al., 2007). Se han identificado cebadores de PCR que amplifican prácticamente todas las secuencias codificantes de VHH de alpaca y pueden usarse para construir bibliotecas de presentación en fagos de VHH de alpaca, que pueden usarse para el aislamiento de fragmentos de anticuerpos mediante técnicas de biopanning estándar bien conocidas en la técnica (Maass et al., 2007).
[0083]También se puede preparar un fragmento de anticuerpo mediante hidrólisis proteolítica de un anticuerpo de longitud completa o mediante expresión en E. coli u otro huésped del ADN que codifica el fragmento. Se puede obtener un fragmento de anticuerpo mediante digestión con pepsina o papaína de anticuerpos de longitud completa mediante métodos convencionales. Por ejemplo, se puede producir un fragmento de anticuerpo mediante escisión enzimática de anticuerpos con pepsina para proporcionar un fragmento de aproximadamente 100 kD denominado F(ab')2. Este fragmento se puede escindir adicionalmente usando un agente reductor de tiol y, opcionalmente, un grupo bloqueante para los grupos sulfhidrilo resultantes de la escisión de enlaces disulfuro, para producir un fragmento monovalente Fab' de aproximadamente 50 Kd. Alternativamente, una escisión enzimática usando papaína produce directamente dos fragmentos Fab monovalentes y un fragmento Fc.
[0084]Otros métodos de escisión de anticuerpos, como la separación de cadenas pesadas para formar fragmentos monovalentes de cadenas ligeras y pesadas, escisión adicional de fragmentos u otras técnicas enzimáticas, químicas o genéticas, siempre que los fragmentos se unan al antígeno que es reconocido por el anticuerpo intacto.
Técnicas generales de clonación y producción de anticuerpos.
[0085]Diversas técnicas, tales como la producción de anticuerpos quiméricos o humanizados, pueden implicar procedimientos de clonación y construcción de anticuerpos. Las secuencias V<k>(cadena ligera variable) y V<h>(cadena pesada variable) de unión al antígeno para un anticuerpo de interés se pueden obtener mediante una variedad de procedimientos de clonación molecular, como RT-PCR, 5'-RACE y detección de bibliotecas de ADNc. Los genes V de un MAb de una célula que expresa un MAb murino pueden clonarse mediante amplificación por PCR y secuenciarse. Para confirmar su autenticidad, los genes V<l>y V<h>clonados pueden expresarse en cultivo celular como un Ab quimérico como describen Orlandi et al., (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86: 3833 (1989)). A partir de las secuencias del gen V, se puede diseñar y construir un MAb humanizado como describen Leung et al. (Mol. Immunol., 32:1413 (1995)).
[0086]Se puede preparar ADNc a partir de cualquier línea de hibridoma conocida o línea celular transfectada que produzca un MAb murino mediante técnicas generales de clonación molecular (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edición (1989)). La secuencia Vk para el MAb puede amplificarse usando los cebadores VK1BACK y VK1FOR (Orlandiet al.,1989) o el conjunto de cebadores extendido descrito por Leung et al. (BioTechniques, 15: 286 (1993)). Las secuencias V<h>se pueden amplificar usando el par de cebadores VH1BACK/VH1FOR (Orlandiet al.,1989) o los cebadores que se hibridan con la región constante de IgG murina descrita por Leung et al. (Hybridoma, 13:469 (1994)). Los genes V humanizados pueden construirse mediante una combinación de síntesis de moldes de oligonucleótidos largos y amplificación por<p>C<r>como lo describen Leung et al. (Mol. Immunol., 32: 1413 (1995)).
[0087]Productos de PCR para Vk se pueden subclonar en un vector de estadificación, tal como un vector de estadificación basado en pBR327, VKpBR, que contiene un promotor de Ig, una secuencia de péptido señal y sitios de restricción convenientes. Los productos de PCR para V<h>se pueden subclonar en un vector de estadificación similar, como el VHpBS basado en pBluescript. Los casetes de expresión que contienen las secuencias V k y V<h>junto con las secuencias del promotor y del péptido señal pueden escindirse de VKpBR y VHpBS y ligarse en vectores de expresión apropiados, tales como pKh y pG1g, respectivamente (Leung et al., Hybridoma, 13:469 (1994)). Los vectores de expresión pueden cotransfectarse en una célula apropiada y los fluidos sobrenadantes pueden controlarse para determinar la producción de un MAb quimérico, humanizado o humano. Alternativamente, los casetes de expresión Vk y V<h>pueden escindirse y subclonarse en un único vector de expresión, tal como pdHL2, como describen Gillies et al. (J. Immunol. Methods 125:191 (1989) y también se muestra en Losman et al., Cancer, 80:2660 (1997)).
[0088]En una forma de realización alternativa, los vectores de expresión se pueden transfectar en células huésped que han sido preadaptadas para la transfección, el crecimiento y la expresión en medio libre de suero. Las líneas celulares ejemplares que pueden usarse incluyen las líneas celulares Sp/EEE, Sp/ESF y Sp/ESF-X (véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. Nos 7.531.327; 7.537.930 y 7.608.425). Estas líneas celulares ejemplares se basan en la línea celular de mieloma Sp2/0, transfectadas con un gen Bcl-EEE mutante, expuestas a metotrexato para amplificar secuencias genéticas transfectadas y preadaptadas a una línea celular libre de suero para la expresión de proteínas.
Anticuerpos biespecíficos y multiespecíficos
[0089]Como se analiza en los ejemplos siguientes, en formas de realización preferidas el anticuerpo radiomarcado y el anticuerpo conjugado con fármaco se administran como anticuerpos separados, ya sea de forma secuencial o simultánea. Sin embargo, en formas de realización alternativas, los dos inmunoconjugados se pueden administrar como un único anticuerpo biespecífico o multiespecífico. Se conocen numerosos métodos para producir anticuerpos biespecíficos o multiespecíficos, como se describe, por ejemplo, en la patente de EE.UU. número 7.405.320. Los anticuerpos biespecíficos pueden producirse mediante el método del cuadroma, que implica la fusión de dos hibridomas diferentes, cada uno de los cuales produce un anticuerpo monoclonal que reconoce un sitio antigénico diferente (Milstein y Cuello, Nature, 1983; 305:537-540).
[0090]Otro método para producir anticuerpos biespecíficos utiliza reticulantes heterobifuncionales para unir químicamente dos anticuerpos monoclonales diferentes (Staerz, et al. Nature. 1985; 314:628-631; Perez, et al. Nature.
1985; 316:354-356). También se pueden producir anticuerpos biespecíficos mediante la reducción de cada uno de los dos anticuerpos monoclonales parentales a las respectivas medias moléculas, que luego se mezclan y se dejan reoxidar para obtener la estructura híbrida (Staerz y Bevan. Proc Natl Acad Sci e E.UU. 1986; 83:1453-1457). Otros métodos incluyen mejorar la eficacia de generar hibridomas híbridos mediante la transferencia genética de distintos marcadores seleccionables a través de vectores lanzadera derivados de retrovirus en hibridomas parentales respectivos, que se fusionan posteriormente (DeMonte, et al. Proc Natl Acad Sci EE.UU. 1990, 87:2941 -2945); o transfección de una línea celular de hibridoma con plásmidos de expresión que contienen los genes de cadena pesada y ligera de un anticuerpo diferente.
[0091]Los dominios Vh y Vl afines se pueden unir con un enlazador peptídico de composición y longitud apropiadas (que normalmente consta de más de 12 residuos de aminoácidos) para formar un Fv monocatenario (scFv), como se analizó anteriormente. La reducción de la longitud del enlazador peptídico a menos de 12 residuos de aminoácidos evita el emparejamiento de los dominios V<h>y V<l>en la misma cadena y fuerza el emparejamiento de los dominios V<h>y Vl con dominios complementarios en otras cadenas, lo que resulta en la formación de multímeros funcionales. Las cadenas polipeptídicas de los dominios V<h>y V<l>que están unidas con conectores entre 3 y 12 residuos de aminoácidos forman predominantemente dímeros (denominados diacuerpos). Con conectores entre 0 y 2 residuos de aminoácidos, se prefieren los trímeros (denominados triacuerpos) y los tetrámeros (denominados tetracuerpos), pero los patrones exactos de oligomerización parecen depender de la composición y de la orientación de los dominios V (VH-enlazador-Vl o VL-enlazador-VH), además de la longitud del enlazador.
[0092]Estas técnicas para producir anticuerpos multiespecíficos o biespecíficos presentan diversas dificultades en términos de bajo rendimiento, necesidad de purificación, baja estabilidad o complejidad de la técnica. Más recientemente, se ha utilizado una técnica conocida como "dock and lock" (DNL), analizada con más detalle a continuación, para producir combinaciones de prácticamente cualquier anticuerpo, fragmento de anticuerpo y otras moléculas efectoras deseadas. Cualquiera de las técnicas conocidas en la técnica para preparar anticuerpos biespecíficos o multiespecíficos se puede utilizar en la práctica de los métodos actualmente reivindicados.
Dock-and-Lock (DNL)
[0093]Se pueden producir anticuerpos biespecíficos o multiespecíficos u otras construcciones usando la tecnología de acoplamiento y bloqueo (véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. números 7.550.143; 7.521.056; 7.534.866; 7.527.787 y 7.666.400). El método DNL aprovecha las interacciones proteína/proteína específicas que se producen entre las subunidades reguladoras (R) de la proteína quinasa dependiente de AMPc (PKA) y el dominio de anclaje (DA) de las proteínas de anclaje de la quinasa A (AKAP) (Baillie et al., FEBS Letters. 2005; 579: 3264. Wong y Scott, Nat. Rev. Mol. La PKA, que desempeña un papel central en una de las vías de transducción de señales mejor estudiadas desencadenada por la unión del segundo mensajero AMPc a las subunidades R, se aisló por primera vez del músculo esquelético de conejo en 1968 (Walsh et al., J. Biol. Chem. 1968; 243:3763). La estructura de la holoenzima consta de dos subunidades catalíticas mantenidas en forma inactiva por las subunidades R (Taylor, J. Biol. Chem. 1989;264:8443). Las isoenzimas de PKA se encuentran con dos tipos de subunidades R (RI y RII), y cada tipo tiene isoformas a y p (Scott, Pharmacol. Ther. 1991 ;50:123). Las subunidades R se han aislado sólo como dímeros estables y se ha demostrado que el dominio de dimerización consta de los primeros 44 residuos amino terminales (Newlon et al., Nat. Struct. Biol. 1999; 6:222). La unión de AMPc a las subunidades R conduce a la liberación de subunidades catalíticas activas para un amplio espectro de actividades de serina/treonina quinasa, que se orientan hacia sustratos seleccionados a través de la compartimentación de PKA mediante su acoplamiento con AKAP (Scott et al., J. Biol. Chem 1990;265;21561) 094*
[0094]Desde que se caracterizó la primera AKAP, la proteína 2 asociada a microtúbulos, en 1984 (Lohmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci EE.UU. 1984; 81:6723), se han identificado más de 50 AKAP que se localizan en varios sitios subcelulares, incluida la membrana plasmática, el citoesqueleto de actina, el núcleo, las mitocondrias y el retículo endoplásmico, con diversas estructuras en especies que van desde levaduras hasta humanos (Wong y Scott, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2004;5: 959). La DA de A kA p para PKA es una hélice anfipática de 14-18 residuos (Carr et al., J. Biol. Chem. 1991;266:14188). Las secuencias de aminoácidos de la DA son bastante variadas entre las AKAP individuales, y las afinidades de unión informadas para los dímeros RII varían de 2 a 90 nM (Alto et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 2003;100:4445). Los AKAP solo se unirán a subunidades R diméricas. Para la Rila humana, la DA se une a una superficie hidrofóbica formada por los 23 residuos amino terminales (Colledge y Scott, Trends Cell Biol.
1999; 6:216). Por lo tanto, el dominio de dimerización y el dominio de unión a AKAP de la Rila humana están ambos ubicados dentro de la misma secuencia de 44 aminoácidos N-terminal (Newlon et al., Nat. Struct. Biol. 1999;6:222; Newlon et al., EMBO J. 2001;20:1651), que en el presente documento se denomina DDD.
[0095]Hemos desarrollado una tecnología de plataforma para utilizar el DDD de Rila humano y el DA de AKAP como un excelente par de módulos enlazadores para acoplar dos entidades cualesquiera, denominadas en lo sucesivoAyB, en un complejo no covalente, que podría ser bloqueado aún más en una estructura unida de manera estable mediante la introducción de residuos de cisteína tanto en DDD como en DA en posiciones estratégicas para facilitar la formación de enlaces disulfuro. La metodología general del enfoque "acoplar y bloquear" es la siguiente. La entidadAse construye uniendo una secuencia DDD a un precursor deA, lo que da como resultado un primer componente denominado en lo sucesivoa.Debido a que la secuencia DDD efectuaría la formación espontánea de un dímero,Aestaría compuesto pora2. La entidadBse construye uniendo una secuencia DA a un precursor deB, lo que da como resultado un segundo componente denominado en lo sucesivob.El motivo dimérico de DDD contenido ena2 creará un sitio de acoplamiento para unirse a la secuencia DA contenida enb,facilitando así una asociación fácil dea2 ybpara formar un complejo trimérico binario compuesto dea2b. Este evento de unión se vuelve irreversible con una reacción posterior para asegurar covalentemente las dos entidades a través de puentes disulfuro, lo que ocurre de manera muy eficiente según el principio de concentración local efectiva porque las interacciones de unión iniciales deberían traer los grupos tiol reactivos colocados tanto en el DDD como en el DA. en proximidad (Chmura et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 2001;98:8480) para ligar sitio específico. Utilizando diversas combinaciones de enlazadores, módulos adaptadores y precursores, se puede producir y utilizar una amplia variedad de construcciones de DNL de diferente estequiometría, incluyendo, entre otras, construcciones de DNL diméricas, triméricas, tetraméricas, pentaméricas y hexaméricas (véanse, por ejemplo, los EE.UU. Nos 7.550.143; 7.521.056; 7.534.866;
[0096]Al unir DDD y DA lejos de los grupos funcionales de los dos precursores, también se espera que dichas ligaciones específicas de sitio conserven las actividades originales de los dos precursores. Este enfoque es de naturaleza modular y potencialmente puede aplicarse para unir, de forma covalente y específica de sitio, una amplia gama de sustancias, incluidos péptidos, proteínas, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y otros restos efectores con una amplia gama de actividades. Utilizando el método de proteína de fusión para construir efectores conjugados de DA y DDD descrito en los Ejemplos siguientes, prácticamente cualquier proteína o péptido puede incorporarse en una construcción DNL. Sin embargo, la técnica no es limitante y se pueden utilizar otros métodos de conjugación.
[0097]Se conocen diversos métodos para producir proteínas de fusión, incluida la síntesis, hibridación y/o amplificación de ácidos nucleicos. para producir un ácido nucleico bicatenario sintético que codifica una proteína de fusión de interés. Dichos ácidos nucleicos bicatenarios pueden insertarse en vectores de expresión para la producción de proteínas de fusión mediante técnicas de biología molecular estándar (véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edición, 1989). En tales formas de realización preferidas, el resto DA y/o DDD puede unirse al extremo N-terminal o C-terminal de una proteína o péptido efector. Sin embargo, el experto se dará cuenta de que el sitio de unión de un resto DA o DDD a un resto efector puede variar, dependiendo de la naturaleza química del resto efector y la(s) parte(s) del resto efector implicadas en su actividad fisiológica. La unión específica de sitio de una variedad de restos efectores se puede realizar usando técnicas conocidas en la técnica, tales como el uso de reactivos de reticulación bivalentes y/u otras técnicas de conjugación química.
Orientación previa
[0098]Según la invención, tal como se define en las reivindicaciones, el radionúclido y el fármaco se unen directamente a los anticuerpos de interés y se administran como inmunoconjugados. Sin embargo, alternativamente, el radionucleido y/o fármaco se pueden conjugar con una construcción seleccionable que comprende uno o más haptenos. El hapteno es reconocido por al menos un brazo de un anticuerpo biespecífico o multiespecífico que también se une a un antígeno asociado a un tumor u otro antígeno asociado a una enfermedad. En este caso, el radionucleido y/o fármaco se unen indirectamente a los anticuerpos, mediante la unión de la construcción dirigible. Este proceso se conoce como orientación previa.
[0099]La orientación previa es un proceso de varios pasos desarrollado originalmente para resolver el lento aclaramiento sanguíneo de los anticuerpos dirigidos directamente, lo que contribuye a una toxicidad indeseable para los tejidos normales, como la médula ósea. Con la orientación previa, se une un radionúclido u otro agente diagnóstico o terapéutico a una pequeña molécula de administración (construcción objetivo) que se elimina de la sangre en cuestión en minutos. Primero se administra un anticuerpo biespecífico o multiespecífico de orientación previa, que tiene sitios de unión para la construcción objetivo, así como un antígeno diana, se deja que el anticuerpo libre se elimine de la circulación y luego se administra la construcción objetivo.01*
[0100]Los métodos de orientación previa se describen, por ejemplo, en Goodwin et al., patente de EE.UU. n° 4.863.713; Goodwin y col., J. Nucl. Med. 29:226, 1988; Hnatowich y col., J. Nucl. Med. 28:1294, 1987; Oehr y col., J. Nucl. Med. 29:728, 1988; Klibanov y col., J. Nucl. Med. 29:1951, 1988; Sinitsyn y col., J. Nucl. Med. 30:66, 1989; Kalofonos et al., J. Nucl. Med. 31:1791, 1990; Schechter y col., Int. J. Cancer 48:167, 1991; Paganelli y col., Cancer Res. 51:5960, 1991; Paganelli y col., Nucl. Med. Commun. 12:211, 1991; Patente de EE.UU. n° 5.256.395; Stickney y col., Cancer Res. 51:6650, 1991; Yuan y col., Cancer Res. 51:3119, 1991; Patente de EE.UU. Nos 6.077.499; 7.011.812; 7.300.644; 7.074.405; 6.962.702; 7.387.772; 7.052.872; 7.138.103; 6.090.381; 6.472.511; 6.962.702; y 6.962.702.
[0101]Un método de orientación previa para tratar o diagnosticar una enfermedad o trastorno en un sujeto puede proporcionarse mediante: (1) administración al sujeto de un anticuerpo biespecífico o fragmento de anticuerpo; (2) opcionalmente administrar al sujeto una composición aclaradora y permitir que la composición elimine el anticuerpo de la circulación; y (3) administrar al sujeto la construcción objetivo, que contiene uno o más agentes terapéuticos o de diagnóstico quelados o unidos químicamente.
Inmunoconjugados
[0102]Según la invención, tal como se define en las reivindicaciones, el radionúclido y el fármaco se unen directamente a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo para formar un inmunoconjugado. Los inmunoconjugados que comprenden radionúclidos pueden formarse mediante unión covalente directa del radionúclido a un grupo funcional del anticuerpo, como en la bien conocida radioyodación de residuos de tirosina. Alternativamente, el radionucleido se puede conjugar con un resto quelante que está unido al anticuerpo o fragmento del mismo. Los métodos para la conjugación covalente de restos quelantes, fármacos y otros agentes terapéuticos con anticuerpos y otras proteínas se conocen en la técnica y se puede utilizar cualquier método conocido.
[0103]Agentes terapéuticos pueden estar unidos, por ejemplo, a grupos SH reducidos y/o a cadenas laterales de carbohidratos. Se puede unir un agente terapéutico a la región bisagra de un componente de anticuerpo reducido mediante la formación de enlaces disulfuro. Alternativamente, dichos agentes se pueden unir usando un reticulante heterobifuncional, tal como 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinilo (SPDP). Yu y col., Int. J. Cancer 56: 244 (1994). Las técnicas generales para dicha conjugación son bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Wong, CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSS-LINKING (CRC Press 1991); Upeslacis et al., "Modification of Antibodies by Chemical Methods", en MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND APPLICATIONS, Birch et al. (eds.), páginas 187-230 (Wiley-Liss, Inc. 1995); Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies," en MONOCLONAL ANTIBODIES: PRODUCTION, ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION, Ritter et al. (eds.), páginas 60-84 (Cambridge University Press 1995). Alternativamente, el agente terapéutico se puede conjugar mediante un resto carbohidrato en la región Fc del anticuerpo. El grupo carbohidrato se puede utilizar para aumentar la carga del mismo agente que está unido a un grupo tiol, o el resto de carbohidrato se puede utilizar para unirse a un agente terapéutico o de diagnóstico diferente.
[0104]Los expertos en la técnica conocen bien los métodos para conjugar grupos funcionales con anticuerpos a través de una fracción carbohidrato de anticuerpo. Véase, por ejemplo, Shih et al., Int. J. Cancer 41: 832 (1988); Shih et al., Int. J. Cancer 46: 1101 (1990); y Shih et al., patente de EE.UU. n° 5.057.313. El método general implica hacer reaccionar un anticuerpo que tiene una porción de carbohidrato oxidada con un polímero portador que tiene al menos una función amina libre. Esta reacción da como resultado un enlace inicial de base de Schiff (imina), que puede estabilizarse mediante reducción a una amina secundaria para formar el conjugado final.
[0105]La región Fc puede estar ausente si el componente de anticuerpo del inmunoconjugado es un fragmento de anticuerpo. Sin embargo, es posible introducir un resto de carbohidrato en la región variable de cadena ligera de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de longitud completa. Véase, por ejemplo, Leung et al., J. Immunol. 154: 5919 (1995); Patentes de EE.UU. Nos 5.443.953 y 6.254.868. El resto de carbohidrato modificado se utiliza para unir el agente terapéutico o de diagnóstico.
[0106]Los métodos de conjugación y uso de agentes quelantes para unir radionucleidos a proteínas son bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, la solicitud de patente de EE.UU. n° 7.563.433). Quelantes ejemplares incluyen, entre otros, DTPA (tal como Mx-DTPA), DOTA, TETA, NETA o NOTA. Los quelatos pueden estar directamente unidos a anticuerpos o péptidos, por ejemplo, como se describe en la patente de EE.UU. 4.824.659. Los restos quelantes particularmente útiles incluyen 2-bencil-DTPA y sus análogos monometilo y ciclohexilo. Otros quelatos de tipo anillo, como los poliéteres macrocíclicos, son de interés para la unión estable de radionucleidos.
