ES2247704T3 - Produccion aumentada de proteinas secretadas pro celulas de levadura rcombinantes. - Google Patents
Produccion aumentada de proteinas secretadas pro celulas de levadura rcombinantes.Info
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Abstract
Esta invención se refiere a tecnología de ADN recombinante. Específicamente, esta invención se refiere a nuevas células de levadura recombinantes transformadas con el gen SEB1. Las células de levadura transformadas con varias copias del gen SEB1, o que sobreexpresan la proteína Seb1 mediante algún otro medio, tienen una capacidad aumentada de producción de proteínas ajenas o endógenas secretadas. Además, las citadas nuevas células recombinantes, cuando se transforman con genes que expresan enzimas hidrolíticas adecuadas, pueden utilizar compuestos macromoleculares apropiados más eficazmente, lo que da como resultado una producción aumentada de masa celular y/o una utilización más versátil de los compuestos en aplicaciones biotécnicas relevantes.
Description
Producción aumentada de proteínas secretadas por
células de levadura recombinantes.
Este invento se refiere a la tecnología del ADN
recombinante. Específicamente, este invento se refiere a nuevas
células de levadura recombinantes transformadas con el gen
SEB1 o sus homólogos. Una célula de levadura transformada con
varias copias de un gen SEB1 o de un gen homólogo a
SEB1 tiene una capacidad aumentada para producir proteínas
foráneas o endógenas secretadas.
Además, dichas nuevas células de levadura
recombinantes, cuando se transforman con genes que expresan enzimas
hidrolíticas apropiadas pueden hidrolizar y/o utilizar compuestos
macromoleculares/polímeros apropiados más eficazmente, lo que da
como resultado la producción de masa celular aumentada y/o la
utilización más versátil de los compuestos en aplicaciones
biotécnicas relevantes.
El desarrollo de métodos de ADN recombinante ha
hecho posible producir proteínas en sistemas hospedantes
heterólogos. Esta posibilidad facilita mucho la producción de, p.
ej., proteínas de importancia terapéutica que se encuentran
normalmente en la naturaleza en cantidades muy bajas o que, de lo
contrario, son difíciles de aislar o purificar. Tales proteínas
incluyen factores de crecimiento, hormonas y otras proteínas o
péptidos biológicamente activos que tradicionalmente se han aislado
de tejidos o fluidos corporales humanos o animales, p. ej., suero
sanguíneo u orina. El peligro creciente de la presencia de virus
humanos patógenos tales como HBV, HIV y virus oncógenos, priones u
otros patógenos en los tejidos o fluidos corporales humanos o
animales ha acelerado mucho la búsqueda de sistemas de producción
heteróloga para estos agentes terapéuticos. Otras proteínas de
importancia clínica son proteínas virales u otras microbianas o de
parásitos humanos necesarias para diagnósticos y para vacunas,
especialmente de organismos tales que son difíciles de cultivar
in vitro o en cultivo de tejidos, o son patógenos humanos
peligrosos. Éstos incluyen virus como HBV, HIV, fiebre amarilla,
rubéola, FMDV, rabia y parásitos humanos como Plasmodium
falciparum, que causa malaria.
Un grupo adicional de proteínas para el que los
sistemas de producción heteróloga se han o se están desarrollando
son enzimas secretadas, especialmente aquellas que hidrolizan
material vegetal y que se necesitan en alimentos y producción de
pienso, así como en otros procedimientos industriales, incluyendo la
industria textil y la industria de la pasta papelera y el papel. La
posibilidad de producir proteínas en sistemas heterólogos o la
producción de proteínas endógenas en células modificadas por
ingeniería genética aumenta sus rendimientos y facilita mucho su
purificación y ha tenido ya anteriormente un gran impacto en
estudios de estructura y función de muchas enzimas y otras proteínas
importantes. La producción y secreción de enzimas hidrolíticas
foráneas en levaduras, por ejemplo, da como resultado mejoras en
los procedimientos basados en cepas de levadura industrial, tales
como levaduras de destilería, cervecería o panadería.
Se han desarrollado y se están desarrollando
varios sistemas de producción que incluyen bacterias, levaduras,
hongos filamentosos, cultivos celulares animales y vegetales e,
incluso, organismos multicelulares, como animales y plantas
transgénicos. Todos estos sistemas diferentes tienen sus ventajas,
aún cuando tengan desventajas, y todos ellos son necesarios.
La levadura Saccharomyces cerevisiae es en
este momento el eucariota mejor conocido a nivel genético. Su
secuencia genómica completa se hizo pública en las bases de datos
el 24 de abril de 1996. Como microbio eucariota posee las ventajas
de una célula eucariota, como la mayoría si no todas las
modificaciones postraduccionales de eucariotas, y como microbio
comparte las propiedades de facilidad de manejo y cultivo de las
bacterias. Los sistemas de fermentación a gran escala están bien
desarrollados para S. cerevisiae, la cual tiene una larga
historia como caballo de trabajo de la biotecnología, incluyendo la
producción de ingredientes alimentarios y de bebidas, como cerveza
y
vino.
vino.
Los métodos genéticos para levaduras son, con
mucho, los mejor desarrollados entre eucariotas basados en el
amplio conocimiento obtenido mediante genética clásica. Esto hizo
fácil adoptar y desarrollar más ampliamente los procedimientos de
tecnología génica para levaduras descritos por primera vez para
Escherichia coli. En otros términos, los métodos para
construir cepas de levaduras que producen proteínas foráneas se han
desarrollado substancialmente (Romanos et al., 1992).
La secreción de las proteínas dentro del medio de
cultivo comprende la transferencia de las proteínas a través de
varios compartimentos encerrados por membrana que constituyen la vía
secretora. Primero las proteínas se translocan dentro de la luz del
retículo endoplásmico, RE. De ahí en adelante las proteínas se
transportan en vesículas de membrana hasta el aparato de Golgi y
desde Golgi a la membrana plasmática. El procedimiento secretor
incluye varias etapas en las que las vesículas que contienen las
proteínas secretadas se escinden a partir de la membrana donadora,
se dirigen y fusionan con la membrana aceptora. En cada una de estas
etapas se precisa la función de varias proteínas diferentes.
Se han elucidado la vía secretora de levaduras y
un gran número de genes implicados en ella mediante aislamiento de
mutantes condicionales letales deficientes en ciertas etapas del
procedimiento secretor (Novick et al., 1990; 1991). La
mutación en una proteína, necesaria para una etapa de transferencia
particular da como resultado la acumulación de las proteínas
secretadas en el compartimento de membrana precedente. De este modo,
las proteínas pueden acumularse en el citoplasma, RE, Golgi o en
vesículas entre el RE y Golgi, o en vesículas entre Golgi y la
membrana plasmática.
Un análisis más detallado de los genes y
proteínas implicados en el procedimiento secretor ha sido posible
por clonación de los genes y caracterización de la función de sus
proteínas codificadas. Está surgiendo una descripción que indica que
en todas las etapas están funcionando varias proteínas que
interactúan. Está creciendo rápidamente el número de genes que está
implicado en la secreción de proteínas y que fue identificado
primero en y aislado a partir de S. cerevisiae y que luego se
encontró en otros organismos, incluyendo eucariotas inferiores y
superiores. La homología estructural y funcional se ha mostrado
para muchas de tales proteínas.
