ES2247780T3 - Un conejo transgenico que expresa una lipoproteina (a) humana funcional. - Google Patents

Abstract

Un conejo transgénico que tiene en su DNA genómico secuencias que codifican polipéptidos de la apolipoproteína (a) humana y la apolipoproteína B humana que son capaces de combinarse para producir la lipoproteína (a) humana.

Description

Un conejo transgénico que expresa una lipoproteína (a) humana funcional.

Esta invención fue realizada con ayuda gubernamental con la subvención PPG HL18574, concedida por el Instituto Nacional de Salud, y el Contrato Nº. DE-AC03-76SF00098 entre el Ministerio de Energía estadounidense y la Universidad de California. El gobierno estadounidense tiene ciertos derechos en la invención.

Remisión a solicitudes relacionadas

Esta solicitud está basada y reivindica la prioridad de la solicitud provisional de EE.UU. Nº. 60/070.727, archivada el 8 de enero de 1998.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a modelos de enfermedades humanas y a métodos para usar estos modelos para identificar compuestos eficaces para el tratamiento de estas enfermedades. En particular, la presente invención representa un nuevo modelo experimental para el análisis in vivo de la lipoproteína (a) humana [Lp (a)] y el desarrollo de estrategias terapéuticas para reducir los peligros para la salud asociados con altos niveles de esta lipoproteína.

Las dislipoproteinemias son trastornos en el metabolismo de las lipoproteínas que son las responsables de transportar lípidos tales como el colesterol y los triglicéridos en la sangre y en los fluidos periféricos. Las dislipoproteinemias, por consiguiente, están asociadas con enfermedades que amenazan la vida vinculadas a hipercolesterolemia, hipocolesterolemia o hipertrigliceridemia, tal como la aterosclerosis.

La aterosclerosis es una enfermedad compleja y poligénica que se define, en el plano histológico, por depósitos (placas lipídicas o fibro-lipídicas) lipídicos y otros derivados de la sangre en la pared de las grandes arterias (aorta, arterias coronarias y carótida). Las placas, que más o menos se calcifican de acuerdo con el progreso de la enfermedad, pueden estar asociadas con lesiones y se unen para formar la acumulación, en las arterias, de depósitos grasos que esencialmente consisten en ésteres de colesterol. Las placas están acompañadas por un hinchamiento de la pared arterial junto con hipertrofia del músculo liso, la aparición de células espumosas y la acumulación de tejido fibroso. Las placas se levantan sobre la pared arterial lo que causa estenosis, es decir, un estrechamiento u obstrucción de la arteria. En los pacientes peores afectados, esta estenosis es responsable de las oclusiones vasculares, tales como ateroma, trombosis y embolias.

En consecuencia, la acumulación de colesterol en exceso (hipercolesterolemias) puede conducir a enfermedades cardiovasculares muy serias tales como infarto, muerte repentina, descompensación cardíaca, enfermedades cerebrovasculares y otras similares.

Es particularmente importante, por lo tanto, tener tratamientos inmediatamente disponibles que disminuyan, en algunas situaciones de la enfermedad, los niveles de colesterol en plasma o que estimulen la salida del colesterol (transporte inverso del colesterol) de los tejidos periféricos para descargar las células que han acumulado el colesterol en el contexto de formar una placa de ateroma. El colesterol se transporta en la sangre por una variedad de lipoproteínas incluyendo lipoproteínas de densidad baja (LDL) y lipoproteínas de densidad alta (HDL). Las LDL se sintetizan en el hígado y son responsables de suministrar a los tejidos periféricos el colesterol. En contraste, las HDL recogen el colesterol de los tejidos periféricos y lo transportan al hígado donde se almacena y/o se destruye.

Numerosos estudios han correlacionado los niveles elevados en plasma de la lipoproteína (a) [Lp (a)] con la incidencia aumentada de enfermedades cardiovasculares e infarto (revisado en Utermann, G., Science (1989) 246, 904-910; Maher, V. M. G., y Brown, B. G., Curr. Opin. Lipidol. (1995) 6, 229-235). La lipoproteína (a) es una partícula compleja compuesta de un resto lipídico y dos subunidades unidas de disulfuro: apolipoproteína B-100 (apoB-100) y apolipoproteína (a) [apo(a)]. La presencia de apo(a), una glicoproteína hidrófila estructuralmente relacionada con el plasminógeno, distingue a la Lp (a) de la lipoproteína de densidad baja (LDL) y confiere sus propiedades características biológicas y físicas.

La apolipoproteína B-100 (apoB) es el principal constituyente proteico de las lipoproteínas de densidad muy baja (VLDL), lipoproteínas de densidad baja (LDL) y lipoproteína Lp (a). Esta proteína es el ligando fisiológico del receptor de LDL, y su concentración en plasma está correlacionada positivamente con el desarrollo de la aterosclerosis (Brunzell et al. 1984 Arteriosclerosis 4, 79-93). La ApoB-100 es una de las proteínas conocidas más grandes, con una masa de 550 kDa y que contiene 4536 aminoácidos (Chen et al. 1986 J. Biol. Chem, 261, 12919-21). Esta apolipoproteína sólo se sintetiza en el hígado. Su concentración en plasma es 1,0-1,2 g/l. La ApoB-100 juega el papel principal en el transporte del colesterol que se sintetiza en el hígado por el plasma a otras células del organismo. Otra versión de la apoB, es decir la apoB-48, está presente en los quilomicrones. En seres humanos, la apoB-48 se sintetiza en el intestino. La ApoB-48 tiene una masa de 260 kDa y contiene 2152 aminoácidos que corresponden directamente al 48% del extremo N de la apoB-100 (Powell et al., 1987, Cell 50, 831-40). Ya que el resto del extremo C de la apoB-100 contiene una zona para unir la apoB-100 al receptor de LDL, la apoB-48 no se une a este último receptor y se comporta de una manera diferente metabólicamente.

Para estudiar los estados de la enfermedad que se refieren a las disliproproteinemias, es ventajoso tener disponible un modelo animal que exprese una proteína o un complejo de proteínas que esté asociado a un riesgo para una enfermedad que esté vinculada a las dislipoproteinemias. Un modelo tal animal sería particularmente ventajoso para entender estas enfermedades y, más específicamente, los mecanismos reguladores que estas proteínas o complejos de proteína inician. Esto haría posible analizar, rápidamente e in vivo, un número considerable de agentes terapéuticos o compuestos con el objetivo de detectar una actividad potencial asociada con la expresión de las proteínas. Además, tal modelo sería de interés para desarrollar nuevos métodos terapéuticos para tratar estos tipos de enfermedades, tales como métodos que están basados en terapia génica. El análisis in vivo de Lp (a), un factor de riesgo de la aterosclerosis independiente en seres humanos, ha estado limitado en parte por su distribución restringida entre mamíferos. La Apo (a) está presente en la naturaleza exclusivamente en monos del antiguo mundo, seres humanos, y una especie no de primates, el erizo europeo. Tal distribución limitada de la apo (a) entre mamíferos ha limitado los estudios de su propiedades in vivo.

En consecuencia, la presente invención se refiere a modelos de animales de estados de enfermedad que implican a la Lp (a), incluyendo aterosclerosis, para permitir la selección y la identificación de compuestos para el tratamiento de estas enfermedades, en particular, para la aterosclerosis.

Logros publicados

Por lo general, los murinos, a saber, los ratones, las ratas y los conejillos de Indias, son los modelos de animales más extensamente usados. Son fáciles para manipular y baratos. Lamentablemente, estos pequeños mamíferos no son siempre compatibles con la aplicación pretendida porque no son siempre representativos de los seres humanos y su metabolismo. Los chimpancés se usan para analizar a agentes terapéuticos y vacunas dirigidas contra varias enfermedades, incluyendo el SIDA y el cáncer. Sin embargo, el alto coste sustancial incurrido en la utilización de chimpancés como sistema modelo constituye un inconveniente principal y forzoso con respeto a su uso.

A pesar de las desventajas de un sistema que use ratones, el desarrollo de ratones transgénicos que expresan cDNA de apo (a) humana proporcionó un medio para analizar las hipótesis que se tienen en cuenta del efecto de la Lp (a) sobre el sistema vascular. Específicamente, estos ratones han sido usados para examinar la capacidad de la apo (a) para promover la aterogénesis por inhibición de la formación de plasmina y consecuencias asociadas (Lawn, et al., Nature (1992) 360, 670-672; Grainger, et al., Nature (1994) 370, 460-462). Los estudios de la apo (a) en ratones transgénicos también ha conducido a varias ideas importantes en el ensamblaje de la Lp (a), incluyendo la observación de que la
apo (a) era incapaz de formar una asociación covalente con la LDL que contiene apoB murina (Chiesa, et al., J. Biol Chem (1992) 267, 24369-24374). Este resultado, unido a las pruebas para la formación de Lp (a) cuando fueron infundidos ratones con LDL humana o fue expresado un transgen de apoB humana (Linton, et al., J Clin Invest (1993) 92, 3029-3037; Callow, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA (1994) 91, 2130-2136) sugirieron que la apoB murina carecía de requerimientos estructurales necesarias para el ensamblaje de la Lp (a). Esto no fue un hallazgo completamente inesperado a la luz de la ausencia del gen de apo (a) en ratones y la interacciones específicas de secuencia entre la apo (a) y la apoB que se creía que mediaba el ensamblaje de la Lp (a) en seres humanos. Dos estudios que usan mutagénesis dirigida específica de transgenes de apoB humana en ratones han publicado la localización de una cisteína sola en apoB humana (Cys 4326) que proporciona el sitio de unión para la apo (a) (Callow, M. J., y Rubin, E. M., J Biol Chem (1995) 270, 23914-23917; McCormick, et al., (1995) 92, 10147-10151).

Más recientemente, la regulación de la expresión génica de apo (a) ha sido estudiada en ratones transgénicos que contenían un clon genómico de apo (a) humana (Frazer, et al., Nat Gen (1995) 9, 424-431). Este transgen comprendía el gen de apo (a) junto con su promotor nativo y elementos que actúan de cis presentes dentro del DNA que flanquea desde aproximadamente 60 kb de 5' y 80 kb de 3'. El transgen fue expresado de una manera más eficiente (es decir, todas las líneas fundadoras transgénicas de apo [a] creadas que contienen un transgen intacto expresaron apo [a]) y causaron niveles de apo (a) en plasma considerablemente más altos que los observados en ratones que contienen una construcción de cDNA de apo (a). Un hallazgo sorprendente en ratones que expresan el transgen genómico de apo (a)
humana eran los profundos cambios inducidos por hormonas del sexo en la expresión de apo (a), sobrepasando mucho la magnitud de cambios relacionados con andrógenos y estrógenos observados en seres humanos. Estos cambios fueron, sin embargo, cualitativamente similares en seres humanos y ratones transgénicos. En ambos casos, estas hormonas bajan los niveles de apo (a) en plasma.

El uso de clones genómicos en la creación de animales transgénicos generalmente tiene varias ventajas respecto al uso de construcciones de cDNA. Lo más importante, la expresión del transgen está regulada de una manera apropiada y es independiente de su sitio de integración. Este enfoque ha estado limitado a la producción de ratones transgénicos para genes grandes tales como apo (a), sin embargo, debido a la dificultad técnica de manipular clones genómicos extremadamente grandes y a la menor eficacia de la transgénesis en otros animales.

Aunque hayan sido creados ratones transgénicos que contienen Lp (a), el pequeño tamaño del ratón y las diferencias de perfiles de lipoproteína entre ratones y seres humanos ha excluido varios estudios. En consecuencia, es deseable identificar un sistema de modelo animal que esté más cercano a los seres humanos, pero que evite el costo asociado con los sistemas de modelos de primates.

Callow et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1994), 91, 2130-2134 describen el aislamiento de un fagómido P1 de 90 kilobases que contiene el gen de apoB humano y la generación de 13 líneas de ratones transgénicos de los que 11 expresaron la apoB humana. La transcripción de apoB humana fue expresada y metabolizada en el hígado de ratones transgénicos.

El documento WO 95/25793 describe un conejo transgénico que expresa una proteína capaz de interferir con enfermedades relacionadas con la dislipoproteinemia, un método para preparar al mismo y su uso como modelo animal.

Fan et al., Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology, (1995), 15, 1889-1899 describen un estudio en el cual un fragmento de DNA genómico humano de 80 kb que atraviesa el gen de apoB humana fue usado para generar conejos blancos de Nueva Zelanda transgénicos que expresaron la apoB-100 humana.

De esta forma, hay una necesidad en la técnica de un modelo apropiado animal de enfermedades y trastornos mediados por Lp (a). Hay una necesidad más en la técnica de un animal transgénico, que exprese a la Lp (a) humana. Además, para ser realmente útil, un animal transgénico debe expresar las proteínas de Lp (a) constituyentes en un nivel bastante alto, y debe permitir la asociación covalente de los constituyentes para producir niveles fisiológicamente relevantes de Lp (a). Hasta el momento, las dificultades técnicas en la generación de tal animal no han sido vencidas, hasta la presente invención.

La presente invención supera estas carencias de la técnica anterior, proporcionando un animal transgénico útil que produce niveles fisiológicos de Lp (a) humana, a pesar de las dificultades en alcanzar tal invención.