[0107]En ciertas realizaciones de la invención como se define en las reivindicaciones, los radionucleidos pueden unirse a proteínas o péptidos mediante reacción con un reactivo que tiene una cola larga, al que se pueden unir una multiplicidad de grupos quelantes para unir iones. Tal cola puede ser un polímero tal como polilisina, polisacárido u otras cadenas derivatizadas o derivatizables que tienen grupos colgantes a los que se pueden unir grupos quelantes tales como, por ejemplo, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA), porfirinas, poliaminas, éteres corona, bis-tiosemicarbazonas, polioximas y grupos similares que se sabe que son útiles para este fin.018*
[0108]Un método alternativo para unir restos quelantes, fármacos u otros grupos funcionales a una molécula objetivo implica el uso de reacciones químicas de clic. El enfoque de la química del clic se concibió originalmente como un método para generar rápidamente sustancias complejas uniendo pequeñas subunidades de forma modular. (Ver, por ejemplo, Kolb et al., 2004, Angew Chem Int Ed 40:3004-31; Evans, 2007, Aust J Chem 60:384-95.) Se conocen en la técnica diversas formas de reacción química de clic, tales como la reacción catalizada por cobre de cicloadición 1,3-dipolar de Huisgen (Tomoe et al., 2002, J Organic Chem 67:3057-64), que a menudo se denomina "reacción de clic". Otras alternativas incluyen reacciones de cicloadición como la de Diels-Alder, reacciones de sustitución nucleofílica (especialmente en pequeños anillos tensos como compuestos de epoxi y aziridina), formación química de carbonilo de compuestos de urea y reacciones que involucran dobles enlaces carbono-carbono, como los alquinos en tiol-ino. reacciones.
[0109]La reacción de cicloadición de azida alquino Huisgen utiliza un catalizador de cobre en presencia de un agente reductor para catalizar la reacción de un grupo alquino terminal unido a una primera molécula. En presencia de una segunda molécula que comprende una fracción de azida, la azida reacciona con el alquino activado para formar un 1,2,3-triazol 1,4-disustituido. La reacción catalizada por cobre ocurre a temperatura ambiente y es suficientemente específica como para que a menudo no sea necesaria la purificación del producto de reacción. (Rostovstev et al., 2002, Angew Chem Int Ed 41:2596; Tornoe et al., 2002, J Org Chem 67:3057.) Los grupos funcionales azida y alquino son en gran medida inertes frente a biomoléculas en medio acuoso, lo que permite la reacción a ocurren en soluciones complejas. El triazol formado es químicamente estable y no está sujeto a escisión enzimática, lo que hace que el producto de química clic sea altamente estable en sistemas biológicos. Aunque el catalizador de cobre es tóxico para las células vivas, la reacción química de clic a base de cobre se puede utilizarin vitropara la formación de inmunoconjugados.
[0110]Se ha propuesto una reacción de clic sin cobre para la modificación covalente de biomoléculas. (Ver, por ejemplo, Agard et al., 2004, J Am Chem Soc 126:15046-47.) La reacción sin cobre utiliza tensión de anillo en lugar del catalizador de cobre para promover una reacción de cicloadición de [3 2] azida-alquino.(Id.)Por ejemplo, el ciclooctino es una estructura de anillo de 8 carbonos que comprende un enlace alquino interno. La estructura de anillo cerrado induce una deformación sustancial del ángulo de enlace del acetileno, que es altamente reactivo con los grupos azida para formar un triazol. Por tanto, los derivados de ciclooctina se pueden utilizar para reacciones de clic sin cobre (Id.).
[0111]Ning et al. informaron de otro tipo de reacción de clic sin cobre. (2010, Angew Chem Int Ed 49:3065-68), que implica cicloadición de alquino-nitrona promovida por cepa. Para abordar la lenta velocidad de la reacción del ciclooctino original, se unen grupos aceptores de electrones adyacentes al triple enlace (Id.). Ejemplos de tales ciclooctinos sustituidos incluyen ciclooctinos difluorados, 4-dibenzociclooctinol y azaciclooctino (id.). Una reacción alternativa sin cobre implicó cicloadición de aquino-nitrona promovida por cepa para dar isoxazolinas N-alquiladas (Id.). Se informó que la reacción tenía una cinética de reacción excepcionalmente rápida y se usó en un protocolo de tres pasos en un solo recipiente para la modificación específica del sitio de péptidos y proteínas(Id.)Las nitronas se prepararon mediante la condensación de aldehídos apropiados con W-metilhidroxilamina y la reacción de cicloadición tuvo lugar en una mezcla de acetonitrilo y agua (Id.). Estas y otras reacciones químicas de clic conocidas pueden usarse para unir restos quelantes o fármacos a anticuerposin vitro.
Métodos de tratamiento terapéutico
[0112]La invención, tal como se define en las reivindicaciones, se refiere al uso de un anticuerpo humano RS7 anti-Trop-2 o un fragmento de unión a antígeno del mismo conjugado con SN-38 mediante el enlazador CL2A y de un anticuerpo de mucina anticáncer pancreático PAM4 o un fragmento de unión a antígeno del mismo conjugado con 90Y para su uso en métodos de tratamiento del cáncer de páncreas en un sujeto, que comprende administrar el anticuerpo anti-Trop-2 RS7 humano o un fragmento de unión a antígeno del mismo conjugado con SN-38 mediante el enlazador CL2A y el anticuerpo mucina anti-cáncer de páncreas PAM4. o fragmento de unión a antígeno del mismo conjugado con 90Y.
[0113]Los inmunoconjugados se pueden complementar con la administración, ya sea concurrente o secuencialmente, de al menos otro agente terapéutico. Las terapias multimodales pueden incluir terapia con otros anticuerpos, como anti-CD22, anti-CD19, anti-CD20, anti-CD21, anti-CD74, anti-CD80, anti-CD23, anti-CD45, anti-CD46, anti-MIF, anticuerpos anti-EGP-1, anti-CEACAM5, anti-CEACAM6, mucina anticáncer de páncreas, anti-IGF-1R o anti-HLA-DR (incluida la cadena invariante) en forma de anticuerpos desnudos, proteínas de fusión o como inmunoconjugados. Los expertos en la técnica conocen diversos anticuerpos de uso, tales como anticuerpos anti-CD19, anti-CD20 y anti-CD22. Véase, por ejemplo, Ghetie et al., Cancer Res. 48:2610 (1988); Hekman y col., Cancer Immunol. Immunother. 32:364 (1991); Longo, Curr. Opinión. Oncol. 8:353 (1996), Patentes de EE.UU. Nos 5.798.554; 6.187.287; 6.306.393; 6.676.924; 7.109.304; 7.151.164; 7.230.084; 7.230.085; 7.238.785; 7.238.786; 7.282.567; 7.300.655; 7.312.318; 7.612.180; 7.501.498.014*
[0114]En una forma de realización no limitante de la invención como se define en las reivindicaciones, la presente invención contempla el tratamiento con el anticuerpo anti-Trop-2 RS7 humano o un fragmento de unión a antígeno del mismo conjugado con SN-38 mediante el enlazador CL2A y el anticuerpo PAM4 mucina contra el cáncer de páncreas o fragmento de unión a antígeno del mismo conjugado con 90Y antes, en combinación con o después de otros anticuerpos asociados al tumor pancreático tales como CA19.9, DUPAN2, SPAN1, Nd2, B72.3, CC49, anticuerpos anti-Lea y anticuerpos contra otros antígenos de Lewis (p. ej., Le(y)), así como anticuerpos contra el antígeno carcinoembrionario (CEA o CEACAM5), CEACAM6, antígeno p específico del colon (CSAp), Mu C-1 , MUC-2, MUC-3, MUC-4, MUC-5ac, MUC-16, MUC-17, HLA-DR, CD40, CD74, CD138, HER2/neu, EGFR, EGP-1, EGP-2, factores de angiogénesis (p. ej., VEGF, PIGF), factor de crecimiento similar a la insulina (ILGF), tenascina, factor de crecimiento derivado de plaquetas e IL-6, así como productos de oncogenes (p. ej., bcl-2, Kras, p53), cMET y anticuerpos contra la necrosis tumoral. sustancias. Estos anticuerpos de tumores sólidos pueden estar desnudos o conjugados, entre otros, con fármacos, toxinas, isótopos, radionúclidos o inmunomoduladores. Se pueden construir y utilizar muchas combinaciones de anticuerpos diferentes, ya sea en forma desnuda o conjugada. Alternativamente, se pueden emplear diferentes combinaciones de anticuerpos para la administración en combinación con otros agentes terapéuticos, tales como un fármaco citotóxico o con radiación, administradas de forma consecutiva, simultánea o secuencial.
[0115]En otra forma de terapia multimodal, los sujetos reciben inmunoconjugados junto con quimioterapia contra el cáncer estándar. Por ejemplo, "CVB" (1,5 g/m2 de ciclofosfamida, 200 a 400 mg/m2 de etopósido y 150 a 200 mg/m2 de carmustina) es un régimen que se utiliza para tratar el linfoma no Hodgkin. Patti et al., Eur. J. Haematol. 51: 18 (1993). Otros regímenes quimioterapéuticos combinados adecuados son bien conocidos por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Freedman et al., "Non-Hodgkin's Lymphomas", en CANCER MEDICINE, VOLUMEN 2, 3a edición, Holland et al. (eds.), páginas 2028-2068 (Lea y Febiger 1993). A modo de ilustración, los regímenes quimioterapéuticos de primera generación para el tratamiento del linfoma no Hodgkin (LNH) de grado intermedio incluyen C-MOPP (ciclofosfamida, vincristina, procarbazina y prednisona) y CHOP (ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina y prednisona). Un régimen quimioterapéutico útil de segunda generación es m-BACOD (metotrexato, bleomicina, doxorrubicina, ciclofosfamida, vincristina, dexametasona y leucovorina), mientras que un régimen adecuado de tercera generación es MACOP-B (metotrexato, doxorrubicina, ciclofosfamida, vincristina, prednisona, bleomicina y leucovorina). Otros fármacos útiles incluyen butirato de fenilo, bendamustina y briostatina-1.
[0116]En una terapia multimodal preferida, tanto los fármacos quimioterapéuticos como las citoquinas se coadministran con un anticuerpo o inmunoconjugado. Las citocinas, los fármacos quimioterapéuticos y los anticuerpos o inmunoconjugados se pueden administrar en cualquier orden o juntos.
[0117]Los inmunoconjugados se pueden formular según métodos conocidos para preparar composiciones farmacéuticamente útiles, mediante las cuales el inmunoconjugado se combina en una mezcla con un excipiente farmacéuticamente adecuado. La solución salina tamponada con fosfato estéril es un ejemplo de excipiente farmacéuticamente adecuado. Otros excipientes adecuados son bien conocidos por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Ansel et al., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, 5.a edición (Lea & Febiger 1990), y Gennaro (ed.), REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18.a edición (Mack Publishing Company 1990), y ediciones revisadas del mismo.
[0118]El inmunoconjugado de la presente invención usado de acuerdo con la invención como se define en las reivindicaciones puede formularse para administración intravenosa mediante, por ejemplo, inyección en bolo o infusión continua. Preferiblemente, el anticuerpo de la presente invención se infunde durante un período de menos de aproximadamente 4 horas, y más preferiblemente, durante un período de menos de aproximadamente 3 horas. Por ejemplo, los primeros 25 a 50 mg se podrían infundir en 30 minutos, preferiblemente incluso 15 minutos, y el resto se podría infundir durante las siguientes 2 a 3 horas. Las formulaciones para inyección pueden presentarse en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampollas o en envases multidosis, con un conservante añadido. Las composiciones pueden tomar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes. Alternativamente, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para su constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril libre de pirógenos, antes de su uso.
[0119]Se pueden emplear métodos farmacéuticos adicionales para controlar la duración de la acción del conjugado terapéutico. Se pueden preparar preparaciones de liberación controlada mediante el uso de polímeros para complejar o adsorber el inmunoconjugado. Por ejemplo, los polímeros biocompatibles incluyen matrices de poli(etileno-coacetato de vinilo) y matrices de un copolímero de polianhídrido de un dímero de ácido esteárico y ácido sebácico. Sherwood y col., Bio/Technology 10: 1446 (1992). La velocidad de liberación de un inmunoconjugado o anticuerpo de dicha matriz depende del peso molecular del inmunoconjugado o anticuerpo, la cantidad de inmunoconjugado o anticuerpo dentro de la matriz y el tamaño de las partículas dispersas. Saltzman y col., Biophys. J. 55: 163 (1989); Sherwood et al,supra.Otras formas de dosificación sólidas se describen en Ansel et al., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, 5a edición (Lea & Febiger 1990), y Gennaro (ed.), REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18a edición (Mack Publishing Company 1990), y ediciones revisadas de los mismos.
[0120]El inmunoconjugado m usado de acuerdo con la invención como se define en las reivindicaciones también puede administrarse a un mamífero por vía subcutánea o incluso por otras vías parenterales. Además, la administración puede ser mediante infusión continua o mediante bolos únicos o múltiples. Preferiblemente, el anticuerpo se infunde durante un período de menos de aproximadamente 4 horas, y más preferiblemente, durante un período de menos de aproximadamente 3 horas.012*
[0121]Más generalmente, la dosis de un inmunoconjugado administrado de acuerdo con la invención como se define en las reivindicaciones para humanos variará dependiendo de factores tales como la edad, el peso, la altura, el sexo, la condición médica general y el historial médico previo del paciente. Puede ser deseable proporcionar al receptor una dosis de inmunoconjugado, proteína de fusión de anticuerpos, que esté en el intervalo de aproximadamente 1 mg/kg a 25 mg/kg como una única infusión intravenosa, aunque también se puede administrar una dosis más baja o más alta. según lo dicten las circunstancias. Una dosis de 1 a 20 mg/kg para un paciente de 70 kg, por ejemplo, es de 70 a 1.400 mg, o de 41 a 824 mg/m2 para un paciente de 1,7 m. La dosis se puede repetir según sea necesario, por ejemplo, una vez por semana durante 4 a 10 semanas, una vez por semana durante 8 semanas o una vez por semana durante 4 semanas. También se puede administrar con menos frecuencia, como cada dos semanas durante varios meses, o mensualmente o trimestralmente durante muchos meses, según sea necesario en una terapia de mantenimiento.
[0122]Alternativamente, se puede administrar un anticuerpo como una dosis cada 2 o 3 semanas, repetida hasta un total de al menos 3 dosis. O bien, los anticuerpos se pueden administrar dos veces por semana durante 4 a 6 semanas. Si la dosis se reduce a aproximadamente 200-300 mg/m2 (340 mg por dosis para un paciente de 1,7 m, o 4,9 mg/kg para un paciente de 70 kg), se puede administrar una o incluso dos veces por semana durante 4 a 10 semanas. Alternativamente, se puede reducir la pauta posológica, es decir, cada 2 o 3 semanas durante 2 o 3 meses. Sin embargo, se ha determinado que se pueden administrar dosis incluso más altas, como 20 mg/kg una vez a la semana o una vez cada 2-3 semanas mediante infusión intravenosa lenta, para ciclos de dosificación repetidos. Opcionalmente, el programa de dosificación se puede repetir en otros intervalos y la dosis se puede administrar a través de varias vías parenterales, con el ajuste apropiado de la dosis y el programa.
[0123]De acuerdo con la divulgación instantánea, los anticuerpos divulgados son útiles para la terapia del cáncer. Los ejemplos de cánceres incluyen, entre otros, carcinoma, linfoma, glioblastoma, melanoma, sarcoma y leucemia, mieloma o neoplasias malignas linfoides. A continuación se indican ejemplos más particulares de tales cánceres e incluyen: cáncer de células escamosas (por ejemplo, cáncer de células escamosas epiteliales), sarcoma de Ewing, tumor de Wilms, astrocitomas, cáncer de pulmón que incluye cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma de pulmón y carcinoma escamoso de pulmón, cáncer de peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o de estómago incluyendo cáncer gastrointestinal, glioblastoma multiforme, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, carcinoma hepatocelular, tumores neuroendocrinos, cáncer medular de tiroides, carcinoma diferenciado de tiroides, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer de recto, cáncer de endometrio o carcinoma uterino, carcinoma de glándulas salivales, cáncer de riñón o riñón, cáncer de próstata, cáncer de vulva, carcinoma anal, carcinoma de pene, así como cáncer de cabeza y cáncer de cuello. El término "cáncer' incluye células o tumores malignos primarios (por ejemplo, aquellos cuyas células no han migrado a sitios en el cuerpo del sujeto distintos del sitio de la malignidad o tumor original) y células malignas o tumores secundarios (por ejemplo, aquellos que surgen de metástasis, la migración de células malignas o tumorales a sitios secundarios que son diferentes del sitio del tumor original).0124*
[0124]Otros ejemplos de cánceres o neoplasias malignas incluyen, entre otros: leucemia linfoblástica aguda infantil, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica aguda, leucemia mieloide aguda, carcinoma suprarrenocortical, cáncer hepatocelular (primario) en adultos, cáncer de hígado (primario) en adultos, leucemia linfocítica aguda en adultos, leucemia mieloide aguda en adultos, linfoma de Hodgkin en adultos, Leucemia linfocítica en adultos, Linfoma no Hodgkin en adultos, cáncer primario de hígado en adultos, sarcoma de tejido blando en adultos, linfoma relacionado con el SIDA, neoplasias malignas relacionadas con el SIDA, cáncer anal, astrocitoma, cáncer de vías biliares, cáncer de vejiga, cáncer de huesos, glioma del tronco encefálico, tumores cerebrales, cáncer de mama, cáncer de pelvis renal y uréter, linfoma del sistema nervioso central (primario), linfoma del sistema nervioso central, astrocitoma cerebeloso, astrocitoma cerebral, cáncer de cuello uterino, cáncer hepatocelular (primario) infantil, cáncer de hígado (primario) infantil, leucemia linfoblástica aguda infantil, leucemia mieloide aguda infantil, glioma del tronco encefálico infantil, astrocitoma cerebeloso infantil, astrocitoma cerebral infantil, tumores extracraneales de células germinales infantiles, enfermedad de Hodgkin infantil, linfoma de Hodgkin infantil, glioma hipotalámico y de las vías visuales infantiles, leucemia linfoblástica infantil, meduloblastoma infantil, linfoma no Hodgkin infantil, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales y pineales infantiles, cáncer primario de hígado infantil, rabdomiosarcoma infantil, sarcoma de tejido blando infantil, glioma hipotalámico y de las vías visuales infantiles, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, cáncer de colon, linfoma cutáneo de células T, carcinoma endocrino de células de los islotes de páncreas, cáncer de endometrio, ependimoma, cáncer epitelial, cáncer de esófago, sarcoma de Ewing y tumores relacionados, cáncer de páncreas exocrino, tumor extracraneal de células germinales, tumor extragonadal de células germinales, cáncer de vías biliares extrahepáticas, cáncer ocular, cáncer de mama femenino, enfermedad de Gaucher, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico, tumor carcinoide gastrointestinal, tumores gastrointestinales, tumores de células germinales, tumor trofoblástico gestacional, leucemia de células pilosas, cáncer de cabeza y cuello, cáncer hepatocelular, linfoma de Hodgkin, hipergammaglobulinemia, cáncer de hipofaringe, cánceres intestinales, melanoma intraocular, carcinoma de células de los islotes, cáncer de páncreas de células de los islotes, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón, cáncer de laringe, labio y cáncer de cavidad oral, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, trastornos linfoproliferativos, macroglobulinemia, cáncer de mama masculino, mesotelioma maligno, timoma maligno, meduloblastoma, melanoma, mesotelioma, cáncer escamoso primario oculto metastásico de cuello, cáncer escamoso primario metastásico de cuello, cáncer escamoso primario metastásico de cuello, mieloma múltiple, mieloma múltiple/neoplasia de células plasmáticas, síndrome mielodisplásico, leucemia mielógena, leucemia mieloide, trastornos mieloproliferativos, cáncer de cavidad nasal y de senos paranasales, cáncer nasofaríngeo, neuroblastoma, linfoma no Hodgkin, cáncer de piel no melanoma, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer escamoso de cuello metastásico primario oculto, cáncer de orofaringe, osteosarcoma/histiocitoma fibroso maligno, osteosarcoma/histiocitoma fibroso maligno, osteosarcoma/histiocitoma fibroso maligno de hueso, cáncer epitelial de ovario, tumor de células germinales de ovario, tumor de ovario de bajo potencial maligno, cáncer de páncreas, paraproteinemias, policitemia vera, cáncer de paratiroides, cáncer de pene, feocromocitoma, tumor pituitario, linfoma primario del sistema nervioso central, cáncer primario de hígado, cáncer de próstata, cáncer de recto, cáncer de células renales, cáncer de pelvis renal y de uréter, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de glándulas salivales, sarcomas de sarcoidosis, síndrome de Sézary, cáncer de piel, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de intestino delgado, sarcoma de tejido blando, cáncer de cuello escamoso, cáncer de estómago, tumores neuroectodérmicos y pineales primitivos supratentoriales, linfoma de células T, cáncer testicular, timoma, cáncer de tiroides, cáncer de células de transición de pelvis renal y de uréter, cáncer de pelvis renal y de uréter de transición, tumores trofoblásticos, cáncer de células de uréter y de pelvis renal, cáncer de uretra, cáncer de útero, sarcoma uterino, cáncer de vagina, glioma de las vías visuales y hipotalámico, cáncer de vulva, macroglobulinemia de Waldenstrom, tumor de Wilms, y cualquier otra enfermedad hiperproliferativa, además de neoplasia, localizada en un sistema de órganos enumerado anteriormente.
[0125]Los métodos y composiciones descritos en el presente documento se pueden usar para tratar afecciones malignas o premalignas y para prevenir la progresión a un estado neoplásico o maligno, incluidos, entre otros, los trastornos descritos anteriormente. Dichos usos están indicados en condiciones conocidas o sospechadas de progresión previa a neoplasia o cáncer, en particular, donde se ha producido un crecimiento de células no neoplásicas que consiste en hiperplasia, metaplasia o, más particularmente, displasia (para una revisión de dichas condiciones de crecimiento anormal, ver Robbins y Angell, Basic Pathology, 2a ed., WB Saunders Co., Filadelfia, págs. 68-79 (1976)).
