ES2247673T3

ES2247673T3 - Ensayos de complementacion de fragmentos proteicos para detectar interacciones biomoleculares.

Info

Publication number: ES2247673T3
Application number: ES98901905T
Authority: ES
Inventors: Stephen William Watson Michnick; Joelle Nina Pelletier; Ingrid Remy
Original assignee: Odyssey Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Odyssey Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1997-01-31
Filing date: 1998-02-02
Publication date: 2006-03-01
Anticipated expiration: 2018-02-02
Also published as: US6428951B1; US20130022999A1; US6270964B1; WO1998034120A1; ATE301835T1; EP1605042A3; DK0966685T3; CA2196496A1; JP2002508832A; EP0966685B1; AU5850598A; US20030049688A1; US20110287950A1; US6929916B2; US7989218B2; US20040038298A1; DE69831136T2; EP0966685A1; DE69831136D1; EP0966685B9

Abstract

DESBRIBIMOS UNA ESTRATEGIA PARA EL DISEÑO E IMPLEMENTACION DE ENSAYOS POR COMPLEMENTACION DE FRAGMENTOS PROTEICOS (PCAS) PARA DETECTAR INTERACCIONES BIOMOLECULARES IN VIVO E IN VITRO. EL DISEÑO, IMPLEMENTACION Y ENORMES APLICACIONES DE ESTA ESTRATEGIA SE ILUSTRAN CON UN GRAN NUMERO DE ENZIMAS, PRESTANDO ESPECIAL ATENCION AL EJEMPLO DE DIHIDROFOLATO REDUCTASA DE MURINO (DHFR). SE EXPRESARON PEPTIDOS DE FUSION QUE CONSISTEN EN FRAGMENTOS N Y C - TERMINALES DE DHFR DE MURINO FUSIONADOS A SECUENCIAS DE CREMALLERA DE LEUCINA GCN4 EN ESCHERICHIA COLI CULTIVADA EN UN MEDIO MINIMO, EN QUE LA ACTIVIDAD DHFR ENDOGENA SE INHIBIO CON TRIMETROPRIMA. LA COEXPRESION DE LOS PRODUCTOS DE FUSION COMPLEMENTARIOS RESTUARO LA FORMACION DE COLONIAS. LA SUPERVIVENCIA SOLO OCURRIO CUANDO LOS DOS FRAGMENTOS DHFR SE ENCONTRABAN PRESENTES Y CONTENIAN SECUENCIAS FORMADORAS DE CREMALLERAS DE LEUCINA, DEMOSTRANDO QUE LA RECONSTITUCION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA REQUIERE LA AYUDA DE LA FORMACION DE CREMALLERAS DE LEUCINA. LAS MUTACIONES PUNTUALES FRAGMENTO DHFR - INTERFAZ DE SEVERIDAD CRECIENTE (ILE A VAL, ALA Y GLY) DIERON COMO RESULTADO UN AUMENTO SECUENCIAL DE LOS TIEMPOS DE DUPLICACION DE E. COLI LO QUE ILUSTRA LA REAGRUPACION ACERTADA DE FRAGMENTOS DHFR EN LUGAR DE INTERACCIONES NO ESPECIFICAS ENTRE FRAGMENTOS. ESTE ENSAYO SE PUDO UTILIZAR PARA ESTUDIAR EL EQUILIBRIO Y LOS ASPECTOS CINETICOS DE INTERACCIONES MOLECULARES INCLUIDAS LAS INTERACCIONES PROTEINA - PROTEINA, PROTEINA - ADN, PROTEINA - ARN, PROTEINA - HIDRATO DE CARBONO Y PROTEINA - MOLECULA PEQUEÑA, PARA SELECCIONAR LIBRERIAS DE CADN PARA LA UNION DE UNA PROTEINA DIANA CON PROTEINAS CONOCIDAS O LIBRERIAS DE PEQUEÑAS MOLECULAS ORGANICAS PARA OBTENER UNA ACTIVIDAD BIOLOGICA. LA SELECCION Y DISEÑO DE LOS CRITERIOS APLICADOS EN LA PRESENTE INVENCION SE DESARROLLARON PARA NUMEROSOS EJEMPLOS DE ENSAYOS DE SELECCION CLONAL, COLOROMETRICOS, FLUOROMETRICOS Y OTROS ENSAYOS BASADOS EN ENZIMAS CUYOS PRODUCTOS SE PUEDEN MEDIR. EL DESARROLLO DE TALES SISTEMAS DE ENSAYO DEMOSTRO SER SENCILLO Y PERMITE UNA SERIE DIVERSA DE APLICACIONES POR COMPLEMENTACION DE FRAGMENTOS PROTEICOS.

Description

Ensayos de complementación de fragmentos proteicos para detectar interacciones biomoleculares.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la determinación de la función de nuevos productos génicos. La invención también se refiere a ensayos de complementación de fragmentos proteicos (ECP). Los ECP permiten detectar una gran variedad de tipos de interacciones proteína-proteína, proteína-ARN, proteína-ADN, proteína-carbohidrato o proteína-molécula orgánica pequeña en diferentes contextos celulares apropiados para estudiar tales interacciones.

Antecedentes de la invención

Muchos procesos biológicos, tales como la transcripción, la traducción y las rutas metabólicas o de transducción de señales, son mediados por complejos multienzimáticos asociados de forma no covalente^{1, 101}. La formación de complejos multiproteicos o proteína-ácido nucleico constituye la maquinaria química más eficaz. Muchas de las investigaciones biológicas modernas están relacionadas con la identificación de proteínas implicadas en procesos celulares, con la determinación de sus funciones y con cómo, cuándo y dónde interactúan con otras proteínas implicadas en rutas específicas. Además, en vista del rápido avance en los proyectos de secuenciación del genoma, existe la necesidad de desarrollar estrategias para definir "mapas de unión de proteínas", inventarios detallados de interacciones entre proteínas que forman ensamblajes funcionales de proteínas^{2,3}. A pesar de lo importante que es comprender el ensamblaje de proteínas en procesos biológicos, existen pocos procedimientos convenientes para estudiar las interacciones proteína-proteína in vivo^{4,5}. Los planteamientos incluyen el uso de reactivos químicos de entrecruzamiento y transferencia de energía de resonancia entre proteínas acopladas a un colorante^{102, 103}. Una estrategia potente y usada comúnmente, el sistema de doble híbrido en levadura, se usa para identificar nuevas interacciones proteína-proteína y para examinar los aminoácidos determinantes de las interacciones proteicas específicas^{4,6-8}. El planteamiento permite el cribado rápido de un gran número de clones, incluidas las librerías de ADNc. Las limitaciones de esta técnica incluyen el hecho de que la interacción ha de ocurrir en un contexto específico (el núcleo de S. cerevisiae), y generalmente no se puede usar para distinguir entre interacciones inducidas o constitutivas.

Recientemente, Johnsson y Varshavsky^{108} han mostrado una nueva estrategia para detectar interacciones proteína-proteína, la denominada técnica de sensor de proteínas escindidas basado en ubiquitina (USPS)^{9}. La estrategia se basa en la escisión de proteínas que presentan extremos N-terminales fusionados con ubiquitina mediante proteasas citosólicas (ubiquitinasas) que reconocen su estructura terciaria. La estrategia depende del reensamblaje de la estructura terciaria de la proteína ubiquitina a partir de fragmentos N- y C-terminales complementarios y, sobre todo, de la potenciación de este reensamblaje mediante dominios de oligomerización fusionados con estos fragmentos. El reensamblaje se detecta mediante la proteolisis específica del producto ensamblado por proteasas citosólicas (ubiquitinasas). Los autores demostraron que también la fusión de una proteína reportera-fragmento C-terminal de ubiquitina se podía escindir mediante ubiquitinasas, pero sólo si se coexpresaba con un fragmento N-terminal de la ubiquitina complementario al fragmento C-terminal. La reconstitución de la actividad ubiquitinasa observable se producía únicamente si los fragmentos N- y C-terminales se unían a través de cremalleras de leucina de GCN4^{109,110}. Los autores sugirieron que esta estrategia del "gen escindido" se podía usar como ensayo in vivo de las interacciones proteína-proteína y para el análisis de la cinética de ensamblaje de proteínas en células. Desafortunadamente, esta estrategia requiere factores celulares adicionales (en este caso ubiquitinasas), y el procedimiento de detección no se presta a un cribado de alto rendimiento de librerías de ADNc.

Rossi, F., C.A. Charlton y H.M. Blau (1997, Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 94, 8405-8410) informaron de un ensayo basado en la complementación clásica de los fragmentos \alpha y \omega de la \beta-galactosidasa (\beta-gal) y la inducción de la complementación mediante la oligomerización inducida por rapamicina de las proteínas FKBP12 y la diana mamífera de rapamicina en líneas celulares de mioblastos C2C12 transfectadas. La reconstitución de la actividad \beta-gal se detecta usando como sustrato fluoresceína di-\beta-D-galactopiranósido y usando diversos ensayos de detección de fluorescencia. Aunque este ensayo presenta un cierto parecido con la presente invención, existen varias diferencias distintivas significativas. En primer lugar, este planteamiento de complementación concreto se ha estado usando durante más de treinta años en un gran número de aplicaciones, que incluyen la detección de interacciones proteína-proteína. Krevolin, M. y D. Kates (1993, patente de Estados Unidos nº 5.362.625) muestran el uso de esta complementación para detectar interacciones proteína-proteína. Asimismo se ha comunicado previamente el logro de la complementación de \beta-gal en células de mamífero (Moosmann, P. y S. Rusconi (1996) Nucl. Acids Res. 24, 1171-1172). Los ECP individuales presentados en esta memoria son ensayos para la detección de interacciones de diseño completamente nuevo, no descritos previamente de manera alguna salvo para publicaciones surgidas del laboratorio del solicitante. En segundo lugar, esta solicitud describe una estrategia general para desarrollar ensayos de interacciones moleculares a partir de un gran número de detectores de enzimas o proteínas, todos ellos ensayos de diseño nuevo, mientras que el ensayo de \beta-gal no es nove-
doso ni constituye una estrategia general o ventaja frente a las aplicaciones existentes, bien documentadas previamente.

Al igual que en el USPS, la estrategia de doble híbrido en levadura requiere para la detección una maquinaria celular adicional que únicamente existe en compartimentos celulares específicos. Por lo tanto, existe la necesidad de un sistema de detección que use la reconstitución de una actividad enzimática específica a partir de fragmentos como ensayo mismo, sin necesidad de usar otras proteínas para la detección de la actividad. Preferentemente, el ensayo debe implicar una complementación asistida por una oligomerización de fragmentos de enzimas monoméricas o multiméricas que no precisen de otras proteínas para la detección de su actividad. Además, si la estructura de una enzima es conocida, es posible diseñar fragmentos de la enzima para asegurar que los fragmentos reensamblados son activos e introducir mutaciones con el fin de alterar el poder de detección del reensamblaje. Sin embargo, el conocimiento de la estructura no es un requisito previo para diseñar fragmentos complementarios, como se explicará más adelante. La flexibilidad permitida en el diseño de un planteamiento de este tipo puede hacerlo aplicable a situaciones en las que pueden no ser adecuados otros sistemas de detección.

Los recientes avances en la investigación del genoma humano han conducido a un rápido progreso en la identificación de genes nuevos. En la aplicación a la investigación biológica y farmacéutica existe ahora una necesidad urgente para determinar las funciones de los productos génicos nuevos; por ejemplo, para genes en los que se ha demostrado su implicación en fenotipos patológicos. Consiste en solucionar problemas funcionales en los que la investigación farmacéutica basada en el genoma se queda atascada, y ahora existe la necesidad de avanzar en el desarrollo de ensayos funcionales sencillos y automatizables. Un primer paso para definir la función de un gen nuevo consiste en determinar sus interacciones con otros productos génicos en un contexto apropiado; es decir, puesto que las proteínas interactúan específicamente con otras proteínas u otros biopolímeros como parte de ensamblajes funcionales, una forma apropiada para examinar la función de un gen nuevo consiste en determinar sus relaciones físicas con los productos de otros genes.

Las técnicas de cribado para identificar interacciones entre proteínas, tales como el sistema de "doble híbrido" en levadura, han transformado la biología molecular, pero únicamente se pueden usar para estudiar tipos específicos de proteínas que interactúan entre sí de forma constitutiva o interacciones de proteínas con otras moléculas en contextos celulares y compartimentales estrechamente definidos y requieren una maquinaria celular compleja (transcripción) para funcionar. Para realizar un cribado racional respecto a interacciones entre proteínas en el contexto de un problema específico se requieren planteamientos más flexibles: concretamente, ensayos que cumplan los criterios necesarios no sólo para la detección de interacciones moleculares sino también para la validación de estas interacciones como específicas y biológicamente relevantes.

Una lista de las características del ensayo que cumplen tales criterios es la siguiente:

1) Permitir la detección de interacciones proteína-proteína, proteína-ADN/ARN o proteína-fármaco in vivo o in vitro.

2) Permitir la detección de estas interacciones en contextos apropiados, tales como en un organismo, tipo celular, compartimento celular u orgánulo específico.

3) Permitir la detección de interacciones proteína-proteína inducidas frente a constitutivas (por ejemplo, mediante un factor de crecimiento o inhibidor celular).

4) Ser capaz de distinguir entre interacciones proteína-proteína específicas e inespecíficas controlando la sensibilidad del ensayo.

5) Permitir la determinación de la cinética del ensamblaje de proteínas en las células.

6) Permitir el cribado de librerías de ADNc, moléculas orgánicas pequeñas o de ADN o ARN para identificar interacciones moleculares.

Resumen de la invención

La presente invención pretende cubrir las necesidades antes mencionadas en las que la técnica anterior fracasa. La presente invención proporciona una estrategia general para detectar interacciones de proteínas con otros biopolímeros, que incluyen otras proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos, o para cribar librerías de moléculas pequeñas para identificar compuestos con un posible valor terapéutico. En una realización preferida, la presente invención pretende proporcionar una complementación de fragmentos de enzimas monoméricas asistida por una oligomerización que no requiera otras proteínas para detectar su actividad. En una realización de este tipo, se proporciona un ensayo de complementación de fragmentos proteicos (ECP) basado en la reconstitución de la actividad de la dihidrofolato reductasa por complementación de fragmentos definidos de la enzima en E. coli. Este ensayo no requiere factores endógenos adicionales para detectar interacciones proteína-proteína específicas (es decir, interacciones de tipo cremallera de leucina) y se puede aplicar convenientemente para el cribado de librerías diseñadas de ADNc, ácidos nucleicos, moléculas pequeñas o proteínas respecto a interacciones moleculares. Además, el ensayo también se puede adaptar para la detección de interacciones entre proteínas en cualquier contexto o compartimento celular, y se puede usar para distinguir entre interacciones proteicas inducidas y constitutivas en sistemas tanto eucarióticos como procarióticos.

En un primer aspecto, la invención proporciona un ensayo de complementación de fragmentos proteicos para la detección de interacciones moleculares que comprende el reensamblaje de fragmentos separados de una proteína, en el que el reensamblaje de los fragmentos proteicos se efectúa a través de la interacción de dominios moleculares fusionados con cada fragmento proteico, en el que el reensamblaje de los fragmentos proteicos es independiente de otros procesos moleculares y en el que dicho reensamblaje se detecta por medio de la reconstitución de la actividad de dicha proteína.

Preferentemente, la proteína es una proteína monomérica; más preferentemente, la proteína es una enzima; aún más preferentemente, la enzima es una enzima monomérica. El peso molecular preferido para la enzima se encuentra en el intercalo de 10 a 40 kDa.

La enzima usada en el ensayo de acuerdo con el primer aspecto de la invención se puede seleccionar del grupo formado por glutatión-S-transferasa, dihidrofolato reductasa, luciferasa, xantina-guanina fosforribosil transferasa, adenosina desaminasa, higromicina-B-fosfotransferasa y L-histidinol NAD^{+} oxidorreductasa. En una realización preferida, la dihidrofolato reductasa está mutada en el residuo de aminoácido 114.

La proteína usada en el ensayo de acuerdo con el primer aspecto de la invención se puede seleccionar del grupo formado por la proteína fluorescente verde y una proteína de unión a bleomicina (gen de resistencia a zeocina). En una realización preferida, la proteína fluorescente verde está mutada en el residuo de aminoácido 65.

En otro aspecto más, la invención proporciona un procedimiento para la detección de interacciones proteína-proteína en organismos vivos no humanos y/o en células no humanas y/o en células humanas aisladas y/o cultivadas, comprendiendo el procedimiento los siguientes pasos:

(a) Síntesis de fragmentos proteicos sonda de una enzima que permita la selección dominante por división del gen que codifica la enzima en al menos dos fragmentos;

(b) construcción de proteínas de fusión formadas por los fragmentos proteicos sonda unidos a dominios moleculares que se han de ensayar respecto a sus interacciones;

(c) coexpresión de las proteínas de fusión; y

(d) detección de la reconstitución de la actividad enzimática usando el ensayo de acuerdo con el primer aspecto de la invención.

En una realización preferida, la coexpresión de las proteínas de fusión complementarias es catalizada por la unión de dichos dominios moleculares entre sí.