Los autores han clonado recientemente un nuevo
gen de levadura, SEB1 (Toikkanen et al., 1996), el
cual codifica la subunidad \beta del complejo trimérico Sec61 (de
ahí el nombre: SEB = SEc61 subunidad Beta) que es
probable que represente el canal conductor de proteína del RE, tanto
en translocación co- como post-traduccional (Hanein
et al., 1996). En el primero funciona en estrecha conexión
con el ribosoma y, en el último, forma un complejo heptámero de
proteína de membrana con el complejo tetrámero Sec62/Sec63 (Panzner
et al., 1995). Genes con similaridad de secuencia con el gen
SEB1 se encuentran en células vegetales y de mamíferos, lo
que indica que el complejo de translocación Sec61 está conservado
en la evolución. De hecho, componentes similares funcionan en la
translocación de proteínas también en procariotas (tratado en
Toikkanen et al., 1996). Esto apoya además el papel
conservado y central del gen SEB1 en la secreción de
proteínas y el transporte intracelular. Sin embargo, hasta la fecha
no existen publicaciones acerca de cualquier efecto positivo de
SEB1 o sus homólogos en la secreción en otras levaduras,
células vegetales o animales cuando se sobreexpresan; tal efecto se
muestra en este invento para el gen de levadura SEB1. Debe
advertirse que la proteína Seb1 está presente en un complejo
proteico diferente, así como en una localización diferente que las
proteínas Sso que los autores han mostrado anteriormente que
incrementan la producción de proteínas secretadas cuando están
presentes en las células en cantidades mayores que las
normales.
El conocimiento sobre el procedimiento de
secreción de proteínas en S. cerevisiae está creciendo
rápidamente. Se conoce menos acerca del sistema secretor de otras
levaduras como Kluyveromyces, Schizosaccharomyces,
Pichia y Hansenula las que, sin embargo, se han
mostrado hospedantes útiles para la producción de proteínas foráneas
(Buckholz y Gleeson, 1991; Romanos et al., 1992) o
Candida y Yarrowia que también son interesantes como
sistemas hospedantes. La genética y biología molecular de estas
levaduras no están tan desarrolladas como para
Saccharomyces, pero las ventajas de estas levaduras como
hospedantes de producción son las mismas que para
Saccharomyces.
Se han hecho y publicado anteriormente varios
intentos para aumentar la producción de proteínas foráneas en
levadura y hongos filamentosos, así como en otros organismos. Se ha
dedicado mucho trabajo a varias construcciones de promotor y
plásmido para aumentar el nivel de transcripción o el número de
copias de plásmido (véase, p. ej., Baldari et al.,
1987; Martegani et al., 1992; Irani y Kilgore, 1988). Un
planteamiento común para intentar y aumentar la secreción es
emplear secuencias de señalización de levaduras (Baldari et
al., 1987; Vanoni et al., 1989). La mutagénesis aleatoria
y el escrutinio para una proteína secretada (Smith et al.,
1985; Sakai et al., 1998; Shuster et al., 1989;
Suzuki et al., 1989; Sleep et al., 1991; Lamsa y
Bloebaum, 1990; Dunn-Coleman et al., 1991) o
la fusión de la proteína foránea a una proteína endógena secretada
eficazmente (Ward et al., 1990; Harkki et al., 1989;
Nyyssönen et al., 1993; Nyyssönen et al., 1992) se han
empleado ampliamente tanto para levadura como para hongos
filamentosos para hacer más eficaz la secreción de proteínas
foráneas. Ambos métodos son de uso limitado. Los mutantes de
sobreproducción aislados por mutagénesis aleatoria y selección son
casi exclusivamente recesivos y, por eso, no pueden transferirse en
cepas de levadura industriales que son poliploides. A menudo la
sobreproducción resulta de cambios distintos al aumento de secreción
y en muchos casos afecta sólo a la proteína empleada para el
escrutinio. El método de proteínas de fusión requiere adaptar la
construcción de la fusión a cada proteína foránea por separado. La
proteína de fusión, a menudo, no es funcional y por eso el producto
final debe liberarse por escisión proteolítica, lo que complica el
procedimiento de producción.
El método de los autores, aumentar el número de
copias de genes que funcionan en la secreción y, de ese modo, la
cantidad de componentes de la maquinaria secretora es más
universal: es aplicable a cualquier proteína sin construcciones de
fusión específicas, y aplicable a cepas diploides y
poliploides.
No se conoce exactamente qué etapas forman el
cuello de botella en el procedimiento secretor, pero puede
anticiparse que hay más de una etapa que puede convertirse en
limitante de la velocidad especialmente en condiciones de
sobreproducción. El gen SEB1 de acuerdo con el invento se
clonó empleando un método genético de levaduras y se mostró que
interacciona genéticamente con el gen SEC61, que codifica el
componente principal del complejo de translocación del RE. El hecho
de que la sobreexpresión del gen SEB1 aumente la producción
de proteínas secretadas dentro del medio de cultivo sugiere que la
proteína Seb1 es un componente limitante de la velocidad en el
procedimiento de translocación. Esto fue sorprendente dado que la
proteína Seb1 es un componente de un complejo multiproteico y el
efecto intensificador no requirió niveles aumentados de los otros
componentes del complejo y dado que el gen SEB1 no es
esencial para el crecimiento de la levadura. Esto podría significar
que hay otro gen que puede llevar a cabo la misma función que
SEB1. Los autores han aislado otro gen, SEB2, homólogo
de SEB1, pero la rotura de ambos SEB1 y SEB2
tampoco fue letal, lo que indica que la función de SEB1 no es
esencial para el crecimiento de la levadura.
El presente invento describe un método para la
producción mejorada de proteínas secretadas basado en la
sobreexpresión del gen SEB1 de Saccharomyces
cerevisiae previamente aislado. Específicamente, el presente
invento describe la construcción de cepas de S. cerevisiae
que sobreexpresan el gen SEB1 bien en un plásmido multicopia
o cuando está integrado en el genoma de la levadura en copias única
o múltiples o situado bajo regulación de un promotor potente.
Además, este invento describe la identificación de homólogos de
SEB1 de otras levaduras, y la detección de la proteína
homóloga de Seb1p en Kluyveromyces lactis.
Este invento proporciona, de este modo, nuevas
células de levadura recombinantes que expresan niveles aumentados
de la proteína Seb1 de S. cerevisiae.
Este invento proporciona también
procedimiento(s) para producir cantidades aumentadas de
proteínas secretadas por sobreexpresión de genes que interaccionan
con el gen SEB1, tal como SEC61.
Las células de levadura de acuerdo con el
invento, siendo transformadas con el gen SEB1 o con genes
que interaccionan con el gen SEB1, tienen una capacidad
aumentada para producir proteínas secretadas. Las nuevas células de
levadura, de acuerdo con el invento, pueden usarse también para la
producción más eficaz de enzimas hidrolíticas e hidrólisis de, p.
ej., sustratos polímeros, lo que da como resultado mejoras en los
procedimientos biotécnicos tales como la producción de una célula
única o de levadura de panadería, debido al aumento de masa celular
o en otros procedimientos donde la producción eficaz de enzimas
hidrolíticas y/o material vegetal de hidrólisis eficaz es
beneficioso.
La Fig. 1 muestra el vector YEpSEB1 de S.
cerevisiae en el que el ADNc del gen SEB1 está integrado entre
el promotor ADH1 y el terminador CYC1 en el plásmido
multicopia pMAC561.
La Fig. 2 muestra el análisis Western que
demuestra la sobreexpresión de la proteína Seb1 en levadura
transformada con YEpSEB1. Calle 1: cepa de sobreexpresión de
SEB1 transformada con el plásmido YEpSEB1. Calle 2: cepa de
sobreexpresión de SEB1 Trp-segregante. Calle 3:
cepa control (con el plásmido pMA56).