[0126]La displasia es frecuentemente un precursor del cáncer y se encuentra principalmente en los epitelios. Es la forma más desordenada de crecimiento celular no neoplásico, que implica una pérdida en la uniformidad celular individual y en la orientación arquitectónica de las células. La displasia ocurre característicamente cuando existe irritación o inflamación crónica. Los trastornos displásicos que pueden tratarse incluyen, entre otros, displasia ectodérmica anhidrótica, displasia anterofacial, displasia torácica asfixiante, displasia auriculodigital, displasia broncopulmonar, displasia cerebral, displasia cervical, displasia condroectodérmica, displasia cleidocraneal, displasia ectodérmica congénita, displasia craneodiafisaria, displasia craneocarpotarsiana, displasia craneometafisaria, displasia dentinaria, displasia diafisaria, displasia ectodérmica, displasia del esmalte, displasia encefalo-oftálmica, displasia epifisaria hemimelia, displasia epifisaria múltiple, displasia epifisaria punctata, displasia epitelial, displasia faciodigitogenital, displasia fibrosa familiar de mandíbulas, displasia de pliegue blanco familiar, displasia fibromuscular, displasia fibrosa del hueso, displasia ósea florida, displasia renal-retiniana hereditaria, displasia ectodérmica hidrótica, displasia ectodérmica hipohidrótica, displasia tímica linfopénica, displasia mamaria, displasia mandibulofacial, displasia metafisaria, displasia de Mondini, displasia fibrosa monostótica, displasia mucoepitelial, displasia epifisaria múltiple, displasia oculoauriculovertebral, displasia oculodentodigital, displasia oculovertebral, displasia odontogénica, displasia oftalmomandibulomelica, displasia cementaria periapical, displasia fibrosa poliostótica, displasia espondiloepifisaria pseudoacondroplásica, displasia retiniana, displasia septoóptica, displasia espondiloepifisaria y displasia ventriculoradial.
[0127]Los trastornos preneoplásicos adicionales que pueden tratarse incluyen, entre otros, trastornos disproliferativos benignos (por ejemplo, tumores benignos, afecciones fibroquísticas, hipertrofia tisular, pólipos o adenomas intestinales y displasia esofágica), leucoplasia, queratosis, enfermedad de Bowen, piel de granjero, queilitis solar y queratosis solar.
[0128]En formas de realización preferidas de la invención como se define en las reivindicaciones, la invención se usa para inhibir el crecimiento, la progresión y/o la metástasis de cánceres.0129*
[0129]Enfermedades, trastornos y/o afecciones hiperproliferativas adicionales incluyen, entre otras, progresión y/o metástasis de neoplasias malignas y trastornos relacionados tales como leucemia (incluyendo leucemias agudas (por ejemplo, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda (incluyendo mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica y eritroleucemia)) y leucemias crónicas (p. ej., leucemia mielocítica crónica (granulocítica) y leucemia linfocítica crónica)), policitemia vera, linfomas (p. ej., enfermedad de Hodgkin y enfermedad no Hodgkin), mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad de las cadenas pesadas y tumores sólidos que incluyen, entre otros, sarcomas y carcinomas como fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, adenocarcinoma, carcinoma de glándulas sudoríparas, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma de vías biliares, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilm, cáncer de cuello uterino, tumor testicular, carcinoma de pulmón, carcinoma de pulmón de células pequeñas, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, emangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma y retinoblastoma.
Otros agentes terapéuticos
[0130]De acuerdo con la invención como se define en las reivindicaciones, se puede administrar una amplia variedad de reactivos terapéuticos adicionales de forma concurrente o secuencial, o conjugados ventajosamente con los anticuerpos de la invención, por ejemplo, fármacos, toxinas, oligonucleótidos, inmunomoduladores, hormonas, antagonistas hormonales, enzimas, inhibidores de enzimas, radionúclidos, inhibidores de la angiogénesis, etc. Los agentes terapéuticos citados en este documento son aquellos agentes que también son útiles para la administración por separado con un anticuerpo como se describe anteriormente. Los agentes terapéuticos incluyen, por ejemplo, fármacos quimioterapéuticos tales como alcaloides de la vinca, antraciclinas, gemcitabina, epipodofilotoxinas, taxanos, antimetabolitos, agentes alquilantes, antibióticos, SN-38, inhibidores de la COX-2, antimitóticos, agentes antiangiogénicos y proapoptóticos, particularmente doxorrubicina, metotrexato, taxol, CPT-11, camptotecanos, inhibidores de proteosomas, inhibidores de mTOR, inhibidores de HDAC, inhibidores de tirosina quinasa y otros. Otros fármacos quimioterapéuticos contra el cáncer útiles para administrar de forma concurrente o secuencial, o para la preparación de inmunoconjugados y proteínas de fusión de anticuerpos incluyen mostazas nitrogenadas, alquilsulfonatos, nitrosoureas, triazenos, análogos del ácido fólico, inhibidores de la COX-2, antimetabolitos, análogos de pirimidina, análogos de purina, complejos de coordinación de platino, inhibidores de mTOR, inhibidores de tirosina quinasa, inhibidores de proteosoma, inhibidores de HDAC, camptotecinas, hormonas y similares. Los agentes quimioterapéuticos adecuados se describen en REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 19a Ed. (Mack Publishing Co. 1995), y en GOODMAN AND GILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS, 7a Ed. (MacMillan Publishing Co. 1985), así como ediciones revisadas de estas publicaciones. Los expertos en la técnica conocen otros agentes quimioterapéuticos adecuados, tales como fármacos experimentales.
[0131]En una forma de realización preferida de la invención como se define en las reivindicaciones, los conjugados de camptotecinas y compuestos relacionados, tales como SN-38, pueden conjugarse con hPAM4 u otros anticuerpos contra el cáncer de páncreas, por ejemplo, como se describe en la solicitud de patente de EE.UU. N° de serie 12/026.811, presentada el 6 de febrero de 2008; y 11/388.032, presentada el 23 de marzo de 2006. En otra forma de realización preferida de la invención como se define en las reivindicaciones, la gemcitabina se administra al sujeto junto con 90Y-hPAM4 y/o SN-38-hRS7.
[0132]Una toxina puede ser de origen animal, vegetal o microbiano. Una toxina, tal como la exotoxina de Pseudomonas, también puede formar complejo o formar la porción de agente terapéutico de un inmunoconjugado de los anticuerpos. Otras toxinas adecuadamente empleadas en la preparación de tales conjugados u otras proteínas de fusión incluyen ricina, abrina, ribonucleasa (RNasa), DNasa I, enterotoxina estafilocócica A, proteína antiviral de hierba carmín, onconasa, gelonina, toxina diftérica, exotoxina de Pseudomonas y endotoxina de Pseudomonas. Véase, por ejemplo, Pastan et al., Cell 47:641 (1986), Goldenberg, CA - A Cancer Journal for Clinicians 44:43 (1994), Sharkey y Goldenberg, CA - A Cancer Journal for Clinicians 56:226 (2006). Los expertos en la técnica conocen toxinas adicionales adecuadas para su uso y se describen en las patentes de EE.UU. n° 6.077.499.
[0133]Un inmunomodulador, tal como una citoquina, también puede conjugarse con, o formar la porción de agente terapéutico del inmunoconjugado, o puede administrarse con, pero sin conjugar, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Como se usa en el presente documento, el término "inmunomodulador" incluye una citocina, una linfocina, una monocina, un factor de crecimiento de células madre, una linfotoxina, un factor hematopoyético, un factor estimulante de colonias (CSF), un interferón (IFN), hormona paratiroidea, tiroxina., insulina, proinsulina, relaxina, prorelaxina, hormona folículo estimulante (FSH), hormona estimulante de la tiroides (TSH), hormona luteinizante (LH), factor de crecimiento hepático, prostaglandina, factor de crecimiento de fibroblastos, prolactina, lactógeno placentario, proteína OB, un crecimiento transformador (TGF), TGF-a, TGF-p, factor de crecimiento similar a la insulina (ILGF), eritropoyetina, trombopoyetina, factor de necrosis tumoral (TNF), TNF-a, TNF-p, una sustancia inhibidora de Müller, gonadotropina de ratón péptido asociado, inhibina, activina, factor de crecimiento endotelial vascular, integrina, interleucina (IL), factor estimulante de colonias de granulocitos (GCSF), factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), interferón-a, interferón-p, interferón-Y, factor S1, IL-1, IL-1cc, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL -11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18 IL-21 e IL-25, LIF, kit-ligando, FLT-3, angiostatina, trombospondina, endostatina y LT, y similares.0134*
[0134]El inmunoconjugado puede comprender uno o más isótopos radiactivos útiles para tratar tejido enfermo. Los radionucleidos terapéuticos particularmente útiles incluyen, entre otros, 111In, 177Lu, 212Bi, 213Bi, 211At, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 90Y, 125I, 131I, 32P, 33P, 47Sc, 111Ag, 67Ga, 142Pr, 153Sm, Tb, 166Dy, 166Ho, 186Re, 188Re, 189Re, 212Pb, 223Ra, 225Ac, 59Fe, 75Se, 77As, 89Sr, 99Mo, 105Rh, 109Pd, 143Pr, 149Pm, 169Er, 194Ir, 198Au, 199Au y 211Pb. El radionucleido terapéutico tiene preferentemente una energía de desintegración en el intervalo de 20 a 6.000 keV, preferentemente en el intervalo de 60 a 200 keV para un emisor Auger, de 100 a 2.500 keV para un emisor beta y de 4.000 a 6.000 keV para un emisor alfa. Las energías máximas de desintegración de los nucleidos emisores de partículas beta útiles son preferentemente de 20 a 5.000 keV, más preferentemente de 100 a 4.000 keV y lo más preferentemente de 500 a 2.500 keV. También se prefieren los radionucleidos que se desintegran sustancialmente con partículas emisoras de Auger. Por ejemplo, Co-58, Ga-67, Br-80m, Tc-99m, Rh-103m, Pt-109, In-111, Sb-119, I-125, Ho-161, Os-189m e Ir-192. Las energías de desintegración de los nucleidos emisores de partículas beta útiles son preferentemente <1.000 keV, más preferentemente <100 keV y lo más preferentemente <70 keV. También se prefieren radionucleidos que se desintegran sustancialmente con la generación de partículas alfa. Dichos radionucleidos incluyen, entre otros: Dy-152, At-211, Bi-212, Ra-223, Rn-219, Po-215, Bi-211, Ac-225, Fr-221, At-217, Bi-213 y Fm-255. Las energías de desintegración de los radionucleidos emisores de partículas alfa útiles son preferentemente de 2.000 a 10.000 keV, más preferentemente de 3.000 a 8.000 keV y lo más preferentemente de 4.000 a 7.000 keV.
[0135]Por ejemplo, el 67Cu, considerado uno de los radioisótopos más prometedores para la radioinmunoterapia debido a su vida media de 61,5 horas y su abundante suministro de partículas beta y rayos gamma, puede conjugarse con un anticuerpo utilizando el agente quelante, ácido p-bromoacetamido-bencil-tetraetilaminotetraacético (TETA). Chase, supra. Alternativamente, 90Y, que emite una partícula beta energética, puede acoplarse a un anticuerpo, fragmento de anticuerpo o proteína de fusión, usando ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA), o más preferiblemente usando DOTA. Los métodos para conjugar 90Y con anticuerpos o construcciones dirigibles se conocen en la técnica y se puede utilizar cualquiera de dichos métodos conocidos. (Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. n° 7.259.249. Véase también Lindén et al., Clin Cancer Res. 11:5215-22, 2005; Sharkey et al., J Nucl Med. 46:620-33, 2005; Sharkey et al., J Nucl Med. 44:2000-18, 2003).
[0136]Radioisótopos terapéuticos potenciales adicionales incluyen 11C, 13N, 15O, 75Br, 198Au, 224Ac, 126I, 133I, 77Br, 113mIn, 95Ru, 97Ru, 103Ru, 105Ru, 107Hg, 203Hg, 121mTe, 125mTe, 165Tm, 167Tm, 168Tm, 197Pt, 109Pd, 105Rh, 142Pr, 143Pr, 161Tb, 166Ho, 199Au, 57Co, 58Co, 51Cr, 59Fe, 75Se, 201Tl, 225Ac, 76Br, 169Yb y similares.
[0137]En otra forma de realización de la invención como se define en las reivindicaciones, se puede usar un radiosensibilizador en combinación con un anticuerpo o fragmento de anticuerpo desnudo o conjugado. Por ejemplo, el radiosensibilizador se puede utilizar en combinación con un anticuerpo o fragmento de anticuerpo radiomarcado. La adición del radiosensibilizador puede dar como resultado una eficacia mejorada en comparación con el tratamiento con el anticuerpo o fragmento de anticuerpo radiomarcado solo. Los radiosensibilizadores se describen en DM Goldenberg (ed.), CANCER THERAPY WITH RADIOLABELED ANTIBODIES, CRC Press (1995). Otros radiosensibilizadores típicos de interés para su uso con esta tecnología incluyen gemcitabina, 5-fluorouracilo y cisplatino, y se han utilizado en combinación con irradiación externa en la terapia de diversos cánceres, incluido el cáncer de páncreas. Por lo tanto, hemos estudiado la combinación de gemcitabina en lo que se cree que son dosis radiosensibilizantes (200 mg/m2 una vez a la semana durante 4 semanas) de gemcitabina combinada con dosis fraccionadas de 90Y-hPAM4, y hemos observado evidencia objetiva de reducción del cáncer de páncreas después de un ciclo único de esta combinación que demostró ser bien tolerado (sin toxicidades de grado 3-4 según el estándar NCI-CTC v. 3).
[0138]Los anticuerpos o fragmentos de los mismos que tienen un portador cargado con un añadido de boro para la terapia de activación de neutrones térmicos normalmente se verán afectados de manera similar. Sin embargo, será ventajoso esperar hasta que el inmunoconjugado no objetivo se aclare antes de realizar la irradiación con neutrones. La eliminación se puede acelerar utilizando un anticuerpo antiidiotípico que se une al anticuerpo anticáncer de páncreas. Véase la patente de EE.UU. 4.624.846 para una descripción de este principio general. Por ejemplo, se pueden unir sumandos de boro, como los carboranos, a anticuerpos. Los carboranos se pueden preparar con funciones carboxilo en cadenas laterales colgantes, como es bien conocido en la técnica. La unión de los carboranos a un vehículo, como el aminodextrano, se puede lograr mediante la activación de los grupos carboxilo de los carboranos y la condensación con aminas en el vehículo. Luego, el conjugado intermedio se conjuga con el anticuerpo. Después de la administración del conjugado de anticuerpo, se activa un sumando de boro mediante irradiación de neutrones térmicos y se convierte en átomos radiactivos que se desintegran mediante emisión alfa para producir efectos altamente tóxicos de corto alcance.
Excipientes farmacéuticamente adecuados
[0139]Los anticuerpos, fragmentos de los mismos o inmunoconjugados que se administrarán a un sujeto pueden comprender uno o más excipientes farmacéuticamente adecuados, uno o más ingredientes adicionales o alguna combinación de estos. El anticuerpo se puede formular según métodos conocidos para preparar composiciones farmacéuticamente útiles, mediante las cuales el inmunoconjugado se combina en una mezcla con un excipiente farmacéuticamente adecuado. La solución salina tamponada con fosfato estéril es un ejemplo de excipiente farmacéuticamente adecuado. Otros excipientes adecuados son bien conocidos por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Ansel et al., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, 5.a edición (Lea & Febiger 1990), y Gennaro (ed.), REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18.a edición (Mack Publishing Company 1990), y ediciones revisadas del mismo.014*
[0140]El inmunoconjugado se puede formular para administración intravenosa mediante, por ejemplo, inyección en bolo o infusión continua. Las formulaciones para inyección pueden presentarse en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampollas o en envases multidosis, con un conservante añadido. Las composiciones pueden tomar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes. Alternativamente, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para reconstitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril libre de pirógenos, antes de su uso.
Kits
[0141] La presente divulgación también se refiere a kits que pueden contener componentes adecuados para tratar o diagnosticar tejido enfermo en un paciente. Los kits ejemplares pueden contener al menos un anticuerpo, fragmento de unión a antígeno o proteína de fusión como se describe en el presente documento. Si la composición que contiene componentes para administración no está formulada para administración a través del tubo digestivo, tal como administración oral, se puede incluir un dispositivo capaz de administrar los componentes del kit a través de alguna otra ruta. Un tipo de dispositivo, para aplicaciones tales como administración parenteral, es una jeringa que se usa para inyectar la composición en el cuerpo de un sujeto. También se pueden utilizar dispositivos de inhalación. En determinadas formas de realización, se puede proporcionar un anticuerpo contra el cáncer de páncreas o un fragmento de unión a antígeno del mismo en forma de una jeringa precargada o una pluma de autoinyección que contiene una formulación líquida estéril o una preparación liofilizada de anticuerpo (p. ej., Kivitz et al., Clin. Ther. 2006, 28:1619-29).
[0142] Los componentes del kit pueden empaquetarse juntos o separarse en dos o más recipientes. En algunas formas de realización, los recipientes pueden ser viales que contienen formulaciones liofilizadas estériles de una composición que son adecuadas para la reconstitución. Un kit también puede contener uno o más tampones adecuados para la reconstitución y/o dilución de otros reactivos. Otros recipientes que pueden usarse incluyen, entre otros, una bolsa, bandeja, caja, tubo o similares. Los componentes del kit se pueden empaquetar y mantener de forma estéril dentro de los recipientes. Otro componente que se puede incluir son las instrucciones de uso del kit.
EJEMPLOS
Ejemplo 1. Terapia de un paciente con carcinoma de páncreas metastásico e inoperable
[0143] El anticuerpo PAM4 humanizado (hPAM4) se preparó y se marcó radioactivamente como se describe en la patente de EE.UU. n° 7.282.567. El paciente 118-001, CWG, era un hombre de 63 años con adenocarcinoma de páncreas en estadio IV con múltiples metástasis hepáticas, diagnosticado en noviembre de 2007. Aceptó someterse a radioinmunoterapia combinada y quimioterapia con gemcitabina como primera estrategia de tratamiento, y luego fue recibió un primer ciclo de terapia de 6,5 mCi/m2 de 90Y-hPAM4, combinado con 200 mg/m2 de gemcitabina, donde la gemcitabina se administró una vez a la semana en las semanas 1 a 4 y 90Y-hPAM4 se administró una vez a la semana en las semanas 2 a 4 (3 dosis). Dos meses después, se repitió el mismo ciclo de terapia, porque no se observaron toxicidades importantes después del primer ciclo. Ya 4 semanas después del primer ciclo de tratamiento, sorprendentemente se observó evidencia por TC de una reducción en los diámetros del tumor primario y 2 de las 3 metástasis hepáticas, y esto fue consistente con disminuciones significativas en los valores SUV de las exploraciones con FDG-PET, con 3 de los 4 tumores volvieron a los niveles de SUV de fondo normales en este momento (FIG. 1 y FIG. 2). El nivel de CA-19.9 previo a la terapia del paciente de 1297 cayó a un nivel bajo de 77, lo que respalda aún más la eficacia de la terapia. La Tabla 1 muestra los efectos de la radioinmunoterapia combinada con 90Y-hPAM4 y quimioterapia con gemcitabina en este paciente. Fue sorprendente e inesperado que dosis tan bajas del radionúclido conjugado con el anticuerpo combinadas con dosis tan bajas y no tóxicas de gemcitabina mostraran tal actividad antitumoral incluso después de un solo ciclo de esta terapia.
Tabla 1. Efectos de la radioinmunoterapia combinada con 90Y-hPAM4 y quimioterapia con gemcitabina en el carcinoma de páncreas metastásico
Ejemplo 2. Terapia de xenoinjertos de cáncer de páncreas con gemcitabina y péptido marcado con 90Y d irig ido previamente utilizando TF10
Resumen
[0144]Actualmente se está examinando 90Y-hPAM4 IgG en ensayos de fase I/II en combinación con gemcitabina en pacientes con cáncer de páncreas en estadio III/IV. Divulgamos un nuevo enfoque para la orientación previa de radionúclidos que es capaz de administrar una cantidad similar de radiactividad a los xenoinjertos de cáncer de páncreas, pero con menos toxicidad hematológica, lo que sería más adecuado para su combinación con gemcitabina. El anticuerpo biespecífico TF10 se preparó mediante la técnica DNL como se describe a continuación. A ratones desnudos con ~0,4 cm3 sc de cáncer de páncreas humano CaPan1 se les administró TF10, seguido 1 día después con un péptido hapteno marcado con 90Y (IMP-288). A este tratamiento se agregaron varias dosis y esquemas de gemcitabina y se monitoreó la progresión del tumor hasta 28 semanas. 0,7 mCi de PT-RAIT solo produjo solo una pérdida transitoria del 60 % en los recuentos sanguíneos, y los animales que recibieron 0,9 mCi de PT-RAIT solo y 0,7 mCi de PT-RAIT 6 mg de gemcitabina (equivalente humano ~1000 mg/m2) no tuvieron evidencia histológica de toxicidad renal después de 9 meses. Una dosis única de 0,25 o 0,5 mCi de PT-RAIT sola puede eliminar completamente el 20% y el 80% de los tumores, respectivamente. PT-RAIT fraccionado mensual (0,25 mCi/dosis administrada al inicio de cada ciclo de gemcitabina) agregado a un régimen estándar de gemcitabina (6 mg semanales x 3; 1 semana de descanso; repetir 3 veces) aumentó significativamente el tiempo medio para que los tumores alcanzaran 3,0 cm3 sobre PT-RAIT solo. Otros planes de tratamiento que examinaron regímenes de dosis de radiosensibilización no citotóxica de gemcitabina agregada a PT-RAIT también mostraron mejoras significativas en la respuesta al tratamiento con respecto a PT-RAIT solo. Los resultados muestran que PT-RAIT es un nuevo enfoque prometedor para el tratamiento del cáncer de páncreas. Estos datos indican que la combinación de PT-RAIT con gemcitabina mejorará las respuestas terapéuticas.
Métodos
[0145]Se preparó el anticuerpo biespecífico TF10 como se describe a continuación. Para la orientación previa, se administró TF10 a ratones desnudos que portaban la línea celular de adenocarcinoma de páncreas humano, CaPan1. Después de dejar tiempo suficiente para que TF10 se eliminara de la sangre (16 h), se administró el péptido HSG divalente radiomarcado. El péptido HSG de pequeño peso molecular (~1,4 kD) se elimina de la sangre en cuestión de minutos y entra en el espacio extravascular donde puede unirse al brazo anti-HSG del bsMAb TF10 predirigido. En unas pocas horas, >80% del péptido HSG radiomarcado se excreta en la orina, dejando el péptido localizado en el tumor y una pequeña cantidad en los tejidos normales.