En el procedimiento de acuerdo con el segundo aspecto de la invención, la enzima es preferentemente la dihidrofolato reductasa.

En otra realización preferida de la invención, las proteínas de fusión presentan péptidos formados por los fragmentos N- y C-terminales de dicha dihidrofolato reductasa y están fusionadas con secuencias de la cremallera de leucina de GCN4.

La invención proporciona adicionalmente un procedimiento para el cribado de una librería de expresión, que comprende la realización de un ensayo de complementación de proteínas de acuerdo con el primer aspecto de la invención en el que el medio de detección de dicho ensayo es la reconstitución de la actividad proteica. Preferentemente, en este procedimiento de cribado existe una interacción entre partes de una primera o una segunda molécula debido a la presencia de al menos una molécula distinta que media la interacción.

Una estrategia particular para diseñar un ensayo de complementación de proteínas (ECP) está basada en el cumplimiento de las siguientes características: 1) Una proteína o enzima que sea relativamente pequeña y monomérica, 2) sobre la cual exista una amplia bibliografía con información estructural y funcional, 3) para la cual existan ensayos sencillos para la reconstitución de la proteína o de la actividad enzimática, tanto in vivo como in vitro, y 4) para la cual se haya demostrado una sobreexpresión en células eucarióticas y procarióticas. Si estos criterios se cumplen, se usa la estructura de la enzima para decidir cuál es la mejor posición en la cadena polipeptídica para dividir el gen en dos partes, basándose en los siguientes criterios: 1) Los fragmentos deben dar como resultado subdominios polipeptídicos continuos; es decir, los fragmentos resultantes no deben romper la estructura de los subdominios de la proteína, 2) los sitios catalíticos y de unión a cofactores deben estar contenidos todos ellos en un mismo fragmento y 3) los extremos N- y C-terminales nuevos deben estar en la misma cara de la proteína para evitar tener que usar conectores peptídicos largos y permitir la realización de estudios sobre la dependencia de la unión proteica de la orientación.

Debe entenderse que no tienen que cumplirse todos los criterios antes mencionados para que la presente invención funcione adecuadamente. Es una ventaja que la enzima sea pequeña, preferentemente de 10 a 40 kDa. Aunque se prefieren enzimas monoméricas, también se pueden prever enzimas multiméricas dentro del alcance de la presente invención. En el presente ensayo se puede usar la proteína tirosinasa dimérica. La información sobre la estructura de la enzima proporciona una ventaja adicional a la hora de diseñar el ECP, pero no es necesaria. De hecho, se presenta una estrategia adicional para desarrollar un ECP, basada en una combinación de fragmentos proteicos generados mediante la digestión con exonucleasas seguida de una evolución dirigida de la proteína aplicando a la enzima la aminoglucósido quinasa. Se prefiere la sobreexpresión en células procarióticas, pero no es una necesidad. El experto en la técnica entenderá que no es absolutamente necesario que el sitio catalítico enzimático (de la enzima elegida) esté en la misma molécula.

La presente solicitud explica la razón y los criterios para usar una enzima concreta en un ECP. La Figura 1 muestra una descripción general de un ECP. El gen de una proteína o enzima se divide de forma racional en dos o más fragmentos. Los fragmentos elegidos se subclonan usando técnicas de biología molecular, y a los extremos 5' de cada uno se fusionan proteínas que se sabe o se cree que interactúan. Después se realiza la cotransfección o cotransformación de estas construcciones de ADN en células. El reensamblaje de la proteína o enzima sonda a partir de sus fragmentos es catalizado por la unión de las proteínas de ensayo entre sí, y la reconstitución se observa con cualquier ensayo. Es esencial entender que estos ensayos únicamente funcionarán si las proteínas fusionadas que interactúan catalizan el reensamblaje de la enzima. Es decir, la observación de la actividad enzimática reconstituida debe ser una medida de la interacción de las proteínas fusionadas.

Una realización preferida de la presente invención se centra en un ECP basado en la enzima dihidrofolato reductasa. Se presenta una ampliación de la estrategia en el sentido de incluir ensayos en células eucarióticas, el cribado de librerías y una aplicación específica a problemas relacionados con el estudio de rutas bioquímicas integradas, tales como vías de transducción de señales. Se describen ensayos adicionales, incluidos aquellos que están basados en enzimas y que pueden actuar como selección dominante o recesiva de fármacos o como recuperación de rutas metabólicas. Asimismo se describen ECP basados en enzimas que producen un producto de color o fluorescente. La presente invención enseña cómo la estrategia de los ECP se puede generalizar y automatizar para el análisis funcional de genes nuevos, el cribado de productos naturales o de librerías de compuestos respecto a su actividad farmacológica y la identificación de productos génicos nuevos que interactúan con ADN, ARN o carbohidratos. También enseña cómo la estrategia de los ECP se puede aplicar para identificar, a partir de librerías de compuestos con un posible valor terapéutico, productos naturales o moléculas pequeñas que pueden inhibir o activar tales interacciones moleculares y cómo se pueden identificar los sustratos enzimáticos y los inhibidores de molécula pequeña de las enzimas. Finalmente, enseña cómo la estrategia de los ECP se puede usar para llevar a cabo experimentos de ingeniería de proteínas que pueden conducir al diseño de enzimas con aplicaciones industriales o de péptidos con actividad biológica.

En la presente memoria se describen estrategias sencillas para diseñar e implementar ensayos para la detección de interacciones de proteínas in vivo. Los autores diseñaron fragmentos complementarios de la DHFRm nativa que, cuando se coexpresan en E. coli cultivado en medio mínimo, permiten la supervivencia de los clones que expresan los dos fragmentos, estando inhibida la actividad basal de la DHFR bacteriana endógena mediante el inhibidor competitivo trimetoprim (Fig. 3). La reconstitución de la actividad se producía únicamente cuando los dos fragmentos N- y C-terminales de la DHFR se coexpresaban en forma de fusiones C-terminales con secuencias de tipo cremallera de leucina de GCN4, lo que indica que el reensamblaje de los fragmentos requiere la formación de una cremallera de leucina entre los péptidos de fusión N- y C-terminales. El aumento secuencial de los tiempos de duplicación de las células, resultante de las mutaciones desestabilizantes dirigidas en la interfase de ensamblaje (Ile 114 a Val, Ala o Gly), demuestra que la supervivencia celular observada en condiciones selectivas es el resultado de la asociación específica, asistida por cremalleras de leucina, del fragmento[1,2] con el fragmento[3] de la DHFRm, al contrario que las interacciones inespecíficas de Z-F[3] con Z-F[1,2]. Se proporcionan numerosos ejemplos adicionales detallados.

Como se demostró previamente con la técnica de sensor de proteínas escindidas basado en ubiquitina (USPS)^{9}, se puede usar una estrategia de complementación de fragmentos proteicos para estudiar el equilibrio y los aspectos cinéticos de las interacciones proteína-proteína in vivo. Sin embargo, el ensayo con la DHFR y otros ECP son ensayos más sencillos. Son sistemas completos; no son necesarios otros factores endógenos adicionales, y los resultados de la complementación se observan directamente, sin más manipulación. Por lo tanto, el ensayo de supervivencia de las células de E. coli descrito en la presente memoria es especialmente útil para el cribado de librerías de ADNc para identificar interacciones proteína-proteína. La expresión de la DHFRm en células se puede monitorizar mediante la unión de análogos fluorescentes y de alta afinidad del sustrato de la DHFR^{26}.

Existen varios aspectos adicionales de los ECP que los distinguen de todas las demás estrategias para estudiar las interacciones proteína-proteína in vivo (excepto USPS). Los autores han diseñado fragmentos complementarios de enzimas que permiten controlar el poder del ensayo y que se pueden usar para estimar la cinética y las constantes de equilibrio para la asociación de dos proteínas. Por ejemplo, en el caso de la DHFR, las mutaciones puntuales de la enzima silvestre Ile 114 a Val, Ala o Gly alteran el poder de reconstitución de la actividad de la DHFR. Para estimar el equilibrio y los parámetros cinéticos para una interacción proteína-proteína específica, se puede llevar a cabo una serie de experimentos ECP de la DHFR con dos proteínas que interactúan con una afinidad conocida, usando los fragmentos silvestres o mutantes desestabilizantes de la DHFR. La comparación de las tasas de crecimiento en este sistema modelo con las tasas de un ECP con la DHFR usando desconocidos proporcionará una estimación del poder de la interacción desconocida.

Debe entenderse que la presente invención no está limitada a la DHFR o a otros ECP presentados, puesto que éstos son sólo realizaciones no limitantes del ensayo de complementación de proteínas de la presente invención. Más aún, los ECP no deben estar limitados respecto al contexto en el que se pueden usar. Las construcciones se pueden diseñar para dirigir las fusiones del ECP a compartimentos específicos de la célula añadiendo secuencias peptídicas de señalización^{27,28}. Las interacciones proteína-proteína inducidas se pueden distinguir de las constitutivas mediante una versión eucariótica del ECP en el caso de una interacción que es provocada por un acontecimiento bioquímico. Asimismo, el sistema se puede adaptar para el uso en el cribado de nuevas asociaciones moleculares y proteicas inducidas entre una proteína diana y una librería de expresión.

La presente invención es pionera en cuanto a que es el primer ensayo de complementación de proteínas que muestra tal nivel de simplicidad y versatilidad. Las realizaciones ejemplificadas representan ensayos de complementación de fragmentos proteicos (ECP) basados en la DHFRm, en los que una cremallera de leucina dirige la reconstitución de la actividad de la DHFR. La actividad se detecta mediante un ensayo de supervivencia de E. coli que es tanto práctico como económico. Este sistema ilustra el uso de la complementación de fragmentos de DHFRm en la detección de la dimerización por cremallera de leucina y se puede aplicar a la detección de interacciones moleculares y proteicas específicas desconocidas in vivo.

Debe entenderse que la presente invención no está limitada a los ECP presentados en esta memoria, puesto que se pueden seleccionar y usar numerosas enzimas diferentes de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención. Ejemplos de tales marcadores se pueden encontrar en Kaufman (1987, Genetic Eng. 9:155-198) y en las referencias allí citadas, así como en la Tabla 1 de esta solicitud.

Asimismo debe quedar claro para el experto en la técnica al que concierne la presente invención que la invención no está limitada al uso de cremalleras de leucina para las dos moléculas que interactúan. De hecho, se pueden usar e identificar numerosos tipos distintos de interacciones proteína-molécula de acuerdo con la enseñanza de la presente invención. Los motivos conocidos implicados en las interacciones proteína-molécula son conocidos en la técnica.

Otras características y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de la descripción siguiente de sus realizaciones preferidas, los ejemplos adjuntos y las reivindicaciones exigidas.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 proporciona una descripción general de un ECP. Usando técnicas de biología molecular se subclonan los fragmentos elegidos de la enzima, y a los extremos 5' de cada uno se fusionan proteínas que se sabe o se cree que interactúan. Después se lleva a cabo la cotransfección o transformación de estas construcciones de ADN en células y se observa la reconstitución con cualquier ensayo.

La Fig. 2 es un esquema de las construcciones de fusión usadas en una de las realizaciones de la invención. Se ilustran el péptido hexahistidina (6His), la cremallera de leucina homodimerizante de GCN4 (Cremallera) y fragmentos de DHFRm (1, 2 y 3). El marcador de las construcciones se usa para identificar tanto las construcciones de ADN como las proteínas expresadas a partir de estas construcciones.

La Fig. 3 (A) muestra el ensayo de supervivencia de E. coli en placas con medio mínimo. Control: Lado izquierdo de la placa: E. coli que porta pQE-30 (sin inserto); lado derecho: E. coli que porta pQE-16 que codifica la DHFRm nativa. Panel I: Lado izquierdo de cada placa: Transformación con la construcción Z-F[1,2]; lado derecho de cada placa: Transformación con la construcción Z-F[3]. Panel II: Cotransformación con las construcciones Z-F[1,2] y Z-F[3]. Panel III: Cotransformación con las construcciones Control-F[1,2] y Z-F[3]. Todas las placas contienen 0,5 mg/ml de trimetoprim. En los paneles I a III, las placas del lado derecho contienen IPTG 1 mM.

(B) Ensayo de supervivencia de E. coli usando mutantes desestabilizantes de la DHFR. Panel I: Cotransformación de E. coli con las construcciones Z-F[1,2] y Z-F[3:Ile114Val]. Panel II: Cotransformación con Z-F[1,2] y Z-F[3:Ile114Ala]. El recuadro es un aumento de 5 veces de la placa del lado derecho. Panel III: Cotransformación con Z-F[1,2] y Z-F[3:Ile114Gly]. Todas las placas contienen 0,5 mg/ml de trimetoprim. Las placas del lado derecho contienen IPTG 1 mM.

La Fig. 4 representa la coexpresión de los fragmentos de la DHFRm.

(A) Análisis en gel de agarosa del patrón de restricción resultante de la digestión del ADN plasmídico con HincII. El carril 1 contiene ADN aislado de E. coli cotransformado con las construcciones Z-F[1,2] y Z-F[3]. Los carriles 2 y 3 contienen ADN aislado de E. coli transformado con la construcción Z-F[3] y la construcción Z-F[1], respectivamente. La migración de los fragmentos (en pb) se indica a la derecha.

(B) Análisis por electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE) de la expresión de los fragmentos de la DHFRm. Los carriles 1 a 5 muestran el lisado bruto de E. coli no transformado (carril 1) o de E. coli que expresa Z-F[1,2] (20,8 kDa; carril 2), Z-F[3] (18,4 kDa; carril 3), Control-F[1,2] (14,2 kDa; carril 4) y Z-F[1,2] + Z-F[3] (carril 5). El carril 6 muestra 40 ml procedentes de 2 ml de Z-F[1,2] y Z-F[3] copurificados. Las puntas de flecha señalan las proteínas de interés. La migración de los marcadores del peso molecular (en kDa) se indica a la derecha.

La Fig. 5 ilustra las características generales de un ECP basado en un ensayo de supervivencia, tal como el ECP de la DHFR. El ensayo se puede usar en un contexto bacteriano o mamífero. El ADN diana insertado puede ser una secuencia conocida que codifica una proteína (o un dominio de una proteína) de interés, o puede ser una librería de ADNc.

La Fig. 6 representa una autorradiografía de un lisado de células COS después del marcado por pulsos con ^{35}S-Met-Cys durante 30 min. El patrón de expresión es esencialmente idéntico al que se observa en E. coli (véase la Fig. 4). El ADN transfectado en las células (o cotransfectado) se indica en la parte superior de los carriles respectivos.

La Fig. 7 ilustra los resultados de una aplicación del ECP bacteriano de la DHFRm a la ingeniería de proteínas. Se crearon dos librerías semialeatorias de cremalleras de leucina (como se describe en el texto) y cada una se insertó en el extremo N-terminal de uno de los fragmentos de DHFRm. La cotransformación de las librerías resultantes de fragmentos cremallera-DHFR en E. coli y el cultivo en placas con medio selectivo permitió la supervivencia de los clones que portaban cremalleras de leucina que interactúan con éxito. Se aislaron catorce clones y se secuenciaron las cremalleras para identificar los residuos en las posiciones "e" y "g". Los pares "e-g" se clasificaron en función de la presencia de un apareamiento atractivo (carga:carga, carga:neutro polar o neutro polar:neutro polar) o de un apareamiento repulsivo (carga:carga) y del número de cada tipo de interacción registrado para cada clon. El número total de interacciones para cada clon es 6; las interacciones se representan en el histograma.

Otras ventajas y características de la presente invención se harán más evidentes después de leer la descripción siguiente de las realizaciones preferidas con referencia a los dibujos adjuntos, que constituyen ejemplos y no deben interpretarse como limitantes del alcance de la presente invención.

Descripción de las realizaciones preferidas Selección de la DHFRm para un ECP

A la hora de diseñar un ensayo de complementación de fragmentos proteicos (ECP), los autores trataron de identificar una enzima para la cual fuera válido lo siguiente: 1) Una enzima que sea relativamente pequeña y monomérica, 2) sobre la cual exista información estructural y funcional, 3) para la cual existan ensayos sencillos para realizar mediciones tanto in vivo como in vitro y 4) para la cual se haya demostrado la sobreexpresión en células eucarióticas y procarióticas. La DHFR murina (DHFRm) cumple todos los criterios expuestos anteriormente para un ECP. Las DHFR procariótica y eucariótica son esenciales para el metabolismo celular de un solo carbono y son absolutamente necesarias para la supervivencia celular en procariotas y eucariotas. Específicamente, cataliza la reducción del dihidrofolato al tetrahidrofolato para usarlo en la transferencia de unidades de un solo carbono, necesaria para la biosíntesis de serina, metionina, purinas y timidilato. Las DHFR son proteínas monoméricas pequeñas (17 kDa a 21 kDa). Las estructuras cristalinas de la DHFR procedente de diferentes fuentes bacterianas y eucarióticas son conocidas y se han determinado los sitios de unión al sustrato y los residuos presentes en los sitios activos^{111-114}, lo que permite realizar un diseño racional de los fragmentos proteicos. Se han estudiado extensamente el plegado, la catálisis y la cinética de numerosas DHFR^{115-119}. La actividad enzimática se puede monitorizar in vitro mediante un sencillo ensayo espectrofotométrico^{120} o in vivo mediante la supervivencia celular de células cultivadas en ausencia de los productos finales de la DHFR. La DHFR es inhibida específicamente por el fármaco anti-folato trimetoprim. Puesto que la DHFR de mamíferos presenta una afinidad 12.000 veces menor por el trimetoprim que la DHFR bacteriana^{121}, el crecimiento de bacterias que expresan la DHFRm en presencia de niveles de trimetoprim letales para las bacterias es un medio eficaz para seleccionar el reensamblaje de los fragmentos de la DHFRm que da lugar a una enzima activa. Se ha demostrado un alto nivel de expresión de la DHFRm en células procarióticas transformadas o eucarióticas transfectadas^{122-126}.