La Fig. 3 muestra la producción aumentada de
\alpha-amilasa de Bacillus secretada por
S. cerevisiae transformada con el plásmido multicopia YEpSEB1
que expresa SEB1 y con Yep\alphaa6 que expresa el gen
\alpha-amilasa de Bacillus. Crecimiento
(símbolos rellenos) y secreción de la
\alpha-amilasa (símbolos vacíos) en la levadura
transformante que sobreexpresa el gen SEB1 (YEp\alphaa6 y
YEpSEB1; cuadrados), en el transformante control
(YEp-\alphaa6 y pMA56; diamantes), en el
segregante YEpSEB1 (YEp\alphaa6; círculos) y en el transformante
\alpha-amilasa (YEp\alphaa6; estrellas).
La Fig. 4 muestra el análisis Western de la
\alpha-amilasa de Bacillus secretada por
S. cerevisiae con o sin el plásmido multicopia que expresa
SEB1. Calle 1: medio de cultivo del transformante YEpSEB1.
Calle 2: medio de cultivo de la cepa control. Calle 3: estándar de
\alpha-amilasa de Bacillus.
La Fig. 5 muestra la producción aumentada de
\alpha-amilasa de Bacillus secretada por
la cepa S. cerevisiae que contiene una copia integrada de un
gen de \alpha-amilasa de Bacillus y
transformada con el plásmido multicopia que expresa el gen
SEB1. La secreción de \alpha-amilasa de
Bacillus de la levadura integrante (símbolos vacíos):
transformante que sobreexpresa el gen SEB1 (YEpSEB1;
cuadrados), transformante control (pMAP56, círculos), segregante
YEpSEB1 (diamantes) y segregante pMA56 (estrellas). El crecimiento
de los transformantes de levadura se muestra con símbolos
rellenos.
La Fig. 6 muestra el casete de expresión
SEB1 flanqueado por secuencias ribosómicas integradas dentro
de BS+, generando el vector YrbSEB1.
Fig. 7. Identificación de homólogos de
SEB1 en otras especies de levaduras por hibridación
heteróloga bajo condiciones no estringentes. ADN genómico, digerido
por HindIII, de Saccharomyces cerevisiae (calle 1), de
Schizosaccharomyces pombe (calle 2), de Kluyveromyces
lactis (calle 3), de Pichia pastoris (calle 4), de
Pichia stipitis (calle 5), de Candida utilis (calle 6)
y de Yarrowia lipolytica (calle 7).
Fig. 8. Detección de la Seb1p y su homólogo en la
levadura K. lactis empleando un anticuerpo específico de
Seb1p. S. cerevisiae (calle 1), K. lactis (calle
2).
Para mejor entendimiento de la siguiente
descripción detallada del invento se dan las siguientes
definiciones de ciertos términos para emplearse posteriormente.
Genes homólogos, homólogos: genes que están
relacionados, pero no idénticos, en su secuencia de ADN y que
llevan a cabo la misma función son homólogos entre sí y se llaman
homólogos uno del otro.
Sobreexpresión de un gen: una proteína codificada
por dicho gen se produce en cantidades aumentadas en la célula. Esto
puede lograrse por aumento del número de copias del gen al
introducir copias extra del gen dentro de la célula en un plásmido
o integrado dentro del genoma. La sobreexpresión también puede
lograrse al situar el gen bajo un promotor más fuerte que su propio
promotor. La cantidad de la proteína en la célula puede variarse al
variar el número de copias del gen y/o la fuerza del promotor
empleado para la expresión.
Proteínas secretadas: proteínas que dentro de la
célula son dirigidas a la vía secretora y transportadas a través de
ella hacia el exterior de la célula, fuera de la membrana
plasmática, son denominadas proteínas secretadas. En levadura las
proteínas pueden permanecer asociadas con la pared celular, como la
invertasa, o pueden liberarse a través de la pared celular dentro
del medio de crecimiento, como la proteína foránea
\alpha-amilasa de Bacillus.
Supresión de una mutación: cuando el efecto de
una mutación en un gen dado se mitiga o anula por una mutación en
otro gen, el segundo gen se denomina supresor del primer gen. La
supresión puede ocurrir también por sobreexpresión del alelo
silvestre del segundo gen por los medios descritos anteriormente.
Esto se denomina supresión por sobreexpresión. Si la sobreexpresión
se produce por copias múltiples del gen supresor, la supresión
puede también denominarse supresión por multicopia. El fenómeno de
supresión indica que estos dos genes interaccionan a nivel
genético. La interacción puede también ocurrir a nivel físico como
contacto físico directo entre las dos proteínas codificadas por los
genes que interaccionan.
Transformante/segregante: cuando la levadura se
transforma con un plásmido se denomina transformante, es decir, una
cepa transformada. Cuando se pierde el plásmido, es decir, se
segrega inmediatamente del transformante la cepa se denomina
segregante.
El gen SEB1 para usar en este invento se aísla a
partir de un organismo que contiene este gen, p. ej.,
Saccharomyces cerevisiae o Kluyveromyces lactis. Otras
levaduras también apropiadas, como Schizosaccharomyces
pombe, Yarrowia lipolytica, Candida spp.,
Pichia spp. y Hansenula spp. pueden usarse. Debe
señalarse que pueden usarse también genes homólogos de otros
organismos.
Además, la sobreexpresión de otros genes que
funcionan en la misma etapa que el gen SEB1, tal como
SEC61, en presencia de niveles normales o aumentados de
proteína Seb1, da como resultado la producción aumentada de
proteínas secretadas.
Genes que funcionan en otras etapas del
procedimiento secretor bien pueden tener un efecto similar. De este
modo, la liberación de las vesículas secretoras a partir del RE o
del complejo de Golgi puede facilitarse al aumentar el número de
copias de genes apropiados que se sabe funcionan en esta etapa o al
ir en busca de y aumentar el número de copias de genes que
interaccionan con los genes conocidos, p. ej., supresores de sus
mutaciones. Asimismo, cualquier otra etapa del procedimiento
secretor puede mejorarse al aumentar el número de copias de genes
implicados. El nuevo gen SEB1, que los autores han aislado a
partir de S. cerevisiae, representa un gen conservado, lo que
sugiere que tiene un importante papel en la célula.
Basado en la naturaleza conservada de SEB1
y sus homólogos en otras especies, según se mencionó anteriormente,
los autores proponen que el aumento del gen SER1 o su
homólogo en cualquier otra levadura daría como resultado eficacia de
la secreción de proteínas mejorada.
El hospedante que se ha de transformar con los
genes del invento puede ser cualquier célula de levadura adecuada
para la producción de proteína foránea o endógena, p. ej.,
cualquier cepa de levadura S. cerevisiae (p. ej., DBY746,
AH22, S150-2B, GPY55-15Ba,
VTT-A-63015), cualquier levadura
Kluyveromyces lactis (p. ej., MW270-7B,
MW179-1D), Schizosaccharomyces pombe,
Hansenula polymorpha, Candida, Pichia o Yarrowia
spp. La transferencia de los genes dentro de estas células puede
lograrse, por ejemplo, empleando los métodos convencionales
descritos para estos organismos.
La secuencia de ADN que contiene SEB1 se
aísla a partir de S. cerevisiae por métodos convencionales.