En particular, la invención se refiere a animales transgénicos que expresan tanto los genes de la apolipoproteína (a) humana [apo (a)] como la apolipoproteína B (apoB). Estos animales expresan la lipoproteína (a) humana [Lp (a)], la partícula compleja compuesta de un resto lipídico y dos subunidades unidas de disulfuro de apo (a) y apoB.

Sumario de la invención

Conforme a la presente invención, se proporciona un conejo transgénico que tiene en su DNA genómico secuencias que codifican polipéptidos de la apolipoproteína (a) humana y la apolipoproteína B humana que son capaces de combinarse para producir la lipoproteína (a).

La presente invención también proporciona un conejo transgénico capaz de producir la lipoproteína (a) en el que el conejo desarrolla lesiones similares a un humano aterosclerótico cuando se alimenta con una dieta rica en colesterol.

La presente invención también proporciona conejos transgénicos capaces de producir la lipoproteína (a) que tienen secuencias de DNA humanas exógenas. Las secuencias de DNA pueden ser seleccionadas de DNA genómicos y cDNA.

Como se indica anteriormente, los conejos transgénicos de la presente invención tienen en su DNA genómico secuencias que codifican la apolipoproteína (a) y la apolipoproteína B. La presente invención proporciona conejos transgénicos capaces de producir la lipoproteína (a) que tienen las células hepáticas que expresan las secuencias de DNA y conejos transgénicos capaces de producir la lipoproteína (a) que tienen las células de testículos que expresan las secuencias de DNA.

Aún, otro aspecto de la presente invención es un conejo transgénico que tiene un nivel estable en plasma del polipéptido de la apolipoproteína (a) en todos los momentos de su madurez sexual.

Un conejo transgénico que es capaz de expresar los polipéptidos de la apolipoproteína (a) y la apolipoproteína B puede ser creado por un procedimiento que comprende combinar células de línea germinal de un primer conejo que es capaz de expresar la apolipoproteína (a) con células germinales de un segundo conejo que es capaz de expresar la apolipoproteína B. Las células de la línea germinal incluyen, por ejemplo, huevos y esperma.

Un conejo transgénico que es capaz de expresar polipéptidos de la apolipoproteína (a) y la apolipoproteína B y que puede ser creado cruzando un primer conejo que es capaz de expresar la apolipoproteína (a) con otro conejo que es capaz de expresar la apolipoproteína B.

En un método preferido para crear un conejo transgénico capaz de expresar la lipoproteína (a), el conejo que expresa la proteína de la apolipoproteína B se proporciona inyectando un embrión de conejo con un fagómido que contiene el gen de la apolipoproteína B humana.

En un método preferido para crear un conejo transgénico capaz de expresar la lipoproteína (a), el conejo que expresa la apolipoproteína (a) se proporciona inyectando un embrión de conejo con un cromosoma artificial de levadura que contiene un gen de la apolipoproteína (a) humana.

En otro método más para crear un conejo transgénico capaz de expresar la lipoproteína (a), el conejo que expresa la apolipoproteína (a) se proporciona introduciendo en células madre embrionales de un conejo al menos un fragmento de DNA humano que codifica la proteína apolipoproteína (a), combinando la célula madre con un blastocisto de conejo y transfiriendo el embrión a un conejo hembra receptor.

En otro método más para crear un conejo transgénico capaz de expresar la lipoproteína (a), el conejo que expresa la apolipoproteína B se proporciona introduciendo en células madres embrionales de conejo al menos un fragmento de DNA humano que codifica la proteína apolipoproteína B, combinando las células madre con un blastocisto de conejo y transfiriendo el embrión a un conejo hembra receptor.

En todavía otro método más para crear un conejo transgénico capaz de expresar la lipoproteína (a), el conejo que lleva y expresa la apolipoproteína (a) se proporciona infectando un blastómero de conejo con un retrovirus que comprende al menos un fragmento de DNA humano que codifica la proteína apolipoproteína (a) y transfiriendo el blastómero a un conejo hembra receptor.

En otro método más para producir un conejo transgénico capaz de expresar la lipoproteína (a), el conejo que lleva y expresa la apolipoproteína B se proporciona infectando un blastómero de conejo con un retrovirus que comprende al menos un fragmento de DNA humano que codifica la proteína de la apolipoproteína B, y transfiriendo el blastómero a un conejo hembra receptor.

La presente invención también proporciona un método para determinar si un compuesto puede inhibir una enfermedad o trastorno vinculado a la expresión o el metabolismo de la lipoproteína (a) que comprende comparar un primer conejo transgénico que es capaz de producir la lipoproteína (a) humana y que manifiesta una enfermedad o trastorno vinculado a la lipoproteína (a) humana y que ha sido tratado con el compuesto, con un segundo conejo transgénico que es capaz de producir la lipoproteína (a) humana y que manifiesta una enfermedad o trastorno vinculado a la lipoproteína (a) y que no ha sido tratado con el compuesto. La presente invención también proporciona la utilización de este método en el que la enfermedad o el trastorno son seleccionados del grupo que consiste en aterosclerosis, enfermedad cardiovascular, isquemia, infarto, reestenosis, enfermedad de arteria coronaria, enfermedad oclusiva arterial periférica, infarto de miocardio, trombosis, y un perfil lipídico indeseable.

La presente invención también proporciona un método para determinar si un compuesto puede inhibir el ensamblaje de una partícula de lipoproteína (a) que comprende comparar el nivel de producción de la lipoproteína (a) en un primer conejo transgénico que ha sido tratado con dicho compuesto y que es capaz de producir lipoproteína (a) humana a un nivel de producción de lipoproteína (a) en un segundo conejo transgénico que no ha sido tratado con dicho compuesto y que es capaz de producir la lipoproteína (a) humana. La presente invención también proporciona la utilización de este método en el que el compuesto se selecciona del grupo que consiste en ácidos nucleicos antisentido, y proteínas de unión intracelulares.

La presente invención proporciona conejos transgénicos, un modelo animal apropiado de enfermedades y trastornos mediados por lipoproteína (a). Los conejos expresan proteínas de lipoproteína (a) constituyentes en un nivel alto para facilitar la asociación covalente de los constituyentes para producir niveles fisiológicamente relevantes de lipoproteína (a). Los conejos ofrecen ventajas significativas frente a los ratones transgénicos, debido, en parte, al mayor tamaño del conejo que facilita el estudio de daños vasculares y reestenosis. Además, aunque los conejos sean similares a los ratones en la falta de la apolipoproteína (a) y la lipoproteína (a), el perfil de lipoproteína del conejo imita más estrechamente al de los seres humanos con LDL como la proteína predominante en plasma. Además, los conejos también desarrollan lesiones ateroscleróticas similares a las de un humano bien caracterizadas cuando se alimentan con una dieta rica en colesterol.

Breve descripción de los dibujos Figura 1 Análisis PCR de apoB y apo (a) humanas en conejos transgénicos

El DNA genómico preparado a partir de animales fundadores y progenie derivada de cruzar transgénicos de apo (a) y apoB fue sometido al análisis de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El fundador transgénico de la apo (a) (muestra 2) contenía el clon genómico de apo (a) completo como se verifica por la amplificación con cuatro juegos de iniciadores diferentes: región 5' de plasminógeno (PMG 5'), apo (a) 5', apo (a) 3' y gen 3' del tipo apo (a) (posiciones indicadas debajo del diagrama del clon genómico). Fueron detectados fundadores transgénicos de ApoB (muestra 1) usando una sola reacción PCR específica para secuencias humanas. Los análisis de progenie representativa de los cruces de apo (a)/apoB, mostrados en las muestras 3 y 4 (apo (a) sólo y apo (a)/apoB combinado, respectivamente), confirmaron la transmisión del transgen. Para cada juego de iniciador, el DNA del clon genómico de apo (a) o apoB fue incluido como control positivo (muestra 5).

Figura 2 Distribución en tejido de la expresión del transgen de apo (a) y apoB.

La expresión de apo (a) (dibujo A) y apoB humanas (dibujo B) fue analizada en los tejidos indicados de conejos control (c) y transgénicos (tg) por el análisis de la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR). Como un control de la especificidad de apoB humana, así como por la calidad de la muestra, el mRNA de apoB de conejo también fue amplificado usando iniciadores específicos de especie (dibujo C).

Figura 3 Transcurso de tiempo de los niveles de apo (a) en conejos transgénicos

Fueron tomadas muestras en plasma de conejos transgénicos de apo (a) masculinos y femeninos en 3 momentos después del nacimiento: 3, 6 y 9 meses. 1 \mul de cada muestra fue sometida a SDS-PAGE en condiciones reductoras e inmunotransferencia usando anticuerpos producidos contra apo (a).

Figura 4 Inmunotransferencia de plasma de conejo transgénico

Volúmenes iguales de plasma (1 \mul) de conejo transgénico (1) de apo (a) humana, un conejo transgénico (2) de apoB/apo (a) humana, y un conejo transgénico (3) de apoB humano fueron fraccionados por tamaño mediante SDS-PAGE. Los geles fueron corridos en condiciones no reductoras (dibujo A) y en condiciones reductoras (dibujos B y C). La inmunotransferencia fue realizada usando anticuerpos producidos contra apo (a) (dibujos A y B) y contra apoB humana (dibujo C). Fue incluido plasma humano como control. Los tamaños de las proteínas observadas fueron evaluados usando una curva de estándares de peso moleculares preteñidos de migración frente a la distancia de migración.

Figura 5 Inmunotransferencia de fracciones de lipoproteína a partir de conejos transgénicos

100 \mul de plasma de conejos transgénicos (A) de apoB/apo (a) humana o conejos transgénicos (B) de apo (a) fueron fraccionados por tamaño por cromatografía en una columna 6 de Superose. Incluso las fracciones numeradas (6-40) fueron sometidas a SDS-PAGE en condiciones no reductoras e inmunotransferencia usando anticuerpos producidos contra apo (a). Los intervalos de tamaño de lipoproteína, determinados por el ensayo del colesterol de las fracciones, son indicados en la barra entre los dibujos A y B.

Figura 6 Alineación de la secuencia de proteína de apoB de humano y conejo

Secuencia de proteínas de apoB de conejo (restos 4315-4364; SEC. ID Nº.:7) alineada con las regiones homólogas de apoB de humano (SEC. ID Nº.:8), rata (SEC. ID Nº.:9), cerdo (SEC. ID Nº.:10) y pollo (SEC. ID Nº.:11). La identidad de la secuencia se indica con mayúsculas. La numeración anterior de las secuencias corresponde a la secuencia de apoB humana. El * indica el sitio de unión de la apo (a) a la apoB humana.

Definiciones

Los siguientes términos definidos se usan a través de toda la presente memoria descriptiva, y deberían ser provechosos en el entendimiento del alcance y la práctica de la presente invención.

Un "polipéptido" es un compuesto polimérico compuesto de restos de aminoácidos covalentemente unidos. Los aminoácidos tienen la estructura general siguiente:

R --

\melm{\delm{\para}{NH _{2} }}{C}{\uelm{\para}{H}}

-- COOH

Los aminoácidos se clasifican en siete grupos en base a la cadena lateral R: (1) cadenas laterales alifáticas, (2) cadenas laterales que contienen un grupo hidroxílico (OH), (3) cadenas laterales que contienen átomos de azufre, (4) cadenas laterales que contienen un ácido o un grupo amida, (5) cadenas laterales que contienen un grupo básico, (6) cadenas laterales que contienen un anillo aromático, y (7) prolina, un ácido de imino en el cual la cadena lateral se funde con el grupo amino.

Una "proteína" es un polipéptido que juega un papel estructural o funcional en una célula viva. Dentro del significado de la presente invención, la designación "complejo de lipoproteína (a)" es entendida para abarcar a las apolipoproteínas (a) y B así como Lp (a) y cualquier otro producto proteico que tenga una actividad de Lp (a). Preferiblemente, el término producto proteico se refiere a cualquier mutante, fragmento o péptido que posea, al menos, una propiedad biológica de una apolipoproteína, así como cualquier variante natural de las apolipoproteínas. Los polipéptidos y proteínas de la invención pueden ser glicosilados o no glicosilados.

Una "variante" de un polipéptido o una proteína es cualquier análogo, fragmento, derivado, o mutante que se derive de un polipéptido o una proteína y que conserve al menos una propiedad biológica del polipéptido o de la proteína. Pueden existir en la naturaleza variantes diferentes del polipéptido o de la proteína. Estas variantes pueden ser variaciones alélicas caracterizadas por diferencias en las secuencias de nucleótidos del gen estructural que codifica para la proteína, o pueden implicar la división diferencial o la modificación post-translacional. Las variantes también incluyen una proteína relacionada que tiene sustancialmente la misma actividad biológica, pero que se obtiene a partir de una especie diferente.

El experto en la técnica puede producir variantes que tienen sustituciones de aminoácidos simples o múltiples, deleciones, adiciones, o reemplazos. Estas variantes pueden incluir, entre otras: (a) variantes en las cuales uno o varios restos de aminoácidos son sustituidos con aminoácidos conservativos o no conservativos, (b) variantes en que uno o varios aminoácidos son añadidos al polipéptido o a la proteína, (c) variantes en las cuales uno o varios de los aminoácidos incluyen un grupo sustituyente, y variantes (d) en las cuales el polipéptido o la proteína se fusiona con otro polipéptido tal como albúmina de suero. Se conocen técnicas para obtener estas variantes, incluyendo técnicas genéticas (supresiones, deleciones, mutaciones, etc.), químicas y enzimáticas, por los expertos ordinarios en la técnica.