Resultados
[0146] FIG.3ilustra la actividad terapéutica derivada de un único tratamiento de tumores CaPan1 establecidos (~0,4 cm3) con 0,15 mCi de 90Y-hPAM4 IgG, o 0,25 o 0,50 mCi de 90Y-IMP-288 predirigido a TF10. Se observó una actividad antitumoral similar para la dosis predirigida de 0,5 |jCi frente a la dosis de 0,15 mCi de la IgG directamente radiomarcada, pero la toxicidad hematológica fue grave a este nivel del conjugado directo (no se muestra), mientras que la dosis predirigida fue sólo moderadamente tóxica (no mostrada). De hecho, la MTD para la orientación previa con 90Y-IMP-288 es de al menos 0,9 mCi en ratones desnudos.
[0147] FIG. 4muestra que la combinación de gemcitabina y PT-RAIT tiene un efecto sinérgico en la terapia antitumoral. Se administraron dosis equivalentes humanas de 1000 mg/m2 (6 mg) de gemcitabina (GEM) por vía intraperitoneal a ratones semanalmente durante 3 semanas y luego, después de descansar durante 1 semana, este régimen se repitió 2 veces. Se administró PT-RAIT (0,25 |jCi de 90YIMP-288 predirigido a TF10) 1 día después de la primera dosis de GEM en cada uno de los 3 ciclos de tratamiento. GEM por sí solo no tuvo un impacto significativo en la progresión del tumor (supervivencia basada en el tiempo para progresar a 3,0 cm3). PT-RAIT solo mejoró la supervivencia en comparación con los animales no tratados, pero el régimen combinado de GEM con pT-RAIT aumentó la supervivencia media en casi 10 semanas. Debido a que la toxicidad hematológica no limita la dosis de PT-RAIT, pero es una de las limitaciones de la terapia con gemcitabina, estos estudios sugieren que PT-RAIT podría agregarse a una terapia GEM estándar con el potencial de mejorar las respuestas. El importante efecto sinérgico de gemcitabina más PT-RAIT fue sorprendente e inesperado.
[0148]Un estudio adicional examinó el efecto del momento de administración sobre la potenciación del efecto antitumoral de gemcitabina más PT-RAIT. Se administró una dosis única de 6 mg de GEM un día antes o 1 día después de 0,25 mCi de 90Y-IMP-288 predirigido a TF 10 (no se muestra). Este estudio confirmó lo que ya se sabe con GEM, es decir, que es mejor realizar la radiosensibilización antes de la radiación. El porcentaje de supervivencia de los ratones tratados mostró poca diferencia en el tiempo de supervivencia entre PT-RAIT solo y PT-RAIT con gemcitabina administrada 22 horas después del péptido radiomarcado. Sin embargo, la administración de gemcitabina 19 horas antes del PT-RAIT resultó en un aumento sustancial de la supervivencia (no mostrado).
[0149]Una dosis única de PT-RAIT (0,25 mCi) combinada con cetuximab (1 mg semanal ip; 7 semanas) o con cetuximab GEM (6 mg semanalmente x 3) en animales portadores de CaPan1 mostró la combinación GEM cetuximab con PT-RAIT proporcionando una mejor respuesta inicial (FIG. 5), pero la respuesta asociada solo con cetuximab solo agregado a PT-RAIT fue alentadora (FlG. 5), ya que fue tan buena o mejor que PT-RAIT GEM. Debido a que la supervivencia general en este estudio fue excelente, con sólo 2 tumores en cada grupo progresaron a >2,0 cm3 después de 24 semanas cuando finalizó el estudio, estos resultados indican un papel potencial para cetuximab cuando se agrega a PT-RAIT.
Ejemplo 3. Efecto de la radioinmunoterapia fraccionada predirigida (PT-RAIT) para la terapia del cáncer de páncreas
[0150] Evaluamos la terapia fraccionada con péptido 90Y-DOTA-di-HSG (IMP-288) y TF10. Se realizaron estudios utilizando TF10 e IMP-288 radiomarcado en ratones desnudos portadores de xenoinjertos de cáncer de páncreas humano sc CaPan1, 0,32-0,54 cm3. Para la terapia, se administró 90Y-IMP-288 predirigido a TF10 [A] una vez (0,6 mCi en la semana 0) o [B] fraccionado (0,3 mCi en las semanas 0 y 1), [C] (0,2 mCi en las semanas 0, 1 y 2) o [D] (0,2 mCi en las semanas 0, 1 y 4).
[0151] Se observó regresión tumoral (>90%) en la mayoría de los ratones, 9/10, 10/10, 9/10 y 8/10 en los grupos [A], [B], [C] y [D], respectivamente. En el grupo [A], la regresión tumoral máxima en el 50 % de los ratones se alcanzó a las 3,7 semanas, en comparación con 6,1, 8,1 y 7,1 semanas en [B], [C] y [D], respectivamente. Algunos tumores mostraron un nuevo crecimiento. En la semana 14, la mejor respuesta terapéutica se observó en el grupo fraccionado (2x0,3 mCi), con 6/10 ratones sin tumores (NT) en comparación con 3/10 en los grupos de 3x0,2 mCi y 1/10 en el grupo 1x 0,6 mCi. No se observó ninguna pérdida importante de peso corporal. PT-RAIt fraccionado proporciona otra alternativa para el tratamiento del cáncer de páncreas con una toxicidad mínima.
Ejemplo 4. Tratamiento con radioinmunoterapia (RAIT) 90Y-hPAM4 más gemcitabina radiosensibilizante (GEM) en cáncer de páncreas (PC) avanzado
[0152] 90Y-hPAM4, un anticuerpo humanizado altamente específico para PC, mostró actividad transitoria en pacientes con enfermedad avanzada y RAIT potenciado por GEM en estudios preclínicos. Este estudio evaluó ciclos de tratamiento repetidos de 90Y-hPAM4 más GEM en pacientes con PC irresecable y no tratada. La dosis de 90Y se incrementó por cohorte, y los pacientes repitieron ciclos de 4 semanas (200 mg/m2 de GEM una vez a la semana, 90Y-hPAM4 una vez a la semana durante las semanas 2 a 4) hasta progresión o toxicidad inaceptable. Las evaluaciones de respuesta utilizaron niveles séricos de CT, FDG-PET y CA19.9.
[0153] De 8 pacientes (3F/5M, 56-72 años) con los primeros 2 niveles de dosis (6,5 y 9,0 mCi/m290Y-hPAM4 x 3), la toxicidad hematológica ha sido transitoria de Grado 1-2. Dos pacientes respondieron al tratamiento inicial con descensos de FDG SUV y CA19.9 y regresión de la lesión mediante TC. Ambos pacientes continúan en buen estado funcional ahora después de 9 y 11 meses. y después de un total de 3 y 4 ciclos, respectivamente, sin toxicidad adicional. Un tercer paciente con una respuesta estable mediante PET y Ct y descensos en los niveles de CA19.9 después del tratamiento inicial se encuentra ahora en un segundo ciclo. Otros cuatro pacientes tuvieron una progresión temprana de la enfermedad y el paciente restante aún está siendo evaluado. El aumento de la dosis continúa después de que RAIT fraccionado con 90Y-hPAM4 más dosis bajas de gemcitabina demostró actividad terapéutica en los niveles iniciales de dosis de 90Y, con toxicidad hematológica mínima, incluso después de 4 ciclos de terapia.
Ejemplo 5. El anticuerpo PAM4 se une a las primeras etapas del cáncer de páncreas
[0154] Se realizaron estudios de inmunohistoquímica con el anticuerpo PAM4. Los resultados obtenidos con secciones de tejido teñidas no mostraron reacción de PAM4 con conductos y tejidos acinares pancreáticos normales (no se muestran). Por el contrario, el uso del anticuerpo MAS aplicado a las mismas muestras de tejido mostró una tinción positiva difusa de los conductos pancreáticos normales y del tejido acinar (no mostrado). En secciones de tejido con adenocarcinoma de páncreas bien diferenciado o moderadamente diferenciado, la tinción con PAM4 fue positiva, con tinción principalmente citoplasmática, pero intensificación en la superficie celular. El tejido pancreático normal en las mismas secciones de tejido no estaba teñido.
[0155] La Tabla 2 muestra los resultados del análisis inmunohistoquímico con PAM4 MAb en muestras de adenocarcinoma de páncreas de diversas etapas de diferenciación. En general, hubo una tasa de detección del 87 % para todas las muestras de cáncer de páncreas, con un 100 % de detección de cánceres de páncreas bien diferenciados y casi un 90 % de detección de cánceres de páncreas moderadamente diferenciados.
Tabla 2. Unión de PAM4 a diferentes estadios del cáncer de páncreas
[0156]LaTabla 3muestra que la tinción inmunohistoquímica con PAM4 también detectó un porcentaje muy alto de lesiones precursoras de cáncer de páncreas, incluyendo PanIN-1A a PanIN-3, IPMN (neoplasias mucinosas papilares intraductales) y MCN (neoplasias quísticas mucinosas). En general, la tinción con PAM4 detectó el 89% de todas las lesiones precursoras pancreáticas. Estos resultados demuestran que la inmunodetección basada en anticuerpos PAM4 es capaz de detectar casi el 90% de los cánceres de páncreas y lesiones precursoras mediante análisisin vitro.La expresión de PAM4 se observó en las primeras fases del desarrollo de PanIN. Se observó tinción intensa en muestras de IPMN y MCN (no se muestran). El epítopo PAM4 estuvo presente en altas concentraciones (tinción intensa y difusa) en la gran mayoría de los adenocarcinomas de páncreas. PAM4 mostró una reactividad intensa y difusa con las primeras etapas de las lesiones precursoras del carcinoma de páncreas, incluidas PanIN-1, IPMN y MCN, pero no reaccionó con el tejido pancreático normal. En conjunto, estos resultados muestran que el anticuerpo PAM4 se une con una especificidad muy alta a las primeras etapas del desarrollo del cáncer de páncreas.
Tabla 3. Bandas de PAM4 en lesiones precursoras del cáncer de páncreas
Ejemplo 6. Preparación de construcciones Dock-and-Lock (DNL)
Proteínas de fusión DDD y DA
[0157]La técnica DNL se puede utilizar para preparar dímeros, trímeros, tetrámeros, hexámeros, etc. que comprenden prácticamente cualquier anticuerpo o fragmentos de los mismos u otros restos efectores. Para determinadas formas de realización preferidas, se pueden producir anticuerpos IgG o fragmentos de anticuerpos Fab como proteínas de fusión que contienen una secuencia de dominio de dimerización y acoplamiento (DDD) o de dominio de anclaje (DA). Aunque en formas de realización preferidas los restos DDD y DA se producen como proteínas de fusión, el experto en la técnica se dará cuenta de que se pueden utilizar otros métodos de conjugación, tales como entrecruzamiento químico, dentro del alcance de los métodos y composiciones reivindicados.
[0158]Se pueden formar anticuerpos biespecíficos combinando una proteína de fusión Fab-DDD de un primer anticuerpo con una proteína de fusión Fab-DA de un segundo anticuerpo. Alternativamente, se pueden preparar construcciones que combinen proteínas de fusión IgG-DA con proteínas de fusión Fab-DDD. La técnica no es limitante y cualquier proteína o péptido de uso puede producirse como una proteína de fusión DA o DDD para su incorporación en una construcción DNL. Cuando se utiliza reticulación química, los conjugados de DA y DDD no se limitan a proteínas o péptidos y pueden comprender cualquier molécula que pueda entrecruzarse con una secuencia de<d>A o DDD utilizando cualquier técnica de reticulación conocida en la técnica. En ciertas formas de realización ejemplares, se puede incorporar un polietilenglicol (PEG) u otro resto polimérico en una construcción de DNL, como se describe con más detalle a continuación.
[0159]Para aplicaciones de predireccionamiento, un anticuerpo o fragmento que contiene un sitio de unión para un antígeno asociado con un tejido enfermo, tal como un antígeno asociado a tumores (TAA), se puede combinar con un segundo anticuerpo o fragmento que se une a un hapteno en una construcción dirigible, a la que se une un agente terapéutico y/o de diagnóstico. El anticuerpo biespecífico basado en DNL se administra a un sujeto, se permite que el anticuerpo circulante se elimine de la sangre y se localice en el tejido objetivo, y se añade la construcción objetivoconjugada y se une al anticuerpo localizado para diagnóstico o terapia.
[0160]Se pueden desarrollar líneas celulares transgénicas independientes para cada proteína de fusión Fab o IgG. Una vez producidos, los módulos pueden purificarse si se desea o mantenerse en el líquido sobrenadante del cultivo celular. Después de la producción, cualquier módulo de proteína DDDfusion se puede combinar con cualquier módulo de proteína de fusión DA para generar una construcción DNL biespecífica. Para diferentes tipos de construcciones, se pueden utilizar diferentes secuencias DA o DDD. A continuación, se proporcionan secuencias DDD y DA ejemplares.
DDD1: SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA (SEQ ID NO:13)
DDD2: CGHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA (SEQ ID NO:14)
AD1: QIEYLAKQIVDNAIQQA (SEQ ID NO:15)
AD2: CGQIEYLAKQIVDNAIQQAGC (SEQ ID NO: 16)
[0161]El experto en la técnica se dará cuenta de que DDD1 y DDD2 comprenden la secuencia DDD de la forma Rila humana de la proteína quinasa A. Sin embargo, en formas de realización alternativas, los restos DDD y DA pueden basarse en la secuencia DDD de la forma Rla humana de proteína quinasa A y una secuencia AKAP correspondiente, como se ejemplifica en DDD3, DDD3C y AD3 a continuación.
DDD3
SLRECELYVQKHNIQALLKDSIVQLCTARPERPMAFLREYFERLEKEEAK (SEQ ID NO:17)
DDD3C
MSCGGSLRECELYVQKHNIQALLKDSIVQLCTARPERPMAFLREYFERLEKEEAK (SEQ ID NO: 18)
AD3
CGFEELAWKIAKMIWSDVFQQGC (SEQ ID NO: 19)
Vectores de expresión
[0162]El vector plasmídico pdHL2 se ha utilizado para producir varios anticuerpos y construcciones basadas en anticuerpos. Véase Gillies et al., J Immunol Methods (1989), 125:191-202; Losman y col., Cancer (Phila) (1997), 80:2660-6. El vector de expresión dicistrónico de mamíferos dirige la síntesis de las cadenas pesada y ligera de IgG. Las secuencias del vector son en su mayoría idénticas para muchas construcciones IgG-pdHL2 diferentes, existiendo las únicas diferencias en las secuencias del dominio variable (V<h>y V<l>). Utilizando herramientas de biología molecular conocidas por los expertos en la técnica, estos vectores de expresión de IgG se pueden convertir en vectores de expresión Fab-DDD o Fab-DA. Para generar vectores de expresión Fab-DDD, las secuencias codificantes para los dominios bisagra, CH2 y CH3 de la cadena pesada se reemplazan con una secuencia que codifica los primeros 4 residuos de la bisagra, un enlazador Gly-Ser de 14 residuos y los primeros 44 residuos de Rila humana (denominada DDD1). Para generar vectores de expresión Fab-DA, las secuencias de los dominios bisagra, CH2 y CH3 de IgG se reemplazan con una secuencia que codifica los primeros 4 residuos de la bisagra, un enlazador Gly-Ser de 15 residuos y un DA sintético de 17 residuos llamado AKAP-/S (denominado AD1), que se generó utilizando bioinformática y tecnología de matriz de péptidos y demostró que se une a los dímeros Rila con una afinidad muy alta (0,4 nM). Véase Alto, et al. Proc. Nacional. Acad. Sci., EE.UU. (2003), 100:4445-50.
[0163]Se diseñaron dos vectores lanzadera para facilitar la conversión de vectores IgG-pdHL2 en vectores de expresión Fab-DDD1 o Fab-AD1, como se describe a continuación.
Preparación de CH1
[0164]El dominio CH1 se amplificó mediante PCR utilizando el vector plásmido pdHL2 como plantilla. El cebador de PCR izquierdo consistía en el extremo aguas arriba (5') del dominio CH1 y un sitio de endonucleasa de restricción Sacll, que está en 5' de la secuencia codificante de CH1. El cebador derecho constaba de la secuencia que codifica los primeros 4 residuos de la bisagra (PKSC) seguida de cuatro glicinas y una serina, comprendiendo los dos codones finales (GS) un sitio de restricción Bam Hl. El amplificador de PCR de 410 pb se clonó en el vector de clonación de PCR PGEMT® (PROMEGA®, Inc.) y se examinaron los clones en busca de insertos en la orientación T7 (5').
[0165]Se sintetizó un oligonucleótido dúplex para codificar la secuencia de aminoácidos de DDD 1 precedida por residuos del péptido enlazador, comprendiendo los dos primeros codones un sitio de restricción BamHI. En el extremo 3' se añaden un codón de parada y un sitio de restricción EagI. La secuencia polipeptídica codificada se muestra a continuación. GSGGGGSGGGGSHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA (SEQ ID NO:20)
[0166]Se sintetizaron y combinaron dos oligonucleótidos, denominados RIIA1-44 superior y RIIA1-44 inferior, que se superponen en 30 pares de bases en sus extremos 3', para comprender los 154 pares de bases centrales de la secuencia DDD1 de 174 pb. Los oligonucleótidos se hibridaron y se sometieron a una reacción de extensión del cebador con Taq polimerasa. Tras la extensión del cebador, el dúplex se amplificó mediante PCR. El amplificador se clonó en PGEMT® y se examinó en busca de insertos en la orientación T7 (5').
[0167]Se sintetizó un oligonucleótido dúplex para codificar la secuencia de aminoácidos de AD1 precedida por 11 residuos del péptido enlazador, comprendiendo los dos primeros codones un sitio de restricción BamHI. En el extremo 3' se añaden un codón de parada y un sitio de restricción EagI. La secuencia polipeptídica codificada se muestra a continuación. GSGGGGSGGGGSQIEYLAKQIVDNAIQQA (SEQ ID NO: 21)
[0168]Se reasociaron dos oligonucleótidos superpuestos complementarios que codifican la secuencia peptídica anterior, denominados AKAP-IS Top y AKAP-IS Bottom. El dúplex se amplificó mediante PCR. El amplificador se clonó en el vector PGEMT® y se examinó en busca de insertos en la orientación T7 (5').
Ligando DDD1 con CH1
[0169]Un fragmento de 190 pb que codifica la secuencia DDD1 se escindió de PGEMT® con enzimas de restricción BamHI y NotI. y luego se ligaron en los mismos sitios en CH1-PGEMT® para generar el vector lanzadera CH1-DDD1-PGEMT®.
Ligando AD1 con CH1
[0170]Un fragmento de 110 pb que contenía la secuencia AD1 se escindió de PGEMT® con BamHI y NotI y luego ligado en los mismos sitios en CH1-PGEMT® para generar el vector lanzadera CH1-AD1-PGEMT®.
Clonación de CH1-DDD1 o CH1-AD1 en vectores basados en pdHL2
[0171]Con este diseño modular se puede incorporar CH1-DDD1 o CH1-AD1 en cualquier construcción de IgG en el vector pdHL2. Todo el dominio constante de la cadena pesada se reemplaza con una de las construcciones anteriores eliminando el fragmento de restricción SacII/EagI (CH1-CH3) de pdHL2 y reemplazándolo con el fragmento SacII/EagI de CH1-DDD 1 o CH1-AD1, que es cortado del respectivo vector lanzadera pGemT.
Construcción de h679-Fd-AD1-pdHL2
[0172]h679-Fd-AD1-pdHL2 es un vector de expresión para la producción de h679 Fab con AD1 acoplado al extremo carboxilo terminal del dominio CH1 de Fd a través de un espaciador peptídico Gly/Ser flexible compuesto de 14 residuos de aminoácidos. Un vector basado en pdHL2 que contiene los dominios variables de h679 se convirtió en h679-Fd-AD1-pdHL2 mediante la sustitución del fragmento SacII/EagI por el fragmento CH1-AD1, que se escindió del vector lanzadera CH1-AD1-SV3 con SacII. y EagI.
Construcción de C-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2
[0173]C-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2 es un vector de expresión para la producción de un dímero estable que comprende dos copias de una proteína de fusión C-DDD1-Fab-hMN-14, en la que DDD1 está unido a hMN-14 Fab en el extremo carboxilo de CH1 mediante un espaciador peptídico flexible. El vector plásmido hMN-14(I)-pdHL2, que se ha utilizado para producir hMN-14 IgG, se convirtió en C-DDD1-Fd-hMN-14-pdHL2 mediante digestión con endonucleasas de restricción SacII y EagI para eliminar los dominios CH1-CH3 e inserción del fragmento CH1-DDD1, que se escindió del vector lanzadera CH1-DDD1-SV3 con SacII y EagI.
[0174]Se ha utilizado la misma técnica para producir plásmidos para la expresión Fab de una amplia variedad de anticuerpos conocidos, tales como hLL1, hLL2, hPAM4, hR1, hRS7, hMN-14, hMN-15, hA19, hA20 y muchos otros. Generalmente, las secuencias codificantes de la región variable del anticuerpo estaban presentes en un vector de expresión pdHL2 y el vector de expresión se convirtió para la producción de una proteína de fusión DA o DDD como se describió anteriormente. Las proteínas de fusión DA y DDD que comprenden un fragmento Fab de cualquiera de dichos anticuerpos se pueden combinar, en una proporción aproximada de dos proteínas de fusión DDD por una proteína de fusión DA, para generar una construcción DNL trimérica que comprende dos fragmentos Fab de un primer anticuerpo y un fragmento Fab de un segundo anticuerpo.
C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2
[0175]C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2 es un vector de expresión para la producción de C-DDD2-Fab-hMN-14, que posee una secuencia de dominio de dimerización y acoplamiento de DDD2 anexada al extremo carboxilo terminal de Fd de hMN-14 a través de un enlazador peptídico Gly/Ser de 14 residuos de aminoácidos. La proteína de fusión secretada está compuesta por dos copias idénticas de hMN-14 Fab unidas mediante interacción no covalente de los dominios DDD2.