En una realización preferida, la secuencia de ADN conocida del gen
SEB1 de S. cerevisiae (Toikkanen et al., 1996)
y de genes similares a SEB1 se emplea para diseñar sondas
para hibridación heteróloga o cebadores de PCR para clonar el gen
SEB1. En otro método, se emplean anticuerpos para las
proteínas codificadas por los genes conocidos SEB1 y
similares a SEB1 para clonar el gen mediante métodos
estándares.
La secuencia de ADN de K. lactis que
contiene el gen SEB1 de K. lactis se aísla a partir
del ADN cromosómico o a partir de un ADNc o un banco de genes
cromosómicos preparados a partir de K. lactis por hibridación
heteróloga en condiciones no astringentes, según se describe en el
Ejemplo 5, y se caracteriza por métodos convencionales, y su
función puede mostrarse según se describe anteriormente. Un método
similar es adecuado para todos los organismos que han mostrado
tener secuencias cromosómicas homólogas al gen SEB1 de
levadura, según se analizó por ejemplo por hibridación Southern del
ADN total. También es posible aislar el gen a partir de una genoteca
de expresión con anticuerpos preparados frente a la proteína Seb1
de levadura.
Alternativamente, los cebadores oligonucleótidos
pueden diseñarse basándose en las homologías encontradas entre las
secuencias de los genes correspondientes aislados a partir de
varios organismos. Estos cebadores se emplean para amplificar el gen
de K. lactis en una reacción de PCR.
Para construir un plásmido adecuado para
transformar dentro de una levadura, el gen SEB1 se clona
dentro de un vector de expresión de levadura adecuado, como pAAH5
(Ammerer, 1983) o vectores derivados de él (Ruohonen et al.,
1991; Ruohonen et al., 1995) que comprenden las regiones
reguladoras de levadura apropiadas. Estas regiones reguladoras
pueden obtenerse a partir de genes de levadura tales como el gen
ADH1, GAL1/GAL10, PGK1, CUP1,
GAP, CYC1, PHO5, TPI1 o asparragina
sintetasa, por ejemplo. Alternativamente, también pueden usarse las
regiones reguladoras de SEB1 para expresar los genes en
S. cerevisiae. El plásmido que lleva el gen SEB1 es
capaz de replicarse autónomamente cuando se transforma en la cepa de
levadura receptora. El gen SEB1 junto con las regiones
reguladoras de levadura apropiadas también puede clonarse dentro de
un vector de levadura de copia única tal como pHR70 de Hans Ronne o
pRS313, pRS314, pRS315 o pRS316 (Sikorski y Hieter, 1989).
Alternativamente, copias extra del gen
SEB1 también pueden integrarse dentro del cromosoma de
levadura, dentro del locus de ARN ribosómico, por ejemplo. Para
este propósito las secuencias ribosómicas de un plásmido adecuado,
p. ej., plásmido pIRL9 (Hallborn et al., 1991), se liberan y
se clonan apropiadamente dentro del vector BS+, según se muestra en
la Fig. 6. El gen SEB1, acoplado entre las regiones adecuadas
del promotor y terminador de levadura, se libera del vector híbrido
que comprende el gen y se clona dentro del plásmido obtenido en la
etapa anterior. De este plásmido resultante, puede liberarse el
casete de expresión, flanqueado por secuencias ribosómicas. Este
fragmento se cotransforma dentro de una levadura con un plásmido que
se replique autónomamente llevando un marcador adecuado para la
transformación. El plásmido puede eliminarse más tarde a partir de
las células que contienen copias extra del gen SEB1
integradas en el cromosoma al cultivar las células en condiciones no
selectivas. Empleando este procedimiento pueden obtenerse cepas
recombinantes que no lleven ADN extra foráneo, tal como secuencias
de vector bacteriano. Si se emplea una cepa de levadura poliploide,
como VTT-A-63015, el gen puede
integrarse también en un locus esencial, como el locus ADH1
o el PGK1.
Para expresar el gen SEB1 en K.
lactis el gen SEB1 entre el promotor ADH1 y el
terminador CYC1 se transforma en una cepa K. lactis
tanto en un plásmido multicopia o integrado en el genoma empleando
métodos conocidos en la técnica. Promotores adecuados, además del
promotor ADH1 o del promotor del mismo gen SEB1, son
por ejemplo los otros promotores de S. cerevisiae, según se
relacionan anteriormente.
Los procedimientos de este invento emplean, de
este modo, cepas de levadura que sobreexpresan el gen SEB1 de
S. cerevisiae, así como gen(es) homólogo(s) de
K. lactis y otras levaduras. La secuencia de los genes puede
determinarse a partir de los plásmidos que los portan, empleando,
p. ej., el método de secuenciación de doble cadena de nucleótidos
dideoxi (Zagursky et al., 1986). La secuencia de nucleótidos
del marco abierto de lectura del gen SEB1 de S.
cerevisiae se proporciona como la SEQ ID nº 1.
Las cepas de levadura portan vectores específicos
que comprenden los genes SEB1. Para levadura tal vector es
bien un plásmido multicopia que se replica autónomamente o un
plásmido de copia única o un vector capaz de integrarse dentro del
cromosoma, según se describe anteriormente.
Las cepas de levadura que contienen copias extra
del gen SEB1 bien en un plásmido(s) de replicación o
integrado(s) dentro del cromosoma proporcionan producción
aumentada de proteínas secretadas, como
\alpha-amilasa de Bacillus, invertasa de
levadura o celulasas de Trichoderma u otras hidrolasas.
De este modo, un método para construir nuevas
células de levadura capaces de expresar niveles aumentados de
proteína Seb1 comprende:
- (a)
- obtener un vector que comprenda una molécula de ADN aislada que codifica la proteína Seb1; y
- (b)
- transformar al menos uno de tales vectores en una célula hospedante de levadura.
En consecuencia, se proporcionan células de
levadura que, además de copias extra del gen SEB1,
comprenden una molécula de ADN que codifica una proteína foránea o
endógena secretada, tal como \alpha-amilasa,
celulasa, o un anticuerpo, y que son capaces de expresar esta
proteína.
La secreción puede mejorarse optimizando el nivel
de proteína Seb1 empleando diferentes promotores y diferente número
de copias del gen y combinando el gen SEB1 con otros genes
implicados en la secreción, como SEC61.
De este modo, el invento proporciona un
procedimiento para producir cantidades aumentadas de una proteína
foránea o endógena secretada en una célula de levadura, tal
procedimiento consiste en las etapas de:
- (a)
- obtener un vector que comprende una molécula de ADN aislada que codifica dicha proteína;
- (b1)
- transformar el vector obtenido dentro de un hospedante de levadura apropiado que comprende una molécula de ADN que codifica la proteína Seb1, la cual tiene una secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID nº 2, o una molécula de ADN que codifica una proteína homóloga de Seb1 de otra levadura y que sobreexpresa el gen SEB1 para obtener células hospedantes de levadura recombinantes; o
- (b2)
- transformar el vector dentro de un hospedante de levadura adecuado y volver a transformar este transformante con un vector de expresión de levadura que comprende una molécula de ADN que codifica la proteína Seb1, la cual tiene una secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID nº 2; o una molécula de ADN que codifica una proteína homóloga de Seb1 de otra levadura, o un fragmento funcional de la misma, para obtener células hospedantes de levadura recombinantes que sobreexpresan el gen SEB1, o
- (b3)
- transformar el vector obtenido dentro de un hospedante de levadura adecuado que sobreexpresa el gen SEB1 y otro gen que codifica una proteína que funciona en la misma etapa que la proteína Seb1 para obtener células hospedantes de levadura recombinantes; o
- (b4)
- transformar el vector dentro de un hospedante de levadura apropiado y volver a transformar este transformante con un vector de expresión de levadura que comprende una molécula de ADN que codifica la proteína Seb1, la cual tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID nº 2, o una molécula de ADN que codifica una proteína homóloga de Seb1 de otra levadura, o un fragmento funcional de la misma, y con otro gen que codifica una proteína que funciona en la misma etapa que la proteína Seb1 para obtener células de levadura transformadas que sobreexpresan el gen SEB1 y otro gen que codifica una proteína que funciona en la misma etapa que la proteína Seb1; y
- (c)
- escrutar células con producción mejorada de dicha proteína; y
- (d)
- cultivar dichas células hospedantes de levadura recombinantes bajo condiciones que permiten la expresión de dicha proteína.