Si tales variaciones alélicas, análogos, fragmentos, derivados, mutantes, y modificaciones, incluyendo las formas de división de mRNA alternativas y formas de modificación alternativas post-translacionales, causan derivados del polipéptido que conservan cualquiera de las propiedades biológicas del polipéptido, se pretende que estos estén incluidos en la amplitud de esta invención.

Un "ácido nucleico" es un compuesto polimérico comprendido de subunidades covalentemente unidas llamadas nucleótidos. El ácido nucleico incluye el ácido polirribonucleico (RNA) y el ácido polidesoxirribonucleico (DNA), ambos de los cuales pueden ser monocatenario o bicatenario. El DNA incluye cDNA, DNA genómico, DNA sintético y DNA semisintético. La secuencia de nucleótidos que codifica una proteína se llama secuencia sentido. Un "gen de apo (a)" es cualquier gen que codifique una proteína apolipoproteína (a). Un "gen de apoB" es cualquier gen que codifique
una proteína apolipoproteína B. Los genes de Apo (a) y apoB preferidos codifican proteínas apo (a) humana y apoB.

Como se usa en este documento, el término "homólogo" en todas sus formas gramaticales y variaciones de ortografía se refiere a la relación entre las proteínas que poseen un "origen evolutivo común", incluyendo proteínas de superfamilias (por ejemplo, la superfamilia de inmunoglobulina) y proteínas homólogas de especies diferentes (por ejemplo, la cadena ligera de miosina, etc.) (Reeck et al., 1987, Cell 50:667). Tales proteínas (y sus genes de codificación) tienen homología de secuencia, como se refleja por su alto grado de semejanza de la secuencia.

En consecuencia, la expresión "semejanza de secuencia" en todas sus formas gramaticales se refiere al grado de identidad o correspondencia entre las secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos de las proteínas que pueden o no compartir un origen evolutivo común (véase Reeck et al., supra). Sin embargo, en el uso común y en la presente aplicación, el término "homólogo", cuando se modifica con un adverbio como "sumamente", puede referirse a la semejanza de secuencia y no a un origen evolutivo común.

En una realización específica, dos secuencias de DNA son "sustancialmente homólogas" o "sustancialmente similares" cuando al menos aproximadamente el 50% (preferiblemente al menos aproximadamente el 75%, y lo más preferiblemente al menos aproximadamente el 90 o el 95%) de los nucleótidos coinciden con la longitud definida de las secuencias de DNA. Las secuencias que son sustancialmente homólogas pueden ser identificadas comparando las secuencias usando el software estándar disponible en los bancos de datos de secuencias, o en un experimento de hibridación Southern, por ejemplo, en condiciones rigurosas tal como se define para aquel sistema particular. Definir las condiciones de hibridación apropiadas está dentro de la maestría de la técnica. Véase, por ejemplo, Maniatis et al., supra; DNA Cloning, Vols. I y II, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.

Asimismo, en una realización particular, dos secuencias de aminoácidos son "sustancialmente homólogas" o "sustancialmente similares" cuando más de aproximadamente el 30% de los aminoácidos son idénticos, o más de aproximadamente el 60% son similares (funcionalmente idénticos). Preferiblemente, las secuencias similares u homólogas son identificadas por alineación utilizando, por ejemplo, el programa de choque en cadena GCG (Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wisconsin).

La expresión "correspondiente a" se usa en este documento para referirse a secuencias similares u homólogas, si la posición exacta es idéntica o diferente de la molécula en la cual la semejanza o la homología es medida. Una alineación de secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos puede incluir espacios. De esta forma, el término "correspondiente a" se refiere a la semejanza de la secuencia, y no a la enumeración de los restos de aminoácidos o bases del nucleótido.

La presente invención se refiere a animales transgénicos, es decir, conejos, que contienen genes que codifican análogos y derivados de apolipoproteínas que tienen la misma actividad funcional u homóloga como las apolipoproteínas, y sus homólogos de otras especies. La producción y el uso de derivados y análogos relacionados con apolipoproteínas están en la amplitud de la presente invención. En una realización específica, el derivado o el análogo son funcionalmente activos, es decir, son capaces de exhibir una o varias actividades funcionales asociadas con una apolipoproteína de cadena completa, del tipo natural de la invención. En particular, un derivado de la apolipoproteína de la invención es capaz de formar una partícula de Lp (a) funcional humana.

Los derivados de apolipoproteína pueden prepararse cambiando la codificación de las secuencias de los ácidos nucleicos por sustituciones, adiciones o deleciones que proporcionen moléculas funcionalmente equivalentes. Preferiblemente, los derivados se preparan tal que han realzado o aumentado la actividad funcional en relación con las apolipoproteínas nativas, es decir, apo (a) y apoB. Como se usa en este documento, el término "apolipoproteína" se refiere a apo (a) o a apoB.

Debido a la degeneración de las secuencias que codifican nucleótidos, pueden usarse otras secuencias de DNA que codifican sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que un gen de la apolipoproteína en la práctica de la presente invención. Estos incluyen, pero no están limitados, alelos, genes homólogos de otras especies, y secuencias de nucleótidos que comprenden todo o partes de los genes de la apolipoproteína que se intercambian por la sustitución de los codones diferentes que codifican el mismo resto de aminoácido dentro de la secuencia, produciendo así un cambio silencioso. De la misma manera, los derivados de apolipoproteína de la invención incluyen, pero no están limitados, a aquellos que contienen, como una secuencia de aminoácidos primaria, todo o parte de la secuencia de aminoácidos de una apolipoproteína incluyendo las secuencias cambiadas en las cuales los restos de aminoácidos funcionalmente equivalentes son sustituidos por restos dentro de la secuencia causando una sustitución de aminoácidos conservativa. Por ejemplo, uno o varios restos de aminoácidos dentro de la secuencia pueden ser sustituidos por otro aminoácido de una polaridad similar, que actúa como equivalente funcional, causando una alteración silenciosa. Los sustitutos de un aminoácido dentro de la secuencia pueden ser seleccionados de otros miembros de la clase a la cual el aminoácido pertenece. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina. Los aminoácidos que contienen estructuras aromáticas de anillo son fenilalanina, triptófano y tirosina. Los aminoácidos polares neutros incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina. Los aminoácidos positivamente cargados (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina. Los aminoácidos negativamente cargados (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. No se esperara que tales alteraciones afecten al peso molecular aparente como se determina por electrofóresis en gel de poliacrilamida, o por enfoque isoeléctrico. Sustituciones particularmente preferidas son:

-

Lys por Arg y viceversa tal que puede ser conservada una carga positiva;

-

Glu por Asp y viceversa tal que puede ser conservada una carga negativa;

-

Ser por Thr tal que puede ser conservado un OH- libre; y -Gln por Asn tal que puede ser conservado un CONH_{2} libre.

También pueden introducirse sustituciones de aminoácidos para sustituir un aminoácido con una propiedad particularmente preferible. Por ejemplo, una Cys puede introducirse en un sitio potencial para puentes disulfuro con otra Cys. Una His puede introducirse como un sitio particularmente "catalítico" (es decir, la His puede actuar como un ácido o base y es el aminoácido más común en la catálisis bioquímica). Pro puede introducirse debido a su estructura particularmente plana, que induce al plegamiento \beta en la estructura de la proteína.

Los genes que codifican derivados de apolipoproteína y análogos de la invención pueden producirse por varios métodos conocidos en la técnica. Las manipulaciones que causan su producción pueden darse a nivel de proteína o de gen. Por ejemplo, la secuencia del gen de la apolipoproteína clonada puede ser modificada según cualquiera de las numerosas estrategias conocidas en la técnica (Sambrook et al., 1989, supra). La secuencia puede ser dividida en sitios apropiados con endonucleasa(s) de restricción, seguido además por una modificación enzimática de ser deseada, puede aislarse, y unirse in vitro. En la producción del gen que codifica un derivado o análogo de una apolipoproteína, debería tenerse cuidado de asegurar que el gen modificado permanece dentro del mismo marco de lectura de translación que el gen de la apolipoproteína nativa, ininterrumpido por señales de parada de translación, en la región génica donde la actividad deseada es codificada.

Además, la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la apolipoproteína puede ser transformada in vitro o in vivo, crear y/o destruir secuencias de traducción, iniciación, y/o terminación, o crear variaciones en la codificación de regiones y/o formar nuevos sitios de restricción de la endonucleasa o destruir los preexistentes, para facilitar más la modificación in vitro. Preferiblemente, tales mutaciones realzan la actividad funcional del producto génico de la apolipoproteína transformada. Cualquier técnica para la mutagénesis conocida en la técnica puede ser usada, incluyendo, pero no limitado, mutagénesis dirigida in vitro (Hutchinson, C., et al., 1978, J. Biol. Chem. 253:6551; Zoller y Smith, 1984, DNA 3:479-488; Oliphant et al., 1986, Gen 44:177; Hutchinson et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:710), el uso de enlazadores TAB (Pharmacia), etc. Las técnicas PCR son preferidas para la mutagénesis dirigida (véase Higuchi, 1989, "Using PCR to Engineer DNA", en PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H. Erlich, ed., Stockton Press, Capítulo 6, págs. 61-70).

Generalmente, los ácidos nucleicos de la presente invención se unen a una o varias regiones reguladoras. La selección de la región reguladora apropiada o regiones es una materia rutinaria, dentro del nivel del experto ordinario en la técnica. "Región reguladora" significa una secuencia de ácidos nucleicos que regula la expresión de una segunda secuencia de ácidos nucleicos. Una región reguladora puede incluir las secuencias que son naturalmente responsables de expresar un ácido nucleico particular (una región homóloga) o puede incluir las secuencias de un origen diferente (responsable de expresar proteínas diferentes o proteínas incluso sintéticas). En particular, las secuencias pueden ser secuencias de genes eucarióticas o virales o secuencias derivadas que estimulan o reprimen la transcripción de un gen en una manera específica o no específica y en una manera inducible o no inducible. Las regiones reguladoras incluyen orígenes de replicación, sitios de división de RNA, potenciadores, secuencias de terminación transcripcionales, secuencias señal que dirigen al polipéptido en las rutas secretorias de la célula objetivo y promotores.

Las regiones reguladoras pueden comprender una región de promotor para la transcripción funcional en células de endotelio, hígado, testículo, cerebro u otros tipos de células en las que es deseada la expresión de apo (a) y apoB, así como una región situada en 3' del gen de interés, y que especifica una señal para la terminación de la transcripción y un sitio de poliadenilación. Todos estos elementos constituyen un casete de expresión.

Los "promotores" que pueden usarse en la presente invención incluyen tanto a promotores constitutivos como a promotores regulados (inducibles). El promotor puede ser naturalmente responsable de la expresión del ácido nucleico. También puede ser de una fuente heteróloga. En particular, puede ser secuencias de promotor de genes eucariotas o virales. Por ejemplo, puede ser secuencias de promotor derivadas del genoma de la célula que se desea infectar. De la misma manera, puede ser secuencias de promotor derivadas del genoma de un virus, incluyendo el adenovirus usado. En cuanto a esto, pueden ser mencionados, por ejemplo, los promotores de los genes E1A, MLP, CMV y RSV y otros similares. Las secuencias de promotor no virales que preferiblemente se usan son los promotores de ApoAI o los potenciadores hepáticos de ApoE o los potenciadores intestinales de apoCIII. Naturalmente, estas secuencias de expresión además pueden modificarse añadiendo secuencias de activación, secuencias reguladoras, etc. El DNA genómico también puede ser incluido en un vector de expresión de gran capacidad tal como el vector P1 o sea el YAC, vectores de cósmido o plásmido.

Además, el promotor puede ser modificado por la adición de secuencias de activación o reguladoras o secuencias que permiten una expresión específica de tejido o predominante (promotores de enolasa y GFAP y similares). Además, cuando el ácido nucleico no contiene las secuencias del promotor, puede ser insertado, tal como en el genoma del virus hacia abajo de tal secuencia.

Algunos promotores útiles para la práctica de esta invención son promotores ubicuos (por ejemplo, HPRT, vimentina, actina, tubulina), promotores filamentosos intermedios (por ejemplo, desmina, neurofilamentos, queratina, GFAP), promotores génicos terapéuticos (por ejemplo, del tipo MDR, CFTR, factor VIII), promotores específicos tisulares (por ejemplo, el promotor de actina en células del músculo liso), promotores que preferencialmente son activados en células que se dividen, promotores que responden a un estímulo (por ejemplo el receptor de la hormona esteroidea, el receptor del ácido retinoico), moduladores de transcripción regulados por tetraciclina, citomegalovirus de actividad inmediata, promotores de LTR retroviral, metalotioneína, SV-40, Ela y MLP. Se describen moduladores de transcripción regulados por tetraciclina y promotores de CMV en los documentos WO 96/01313, US 5.168.062 y US 5.385.839.

Una región reguladora de una "fuente heteróloga" es una región reguladora que no está asociada naturalmente con el ácido nucleico expresado. Incluidas entre las regiones heterólogas reguladoras están regiones reguladoras de una especie diferente, regiones reguladoras de un gen diferente, secuencias reguladoras híbridas, y secuencias reguladoras que no ocurren en la naturaleza, pero que son diseñadas por un experto ordinario en la técnica.