Consideraciones sobre el diseño

La DHFRm comparte una elevada identidad de secuencia con la secuencia de la DHFR humana (DHFRh) (91% de identidad) y es altamente homóloga a la enzima de E. coli (29% de identidad, 68% de homología), y estas secuencias comparten una estructura terciaria visualmente superponible^{111}. La comparación de las estructuras cristalinas de la DHFRm y la DHFRh sugiere que sus sitios activos son esencialmente idénticos^{127,128}. Se ha descrito que la DHFR está formada por tres fragmentos estructurales que forman dos dominios^{129,130}, el dominio de unión a adenina (residuos 47 a 105 = fragmento[2]) y un dominio discontinuo (residuos 1 a 46 = fragmento[1] y 106 a 186 [3]; numeración de acuerdo con la secuencia murina). La cavidad de unión a folato y el surco de unión a NADPH están formados principalmente por residuos pertenecientes a los fragmentos[1] y [2]. El fragmento[3] no está implicado directamente en la catálisis.

Los residuos 101 a 108 de la DHFRh, en el punto de unión entre el fragmento[2] y el fragmento[3], forman un bucle desordenado que está situado en la misma cara de la proteína que ambos extremos terminales. Los autores decidieron cortar la DHFRm en los fragmentos [1,2] y [3], en el residuo 107, para afectar mínimamente el sitio activo y los sitios de unión al cofactor NADPH. El extremo N-terminal nativo de la DHFRm y el extremo N-terminal nuevo creado por el corte se encuentran en la misma superficie de la enzima^{112, 128}, permitiendo con facilidad la unión covalente N-terminal de cada fragmento con los fragmentos a los que se ha de asociar, tales como las cremalleras de leucina usadas en este estudio. Usando este sistema, los autores obtuvieron un ensamblaje de los fragmentos de la DHFRm asistido por cremalleras de leucina que proporcionó la enzima activa.

Ejemplo 1 Protocolo experimental Construcciones de ADN

Los oligonucleótidos mutagénicos y de secuenciación fueron suministrados por Gibco BRL. Las endonucleasas de restricción y las enzimas modificadoras de ADN provinieron de Pharmacia y New England Biolabs. Los fragmentos de la DHFRm, que portaban su propio codón de terminación dentro del marco de lectura, se subclonaron en pQE-32 (Qiagen), cadena abajo y dentro del marco de lectura del péptido de hexahistidina y una cremallera de leucina de GCN4 (Fig. 1, Fig. 2). Todas las construcciones finales estaban basadas en la serie de vectores pQE de Qiagen, que contienen un elemento promotor-operador inducible (tac), un sitio de unión consenso a ribosomas, un codón de iniciación y nucleótidos que codifican un péptido de hexahistidina. pQE-16 (Qiagen) expresa la DHFRm en su longitud completa.

Vector de expresión que porta la cremallera de leucina de GCN4

Los residuos 235 a 281 de la cremallera de leucina de GCN4 (un fragmento SalI/BamHI de 254 pb) se obtuvieron a partir de un plásmido de expresión pRS316 de levaduras^{9}. El extremo escindido en el sitio BamHI se rellenó con la polimerasa Klenow y el fragmento se ligó en pQE-32 linealizado con SalI/HindIII (relleno). El producto, la construcción Z, lleva un marco de lectura abierto que codifica la secuencia Met-Arg-Gly-Ser, seguida de un marcador de hexahistidina y 13 residuos que preceden a los residuos de la cremallera de leucina de GCN4.

Creación de fragmentos de la DHFR

Como molde para la generación de la DHFRm por PCR se usó el vector eucariótico de expresión transitoria, pMT3 (derivado de pMT2)^{16}, que reunía las características que permitían la subclonación y la expresión separada del fragmento[1,2] y del fragmento[3]. Se usó el procedimiento del megacebador de la mutagénesis por PCR^{29} para generar un producto de 590 pb de longitud completa. Se usaron oligonucleótidos complementarios a la secuencia nucleotídica que codifica los extremos N- y C-terminales de la DHFRm y que contiene un nuevo sitio BspEI fuera de la secuencia codificante, así como un oligonucleótido usado para crear un nuevo codón de terminación detrás del fragmento[1,2], seguido de un nuevo sitio SpeI usado para la subclonación del fragmento[3].

Construcción de una nueva región de clonación múltiple y subclonación de los fragmentos [1,2] y [3] de la DHFR

Se hibridaron juntos los oligonucleótidos complementarios que contenían los nuevos sitios de restricción: SnaBI, NheI, SpeI y BspEI, obteniéndose en 5' y 3' extremos sobresalientes complementarios a EcoRI, y se insertaron en pMT3 en un único sitio EcoRI. El producto de PCR, de 590 pb (descrito anteriormente), se digirió con BspEI y se insertó en pMT3 linealizado en BspEI, proporcionando la construcción [1,2,3]. El fragmento BspEI/EcoNI, de 610 pb (que codifica el fragmento [1,2] de la DHFR seguido de una nueva terminación y el fragmento[3] hasta EcoNI) se rellenó en EcoNI y se subclonó en pMT3 abierto con BspEI/HpaI, proporcionando la construcción F[1,2]. El fragmento SpeI/BspEI, de 250 pb, de la construcción [1,2,3] que codifica el fragmento[3] de la DHFR (con codón de terminación dentro del marco de lectura) se subclonó en pMT3 abierto con las mismas enzimas. El codón de terminación de la secuencia de DHFR silvestre, cadena abajo del fragmento[3] en pMT3, se insertó de la siguiente manera: El corte con EcoNI, presente tanto en el fragmento[3] insertado como en el fragmento[3] silvestre, la eliminación de la secuencia intermedia, de 683 pb, y el religado del vector proporcionaron una construcción del fragmento[3] con el codón de terminación silvestre, la construcción F[3].

Creación de las construcciones de expresión

Los fragmentos SnaBI/XbaI de 1051 pb y de 958 pb de las construcciones F[1,2] y F[3], respectivamente, se subclonaron en la construcción Z abierta con BglII(relleno)/NheI, proporcionando las construcciones Z-F[1,2] y Z-F[3] (Fig. 2). Para la construcción de expresión control, se eliminó de la construcción Z-F[1,2] el fragmento XmaI/BspEI, de 180 pb, que codifica la cremallera, proporcionando la construcción Control-F[1,2] (Fig. 2).

Creación de mutantes de estabilidad

Se realizó una mutagénesis dirigida^{30} para producir mutantes en Ile114 (numeración de la DHFRm silvestre). La reacción de mutagénesis se llevó a cabo en el fragmento KpnI/BamHI de la construcción Z-F[3] subclonada en pBluescript SK+ (Stratagene) usando oligonucleótidos que codifican una mutación silenciosa que genera un nuevo sitio BamHI. El fragmento NheI/EcoNI, de 206 pb, de los mutantes putativos identificados por restricción se volvió a subclonar en Z-F[3]. Las mutaciones se confirmaron mediante la secuenciación del ADN.

Ensayo de supervivencia de E. coli

La cepa de E. coli BL21, que lleva el plásmido pRep4 (de Qiagen, para la expresión constitutiva del represor lac), se hizo competente, se transformó con las construcciones de ADN adecuadas y se lavó dos veces con medio mínimo antes de sembrarla en placas con medio mínimo que contenía 50 mg/ml de kanamicina, 100 mg/ml de ampicilina y 0,5 mg/ml de trimetoprim. La mitad de cada mezcla de transformación se cultivó en ausencia y la otra mitad en presencia de IPTG 1 mM. Todas las placas se mantuvieron a 37ºC durante 66 h.

Curvas de crecimiento de E. coli

Se propagaron colonias obtenidas de la cotransformación y se usaron para inocular 10 ml de medio mínimo suplementado con ampicilina, kanamicina, así como con IPTG (1 mM) y trimetoprim (1 mg/ml) como se indicó. Los cotransformantes de Z-F[1,2] + Z-F[3:Ile114Gly] se obtuvieron en condiciones no selectivas sembrando la mezcla de transformación en placas de L-agar (+ kanamicina y ampicilina) y cribándolas respecto a la presencia de las dos construcciones mediante el análisis de restricción. Todas las curvas de crecimiento se realizaron por triplicado. Se retiraron periódicamente alícuotas para medir la densidad óptica. Se calculó el tiempo de duplicación para el crecimiento logarítmico temprano (DO 600 entre 0,02 y 0,2).

Sobreexpresión y purificación de proteínas

Las bacterias se propagaron en caldo de cultivo Terrific Broth^{31} en presencia de los antibióticos apropiados hasta una DO600 de aproximadamente 1,0. La expresión se indujo mediante la adición de IPTG 1 mM y la incubación posterior durante 3 h. Para el análisis del extracto bruto, los sedimentos de 150 ml de células inducidas se lisaron por ebullición en colorante de carga. Los lisados se clarificaron por microcentrifugación y se analizaron mediante SDS-PAGE^{32}. Para la purificación de las proteínas, se lisó por sonicación un sedimento celular de 50 ml de E. coli inducidas, cotransformadas con las construcciones Z-F[1,2] y Z-F[3], y se efectuó una purificación desnaturalizante del sedimento insoluble usando Ni-NTA (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. Las proteínas se eluyeron con un gradiente escalonado de imidazol. Las fracciones se analizaron mediante SDS-PAGE.

Resultados Diseño de los fragmentos de la DHFRm para un ECP

La DHFRm comparte una elevada identidad de secuencia con la DHFR humana (DHFRh). Puesto de las coordenadas de la estructura cristalina murina no estaban disponibles, los autores basaron sus consideraciones de diseño en la estructura de la DHFRh. Se ha descrito que la DHFR comprende tres fragmentos estructurales que forman dos dominios: el dominio de unión a adenina (F[2]) y un dominio discontinuo (F[1] y F[3])^{13,18}. La cavidad de unión a folato y el surco de unión a NADPH están formados principalmente por residuos pertenecientes a F[1] y F[2]. Los residuos 101 a 108 de la DHFRh forman un bucle desordenado que está situado en la misma cara de la proteína que los dos extremos terminales. Este bucle se produce en la unión entre F[2] y F[3]. Al cortar la DHFRm en el residuo 107, los autores crearon F[1,2] y F[3], afectando así mínimamente el sitio activo y los sitios de unión al sustrato. El extremo N-terminal nativo de la DHFRm y el nuevo extremo N-terminal creado por el corte se unieron covalentemente a los extremos C-terminales de las cremalleras de leucina de GCN4 (Fig. 1).

Ensayos de supervivencia de E. coli

La Figura 2 ilustra las características generales de las construcciones expresadas y la nomenclatura usada en este estudio. La Figura 3 (panel A) ilustra los resultados de la cotransformación de bacterias con las construcciones que codifican Z-F[1,2] y Z-F[3] en presencia de trimetoprim, que demuestran claramente que el crecimiento de las colonias bajo presión selectiva únicamente es posible en el caso de las células que expresan ambos fragmentos de la DHFRm. No hay crecimiento en presencia de Z-F[1,2] o Z-F[3] solos. La inducción de la expresión de proteínas con IPTG es esencial para el crecimiento de las colonias (Fig. 3A). La presencia de la cremallera de leucina en ambos fragmentos de la DHFRm es esencial, como se ilustra mediante la cotransfección de bacterias con ambos vectores que codifican los fragmentos de DHFRm de los cuales sólo uno lleva una cremallera de leucina (Fig. 3A). Cabe destacar que el crecimiento de E. coli control transformado con la DHFRm de longitud completa es posible en ausencia de IPTG debido a los bajos niveles de expresión en células no inducidas.

La confirmación de que ambos plásmidos están presentes en bacterias capaces de crecer con trimetoprim se obtuvo mediante el análisis de restricción del ADN plasmídico purificado de colonias aisladas. La Figura 4 (A) revela la presencia del fragmento de restricción HincII, de 1200 pb, de la construcción Z-F[1,2], así como de los fragmentos de restricción HincII, de 487 y 599 pb, de la construcción Z-F[3]. Asimismo está presente el fragmento HincII de pRep4, de 935 pb. En la Figura 4 (B) se ilustra la sobreexpresión de las proteínas de fusión. En todos los casos se observa en la SDS-PAGE del lisado bruto la sobreexpresión de una proteína del peso molecular esperado. La purificación de las proteínas coexpresadas en condiciones desnaturalizantes proporcionó dos bandas de homogeneidad evidente en el análisis por SDS-PAGE teñido con azul de Coomassie (Fig. 4B).

Mutantes de estabilidad

Los solicitantes generaron mutantes de F[3] para analizar si la reconstitución de la actividad de la DHFRm mediante el ensamblaje de los fragmentos era específica. La estabilidad de las proteínas se puede reducir cambiando el volumen de cadenas laterales en el núcleo hidrófobo de una proteína^{9, 22-25}. El residuo Ile114 de la DHFRm se encuentra en una cadena \beta en el núcleo, en la interfase entre F[1,2] y F[3], aislado del sitio activo. Ile114 presenta un contacto de van der Waals con Ile51 y Leu93 en F[1,2]^{11}. Los autores mutaron la Ile114 a Val, Ala o Gly. La Figura 3 (panel B) ilustra los resultados de la cotransformación de E. coli con la construcción Z-F[1,2] y las construcciones Z-F[3] mutadas. Las colonias obtenidas a partir de la cotransformación con Z-F[3:Ile114Ala] crecieron más lentamente que las cotransformadas con Z-F[3] o Z-F[3:Ile114Val] (véase el recuadro en la Fig. 3B). No se observó crecimiento de colonias en las células cotransformadas con Z-F[3Ile114Gly]. El número de transformantes obtenido no fue significativamente diferente en el caso en el que se observaron colonias, lo que implica que las células cotransformadas con Z-F[1,2] y Z-F[3], Z-F[3:Ile114Val] o Z-F[3:Ile114Ala] presentan la misma tasa de supervivencia. La sobreexpresión de los mutantes Z-F[3:Ile114X] se encontraba en el mismo intervalo que la de Z-F[3], como se determinó mediante SDS-PAGE teñido con azul de Coomassie (datos no mostrados).

Los autores también compararon la eficacia relativa del reensamblaje de los fragmentos de la DHFRm midiendo el tiempo de duplicación de los transformantes en medio líquido. El tiempo de duplicación en medio mínimo fue constante para todos los transformantes (datos no mostrados). La presión selectiva con trimetoprim en ausencia de IPTG impidió el crecimiento de E. coli excepto cuando se transformaron con pQE-16, que codifica la DHFR de longitud completa, debido a los bajos niveles de expresión en células no inducidas. La inducción de la expresión de los fragmentos de la DHFRm con IPTG permitió la supervivencia de las células cotransformadas (excepto en el caso de Z-F[1,2] + Z-F[3:Ile114Gly]), aunque los tiempos de duplicación aumentaron significativamente respecto al crecimiento en ausencia de trimetoprim. El tiempo de duplicación medido para las células que expresaban Z-F[1,2] + Z-F[3], Z-F[1,2] + Z-F[3:Ile114Val] y Z-F[1,2] + Z-F[3:Ile114Ala] fue, respectivamente, 1,6 veces, 1,9 veces y 4,1 veces mayor que el tiempo de duplicación de E. coli que expresaba pQE-16 en ausencia de trimetoprim e IPTG. La presencia de IPTG impidió, inesperadamente, el crecimiento de E. coli transformado con DHFRm de longitud completa. El crecimiento se restableció parcialmente mediante la adición de los productos finales del metabolismo de folato, timina, adenina, pantotenato, glicina y metionina (datos no mostrados). Esto sugiere que la sobreexpresión inducida de la DHFRm fue letal para E. coli cuando se cultivó en medio mínimo como resultado del agotamiento de la reserva de folato por la unión a la enzima.

En otra realización, los solicitantes realizaron mutaciones puntuales en la cremallera de leucina de GCN4 de Z-F[1,2] y Z-F[3], para la cual se conocen el equilibrio directo y los parámetro cinéticos, y estos valores conocidos se correlacionaron con parámetros derivados del ECP (Pelletier y Michnick, en preparación). La comparación de las tasas de crecimiento celular en este sistema modelo con las tasas de un ECP con la DHFR usando desconocidos proporcionará una estimación del poder de la interacción desconocida. Esto debería permitir estimar el equilibrio y los parámetros cinéticos para una interacción proteína-proteína específica.