El presente invento también proporciona un
procedimiento para la producción aumentada de una proteína
secretada endógena, cuyo procedimiento consiste en las etapas
de:
- (a)
- transformar células que producen dicha proteína con un vector de expresión de levadura que comprende una molécula de ADN que codifica la proteína Seb1, la cual tiene una secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID nº 2, o una molécula de ADN que codifica una proteína homóloga de Seb1 de otra levadura, o un fragmento funcional de la misma, solo o junto con otro gen que codifica una proteína que funciona en la misma etapa que la proteína Seb1;
- (b)
- escrutar transformantes que producen niveles mejorados de dicha proteína, de modo que obtienen células recombinantes para la producción mejorada de proteína; y
- (c)
- cultivar dichas células recombinantes en condiciones que permiten expresar dicha proteína.
Las cepas de levadura empleadas en este invento
pueden, además de copias extra del gen SEB1 o de sus
homólogos, comprender también una secuencia de ADN que codifica una
enzima hidrolítica tal como \alpha-amilasa y/o
glucoamilasa o enzimas hidrolizantes de lignocelulosa como
celulasas, hemicelulasas o ligninasas, las cuales hacen que la
levadura sea capaz de hidrólisis aumentada de, y/o crecimiento
mejorado de compuestos polímeros tales como almidón o
lignocelulosa. De este modo, se proporciona un procedimiento para
producir eficazmente biomasa de un material de partida o hidrólisis
eficaz de un material de partida; tal procedimiento consiste en las
etapas de:
- (a)
- obtener un vector que comprende una molécula de ADN aislada de ADN que codifica una enzima hidrolítica endógena o foránea;
- (b1)
- transformar el vector obtenido dentro de un hospedante de levadura adecuado que comprende una molécula de ADN que codifica la proteína Seb1, la cual tiene una secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID nº 2, o una molécula de ADN que codifica un homólogo de la proteína Seb1 de otra levadura, y que sobreexpresa el gen SEB1 para obtener células hospedantes de levadura recombinantes; o.
- (b2)
- transformar dicho vector dentro de un hospedante de levadura adecuado y volver a transformar este transformante con un vector de expresión de levadura que comprende una molécula de ADN que codifica la proteína Seb1, la cual tiene una secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID nº 2, o una molécula de ADN que codifica un homólogo de la proteína Seb1 de otra levadura, o un fragmento funcional de la misma, para obtener células hospedantes recombinantes que sobreexpresan el gen SEB1; o
- (b3)
- transformar el vector obtenido dentro de un hospedante de levadura apropiado que sobreexpresa el gen SEB1 y otro gen que codifica una proteína que funciona en la misma etapa que la proteína Seb1, para obtener células hospedantes de levadura recombinantes; o
- (b4)
- transformar el vector en un hospedante de levadura apropiado y volver a transformar este transformante con un vector de expresión de levadura que comprende una molécula de ADN que codifica la proteína Seb1, la cual tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID nº 2 o una molécula de ADN que codifica una proteína homóloga de Seb1 de otra levadura, o un fragmento funcional de la misma, y con otro gen que codifica una proteína que funciona en la misma etapa que la proteína Seb1, para obtener células de levaduras transformadas que sobreexpresan el gen SEB1 y otro gen que codifica una proteína que funciona en la misma etapa que la proteína Seb1; y
- (c)
- escrutar células con producción mejorada de dicha enzima; y
- (d)
- cultivar dichas células hospedantes de levadura recombinantes bajo condiciones que permiten expresar dicha enzima hidrolítica.
Aplicaciones posibles de dichas células
recombinantes son, p. ej., producción de células únicas, mejora de
la producción de alcohol o procedimientos donde se desea la
hidrólisis eficaz de materia prima.
La cepa de S. cerevisiae empleada en todos
los experimentos fue DBY746 (una his3DI
leu2-3 leu2-112
ura3-52 trpI -289 Cyh^{R}) (obtenida de David
Botstein, Departamento de Biología, Massachusetts Institute of
Technology, Cambridge, MA).
Las cepas de S. cerevisiae transformadas
(Ito et al., 1983) con el plásmido control pMA56 (1)
(Ammerer, 1983) o con YEpSEB1 (3) (Toikkanen et al., 1996)
se cultivaron en medio sintético completo (Sherman et al.,
1983) sin Trp, y una cepa a partir de la cual el plásmido YEpSEB1
se segregó inmediatamente (2) se cultivó en medio sintético
completo. Los lisados de células de levadura se prepararon en
presencia de SDS, según se describe por Keränen (1986). Treinta
\mug de proteína de levadura total presentes en el lisado se
separaron por SDS-PAGE (Schägger y von Jagow, 1987)
y se detectaron por transferencia Western empleando anticuerpos
policlonales preparados en conejo frente a un péptido
N-terminal de 18 aminoácidos de largo de la proteína
Seb1 (Toikkanen et al., 1996) e IgG
anti-conejo de cabra conjugada con fosfatasa
alcalina para detección. Según se muestra en la Fig. 2, se observó
una cantidad muy aumentada de proteína Seb1 en el transformante
YEpSEB1. Cuando el plásmido YEpSEB1 se segregó inmediatamente de la
levadura, el nivel de proteína Seb1 se redujo hasta el nivel de la
cepa control transformada con el plásmido vector que no contiene el
gen SEB1.
La cepas de S. cerevisiae que albergan el
plásmido YEp\alphaa6 que contiene el gen
\alpha-amilasa de Bacillus ligado entre el
promotor ADH1 y el terminador (Ruohonen et al.,
1987), modificado para expresar más eficazmente mediante delección
de secuencias inhibidoras 5' predichas del elemento promotor
(Ruohonen et al., 1991; 1995) se transformó bien con YEpSEB1
o con el plásmido control pMA56 (Ammerer, 1983). Las cepas de
levadura obtenidas que contenían YEpSEB1 e YEp\alphaa6 o pMA56 e
YEp\alphaa6 se cultivaron en medio selectivo a 30ºC y la
secreción de \alpha-amilasa en el medio de
cultivo se monitorizó midiendo la actividad
\alpha-amilasa empleando el ensayo de la amilasa
de Phadebas (Pharmacia Diagnostics AB, Suecia). Según se muestra en
la Fig. 3, se obtuvo actividad \alpha-amilasa
aumentada en la cepa que portaba SEB1 en el plásmido
multicopia comparada con la cepa control transformada con el
plásmido control sin gen SEB1. No se observó diferencia en
el crecimiento de levadura entre el transformante control y el
transformante SEB1. La secreción de la proteína endógena,
invertasa, también se mejoró por la sobreexpresión de SEB1
medida en fase de crecimiento logarítmica tardía a estacionaria
temprana. La actividad de la invertasa secretada en el transformante
YEpSEB1 fue 1,4 veces comparada con la del transformante control
que contenía pMA56.