[0176]El vector de expresión se diseñó de la siguiente manera. Se prepararon sintéticamente dos oligonucleótidos complementarios superpuestos, que comprenden la secuencia codificante de parte del péptido enlazador y los residuos 1-13 de d DD2. Los oligonucleótidos se hibridaron y fosforilaron con t 4 PNK, lo que dio como resultado salientes en los extremos 5' y 3' que son compatibles para la ligación con ADN digerido con las endonucleasas de restricción BamHI y PstI, respectivamente.
[0177]El ADN dúplex se ligó con el vector lanzadera CH1-DDD1-PGEMT®, que se preparó mediante digestión con BamHI y PstI, para generar el vector lanzadera CH1-DDD2-PGEMT®. Se escindió un fragmento de 507 pb de CH1-DDD2-PGEMT® con SacII y EagI y se ligó con el vector de expresión de IgG hMN-14(I)-pdHL2, que se preparó mediante digestión con SacII y EagI. La construcción de expresión final se denominó C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2. Se han utilizado técnicas similares para generar proteínas de fusión DDD2 de los fragmentos Fab de varios anticuerpos humanizados diferentes.
h679-Fd-AD2-pdHL2
[0178]h679-Fab-AD2, se diseñó para emparejarse comoBcon C-DDD2-Fab-hMN-14 comoA.h679-Fd-AD2-pdHL2 es un vector de expresión para la producción de h679-Fab-AD2, que posee una secuencia del dominio de anclaje de AD2 unida al extremo carboxilo terminal del dominio CH1 a través de un enlazador peptídico Gly/Ser de 14 residuos de aminoácidos. AD2 tiene un residuo de cisteína anterior y otro siguiente a la secuencia del dominio de anclaje de DA 1.
[0179]El vector de expresión se diseñó de la siguiente manera. Se fabricaron sintéticamente dos oligonucleótidos complementarios superpuestos (AD2 superior y AD2 inferior), que comprenden la secuencia codificante de AD2 y parte de la secuencia conectora. Los oligonucleótidos se hibridaron y fosforilaron con T4 PNK, lo que dio como resultado salientes en los extremos 5' y 3' que son compatibles para la ligación con ADN digerido con las endonucleasas de restricción BamHI y SpeI, respectivamente.
[0180]ADN dúplex se ligó en el vector lanzadera CH1-AD1-PGEMT®, que se preparó mediante digestión con BamHI y SpeI, para generar el vector lanzadera CH1-AD2-PGEMT®. Un fragmento de 429 pares de bases que contenía secuencias codificantes de CH1 y AD2 se escindió del vector lanzadera con enzimas de restricción SacII y EagI y se ligó en el vector h679-pdHL2 que se preparó mediante digestión con esas mismas enzimas. El vector de expresión final es h679-Fd-AD2-pdHL2.
Generación de construcción TF2 DNL
[0181]Se obtuvo una construcción DNL trimérica denominada TF2 haciendo reaccionar C-DDD2-Fab-hMN-14 con h679-Fab-AD2. Se generó un lote piloto de TF2 con un rendimiento >90 % de la siguiente manera. Se mezcló C-DDD2-Fab-hMN-14 (200 mg) purificada con proteína L con h679-Fab-AD2 (60 mg) en una relación molar de 1,4:1. La concentración de proteína total fue de 1,5 mg/ml en PBS que contenía EDTA 1 mM. Los pasos posteriores incluyeron reducción de TCEP, cromatografía HIC, oxidación de DMSO y cromatografía de afinidad IMP 291. Antes de la adición de TCEP, SE-HPLC no mostró ninguna evidencia de formación dea2b. La adición de TCEP 5 mM dio como resultado rápidamente la formación de un complejoa2bconsistente con una proteína de 157 kDa esperada para la estructura binaria. TF2 se purificó hasta casi la homogeneidad mediante cromatografía de afinidad IMP 291 (no se muestra). IMP 291 es un péptido sintético que contiene el hapteno HSG al que se une el Fab 679 (Rossi et al., 2005, Clin Cancer Res 11:7122s-29s). El análisis SE-HPLC de la fracción no unida de IMP 291 demostró la eliminación de las cadenas a4, a2 y kappa libres del producto (no se muestra).
[0182]La funcionalidad de TF2 se determinó mediante el ensayo BIACORE®. TF2, C-DDD1-hMN-14+h679-AD1 (usado como muestra de control del complejoa2bno covalente), o C-DDD2-hMN-14+h679-AD2 (usado como muestra de control de los componentes a2 y b no reducidos) se diluyeron a 1 pg/ml (proteína total) y se pasaron sobre un chip sensor inmovilizado con HSG. La respuesta para TF2 fue aproximadamente el doble que la de las dos muestras de control, lo que indica que solo el componente h679-Fab-DA en las muestras de control se uniría y permanecería en el chip sensor. Las inyecciones posteriores de WI2 IgG, un anticuerpo antiidiotipo para hMN-14, demostraron que solo TF2 tenía un componente DDD-Fab-hMN-14 que estaba estrechamente asociado con h679-Fab-DA como lo indica una respuesta de señal adicional. El aumento adicional de unidades de respuesta resultante de la unión de WI2 a TF2 inmovilizado en el chip sensor correspondió a dos sitios de unión completamente funcionales, cada uno de los cuales contribuyó con una subunidad de C-DDD2-Fab-hMN-14. Esto fue confirmado por la capacidad de TF2 para unirse a dos fragmentos Fab de WI2 (no mostrado).
Producción de anticuerpo biespecífico TF10
[0183]Se utilizó un protocolo similar para generar una construcción trimérica TF10 DNL, que comprende dos copias de C-DDD2-Fab-hPAM4 y una copia de C-AD2-Fab-679. El componente de anticuerpo dirigido al cáncer en TF10 se derivó de hPAM4, un MAb de mucina humanizado contra el cáncer de páncreas que se ha estudiado en detalle como un MAb radiomarcado (por ejemplo, Gold et al., Clin. Cancer Res. 13: 7380-7387, 2007). El componente de unión a hapteno se derivó de h679, un MAb antihistaminil-succinil-glicina (HSG) humanizado. El anticuerpo biespecífico TF10 ([hPAM4]2 x h679) se produjo usando el método descrito para la producción del bsAb TF2 (anti CEA)2 x anti HSG, como se describió anteriormente. La construcción TF10 lleva dos Fab PAM4 humanizado y un Fab 679 humanizado.
[0184]Las dos proteínas de fusión (hPAM4-DDD y h679-AD2) se expresaron de forma independiente en células de mieloma transfectadas de forma estable. Los fluidos sobrenadantes del cultivo de tejidos se combinaron, dando como resultado un exceso molar del doble de hPAM4-DDD. La mezcla de reacción se incubó a temperatura ambiente durante 24 horas en condiciones reductoras suaves usando glutatión reducido 1 mM. Después de la reducción, la reacción DNL se completó mediante oxidación suave usando glutatión oxidado 2 mM. TF10 se aisló mediante cromatografía de afinidad utilizando resina IMP 291 -affigel, que se une con alta especificidad al Fab h679.
[0185]Se ha examinado un panel completo de histología tisular y de unión a células sanguíneas para detectar IgG ÜPAM4 y para un bsMAb anti-CEA x anti-HSG que está entrando en ensayos clínicos. La unión de hPAM4 se limitó a una unión muy débil a la vejiga urinaria y al estómago en 1/3 de las muestras (no se observó uniónin vivo),y no se atribuyó ninguna unión a tejidos normales al bsMAb antiCEA x anti-HSG. Además, los estudiosin vitrocontra líneas celulares que portan los receptores de histamina H1 y H2 no mostraron actividad antagonista o agonista con el péptido di-HSG IMP 288, y los estudios en animales en 2 especies diferentes no mostraron actividad farmacológica del péptido relacionado con el componente de histamina en dosis 20.000 veces superiores a las utilizadas para la obtención de imágenes. Por tanto, el derivado HSG-histamina no tiene actividad farmacológica.
[0186]El experto en la técnica se dará cuenta de que las técnicas de DNL descritas anteriormente se pueden usar para producir complejos que comprenden cualquier combinación de anticuerpos o inmunoconjugados, por ejemplo, un hPAM4 radiomarcado y un complejo de DNL hRS7 conjugado con SN-38.
Ejemplo 7. Variantes de secuencia para DNL
[0187]En ciertas formas de realización preferidas, las secuencias DA y DDD incorporadas en el complejo DNL comprenden las secuencias de aminoácidos de AD1 o AD2 y DDD1 o DDD2, como se analizó anteriormente. Sin embargo, en formas de realización alternativas, se pueden utilizar variantes de secuencia de restos DA y/o DDD en la construcción de los complejos DNL. Por ejemplo, existen sólo cuatro variantes de secuencias de PKA DDD humana, correspondientes a los restos DDD de PKA RIa, Rila, RIp y RIIp. La secuencia Rila DDD es la base de DDD1 y DDD2 descritos anteriormente. Las cuatro secuencias de PKA d Dd humana se muestran a continuación. La secuencia DDD representa los residuos 1-44 de Rila, 1-44 de RIIp, 12-61 de Rla y 13-66 de Rlp. (Tenga en cuenta que la secuencia de DDD1 está ligeramente modificada con respecto al resto humano PKA RIIa DDD).
PKA RIa
SLRECELYVQKHNIQALLKDVSIVQLCTARPERPMAFLREYFEKLEKEEAK (SEQ ID NO:22)
PKA RIp
SLKGCELYVQLHGIQQVLKDCIVHLCISKPERPMKFLREHFEKLEKEENRQILA (SEQ ID NO:23)
PKA RIIa
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVGQQPPDLVDFAVEYFTRLREARRQ (SEQ ID NO: 24)
PKA RIIp
SIEIPAGLTELLQGFTVEVLRHQPADLLEFALQHFTRLQQENER (SEQ ID NO: 25)
[0188]Las relaciones estructura-función de los dominios AD y DDD han sido objeto de investigación. (Ver, por ejemplo, Burns-Hamuro et al., 2005, Protein Sci 14:2982-92; Carr et al., 2001, J Biol Chem 276: 17332-38; Alto et al., 2003, Proc Natl Acad Sci EE.UU. 100:4445-50; Hundsrucker et al., 2006, Biochem J 396:297-306; Stokka et al., 2006, Biochem J 400:493-99; ; Kinderman et al., 2006, Mol Cell 24:397-408.)
[0189]Por ejemplo, Kinderman et al. (2006) examinaron la estructura cristalina de la interacción de unión DA-DDD y concluyeron que la secuencia de DDD humana contenía una serie de residuos de aminoácidos conservados que eran importantes en la formación de dímeros o en la unión de AKAP, subrayados en la SEQ ID NO:13 a continuación. (Ver Figura 1 de Kinderman et al., 2006.) El experto en la materia se dará cuenta de que al diseñar variantes de secuencia de la secuencia DDD, sería deseable evitar cambiar cualquiera de los residuos subrayados, mientras que se podrían realizar sustituciones conservadoras de aminoácidos para los residuos que son menos críticos para la dimerización y la unión de AKAP.
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA (SEQ ID NO:13)
[0190]Alto y col. (2003) realizaron un análisis bioinformático de la secuencia DA de varias proteínas AKAP para diseñar una secuencia DA selectiva de RII denominada AKAP-IS (SEQ ID NO:15), con una constante de unión para DDD de 0,4 nM. La secuencia de AKAPIS se diseñó como un péptido antagonista de la unión de AKAP a PKA. Los residuos en la secuencia AKAP-IS donde las sustituciones tendieron a disminuir la unión a DDD están subrayados en SEQ ID NO:15. El experto en la técnica se dará cuenta de que al diseñar variantes de secuencia de la secuencia DA, sería deseable evitar cambiar cualquiera de los residuos subrayados, mientras que se podrían realizar sustituciones de aminoácidos conservadoras para los residuos que son menos críticos para la unión de DDD.
Secuencia AKAP-IS
[0191]QIEYLAKQIVDNAIQQA (SEQ ID NO:15)
[0192]Gold (2006) utilizó cristalografía y cribado de péptidos para desarrollar una secuencia SuperAKAP-IS (SEQ ID n O:26), que muestra una selectividad cinco órdenes de magnitud mayor para la isoforma RII de PKA en comparación con la isoforma RI. Los residuos subrayados indican las posiciones de las sustituciones de aminoácidos, en relación con la secuencia AKAP-IS, que aumentaron la unión al resto DDD de RIIa. En esta secuencia, el residuo Q N-terminal está numerado como residuo número 4 y el residuo A C-terminal es el residuo número 20. Los residuos donde se podrían realizar sustituciones para afectar la afinidad por RIIa fueron los residuos 8, 11, 15, 16, 18, 19 y 20 (Gold et al., 2006). Se contempla que, en ciertas formas de realización alternativas, la secuencia SuperAKAP-IS puede sustituirse por la secuencia del resto AKAP-IS DA para preparar construcciones DNL. Otras secuencias alternativas que podrían sustituirse por la secuencia AKAP-IS DA se muestran en SEQ ID NO:27-29. Las sustituciones relativas a la secuencia AKAP-IS están subrayadas. Se anticipa que, al igual que con la secuencia AD2 mostrada en SEQ ID NO:16, el resto DA también puede incluir los residuos N-terminales cisteína y glicina adicionales y los residuos C-terminales glicina y cisteína.
SuperAKAP-IS
QIEYVAKQIVDYAIHQA (SEQ ID NO: 26)
Secuencias AKAP alternativas
QIEYKAKQIVDHAIHQA (SEQ ID NO: 27)
QIEYHAKQIVDHAIHQA (SEQ ID NO:28)
QIEYVAKQIVDHAIHQA (SEQ ID NO:29)
[0193]Figura 2 de Gold et al. reveló secuencias adicionales de unión a DDD de una variedad de proteínas AKAP, que se muestran abajo.
AKAP específicos de RII
[0194]
AKAP-KL
PLEYQAGLLVQNAIQQAI (SEQ ID NO: 30)
AKAP79
LLIETASSLVKNAIQLSI (SEQ ID NO: 31)
AKAP-Lbc
LIEEAASRIVDAVIEQVK (SEQ ID NO: 32)
AKAP específicos de RI
[0195]
AKAPce
ALYQFADRFSELVISEAL (SEQ ID NO: 33)
RIADLEQVANQLADQIIKEAT (SEQ ID NO:34)
PV38
FEELAWKIAKMIWSDVF (SEQ ID NO: 35)
AKAP de doble especificidad
[0196]
AKAP 7
ELVRLSKRLVENAVLKAV (SEQ ID NO: 36)
MAP2D
TAEEVSARIVQVVTAEAV (SEQ ID NO: 37)
DAKAP1
QIKQAAFQLISQVILEAT (SEQ ID NO: 38)
DAKAP2
LAWKIAKMIVSDVMQQ (SEQ ID NO: 39)
[0197]Stokka y col. (2006) también desarrollaron péptidos competidores de la unión de AKAP a PKA, mostrados en Se Q ID NO:40-42. Los antagonistas peptídicos se designaron como Ht31 (SEQ ID NO:40), RIAD (SEQ ID NO:41) y PV-38 (SEQ ID NO:42). El péptido Ht-31 mostró una mayor afinidad por la isoforma RII de P<k>A, mientras que el R<i>AD y el PV-38 mostraron una mayor afinidad por RI.
Ht31
DLIEEAASRIVDAVIEQVKAAGAY (SEQ ID NO: 40)
RIADLEQYANQLADQIIKEATE (SEQ ID NO: 41)
PV-38
FEELAWKIAKMIWSDVFQQC (SEQ ID NO: 42)
[0198]Hundsrucker et al. (2006) desarrollaron otros péptidos competidores para la unión de AKAP a PKA, con una constante de unión tan baja como 0,4 nM al DDD de la forma RII de PKA. Las secuencias de diversos péptidos antagonistas de AKAP se proporcionan en la Tabla 1 de Hundsrucker et al., reproducida en laTabla 4a continuación. AKAPIS representa un péptido de unión a subunidades RII sintético. Todos los demás péptidos se derivan de los dominios de unión a RII de las AKAP indicadas.
Tabla 4. Secuencias del péptido AKAP
Secuencia peptídica
AKAPIS QIEYLAKQIVDNAIQQA (SEQ ID NO:15)
AKAPIS-P QIEYLAKQIPDNAIQQA (SEQ ID NO:43)
Ht31 KGADLIEEAASRIVDAVIEQVKAAG (SEQ ID NO:44) Ht31-P KGADLIEAASRIPDAPIEQVKAAG (SEQ ID NO:45)
AKAP75-wt-pep PEDAELVRLSKRLVENAVLKAVQQY (SEQ ID NO:46) AKAP75-L304T-pep PEDAELVRTSKRLVENAVLKAVQQY (SEQ ID NO:47) AKAP75-L308D-pep PEDAELVRLSKRDVENAVLKAVQQY (SEQ ID NO:48) AKAP75-P-pep PEDAELVRLSKRLPENAVLKAVQQY (SEQ ID NO:49) AKAP75-PP-pep PEDAELVRLSKRLPENAPLKAVQQY (SEQ ID NO:50) AKAP75-L314E-pep PEDAELVRLSKRLVENAVEKAVQQY (SEQ ID NO:51) AKAP1-pep EEGLDRNEEIKRAAFQIISQVISEA (SEQ ID NO:52) AKAP2-pep LVDDPLEYQAGLLVQNAIQQAIAEQ (SEQ ID NO:53) AKAP5-pep QYETLLIETASSLVKNAIQLSIEQL (SEQ ID NO:54)
AKAP9-pep LEKQYQEQLEEEVAKVIVSMSIAFA (SEQ ID NO:55) AKAP10-pep NTDEAQEELAWKIAKMIVSDIMQQA (SEQ ID NO:56) AKAP11-pep VNLDKKAVLAEKIVAEAIEKAEREL (SEQ ID NO:57) AKAP12-pep NGILELETKSSKLVQNIIQTAVDQF (SEQ ID NO:58) AKAP14-pep TQDKNYEDELTQVALALVEDVINYA (SEQ ID NO:59) Rab32-pep ETSAKDNINIEEAARFL VEKIL VNH (SEQ ID NO:60)
[0199]Los residuos que estaban altamente conservados entre los dominios DA de diferentes proteínas AKAP se indican a continuación subrayados con referencia a la secuencia IS de AKAP (SEQ ID NO: 15). Los residuos son los mismos que los observados por Alto et al. (2003), con la adición del residuo de alanina C-terminal. (Ver Figura 4 de Hundsrucker et al. (2006). Las secuencias de antagonistas peptídicos con afinidades particularmente altas por la secuencia RII DDD fueron las de AKAP-IS, AKAP78-wt-pep, AKAP78-L304T-pep y AKAP76- L308D-pep.
AKAP-IS
[0200]QIEYLAKQIVDNAIQQA (SEQ ID NO: 15)
[0201]Carr y col. (2001) examinaron el grado de homología de secuencia entre diferentes secuencias DDD de unión a AKAP de proteínas humanas y no humanas e identificó residuos en las secuencias DDD que parecían ser las más altamente conservadas entre diferentes restos DDD. Estos se indican a continuación subrayados con referencia a la PKA humana. La secuencia RIIa DDD de SEQ ID NO: 13. Los residuos que se conservaron particularmente se indican además en cursiva. Los residuos se superponen con los sugeridos por Kinderman et al., pero no son idénticos (2006) es importante para vincular proteínas AKAP. El experto en la técnica se dará cuenta de que al diseñar variantes de secuencia de DDD, lo más preferido sería evitar cambiar los residuos más conservados (en cursiva), y sería preferible evitar también cambiar los residuos conservados (subrayados), mientras que se pueden considerar sustituciones conservadoras de aminoácidos para residuos que no son ni subrayados ni en cursiva.
SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQEPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO: 13)
[0202]El experto en la técnica se dará cuenta de que estas y otras sustituciones de aminoácidos en el resto de anticuerpo o porciones de enlazador de las construcciones de DNL se pueden utilizar para mejorar las propiedades terapéuticas y/o farmacocinéticas de las construcciones de DNL resultantes.
Ejemplo 8. Citotoxicidad de inmunoconjugados RS7 para células cancerosas
[0203]El anticuerpo RS7 se conjugó con ranpirnasa para producir un inmunoconjugado con toxicidad muy alta para una variedad de líneas celulares epiteliales. La ranpirnasa (Rap) es una ribonucleasa monocatenaria de 104 aminoácidos aislada originalmente de los ovocitos deRana pipiens.El rap exhibe efectos citostáticos y citotóxicos en una variedad de líneas celulares tumoralesin vitro,así como actividad antitumoralin vivo.El rap ingresa a las células a través de endocitosis mediada por receptores y una vez internalizado en el citosol, degrada selectivamente el ARNt, lo que resulta en la inhibición de la síntesis de proteínas y la inducción de la apoptosis. El rap se puede administrar repetidamente a pacientes sin una respuesta inmune adversa, y se informa que la toxicidad renal reversible es limitante de la dosis (Mikulski et al., J Clin Oncol 2002; 20:274-81; Int J Oncol 1993; 3:57-64).
[0204]En los estudios siguientes, un inmunoconjugado que comprende Rap unido a RS7 mostró una actividad antiproliferativa amplia y potente contra diversas líneas celulares de cáncer epitelial humanoin vitro,así como un xenoinjerto de cáncer de pulmón humanoin vivo.La inmunotoxina basada en IgG, denominada 2L-Rap(Q)-hRS7, comprendía Rap(Q) (una forma mutante de Rap con el supuesto sitio de N-glicosilación eliminado) conjugado con hRS7. 2L-Rap(Q)-hRS7 suprimió el crecimiento tumoral en un modelo profiláctico de ratones desnudos portadores de xenoinjertos de cáncer de pulmón de células no pequeñas humano Calu-3, con un aumento en el tiempo medio de supervivencia (MST) de 55 a 96 días (P<0,01). Los resultados demostraron una eficacia superior de 2L-Rap(Q)-hRS7 como terapéutico para diversos cánceres que expresan Trop-2, como el de cuello uterino, mama, colon, páncreas, ovario y próstata.
Métodos
[0205]Ensayo de proliferación celular Se sembraron células tumorales en placas de 96 pocillos (1 x 104 células por pocillo) y se incubaron con artículos de prueba de 0,01 a 100 nM durante 72 h. Luego se determinó el número de células vivas utilizando la sal soluble de tetrazolio, MTS [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio], siguiendo el protocolo del fabricante. Los datos de las curvas dosis-respuesta se analizaron utilizando el software GraphPad Prism para obtener valores de CE50 (la concentración a la que se produce el 50% de inhibición).