La presente invención ha ilustrado y demostrado un ensayo de complementación de fragmentos proteicos (ECP) basado en la DHFRm, en el que una cremallera de leucina dirige la reconstitución de la actividad de la DHFR. La actividad se detectó mediante un ensayo de supervivencia de E. coli que es práctico y económico. Este sistema ilustra el uso de la complementación de fragmentos de la DHFRm en la detección de la dimerización mediante cremalleras de leucina y se podrá aplicar a la detección de interacciones proteína-proteína específicas desconocidas.

Aminoglucósido quinasa de E. coli: Optimización y diseño de un ECP usando una estrategia de exonucleasa/evolución molecular

Aunque los solicitantes han demostrado que la estrategia de ingeniería/diseño antes descrita se puede usar para producir fragmentos enzimáticos complementarios, es obvio que las proteínas no evolucionaron para poder esperar que tales fragmentos presentaran características físicas óptimas, incluidas la solubilidad, la plegabilidad (plegado rápido), la resistencia a proteasas o la actividad enzimática. Una realización alternativa de esta estrategia de ingeniería/diseño consiste en el planteamiento de endonucleasa/evolución. Esta estrategia se puede usar sola o junto con la estrategia de ingeniería/diseño. Las ventajas de este planteamiento residen en que, en principio, no es necesario conocer previamente la estructura de la proteína, en que se eligen los fragmentos óptimos para el ECP y en que estos fragmentos también presentarán características óptimas. Una vez seleccionados los fragmentos complementarios óptimos, los fragmentos se exponen a múltiples ciclos de mutagénesis aleatoria. La mutagénesis se consigue mediante una PCR subóptima combinada con una mutagénesis química o mezclando ADN (Stemmer, W.P.C. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 10747-10751). La estrategia general se describe para el caso de la aminoglucósido quinasa (AK), un ejemplo de marcador de resistencia a antibióticos que se puede usar para la selección dominante de células procarióticas, tales como E. coli, o de células eucarióticas, tales como levadura o líneas celulares de mamíferos. La estructura de la AK es conocida, de manera que sería posible usar la estrategia (1), pero los autores eligieron combinar la estrategia (1), como se definió anteriormente para la DHFR, con la estrategia (2).

Protocolo experimental

El procedimiento se optimización/selección es el siguiente:

Generación de una librería de fragmentos de la AK basada en productos de la digestión con exonucleasas

Se crean conjuntos de deleciones anidadas en los extremos 5' y 3' del gen de la AK. Con el fin de crear deleciones unidireccionales, se introducen sitios de restricción únicos en las regiones flanqueantes del gen de la AK. En los extremos 5' y 3' se añaden por PCR un sitio cohesivo "exterior", con un extremo 3' protuberante (Sph I y Kpn I, respectivamente), y un sitio cohesivo "interior", con un extremo 3' entrante (Bgl II y Sal I, respectivamente). La escisión con Sph I y Bgl II (o Kpn I y Sal I) da como resultado la creación de un extremo protuberante orientado hacia atrás, a la secuencia flanqueante, y un extremo entrante orientado hacia el gen de la AK. La digestión con la exonucleasa III y la nucleasa S1 de E. coli (Henikoff, S. (1987) Methods in Enzymology 155, 156-165) proporciona un conjunto de deleciones anidadas únicamente a partir del extremo entrante. Por lo tanto, se digieren 10 mg de ADN con Sph I y Bgl II (o Kpn I y Sal I), se extraen con fenol-cloroformo y se añaden 12,5 U de exonucleasa III. Se toman alícuotas a intervalos de 30 s durante 10 min y se introducen en una solución con 2 U de nucleasa S1. Los extremos recién creados se rellenan con la ADN polimerasa de T4 (0,1 U por muestra), y el conjunto de vectores se vuelve a cerrar mediante la ligación de extremos romos (10 U de ligasa por muestra). La longitud media de la deleción en cada momento se determina mediante un análisis de restricción de los conjuntos. Esto proporciona conjuntos de genes de la AK delecionados a partir de los extremos 5' o 3'. Esta manipulación se realiza directamente en las construcciones de cremallera de pQE-32, de manera que los productos se pueden usar directamente en el cribado respecto a la actividad.

Cribado respecto a la actividad de la AK

Como primer paso para determinar los requisitos necesarios para la complementación de fragmentos, los autores deben determinar los fragmentos N-terminal y C-terminal mínimos de la AK que son activos por sí solos. Los conjuntos de deleciones se transforman individualmente en células BL21 de E. coli, y la expresión de los fragmentos de AK se induce mediante IPTG. Los conjuntos en los que aparece un número significativo de colonias en presencia de G418 sirven para indicar la longitud aproximada de los fragmentos N- y C-terminales de la AK que conservan actividad. Por lo tanto, la complementación de fragmentos se ha de realizar con fragmentos escogidos entre estos límites. La complementación de fragmentos dirigida por la cremallera se detecta de la siguiente manera: se cotransforman BL21 con conjuntos apropiados de deleciones, o con mezclas de conjuntos, se induce la expresión con IPTG y se monitoriza el crecimiento en presencia de concentraciones variables de G418. Se seleccionan las colonias grandes que crecen en presencia de altas concentraciones de G418, puesto que producen los productos de complementación más eficaces.

Evolución dirigida de los fragmentos óptimos de la AK usando "mezclado de ADN"

Una vez seleccionados los fragmentos óptimos, los fragmentos individuales se eliminan por digestión de restricción con Sph I y Kpn I, proporcionando regiones cebadoras 5' y 3' constantes que flanquean los fragmentos complementarios N- o C-terminales de la AK. Estos oligonucleótidos (2 a 4 mg) se digieren con DNasa I (0,005 unidades/\mul, 100 \mul) y a partir de agarosa de bajo punto de fusión se extraen fragmentos de 10 a 50 nucleótidos. Después se lleva a cabo una PCR con el ADN fragmentado usando la polimerasa Taq (2,5 unidades/\mul) en una mezcla para PCR que contiene dNTP 0,2 mM, Cl_{2}Mg 2,2 mM (o 0 mM para una PCR subóptima), KCl 50 mM, Tris HCl 10 mM, pH 9,0, 0,1% de TritonX-100. Un programa de PCR de 60 s a 94ºC; 30 s a 94ºC; 30 s a 55ºC; 30 s a 72ºC, 30 a 50 veces; 5 min a 72ºC. Se toman muestras cada 5 ciclos después de 25 ciclos para controlar la aparición de fragmentos completos reensamblados en gel de agarosa. El producto de PCR sin cebador se diluye después 1:40 ó 1:60 y se usa como molde para la PCR, con oligonucleótidos 5', 3' complementarios a la región constante como cebadores para otros 20 ciclos. El producto final se digiere por restricción con Sph I y Kpn I, y los productos se vuelven a clonar en pQE32 con cremallera para proporcionar la librería final de plásmidos de expresión. Igual que antes, las células BL21 de E. coli se transforman sucesivamente con vectores de expresión de fragmentos C-terminales o N-terminales complementarios, con una eficacia estimada de 109, y, finalmente, las células se cotransforman con el fragmento complementario. E. coli se cultiva en placas de agarosa que contienen 1 mg/ml de G418, y al cabo de 16 horas se seleccionan las colonias más grandes y se cultivan en medio líquido a concentraciones crecientes de G418. Después se seleccionan aquellos clones que muestran la máxima resistencia a G418 y, cuando se alcanza la resistencia máxima o mayor, la evolución ha concluido. De lo contrario, se repite el procedimiento de mezclado de ADN. Finalmente, los fragmentos óptimos se secuencian, y se valoran las propiedades físicas y la actividad enzimática. Este ECP de AK optimizado está ahora listo para la selección dominante en cualquier otro tipo celular, incluidas las levaduras y las líneas celulares de mamíferos. Esta estrategia se puede usar para desarrollar cualquier ECP basado en enzimas que confieren selección dominante o recesiva a un fármaco o una toxina, o a enzimas que producen un producto teñido o fluorescente. En los dos últimos casos, el punto final del proceso de evolución consiste en el mínimo, en obtener de nuevo la señal para la enzima silvestre intacta o en potenciar la señal. Esta estrategia también se puede usar sin conocer la estructura de la enzima, independientemente de si la enzima presenta una estructura mono-, di- o multimérica. Sin embargo, el conocimiento de la estructura de la enzima tampoco impide aplicar esta estrategia, como se describirá más adelante.

Como se puede apreciar, el conocimiento de la estructura de la enzima se puede usar para proporcionar una forma más eficaz de usar la evolución molecular para diseñar un ECP. En este caso, la estructura de la enzima se usa para definir dominios mínimos de la proteína en cuestión, como se hizo para la DHFR. En lugar de generar fragmentos de longitud totalmente aleatoria para los fragmentos N- o C-terminales, los autores seleccionan, durante la fase de la exonucleasa, aquellos fragmentos que como mínimo codifican uno de los dos dominio. Por ejemplo, en el caso de la AK se pueden distinguir en la estructura dos dominios bien definidos que constan de los residuos 1 a 94 en el extremo N-terminal y de los residuos 95 a 267 en el extremo C-terminal. Las digestiones con las endonucleasas se realizan como anteriormente, pero se seleccionan los productos de reacción que codifican como mínimo uno de los dos dominios. Éstos constituyen entonces los puntos de partida para la selección de fragmentos y los ciclos de evolución descritos anteriormente.

ECP de enzimas heteroméricas

Otra realización más de la invención se refiere a un ECP basado en el uso de enzimas heterodiméricas o heteromultiméricas en las que toda la maquinaria catalítica está contenida en una subunidad que se pliega independientemente y la otra subunidad proporciona estabilidad y/o un cofactor para la subunidad enzimática. En esta realización del ECP, la subunidad reguladora se divide en fragmentos complementarios y se fusiona con proteínas que interactúan. Estos fragmentos se cotransforman/cotransfectan en células junto con la subunidad enzimática. Al igual que en los ECP de enzimas sencillas descritos para la DHFR y la AK, la reconstitución y detección de la actividad enzimática depende del reensamblaje, asistido por el dominio de oligomerización, de la subunidad reguladora a su topología nativa. Sin embargo, la subunidad reconstituida interactúa después con la subunidad enzimática intacta para producir actividad. Este planteamiento recuerda al sistema USPS, excepto por que presenta la ventaja de que la enzima no es en este caso una enzima celular constitutiva sino más bien un producto génico exógeno. Puesto que no hay problemas con la actividad de fondo de la célula huésped, la enzima se puede expresar en niveles más altos que un gen natural, y también se puede modificar para ser dirigida a compartimentos subcelulares específicos (subclonando péptidos de señalización específicos de compartimento en los extremos N- o C-terminales de la enzima y de fragmentos de la subunidad). La ventaja específica de este planteamiento reside en que, mientras la estrategia de la enzima sencilla puede producir una actividad enzimática subóptima, en este planteamiento la enzima se pliega independientemente y puede actuar de hecho como chaperona para la subunidad reguladora fragmentada, ayudándola a plegarse de nuevo. Además, el plegado de los fragmentos puede no tener que ser completo para conferir regulación a la enzima. Este planteamiento se realiza mediante un ensayo colorimétrico/fluorimétrico desarrollado por los autores, que se basa en la tirosinasa de Streptomyces. Esta enzima cataliza la conversión de la tirosina en desoxifenilalanina (DOPA). La reacción se puede medir mediante la conversión de fluorocinil-tirosina en la forma de DOPA. La enzima activa consta de dos subunidades, el dominio catalítico (Melc2) y un dominio de unión a cobre (Melc1). Melc1 es una proteína pequeña de 14 kDa que es absolutamente necesaria para la actividad de Melc2. En el ensayo que los autores están desarrollando, la proteína Melc1 se divide en dos fragmentos que sirven de parte complementaria del ECP. Estos fragmentos, fusionados a los dominios de oligomerización, se coexpresan con Melc2, y la base del ensayo consiste en que la actividad de Melc2 depende de la complementación de los fragmentos de Melc1. También se pueden abordar las estequiometrías de complejos proteicos (es decir, si un complejo consta de dos o tres proteínas) de la siguiente manera. Se fusionan dos proteínas a los dos fragmentos de Melc1 y una tercera a Melc2 intacta. De este modo se puede demostrar que el complejo activo complementario mínimo de la tirosinasa requerirá los tres componentes y, por lo tanto, es necesario un trímero. Un aspecto clave de este planteamiento reside en que se pueden demostrar fácilmente interacciones específicas haciendo que un componente, específicamente la subunidad catalítica de fusión proteína-Melc2, dependa de los demás componentes mediante su infraexpresión en segundo plano respecto a las fusiones fragmento de Melc1-proteína sobreexpresadas.

ECP basado en la ruptura de multímeros

Aunque los solicitantes únicamente han descrito un ECP que comprende la complementación de fragmentos de proteínas intactas, dominios proteicos o subunidades, una realización alternativa se refiere a ECP basados en la ruptura de la interfase entre, por ejemplo, una enzima dimérica que requiere una asociación estable de las subunidades para poseer actividad catalítica. En estos casos, una mutagénesis selectiva o aleatoria en la interfase de las subunidades interrumpiría la interacción, y la base del ensayo consistiría en que los dominios de oligomerización fusionados a las subunidades proporcionaran la energía de unión necesaria para juntar las subunidades en una enzima funcional.

Diseño de los vectores para la aplicación a los ECP

En las estrategias del ECP expuestas se han usado hasta ahora estrategias de transformación de dos plásmidos para la expresión de los fragmentos complementarios. Este planteamiento presenta algunas ventajas, tales como el uso de diferentes marcadores de resistencia a fármacos para seleccionar la incorporación óptima de genes, por ejemplo en células transformadas o transfectadas, o la transformación óptima de los plásmidos en bacterias y el control de los niveles de expresión de los fragmentos del ECP usando diferentes promotores. Sin embargo, las estrategias de un solo plásmido presentan ventajas en cuanto a la simplicidad de la transfección/transformación. Los niveles de expresión de proteínas se pueden controlar de diferentes maneras, mientras que la selección de fármacos se puede lograr de una de las dos maneras: En el caso de los ECP basados en un ensayo de supervivencia en el que se usan enzimas que son ellas mismas marcadores de resistencia a fármacos, tales como la AK, y cuando la enzima complementa una ruta metabólica, tal como la DHFR, no es necesario incorporar genes de resistencia a fármacos adicionales en los plásmidos de expresión. Si, por el contrario, el ECP está basado en una enzima que produce un producto teñido o fluorescente, tal como la tirosinasa o la luciferasa de luciérnaga, el plásmido ha de expresar un gen de resistencia a fármacos adicional. La expresión de fragmentos complementarios del ECP y de las librerías de ADNc/genes diana fusionados se puede reunir en un solo plásmido en forma de operones individuales que están bajo el control de promotores inducibles o constitutivos separados, o se pueden expresar policistrónicamente. En E. coli, la expresión policistrónica se puede lograr usando secuencias de regiones intercodificantes conocidas; por ejemplo, los autores usan la región del operón mel, a partir del cual derivaron los genes melc1 y melc2 de la tirosinasa que han demostrado expresarse en altos niveles en E. coli bajo el control de un promotor fuerte (tac). Los genes también se pueden expresar e inducir a partir de promotores independientes, tales como tac y arabinosa. Para los sistemas de expresión mamíferos, los sistemas de un solo plásmido se pueden usar para la expresión tanto transitoria como estable en líneas celulares y para la expresión constitutiva o inducible. Asimismo se puede realizar un control diferencial de la expresión de una de las fusiones de fragmentos complementarios, normalmente del fragmento fusionado a un cebo, para minimizar la expresión. Esto será importante para reducir el fondo de interacciones inespecíficas. Ejemplos del control diferencial de la expresión de fragmentos complementarios incluyen las siguientes estrategias:

i) En la expresión policistrónica, la expresión, transitoria o estable, del segundo gen será forzosamente menos eficaz y, por lo tanto, puede servir por sí mismo para limitar la cantidad de uno de los fragmentos complementarios. De forma alternativa, la expresión del primer producto génico se puede limitar mediante una mutación en un sitio donador/de ayuste cadena arriba, mientras que el segundo gen se puede disponer bajo el control de un sitio de iniciación interno retroviral, tal como el del ECMV, para potenciar la expresión.

ii) Las parejas de fragmentos complementarios fusionados individuales también se pueden disponer bajo el control de promotores inducibles, disponibles todos ellos en el mercado, incluidos aquellos que están basados en el promotor de PhCMV*-1 que responde a Tet, y/o de elementos de respuesta a receptores esteroideos. En un sistema de este tipo se pueden activar los dos genes de fragmentos complementarios, y los niveles de expresión se pueden controlar mediante la expresión dependiente de la dosis del inductor, en estos casos la tetraciclina y las hormonas esteroideas.