La eliminación de las secuencias inhibitorias
predichas del promotor ADH1 (véase arriba) empleado
para expresar el SEB1 en YEpSEB1 da como resultado la
expresión prolongada de SEB1 y prolonga la existencia de
nivel aumentado de la proteína Seb1 y, en consecuencia, niveles
finales de la \alpha-amilasa de Bacillus
incluso superiores se segregan en el medio.
El casete que expresa la
\alpha-amilasa de Bacillus
amyloliquefaciens se liberó del plásmido YEp\alphaa6
(Ruohonen et al., 1995) como fragmento de 3,35 kb mediante
digestión con BamHI y SalI y se clonó dentro del
vector integrante de levadura pRS403 (Sikorski y Hieter, 1989),
entre los sitios BamHI y SalI para obtener el
plásmido YIp\alphaa1. El plásmido se linearizó por digestión con
PstI dentro del gen HIS3 y se empleó para transformar
la levadura. Los transformantes se seleccionaron por prototrofia
para histidina. La integración del casete de expresión de
\alpha-amilasa en el locus HIS3 se confirmó
por análisis Southern. La cepa integrante así obtenida se
transformó con YEpSEB1 o con el plásmido control pMA56. Los
tranformantes se cultivaron en medio selectivo a 30ºC y la secreción
de \alpha-amilasa en el medio de cultivo se
monitorizó midiendo la actividad \alpha-amilasa
según se describe en el Ejemplo 2. Se detectaron niveles claramente
mejorados de \alpha-amilasa secretada en el
transformante YEpSEB1, en el que el nivel de
\alpha-amilasa en el medio de cultivo fue 4.2
veces el de la cepa control.
Un casete de integración para integrar el gen de
la \alpha-amilasa en el locus URA3 se
construyó como sigue. Se realizaron dos fragmentos URA3 por
PCR y se clonaron dentro del sitio de clonaje múltiple sitio de
pBluescript SK(-). El primer fragmento que comprende los pares de
bases (pb) 71-450 de URA3 de 1135 pb de largo
se clonó como un fragmento SacI-XbaI. El segundo
fragmento (781-1135 pb) se clonó como un fragmento
XhoI-KpnI. El plásmido resultante es pBUF. El casete
de expresión de \alpha-amilasa de 3,5 kb de largo
se cortó como un fragmento BamHI-SalI a partir del
plásmido YEp\alphaa6 (Ruohonen et al., 1995) y se clonó en
el vector pBluescript rindiendo el plásmido pB\alphaa6. El casete
de expresión se liberó entonces de nuevo como un fragmento
BamHI-SalI y se insertó en pBUF entre los fragmentos
URA3. Este constructo es pUI\alphaa1. La cepa de S.
cerevisiae que es ura3-52 se convirtió primero a
URA3 silvestre por transformación con un fragmento que
contenía el gen URA3 completo. Esta cepa se transformó
entonces con el casete de integración de
\alpha-amilasa liberado como un fragmento
SacI-NsiI a partir de pUI\alphaa1 y los
transformantes se seleccionaron en presencia de
5-FOA, que selecciona cepas en las que el gen
URA3 está inactivado por integración del casete de
\alpha-amilasa. La integración en el locus
URA3 se confirmó por análisis Southern. La cepa obtenida de
este modo se transformó con YEpSEB1 o con el plásmido control
pMA56. El transformante YEpSEB1 obtenido se denominó VTT
C-97280 y se depositó de acuerdo con el Tratado de
Budapest en DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkuluren GmbH) el 16 de junio de 1997 con el número de acceso
DSM 11615.
Los transformantes se cultivaron en medio
selectivo a 30ºC y la secreción de \alpha-amilasa
dentro del medio de cultivo se monitorizó midiendo la actividad
\alpha-amilasa como se describe en el Ejemplo 2.
Según se muestra en la Fig. 4 y Fig. 5 se detectaron niveles de
\alpha-amilasa secretada claramente aumentados en
el transformante YEpSEB1 tanto por transferencia Western como por
medida de la actividad \alpha-amilasa.
Se aisló el ADN genómico de las especies fúngicas
Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe,
Kluyveromyces lactis, Pichia pastoris, Pichia
stipitis, Candida utilis y Yarrowia lipolytica, se
digirió con la enzima de restricción HindIII, se separó
electroforéticamente en un gel de agarosa al 0,8% y se transfirió
sobre un filtro de nailon. La hibridación Southern del filtro se
llevó a cabo a diferentes astringencias empleando la región
codificante del gen SEB1 de Saccharomyces como una
sonda. La hibridación en una mezcla con 30% de formamida, 6x SSC,
10x solución de Denhardt, 0,5% de SDS, 100 mg/ml de ADN de esperma
de arenque y 10 mg/ml de poliA a 35ºC, y lavando 15 minutos en 6x
SSC, 0,1% de SDS a 42ºC y 2 x 30 minutos en 2x SSC, 0,1% de SDS a
42ºC, reveló bandas de hibridación claras en ADN derivado de S.
cerevisiae, S. pombe, K. lactis, P.
stipitis e Y. lipolytica, y una banda mucho más débil en
el ADN de C. utilis (Fig. 7).
El plásmido YEpSEB1 (vector de S.
cerevisiae con el gen SEB1) y el vector plasmídico se
convirtieron en vectores de enlace que son capaces de replicarse en
K. lactis. El origen de replicación de K. lactis (Chen
et al., 1986) se liberó del plásmido KEp6 como un fragmento
de aproximadamente 1000 pb (digestión con AatII y
ClaI, relleno por la polimerasa T4 de ADN) y se purificó y
ligó en el sitio PvuII de YEpSEB1 y del vector control,
pMA56, para obtener los plásmidos KEpSEB1 y KpMA56, respectivamente.
Los plásmidos se transformaron en K. lactis y los
transformantes se seleccionaron por crecimiento en placas
SC-Trp. Los lisados de SDS preparados a partir de
los transformantes se analizaron por transferencia Western,
empleando un anticuerpo específico de Seb1p de S.
cerevisiae, según se describe en el Ejemplo 1. El anticuerpo
detectó una banda con una migración ligeramente más lenta que la de
Seb1p de S. cerevisiae (Fig. 8).
La cepa de S. cerevisiae en la que el
casete de expresión de la \alpha-amilasa de
Bacillus está integrado en el locus URA3 se transformó
bien con un plásmido multicopia YEpSEC61 que expresa el gen SEC61 o
con el plásmido control pRS425 (Christianson et al., 1992).
Los transformantes se cultivaron en medio selectivo a 30ºC y la
secreción de \alpha-amilasa dentro del medio de
cultivo se monitorizó midiendo la actividad
\alpha-amilasa, empleando la prueba de amilasa de
Phadebas (Pharmacia Diagnostics AB, Suecia). La actividad de
\alpha-amilasa aumentada (1,3 veces) se obtuvo en
la cepa que porta SEC61 en un plásmido multicopia comparado
con la cepa transformada con el vector sin el gen SEC61.
La sobreexpresión simultánea de ambos Sec61p y
Seb1p a partir de dos plásmidos diferentes mejoró la producción de
\alpha-amilasa secretada incluso más (3,3 veces).