[0206]Ensayo de formación de colonias Se tripsinizaron células tumorales y se sembraron en placas de 60 mm (1 x 103 células). Las células se trataron con cada artículo de prueba y se les permitió formar colonias. Se agregaron medios nuevos que contenían el artículo de prueba cada 4 días y, después de 2 semanas de incubación, las colonias se fijaron en formaldehído al 4% y se tiñeron con Giemsa. Se enumeraron colonias > 50 células bajo un microscopio.
[0207]Toxicidadin vivoA ratones BALB/c sin tratamiento previo (hembras, 7 semanas de edad, Taconic Farms, Germantown, NY) se les inyectó por vía intravenosa diversas dosis de (Q)-hRS7 que oscilaban entre 25 y 400 |jg por ratón y se controlaron diariamente para detectar signos visibles de toxicidad y cambio de peso corporal. La dosis máxima tolerada (MTD) se definió como la dosis más alta a la que no se produjeron muertes y la pérdida de peso corporal fue del 20 % o menos del peso del animal antes del tratamiento (aproximadamente 20 g). Los animales que experimentaron efectos tóxicos fueron sacrificados.
[0208]Eficacia terapéutica en ratones portadores de tumores Ratones nu/nu atímicos homocigotos NCr hembra de aproximadamente 20 g (5 semanas de edad cuando se recibieron de Taconic Farms) se inocularon con 1 x 107 células de NSCLC humano Calu-3 y se controló el crecimiento del tumor. mediante mediciones con calibre de longitud x ancho del tumor. El volumen del tumor se calculó como (L x W2)/2. Una vez que los tumores alcanzaron aproximadamente 0,15 cm3 de tamaño, los animales se dividieron en grupos de tratamiento de cinco por grupo. La terapia consistió en una única inyección intravenosa de 50 mg de (Q)-hRS7 o dos inyecciones de 25 mg administradas con siete días de diferencia. Un grupo de control recibió solución salina. Los animales fueron monitoreados diariamente para detectar signos de toxicidad y fueron sacrificados humanamente y se consideró que habían sucumbido a la progresión de la enfermedad si los tumores alcanzaban un tamaño superior a 2,0 cm3 o se ulceraban. Además, si los ratones perdían más del 20% del peso corporal inicial o morían de otro modo, se les aplicaba la eutanasia. Los datos de supervivencia se analizaron mediante gráficos de Kaplan-Meier (análisis de rangos logarítmicos) con el software GraphPad Prism. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas a P<0,05.
Resultados
[0209]Análisis de unión La reactividad de (Q)-hRS7 con líneas celulares que expresan Trop-2 se evaluó inicialmente mediante ELISA y se demostró para PC-3 y Calu-3 (datos no mostrados), produciendo ambos una constante de disociación aparente (KD) aproximadamente dos veces mayor que el de hRS7 (0,28 nM frente a 0,14 nM). No se observó unión para el 22Rv1 negativo para Trop-2. Se realizaron estudios posteriores mediante citometría de flujo en un total de 10 líneas celulares que expresan Trop-2, y los resultados (no mostrados) indican que prácticamente no hubo diferencia en la propiedad de unión de (Q)-hRS7 con respecto a la de hRS7.
[0210]Actividad RNasa El ensayo IVTT mide la inhibición de la síntesis de proteínas debido a la degradación del ARNm por la RNasa. (Q)-hRS7 y rRap exhibieron actividad RNasa comparable en este ensayo sin células (no mostrado). Utilizando ARNt de levadura como sustrato, estimamos que las kcat/Km (109 M'1 s_1) de rRap y (Q)-hRS7 eran 4,10 (± 0,42) y 1,98, respectivamente. Por lo tanto, la eficiencia catalítica de (Q)-hRS7 basada en la concentración de Rap es aproximadamente el 50% de rRap.
[0211]Citotoxicidad in vitro Según los resultados de un ensayo MTS, (Q)-hRS7 es más potente contra ME-180, T-47D, MDA-MB-468 y Calu-3 (no mostrado), con valores de CE50. de 1,5, 2,0, 3,8 y 8,5 nM, respectivamente. Para aquellas líneas celulares que muestran menos de <50% de inhibición del crecimiento a 100 nM de (Q)-hRS7 con el ensayo MTS, realizamos ensayos de formación de colonias para confirmar que (Q)-hRS7 era citotóxico a 10 o 100 nM para DU-145, PC-3, MCF7, SK-BR-3, BxPC-3, Capan-1 y<s>K-OV-3 (no se muestran). En ambos ensayos, hRS7, rRap y la combinación de hRS7 y rRap mostraron poca o ninguna toxicidad a 100 nM en todas las líneas celulares evaluadas. La AsPC-1 negativa para Trop-2 fue resistente a (Q)-hRS7 en ambos ensayos.
[0212]Internalización y ubicación subcelular La internalización de (Q)-hRS7 en células ME-180 se observó claramente (no se muestra). El patrón de distribución de (Q)-hRS7 intracelular en ME-180, detectado directamente por GAH conjugado con FITC o indirectamente por GAM conjugado con PE a través de IgG anti-Rap de ratón, parecía ser casi idéntico, lo que sugiere que (Q)-hRS7 permanece intacto después de la entrada en estas células (no se muestra).
[0213]Eficacia terapéutica en ratones portadores de tumores Como se muestra en laFIG. 6A,cualquiera de los tratamientos (dosis única, 50 |jg o dos dosis de 25 |jg administradas con 5 días de diferencia) con (Q)-hRS7 inhibió significativamente el crecimiento de los xenoinjertos de Calu-3 en comparación con controles no tratados(P<0,019), con el tiempo medio de supervivencia aumentado de 55 días a 96 días (P <0,01;FIG. 6B).
Discusión
[0214]El avance clínico de las RNasas dirigidas a anticuerpos de origen animal es relativamente moderada, con la mayoría desarrollada para tratar neoplasias malignas hematológicas y los componentes de dirección conferidos por algunas formas de scFv (Schirrmann et al., Exp Opin Biol Ther 2009;9: 79-95). Hasta la fecha, las RNasas animales dirigidas a anticuerpos no se han evaluado en pacientes con ningún cáncer.
[0215]Dos dificultades observadas en el desarrollo clínico de inmunotoxinas vegetales o microbianas son la toxicidad y la inmunogenicidad indeseables. La toxicidad tisular normal observada con estas inmunotoxinas incluye el síndrome de fuga vascular (VLS), el síndrome urémico hemolítico (HUS) y la hepatotoxicidad (Kreitman, BioDrugs 2009;23:1-13). El motivo estructural (x)D(y) identificado como responsable de la unión de la cadena A de ricina o IL-2 a las células endoteliales está ausente en la secuencia nativa de Rap(Q), y hRS7 no tiene reactividad cruzada con las células endoteliales humanas. Por lo tanto, consideramos la probabilidad de que (Q)-hRS7 provoque que VLS sea remoto. El gran tamaño de (Q)-hRS7 (~ 180 kDa), que plantea una preocupación potencial por una penetración menos rápida de los tumores (Yokota et al., Cancer Res 1992;52:3402-8), debería impedir su eliminación a través de los riñones y mitigar el riesgo de SUH. En cuanto a la hepatotoxicidad, observamos que BL22, una inmunotoxina anti-CD22 recombinante compuesta por el Fv estabilizado con disulfuro de RFB4 fusionado a PE38, e inmunotoxinas similares como LMB-2 (anti-Tac(Fv)-PE38), también tuvo un efecto MTD muy baja en ratones debido a toxicidad hepática inespecífica; sin embargo, se ha informado que BL22 es seguro y eficaz en ensayos clínicos de pacientes con leucemia de células peludas (Kreitman et al., N Engl J Med 2001;345:241-7). Por lo tanto, la hepatotoxicidad limitante de la dosis que se observa comúnmente en ratones puede manifestarse raramente en humanos (Kreitman, BioDrugs 2009;23:1-13).
[0216]La mayoría de las inmunotoxinas genéticamente modificadas que se han evaluado en pacientes con cáncer indujeron una fuerte respuesta inmune humoral, que acorta la vida media en suero y previene una administración adicional. Se espera que (Q)-hRS7 sea menos inmunogénico, porque comprende la fusión de un anticuerpo humanizado con una toxina (Rap) que parece inducir poca respuesta de anticuerpos en los pacientes (Mikulski et al., J Clin Oncol 2002;20 :274-81).
[0217]Aunque se encontró que la potenciain vitrode (Q)-hRS7 varía entre líneas celulares que expresan Trop-2 cuando se mide mediante el ensayo MTS de 3 días, la citotoxicidad de (Q)-hRS7 se demostró inequívocamente a 10 nM para todas las líneas celulares utilizando el ensayo de formación de colonias de 14 días. Además de su potente citotoxicidad contra diversas líneas celulares cancerosas in vitro, (Q)-hRS7 demostró ser eficaz para inhibir el crecimiento de xenoinjertos de cáncer de pulmón humano Calu-3 en ratones desnudos, validando así la actividad antitumoral y la estabilidad de (Q)-hRS7 in vivo y confirmando la idoneidad de agregar Trop-2 a la lista actual de antígenos en cánceres sólidos atacados por inmunotoxinas (Kreitman, AAPS J 2006;8:E532-51; Pastan et al., Nat Rev Cancer 2006; Pastan et al., Ann Rev Med 2007;58:221-37; Schirrmann et al., Exp Opin Biol Ther 2009;9:79-95).
[0218]En conclusión, hemos demostrado que una ARNasa de anfibio fusionada de forma recombinante con un anticuerpo antiTrop-2 humanizado muestra una citotoxicidad selectiva y potente contra una variedad de cánceres epiteliales, tanto in vitro como in vivo.
Ejemplo 9. Alta potencia de una construcción DNL IgG Rap-anti-Trop-2 contra carcinomas
[0219]Usando las técnicas de DNL descritas en los ejemplos anteriores, se produjo una construcción E1-Rap DNL, que comprende hRS7-IgG-Ad2 (anti-Trop-2) unido a cuatro copias de Rap-DDD2 y mostró propiedades inhibidoras del crecimiento potentein vitrocontra una variedad de líneas celulares de carcinoma (no mostradas). En las líneas tumorales de mama (MDA-MB-468), cervical (ME-180) y páncreas (BxPC-3 y Capan-1), todas las cuales expresan altos niveles de Trop-2, E1-Rap fue muy potente, mostrando CE50 en el rango subnanomolar (5 a 890 pM), que fue de 1000 a 100,00 veces mayor que el Rap no dirigido o la combinación de Rap y hRS7. En líneas celulares que expresan niveles moderados de Trop-2, como las tres líneas de cáncer de próstata (PC-3, DU 145 y LNCaP), E1-Rap fue menos potente, pero aún mostró CE50 en el rango nanomolar (1 a 890 nM). Los datos de unión celular obtenidos para estas líneas celulares sólidas de cáncer sugieren que la sensibilidad de una línea celular a E1-Rap parece correlacionarse con su expresión de Trop-2 en la superficie celular. No se observó toxicidad para E1-Rap en la línea de cáncer de próstata, 22Rv1, que no se une a hRS7. Estos resultados muestran la eficacia de E1-Rap como un nuevo tratamiento para los tumores sólidos Trop-2 positivos, incluidos los carcinomas de mama, colon, estómago, pulmón, ovario, endometrio, cuello uterino, páncreas y próstata.
Ejemplo 10. La combinación de radiación dirigida a anticuerpos (radioinmunoterapia) y conjugados de anticuerpo-SN-38 (ADC) mejora la terapia contra el cáncer de páncreas
[0220]Anteriormente informamos sobre una actividad antitumoral eficaz en ratones desnudos que portaban tumores pancreáticos humanos con IgG PAM4 humanizada 90Y (hPAM4; 90Y-clivatuzumab tetraxetan) que se mejoró cuando se combinó con gemcitabina (GEM) (Gold et al., Int J. Cancer 109:618-26, 2004; Clin Cancer Res 9:3929S-37S, 2003). Estos estudios condujeron a pruebas clínicas de IgG 90Y-hPAM4 fraccionada combinada con GEM que muestran respuestas objetivas alentadoras. Si bien GEM es conocido por su capacidad radiosensibilizante, por sí solo no es un agente terapéutico muy eficaz para el cáncer de páncreas y su dosis está limitada por la toxicidad hematológica, que también es limitante para la IgG 90Y-hPAM4.
[0221]Hemos observado una actividad antitumoral prometedora con un ADC compuesto de hRS7 IgG (glicoproteína-1 antiepitelial humanizado; EGP-1) y SN-38, el componente activo del irinotecán. Este ADC es muy bien tolerado en ratones (p. ej., > 60 mg), aunque solo 4,0 mg (0,5 mg, dos veces por semana x 4) es significativamente terapéutico. EGP-1 (Trop2) también se expresa en la mayoría de los cánceres de páncreas.
[0222]El presente estudio examinó combinaciones de IgG 90Y-hPAM4 con RS7-SN-38 en ratones desnudos portadores de xenoinjertos subcutáneos de 0,35 cm3 de la línea celular de cáncer de páncreas humano, Capan-1. Los ratones (n=10) fueron tratados con una dosis única de 90Y-hPAM4 IgG sola (130<j>C¡, es decir, la dosis máxima tolerada (MTD) o 75|jC¡), con RS7-SN-38 solo (como arriba) o combinaciones de los 2 agentes en los dos niveles de dosis de 90Y-hPAM4, y la primera inyección de ADC se administró el mismo día que la de 90Y-hPAM4. Todos los tratamientos fueron tolerados, con < 15% de pérdida de peso corporal. Se produjeron respuestas objetivas en la mayoría de los animales, pero fueron más sólidas en ambos grupos de combinación en comparación con cada agente administrado solo. Todos los animales del grupo 0,13 mCi 90Y-hPAM4 IgG hRS7-SN-38 alcanzaron un estado libre de tumor en 4 semanas, mientras que otros animales continuaron teniendo evidencia de enfermedad persistente. Estos estudios proporcionan la primera evidencia de que la radioinmunoterapia combinada y el ADC mejoran la eficacia en dosis seguras.
[0223]En los ensayos clínicos de PAM4 en curso, se realiza un ciclo de tratamiento clínico de cuatro semanas. En la semana 1, a los sujetos se les administra una dosis de 111In-hPAM4, seguida al menos 2 días después de una dosis de gemcitabina. En las semanas 2, 3 y 4, a los sujetos se les administra una dosis de 90Y-hPAM4, seguida al menos 2 días después de gemcitabina (200 mg/m2). La escalada comenzó a 3 x 6,5 mCi/m2. La dosis máxima tolerada en pacientes con cáncer de páncreas de primera línea fue de 3 x 15 mCi/m2 (la toxicidad hematológica limita la dosis). De 22 pacientes evaluables por TC, la tasa de control de la enfermedad (CR+PR+SD) fue del 68 %, con 5 (23 %) respuestas parciales y 10 (45 %) tuvieron la estabilización como mejor respuesta según los criterios RECIST.
Preparación del conjugado anticuerpo-fármaco (ADC)
[0224]Se preparó el anticuerpo hRS7 conjugado con SN-38 como se muestra en laFIG. 7y según protocolos descritos previamente (Moon et al. J Med Chem 2008, 51:6916-6926; Govindan et al., Clin Cancer Res 2009. 15:6052-6061). Se preparó un derivado bifuncional reactivo de SN-38 (CL2A-SN-38,FIG. 7A)como se describe en la publicación de solicitud de patente de EE.UU. N° 20200204589. La fórmula de CL2A-SN-38 es (maleimido-[x]-Lys-PABOCO-20-0-SN-38, donde PAB es p-aminobencilo y 'x' contiene un PEG corto). El esquema sintético para la producción de CL2A-SN-38 se ilustra con más detalle en laFIG. 7B.Después de la reducción de los enlaces disulfuro en el anticuerpo con TCEP, el CL2A-SN-38 se hace reaccionar con el anticuerpo reducido para generar el RS7 conjugado con SN-38(FIG. 7C).
[0225]Se prepara 90Y-hPAM4 como se describió previamente (Gold et al., Clin Cancer Res 2003, 9:3929S-37S; Gold et al., Int J Cancer 2004, 109:618-26).
Combinación RAIT ADC
[0226]Los conjugados hRS7-SN-38 se están examinando en diversos modelos de xenoinjerto de cáncer humanoratón. Los ensayos clínicos iniciales con 90Y-hPAM4 IgG más cantidades radiosensibilizantes de GEM son alentadores, con evidencia de reducción del tumor o enfermedad estable. Sin embargo, la terapia del cáncer de páncreas es un gran desafío. Por lo tanto, se examinó una terapia combinada para determinar si respondería. Específicamente, la administración de hRS7-SN-38 en dosis efectivas, pero no tóxicas se combinó con RAIT con 90Y-hPAM4 IgG.
[0227]Los resultados mostrados en laFIG. 8demuestran que la combinación de hRS7-SN-38 con 90Y-hPAM4 fue más efectiva que cualquiera de los tratamientos solos o la suma de los tratamientos individuales. Con una dosis de 75 |jC¡ de 90Y-hPAM4, solo 1 de 10 ratones quedó libre de tumores después de 20 semanas de terapia, lo mismo que se observó con hRS7-SN-38 solo. Sin embargo, la combinación de hRS7-SN-38 con 90Y-hPAM4 dio como resultado que 4 de 10 ratones estuvieran libres de tumores después de 20 semanas, y los sujetos restantes mostraron una disminución sustancial en el volumen del tumor en comparación con cualquiera de los tratamientos solos. A 130 jC i 90Y-hPAM4 la diferencia fue aún más sorprendente, con 9 de 10 animales libres de tumores en el grupo de terapia combinada en comparación con 5 de 10 en el grupo de RAIT solo. Estos datos demuestran el efecto sinérgico de la combinación de hRS7-SN-38 con 90Y-hPAM4. RAIT ADC mejoró significativamente el tiempo hasta la progresión y aumentó la frecuencia del tratamiento libre de tumores.
[0228] FIG. 9muestra que la combinación de ADC con hRS7-SN-38 añadido al MTD de RAIT con 90Y-hPAM4 tuvo una toxicidad adicional mínima, indicada por el % de pérdida de peso del animal en respuesta al tratamiento.
[0229]El efecto de diferentes tratamientos secuenciales sobre la supervivencia del tumor se ilustra en laFIG. 10.
Los resultados indican que el efecto óptimo se obtiene cuando se administra primero RAIT, seguido de ADC. Por el contrario, cuando se administra primero ADC seguido de RAIT, hay una disminución en la incidencia de animales libres de tumores. Ni los anticuerpos hPAM4 ni hRS7 no conjugados tuvieron actividad antitumoral cuando se administraron solos.
[0230]Se realizaron experimentos en los que tanto el radionúclido como el fármaco (SN-38) se conjugaron con el mismo anticuerpo (PAM4).FIG. 11muestra que una dosis de 0,5 mg de hPAM4-SN-38, administrada dos veces por semana durante 8 semanas, fue relativamente eficaz para inhibir el crecimiento tumoral. Sin embargo, la adición de 90Y-hPAM4 el mismo día o antes del ADC mejoró la incidencia de animales libres de tumores a las 12 semanas. Estos resultados muestran que los tratamientos RAIT y ADC dirigidos al mismo antígeno se puede administrar juntos. Aunque hPAM4 IgG no se internaliza, el conjugado hPAM4-SN-38 controló el crecimiento tumoral durante más tiempo que hRS7-SN-38 en este sistema modelo (que expresa altos niveles de antígeno PAM4).
Ejemplo 11. Eficacia de conjugados SN-38 de diferentes anticuerpos
[0231]Se conjugó CL2A-SN-38 con anticuerpos humanizados, hRS7 (anti-EGP-1), hPAM4 (anti-mucina), hMN-14 (anti-CEACAM5), hLL2 (anti-CD22) y hA20 (anti-CD20). Los conjugados, con una sustitución media de SN-38/MAb (MSR) de ~6, se evaluaron en los xenoinjertos de tumor pancreático humano Capan-1 y BxPC-3 y en el xenoinjerto de linfoma humano de Ramos cultivado s.c. en ratones desnudos atímicos hembra. Cuando los tamaños iniciales de los tumores en animales alcanzaron de 0,2 a 0,3 cm3, se administraron conjugados de control específicos y no dirigidos por vía intraperitoneal en un programa de x 4 semanas dos veces por semana utilizando 25 mg/kg, 12,5 mg/kg o 5 mg/kg de dosis de proteína.
[0232]Todos los conjugados de anticuerpo SN-38 mostraron eficacia cuando se examinaron en una línea celular cancerosa diana apropiada (datos no mostrados). El conjugado hMN-14-SN-38 mostró eficacia contra el xenoinjerto de carcinoma de colon humano LS 174T en ratones desnudos (no mostrado). Los conjugados hA20-SN-38 y hLL2 mostraron eficacia contra xenoinjertos de linfoma humano de Ramos en ratones desnudos (no mostrado). Los conjugados hRS7-SN-38 y hPAM4-SN-38 mostraron eficacia contra xenoinjertos de cáncer de páncreas humano Capan-1 en ratones desnudos (no mostrado).
[0233]Se realizó una comparación de la eficacia de los conjugados SN-38 de hRS7, hPAM4, hMN14 y los anticuerpos hA20 de control contra xenoinjertos de cáncer de páncreas humano Capan-1 en ratones desnudos. Como se muestra en la FIG. 12, los conjugados hRS7 y hPAM4 de SN-38 mostraron la mayor eficacia contra una línea celular de cáncer de páncreas humano.