Un "vector" es cualquier medio para la transferencia de un ácido nucleico de acuerdo con la invención en una célula huésped. El término "vector" incluye tanto un medio viral como no viral para introducir el ácido nucleico en una célula in vitro, ex vivo o in vivo. Los vectores no virales incluyen plásmidos, fagómidos, BAC, PAC, YAC, P1, liposomas, lípidos cargados eléctricamente (citofectinas), complejos DNA-proteína, y biopolímeros. Los vectores que contienen un ácido nucleico de acuerdo con la invención pueden incluir vectores de plásmido, fagómido, P1, BAC, PAC, YAC o cósmido. Los vectores de interés particular para la invención incluyen los que son capaces de acomodar grandes secuencias de DNA, (es decir, vectores de fagómidos, plásmidos, P1, BAC, PAC, YAC o cósmido), especialmente en el caso de las secuencias de DNA genómicas que pertenecen a la invención. Además de un ácido nucleico de acuerdo con la invención, un vector también puede contener una o varias regiones reguladoras, y/o marcadores seleccionables útiles al seleccionar, medir y controlar los resultados de la transferencia de los ácidos nucleicos (transferencia a qué tejidos, duración de la expresión, etc.).

"Perfil lipídico" significa el grupo de concentraciones de colesterol, triglicérido, colesterol de lipoproteína y otros lípidos en el cuerpo de un humano u otro animal.

Un "perfil lipídico indeseable" es la condición en la que las concentraciones de colesterol, triglicérido, o colesterol de lipoproteína están fuera de los intervalos de referencia ajustados de edad y género. Generalmente, una concentración de colesterol total > 200 mg/dl, de triglicéridos en plasma > 200 mg/dl, de colesterol LDL > 130 mg/dl, de colesterol HDL < 39 mg/dl, o una relación de colesterol total al colesterol HDL > 4,0 es considerado un perfil lipídico indeseable. Un perfil lipídico indeseable está asociado con una variedad de condiciones patológicas, incluyendo hiperlipidemias, diabetes, hipercolesterolemia, aterosclerosis y otras formas de enfermedad de arteria coronaria.

La regulación baja de la expresión génica usando ácidos nucleicos antisentido puede ser alcanzada en el nivel translacional o transcripcional. Los ácidos nucleicos antisentido de la invención son preferiblemente fragmentos de ácidos nucleicos capaces de hibridarse específicamente con un ácido nucleico que codifica la apolipoproteína (a) o B o los RNA mensajeros correspondientes. Estos ácidos nucleicos antisentido pueden ser oligonucleótidos sintéticos, opcionalmente modificados para mejorar su estabilidad y selectividad. También pueden ser secuencias de DNA cuya expresión en la célula produce RNA complementario a todo o parte del mRNA que codifica la apolipoproteína (a) o B. Los ácidos nucleicos antisentido pueden prepararse por la expresión de todo o parte de un ácido nucleico que codifica la apolipoproteína (a) o B, en la orientación opuesta, como se describe en el documento EP 140308. Cualquier longitud de la secuencia antisentido es adecuada para la práctica de la invención mientras que sea capaz de disminuir u obstruir la expresión de la apolipoproteína (a) o B. Preferiblemente, la secuencia antisentido es de al menos 20 nucleótidos en longitud. La preparación y el uso de ácidos nucleicos antisentido, DNA que codifica RNA antisentido y el uso de oligo y antisentido genético se describen en el documento WO 92/15680.

Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" comprende diluyentes y cargas que son farmacéuticamente aceptables para los métodos de administración, son estériles, y pueden ser suspensiones acuosas u oleaginosas formuladas usando los agentes de dispersión o humectantes adecuados y agentes de suspensión. El vehículo farmacéuticamente aceptable particular y la relación de compuesto activo a vehículo son determinados por la solubilidad y las propiedades químicas de la composición, el modo particular de administración y la práctica estándar farmacéutica.

La expresión "nivel fisiológico" se usa en este documento para referirse al nivel de expresión de la proteína, o producción de Lp (a), que origina el animal transgénico que posee un perfil de lipoproteína que imita estrechamente al de los seres humanos. En particular, el animal transgénico es capaz de desarrollar lesiones bien caracterizadas similares a las de un humano aterosclerótico cuando se alimenta con una dieta rica en colesterol. En una realización específica, el nivel de Lp (a) en el animal transgénico está dentro del intervalo encontrado en los seres humanos.

Las expresiones "animales transgénicos" y "animal" se usan en este documento para incluir todos los animales vertebrados, excepto a los seres humanos. Esto también incluye un animal individual en todas las etapas de su desarrollo, incluyendo las etapas embrionarias y fetales. Un "animal transgénico" es un animal que contiene una o varias células que llevan información genética recibida, directamente o indirectamente, por la manipulación genética deliberada a nivel subcelular, tal como por la microinyección o la infección con virus recombinantes. Esta molécula de DNA introducida puede integrarse dentro de un cromosoma, o puede ser DNA que se replica extra-cromosómicamente. La expresión "animal transgénico de línea celular germinal" se refiere a un animal transgénico en el que la información genética fue introducida en una célula de línea germinal, confiriendo así la capacidad de transferir la información al descendiente.
Si tal descendiente, de hecho, posee algo o toda la información, entonces ellos, también, son animales transgénicos.

Descripción detallada de la invención

Como se menciona arriba, hay una necesidad en la técnica de un modelo de animal apropiado de enfermedades y trastornos mediados por Lp (a). En particular, es importante proporcionar un modelo experimental para el análisis in vivo de la lipoproteína (a) humana. Los solicitantes han obtenido por primera vez en la técnica conejos transgénicos capaces de proporcionar lipoproteína (a).

Los conejos transgénicos representan una alternativa cada vez más utilizada en el estudio de apolipoproteínas y su impacto en el metabolismo de lipoproteína y la aterogénesis (Fan, et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol (1995) 15, 1889-1899; Duverger, et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol (1996) 16, 1424-1429). Las ventajas de este animal, comparado con el ratón, se refieren en parte con su, relativamente, gran tamaño, permitiendo estudios fáciles de daño vascular y reestenosis. Además, aunque los conejos sean similares a los ratones en la carencia de apo (a) y Lp (a), su perfil de lipoproteína imita más estrechamente al de los seres humanos, siendo LDL la lipoproteína predominante en el plasma (Chapman, M. J., en "Methods in Enzymology", vol. 128: Plasma Lipoproteins, Part A, Preparation, Structure, and Molecular Biology Segrest, J. P., y Albers, J. J., Eds. (Academic Press, Inc., New York, 1986), vol. 128, págs. 70-143). Los conejos también desarrollan lesiones similares a un humano aterosclerótico bien caracterizadas cuando se alimentan con una dieta rica en colesterol.

En la amplitud de la presente invención, el conejo ha demostrado ser el modelo de animal apropiado. Existe un conocimiento comprensivo del metabolismo del conejo y de las enfermedades de este animal que están relacionadas con las lipoproteínas. El conejo es un animal que se clasifica como "mamífero LDL", es decir, los LDL son los transportadores principales del colesterol en plasma como en el hombre, contrariamente a ratas y ratones, que son animales clasificados como "mamífero HDL". Además, existe un número grande de variaciones genéticas en las lipoproteínas dentro de las líneas de conejo, tales como en los conejos WHHL que son deficientes en el receptor de LDL (conejo hiperlipidémico hereditario de Watanabe) o los otros conejos de "St. Thomas Hospital", que sobreproducen LDL (Rosenfeld et al., 1990, Arteriosclerosis 10, 680-687; Sedon et al.; 1987, Arteriosclerosis 7, 113-124).

La presente invención proporciona un nuevo modelo animal relativamente grande para estudiar las propiedades biológicas de Lp (a), en la forma de un conejo que contiene ambos transgenes genómicos humanos para apo (a) o apoB. Los conejos muestran una expresión eficiente específica de tejido tanto de transgenes humanos como del ensamblaje de las partículas de Lp (a). Además, la apo (a) actúa covalentemente in vivo con la apoB de conejo y el modelo de conejo transgénico representa un medio para caracterizar esta nueva interacción. Los solicitantes han preparado un conejo transgénico en cuyo genoma han sido insertadas secuencias de DNA genómicas exógenas que codifican las proteínas de la apolipoproteína (a) y la apolipoproteína B que forman un complejo de lipoproteína (a).

Además de proporcionar ideas únicas en el ensamblaje de la Lp (a) y la expresión de apo (a), varias propiedades de los conejos transgénicos de Lp (a) proporcionados según esta invención representan mejoras de los modelos actualmente disponibles de animales para investigar la Lp (a). Estos animales poseen un perfil de lipoproteína que imita estrechamente al de los seres humanos y que desarrollan lesiones bien caracterizadas similares a las de un humano aterosclerótico cuando se alimenta con una dieta rica en colesterol. También, debido a su tamaño relativamente grande, han sido usados satisfactoriamente en estudios de daño vascular y reestenosis. De esta forma, estos conejos transgénicos proporcionarán un recurso valioso para estudiar factores que afectan a los niveles de Lp (a) así como a los efectos de Lp (a) en la progresión de aterosclerosis y enfermedad vascular.

Puede usarse cualquier conejo para preparar un animal transgénico de la invención. Preferiblemente, el conejo es de una estirpe homogénea de laboratorio, que puede ser obtenida a partir de cualquier fuente de animal tal como Charles River o Jackson Laboratories (Bar Harbor, Maine). En una realización específica, infra, el conejo es un conejo blanco de Nueva Zelanda. De forma alternativa, puede ser generado un conejo transgénico hiperlipidémico de Watanabe de la invención.

Un procedimiento preferido para crear el conejo transgénico comprende inyectar, en un embrión de conejo, secuencias de DNA genómicas exógenas que codifican las proteínas apo (a) o apoB que forman un complejo de lipoproteína (a), transferir el embrión a un conejo receptor y, después del nacimiento, comprobar la presencia de las secuencias de DNA genómicas en el genoma de los conejos recién nacidos. Los conejos transgénicos de Apo (a) y los conejos transgénicos de apoB son cruzados entonces para producir el conejo transgénico de apo (a)-apoB que expresa a la Lp (a).

El procedimiento para crear el conejo transgénico se describe más detalladamente en el Ejemplo 2 debajo. La puesta en práctica de tal procedimiento no presenta ninguna dificultad para una persona experta que esté familiarizada con las técnicas de microinyección, y de retirada e implantación de embriones, así como cría de animales.

La presente invención se refiere especialmente al uso de un clon (YAC) de cromosoma artificial de levadura de 270 kb que contiene el gen de la apo (a) humana y un clon de fagómido P1 de 90 kb que contiene el gen de la apoB humana para crear un conejo transgénico que expresa a ambos transgenes. El conejo transgénico de la presente invención exhibe la expresión específica de tejido de ambos transgenes que se localiza predominantemente en el hígado. En contraste con las observaciones en ratones transgénicos de apo (a), la presente invención da como resultado niveles de apo (a) en plasma que son estables en todos los momentos de la madurez sexual en los conejos. Además, la apo (a) es capaz de formar una asociación covalente con la apoB de conejo endógeno, aunque con una eficacia inferior que su asociación con la apoB humana. La invención de este modelo de conejo transgénico de Lp (a) proporciona nuevas ideas en los requerimientos estructurales para el ensamblaje de la Lp (a) y la regulación de la expresión de apo (a). Además, estos conejos transgénicos representan un nuevo modelo experimental para el análisis in vivo de Lp (a) y el desarrollo de estrategias terapéuticas para reducir el riesgo de aterosclerosis asociado con altos niveles de esta lipoproteína.

En consecuencia, la presente invención proporciona un conejo transgénico que comprende tanto genes de apo (a) como de apoB o sus variantes, y el conejo es capaz de expresar estos genes tal que se forma un complejo de lipoproteína (a).

La presente información genética en los conejos transgénicos puede ser extraña a la especie de animal a la que pertenece el receptor, (es decir, exógena) extraña sólo al receptor individual particular (es decir, exógena), o a la información genética ya poseída por el receptor. En el último caso, el gen introducido puede expresarse de manera diferente comparado con el gen endógeno nativo.

Los genes pueden ser obtenidos aislándolos de fuentes genómicas, por preparación de los cDNA de plantillas de RNA aisladas, por síntesis dirigida, o por alguna de sus combinaciones. En una realización preferida de la invención, los genes de apo (a) humana y apoB se clonan a partir del DNA genómico, tal que la expresión de los transgenes se regula de una manera apropiada y es independiente de su sitio de integración en el DNA cromosómico del animal transgénico.

Un conejo transgénico de acuerdo con la invención puede integrar las secuencias de DNA genómicas en todas sus células o sólo en un cierto porcentaje de células; en el último caso sería llamado mosaico. En general, las secuencias de DNA genómicas son integradas en todas las células. Las secuencias de DNA genómicas insertadas de acuerdo con la invención codifican todo, o una parte activa, de las proteínas que están implicadas en la formación del complejo de lipoproteína (a) y/o en el metabolismo. Estas secuencias de DNA genómicas también pueden contener varios genes que están organizadas, si es necesario, en forma de racimo.

Las secuencias de DNA insertadas dentro del significado de la presente invención que pueden ser citadas más específicamente son los genes que codifican todo o una parte activa de las apolipoproteínas (a), B, o una variante o un derivado de estas apolipoproteínas, y forman un complejo de Lp (a).