Bajo las condiciones de estos dos plásmidos la mejora por
SEB1 solo fue de 2,4 veces. El plásmido que expresa el gen
SEC61 está disponible en VTT, Biotechnical Laboratory,
Espoo, Finlandia.
El siguiente microorganismo se depositó de
acuerdo con el Tratado de Budapest en el Deutsche Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Mascheroder Weg 1b,
D-38124 Braunschweig, Alemania.
| Cepa | Número de acceso | Fecha de depósito |
| Saccharomyces cerevisiae VTT C-97280 que porta el gen | ||
| \alpha-amilasa integrado y el plásmido YEpSEB1 | DSM 11615 | 16.06.1997 |
Aalto, M.K., Ronne, H. y
Keränen, S. 1993. Yeast syntaxins Sso1p and Sso2p
belong to a family of membrane proteins that function in vesicular
transport. EMBO J. 12, 4095-4104.
Ammerer, G. 1983. Expression of
genes in yeast using the ADC1 promoter. Methods
Enzymol. 101, 192-201.
Baldari, C, Murray, J.A.H.,
Ghiara, P., Cesareni, G. y Galeotti, C.L.
1987. A novel peptide leader which allows efficient
secretion of a fragment of human interleukin 1b in Saccharomyces
cerevisiae. EMBO J., 6, 229-234.
Buckholz, R.G. y Gleeson, M.A.
1991. Yeast systems for the commercial production of
heterologous proteins. Bio/Technology 9,
1067-1072.
Chen, X.J., Saliola, M.,
Falcone, C, Bianchi, M.M. y Fukuhara, H.
1986. Sequence organization of the circular plasmid pKD1
from the yeast Kluyveromyces drosophilarum. Nucleic Acids
Res. 14, 4471-4481.
Christianson, T.W., Sikorski, R.S.,
Dante, M., Shero, J.H. y Hieter, P.
1992. Multifunctional yeast
high-copy-number shuttle vectors.
Gene 110, 119-122.
Dunn-Coleman, N.,
Bloebaum, P., Berka, R., Bodie, E.,
Robinson, N., Armstrong, G., Ward, M.,
Przetak, M., Carter, G., LaCost, R.,
Wilson, L, Kodama, K., Baliu, E., Bower,
B., Lamsa, M. y Heinsohn, H. 1991. Commercial
levels of chymosin production by Aspergillus. Bio/Technology 9: 976-981.
Hallborn, J., Penttilä, M.,
Ojamo, H., Keränen, S. y
Hahn-Hägerdal, B. 1991. Xylose
utilization by recombinant yeasts. Solicitud de Patente
Internacional WO 91/15588.
Hanein, D, Matlack, K.E.S.,
Jungnickel, B., Plath, K., Kalies,
K-U., Miller, K.R., Rapoport, T.A. y
Akey, C.W., 1996. Oligomeric rings of the Sec61
complex induced by ligands required for protein translocation.
Cell 87, 721-732.
Harkki, A., Uusitalo, J.,
Bailey, M., Penttilä, M. y Knowles, J.K.C.
1989. A novel fungal expression system: secretion of active
calf chymosin from the filamentous fungus Trichoderma reesei. Bio/Technology 7: 596-603.
Irani, M.H. y Kilgore, T.L.
1988. High level expression in yeast. Solicitud de Patente
Europea EP 0 284 044 A1.
Ito, H., Fukuda, Y., Murata,
K. y Kimura, A. 1983. Transformation of intact yeast
cells with alkali cations. J. Bacteriol. 153,
163-168.
Keränen, S. 1986. Synthesis and
processing of Semliki forest virus polyprotein in Saccharomyces
cerevisiae: a yeast type glycosylation of E1 envelope protein.
Gene 48, 267-275.
Lamsa, M. y Bloebaum, P.
1990. Mutation and screening to increase chymosin yield in a
genetically-engineered strain of Aspergillus
awamori. J. Ind. Microbiol. 5,
229-238.
Martegani, E., Forlani, N.,
Mauri, I., Porro, D., Schleuning, W.D. y
Alberghina, L. 1992. Expression of high levels of
human tissue plasminogen activator in yeast under the control of an
inducible GAL promoter. Appl. Microbiol. Biotechnol, 37,
604-608.
Novick, P., Ferro, S. y
Scheckman, R. 1981. Order of events in the yeast
secretory pathway. Cell 25, 461 -469.
Novick, P., Fields, C. y
Scheckman, R. 1980. Identification of 23
complementation groups required for
post-translational events in the yeast secretory
pathway. Cell 21, 205-215.
Nyyssönen, E., Keränen, S.,
Penttilä, M., Takkinen, K. y Knowles, J.K.C.
1992. Immunoglobulin production by Trichoderma.
Solicitud de Patente Internacional WO 92/01797.
Nyyssönen, E., Penttilä, M.,
Harkki, A., Saloheimo, A., Knowles, J.K.C. y
Keränen, S. 1993. Efficient production of antibodies
by the filamentous fungus Trichoderma reesei. Bio/Technology 11, 591-595.
Panzner, S., Dreier, L.,
Hartmann, E., Kostka, S. y Rapoport, T.A.
1995. Post-translational protein transport in
yeast reconstituted with purified complex of Sec proteins and
Kar2p. Cell 81, 561-570.
Romanos, M.A., Scorer, C.A. y
Clare, J.J. 1992. Foreign gene expression in yeast: a
Review. Yeast 8, 423-488.
Ruohonen, L., Aalto, M.K. y
Keränen, S. 1995. Modifications to the ADH1
promoter of Saccharomyces cerevisiae for efficient production
of heterologous proteins. J. Biotechnol. 39,
193-203.
Ruohonen, L., Hackman, P.,
Lehtovaara, P., Knowles, J.K.C. and Keränen,
S. 1987. Efficient secretion of Bacillus
amyloliquefaciens\alpha-amylase by its own
signal peptide in Saccharomyces cerevisiae host cells.
Gene 59, 161 -170.
Ruohonen, L., Penttilä, M. y
Keränen, S. 1991. Optimization of Bacillus\alpha-amylase production by Saccharomyces
cerevisiae. Yeast 7, 337-346.
Sakai, A. Shimizu, Y. e
Hishinuma, F. 1988. Isolation and characterization of
mutants which show an overse-cretion phenotype in
Saccharomyces cerevisiae. Genetics 119,
499-506.
Schägger, H. y von Jagow, G.
1987. Tricine-sodium dodecyl sulphate
polyacryl amide gel electrophoresis for the separation of proteins
in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. 166,
368-379.
Shuster, J.R., Moyer, D.L.,
Lee, H., Dennis, A., Smith, B. y
Merryweather, J.P. 1989. Yeast mutants conferring
resistance to toxic effects of cloned human
insulin-like growth factor I. Gene 83,
47-55.
Sherman, F., Fink, G. y
Hicks, J.B. 1983. Methods in Yeast Genetics. A
Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, Nueva York.
Sikorski, R.S. y Hieter, P.
1989. A system of shuttle vectors and yeast host strains
designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces
cerevisiae. Genetics 122, 19-27.
Sleep, D., Belfield, G.P.,
Ballance, D.J., Steven, J., Jones, S.,
Evans, L.R., Moir, P.D. y Goodey, A.R.
1991. Saccharomyces cerevisiae strains that
overexpress heterologous proteins. Bio/Technology 9,
183-187.
Smith, R.A., Duncan, M.J. y
Moir, D.T. 1985. Heterologous protein secretion from
yeast. Science 229, 1219-1224.