Ejemplo 2 Aplicaciones de la estrategia del ECP para detectar nuevos productos génicos en rutas bioquímicas y para mapear estas rutas

Una de las ventajas más importantes de los ECP frente a otros procedimientos de cribado para identificar interacciones moleculares reside en que están diseñados para realizarlos tanto in vivo como en cualquier tipo celular. Esta característica es crucial si el objetivo de la aplicación de una técnica es identificar nuevas interacciones a partir de librerías y, simultáneamente, ser capaz de determinar si las interacciones observadas son biológicamente relevantes. El ejemplo detallado expuesto a continuación y otros ejemplos al final de esta sección ilustran la manera en que resulta posible validar interacciones con un ECP. Esencialmente, se logra de la siguiente manera. En las rutas bioquímicas, tales como la señalización mediada por receptores de hormonas, una cascada de reacciones químicas mediadas por enzimas se dispara a causa de algún acontecimiento, tal como la unión de una hormona a su receptor en la superficie de la membrana. Entonces se producen interacciones de enzimas con sustratos proteicos e interacciones proteína-proteína o proteína-ácido nucleico con sustratos modificados por enzimas. Estas cascadas de señalización bioquímicas sólo se producen en tipos celulares específicos y en líneas celulares modelo para el estudio de estos procesos. Por lo tanto, para detectar interacciones inducidas, por ejemplo con proteínas conocidas en una ruta con proteínas aún no identificadas, obviamente es necesario realizar tal cribado en líneas celulares modelo apropiadas y en el compartimento celular correcto. Para realizarlo, únicamente se puede usar de forma general la estrategia del ECP. Las técnicas de interacción proteína-molécula, tales como las técnicas de doble o triple híbrido en levaduras, no pueden usarse en un contexto en el que se producen tales acontecimientos, excepto en el caso límite de la interacción nuclear en levaduras o en las interacciones que no se disparan. Existen técnicas de doble híbrido en mamíferos con las que es posible detectar interacciones de proteínas inducibles, pero, de nuevo, únicamente si las proteínas implicadas se pueden activar simultáneamente, transportar al núcleo e interactuar con sus parejas. Los ECP no presentan estas limitaciones dado que no requieren una maquinaria celular adicional, disponible únicamente en compartimentos específicos. Un punto adicional consiste en que, al usar la estrategia del ACP en tipos celulares modelo apropiados, también es posible introducir controles positivos y negativos apropiados para estudiar una ruta concreta. Por ejemplo, para una ruta de señalización mediada por hormonas, es probable que se conozcan los agonistas y antagonistas de la señalización mediada por hormonas o mutantes dominantes negativos de las proteínas de la cascada de señalización que se encuentran cadena arriba o actúan en paralelo a los acontecimientos que se estén examinando en el ECP. Estos reactivos se pueden usar para determinar si las nuevas interacciones detectadas en el ECP son biológicamente relevantes. En general, pues, las interacciones que se detectan únicamente si se introduce la hormona pero no se observan cuando se introduce simultáneamente un antagonista, podrían permitir la hipótesis de que representan interacciones relevantes para el proceso que se está estudiando.

A continuación se describe en detalle una aplicación de la DHFR que ilustra estos puntos, así como ejemplos adicionales en los que se puede usar la estrategia del ECP.

Aplicación del ECP de la DHFR para el mapeo de rutas de transducción de señales mediadas por factores de crecimiento

Uno de los acontecimientos que más temprano se pueden detectar en la proliferación celular activada por factores de crecimiento es la fosforilación de serina en la proteína S6 de la subunidad ribosómica 40S. El descubrimiento de las serina/treonina quinasas que fosforilan específicamente la S6 ha contribuido considerablemente a la identificación de nuevas rutas de transducción de señales mediadas por mitógenos. La serina/treonina quinasa p70S6k se ha identificado como una fosforilasa específica de S6^{131-136}. La p70S6k es activada por la fosforilación de serina y treonina en sitios específicos en respuesta a diversas señales mitogénicas, que incluyen suero en células privadas de suero, factores de crecimiento que incluyen insulina y PDGF, y por mitógenos tales como ésteres de forbol. En los últimos cinco años se ha realizado un considerable esfuerzo para determinar cómo se activa la p70/p85S6k en respuesta a mitógenos. En la activación de la p70S6k se han implicado dos rutas mediadas por receptores, una asociada con la fosfatidilinositol-3-quinasa (PI(3)k) y la otra con la mTOR homóloga a la PI(3)k^{137-144}. La clave para entender esta propuesta reside en el hecho de que el papel que desempeñan estas enzimas en la activación de la p70S6k se determinó por medio de los efectos ejercidos por dos productos naturales sobre la fosforilación y la actividad enzimática: La rapamicina, que inhibe indirectamente la actividad de mTOR, y la wortmanina, que inhibe directamente la actividad de la PI(3)k. Asimismo es importante señalar que hasta la fecha no se ha identificado ninguna quinasa directa corriente arriba ni otras proteínas reguladoras de la p70S6k.

Las interacciones de la p70S6k con su sustrato conocido S6 se pueden estudiar como sistema de prueba para el ECP de la DHFR en E. coli y en líneas celulares de mamíferos. También se puede tratar de identificar nuevas interacciones con esta enzima que proporcionen nuevas ideas acerca de cómo se regula esta importante enzima. Puesto que la activación de la enzima es mediada por múltiples rutas que se pueden inhibir selectivamente con fármacos específicos, éste también es un sistema ideal para probar los ECP como procedimientos para distinguir entre interacciones proteína-proteína inducidas y constitutivas.

a) Prueba del ensayo de supervivencia de E. coli: Interacción de p70S6k con S6

Esta prueba es ideal puesto que la Km aparente (= 250 nM) de la p70S6k para la proteína S6^{145} es aproximadamente igual a la Kd para los péptidos formadores de cremalleras de leucina de GCN4 usados en el sistema de ensayo de los autores. Sin embargo, los autores tendrán que usar una forma constitutivamente activa de la enzima para sus pruebas. Una forma de la enzima, truncada en el extremo N-terminal, D77-p70S6k, es constitutivamente activa y se usará en estos estudios^{147}.

Metodología: La fusión D77-p70S6k-F[1,2] y la fusión D77-p70S6k-F[3], o F[1,2] y la fusión D77-p70S6k-F[3] (como control) se contransforman en E. coli y las células se cultivan en medio mínimo en presencia de trimetoprim. Las colonias se seleccionan y se expanden para analizar la actividad kinasa frente a las subunidades ribosómicas 40S y coexpresar las dos proteínas.

b) Modificación del ensayo de supervivencia de bacterias para el cribado de librerías: Identificación de nuevas proteínas que interactúan

El cribado de una librería de expresión para identificar interacciones con una diana dada (p70S6k-D77 en este caso) resultará sencillo con este sistema, dado que los únicos pasos implicados son: 1. Construcción de la librería de expresión de fusiones en forma de una fusión con el fragmento[3] de la DHFRm; 2. transformación de la librería en E. coli BL21 que porta pRep4 (para la expresión constitutiva del represor de lac; es necesario en el caso en que un producto proteico sea tóxico para las células) y un plásmido que codifica la fusión p70S6k-D77-[1,2]; 3. cultivo en medio mínimo en presencia de trimetoprim e IPTG; 4. selección de todas las colonias crecidas, propagación y aislamiento del ADN plasmídico, seguido de la secuenciación de los insertos de ADN; 5. purificación de los productos de fusión desconocidos mediante el marcador hexaHis y determinación del tamaño en SDS-PAGE.

Metodología

En la Figura 5 se ilustra la estrategia general. 1. Construcción de una librería de expresión direccional de fusiones:

(i) Producción de ADNc: Se puede aislar poli(A)+ ARN a partir de células BA/F3 (células linfoides B) puesto que estas células se han usado con éxito en el estudio de la cascada de activación de p70S6k sensible a rapamicina^{139}. Para enriquecer el ARNm de longitud completa, los autores purifican el ARNm por afinidad a través de la estructura 5' cap usando el procedimiento CAPture^{148}. Como cebador para la transcripción inversa se usa un "cebador conector": presenta una cola de poli(T) que sirve de cebador para la cola de ARNm poli(A) y un sitio XhoI para el uso posterior en la clonación direccional de los fragmentos. La primera cadena se metila. Después de sintetizar la segunda cadena y hacer los productos romos, se añaden "adaptadores de EcoRI". La digestión de los conectores con EcoRI y XhoI (los insertos están protegidos por metilación) proporciona ADNc de longitud completa listo para la inserción direccional en un vector abierto con EcoRI y XhoI. Puesto que el éxito del cribado de la librería depende en gran medida de la calidad del ADNc producido, los autores usan los procedimientos anteriores dado que han demostrado producir sistemáticamente librerías de ADNc de alta calidad.

(ii) Inserción del ADNc en los vectores: La librería se construye en forma de fusión C-terminal con F[3] de la DHFRm en el vector pQE-32 (Qiagen), puesto que con este vector se obtuvieron altos niveles de expresión de las fusiones de DHFRm en células BL21. Se crean tres vectores de este tipo que difieren en su extremo 3', que es el nuevo sitio de policlonación que crearon los autores (descrito anteriormente, en el punto Procedimientos) y que lleva 0, 1 ó 2 nucleótidos adicionales. Esto permite leer de principio a fin, desde F[3] hasta los fragmentos de la librería, en los 3 marcos de lectura traduccionales. Los fragmentos de ADNc se insertan direccionalmente en los tres vectores a la vez, en los sitios EcoRI y XhoI.

2, 3, 4 y 5: Estos pasos se describieron con anterioridad, en el punto Resultados, excepto la secuenciación final de los clones identificados usando cebadores de secuenciación específicos para las secuencias vectoriales que flanquean los sitios de inserción de la librería. La purificación de las proteínas también se realiza según se describió anteriormente, mediante una purificación de un solo paso en Ni-NTA (Qiagen). Si el tamaño del producto superaba en más de 15 kDa el peso molecular del componente DHFR (igual a un inserto de ADNc de más de 450 pb), los autores secuenciaron los insertos en el Sheldon Biotechnology Center (McGill University).

c) Desarrollo de un ensayo eucariótico

La transformación del sistema antes descrito resulta útil para desarrollar un ensayo equivalente para uso en células eucarióticas. El principio básico del ensayo es el mismo: los fragmentos de la DHFRm se fusionan con dominios que se asocian, y la asociación de los dominios se detecta mediante la reconstitución de la actividad de la DHFR en células eucarióticas (Figura 5).

Creación de las construcciones de expresión: Los fragmentos de ADN que codifican las fusiones cremallera de GCN4-fragmento de DHFRm se insertaron enteros en pMT3, un vector eucariótico de expresión transitoria^{126}. La expresión de las proteínas de fusión en células COS quedó clara en SDS-PAGE después del marcado con ^{35}[S]Met.

Ensayos de supervivencia de células eucarióticas: Se pueden usar dos sistemas en paralelo para detectar el reensamblaje de la DHFRm:

(i) Se cotransfectan células CHO-DUKX B11 (línea celular de ovario de hámster chino con actividad DHFR deficiente) con las fusiones cremallera de GCN4-fragmento de DHFRm. Las células se cultivan en ausencia de nucleótidos; únicamente las células que llevan la DHFR reconstituida efectuarán una división celular y formarán colonias normales.

(ii) Se crearon mutantes de la DHFRm resistentes a metotrexato (MTX) con el fin de transfectar células que presentan una actividad DHFR constitutiva, tales como las células COS y 293. Los autores mutaron el F[1,2] con el fin de incorporar, de una en una, cada una de las cinco mutaciones que aumentan significativamente la Ki (MTX): Gly15Trp, Leu22Phe, Leu22Arg, Phe31Ser y Phe34Ser (numeración de acuerdo con la secuencia de la DHFRm silvestre). Estas mutaciones aparecen en distintas posiciones respecto al sitio activo y al F[3], y presentan diferentes efectos en la Km (DHF), la Km (NADPH) y la Vmax de las enzimas completas de mamíferos en las que están. Los mutantes Z-F[1,2: Leu22Phe], Z-F[1,2: Leu22Arg] y Z-F[1,2: Phe31Ser] permiten todos la supervivencia bacteriana con altas tasas de crecimiento cuando se cotransforman con Z-F[3] (resultados no mostrados). Los cinco mutantes se ensayan en células eucarióticas en cuanto a la reconstitución de los fragmentos de la DHFRm para producir una enzima que puede mantener el crecimiento de las células COS o 293 bajo la presión selectiva de MTX, que elimina el fondo debido a la actividad de la enzima nativa. Las mutaciones ofrecen una ventaja en la selección, mientras que no presentan ningún inconveniente aparente respecto al reensamblaje de la enzima activa. Si la DHFRm reconstituida producida en cualquiera de los ensayos de supervivencia permite el crecimiento de las células eucarióticas, que es significativamente más lento que el crecimiento con la enzima silvestre, se añade timidilato al medio de cultivo para aliviar parcialmente la presión selectiva ejercida por la falta de nucleótidos.

d) Prueba del ensayo de supervivencia eucariótico

En primer lugar es necesario comprobar si se pueden detectar las interacciones con p70S60k inducidas. Se puede usar el mismo sistema de prueba que el sistema de prueba de E. coli antes descrito: Inducción de la asociación de p70S60k con la proteína S6.

Metodología

Se cotransfectan el mutante Leu22Phe de DHFR S6-F[1,2] y p70S6k-F[3], o F[1,2] y p70S6k-F[3] (como control), en células COS y las células se privan de suero durante 48 horas, después de lo cual las células se vuelven a cultivar a baja densidad en suero y MTX. Las colonias se seleccionan y se expanden para el análisis de la actividad quinasa frente a las subunidades ribosómicas 40S y para la coexpresión de las dos proteínas. Se realizan controles adicionales respecto a la inhibición de la asociación de las proteínas con wortmanina y rapamicina.

e) Modificación del ensayo de supervivencia eucariótico para el cribado de librerías

Se ha realizado ya una parte importante del trabajo requerido para la creación de una librería para el uso en células eucarióticas, puesto que el ADNc direccional EcoRI/XhoI producido por el "Kit de síntesis de ADNc" de Stratagene se puede insertar directamente en el vector Zap Express® de Stratagene (Zap Express® es una marca registrada de Stratagene Corporation, La Jolla, CA, EE.UU.).

Metodología

Los pasos 1 a 5 son paralelos a los del cribado de librerías bacterianas (anteriormente). 1. De nuevo, la librería se construye en forma de fusión C-terminal con el F[3] de DHFRm. El F[3] (sin codón de terminación) se inserta en Zap Express®dentro del marco de lectura, seguido de la inserción de los nuevos policonectores que permiten las expresión de los insertos en los tres marcos de lectura (antes descrito) y del ADNc direccional EcoRI/XhoI. Esta librería de bacteriófagos se propaga y se trata con el fago auxiliar de Stratagene para escindir un vector de expresión fagómido eucariótico (pBK-CMV) que lleva los insertos de fusión. 2. Cotransfección de la librería y las construcciones p70S6k-F[1,2] en células eucarióticas: Los autores realizan el cribado en células COS o 293, ya que éstas responden al suero activando la vía de señalización de la p70S6k. Los experimentos de selección se llevan a cabo según se describió en el sistema de prueba de S6 anterior. 3. Se efectúa la propagación, el aislamiento y la secuenciación del ADN insertado. 4. El tamaño de las proteínas de fusión clonadas se determina en SDS-PAGE mediante la visualización directa tras el marcado con ^{35}S-Met/Cys o mediante transferencia Western usando un anticuerpo policlonal comercial para la DHFRm.

Generalización de la estrategia: El esquema para la detección de parejas para la proteína p70S6k se puede aplicar a estudios de cualquier ruta bioquímica en cualquier organismo vivo. Estas rutas también se pueden relacionar con procesos patológicos. La ruta relacionada con una enfermedad puede ser un proceso intrínseco de las células en los seres humanos en los que la patología resulta, por ejemplo, de la mutación, deleción o infra- o sobreexpresión de un gen. De forma alternativa, la ruta bioquímica puede ser específica de un organismo patógeno o el mecanismo de invasión del huésped. En este caso, las proteínas componentes de tales procesos pueden constituir dianas para una estrategia terapéutica, tal como el desarrollo de fármacos que inhiben la invasión por el organismo o una enzima componente de una ruta bioquímica específica del organismo patógeno.

Las enfermedades inflamatorias representan un caso que puede comprender ambos ejemplos. Se sabe que las interacciones proteína-proteína que median la adhesión de leucocitos a tejidos inflamados implican proteínas tales como la molécula de adhesión a células vasculares 1 (VCAM-1) y ciertas citocinas, tales como la IL-6 y la IL-8, que son producidas durante la inflamación. Sin embargo, muchas de las proteínas implicadas en la aparición de la respuesta inflamatoria siguen siendo desconocidas; además, las vías de señalización intracelular disparadas por la asociación extracelular no están muy claras. Los ECP se podrían usar para elucidar los mecanismos subyacentes a la aparición de la inflamación, así como la señalización subsiguiente. Por ejemplo, las vías se señalización asociadas con inflamación, tales como las que son mediadas por IL-1, IL-6, IL-8 y el factor de necrosis tumoral, se han estudiado con cierto detalle, y se conocen muchos reguladores directos y corriente abajo. Estos reguladores se pueden usar como dianas de partida en un cribado con un ECP para identificar otras proteínas de señalización o moduladoras que puedan constituir también dianas para el desarrollo de fármacos.