Más expecíficamente, un gen debería ser operativamente unido a una región reguladora. Las regiones reguladoras, tales como los promotores, pueden usarse para aumentar, disminuir, regular o designar a ciertos tejidos o a ciertas etapas del desarrollo la expresión de un gen. El promotor no tiene que ser un promotor que se de naturalmente. Los "animales transgénicos no humanos" de la invención son producidos introduciendo "transgenes" en la línea germinal del animal no humano. Los métodos que permiten la introducción de DNA en células están generalmente disponibles y son conocidos en la técnica. Podrían usarse diferentes métodos de introducir transgenes. Generalmente, el cigoto es el objetivo preferido para la microinyección. El uso de cigotos como objetivo para la transferencia génica tiene una ventaja principal. En la mayor parte de los casos, el DNA inyectado será incorporado en el gen huésped antes de la primera división (Brinster, et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 4438-4442). Por consiguiente, casi todas las células del animal transgénico no humano llevarán el transgen incorporado. Generalmente, esto también causará la transmisión eficiente del transgen al descendiente del fundador ya que el 50% de las células germinales contendrán el transgen. La microinyección de cigotos es un método preferido para incorporar transgenes a la práctica de la invención.

La infección retroviral también puede usarse para introducir un transgen en un animal no humano. El embrión no humano que se desarrolla puede ser cultivado en la etapa de blastocisto in vitro. Durante este tiempo, los blastómeros pueden ser objetivos para la infección retroviral (Jaenich, R. (1976) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73, 1260-1264). La infección eficiente de los blastómeros es obtenida por tratamiento enzimático para eliminar la zona pellucida (Hogan et al., (1986) en Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). El sistema de vector viral usado para introducir el transgen es típicamente un retrovirus defectuoso de replicación que lleva el transgen (Jahner et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6927-6931; Van der Putten et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6148-6152). La transfección se obtiene fácilmente y de manera eficiente cultivando los blastómeros sobre una monocapa de células que producen el virus (Van der Putten et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6148-6152; Stewart et al., (1987) J EMBO. 6:383-388). De forma alternativa, la infección puede realizarse en una etapa posterior. El virus o células que producen el virus pueden ser inyectados en el blastocito (Jahner et al., (1982) Nature 298:623-628.). La mayor parte de los animales fundadores serán mosaicos para el transgen ya que la incorporación ocurre sólo en un subconjunto de las células que formaron el animal transgénico no humano. Además, el animal fundador puede contener inserciones retrovirales del transgen en una variedad de posiciones en el genoma; estos generalmente segregan en el descendiente. Además, es posible también introducir transgenes en la línea germinal, aunque con baja eficacia, por la infección intrauterina retroviral del embrión en media gestación (Jahner et al., (1982) Nature 298:623-628.).

Un tercer tipo de célula objetivo para la introducción de un transgen es la célula madre embrional (ES). Las células ES son obtenidas de embriones de preimplantación cultivados in vitro (Evans, M.J., et al., (1981) Nature 292, 154-156; Bradley, A., et al. (1984) Nature 309, 255-258; Gossler, et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 9065-9060; y Robertson, et al., (1986) Nature 322, 445-448). Los transgenes pueden introducirse de manera eficiente en células ES por transfección de DNA o por la transducción mediada por retrovirus. Las células ES transformadas resultantes a partir de entonces pueden combinarse con blastocistos de un animal no humano. Las células ES colonizan el embrión y contribuyen a la línea germinal del animal quimérico resultante (para la revisión, véase Jaenisch, R. (1988) Science 240, 1468-1474).

Los métodos para evaluar la presencia del DNA introducido así como su expresión están fácilmente disponibles y son conocidos en la técnica. Tales métodos incluyen, pero no están limitados con la hibridación de DNA (Southern) para detectar el DNA exógeno, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la electrofóresis en gel de poliacrilamida (PAGE) y las transferencias Western para detectar el DNA, el RNA y la proteína.

Los conejos que poseen secuencias que codifican la apolipoproteína (a) humana en su DNA genómico, incluyendo su DNA de línea germinal, se cruzan con los conejos que poseen la apolipoproteína B humana en su DNA genómico, incluyendo su DNA de línea germinal. En una realización específica, un conejo transgénico que expresa apo-B puede cruzarse con un conejo transgénico que exprese niveles fisiológicos de apo (a), como se describe en el documento WO 95/25793 y que está transferida en la solicitud de patente de EE.UU. Nº. 08/704.582, ahora patente de EE.UU. Nº. 5.792.902, publicada el 11 de agosto de 1998.

La progenie resultante entonces se selecciona para identificar a aquellos conejos que expresen la apolipoproteína (a) y la apolipoproteína B, tal que la lipoproteína (a) es producida.

Como se usa en este documento, un "transgen" es una secuencia de DNA introducida en la línea germinal de un animal no humano por vía de la intervención humana tal como por vía de los Ejemplos descritos debajo.

Ácidos nucleicos

Los animales transgénicos de acuerdo con la invención comprenden secuencias de ácidos nucleicos que comprenden genes que codifican apo (a) y apoB o sus variantes y son capaces de expresar estos genes para formar un complejo de lipoproteína (a). El ácido nucleico puede ser de origen natural o artificial. Puede ser DNA genómico (gDNA), DNA complementario (cDNA), secuencias híbridas o secuencias sintéticas o semisintéticas. Puede ser de ser humano, animal, planta, de origen bacteriano o viral y otros similares. Puede ser obtenido por cualquier técnica conocida para las personas expertas en la técnica, y especialmente seleccionando genotecas, por síntesis química, o de forma alternativa por métodos mixtos incluyendo la modificación química o enzimática de secuencias obtenidas seleccionando genotecas. Es preferiblemente cDNA o gDNA.

Un clon YAC que contiene el gen de apo (a) humana (clon 366H2 en la genoteca CEPH) ha sido descrito anteriormente (Frazer, K. A., Narla, G., Zhang, J. L., y Rubin, E. M., Nat. Gen (1995) 9, 424-431). Para aislar el gen de la apo (a) humana, puede ser separado el YAC de los cromosomas de levadura por electrofóresis en gel en campo pulsado. La banda que contiene el YAC es entonces excindida en agarosa GTG de SeaPlaque (FMC, Rockland, MD), tratada con beta-agarasa (NEB, Beverly, MA), y dializada contra NaCl 0,1 M, Tris 10 mM, EDTA 0,1 mM (Couto, L. B., Spangler, E. A., y Rubin, E. M., Nuc Acide Res (1989) 17 (19), 8010).

Un fagómido P1 de 90 kb que contiene el gen de la apoB humana ha sido descrito anteriormente (Callow, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91, 2130-2136). De forma alternativa, un fragmento de DNA que contiene la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la apo (a) humana o apoB bajo el control de su propio promotor puede ser obtenido seleccionando genotecas genómicas o de expresión de cDNA humano. Para hacer esto, la genoteca se sondea por hibridación con una sonda de DNA que era complementaria a la apolipoproteína (a) humana o apoB. El clon o clones que contienen el DNA de apo (a) o apoB aislado en este sondeo entonces se analiza o analizan por la comparación con sus secuencias publicadas respectivas Frazer, K. A., Narla, G., Zhang, J. L., y Rubin, E. M., Nat Gen (1995) 9, 424-431; y Callow, et al., Proc Natl Acad Sci, USA (1994) 91, 2130-2136).

Regiones reguladoras

Generalmente, los genes que codifican apo (a) y apoB o sus variantes se unen a una o varias regiones reguladoras. La selección de la región reguladora apropiada o regiones es una materia rutinaria que está dentro del nivel del experto ordinario en la técnica.

Las regiones reguladoras pueden comprender una región de promotor para la transcripción funcional, así como una región situada en 3' del gen de interés, y que especifique una señal para la terminación de la transcripción y un sitio de poliadenilación. Todos estos elementos constituyen un casete de expresión.

Los promotores que pueden usarse en la presente invención incluyen tanto a promotores constitutivos como promotores regulados (inducibles). El promotor puede ser naturalmente responsable de la expresión del ácido nucleico. También puede ser de una fuente heteróloga y puede ser las secuencias de promotor de genes eucariotas o virales. Por ejemplo, puede ser secuencias de promotor derivadas del genoma de la célula que se desea infectar. De la misma manera, puede ser secuencias de promotor derivadas del genoma de un virus, incluyendo el adenovirus usado. En cuanto a esto, pueden ser mencionado en este documento, por ejemplo, los promotores de los genes E1A, MLP, HCMV y RSV y otros similares. Además, el promotor puede ser modificado por la adición de secuencias de activación o reguladoras o secuencias que permiten una expresión específica de tejido o predominante. Los promotores específicos de tejidos proporcionan los medios para modelar una variedad de enfermedades. Cuando el ácido nucleico no contiene secuencias de promotor, puede ser insertada una.

Promotores adicionales útiles para la práctica de esta invención son los promotores ubicuos vimentina HPRT, actina y tubulina, los promotores de filamento intermedios neurofilamentos de desmina, queratina, y GFAP; los promotores génicos terapéuticos MDR, CFTR, y promotores del factor VIII que preferencialmente son activados en células que se dividen; los promotores que responden a un estímulo como el receptor de hormona esteroide y promotores del receptor del ácido retinoico; moduladores de transcripción regulados por tetraciclina; citomegalovirus de actividad inmediata; promotores de LTR retroviral; metalotioneína; SV40, Ela y MLP. Se describen moduladores de transcripción regulados por tetraciclina y promotores de CMV en los documentos WO 96/01313, US 5.168.062 y US 5.385.839.

En ciertas realizaciones de la invención, los genes de apo (a) humana y apoB o sus variantes se unen operativamente a un promotor fuerte, por ejemplo, un promotor de citomegalovirus humano (HCMV), de modo que se alcanzan altos niveles de expresión del transgen. Un animal transgénico que comprende tal construcción proporcionaría un modelo de expresión de lipoproteína (a) humana y, por lo tanto, de aterosclerosis, infarto, isquemia, reestenosis, enfermedad cardiovascular, enfermedad de arteria coronaria, enfermedad oclusiva arterial periférica, infarto de miocardio, perfil lipídico indeseable y también trombosis.

En otra realización de la invención, los genes de apo (a) humana y apoB se unen operativamente a promotor(es) específico(s) de tejido para localizar la sobreexpresión de los transgenes en células particulares. Los promotores específicos de tejido preferidos incluyen las células de la vasculación y endoteliales.

Es también posible sobreexpresar los genes de apo (a) humana y apo B unidos operativamente a una secuencia que codifica un dominio de unión de un ligando mutado a partir de un receptor de glucocorticoide o estrógeno fusionado a los genes. En esta realización, la expresión de los genes se regula por glucocorticoides o tamoxifeno.

Vectores

Como se menciona anteriormente, un "vector" es cualquier medio para la transferencia de un ácido nucleico en una célula huésped. Los vectores preferidos son plásmidos y vectores virales, tales como, por ejemplo, los retro-
virus.

Los vectores virales pueden usarse para producir un animal transgénico de acuerdo con la invención. Preferiblemente, los vectores virales son una replicación defectiva, es decir, son incapaces de replicarse autónomamente en la célula objetivo. En general, el genoma de los vectores virales defectivos de replicación que se usan dentro del alcance de la presente invención carecen de al menos una región que es necesaria para la replicación del virus en la célula infectada. Estas regiones pueden o estar eliminadas (en todo o en parte), o resultar no funcionales por cualquier técnica conocida para una persona experta en la técnica. Estas técnicas incluyen eliminación total, sustitución (por otras secuencias, en particular por la inserción de ácido nucleico), deleción parcial o adición de una o varias bases en una región esencial (para la replicación). Tales técnicas pueden realizarse in vitro (en el DNA aislado) o in situ, usando técnicas de manipulación genética o por tratamiento con agentes mutágenos.

Preferiblemente, el virus de replicación defectiva conserva las secuencias de su genoma que son necesarias para encapsular las partículas virales.

Los retrovirus integran los virus que infectan las células que se dividen. El genoma del retrovirus incluye dos LTR, una secuencia de encapsulación y tres regiones de codificación (gag, pol y env). La construcción de vectores retrovirales recombinantes ha sido descrita: véanse, en particular, los documentos EP 453242, EP 178220, Bernstein et al. Genet. Eng. (1985) 7:235; McCormick, BioTechnology (1985) 3: 689, etc. En vectores retrovirales recombinantes, los genes gag, pol y env generalmente se suprimen, en todo o en parte, y se sustituyen con una secuencia de ácidos nucleicos heteróloga de interés. Estos vectores pueden ser construidos a partir de diferentes tipos de retrovirus, tales como, el virus de la immunodeficiencia humana HIV, MoMuLV "virus de la leucemia de Moloney murino" MSV "virus del sarcoma murino de Moloney", HaSV "sarcomavirus de Harvey"; SNV ("necrosisvirus del bazo"); RSV ("virus del sarcoma de Rous") y virus de Friend. Vectores retrovirales defectivos son descritos en el documento WO 95/02697.

En general, para construir retrovirus recombinantes que contengan una secuencia de ácidos nucleicos, se construye un plásmido que contiene los LTR, la secuencia de encapsulado y la secuencia de codificación. Esto construcción se usa para transfectar una línea celular de empaquetamiento, cuya línea celular es capaz de suministrar en la transacción funciones retrovirales que son deficientes en el plásmido. En general, las líneas celulares de empaquetamiento son capaces por lo tanto de expresar los genes gag, pol y env. Tales líneas celulares de empaquetamiento han sido descritas en la técnica anterior, en particular la línea celular PA317 (patente de EE.UU. Nº. 4.861.719); la línea celular PsiCRIP (documento WO90/02806) y la línea celular GP+envAm-12 (documento WO89/07150). Además, los vectores retrovirales recombinantes pueden contener modificaciones dentro de los LTR para suprimir la actividad transcripcional así como secuencias de encapsulado extensas que pueden incluir una parte del gen gag (Bender et al., J. Virol. (1987) 61: 1639). Los vectores retrovirales recombinantes son purificados por técnicas estándar conocidas para los expertos ordinarios en la técnica.