Suzuki, K., Ichikawa, K. y
Jigami, Y. 1989. Yeast mutants with enhanced ability
to secrete human lysozyme: Isolation and identification of a
protease-deficient mutant. Mol. Gen. Genet.
219, 58-64.
Toikkanen, J., Gatti, E.,
Takei, K., Saloheimo, M., Olkkonen, V.,
Söderlund, H., De Camilli, P. y Keränen, S.
1996. Yeast protein translocation complex: isolation of two
genes SEB1 and SEB2 encoding proteins homologous to
Sec61 \beta-subunit. Yeast 12,
425-438.
Vanoni, M., Porro, D.,
Martegani, E. y Alberghina, L. 1989. Secretion
of Escherichia coli\beta-galactosidase in
Saccharomyces cerevisiae using the signal sequence from the
glucoamylase-encoding STA2 gene. Biochem.
Biophys. Res. Commun. 164, 1331-1338.
Ward, M., Wilson, L.J.,
Kodama, K.H., Rey, M.W. y Berka, R.M.
1990. Improved production of calf chymosin in
Aspergillus by expression as a
glucoamylase-chymosin fusion. Bio/Technology
8, 435-440.
Zagursky, R.J., Berman, M.L.,
Baumeister, K. y Lomax, N. 1986. Rapid and
easy sequencing of large linear double stranded DNA and supercoiled
plasmid DNA. Gene Anal. Techn. 2, 89-94.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Valtion teknillinen tutkimuskeskus
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Vourimiehentie 5
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Espoo
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Finlandia
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: FIN-02150
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DEL INVENTO: Producción aumentada de proteínas secretadas por células recombinantes de levadura
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 2
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA DE LECTURA EN EL ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: disco extraíble
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM compatible PC
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release nº 1.0, Versión nº 1.25 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 249 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Saccharomyces cerevisiae
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..249
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 82 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID nº 2:
Claims (5)
1. Un procedimiento para producir cantidades
aumentadas de una proteína foránea o endógena secretada en una
célula de levadura, caracterizado porque el procedimiento
consiste en las etapas de:
- (a)
- obtener un vector que comprende una molécula aislada de ADN que codifica dicha proteína;
- (b1)
- transformar el vector obtenido dentro de un hospedante de levadura apropiado que comprende una molécula de ADN que codifica la proteína Seb1, la cual tiene una secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID nº 2, o una molécula de ADN que codifica un homólogo de la proteína Seb1 de otra levadura y que sobreexpresa el gen SEB1 para obtener células hospedantes de levadura recombinantes; o
- (b2)
- transformar el vector dentro de un hospedante de levadura apropiado y volver a transformar este transformante con un vector de expresión de levadura que comprende una molécula de ADN que codifica la proteína Seb1, la cual tiene una secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID nº 2; o una molécula de ADN que codifica un homólogo de la proteína Seb1 de otra levadura, o un fragmento funcional de la misma, para obtener células hospedantes de levadura recombinantes que sobreexpresan el gen SEB1, o
- (b3)
- transformar el vector obtenido dentro de un hospedante de levadura adecuado que sobreexprese el gen SEB1 y otro gen que codifica una proteína que funciona en la misma etapa que la proteína Seb1 para obtener células hospedantes de levadura recombinantes; o
- (b4)
- transformar el vector dentro de un hospedante de levadura apropiado y volver a transformar este transformante con un vector de expresión de levadura que comprende una molécula de ADN que codifica la proteína Seb1, la cual tiene la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID nº 2, o una molécula de ADN que codifica una proteína homóloga de Seb1 de otra levadura, o un fragmento funcional de la misma, y con otro gen que codifica una proteína que funciona en la misma etapa que la proteína Seb1 para obtener células de levadura transformadas que sobreexpresan el gen SEB1 y otro gen que codifica una proteína que funciona en la misma etapa que la proteína Seb1; y
- (c)
- escrutar células con producción mejorada de dicha proteína; y
- (d)
- cultivar dichas células hospedantes de levadura recombinantes bajo condiciones que permiten la expresión de dicha proteína.
2. Un procedimiento para la producción aumentada
de una proteína endógena secretada, caracterizado porque el
procedimiento consiste en las etapas de:
- (a)
- transformar células que producen dicha proteína con un vector de expresión de levadura que comprende una molécula de ADN que codifica la proteína Seb1, la cual tiene una secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID nº 2, o una molécula de ADN que codifica una proteína homóloga de Seb1 de otra levadura, o un fragmento funcional de la misma, solo o junto con otro gen que codifica una proteína que funciona en la misma etapa que la proteína Seb1;
- (b)
- escrutar transformantes que producen niveles mejorados de dicha proteína, obteniendo así células recombinantes para la producción mejorada de proteína; y
- (c)
- cultivar dichas células recombinantes en condiciones que permiten la expresión de dicha proteína.
3. Un procedimiento para la producción eficaz de
biomasa sobre un material de partida o para la hidrólisis eficaz de
un material de partida, caracterizado porque el
procedimiento consiste en las etapas de:
- (a)
- obtener un vector que comprenda una molécula de ADN aislada que codifica una enzima hidrolítica endógena o foránea;
- (b1)
- transformar el vector obtenido dentro de un hospedante de levadura apropiado que comprende una molécula de ADN que codifica la proteína Seb1, la cual tiene una secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID nº 2, o una molécula de ADN que codifica una proteína homóloga de Seb1 de otra levadura, y que sobreexpresa el gen SEB1, para obtener células hospedantes de levadura recombinantes; o
- (b2)
- transformar dicho vector dentro de un hospedante de levadura adecuado y volver a transformar este transformante con un vector de expresión de levadura que comprende una molécula de ADN que codifica la proteína Seb1, la cual tiene una secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID nº 2, o una molécula de ADN que codifica una proteína homóloga de Seb1 de otra levadura, o un fragmento funcional de la misma, para obtener células hospedantes recombinantes que sobreexpresan el gen SEB1, o
- (b3)
- transformar el vector obtenido dentro de un hospedante de levadura adecuado que sobreexpresa el gen SEB1 y otro gen que codifica una proteína que funciona en la misma etapa que la proteína Seb1 para obtener células hospedantes de levadura recombinantes; o
- (b4)
- transformar el vector dentro de un hospedante de levadura apropiado y volver a transformar este transformante con un vector de expresión de levadura que comprende una molécula de ADN que codifica la proteína Seb1, la cual tiene una secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID nº 2, o una molécula de ADN que codifica una proteína homóloga de Seb1 de otra levadura, o un fragmento funcional de la misma, y con otro gen que codifica una proteína que funciona en la misma etapa que la proteína Seb1 para obtener células de levadura transformadas que sobreexpresan el gen SEB1 y otro gen que codifica una proteína que funciona en la misma etapa que la proteína Seb1; y
- (c)
- escrutar células con producción mejorada de dicha enzima; y
- (d)
- cultivar dichas células hospedantes de levadura recombinantes bajo condiciones que permiten la expresión de dicha enzima hidrolítica.
4. El procedimiento, de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el gen que
codifica una proteína que funciona en la misma etapa que la
proteína Seb1 es el gen SEC61.
5. Siendo las células recombinantes de levadura
las células de la cepa VTT C-97280 de
Saccharomyces cerevisiae con el número de acceso del depósito
DSM 11615.
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|---|---|---|---|
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|---|---|
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Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
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-
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-
1998
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- 1998-07-08 JP JP2000502210A patent/JP2001509392A/ja active Pending
- 1998-07-08 DK DK98933668T patent/DK0994955T3/da active
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