Existe un mayor riesgo de infección por agentes patógenos entéricos en el caso de la inflamación intestinal que caracteriza las enfermedades intestinales idiopáticas. Hay dos mecanismos que faltan por entender y que se pueden abordar mediante el ECP:

(i) Los mecanismos celulares de inflamación como se describió anteriormente y

(ii) el descubrimiento de los ligandos específicos en la superficie celular que reconocen los organismos patógenos y con los que se asocian. Las proteínas secretadas producidas por el agente patógeno se pueden unir a la membrana basolateral de las células epiteliales (como en el caso de una infección por Yersinia pseudotuberculosis) o translocarse al interior de células epiteliales intestinales (infección por Salmonella), provocando infectividad y/o respuestas fisiológicas frente a la infección. Sin embargo, en la mayoría de los casos, las interacciones entre la proteína patógena y las células epiteliales son desconocidas.

Adhesión celular y regeneración del sistema nervioso: Un ejemplo relacionado de la adhesión celular incluye los procesos implicados en el desarrollo y la regeneración del sistema nervioso. Las cadherinas son proteínas de membrana que median la adhesión célula-célula dependiente de calcio. Para ello necesitan otra clase de proteínas citoplasmáticas, denominadas cateninas. Éstas forman un puente entre las cadherinas y el citoesqueleto. Las cateninas también son genes reguladores que controlan los genes específicos de la diferenciación. Por ejemplo, la proteína \beta-catenina puede interactuar en ciertas situaciones con un factor de transcripción (lef-1) y translocarse al interior del núcleo, en el que restringe el número de genes transactivados por lef-1 (diferenciación). Este proceso es regulado por la vía de señalización Wnt (homóloga a la ruta sin alas en drosófila) mediante la inactivación de GSK3B, que permite la degradación posterior de APC (una proteína adaptadora citoplasmática). Las estrategias del ECP se podrían usar para identificar nuevas proteínas implicadas en la regulación de estos procesos.

Las proteínas implicadas en procesos de integración vírica son ejemplos de dianas que se podrían ensayar para identificar inhibidores usando las estrategias del ECP. Los ejemplos para el virus VIH incluyen:

i) Inhibición de la integrasa o del transporte del complejo de preintegración: proteína Ma o vpr.

ii) Inhibición del ciclo celular en G2 mediante vpr (interacción mediante la ciclina B), causando la inducción de la apoptosis.

iii) Inhibición de la interacción de la gp160 (precursor de las proteínas de membrana) con furina.

Proteínas accesorias de VIH como diana terapéutica:

i) Vpr: Secuencia de localización nuclear (diana): Sitio de interacción de vpr con las fosfatasas A.

ii) vif: Interacción con vimentina (proteína asociada al citoesqueleto).

iii) Vpu: Degradación de CD4 en el RE mediada por la parte citoplasmática de Vpu.

iv) nef: Señal de miristoilación de Nef.

Ejemplo 3 Otros ejemplos de ensayos de complementación de fragmentos proteicos

En este ejemplo se ilustran otros ejemplos de ensayos. La razón para desarrollar estos ensayos reside en proporcionar estrategias de ECP alternativas que sean apropiadas para problemas específicos de la asociación de proteínas, tales como el estudio del equilibrio o de los aspectos cinéticos del ensamblaje. Asimismo es posible que, en ciertos contextos (por ejemplo, en tipos celulares específicos) o para ciertas aplicaciones, no funcione un ECP específico pero sí uno alternativo. A continuación se encuentran breves descripciones de cada una de las realizaciones de ECP alternativas.

1) Glutatión-S-transferasa (GST). La GST del gusano plano Schistosoma japonicum es una proteína monomérica pequeña (28 kDa) soluble que se puede expresar en células tanto procarióticas como eucarióticas. Se esclareció una estructura cristalina de alta resolución que sirvió de punto de partida para el diseño de un ECP. Se desarrolló un ensayo colorimétrico sencillo y económico para la actividad de la GST, que consistía en la conjugación reductora de glutatión reducido con 1-cloro-2,4-dinitrobencina (CNDB), un producto amarillo brillante. Los autores diseñaron un ECP basado en criterios estructurales similares a los que se usaron para desarrollar el ECP de la DHFR, usando cremalleras de leucina de GCN4 como dominios de oligomerización. Los cotransformantes de las fusiones cremallera-fragmento de GST se expresan en E. coli en placas de agar y las colonias se transfieren a papel de nitrocelulosa. La detección de la complementación de fragmentos se lleva a cabo mediante un ensayo en el que una mezcla de reacción de glutatión-CDNB se aplica en forma de aerosol sobre la nitrocelulosa y las colonias que expresan los fragmentos de GST coexpresados se detectan como imágenes amarillas.

2) Proteína fluorescente verde (GFP). La GFP de Aequorea victoria se ha convertido en uno de los marcadores de proteínas más popular para la expresión de genes. Esto se debe a que la proteína monomérica pequeña, de 238 aminoácidos, es intrínsecamente fluorescente a causa de la presencia de un cromóforo interno que resulta de la ciclación autocatalítica del esqueleto polipeptídico entre los residuos Ser65 y Gly67 y la oxidación del enlace de Tyr66. El cromóforo de la GFP absorbe la luz óptimamente a 395 nm y posee también un segundo máximo de absorción a 470 nm. Esta absorción biespecífica sugiere la existencia de dos conformómeros del cromóforo de baja energía cuya población relativa depende del entorno local del cromóforo. Un mutante, Ser65Thr, que elimina la isomerización (único máximo de absorción a 488 nm) emite una fluorescencia de 4 a 6 veces más intensa que el tipo silvestre. Recientemente, dos grupos han esclarecido la estructura de la GFP, convirtiéndola ahora en un candidato para el diseño de un ECP basado en la estructura que los autores ya han comenzado a desarrollar. Al igual que con el ensayo de la GST, todo el desarrollo inicial se realiza en E. coli, con secuencias formadoras de cremalleras de leucina de GCN4 como dominios de oligomerización. Se usa una detección directa de la fluorescencia mediante la observación visual bajo luz UV de amplio espectro. Los autores también probarán este sistema en células COS, seleccionando cotransfectantes mediante la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS).

3) Luciferasa de luciérnaga. La luciferasa de luciérnaga es una proteína de 62 kDa que cataliza la oxidación de la luciferina heterocíclica. El producto posee uno de los mayores rendimientos cuánticos para las reacciones de bioluminiscencia: se emite un fotón por cada molécula de luciferina oxidada. La estructura de la luciferasa se ha esclarecido recientemente, permitiendo el desarrollo de un ECP basado en la estructura. Al igual que con el ensayo de la GST, las células se cultivan en una matriz de nitrocelulosa. La adición de la luciferina a la superficie de la nitrocelulosa permite su difusión a través de las membranas citoplasmáticas y dispara la reacción de fotoluminiscencia. La detección se realiza inmediatamente sobre una película fotográfica. La luciferasa es un candidato ideal para un ECP: Los ensayos de detección son rápidos, económicos y muy sensibles, y utilizan un sustrato no radiactivo disponible en el mercado. El sustrato de la luciferasa, la luciferina, es capaz de difundir a través de la membrana citoplasmática (a pH ácido), permitiendo la detección de la luciferasa en células intactas. Esta enzima se usa actualmente como gen reportero en una diversidad de sistemas de expresión. La expresión de esta proteína está bien caracterizada en células bacterianas, mamíferas y vegetales, lo que sugiere que proporcionaría un ECP versátil.

4) Xantina-guanina fosforribosil transferasa (XGPRT). La enzima XGPRT de E. coli convierte la xantina en el monofosfato de xantina (XMP), un precursor de GMP. Puesto que la enzima de mamíferos hipoxantina-guanina fosforribosil transferasa (HGPRT) únicamente es capaz de usar hipoxantina y guanina como sustratos, se puede usar la XGPRT bacteriana como ensayo de selección dominante para un ECP para células cultivadas en presencia de xantina. Los vectores que expresan la XGPRT confieren a las células de mamíferos la capacidad de crecer en medio selectivo que contiene adenina, xantina y ácido micofenólico. La función del ácido micofenólico consiste en inhibir la síntesis de novo de GMP bloqueando la conversión de IMP a XMP (Chapman A.B. (1983) Molec. & Cellul. Biol. 3, 1421-1429). El único GMP producido proviene entonces de la conversión de xantina en XMP catalizada por la XGPRT bacteriana. Al igual que con la aminoglucósido fosfotransferasa, se pueden generar fragmentos de la XGPRT en base a la estructura conocida (véase la Tabla 1) usando la estrategia de diseño-evolución antes descrita, con fragmentos fusionados a las cremalleras de leucina de GCN4 como dominios de oligomerización de ensayo. Se cotransfectan las fusiones complementarias, y las proteínas se expresan de forma transitoria en células COS-7 o se expresan de forma estable en células CHO cultivadas en el medio selectivo. En el caso de las células CHO, las colonias se recogen y se vuelven a cultivar sucesivamente a concentraciones crecientes de los compuestos selectivos, con el fin de enriquecer las poblaciones de células que expresan eficazmente las fusiones a altas concentraciones.

5) Adenosina desaminasa. La adenosina desaminasa (ADA) está presente en cantidades mínimas en prácticamente todas las células de mamíferos. La ADA se puede usar en un ensayo de selección dominante aunque no sea una enzima esencial para el crecimiento celular. Es posible establecer condiciones de crecimiento en las que las células precisan de la ADA para sobrevivir. La ADA cataliza la conversión irreversible de nucleósidos de adenina citotóxicos en sus respectivos análogos de inosina no tóxicos. Cuando se añaden a las células concentraciones citotóxicas de adenosina o de análogos de adenosina citotóxicos, tales como 9-\beta-D-xilofuranosiladenina, la ADA es necesaria para el crecimiento celular para destoxificar el agente citotóxico. Las células que incorporan el gen de la ADA se pueden seleccionar después para la amplificación en presencia de bajas concentraciones de 2'-desoxicoformicina, un inhibidor de la ADA análogo al estado de transición de unión fuerte. La ADA se pueden usar, pues, para un ECP basado en la supervivencia celular (Kaufman, R.J. y col. (1986) Proc. of the Nat. Acad. Sci. (USA) 83, 3136-3140). Al igual que con los demás sistemas descritos anteriormente, se pueden generar fragmentos de ADA en base a la estructura conocida (véase la Tabla 1) usando la estrategia de diseño-evolución antes descrita, con los fragmentos fusionados a las cremalleras de leucina de GCN4 como dominios de oligomerización de ensayo. Se cotransfectan las fusiones complementarias, y las proteínas se expresan de forma transitoria en células COS-7 o se expresan de forma estable en células CHO cultivadas en el medio selectivo que contiene 2'-desoxicoformicina. En el caso de las células CHO, las colonias se recogen y se vuelven a cultivar sucesivamente a concentraciones crecientes de 2'-desoxicoformicina, con el fin de enriquecer las poblaciones de células que expresan eficazmente las fusiones a altas concentraciones.

6) Proteína de unión a bleomicina (gen de resistencia a zeocina). La zeocina, un miembro de la familia de antibióticos bleomicina/fleomicina, es tóxica para bacterias, hongos, plantas y células de mamíferos. La expresión del gen de resistencia a zeomicina confiere resistencia a bleomicina/zeocina. La proteína confiere resistencia uniéndose al fármaco y secuestrándolo, previniendo así su asociación y la hidrólisis del ADN. Berdy, J. (1980) en Amino Acid and Peptide Antibiotics, J. Berdy, ed. (Boca Raton, FL: CRC Press), págs. 459-497; Mulsant, P., Tiraby, G., Kallerhoff, J. y Perret, J. (1989 Somat. Cell. Mol. Genet. 14, 243-252). La proteína de unión a bleomicina (BBP) se puede usar entonces para un ECP basado en la supervivencia celular. Al igual que con los demás sistemas descritos anteriormente, se pueden generar fragmentos de ADA en base a la estructura conocida (véase la Tabla 1) usando la estrategia de diseño-evolución antes descrita, con los fragmentos fusionados a las cremalleras de leucina de GCN4 como dominios de oligomerización de ensayo. La BBP es un dímero pequeño (8 kDa) que se une a los fármacos a través de un sitio de unión en la interfase de las subunidades. Por esta razón, el diseño sería algo diferente en cuanto a que primero se generaría una forma de cadena sencilla del dímero fusionando dos genes de BBP con una corta secuencia que codifica un conector polipeptídico sencillo introducido entre las dos subunidades. En este caso, los fragmentos están basados en una corta secuencia de uno de los módulos de una subunidad, mientras que el otro fragmento está compuesto por la secuencia restante de la subunidad más la otra subunidad. Los experimentos de complementación y selección se realizan como se describió para los ejemplos anteriores, usando bleomicina o zeocina como fármacos selectivos.

7) Higromicina-B-fosfotransferasa. El antibiótico higromicina B es un aminociclitol que inhibe la síntesis de proteínas interrumpiendo la translocación y provocando errores de lectura. La enzima higromicina-B-fosfotransferasa de E. coli destoxifica las células fosforilando la higromicina B. Cuando se expresa en células de mamífero, la higromicina-B-fosfotransferasa es capaz de conferir resistencia a la higromicina B (Gritz, L. y Davies, L. (1983) Gene 25, 179-188). La enzima es un marcador de la selección dominante y se puede usar para un ECP basado en la supervivencia celular. Aunque no se conoce la estructura de la enzima, se sospecha que esta enzima es homóloga a la aminoglucósido quinasa (Shaw y col. (1993) Microbiol. Rev. 57, 138-163). Por lo tanto, es posible usar la estrategia combinada de diseño/evolución para desarrollar un ECP con esta enzima y realizar una selección dominante en células de mamífero seleccionando a concentraciones crecientes de higromicina B.

8) L-Histidinol NAD^{+} oxidorreductasa. El gen hisD de Salmonella typhimurium codifica la L-histidinol NAD^{+} oxidorreductasa, que convierte el histidinol en histidina. Las células de mamífero cultivadas en medios que carecen de histidina pero contienen histidinol se pueden seleccionar respecto a la expresión de hisD (Hartman, S.C., R.C. Mulligan (1988) Proc. of the Nat. Acad. Sci. (USA) 85, 8047-8051). Una ventaja adicional del uso de hisD en la selección dominante reside en que el histidinol es tóxico por sí mismo, inhibiendo la actividad de la histidil-tRNA sintetasa endógena. El histidinol también es económico y penetra fácilmente en las células. La estructura de la histidinol NAD^{+} oxidorreductasa es desconocida y, de este modo, el desarrollo de un ECP basado en esta enzima se basa enteramente en la estrategia de fragmentos de exonucleasa/evolución.

La siguiente tabla enumera las realizaciones alternativas en las que se usan otros reporteros para el ECP. Abreviaturas en la tabla: Tipo: D, marcador de selección dominante; R, marcador de selección recesiva. Estructura: Códigos de cuatro letras = entradas en el Banco de Datos de Proteínas (PDB); K, conocida pero no depositada en el PDB; U, desconocida. Mono/oligo: M, monómero; D, dímero; tetra, tetrámero.

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TABLA 1

Lista de otros posibles candidatos para reporteros en el ECP A - Ensayos basados en la selección dominante o recesiva

1

2

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ii - Ensayos de placas virales

4

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B - Ensayos de muerte celular

5

6

C - Ensayo colorimétrico/fluorimétrico

7

8

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D - Estrategias con enzimas heteroméricas

9

Ejemplo 4 Ejemplos de variantes del ECP para detectar complejos multiproteicos/ proteína-ADN/ proteína-ARN/ proteína-fármaco

Hasta este momento únicamente se han proporcionado ejemplos específicos de las aplicaciones del ECP a interacciones entre parejas de proteínas. Sin embargo, es posible aplicar el ECP a interacciones multiproteicas, proteína-ARN, proteína-ADN o proteína-molécula pequeña. Existen dos esquemas generales para lograr tales sistemas. ECP para múltiples subunidades: No es necesario que interactúen dos proteínas para que se observe una señal en el ECP; si una proteína pareja o un complejo proteico se une a dos proteínas simultáneamente, es posible detectar un complejo de tres proteínas de este tipo. Un ECP para múltiples subunidades se concibe en el ejemplo de la timidina quinasa (TK), un homodímero de 40 kDa, del virus del herpes simple. En esta concepción, la estructura de la TK contiene dos dominios bien definidos que constan de un dominio alfa/beta (residuos 1-223) y de uno en alfa-hélice (224-374). Como sistema de ensayo los autores usaron el dímero Rop1, un homodímero de cuatro haces helicoidales. Los dos fragmentos de la TK se extrajeron por PCR y se subclonaron en el vector pMT3 de transfección transitoria, el primero en tándem respecto al principal promotor tardío de adenovirus, líder tripartito 3' respecto al primer ATG, y el segundo cadena abajo de un sitio de iniciación interno de ECMV. Los sitios de restricción introducidos previamente entre el primero y el último ATG se subclonan en los sitios de clonación BamHI/KpnI y PstI/EcoRI cadena abajo de los dos ATGs. Éstos se usan para subclonar los fragmentos generados por PCR de las subunidades de Rop1 en dos vectores diferentes. Seguidamente se cotransfectan células Ltk con los dos plásmidos mediante lipofección, y las colonias de células supervivientes se seleccionan en serie en medio que contiene concentraciones crecientes de HAT (hipoxantina/ aminopterina/ timidina). Las células que expresan los fragmentos complementarios de la TK fusionados con los cuatro Rop1 proliferarán bajo esta presión selectiva o, de no ser así, morirán. Ejemplos específicos del uso de este concepto consistirían en la determinación de los constituyentes de complejos multiproteicos que se forman de manera transitoria o constitutiva en las células.