Ensayos de selección de fármaco

Los animales transgénicos que sobreexpresan los genes de apo (a) humana y apoB o sus variantes son útiles en ensayos de selección de fármaco. Estos ensayos son útiles para identificar compuestos eficaces para el tratamiento de enfermedades, tales como aterosclerosis, infarto, isquemia, reestenosis, enfermedad cardiovascular, enfermedad de arteria coronaria, enfermedad oclusiva arterial periférica, infarto de miocardio, perfil lipídico indeseable, trombosis y otros similares.

La presente invención proporciona métodos para determinar la capacidad de un compuesto de modular las funciones de apo (a), apoB y la lipoproteína (a) en una célula. Los métodos preferidos comprenden administrar un compuesto a un animal transgénico no humano que comprende los genes de apo (a) humana y apoB o sus variantes que se expresan y forman un complejo de lipoproteína (a) humana y comparar los efectos terapéuticos potenciales del compuesto en los animales transgénicos comparado con los de los animales control. Pueden determinarse compuestos terapéuticos potenciales que previenen y/o tratan las enfermedades o los trastornos que están asociados con la expresión inducida o exacerbada de Lp (a), por ejemplo, aterosclerosis, reestenosis, infarto, isquemia, reestenosis, enfermedad cardiovascular, enfermedad de arteria coronaria, enfermedad oclusiva arterial periférica, infarto de miocardio, perfil lipídico indeseable y trombosis y similares.

La presente invención también se refiere al uso del conejo transgénico reivindicado para detectar la actividad de agentes/compuestos terapéuticos o métodos terapéuticos con la idea de que prevengan y/o traten enfermedades vinculadas a la expresión de Lp (a) así como a métodos para detectar nuevos compuestos usando este conejo y a compuestos que son caracterizados así. Este sistema de modelo animal de conejo transgénico es particularmente ventajoso para detectar agentes/compuestos terapéuticos específicos para tratar y/o prevenir enfermedades vinculadas a la expresión y/o el metabolismo de Lp (a), en particular, en el campo de las enfermedades cardiovasculares tales como aterosclerosis, enfermedad cardiovascular, enfermedad de arteria coronaria, infarto, isquemia, enfermedad oclusiva arterial periférica, reestenosis, trombosis, infarto de miocardio, angina de pecho, muerte repentina, un perfil lipídico indeseable, decompensación cardíaca o enfermedades cerebrovasculares.

La invención también proporciona métodos para identificar un compuesto eficaz para el tratamiento de enfermedades y trastornos asociados con la expresión inducida y/o exacerbada por Lp (a), tales como aterosclerosis, reestenosis, infarto, isquemia, reestenosis, enfermedad cardiovascular, enfermedad de arteria coronaria, enfermedad oclusiva arterial periférica, infarto de miocardio, perfil lipídico indeseable, y trombosis y otras similares. Tales métodos comprenden administrar un compuesto a un animal transgénico no humano que comprende los genes de apo (a) humana y apoB o sus variantes, en el que los transgenes son expresados y forman un complejo de lipoproteína (a) humana, y comparar los efectos potenciales terapéuticos del compuesto en los animales transgénicos comparados a los animales transgénicos control.

La presente invención también proporciona un método para identificar un compuesto que es capaz de modular el ensamblaje de la Lp (a) humana en una célula administrando un compuesto a un animal transgénico no humano que comprende los genes de apo (a) humana y apoB o sus variantes, en el que los transgenes son expresados y forman un complejo de lipoproteína (a) humana, y controlar los niveles de Lp (a) humana y/o la actividad biológica dentro del animal transgénico tratado comparando esto con los animales transgénicos control. En un aspecto preferido de la invención, las células son células de un animal que sufre de una enfermedad o trastorno asociado con la expresión inducida y/o exacerbada por Lp (a) y el método comprende administrar a las células de un animal un compuesto capaz de modular a la función de Lp (a) para prevenir y/o tratar la enfermedad/el trastorno. Tales enfermedades incluyen aterosclerosis, reestenosis, infarto, isquemia, reestenosis, enfermedad cardiovascular, enfermedad de arteria coronaria, enfermedad oclusiva arterial periférica, infarto de miocardio, perfil lipídico indeseable, y trombosis y otras similares.

Los ensayos de selección de fármaco de la invención pueden ser realizados en una escala grande o una escala pequeña. La selección a escala grande implica la observación visual del sistema vascular u otro tejido que exprese los transgenes de apo (a) y apoB, y la comparación con los animales control. Por ejemplo, si la producción de Lp (a) humana dentro del animal transgénico causa la formación de placa aterosclerótica en los vasos sanguíneos, el observador evaluaría un candidato de fármaco basado en su capacidad de disminuir esta formación en relación con los animales no tratados.

De forma alternativa, pueden prepararse los animales transgénicos de la invención que expresan a la Lp (a) humana o una de sus variantes y que también comprenden un gen indicador unido operativamente a un promotor cuya expresión es cambiada por Lp (a) o una de sus variantes. Por ejemplo, tal promotor unido operativamente al gen de la \beta-galactosidasa (LacZ) sería no inducido o inducido dependiendo de la presencia respectiva o la ausencia de tratamiento correctivo para la expresión de Lp (a).

También pueden realizarse ensayos de selección de fármaco de la invención a una escala pequeña. Los ensayos a escala pequeña implican la biopsia y tanto análisis histológicos como inmunohistoquímicos. Estas características pueden ser evaluadas histológicamente por un experto especialista. El análisis inmunohistoquímico puede realizarse usando un marcador para aterosclerosis, infarto, isquemia, reestenosis, enfermedad cardiovascular, enfermedad de arteria coronaria, enfermedad oclusiva arterial periférica, infarto de miocardio, perfil lipídico indeseable, trombosis y otras similares.

Los compuestos capaces de modular la función de Lp (a) incluyen los que son capaces de inhibir o disminuir la expresión de uno o ambos de los genes de apo (a) y apoB, de inhibir la formación del complejo de Lp (a) o la actividad biológica de Lp (a) en una célula, o reducir el nivel en plasma de la lipoproteína (a). Tales compuestos incluyen ácidos nucleicos antisentido, proteínas de unión intracelulares, incluyendo anticuerpos y cualquier compuesto, natural o sintético, identificado usando animales transgénicos y ensayos descritos en este documento.

La preparación y el uso de polinucleótidos antisentido, DNA que codifica moléculas de RNA antisentido y el uso de oligonucleótido y antisentido genético se describen en el documento WO 92/15680, cuyo contenido entero se incorpora en este documento como referencia. Los ácidos nucleicos antisentido para el uso de acuerdo con la invención es preferiblemente RNA capaz de hibridar específicamente con todo o parte de los genes de apo (a) y/o apoB, o sus RNA mensajero correspondiente. La secuencia antisentido puede ser derivada de secuencias de DNA cuya expresión en la célula produce el RNA complementario en todo o parte de los genes de apo (a) y/o apoB. Estas secuencias antisentido pueden prepararse por la expresión de todo o parte de una secuencia que codifica apo (a) y/o apoB en la orientación opuesta. Cualquier longitud de la secuencia antisentido es adecuada para la práctica de la invención siempre que sea capaz de disminuir u obstruir la expresión de los genes de apo (a) y/o apoB. Preferiblemente, la secuencia antisentido es de al menos 20 nucleótidos de longitud.

En un aspecto, el ácido nucleico codifica moléculas de RNA antisentido. En esta realización, el ácido nucleico se une operativamente a regiones reguladoras adecuadas (discutidas anteriormente) que permiten la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos, y se introduce en una célula utilizando, preferiblemente, construcciones del vector recombinante, que expresarán el ácido nucleico antisentido una vez que el vector se introduce en la célula. Los ejemplos de vectores adecuados incluyen plásmidos, adenovirus, virus adenoasociados (véanse los documentos WO 91/18088; WO 93/09239; patente de EE.UU. Nº. 4.797.368, patente de EE.UU. Nº. 5.139.941, documento EP 488528), retrovirus (véase anteriores), y virus de herpes. Para suministrar un gen terapéutico, el vector es preferiblemente un adenovirus.

Los adenovirus son virus de DNA eucariotas que pueden ser modificados de manera eficiente para suministrar un ácido nucleico de la invención a una variedad de tipos de células.

Existen varios serotipos de adenovirus. De estos serotipos, se da preferencia, en la amplitud de la presente invención, a la utilización de adenovirus humanos del tipo 2 o tipo 5 (Ad 2 o Ad 5) o adenovirus de origen animal (véase el documento WO 94/26914). Los adenovirus de origen animal que pueden usarse en la amplitud de la presente invención incluyen adenovirus de origen canino, bovino, murino, ovino, porcino, avino, y similares (ejemplo: SAV). Preferiblemente, el adenovirus de origen animal es un adenovirus canino, más preferiblemente el adenovirus CAV2 (por ejemplo, Manhattan o estirpe A26/61 (ATCC VR-800)).

Preferiblemente, los vectores adenovirales defectivos de replicación para uso en la invención comprenden los ITR, una secuencia de encapsulado y el ácido nucleico de interés. Todavía más preferiblemente, al menos la región E1 del vector adenoviral no es funcional. La deleción en la región E1 se extiende preferiblemente de los nucleótidos 455 a 3329 en la secuencia del adenovirus Ad5 (fragmento PvuII-BgIII) o de 382 a 3446 (fragmento HinfII Sau3A). También pueden modificarse otras regiones, en particular la región E3 (documento WO 95/02697), la región E2 (documento WO 94/28938), la región E4 (documentos WO 94/28152, WO 94/12649 y WO 95/02697), o en cualquiera de los genes L1-L5 tardíos.

En una realización preferida, el vector adenoviral tiene una deleción en la región E1 (Ad 1.0). Los ejemplos de adenovirus E1 delecionados son descritos en el documento EP 185.573. En otra realización preferida, el vector adenoviral tiene una deleción en las regiones E1 y E4 (Ad 3.0). Los ejemplos de los adenovirus E1/E4 delecionados son descritos en los documentos WO 95/02697 y WO 96/22378. En otra realización más preferida, el vector adenoviral tiene una deleción en la región E1 en la cual la región E4 y la secuencia de ácidos nucleicos son insertadas (véase el documento FR94 13355).

Los adenovirus recombinantes defectivos de replicación pueden prepararse por cualquier técnica conocida para la persona experta en la técnica (Levrero et al., (1991) Gene 101, 195; documento EP 185573; Graham, (1984) J EMBO, 3, 2917). En particular, pueden prepararse por recombinación homóloga entre un adenovirus y un plásmido que lleva, entre otras cosas, la secuencia de DNA de interés. La recombinación homóloga se efectúa después de la cotransfección de dicho adenovirus y plásmido en una línea celular apropiada. La línea celular que se emplea debería preferiblemente (i) ser transformable por dichos elementos, y (ii) contener las secuencias que sean capaces de complementar la parte del genoma del adenovirus defectivo de replicación, preferiblemente en forma integrada para evitar los riesgos de la recombinación. Los ejemplos de las líneas celulares que pueden usarse son la línea celular embrionaria de riñón humana 293 (Graham et al., (1977) J. Gen. Virol. 36, 59) que contiene la parte a la izquierda del genoma de un adenovirus Ad5 (12%) integrado en su genoma, y líneas celulares que sean capaces de complementar las funciones de E1 y E4, como se describe en las solicitudes WO 94/26914 y WO 95/02697. Los adenovirus recombinantes son recuperados y purifi-
cados usando técnicas de biología molecular estándar, que son conocidas para cualquier experto ordinario en la técnica.

Otra realización del método de la invención para inhibir específicamente la actividad de Lp (a) comprende inhibir la función de Lp (a) por la expresión de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína de unión intracelular capaz de interaccionar con criterio selectivo con el complejo de apo (a), apoB y/o Lp (a) dentro de una célula transfectada. Los documentos WO 94/29446 y WO 94/02610 describen la transfección celular con genes que codifican una proteína de unión intracelular. Una proteína de unión intracelular incluye cualquier proteína capaz de interaccionar con criterio selectivo, o unirse, con el complejo apo (a), apoB y/o Lp (a), incluyendo apo (a) humana, apoB y/o Lp (a) en la célula en la cual se expresa y neutralizar la función de apo (a), apoB y/o Lp (a) unidos. Preferiblemente, la proteína de unión intracelular es un anticuerpo o un fragmento de un anticuerpo. Preferiblemente, la proteína de unión intracelular es un anticuerpo de cadena simple. El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal.

El documento WO 94/02610 describe la preparación de anticuerpos y la identificación del ácido nucleico que codifica un anticuerpo particular. Usando las proteínas del complejo apo (a), apoB o Lp (a) o sus fragmentos, se prepara un anticuerpo monoclonal específico para apo (a), apoB o Lp (a) de acuerdo con técnicas conocidas para los expertos en la técnica. Un vector que comprende el ácido nucleico que codifica una proteína de unión intracelular, o una de sus partes, y capaz de expresarse en una célula huésped posteriormente, se prepara para uso en el método de esta invención. Vectores adecuados y métodos de suministrar ácidos nucleicos que codifiquen proteínas de unión intracelulares a células que contienen apo (a), apoB y/o Lp (a) incluyen los mencionados anteriormente para la entrega de ácidos nucleicos antisentido.