Claims (8)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un anticuerpo anti-Trop-2 RS7 humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo conjugado con un agente citotóxico, para usar en un método para tratar el cáncer de páncreas que comprende: a) administrar a un sujeto con cáncer de páncreas el anticuerpo anti-Trop-2 o fragmento de unión a antígeno del mismo conjugado con un agente citotóxico, en el que el anticuerpo anti-Trop-2 o fragmento del mismo comprende las secuencias CDR de cadena ligera CDR1 (KASQDVSIAVA, SEQ<i>D NO:7); CDR2 (SASYRYT, SEQ ID NO:8); y CDR3 (QQHYITPLT, SEQ ID NO:9) y las secuencias de CDR de cadena pesada CDR1 (NYGMN, SEQ ID NO:10); CDR2 (WINTYTGEPTYTDDFKG, SEQ ID NO.11) y CDR3 (GGFGSSYWYFDV, SEQ ID NO:12), en donde el agente citotóxico es SN-38 conjugado con el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno mediante el enlazador CL2A, en donde la estructura del inmunoconjugado es MAb-CL2A-SN-38
    y b) administrar a dicho sujeto un anticuerpo mucina anticáncer pancreático PAM4 o un fragmento de unión a antígeno del mismo conjugado con un radionúclido, en el que el anticuerpo mucina anticáncer pancreático o un fragmento del mismo comprende las secuencias de región determinante de la complementariedad de la luz (CDR) CDR1 (SASSSVSSSYLY, SEQ ID NO:1); CDR2 (STSNLAS, SEQ ID NO:2); y CDR3 (HQWNRYPYT, SEQ ID NO:3); y las secuencias CDR de cadena pesada CDR1 (SYVLH, SEQ ID NO:4); CDR2 (YINPYNDGTQYNEKFKG, SEQ ID NO:5) y CDR3 (GFGGSYGFAY, SEQ ID NO:6), y en donde el radionucleido es 90Y.
  2. 2. Un anticuerpo mucina anti-cáncer de páncreas PAM4 o un fragmento de unión a antígeno del mismo conjugado con un radionúclido, para usar en un método para tratar el cáncer de páncreas que comprende: a) administrar a un sujeto con cáncer de páncreas un anticuerpo RS7 anti-Trop-2 humanizado o fragmento de unión a antígeno del mismo conjugado con un agente citotóxico, en el que el anticuerpo anti-Trop-2 o fragmento del mismo comprende las secuencias CDR de cadena ligera CDR1 (KASQDVSIAVA, SEQ ID NO:7); CDR2 (SASYRYT, SEQ ID NO:8); y CDR3 (QQHYITPLT, SEQ ID NO:9) y las secuencias de CDR de cadena pesada CDR1 (NYGMN, SEQ ID NO:10); CDR2 (WINTYTGEPTYTDDFKG, SEQ ID NO. 11) y CDR3 (GGFGSSYWYFDV, SEQ ID NO:12), en donde el agente citotóxico es SN-38 conjugado con el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno mediante el enlazador CL2A, en donde la estructura del inmunoconjugado es MAb-CL2A-SN-38
    y b) administrar a dicho sujeto el anticuerpo de mucina contra el cáncer de páncreas o su fragmento de unión a antígeno conjugado con un radionúclido, en el que el anticuerpo de mucina contra el cáncer de páncreas o su fragmento comprende las secuencias de región determinante de la complementariedad de la luz (CDR) CDR1 (SASSSVSSSYLY, SEQ ID NO:1); CDR2 (STSNLAS, SEQ ID NO:2); y CDR3 (HQWNRYPYT, SEQ ID NO:3); y las secuencias CDR de cadena pesada CDR1 (Sy Vl H, SEQ ID NO:4); CDR2 (YINPYNDGTQYNEKFKG, SEQ ID NO:5) y CDR3 (GFGGSYGFAY, SEQ ID NO:6), y en donde el radionucleido es 90Y.
  3. 3. Una composición farmacéutica que comprende a) un anticuerpo RS7 anti-Trop-2 humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo conjugado con un agente citotóxico, en donde el anticuerpo anti-Trop-2 o un fragmento del mismo comprende las secuencias CDR de cadena ligera CDR1 (KASQDVSIAVA, SEQ ID NO:7); CDR2 (SASYRYT, SEQ ID NO:8); y CDR3 (QQHYITPLT, SEQ ID NO:9) y las secuencias de CDR de cadena pesada CDR1 (NYGMN, SEQ ID NO:10); CDR2 (WINTYTGEPTYTDDFKG, SEQ ID NO. 11) y CDR3 (GGFGSSYWYFDV, SEQ ID NO:12), en donde el agente citotóxico es SN-38 conjugado con el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno mediante el enlazador CL2A, en donde la estructura del inmunoconjugado es MAbCL2A-SN-38
    y b) un anticuerpo de mucina contra el cáncer de páncreas PAM4 o un fragmento de unión a antígeno del mismo conjugado con un radionúclido, en el que el anticuerpo de mucina contra el cáncer de páncreas o un fragmento del mismo comprende las secuencias de la región determinante de la complementariedad ligera (CDR) CDR1 (SASSSVSSSYLY, SEQ ID NO: 1); CDR2 (STSNLAS, SEQ ID NO: 2); y CDR3 (HQWNRYPYT, SEQ ID NO: 3); y las secuencias CDR de cadena pesada CDR1 (SYVLH, SEQ ID NO: 4); CDR2 (YINPYNDGTQYNEKFKG, SEQ ID NO: 5) y CDR3 (GFGGSYGFAY, SEQ ID NO: 6), y en donde el radionúclido es 90Y, y en donde la composición farmacéutica es para uso en un método para tratar el cáncer de páncreas.
  4. 4. El anticuerpo para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 y la composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 3, en el que el anticuerpo anti-Trop-2 o fragmento del mismo y el anticuerpo mucina anti-cáncer de páncreas o fragmento del mismo se administran secuencialmente o al mismo tiempo.
  5. 5. El anticuerpo para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 y la composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 3, en el que el anticuerpo anti-Trop-2 o fragmento del mismo y el anticuerpo o fragmento de mucina anti-cáncer de páncreas de los mismos están conjugados entre sí.
  6. 6. El anticuerpo para su uso según la reivindicación 5 y la composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 5, en el que el anticuerpo anti-Trop-2 o fragmento del mismo y el anticuerpo mucina anticáncer de páncreas o fragmento del mismo se conjugan entre sí mediante la técnica de dock-and-lock (DNL).
  7. 7. El anticuerpo para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 y la composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 3, en el que el anticuerpo mucina anticáncer pancreático o fragmento del mismo es un anticuerpo quimérico, humanizado o humano o fragmento del mismo.
  8. 8. El anticuerpo para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 y la composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 3, en el que el anticuerpo mucina anticáncer de páncreas se une al 80% o más del adenocarcinoma de páncreas invasivo humano, neoplasia mucinosa papilar intraductal, PanIN-IA, PanIN-1 B y PanIN-2, y no se une al tejido pancreático humano normal.
ES10835036T 2009-12-02 2010-12-01 Combinación de radio inmunoterapia y conjugados anticuerpo-fármaco para mejorar la terapia contra el cáncer Active ES2978177T3 (es)

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Families Citing this family (57)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2924398A1 (en) * 2013-11-05 2015-05-14 Immunomedics, Inc. Humanized anti-ceacam5 antibody and uses thereof
PT3088419T (pt) * 2013-12-25 2019-01-11 Daiichi Sankyo Co Ltd Conjugado de anticorpo anti-trop2-fármaco
HRP20190431T1 (hr) 2014-01-31 2019-04-19 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-her2 antitijelo-lijek konjugat
ES2754348T3 (es) 2014-04-10 2020-04-17 Daiichi Sankyo Co Ltd Conjugado de (anticuerpo anti-HER2)-fármaco
CN111228511B (zh) 2014-04-10 2024-06-18 第一三共株式会社 抗her3抗体-药物偶联物
CN116059395A (zh) 2015-06-29 2023-05-05 第一三共株式会社 用于选择性制造抗体-药物缀合物的方法
EP3552626A4 (en) 2016-12-12 2020-06-10 Daiichi Sankyo Company, Limited ASSOCIATION OF AN ANTIBODY DRUG CONJUGATE AND AN IMMUNE CONTROL POINT INHIBITOR
EP3572428A4 (en) 2017-01-17 2020-12-30 Daiichi Sankyo Company, Limited ANTI-BODY ANTI-GPR20 AND ANTI-BODY-DRUG CONJUGATE ANTI-GPR20
TWI855528B (zh) 2017-05-15 2024-09-11 日商第一三共股份有限公司 抗體-藥物結合物之製造方法
KR20250084239A (ko) 2017-08-31 2025-06-10 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항체-약물 콘주게이트의 개량 제조 방법
JP7248578B2 (ja) 2017-08-31 2023-03-29 第一三共株式会社 抗体－薬物コンジュゲートの新規製造方法
CN111542324B (zh) * 2018-02-11 2023-09-12 四川科伦博泰生物医药股份有限公司 细胞毒性剂及其偶联物、其制备方法及用途
HRP20240756T1 (hr) 2018-05-18 2024-09-13 Daiichi Sankyo Co., Ltd. Anti-muc1-eksatekan antitijelo-lijek konjugat
TWI846717B (zh) 2018-07-27 2024-07-01 日商第一三共股份有限公司 辨識抗體-藥物結合物之藥物部位的蛋白質
EP3831412A4 (en) 2018-07-31 2022-04-27 Daiichi Sankyo Company, Limited TREATMENT OF METASTATIC BRAIN TUMOR BY ADMINISTRATION OF AN ANTIBODY-DRUG CONJUGATE
EP3842546A4 (en) 2018-08-23 2022-06-29 Daiichi Sankyo Company, Limited Sensitivity marker for antibody-drug conjugate
US20220088231A1 (en) * 2018-12-03 2022-03-24 Fusion Pharmaceuticals Inc. Radioimmunoconjugates and dna damage and repair inhibitor combination therapy
IL288485B2 (en) 2019-05-29 2026-04-01 Daiichi Sankyo Co Ltd Anti-TROP2 antibody conjugates - a drug for use in cancer treatment
CA3176626A1 (en) 2020-05-08 2021-11-11 David Dornan Elastase-substrate, peptide linker immunoconjugates, and uses thereof
CN116234586A (zh) 2020-08-13 2023-06-06 博尔特生物治疗药物有限公司 吡唑并氮呯免疫缀合物及其用途
TW202304520A (zh) 2021-03-26 2023-02-01 美商博特生物治療公司 ２－胺基－４－羧醯胺－苯并氮呯免疫結合物及其用途
CN117940168A (zh) 2021-03-26 2024-04-26 博尔特生物治疗药物有限公司 2-氨基-4-甲酰胺-苯并氮杂䓬免疫缀合物及其用途
JP7673255B2 (ja) 2021-06-11 2025-05-08 ギリアード サイエンシーズ， インコーポレイテッド Ｍｃｌ－１阻害剤と抗体薬物コンジュゲートとの組み合わせ
TWI910028B (zh) 2021-06-11 2025-12-21 美商基利科學股份有限公司 Mcl-1抑制劑與抗癌劑之組合
AU2022375782B2 (en) 2021-10-28 2026-02-26 Gilead Sciences, Inc. Pyridizin-3(2h)-one derivatives
AU2022376954B2 (en) 2021-10-29 2026-04-23 Gilead Sciences, Inc. Cd73 compounds
CN118475372A (zh) 2021-10-29 2024-08-09 博尔特生物治疗药物有限公司 具有半胱氨酸突变抗体的tlr激动剂免疫缀合物及其用途
KR20240113514A (ko) 2021-11-30 2024-07-22 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 프로테아제 분해성 마스크 항체
AU2022419982B2 (en) 2021-12-22 2026-04-16 Gilead Sciences, Inc. Ikaros zinc finger family degraders and uses thereof
CA3237577A1 (en) 2021-12-22 2023-06-29 Gilead Sciences, Inc. Ikaros zinc finger family degraders and uses thereof
CN114432442A (zh) * 2022-01-24 2022-05-06 山东大学第二医院 表柔比星作为125i的增敏剂
TW202340168A (zh) 2022-01-28 2023-10-16 美商基利科學股份有限公司 Ｐａｒｐ７抑制劑
KR20240141757A (ko) 2022-02-09 2024-09-27 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 환경 응답성 마스킹 항체 및 그 이용
EP4493554A1 (en) 2022-03-17 2025-01-22 Gilead Sciences, Inc. Ikaros zinc finger family degraders and uses thereof
KR20250004779A (ko) 2022-04-13 2025-01-08 길리애드 사이언시즈, 인코포레이티드 Trop-2 발현 암을 치료하기 위한 병용 요법
EP4508083A1 (en) 2022-04-13 2025-02-19 Gilead Sciences, Inc. Combination therapy for treating tumor antigen expressing cancers
CR20240451A (es) 2022-04-21 2024-12-04 Gilead Sciences Inc Compuestos de modulación de kras g12d
PE20250758A1 (es) 2022-07-01 2025-03-13 Gilead Sciences Inc Compuestos de cd73
WO2024097812A1 (en) 2022-11-04 2024-05-10 Gilead Sciences, Inc. Therapy for treating bladder cancer
CN120225509A (zh) 2022-12-22 2025-06-27 吉利德科学公司 Prmt5抑制剂及其用途
EP4637833A2 (en) 2022-12-23 2025-10-29 Genentech, Inc. Cereblon degrader conjugates, and uses thereof
EP4653017A1 (en) 2023-01-18 2025-11-26 Tyligand Bioscience (Shanghai) Limited Antibody-drug conjugate and use thereof
CN120981252A (zh) 2023-02-14 2025-11-18 博尔特生物治疗药物有限公司 氮杂-苯并氮杂䓬免疫缀合物及其用途
WO2024186626A1 (en) 2023-03-03 2024-09-12 Bolt Biotherapeutics, Inc. Aza-bicyclic sting agonist immunoconjugates, and uses thereof
AU2024252725A1 (en) 2023-04-11 2025-11-06 Gilead Sciences, Inc. Kras modulating compounds
PE20260121A1 (es) 2023-04-21 2026-01-16 Gilead Sciences Inc Inhibidores de prmt5 y usos de los mismos
AU2024306338A1 (en) 2023-06-30 2026-01-08 Gilead Sciences, Inc. Kras modulating compounds
KR20260046403A (ko) 2023-07-26 2026-04-07 길리애드 사이언시즈, 인코포레이티드 Parp7 저해제
WO2025024811A1 (en) 2023-07-26 2025-01-30 Gilead Sciences, Inc. Parp7 inhibitors
US20250101042A1 (en) 2023-09-08 2025-03-27 Gilead Sciences, Inc. Kras g12d modulating compounds
AU2024337913A1 (en) 2023-09-08 2026-03-26 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine-containing polycyclic derivatives as kras g12d modulating compounds
US20250154172A1 (en) 2023-11-03 2025-05-15 Gilead Sciences, Inc. Prmt5 inhibitors and uses thereof
WO2025137640A1 (en) 2023-12-22 2025-06-26 Gilead Sciences, Inc. Azaspiro wrn inhibitors
WO2025245003A1 (en) 2024-05-21 2025-11-27 Gilead Sciences, Inc. Prmt5 inhibitors and uses thereof
WO2026039365A1 (en) 2024-08-12 2026-02-19 Gilead Sciences, Inc. Kras modulating compounds
WO2026055185A1 (en) 2024-09-04 2026-03-12 Bolt Biotherapeutics, Inc. Sting agonist immunoconjugates and uses thereof
WO2026089992A1 (en) 2024-10-21 2026-04-30 Gilead Sciences, Inc. Prmt5 inhibitors and uses thereof

Family Cites Families (200)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2681108A (en) 1950-12-12 1954-06-15 Us Rubber Co Trimming method and apparatus
US4036945A (en) 1976-05-03 1977-07-19 The Massachusetts General Hospital Composition and method for determining the size and location of myocardial infarcts
US4150149A (en) 1976-11-29 1979-04-17 Professional Staff Association Of The Los Angeles County Harbor General Hospital Method and means for the early detection and diagnosis of certain types of cancers
US4361544A (en) 1980-03-03 1982-11-30 Goldenberg Milton David Tumor localization and therapy with labeled antibodies specific to intracellular tumor-associated markers
US4331647A (en) 1980-03-03 1982-05-25 Goldenberg Milton David Tumor localization and therapy with labeled antibody fragments specific to tumor-associated markers
US4444744A (en) 1980-03-03 1984-04-24 Goldenberg Milton David Tumor localization and therapy with labeled antibodies to cell surface antigens
DE3008260A1 (de) 1980-03-04 1981-09-17 Siemens AG, 1000 Berlin und 8000 München Verfahren zum aufzeichnen von stroemungsgrenzschichten in fluessigen medien
US4624846A (en) 1983-07-29 1986-11-25 Immunomedics, Inc. Method for enhancing target specificity of antibody localization and clearance of non-target diagnostic and therapeutic principles
US4824659A (en) 1985-06-07 1989-04-25 Immunomedics, Inc. Antibody conjugates
US5776093A (en) 1985-07-05 1998-07-07 Immunomedics, Inc. Method for imaging and treating organs and tissues
US5525338A (en) 1992-08-21 1996-06-11 Immunomedics, Inc. Detection and therapy of lesions with biotin/avidin conjugates
US5057313A (en) 1986-02-25 1991-10-15 The Center For Molecular Medicine And Immunology Diagnostic and therapeutic antibody conjugates
US6861511B1 (en) 1986-06-04 2005-03-01 Bayer Corporation Detection and quantification of neu related proteins in the biological fluids of humans
US4863713A (en) 1986-06-23 1989-09-05 The Board Of Trustees Of Leland Stanford Jr. Univ. Method and system for administering therapeutic and diagnostic agents
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4704692A (en) 1986-09-02 1987-11-03 Ladner Robert C Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
US5567610A (en) 1986-09-04 1996-10-22 Bioinvent International Ab Method of producing human monoclonal antibodies and kit therefor
FR2604092B1 (fr) 1986-09-19 1990-04-13 Immunotech Sa Immunoreactifs destines a cibler les cellules animales pour leur visualisation ou leur destruction in vivo
US6893625B1 (en) 1986-10-27 2005-05-17 Royalty Pharma Finance Trust Chimeric antibody with specificity to human B cell surface antigen
US5019368A (en) 1989-02-23 1991-05-28 Cancer Biologics, Inc. Detection of necrotic malignant tissue and associated therapy
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
US6511665B1 (en) 1987-11-25 2003-01-28 Immunex Corporation Antibodies to interleukin-1 receptors
US4867962A (en) * 1988-02-26 1989-09-19 Neorx Corporation Functionally specific antibodies
US6362325B1 (en) 1988-11-07 2002-03-26 Advanced Research And Technology Institute, Inc. Murine 4-1BB gene
US6352694B1 (en) 1994-06-03 2002-03-05 Genetics Institute, Inc. Methods for inducing a population of T cells to proliferate using agents which recognize TCR/CD3 and ligands which stimulate an accessory molecule on the surface of the T cells
US5571714A (en) 1988-12-22 1996-11-05 Celtrix Pharmaceuticals, Inc. Monoclonal antibodies which bind both transforming growth factors β1 and β2 and methods of use
US6432402B1 (en) 1989-05-25 2002-08-13 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Anti-idiotypic antibody which induces an immune response against a glycosphingolipid and use thereof
ES2095876T3 (es) 1989-06-02 1997-03-01 Univ Johns Hopkins Med Anticuerpos monoclonales contra la cadena beta de receptores de adhesion de leucocitos; procedimiento de produccion de estos anticuerpos y utilizacion
US7041293B1 (en) 1990-04-03 2006-05-09 Genentech, Inc. HIV env antibodies
US5229275A (en) 1990-04-26 1993-07-20 Akzo N.V. In-vitro method for producing antigen-specific human monoclonal antibodies
US6764681B2 (en) 1991-10-07 2004-07-20 Biogen, Inc. Method of prophylaxis or treatment of antigen presenting cell driven skin conditions using inhibitors of the CD2/LFA-3 interaction
US5854416A (en) 1991-11-14 1998-12-29 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Streptococcus pneumoniae 37-KDA surface adhesin a protein and nucleic acids coding therefor
US5474771A (en) 1991-11-15 1995-12-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Murine monoclonal antibody (5c8) recognizes a human glycoprotein on the surface of T-lymphocytes, compositions containing same
EP0672253A4 (en) 1992-01-29 1995-12-06 Sci Clone Inc ANTIGEN (SK1) ASSOCIATED WITH CARCINOMA AND MONOCLONAL ANTIBODIES DIRECTED AGAINST SK1, PROCESSES FOR THE PRODUCTION THEREOF AND APPLICATIONS.