La utilidad del ECP no está limitada a la detección de interacciones proteína-proteína, sino que se puede adaptar a la detección de interacciones de proteínas con ADN, ARN o moléculas pequeñas. En esta concepción, se fusionan dos proteínas con los fragmentos complementarios del ECP, pero las dos proteínas no interactúan entre sí. La interacción ha de ser desencadenada por una tercera entidad, que puede ser cualquier molécula que se una simultáneamente a las dos proteínas o que induzca una interacción entre las dos proteínas provocando un cambio conformacional en una o ambas parejas. En el laboratorio de los autores se demostraron dos ejemplos usando el ECP de la DHFRm en E. coli. En el primer caso se usa un producto natural, el fármaco inmunosupresor rapamicina, para inducir una interacción entre su receptor FKBP12 y una proteína pareja TORm (diana de rapamicina en mamíferos). Los autores la detectan por cotransformación de los fragmentos de la DHFR fusionados con FKBP o TORm en E. coli cultivado en presencia o ausencia de trimetoprim (como se describió anteriormente) y rapamicina (0 a 10 nM). Los autores demostraron que el mantenimiento del crecimiento, detectado mediante la formación de colonias, depende absolutamente de la adición de rapamicina, lo que sugiere que el ECP de la DHFRm detecta un ensamblaje de FKBP12-TORm inducido por rapamicina y la reconstitución siguiente de la actividad DHFR. Este es un ejemplo del uso de la estrategia del ECP para ensayar moléculas pequeñas que pueden inducir interacciones entre proteínas. Se puede aplicar de forma general al desarrollo terapéutico, en forma del cribado de librerías de compuestos combinatoriales de moléculas pequeñas respecto a moléculas que induzcan interacciones entre proteínas capaces de inhibir las actividades de una o ambas proteínas o de activar procesos celulares específicos que son iniciados por otros acontecimientos, tales como la dimerización del receptor mediada por un factor de crecimiento. El descubrimiento de tales moléculas pequeñas podría conducir al desarrollo de fármacos de administración oral para el tratamiento de un amplio espectro de enfermedades humanas.

Otro ejemplo de una interacción inducida que se ha estudiado con el ECP de la DHFR es la interacción del oncogen GTPasa p21 ras con su diana directa cadena abajo, la serina/treonina quinasa raf. Esta interacción se produce únicamente cuando la GTPasa está en la forma unida a GTP, mientras que el cambio de GTP a GDP provoca la liberación del complejo. Al igual que con el complejo FKBP-TORm, los autores demostraron esta interacción inducida en E. coli. El ECP se puede usar de manera general para estudiar tales interacciones inducidas y para el cribado respecto a compuestos que liberen o impidan estas interacciones en estados patológicos. La interacción ras-raf misma podría representar una diana para una intervención terapéutica. Las formas oncogénicas de ras consisten en mutantes que son incapaces de renovar el GTP y que, por lo tanto, permanecen asociados permanentemente con ras activado. Esto provoca una señal constitutiva de crecimiento incontrolado que, en parte, tiene como resultado la oncogénesis. La identificación, mediante el ECP, de compuestos que inhiban este proceso sería de gran valor en el tratamiento amplio de cánceres. Otros ejemplos de aplicaciones multimoleculares del ECP pueden incluir la identificación de nuevas proteínas de unión a ADN o ARN. En su concepción más simple, se usa un motivo conocido de unión a ADN o ARN, por ejemplo el dedo de cinc del receptor de ácido retinoico, o una proteína sencilla de unión a ARN, tal como IF-1, respectivamente. Una parte del ECP consta del dominio de unión de la proteína al ADN o ARN fusionado con uno de los fragmentos del ECP (fragmento control). El fragmento complementario se fusiona con una librería de ADNc. Una tercera entidad la constituye el gen que codifica una secuencia que contiene un elemento que se sabe se une a la proteína control, y detrás de esta secuencia se codifica un segundo posible o conocido elemento regulador. Un sistema de ensayo consta de elementos tat/tar que controlan la elongación en la transcripción/traducción de los genes del VIH. Un ejemplo de aplicación consistiría en la identificación de elementos de unión a tat, que se ha propuesto existen en genomas eucarióticos y son capaces de regular genes de una manera igual o similar a la de los genes del VIH (SenGupta, D. J. y col. (1996) Proc. Natl. Acad. USA 6, 8496-8501).

Ejemplo 5 Ejemplos de aplicaciones del ECP al cribado de fármacos: Cribado de librerías combinatoriales de compuestos respecto a aquellos que inhiben o inducen la formación de complejos proteína-proteína/ proteína-ARN/ proteína-ADN A) Cribado de fármacos

Cribado de librerías combinatoriales de compuestos respecto a aquellos que inhiben o inducen la formación de complejos proteína-proteína/ proteína-ARN/ proteína-ADN. La estrategia del ECP se puede aplicar directamente para identificar moléculas potencialmente terapéuticas contenidas en librerías combinatoriales de moléculas orgánicas. Es posible realizar un cribado de alto rendimiento de tales librerías para identificar compuestos que inhiban o induzcan interacciones proteína-proteína o interacciones proteína-ADN/ARN (como se comentó anteriormente). Además, también es posible cribar respecto a compuestos que inhiban enzimas cuyos sustratos son otras proteínas, ADN, ARN o carbohidratos, como se comentará a continuación. En esta aplicación, las proteínas que interactúan/ parejas de sustratos proteicos o parejas de proteína-enzima control que se unen a ADN/ARN se fusionan con los fragmentos complementarios del ECP, y los plásmidos que portan estas parejas se transforman/transfectan en una célula junto con un tercer elemento de ADN o ARN, según lo requiera el caso. Las células transformadas/ transfectadas se cultivan en medio de cultivo líquido, en placas de microvaloración en las que cada pocillo se inocula con un único compuesto de una serie de compuestos sintetizados de forma combinatorial. La lectura de una respuesta depende del efecto del compuesto. Si el compuesto inhibe una interacción de proteínas, se obtiene una respuesta negativa (ninguna señal en el ECP es la respuesta positiva). Si el compuesto induce una interacción de proteínas, la respuesta es una señal positiva en el ECP. Los controles para los efectos inespecíficos de los compuestos incluyen: 1) La demostración de que el compuesto no afecta a la enzima del ECP misma (ensayo frente a células transfectadas con la enzima intacta silvestre usada como sonda para el ECP) y, en el caso de un ensayo de supervivencia celular, de que el compuesto no es tóxico para las células que no se han transformado/transfectado. Además de proporcionar un ensayo de alto rendimiento para la actividad biológica de compuestos, el ECP también ofrece la ventaja frente a los ensayos in vitro de que es un ensayo para la permeabilidad de la membrana celular para compuestos activos. Ejemplos específicos demostrados del ECP para el cribado de fármacos en el laboratorio de los autores incluyen la aplicación del ECP de la DHFR en E. coli a la detección de compuestos que inhiben dianas terapéuticamente relevantes. Éstas incluyen Bax/Bcl2, fkbp12/tor, ras/raf, el dominio de dimerización carboxilo terminal de la proteína de la cápsida del VIH-1, los dominios de dimerización de las lkB quinasas IKK-1 e IKK-2 (cremalleras de leucina y dominios hélice-bucle-hélice). En cada caso, las dos proteínas se subclonan 5' cadena arriba de F[1,2] o F[3] como se describió anteriormente. Los plásmidos que portan los fragmentos complementarios se cotransforman en células BL21. Se escogen las colonias de las placas con medio mínimo que contiene IPTG y trimetoprim y se cultivan en medio líquido en las mismas condiciones selectivas, y los caldos concentrados se congelan. Para un solo ciclo de cribado, se cultiva durante la noche en medio LB un cultivo preparado a partir de los caldos concentrados congelados. A cada pocillo de una placa de 384 pocillos se añaden alícuotas de 25 ml de un medio mínimo selectivo que contiene trimetoprim, ampicilina e IPTG. Después se inocula cada pocillo con 1 \mul de una muestra individual de una serie de compuestos (ArQuie Inc.) para obtener una concentración final de 10 \muM. Después se inocula cada pocillo con 2 ml del cultivo crecido durante la noche, y las placas se incuban a 37ºC en un baño agitador especialmente adaptado. Las placas se leen a intervalos de 2 horas en un lector de placas espectroscópico de absorción óptica acoplado a un ordenador con software para hojas de cálculo a 600 nm (dispersión) durante un periodo de 8 horas. Las tasas de crecimiento se calculan para cada pocillo a partir de las lecturas realizadas en cada momento individual y se comparan con una curva patrón. Un "éxito" se define como el caso en el que un compuesto individual reduce la tasa de crecimiento a un valor inferior al intervalo de confianza del 95% en base a la desviación típica para las tasas de crecimiento observadas en todos los pocillos de la placa de ensayo. Los "casi éxitos" se definen como aquellos casos en los que las tasas de crecimiento se encuentran dentro del intervalo de confianza del 95%. Para cada uno de los éxitos o casi éxitos se realizan los siguientes controles: El mismo experimento se lleva a cabo con células BL21 que se transforman con el vector vacío (y sin trimetoprim) o con el vector que porta el gen completo de la DHFRm, o con células cotransfectadas en las que la expresión de proteínas no es inducida por IPTG. Si en todos estos casos el compuesto no tiene efecto alguno, se puede concluir que rompe específicamente la interacción proteína-proteína que se está ensayando. Estos éxitos o casi éxitos validados se vuelven a ensayar después para establecer una curva de dosis-respuesta para el compuesto individual, variando las concentraciones de 1 pM a 1 mM en órdenes de magnitud de 10. La estrategia del ECP para el cribado de compuestos también se puede aplicar a los casos multiproteicos de proteína-ARN/ADN como se describió anteriormente, y se puede adaptar fácilmente al ECP de la DHFR o a cualquier otro ECP en E. coli o en versiones de los mismos ECP en levaduras. Este cribado también se puede aplicar a enzimas cuyas dianas son otras proteínas o ácidos nucleicos, para identificar parejas enzima/sustrato conocidas o parejas enzima/sustrato nuevas como se describe a continuación.

Las proteínas implicadas en los procesos de integración vírica son ejemplos de dianas que se pueden ensayar para identificar inhibidores usando las estrategias del ECP. Los ejemplos para el virus VIH incluyen:

Proteínas accesorias de VIH como diana terapéutica:

ii) vif: Interacción con vimentina (proteína asociada al citoesqueleto).

iv) nef: Señal de miristoilación de Nef.

Otras dianas generales para el cribado de fármacos pueden incluir proteínas relacionadas con enfermedades neurodegenerativas, tales como la alfa-sinucleína. Esta proteína se ha relacionado con el inicio temprano de la enfermedad de Parkinson, y actualmente también se ha implicado en la enfermedad de Alzheimer. También existen proteínas \beta-amiloides relacionadas con la enfermedad de Alzheimer.

Un ejemplo de las interacciones proteína-carbohidrato que constituirían una diana para el cribado de fármacos incluye las selectinas, que están implicadas generalmente en inflamaciones. Estas glicoproteínas de la superficie celular están implicadas directamente en la diapedesis.

Se pueden cribar numerosos genes supresores de tumores cuyas acciones son mediadas por interacciones proteína-proteína, para identificar posibles compuestos anticancerígenos. Éstos incluyen PTEN, un supresor de tumores implicado directamente en la formación de hamartomas. También está implicado en el cáncer de mama y de tiroides congénito. Otros genes interesantes supresores de tumores incluyen p53, Rb y BARC1.

Ejemplo 6 Ejemplos de aplicaciones de la estrategia del ECP para detectar interacciones enzima/sustrato

Los ejemplos antes descritos se usan para identificar nuevas interacciones moleculares que implican moléculas que meramente se unen entre sí. Sin embargo, la detección de los sustratos de enzimas también es completamente compatible con la estrategia del ECP, como se muestra a continuación:

i) Enzimas que forman complejos fuertes con sustratos proteicos o inducen un ensamblaje eficaz de los fragmentos del ECP o

ii) enzimas mutantes que se unen fuertemente al sustrato pero que no liberan el producto debido a que los residuos mutados están implicados en el ataque nucleofílico y/o en la liberación del producto (retención del sustrato).

Las enzimas pueden formar complejos fuertes con sus sustratos (Kd \sim1-10 mM). En estos casos, el ECP puede ser suficientemente eficaz para detectar tales interacciones. Sin embargo, incluso cuando esto no sea cierto, el ECP puede funcionar para detectar interacciones más débiles. En general, si la velocidad de catálisis y de liberación del producto es más baja que la velocidad del plegado/reensamblaje de los fragmentos complementarios del ECP, se habrá producido eficazmente un plegado y una reconstitución irreversibles de la actividad reportera del PCA. Por lo tanto, se detecta la señal del ECP incluso cuando la enzima y el sustrato ya no están interactuando. Por lo tanto, puede ser posible detectar nuevos sustratos de enzimas usando el ECP, independientemente de la Kd efectiva del sustrato o la velocidad de liberación del producto. En los casos en los que la liberación del producto es mucho más rápida que el ensamblaje/plegado de los fragmentos del ECP, se proporciona un planteamiento alternativo que consiste en generar mutantes "que retienen el sustrato" de la enzima de ensayo. Un ejemplo de este planteamiento se ha aplicado a la proteína tirosina fosfatasa PTP1B, para la cual se han generado mutantes que retienen el sustrato mediante la mutación del aspartato 181 nucleofílico a alanina, proporcionando una enzima catalíticamente inactiva pero capaz de formar complejos fuertes con un sustrato conocido, el receptor del EGF y otras proteínas desconocidas (Flint, A.J. y col. (1996) Proc. Natl. Acad. USA 94, 1680-1685). A continuación se proporciona una aplicación del uso del ECP para el cribado de parejas que interactúan con la PTP1B. Los autores usan el ECP basado en la aminoglucósido quinasa (AK) en células COS o 293 transfectadas de forma transitoria. El dominio catalítico de la PTP1B, mutado para retener el sustrato, se fusiona con el fragmento complementario N-terminal de la AK, mientras que se realiza una fusión C-terminal del otro fragmento de la AK con una librería de ADNc. Las células se cotransfectan con parejas complementarias de AK y se cultivan a concentraciones selectivas de G418. Al cabo de 72 horas, se escogen las colonias de células supervivientes y se realiza una PCR in situ usando cebadores diseñados para alinearse con las regiones flanqueantes 3' y 5' de la región codificante del ADNc. Después se secuencian en dirección 5' los productos amplificados mediante la PCR para identificar el gen.

Inhibidores de enzimas: Cribado de librerías combinatoriales de compuestos para identificar a aquéllos que inhiben los complejos enzima-sustrato PROTEICO con:

i) Enzimas que forman complejos fuertes con sustratos proteicos o

ii) enzimas mutantes que se unen fuertemente al sustrato pero que no libera el producto debido a la mutación.

Ejemplo 7 Aplicaciones de la estrategia del ECP a la evolución/ingeniería de proteínas

La estrategia del ECP se puede usar para generar péptidos o proteínas con nuevas propiedades de unión que pueden tener un valor terapéutico, como se está haciendo en la actualidad con la tecnología de exposición en fagos. También es posible desarrollar enzimas con nuevas propiedades físicas o de sustrato para el desarrollo industrial de enzimas. A continuación se proporcionan dos ejemplos detallados de la aplicación de la estrategia del ECP a estas finalidades, con aplicaciones adicionales expuestas a continuación.