En un aspecto preferido de esta realización, la secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína de unión intracelular de apo (a), apoB y/o Lp (a) comprende además una secuencia que codifica 1) una señal de localización para dirigir a la proteína de unión intracelular a una posición celular apropiada para permitir la interacción de la proteína de unión intracelular y su(s) molécula(s) objetivo(s), y/o 2) una secuencia que permita la inserción de la proteína de unión intracelular en la membrana celular. La señal de localización o la secuencia de inserción pueden ser localizadas en todas las partes de la proteína de unión intracelular, siempre que esto no interfiera con la capacidad de la proteínas de unirse a apo (a), apoB y/o Lp (a). Ejemplos de señales de localización son descritos en el documento WO 94/02610.

Composiciones farmacéuticas

Los compuestos capaces de modular la función de Lp (a) incluyen ácidos nucleicos antisentido, proteínas de unión intracelulares y compuestos identificados usando animales transgénicos y ensayos descritos en este documento.

Las construcciones de ácidos nucleicos antisentido que son capaces de disminuir u obstruir la expresión de los transgenes de apo (a) y apoB pueden suministrarse a las células afectadas. Los ácidos nucleicos, en forma de un vector o DNA desnudo, pueden ser combinados con uno o varios vehículos farmacéuticamente aceptables para una formulación inyectable. Estos pueden ser, en particular, soluciones salinas isotónicas, estériles, (fosfato de monosodio o disodio, cloruro de sodio, potasio, calcio o magnesio y similares o mezclas de tales sales), o composiciones secas, especialmente liofilizadas que bajo la adición, dependiendo del caso, de una solución salina esterilizada de agua o fisiológica, permite la constitución de soluciones inyectables.

Las preparaciones estériles inyectables preferidas pueden ser una solución o suspensión en un disolvente o diluyente no tóxico parenteralmente aceptable. Los ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables son solución salina, solución salina tamponada, solución salina isotónica (por ejemplo, fosfato de monosodio o disodio, cloruro de sodio, potasio, calcio o magnesio, o mezclas de tales sales), solución de Ringer, dextrosa, agua, agua estéril, glicerol, etanol y sus combinaciones. 1,3-Butanodioles y aceites fijos estériles son empleados convenientemente como medio de suspensión o disolución. Cualquier aceite fijo suave puede emplearse incluyendo mono- o di-glicéridos sintéticos. Ácidos grasos tales como el ácido oleico también encuentran uso en la preparación de inyectables.

De ser administrado como un virus, la(s) dosis puede(n) adaptarse como una función de varios parámetros, y, en particular, como una función del sitio de administración considerado, el número de inyecciones, el gen que se expresa o, de forma alternativa, de la duración deseada del tratamiento. En general, los adenovirus recombinantes son formulados y administrados en forma de dosis de entre 10^{4} y 10^{14} pfu, y preferiblemente de 10^{6} a 10^{11} pfu. El término pfu (unidad formadora de placa) corresponde a la infectividad de una solución de virus, y se determina infectando un cultivo celular apropiado y midiendo, generalmente después de 15 días, el número de placas de células infectadas. La técnica para determinar el título de pfu de una solución viral está bien documentada en la literatura.

Un ácido nucleico, tal como el que codifica una proteína de unión intracelular o antisentido, también puede ser administrado como DNA desnudo. Los métodos para formular y administrar el DNA desnudo al tejido muscular del mamífero son descritos en las patentes de EE.UU. N^{os}. 5.580.859 y 5.589.466.

Ejemplos

La presente invención será descrita en mayor detalle con ayuda de los ejemplos siguientes que deberían ser considerados como ilustrativos y no limitantes.

Biología molecular general

Conforme a la presente invención, puede emplearse biología molecular convencional, microbiología y técnicas del DNA recombinante dentro de la experiencia de la técnica. Tales técnicas son explicadas totalmente en la literatura. Véase, por ejemplo, Sambrook, Fritsch y Maniatis, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Segunda Edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (en este documento "Sambrook et al., 1989"); "DNA Cloning: A Practical Approach", Volúmenes I y II (D.N. Glover ed. 1985); "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait ed. 1984); "Nucleic Acid Hybridization" [B.D. Hames y S. J. E. Higgins eds. (1985)]; "Transcription And Translation" [B.D. Hames y S.J. Higgins, eds.(1984)]; "Animal Cell Culture" [R.I. Freshney, ed.(1986)]; "Immobilized Cells And Enzymes" [IRL Press,(1986)]; B. E. Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984); F.M. Ausubel et al. (eds.), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, Inc. (1994).

Ejemplo 1 Preparación y caracterización de DNA de apo (a) humana y apo B

El clon YAC que contiene el gen de la apo (a) humana (clon 366H2 en la genoteca CEPH) ha sido descrito anteriormente (Frazer, K. A., Narla, G., Zhang, J. L., y Rubin, E. M., Nat. Gen. (1995) 9, 424-431). El YAC fue separado de los cromosomas de levadura por electrofóresis en gel en campo pulsado. La banda que contiene el YAC fue excindida en agarosa GTG de SeaPlaque (FMC, Rockland, MD), fue tratada con \beta-agarasa (NEB, Beverly, MA), y luego fue dializada contra NaCl 0,1M, Tris 10 mM, EDTA 0,1 mM (Couto, L. B., Spangler, E. A., y Rubin, E. M., Nuc Acids Res (1989) 17 (19), 8010). El fagómido P1 de 90 kb que contiene el gen de la apoB humana ha sido descrito anteriormente (Callow, et al., Proc Natl Acad Sci, USA (1994) 91, 2130-2136).

Ejemplo 2 Producción y selección de conejos transgénicos

La producción de conejos transgénicos utilizaba los métodos antes descritos (Duverger, et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol (1996) 16, 1424-1429). Brevemente, conejos blancos de Nueva Zelanda adultos femeninos fueron superovulados, luego fueron cruzados durante el mismo día que fue inyectada la hormona luteinizante. Los embriones fueron recogidos 17 horas más tarde. La inyección del embrión, la transferencia a hembras pseudoembarazadas y la cría del animal fue como se describe antes (Fun, et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol(1995) 15, 1889-1899); Duverger, et al.,
Arterioscler Thromb Vasc Biol (1996) 16, 1424-1429). Aproximadamente 2 pL de una solución de DNA de 1 ng/ml que contenía el YAC de apo (a) humana o el fagómido P1 de apoB humana fueron inyectados en pronúcleos masculinos.

Para crear los conejos transgénicos de apo (a), fueron transferidos 280 embriones microinyectados en hembras pseudoembarazadas, dando como resultado 17 conejos nacidos en parto natural. El DNA de conejo, extraído de biopsias de oído, fue seleccionado para detectar la presencia de apo (a) humana por PCR utilizando los métodos y los iniciadores descritos antes (Frazer, et al., Nat Gen (1995) 9, 424-431). Dos conejos femeninos fueron transgénicos, y el animal con el nivel de apo (a) más alto en plasma fue usado en los estudios subsecuentes. Fue usada selección por PCR para identificar a los conejos que contenían los transgenes y confirmar la integración completa del gen de apo (a) y sus regiones flanqueantes (Figura 1). Los conejos de apo (a) fundadores contenían una copia intacta del clon YAC genómico entero, como se determina por cuatro reacciones diferentes de PCR que atraviesan la longitud entera del clon. Para crear los transgénicos de apoB, fueron transferidos 780 embriones microinyectados en hembras pseudoembarazadas. De los 20 conejos nacidos en parto natural, fueron identificados dos transgénicos de apoB usando DNA de biopsia de oído, PCR e iniciadores humanos de apoB específicos de la región del gen promotor: 5'-AGAAGGTTC
CAGATGTCTATGAGG (SEC. ID Nº.:1) y 5'-TCCAAGTATCTGTCTTCAAGAAACC (SEC. ID Nº.:2). El animal con el nivel de apoB en plasma más alto fue usado en los estudios subsecuentes. El gen de la apoB humana fue detectado por una sola reacción PCR específica para secuencias humanas en la región del promotor. La descendencia de los animales de apo (a) y apoB fundadores fue positiva para los marcadores apropiados y demostró un modelo de transmisión de los dos transgenes Mendeliano. El cruce entre los fundadores transgénicos de apo (a) y apoB produjo conejos de los genotipos predichos que son el objeto de esta invención.

Ejemplo 3 Análisis de distribución en tejido de apo (a) y apo (b) transgénico por RT-PCR

El RNA total fue extraído de tejidos de conejo control y transgénicos usando RNAstat-60 (Tel-Test B, Frienswood, TX), fue sometido a tratamiento con DNAse, luego a transcripción inversa (5 \mug de RNA incubados con 10 ng del iniciador de apo (a) RT: 5'-GATGACCAAGCTTGGCAGGTTCTTCC-3' (SEC. ID Nº.:3), o el iniciador M46 de apoB: 5'-CCACATTTTGAATCCAGGATGCAGTACTACT-3' (SEC. ID Nº.:4) en un volumen de 12 \mul a 65ºC durante 10 minutos, luego fue suplementado con Superscript Il/tampón (GibcoBRL, Bethesda, MD) y fue incubado durante 1 hora a 42ºC). La primera cadena de cDNA fue tratada después con RNAsa, y fue extraída con fenol/cloroformo. 5 \mul del producto de RT fueron sometidos a PCR en condiciones estándar para la polimerasis Taq (Boehringer Manheim, Indianapolis, IN) usando 50 pmoles de cada iniciador y termociclación como sigue: (94ºC durante 30 segundos, 62ºC durante 30 segundos, seguido de 72ºC durante 90 segundos - 25 ciclos). El cDNA de Apo (a) fue detectado usando los iniciadores (a) Kr1F: 5'-ACCTGAGCAAAGCCATGTG-3' (SEC. ID Nº. 5) y (a) Kr1R: 5'-AGTACTCCCACCTGA
CACCG-3' (SEC. ID Nº. 6). El cDNA de ApoB fue detectado usando iniciadores específicos de la PCR de humano y conejo (M49/M50 de humano o M49/M50 de conejo, Hughes, S.D. et al., Hum. Gene Ther., 7, 39-49 (1996)). Los productos de la PCR fueron analizados en geles de agarosa del 1,5%. Para demostrar la ausencia de contaminación de DNA genómico, las preparaciones de RNA fueron sometidas directamente a las mismas condiciones de la PCR, y ningún producto fue amplificado.

Para determinar la distribución de la expresión del transgen de apo (a) y apoB, fueron sometidas preparaciones de RNA de varios tejidos (hígado, testículos, intestino delgado, riñón, cerebro, y pulmón) a ensayos de RT-PCR como una determinación cualitativa de la expresión del transgen (Figura 2). El RNA de Apo (a) fue detectado en el hígado y los testículos, aunque también fue observado en el cerebro en condiciones más sensibles (aumentado el número de ciclos de la PCR de 25 a 30). El hígado y los testículos fueron también los sitios principales de expresión para el transgen de la apoB humana. Una señal relativamente débil (< 5% de señal en el hígado) fue detectada en el intestino delgado. Como un control de la especificidad de la especie del ensayo de mRNA de apoB, así como para la calidad del RNA, fue usado un ensayo de RT-PCR para detectar específicamente la apoB de conejo. Como se esperaba, el mRNA de apoB de conejo fue detectado en todos los tejidos examinados. Compatible con los estudios en ratones transgénicos, tanto los transgenes de la apo (a) humana como de la apoB fueron expresados en niveles significativos y en los tejidos apropiados en todos los conejos fundadores identificados, demostrando la alta eficacia y la expresión específica de tejido de estos transgenes genómicos comparado con transgenes de cDNA (Chiesa, et al., J Biol Chem (1992) 267, 24369-24374; Chiesa, et al., J Chem Bio (1993) 268, 23747-23750).

La distribución en tejido de la expresión de apoB humana fue algo diferente a lo observado en ratones transgénicos. El bajo nivel de la expresión intestinal de apoB humana en los conejos transgénicos indica que algún nivel basal de transcripción del promotor de apoB humana ocurre en el intestino del conejo, pero la expresión está muy por debajo de la de la apoB endógeno en el intestino, sugiriendo que los elementos de control requeridos para la expresión en este tejido no estaban presentes en la construcción del gen de apoB. Este último punto es compatible con las conclusiones de dos informes independientes de ratones que contenían un transgen de apoB idéntico (Callow, et al., Proc Natl Acad Sci, USA (1994) 91, 2130-2136; Purcell-Huynh, et al., J Clin Invest (1995) 95, 2246-2257). Además, los investigadores no detectamos la apoB-48 humana en el plasma de los conejos transgénicos. Este resultado, compatible con las conclusiones de (Fan, et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol (1995) 15, 1889-1899) sugiere que poca o ninguna producción de proteína apoB humana ocurre en el intestino de los conejos transgénicos.