DE69333348T2 (de) 1992-03-09 2004-09-16 San Diego Regional Cancer Center, San Diego Anti-idiotypischer Antikörper und seine Verwendung zur Diagnose und Therapie bei HIV-bezogenen Krankheiten
US6129914A (en) 1992-03-27 2000-10-10 Protein Design Labs, Inc. Bispecific antibody effective to treat B-cell lymphoma and cell line
DE69322860T2 (de) 1992-04-03 1999-07-01 Genentech, Inc., South San Francisco, Calif. Antikörper gegen alpha v beta 3 integrin
ATE194916T1 (de) 1992-05-06 2000-08-15 Immunomedics Inc Intraoperative, intravaskulare und endoskopische bestimmung und behandlung von verletzungen und tumoren
US6096289A (en) 1992-05-06 2000-08-01 Immunomedics, Inc. Intraoperative, intravascular, and endoscopic tumor and lesion detection, biopsy and therapy
AU4231393A (en) 1992-05-08 1993-12-13 Genentech Inc. Antibodies to leukemia inhibitory factor
US5686072A (en) 1992-06-17 1997-11-11 Board Of Regents, The University Of Texas Epitope-specific monoclonal antibodies and immunotoxins and uses thereof
US5397703A (en) 1992-07-09 1995-03-14 Cetus Oncology Corporation Method for generation of antibodies to cell surface molecules
DE69303494T2 (de) 1992-11-13 1997-01-16 Idec Pharma Corp Therapeutische verwendung von chimerischen und markierten antikörper gegen menschlichen b lymphozyt beschränkter differenzierung antigen für die behandlung von b-zell-lymphoma
JPH08510250A (ja) 1993-05-17 1996-10-29 イムノメディクス，インコーポレイテッド ビオチンまたはアビジンと金属キレート化タンパク質との複合体による病変の検出および治療法の改善
ATE335072T1 (de) 1993-05-28 2006-08-15 Scripps Research Inst Methoden für inhibition der cd14-abhängigen zellaktivierung
US6084067A (en) 1993-07-26 2000-07-04 Dana-Farber Cancer Institute CTLA4/CD28 ligands and uses therefor
UA40577C2 (uk) 1993-08-02 2001-08-15 Мерк Патент Гмбх Біспецифічна молекула, що використовується для лізису пухлинних клітин, спосіб її одержання, моноклональне антитіло (варіанти), фармацевтичний препарат, фармацевтичний набір (варіанти), спосіб видалення пухлинних клітин
AU7831594A (en) 1993-09-09 1995-03-27 Duke University A method of promoting cellular function
WO1995014040A1 (en) 1993-11-19 1995-05-26 Baylor College Of Medicine Monoclonal antibodies specific for human interleukin-5
US5443953A (en) 1993-12-08 1995-08-22 Immunomedics, Inc. Preparation and use of immunoconjugates
US6432404B1 (en) 1993-12-23 2002-08-13 Icos Corporation Methods of inhibiting locomotor damage following spinal cord injury with α D-specific antibodies
US5922572A (en) 1994-01-25 1999-07-13 Human Genome Sciences, Inc. Polynucleotides encoding haemopoietic maturation factor
US6074642A (en) 1994-05-02 2000-06-13 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Use of antibodies specific to human complement component C5 for the treatment of glomerulonephritis
US6100389A (en) 1995-04-21 2000-08-08 Human Genome Sciences, Inc. Polynucleotides encoding a human chemotactic protein
US5798100A (en) 1994-07-06 1998-08-25 Immunomedics, Inc. Multi-stage cascade boosting vaccine
US6303769B1 (en) 1994-07-08 2001-10-16 Immunex Corporation Lerk-5 dna
AU3272695A (en) 1994-08-12 1996-03-07 Immunomedics Inc. Immunoconjugates and humanized antibodies specific for b-cell lymphoma and leukemia cells
US5587459A (en) 1994-08-19 1996-12-24 Regents Of The University Of Minnesota Immunoconjugates comprising tyrosine kinase inhibitors
US6174995B1 (en) 1994-08-23 2001-01-16 Haodong Li Human chemokines, CKβ4 and CKβ10/MCP-4
US6458349B1 (en) 1995-06-02 2002-10-01 Human Genome Sciences, Inc. Chemokine β-4 polypeptides
US6709653B1 (en) 1994-09-16 2004-03-23 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies specific for human inositol monophosphatase H1
US5874540A (en) 1994-10-05 1999-02-23 Immunomedics, Inc. CDR-grafted type III anti-CEA humanized mouse monoclonal antibodies
US5750370A (en) 1995-06-06 1998-05-12 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acid encoding human endothlein-bombesin receptor and method of producing the receptor
US6538121B1 (en) 1994-11-01 2003-03-25 Human Genome Sciences, Inc. Interleukin-1 β converting enzyme like apoptosis protease-3 and 4
US5677136A (en) 1994-11-14 1997-10-14 Systemix, Inc. Methods of obtaining compositions enriched for hematopoietic stem cells, compositions derived therefrom and methods of use thereof
US6521227B1 (en) 1999-11-18 2003-02-18 Peter L. Hudson Polynucleotides encoding prostatic growth factor and process for producing prostatic growth factor polypeptides
US6537764B1 (en) 1995-01-19 2003-03-25 Children's Medical Center Corporation Method of identifying inhibitors of C—C chemokine receptor 3
US5786204A (en) 1995-01-20 1998-07-28 Human Genome Sciences, Inc. Human prostatic specific reductase
US6312691B1 (en) 1996-01-26 2001-11-06 Jeffrey L. Browning Lymphotoxin-α/β complexes and anti-lympotoxin-β receptor antibodies as anti-tumor agents
US6949244B1 (en) 1995-12-20 2005-09-27 The Board Of Trustees Of The University Of Kentucky Murine monoclonal anti-idiotype antibody 11D10 and methods of use thereof
US5798554A (en) 1995-02-24 1998-08-25 Consorzio Per La Ricerca Sulla Microelettronica Nel Mezzogiorno MOS-technology power device integrated structure and manufacturing process thereof
US5783404A (en) 1995-04-13 1998-07-21 Amgen Inc. Methods and compositions for determining HER-2/neu expression using monoclonal antibodies
US5686292A (en) 1995-06-02 1997-11-11 Genentech, Inc. Hepatocyte growth factor receptor antagonist antibodies and uses thereof
US5773292A (en) 1995-06-05 1998-06-30 Cornell University Antibodies binding portions, and probes recognizing an antigen of prostate epithelial cells but not antigens circulating in the blood
US5773252A (en) 1995-06-05 1998-06-30 Human Genome Sciences, Inc. Fibroblast growth factor 15
US6605441B1 (en) 1995-06-05 2003-08-12 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies against fibroblast growth factor 11
AU6223296A (en) 1995-06-07 1996-12-30 Novartis Ag Methods for obtaining compositions enriched for hematopoieti c stem cells and antibodies for use therein
US6340459B1 (en) 1995-12-01 2002-01-22 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Therapeutic applications for the anti-T-BAM (CD40-L) monoclonal antibody 5C8 in the treatment of reperfusion injury in non-transplant recipients
US5783186A (en) 1995-12-05 1998-07-21 Amgen Inc. Antibody-induced apoptosis
US5945309A (en) 1996-03-19 1999-08-31 Human Genome Sciences, Inc. Cytostatin III nucleic acids encoding
ATE267610T1 (de) 1996-03-20 2004-06-15 Immunomedics Inc Glykosylierte igg antikörper
JP2000511403A (ja) 1996-03-20 2000-09-05 イムノメディクス，インコーポレイテッド 抗癌胎児抗原抗イディオタイプ抗体のヒト化と腫瘍ワクチンとしての使用及びターゲッティング用途のための使用
FR2746398B1 (fr) 1996-03-21 1998-04-30 Bio Merieux Anticorps specifique de staphylococcus aureaus, et utilisations
US6174992B1 (en) 1997-03-21 2001-01-16 Human Genome Sciences, Inc. Human endometrial specific steroid-binding factor I, II and III
US6962981B1 (en) 1996-03-25 2005-11-08 Medarex, Inc. Monoclonal antibodies specific for the extracellular domain of prostate-specific membrane antigen
US6004780A (en) 1996-03-26 1999-12-21 Human Genome Sciences, Inc. Growth factor HTTER36
US6110463A (en) 1996-03-29 2000-08-29 North Carolina State University Anti-Cryptosporidium parvum preparations
US6066617A (en) 1996-04-03 2000-05-23 Human Genome Sciences, Inc. Human cystatin F
US7011812B1 (en) 1996-05-03 2006-03-14 Immunomedics, Inc. Targeted combination immunotherapy of cancer and infectious diseases
ATE365562T1 (de) 1996-05-03 2007-07-15 Immunomedics Inc Zielgerichtete kombinations-immuntherapie für krebs
US6136311A (en) 1996-05-06 2000-10-24 Cornell Research Foundation, Inc. Treatment and diagnosis of cancer
US6107090A (en) 1996-05-06 2000-08-22 Cornell Research Foundation, Inc. Treatment and diagnosis of prostate cancer with antibodies to extracellur PSMA domains
WO1998010055A1 (en) 1996-09-03 1998-03-12 Kaneka Corporation Method for inducing immunosuppressive cells and culturing device to be used therefor
AU744637B2 (en) 1996-10-09 2002-02-28 Corporation Of The Trustees Of The Order Of The Sisters Of Mercy In Queensland, The Dendritic cell-specific antibodies
US6653104B2 (en) 1996-10-17 2003-11-25 Immunomedics, Inc. Immunotoxins, comprising an internalizing antibody, directed against malignant and normal cells
US6812327B1 (en) 1996-10-25 2004-11-02 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha polypeptides
US6528625B1 (en) 1996-10-28 2003-03-04 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Anti-CCR5 antibodies and kits comprising same
US6043348A (en) 1996-11-13 2000-03-28 Lawman; Michael J. P. Antibody recognizing a small subset of human hematopoietic cells
US6455040B1 (en) 1997-01-14 2002-09-24 Human Genome Sciences, Inc. Tumor necrosis factor receptor 5
WO1998031818A2 (en) 1997-01-21 1998-07-23 Human Genome Sciences, Inc. Tace-like and matrilysin-like polypeptides
US6605699B1 (en) 1997-01-21 2003-08-12 Human Genome Sciences, Inc. Galectin-11 polypeptides
EP1012274B2 (en) 1997-01-28 2011-06-15 Human Genome Sciences, Inc. Death domain containing receptor 4 (dr4: death receptor 4), member of the tnf-receptor superfamily and binding to trail (ap0-2l)
DE69840723D1 (de) 1997-02-11 2009-05-20 Immunomedics Inc Stimulation einer immunantwort durch antikörper, welche mit dem alpha-galaktosylepitop markiert sind
CA2282410A1 (en) 1997-03-03 1998-10-01 Bristol-Myers Squibb Company Monoclonal antibodies to human cd6
US6951924B2 (en) 1997-03-14 2005-10-04 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies against secreted protein HTEBYII
US6919433B2 (en) 1997-03-14 2005-07-19 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies to protein HPMBQ91
US6872568B1 (en) 1997-03-17 2005-03-29 Human Genome Sciences, Inc. Death domain containing receptor 5 antibodies
US6306393B1 (en) 1997-03-24 2001-10-23 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B-cell malignancies using anti-CD22 antibodies
US6183744B1 (en) 1997-03-24 2001-02-06 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B-cell malignancies using anti-CD22 antibodies
DE69831224T2 (de) 1997-05-02 2006-03-23 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Immuntoxine, die ein onc protein enthalten, gegen bösartige zellen
US6284474B1 (en) 1998-04-23 2001-09-04 The Regents Of The University Of California Detection and diagnosis of conditions associated with lung injury
US6372217B1 (en) 1997-06-03 2002-04-16 Regents Of The University Of Minnesota Methods for the treatment of CD7+ viral infection with TXU-7-PAP
US6545130B2 (en) 1997-06-04 2003-04-08 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Monoclonal antibodies to mycobacterium tuberculosis and a modified ELISA assay
US6358508B1 (en) 1997-06-11 2002-03-19 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies to human tumor necrosis factor receptor TR9
PT1015587E (pt) 1997-09-18 2008-07-31 Genentech Inc Polipéptido dcr3, um homólogo de tnfr
US6689607B2 (en) 1997-10-21 2004-02-10 Human Genome Sciences, Inc. Human tumor, necrosis factor receptor-like proteins TR11, TR11SV1 and TR11SV2
US6355244B1 (en) 1997-11-17 2002-03-12 University Of Kentucky Research Foundation Methods and compositions for the treatment of psoriasis
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
US6562618B1 (en) 1997-12-25 2003-05-13 Japan Tobacco, Inc. Monoclonal antibody against connective tissue growth factor and medicinal uses thereof
US6956107B2 (en) 1998-02-20 2005-10-18 Tanox, Inc. Inhibitors of complement activation
US6861227B2 (en) 1998-03-19 2005-03-01 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies to cytokine receptor common gamma chain like
US6200765B1 (en) 1998-05-04 2001-03-13 Pacific Northwest Cancer Foundation Non-invasive methods to detect prostate cancer
EP1079862B1 (en) 1998-05-20 2010-07-07 Immunomedics, Inc. Therapeutics using a bispecific anti-hla class ii invariant chain x anti-pathogen antibody
IL139700A (en) 1998-06-15 2005-09-25 Altarex Medical Corp Immunotherapeutic composition for the treatment of prostate cancer
US7405320B2 (en) 1998-06-22 2008-07-29 Immunomedics, Inc. Therapeutic and diagnostic conjugates for use with multispecific antibodies
US6528269B1 (en) 1998-06-22 2003-03-04 Case Western Reserve University Immunological agents specific for prion protein (PRP)
US6962702B2 (en) 1998-06-22 2005-11-08 Immunomedics Inc. Production and use of novel peptide-based agents for use with bi-specific antibodies
US7052872B1 (en) 1999-06-22 2006-05-30 Immunomedics, Inc. Bi-specific antibodies for pre-targeting diagnosis and therapy
US7074405B1 (en) 1998-06-22 2006-07-11 Immunomedics, Inc. Use of bi-specific antibodies for pre-targeting diagnosis and therapy
US7387772B1 (en) 1999-06-22 2008-06-17 Immunimedics, Inc. Chimeric, human and humanized anti-CSAP monoclonal antibodies
US7138103B2 (en) 1998-06-22 2006-11-21 Immunomedics, Inc. Use of bi-specific antibodies for pre-targeting diagnosis and therapy
US6312689B1 (en) 1998-07-23 2001-11-06 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Anti-CCR2 antibodies and methods of use therefor
US6572856B1 (en) 1998-09-10 2003-06-03 The University Of Virginia Patent Foundation Methods for the prevention and treatment of cancer using anti-C3b(i) antibodies
US6818749B1 (en) 1998-10-31 2004-11-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Variants of humanized anti carcinoma monoclonal antibody cc49
EP1127170A4 (en) 1998-11-05 2005-04-27 Univ Leland Stanford Junior HUMAN MONOCLONAL ANTIBODIES TO HUMAN PAN-HEPATITIS C VIRUS
CA2355896A1 (en) 1998-12-21 2000-06-29 Ludwig Institute For Cancer Research Antibodies to truncated vegf-d and uses thereof
EE05627B1 (et) 1998-12-23 2013-02-15 Pfizer Inc. CTLA-4 vastased inimese monoklonaalsed antikehad
JP2002533134A (ja) 1998-12-23 2002-10-08 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ， インコーポレイテッド ペプチドグリカン認識タンパク質
US6488930B1 (en) 1999-01-15 2002-12-03 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Anti-CCR4 antibodies and methods of use therefor
IL145941A (en) 1999-04-28 2007-08-19 Univ Texas Compositions and methods for cancer treatment by selectively inhibiting vegf
US7666400B2 (en) 2005-04-06 2010-02-23 Ibc Pharmaceuticals, Inc. PEGylation by the dock and lock (DNL) technique
US7527787B2 (en) 2005-10-19 2009-05-05 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Multivalent immunoglobulin-based bioactive assemblies
US7550143B2 (en) 2005-04-06 2009-06-23 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Methods for generating stably linked complexes composed of homodimers, homotetramers or dimers of dimers and uses
US7534866B2 (en) * 2005-10-19 2009-05-19 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for generating bioactive assemblies of increased complexity and uses
US6946129B1 (en) 1999-06-08 2005-09-20 Seattle Genetics, Inc. Recombinant anti-CD40 antibody and uses thereof
EP1194167B1 (en) 1999-06-09 2009-08-19 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of autoimmune disorders using antibodies which target b-cells
US20020002270A1 (en) 1999-06-16 2002-01-03 Raymond P. Zinkowski Purified antigen for alzheimer's disease, and methods of obtaining and using same
US6355481B1 (en) 1999-06-18 2002-03-12 Emory University Hybridoma cell line and monoclonal antibody for huntingtin protein
US6964854B1 (en) 1999-07-13 2005-11-15 Science & Technology Corporation Compositions and methods useful for the diagnosis and treatment of heparin induced thrombocytopenia/thrombosis
US6693176B1 (en) 1999-07-23 2004-02-17 University Of Massachusetts Antitumor antibodies, proteins, and uses thereof
US6376654B1 (en) 1999-08-13 2002-04-23 Molecular Discoveries, Llc Myeloma cell and ovarian cancer cell surface glycoproteins, antibodies thereto, and uses thereof
US6716966B1 (en) 1999-08-18 2004-04-06 Altarex Corp. Therapeutic binding agents against MUC-1 antigen and methods for their use
AU7089600A (en) 1999-08-30 2001-03-26 U.S. Army Medical Research Institute Of Infectious Diseases Monoclonal antibodies and vaccines against epitopes on the ebola virus glycoprotein
US6824780B1 (en) 1999-10-29 2004-11-30 Genentech, Inc. Anti-tumor antibody compositions and methods of use
US20030031670A1 (en) 1999-11-08 2003-02-13 Jack R. Wands Diagnosis and treatment of malignant neoplasms
US6835370B2 (en) 1999-11-08 2004-12-28 Rhode Island Hospital Diagnosis and treatment of malignant neoplasms
US6994852B1 (en) 1999-11-12 2006-02-07 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Inhibition of angiogenesis by antibodies against high molecular weight kininogen domain 5
US6994976B1 (en) 1999-11-19 2006-02-07 Tittle Thomas V Tr3-specific binding agents and methods for their use
US6319675B1 (en) 1999-11-24 2001-11-20 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods for detecting and/or identifying agents which bind and/or modulate function of “bonzo” chemokine receptor
US6835549B2 (en) 2000-02-24 2004-12-28 University Of Medicine & Dentistry Of New Jersey Immunoassay method for the diagnosis of gastric intestinal metaplasia associated with gastric carcinoma
PT1265929E (pt) 2000-03-23 2009-10-15 Genentech Inc Inibidores anti-c2/c2a de activação complementar
IL152747A0 (en) 2000-05-11 2003-06-24 Altarex Inc Therapeutic method and composition utilizing antigen-antibody complexation and presentation by dendritic cells
WO2001094413A2 (en) 2000-06-06 2001-12-13 Bristol-Myers Squibb Company B7-related nucleic acids and polypeptides and their uses for immunomodulation
WO2002010764A2 (en) 2000-07-31 2002-02-07 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services SPECIFIC BINDING AGENTS FOR KSHV vIL-6 THAT NEUTRALIZE A BIOLOGICAL ACTIVITY
US7060802B1 (en) 2000-09-18 2006-06-13 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Tumor-associated marker
DE60141844D1 (de) 2000-10-02 2010-05-27 Oklahoma Med Res Found Assay zum schnellen nachweis vom humanen aktivierten protein c und hochspezifischer monoklonaler antikörper dagegen
EP2113516B1 (en) 2000-10-10 2014-05-21 Genentech, Inc. Antibodies against C5 inhibiting type II endothelial cell activation
US7138496B2 (en) 2002-02-08 2006-11-21 Genetastix Corporation Human monoclonal antibodies against human CXCR4
PA8535501A1 (es) 2001-01-05 2003-07-28 Pfizer Anticuerpos contra el receptor del factor de crecimiento similar a insulina
US6743898B2 (en) 2001-03-15 2004-06-01 Ochsner Clinic Foundation Monoclonal antibodies that suppress B cell growth and/or differentiation
AU2002303181A1 (en) 2001-03-30 2002-10-15 University Of Massachusetts Morpholino imaging and therapy
US6824778B2 (en) 2001-04-23 2004-11-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Prophylactic and therapeutic monoclonal antibodies
AU2002303832A1 (en) 2001-05-21 2002-12-03 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. P.aeruginosa mucoid exopolysaccharide specific binding peptides
NZ513418A (en) 2001-08-07 2004-04-30 Univ Massey Vaccine comprising proteins from mycobacterium paratuberculosis
US7049060B2 (en) 2001-11-05 2006-05-23 Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. HCV anti-core monoclonal antibodies
WO2003048207A2 (en) 2001-11-28 2003-06-12 Immunomedics, Inc. Anti-dota antibody
RU2004127458A (ru) 2002-02-14 2005-10-27 Иммуномедикс, Инк. (Us) Анти-cd20 антитела, их гибридные белки и способы их использования
US8877901B2 (en) 2002-12-13 2014-11-04 Immunomedics, Inc. Camptothecin-binding moiety conjugates
CA2478047C (en) * 2002-03-01 2014-01-21 Immunomedics, Inc. Rs7 antibodies
JP4472351B2 (ja) 2002-03-01 2010-06-02 イミューノメディクス、インコーポレイテッド インターナライジング抗ｃｄ７４抗体およびその使用方法
CN101824090B (zh) * 2002-06-14 2013-01-02 免疫医疗公司 人源化单克隆抗体hPAM4
RU2005100777A (ru) 2002-06-14 2005-08-27 Иммуномедикс, Инк. (Us) Моноклональное антитело рам4 и его применение для диагностики и лечения рака поджелудочной железы
US7563433B2 (en) 2007-01-11 2009-07-21 Immunomedics, Inc. Methods and compositions for F-18 labeling of proteins, peptides and other molecules
CA2494310A1 (en) 2002-08-01 2004-02-12 Immunomedics, Inc. Alpha-fetoprotein immu31 antibodies and fusion proteins and methods of use thereof
US7541440B2 (en) 2002-09-30 2009-06-02 Immunomedics, Inc. Chimeric, human and humanized anti-granulocyte antibodies and methods of use
EP1572131B1 (en) 2002-10-08 2016-07-06 Immunomedics, Inc. Antibody therapy
US20040120949A1 (en) * 2002-11-08 2004-06-24 Boehringer Ingelheim International Gmbh Compositions and methods for treating cancer using cytotoxic CD44 antibody immunoconjugates and radiotherapy
JP4959136B2 (ja) 2002-12-13 2012-06-20 イミューノメディクス、インコーポレイテッド 細胞内で開裂可能な結合を有する免疫接合体
MXPA05007973A (es) 2003-01-28 2005-09-20 Schering Corp Anticuerpos especificos para celulas dendriticas plasmacitoides.
JP4937751B2 (ja) * 2003-06-13 2012-05-23 イミューノメディクス、インコーポレイテッド Ｄ−アミノ酸ペプチド
US7109304B2 (en) 2003-07-31 2006-09-19 Immunomedics, Inc. Humanized anti-CD19 antibodies
JP4912153B2 (ja) 2003-12-01 2012-04-11 イミューノメディクス、インコーポレイテッド タンパク質とキレート剤とのコンジュゲートを調製するための改良された方法
US7608425B2 (en) 2004-07-23 2009-10-27 Immunomedics, Inc. Methods for protein expression in mammalian cells in serum-free medium
US7537930B2 (en) 2004-07-23 2009-05-26 Immunomedics, Inc. Mammalian cell lines for increasing longevity and protein yield from a cell culture
US7531327B2 (en) 2004-07-23 2009-05-12 Immunomedics, Inc. Methods and compositions for increasing longevity and protein yield from a cell culture
US7251164B2 (en) 2004-11-10 2007-07-31 Innovative Silicon S.A. Circuitry for and method of improving statistical distribution of integrated circuits
ES2829566T3 (es) 2005-03-03 2021-06-01 Immunomedics Inc Anticuerpos L243 humanizados
CA2604032C (en) 2005-04-06 2017-08-22 Ibc Pharmaceuticals, Inc. Methods for generating stably linked complexes composed of homodimers, homotetramers or dimers of dimers and uses
CN101534865A (zh) 2005-10-19 2009-09-16 Ibc药品公司 生物活性装配体的制备方法及其用途
US10938854B2 (en) 2017-09-22 2021-03-02 Acronis International Gmbh Systems and methods for preventive ransomware detection using file honeypots

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