1) Selección de secuencias de cremalleras de leucina heterodimerizantes de alta afinidad (J. Pelletier, K. Arndt, A. Plueckthun y S. Michnick, manuscrito en preparación). Se usó el ECP de la DHFRm antes descrito en un esquema para la selección de cremalleras de leucina diseñadas, eficaces en la heterodimerización. Se ha propuesto que la formación de puentes salinos entre residuos de carga positiva y negativa en las posiciones de complementación "e" y "g" es importante para estabilizar la formación de las cremalleras de leucina, aunque se ha disputado esta opinión. Con el fin de ayudar a definir la importancia de la formación de puentes salinos en las posiciones "e" y "g", se construyeron dos librerías de cremalleras de leucina. Ambas se basan en la secuencia de la cremallera de leucina de GCN4 pero contienen información de secuencia específica para las cremalleras de Jun o Fos con el fin de crear parejas heterodimerizantes. Asimismo, las posiciones e-1 a e-4 y g-1 a g-4 de cada librería se aleatorizaron para codificar residuos de carga positiva o negativa o residuos neutros polares. Estas librerías se amplificaron por PCR y se subclonaron en las construcciones Z-F[1,2] o Z-F[3] (antes descritos) de las cuales se eliminaron las secuencias de la cremallera de GCN4. Se realizó la selección mediante el ECP bacteriano con DHFRm en medios sólidos selectivos como se describió anteriormente. Se escogieron las colonias y se secuenciaron; el análisis de las secuencias reveló que la distribución de los residuos cargados o neutros en las parejas e-g no es aleatoria sino que se inclina hacia el apareamiento de cargas opuestas o el apareamiento de un residuo cargado con uno neutro en lugar de hacia el apareamiento de cargas iguales (véase la Figura 7). Los autores siguieron el razonamiento de que un mejor apareamiento de la cremallera conduciría a un aumento en la eficacia de la complementación de los fragmentos de la DHFR, dando como resultado unos tiempos de duplicación bacteriana más cortos (véase la Tabla 1 en la descripción del ECP con la DHFRm), y llevaron a cabo una selección/enriquecimiento de las cremalleras nuevas respecto a las de GCN4 de la siguiente manera. Se cotransformaron las librerías de cremalleras diseñadas, expresadas como fusiones N-terminales con el F[1,2] o F[3] de la DHFR, se escogieron los clones, se propagaron y se mezclaron en un medio de cultivo líquido selectivo, y la mezcla se añadió al clon Z-F[1,2] + Z-F[3:I114A] (cremalleras de leucina originales de GCN4) en una relación de 1:1.000.000. La mezcla se propagó en un medio de cultivo líquido selectivo durante múltiples pasadas. El análisis de restricción muestra que en 4 pasadas la población de las bacterias que expresan GCN4 disminuye en relación con las nuevas secuencias de cremallera (datos no mostrados), lo que indica que algunos de los clones que contienen cremalleras diseñadas se propagan a una velocidad mayor que los que contienen GCN4. Las bacterias de pasadas posteriores se cultivaron en placas en medio selectivo, y se secuenciaron clones individuales para revelar la identidad de las parejas de cremalleras diseñadas de mayor éxito (datos no mostrados).

2) Aplicación del ECP a la función y el diseño enzimáticos. Desarrollo del ECP: La adenosina desaminasa (ADA) cumple todos los criterios antes expuestos para un ECP. La ADA es una metaloenzima monomérica con cinc pequeña (\sim40 kDa) y fácilmente purificable, y se ha esclarecido la estructura de la ADA murina. Se han desarrollado diversos ensayos in vitro de la actividad de la ADA, que implican espectrofotometría UV y fluorimetría de flujo detenido. La ADA de E. coli cataliza la conversión irreversible de nucleósidos de adenina citotóxicos en inosinas no tóxicas.

Las células eucarióticas o procarióticas propagadas en presencia de concentraciones citotóxicas de adenosina o de análogos de adenosina requieren la ADA para destoxificar estos compuestos. Esta es la base de una estrategia de selección dominante usada para seleccionar células que expresan un gen específico en células de mamífero. El gen de la ADA también se ha expresado en células de E. coli SF3834, que carecen del gen que codifica la ADA endógena. Cuando el gen que codifica la ADA se introduce en ADN bacteriano, las células que expresan la ADA son capaces de sobrevivir a altas concentraciones de adenosina añadida; las que no lo hacen, mueren. Esto constituye la base para un ensayo de la actividad de ADA in vivo.

Los autores eligieron la ADA principalmente porque se puede usar como marcador de selección dominante en células bacterianas y de mamífero en las que el gen se ha eliminado. La razón por la que los autores eligieron genes de selección dominante reside en que en el cribado respecto a nuevas interacciones proteína-proteína, concretamente en el ensayo de las interacciones de una proteína conocida frente a una librería de millones de clones independientes, la selección sirve de filtro para las células que pueden mostrar una respuesta positiva por otros motivos que no tienen nada que ver con una interacción proteína-proteína específica. Los autores usaron tres sistemas de ensayo para proteínas que interactúan, que incluyen las secuencias que forman la cremallera de leucina, las proteínas raf y p21 y el sistema de oligomerización inducida, la proteína de unión a FK506 (FKBP) y TORm, que interactúan a través del compuesto macrocíclico inmunosupresor rapamicina. Para todos estos sistemas los autores construyeron plásmidos de transfección transitoria en E. coli y células de mamífero y subclonaron las proteínas de ensayo en forma de fusiones con fragmentos complementarios de la ADA. El ensayo primario consiste en la supervivencia de las células de E. coli SF3834 que han sido transformadas con los fragmentos complementarios de ADA fusionados con las proteínas de oligomerización de ensayo en presencia de concentraciones tóxicas de adenosina. Después se purifican las proteínas de fusión a partir de las colonias y se llevan a cabo ensayos in vitro de la actividad de la ADA como se describe a continuación. La utilidad del ECP con ADA como procedimiento para identificar proteínas nuevas que interactúan con un cebo de ensayo se muestra en las células de mamífero COS-7 y HEK-293T transfectadas de forma transitoria con la FKBP fusionada con uno de los fragmentos de la ADA y el otro fragmento fusionado con una librería de ADNc procedente de bazo humano normal que contiene 10^{6} clones independientes. Al igual que con el ensayo en E. coli, se recogen las células que sobreviven en un medio que contiene concentraciones tóxicas de ADA y los plásmidos aislados se ensayan para identificar el gen de la proteína que interactúa mediante técnicas de amplificación por PCR y terminación de cadena.

Motivos estructurales necesarios para la función de la proteína: La determinación de los elementos estructurales necesarios para la función enzimática de la ADA se realiza alterando las estructuras de los fragmentos de la enzima. En primer lugar, la ADA se corta en dos dominios separados, uno de ellos responsable de la unión al sustrato (residuos 1 a 210) y el otro responsable de la catálisis (residuos 211 a 352). Estos trozos separados se unen a dominios de ensamblaje conocidos, tales como cremalleras de leucina (véase el ejemplo 1 anterior). El reensamblaje restablece la actividad, la cual se valora mediante un análisis cinético detallado in vitro de las propiedades de unión y catalíticas de la enzima reensamblada, usando espectrofotometría UV y fluorimetría de flujo detenido para observar las reacciones enzimáticas. Este sistema constituye otra posibilidad para manipular la actividad enzimática, que proporcionará una poderosa herramienta para el estudio de los mecanismos enzimáticos. Por ejemplo, la diferencia en el comportamiento cinético entre la enzima reensamblada después de mezclarla con el sustrato y la enzima reensamblada en presencia del sustrato (donde el sustrato puede estar unido ya al dominio de unión) permitirá realizar un estudio sofisticado sobre la importancia de la energía de unión en la catálisis. Mutaciones puntuales posteriores en los dominios funcionales o de ensamblaje de las proteínas permitirá entonces obtener perturbaciones muy sutiles y una cuantificación detallada de la relación entre la energía de unión y la catálisis. Este control preciso de la estructura y el ensamblaje de dominios funcionales separados de la enzima permitirá realizar estudios muy sofisticados sobre la estructura y función enzimáticas, definir motivos estructurales y comprender su papel en la catálisis.

Diseño de nuevos catalizadores proteicos: El conocimiento detallado del mecanismo enzimático adquirido a partir de la determinación de los requisitos estructurales para la catálisis se puede explotar mediante la combinación de estos "bloques constructivos" funcionales con los motivos funcionales responsables de la unión al sustrato y de la catálisis en otras enzimas, lo que permite la generación de nuevos catalizadores proteicos. Por ejemplo, el motivo catalítico de la ADA se modifica para dar un motivo de unión a citidina, creando una enzima nueva con propiedades catalíticas potencialmente útiles. La actividad de estas nuevas enzimas se puede valorar fácilmente mediante ensayos in vivo similares a los del sistema de ECP o mediante ensayos de actividad in vitro. Además, la investigación detallada del mecanismo de las enzimas resultantes, posiblemente con este sistema, permitirá realizar un diseño racional de cada una de las generaciones siguientes de catalizadores.

Ejemplo 8 Ejemplos de aplicaciones de la estrategia del ECP para detectar interacciones moleculares en organismos completos

Resulta lógico extender las descripciones de las aplicaciones anteriores del ECP a la utilidad de estas técnicas en organismos modelo completos, tales como, por ejemplo, drosófila, nemátodos, pez cebra y pez globo. Las únicas diferencias respecto a los otros ejemplos expuestos reside en que los vectores usados tendrán que ser diferentes (por ejemplo, vectores retrovíricos) y en que cualquier sustrato necesario para el ECP tendrá que estar biodisponible o la detección tendrá que realizarse in situ.

Ejemplo 9 Ejemplos de aplicaciones de la estrategia del ECP a la terapia génica

Otra realización importante de la invención consiste en proporcionar un medio y un procedimiento para la terapia génica de enfermedades en mamíferos. De especial interés es el uso terapéutico del ECP para el tratamiento del cáncer. En una realización de dicha terapia génica con el ECP, se desarrolla un ECP que usa fragmentos (unidades proteicas modulares) procedentes de una toxina proteica, por ejemplo: la exotoxina de Pseudomonas, la toxina diftérica y la toxina vegetal gelonina, u otras moléculas similares. Para el tratamiento del cáncer de mama, por ejemplo, se prepara en primer lugar una construcción génica cromosómica artificial eucariótica (EAC), de mamífero, de retrovirus o de adenovirus que introduce un fragmento de la toxina seleccionada bajo el control del promotor para la expresión del oncogen erbB2. Se sabe que el oncogen erbB2 está sobreexpresado en el cáncer de mama y en las células de adenocarcinoma (D.J. Slamon y col., Science, 1989, 244, 707). El protooncogen HER2/neu (c-erbB-2) codifica un receptor transmembranal de factor de crecimiento con actividad proteína tirosina quinasa, de 185 kDa, de la subclase 1, la p185^{HER2}. Asimismo, el oncogen erbB2 humano está situado en el cromosoma 17, región q21, y comprende 4.480 pares de bases, y la p185^{HER2} sirve de receptor para un factor de crecimiento glicoproteico de 30 kDa secretado por las líneas celulares de cáncer de mama humano (R. Lupu y col., Science, 1990, 249, 1152).

El transgen se introduce in vivo o ex vivo en las células diana usando procedimientos conocidos para los expertos en la técnica, por ejemplo recombinación homóloga para insertar el transgen en el locus de interés por vía retroviral, adenoviral o EAC. Una segunda construcción génica comprende un gen de fusión que contiene un ADN diana que codifica una proteína que interactúa con el oncogen erbB2, descubierta mediante el proceso de ECP descrito en esta invención, y el "segundo" fragmento de la molécula de la toxina. Esta construcción se administra al paciente por medio de procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo como se muestra en las patentes de Estados Unidos nº 5.399.346 y 5.585.237, cuyo contenido completo se incorpora en la presente memoria por referencia. La expresión del transgen oncogen erbB2-fragmento de toxina descrito se encuentra ahora bajo el control del promotor constitutivo del oncogen. Las células tumorales que proliferan producirán, pues, un trozo de la toxina fusionado al oncogen erbB2. En presencia de la segunda construcción génica, que expresa la "proteína que interactúa con el oncogen erbB2 descubierta mediante el ECP - fragmento de toxina", se creará oncogen erbB2-fragmento de toxina A:proteína que interactúa-fragmento de toxina B que induce la muerte de las células tumorales objetivo a través de la creación de una toxina activa mediante la complementación de fragmentos proteicos, proporcionando así un tratamiento eficaz y eficiente para dicha enfermedad.

Esto se puede extender a otras enfermedades y a otras toxinas, usando las técnicas descritas y realizadas en esta invención.

Ejemplo 10 Ejemplos de aplicaciones de la estrategia del ECP para detectar interacciones moleculares in vitro

Cualquiera de las estrategias del ECP antes descritas se pueden adaptar a la detección in vitro. Sin embargo, a diferencia de los ECP in vivo, la detección se realiza con proteínas de fusión de fragmentos del ECP purificadas. Estos usos del ECP presentan un potencial para el uso en kits diagnósticos. Por ejemplo, el ensayo con la DHFR antes descrito, en el que los dominios de interacción son FKBP12 y TOR, se puede usar como prueba diagnóstica de las concentraciones de rapamicina para monitorizar la dosificación en pacientes tratados con este fármaco.

Como se mostró anteriormente, la presente invención:

1) Permite la detección de interacciones proteína-proteína in vivo o in vitro.

2) Permite la detección de interacciones proteína-proteína en contextos apropiados, tales como en un organismo, tipo celular, compartimento celular u orgánulo específico.

3) Permite la detección de interacciones proteína-proteína inducidas frente a constitutivas (por ejemplo, mediante un factor de crecimiento o inhibidor celular).

4) Es capaz de distinguir entre interacciones proteína-proteína específicas e inespecíficas controlando la sensibilidad del ensayo.

5) Permite la determinación de la cinética del ensamblaje de proteínas en las células.

6) Permite el cribado de librerías de ADNc para identificar interacciones proteína-proteína.

Se pueden demostrar aspectos adicionales de la invención mediante la identificación de nuevas interacciones con la enzima p70S6k, para determinar su regulación y la manera en que diferentes cascadas de señalización convergen en esta enzima.

El procedimiento del ECP es especialmente útil para la determinación de la cinética del ensamblaje de proteínas en células. La cinética del ensamblaje de proteínas se puede determinar usando sistemas proteicos fluorescentes.

En una realización adicional de la invención, el ECP se puede usar para el cribado de fármacos. Las técnicas del ECP se usan para identificar fármacos que bloqueen rutas bioquímicas específicas en las células, proporcionando un procedimiento cuidadosamente dirigido y controlado para la identificación de productos que presentan propiedades farmacológicas útiles.

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Abreviaturas: ECP, ensayo de complementación de fragmentos proteicos; DHFRm, dihidrofolato reductasa murina; DHFRh, dihidrofolato reductasa humana; Z-F[1,2], cremallera de leucina de GCN4-fragmento[1,2] de la DHFRm; USPS, técnica de sensor de proteínas escindidas basado en ubiquitina; IPTG, isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido; PMSF, fluoruro de fenilmetilsulfonilo; SDS-PAGE, electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS.

Claims

1. Un ensayo de complementación de fragmentos proteicos para la detección de interacciones moleculares que comprende el reensamblaje de fragmentos separados de una proteína, en el que el reensamblaje de los fragmentos proteicos se efectúa mediante la interacción de dominios moleculares fusionados con cada fragmento proteico, en el que el reensamblaje de los fragmentos proteicos es independiente de otros procesos moleculares y en el que dicho reensamblaje se detecta por medio de la reconstitución de la actividad de dicha proteína.

2. El ensayo según la reivindicación 1, en el que la proteína es una proteína monomérica.

3. El ensayo según la reivindicación 1, en el que la proteína es una enzima.

4. El ensayo según la reivindicación 3, en el que la enzima es una enzima monomérica.

5. El ensayo según la reivindicación 3 ó 4, en el que la enzima presenta un peso molecular de 10 a 40 kDa.

6. El ensayo según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en el que la enzima es la glutatión-S-transferasa.

7. El ensayo según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en el que la enzima es la dihidrofolato reductasa.

8. El ensayo según la reivindicación 7, en el que la dihidrofolato reductasa se muta en el residuo de aminoácido 114.

9. El ensayo según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en el que la enzima es la luciferasa.

10. El ensayo según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en el que la enzima es la xantina-guanina fosforribosil transferasa.

11. El ensayo según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en el que la enzima es una adenosina desaminasa.

12. El ensayo según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en el que la enzima es una higromicina-B-fosfotransferasa.

13. El ensayo según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en el que la enzima es la L-histidinol NAD^{+} oxidorreductasa.

14. El ensayo según la reivindicación 2, en el que la proteína es una proteína fluorescente verde.

15. El ensayo según la reivindicación 14, en el que la proteína fluorescente verde se muta en el residuo de aminoácido 65.

16. El ensayo según la reivindicación 2, en el que la proteína es una proteína de unión a bleomicina (gen de resistencia a zeomicina).

17. Un procedimiento para la detección de interacciones proteína-proteína en organismos vivos no humanos y/o en células no humanas y/o en células humanas que se aíslan y/o cultivan, comprendiendo el procedimiento los siguientes pasos:

(b) construcción de proteínas de fusión que consisten en los fragmentos proteicos sonda unidos a dominios moleculares que se han de ensayar respecto a sus interacciones;

(c) coexpresión de las proteínas de fusión; y

(d) detección de la reconstitución de la actividad enzimática usando el ensayo de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 13.

18. El procedimiento según la reivindicación 17, en el que la coexpresión de las proteínas de fusión complementarias es catalizada por la unión de dichos dominios moleculares entre sí.

19. El procedimiento según la reivindicación 17 ó 18, en el que la enzima es la dihidrofolato reductasa.

20. El procedimiento según la reivindicación 19, en el que las proteínas de fusión presentan péptidos que consisten en los fragmentos N- y C-terminales de dicha dihidrofolato reductasa y están fusionadas con las secuencias de la cremallera de leucina de GCN4.

21. Un procedimiento para el cribado de una librería de expresión, que comprende la realización de un ensayo de complementación de proteínas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 en el que el medio de detección de dicho ensayo es la reconstitución de la actividad de la proteína.

22. El procedimiento según la reivindicación 21, en el que existe una interacción entre partes de una primera o una segunda molécula debido a la presencia de al menos una molécula adicional que media la interacción.