A causa de la profunda disminución de los niveles de apo (a) en plasma asociados con la madurez sexual antes nombrada en ratones que contienen el transgen de apo (a) genómico, los investigadores examinamos el efecto de la madurez sexual respecto a los niveles de apo (a) en plasma en los conejos transgénicos. Las muestras de plasma recogidas de conejos en 3, 6, y 9 meses de edad (los conejos son sexualmente maduros a los 6 meses de edad) fueron evaluadas para detectar los cambios de niveles de la apo (a) por inmunotransferencia (Figura 3). Este análisis no reveló ningún
cambio significativo de los niveles de apo (a) respecto al curso de la maduración sexual en los conejos transgénicos.

Aunque la especificidad en tejido de la expresión del transgen genómico de apo (a) fue similar en conejos y ratones, la regulación del desarrollo de la expresión se diferenciaba considerablemente entre estos dos organismos. A diferencia de los efectos asombrosos de la madurez sexual sobre los niveles de apo (a) en plasma en ratones transgénicos, los niveles de apo (a) en conejos no cambiaron por la maduración sexual. Dado que los niveles en plasma de apo (a) son determinados principalmente por la velocidad de síntesis, la carencia de una disminución en los niveles de apo (a) en plasma que acompañan a la madurez sexual en conejos que contienen el transgen de apo (a) sugiere que las hormonas sexuales no tienen un efecto potente sobre la expresión del transgen en estos animales. Los efectos de estas hormonas respecto a la transcripción de apo (a) en conejos pueden ser más sutiles, como ha sido mostrado en seres humanos.

Ejemplo 4 Análisis de apolipoproteína y lipoproteína

La fracción de lipoproteína total (r < 1,21 g/ml) fue preparada a partir de muestras de plasma de conejo por un método de ultracentrifugación por gradiente de densidad descrito anteriormente (Callow, et al., Proc Natl Acad Sci, USA (1994) 91, 2130-2136). Las concentraciones de Lp (a) y apoB humana fueron medidas en plasma de conejo y las fracciones de lipoproteína por un ensayo ELISA sandwich. Para Lp (a), se unió IgG purificada preparada a partir de antisuero policlonal de cabra a apolipoproteína (a) humana (International Immunology Corp., Murrieta, CA) a los pocillos de una placa de microtítulo como anticuerpo de captura. Un conjugado de peroxidasa de rábano picante del mismo anticuerpo fue usado para la detección de la apo (a) después de la adición del sustrato cromogénico o-fenilen-diamina. La estandarización del método se basó en calibradores de lipoproteína humana interior medidos por separado utilizando un kit ELISA de Lp (a) estandarizado disponible en el comercio (Strategic Diagnostics, Newark, DE). El ensayo para la apoB humana (B48 + B100) empleó un anticuerpo de apoB antihumano de ratón (Genzyme, Cambridge, MA). Fueron calculadas curvas estándar con los blancos y controles apropiados usando la transformación de datos Logit-Log. Todas las concentraciones mencionadas fueron calculadas a partir del análisis por triplicado.

Para evaluar las interacciones de apo (a) y apoB, el plasma aislado de los conejos transgénicos fue separado por SDS-PAGE en geles de poliacrilamida del 4% de acuerdo con (Laemmli, E. K., Nature (1970) 227, 680-685) y las proteínas fueron transferidas a una membrana de nitrocelulosa de Millipore por inmunotransferencia de acuerdo con (Towbin, et al., J Proc Nat Acad Sci, USA (1979) 6, 4350-4354). Cuando se indica, las muestras fueron reducidas por la adición de tampón de muestra desnaturalizante que contenía 2,5% de 2-mercaptoetanol y se incubaron a 100ºC durante 5 minutos. La Apo (a) fue detectada con anti-apo (a) de cabra (Valbiotech, París) seguido de anticabra de conejo HRP-conjugado (BioRad, Hercules, CA). La ApoB humana fue detectada usando la apoB antihumano de conejo policlonal HRP-conjugado (proporcionado amablemente por C. Fievet). Las bandas de proteína fueron reveladas por un kit de quimiluminiscencia potenciado (Amersham, Arlington Heights, IL) y sondeadas usando un densitómetro de exploración de transmitancia GS de Hoefer. El área de los picos principales fue usada para evaluar la proporción relativa de apo (a) libre y unida a apoB (Gabel, et al., Arterio. Thromb. Vasc. Biol. (1996) 16, 1559-1567). Los pesos moleculares aparentes fueron determinados por el uso de estándares preteñidos (BioRad). El suero humano control fue usado como control positivo de la expresión de las proteínas humanas.

En condiciones no reductoras, las muestras de plasma tanto de los conejos transgénicos de apo (a) como de los conejos transgénicos de apoB/apo (a) humano combinado mostraron dos bandas (Figura 4A); la banda de peso molecular más alto correspondiente al complejo de apoB/apo (a), y la banda de peso molecular inferior correspondiente a la apo (a) libre. La presencia de una banda de peso molecular alto de apo (a) indicó el ensamblaje de Lp (a) en los conejos transgénicos combinados, así como algún grado de interacción covalente entre la apo (a) y la apoB de conejo en conejos transgénicos para la apo (a) sóla. Este resultado fue confirmado con muestras de plasma reducidas por inmunotransferencia (Figura 4B), en la que sólo una banda sola que representa la apo (a) fue detectada en ambos tipos de conejos transgénicos usando el mismo antisuero de apo (a) humana. El peso molecular aparente de la apo (a) en los conejos transgénicos fue de aproximadamente 200 kD. Esto es similar al tamaño observado de apo (a) en ratones transgénicos que contenían esta misma construcción genómica de apo (a), correspondiente a una proteína de apo (a) que contenía aproximadamente nueve repeticiones tipo 4 kringles. Las muestras transferidas con antisuero de apoB específico humano (Figura 4C) dieron una banda simple de 550 kD, que representa la apoB-100 humana, exclusivamente en el plasma de conejos que dieron positivo por PCR para la apoB humana. Las concentraciones de apo (a) y apoB en los conejos transgénicos fueron evaluadas por ELISA. La concentración promedio de apoB humana en los conejos transgénicos fue 17,6 mg/dl. El promedio total de la concentración de apo (a) en el plasma fue 2,5 mg/dl, sin diferencia significativa entre los transgénicos de apo (a) sóla y apoB/apo (a) humana.

La ultracentrifugación fue usada para examinar la asociación de apo (a) con la fracción de lipoproteína. El enlace disulfuro entre apo (a) y apoB humana ha mostrado que resiste las condiciones de ultracentrifugación usadas para aislar lipoproteínas, aunque la apo (a) asociada no covalentemente se fracciona con las proteínas más densas en el plasma (Utermann, G., y Weber, W., FEBS Let (1983) 154, 357-361). Las fracciones de lipoproteína aisladas de conejos transgénicos de apo (a) y transgénicos de apoB/apo (a) fueron analizadas para comprobar la presencia de apo (a) por ELISA. La Apo (a) fue detectada en las fracciones de lipoproteína de ambos tipos de conejos transgénicos, indicando que la apo (a) formaba un puente disulfuro entre la apoB de humano y de conejo. Las proporciones relativas de Lp (a) y apo (a) en el plasma, sin embargo, sugirieron que el complejo de la apoB-apo (a) de conejo se formaron in vivo en una eficacia relativamente inferior que la observada con la apoB humana. La comparación de los modelos de inmuno-reactividad de apo (a) entre conejos transgénicos de apo (a) y transgénicos de apoB/apo (a) (Figura 4A) reveló una mayor proporción de apo (a) no unido covalentemente cuando sólo estaba presente la apoB de conejo. Las relaciones relativas de las diferentes formas moleculares de apo (a) en los conejos transgénicos fueron estimadas a partir de inmunotransferencias por exploración densitométrica de películas quimiluminiscentes. En los transgénicos de apoB/apo (a), aproximadamente el 20% de la apo (a) emigró consistentemente como apo (a) libre (n=3), con el 80% restante covalentemente unido a apoB de humano o de conejo. En conejos transgénicos de apo (a), fue observada la distribución inversa (80% de proteína libre y 20% unido al apoB de conejo; n=3). Aunque estas relaciones no sean rigurosamente cuantitativas, las diferencias constantes entre los dos grupos de conejos transgénicos que contienen el mismo transgen de apo (a) y los niveles de apo (a) totales similares sugieren que la apo (a) forma un enlace disulfuro de una manera más eficiente con apoB humana que con apoB de conejo.

La capacidad de apoB de conejo para formar un enlace covalente con apo (a) primero fue sugerida por estudios in vitro examinando interacciones de apo (a) humana con apoB a partir de un número de mamíferos que mostraron que la apoB de conejo puede formar una interacción covalente con apo (a) humana en ciertas condiciones (Trieu, V., y McConathy, W. J., Biochem. J. (1995) 309, 899-904). La demostración del ensamblaje de Lp (a) en los conejos que expresaban sólo el transgen de apo (a) justifica esta interacción en condiciones in vivo. En comparación, los conejos que contienen tanto transgenes de apoB humana como de apo (a) contenían una proporción mucho más alta de apo (a) en la forma de Lp (a). Sin embargo, a pesar de los niveles adecuados de apoB humana en los conejos transgénicos de apoB/apo (a) combinados, aproximadamente el 20% de la apo (a) persistía en un estado no covalentemente unido. Esto está en oposición con la condición en seres humanos donde toda la apo (a) está unida covalentemente a apoB, y la presencia de apo libre(gratis) (a) ha sido observada sólo en casos raros de abetalipoproteinemia (Menzel, et al., J Chem Bio (1990) 265, 981-986).

Ejemplo 5 Fraccionamiento de lipoproteínas en plasma y medida de colesterol

Plasma recién aislado fue fraccionado por cromatografía de permeabilidad en gel usando un columna de Superose 6 (Pharmacia). 100 \mul de plasma fueron inyectados en la columna y fueron corridos en condiciones isocráticas con un caudal de 40 \mul/minuto en tampón GF2 (Tris 20 mM, pH 8,0, EDTA 0,27 mM, NaCl 150 mM). El efluente fue controlado respecto a su absorbancia a 280 nm, y fueron recogidas fracciones de 50 \mul durante el corrimiento y posteriormente fueron analizadas respecto al colesterol usando un kit de ensayo de colesterol comercial (Boehringer-Mannheim). Una alícuota de 20 \mul de fracciones que contenían colesterol fue usada para detectar la presencia de apo (a) y Lp (a) usando electrofóresis e inmunotransferencia como se describe anteriormente.

Para caracterizar además la asociación de apo (a) con lipoproteínas en los conejos transgénicos, las lipoproteínas fueron fraccionadas por tamaños por cromatografía de filtración en gel. En contraste con los métodos de centrifugación por gradiente de densidad, los métodos cromatográficos pueden aislar complejos de lipoproteína que contienen proteínas asociadas por interacciones débiles, no covalentes. La inmunotransferencia de plasma fraccionado en esta manera mostró que la apo (a) estaba presente principalmente en la fracción LDL tanto en conejos transgénicos de apoB/apo (a) humana (Figura 5A) como en apo (a) (Figura 5B). Las fracciones de LDL de conejos transgénicos combinados contenían dos bandas de alto peso molecular distintas correspondientes al complejo de apoB/apo (a) de humano y el complejo de apoB/apo (a) de conejo, distinguido en la base del peso molecular inferior de apoB-100 de conejo (320 kD). La apo (a) no covalentemente asociada, aunque presente en la inmunotransferencia del plasma total, no fue detectada en las fracciones de LDL de conejos transgénicos de apoB/apo (a) humana. Las fracciones de LDL de conejos transgénicos de apo (a) contenían una amplia banda que representa al complejo de apoB/apo (a) de conejo acompañado por una cantidad relativamente más grande de apo (a) disociada de LDL en condiciones de electrofóresis, designadas como apo (a) libre (Figura 5B). Este análisis confirmó la asociación de apo (a) con lipoproteínas que contienen tanto apoB de humano como de conejo, aunque en el caso de apoB de conejo, la apo (a) fue unida por un puente disulfuro en una proporción mucho más inferior de partículas.

En la presente invención, la apo (a) exhibió interacciones específicas no covalentes con lipoproteínas que contenían apoB, sugiriendo una afinidad sumamente conservada entre apo (a) y apoB, similar a los resultados de los estudios anteriores de las interacciones de apo (a) con apoB de varias otras especies (Chiesa, et al., J Chem Bio (1993) 268, 23747-23750; Trieu, V., y McConathy, W. J., Biochem. J. (1995) 309, 899-904). Esto se apoya por la observación de apo (a) no covalentemente asociado en la fracción de LDL de conejos transgénicos de apo (a). Tales interacciones no covalentes entre apo (a) y apoB se han propuesto para facilitar el ensamblaje de la Lp (a) trayendo restos de cisteína en posición para formar un puente disulfuro (Trieu, V., y McConathy, W. J., J. Biol. Chem. (1995) 270, 15471-15474). En el plasma de los conejos transgénicos de apoB/apo (a), la apo (a) puede persistir en esta forma de enlace no covalente debido a la capacidad de la apoB de conejo de atrapar eficazmente alguna apo (a) en la etapa de unión inicial, aunque la formación del puente disulfuro de este intermedio procede con una eficacia mucho menor ya que el enlace covalente debe ocurrir entre cisteínas que no están colocadas óptimamente a través de interacciones no covalentes.

Ejemplo 6 Comparación de la secuencia del sitio de unión de la apo (a) putativa en humanos y apoB de conejo

Debido a la sorprendente capacidad de la apoB de conejo, a diferencia de la apoB murina, de formar un enlace covalente con apo (a) humana, los inventores hicieron una comparación de su secuencia de aminoácidos dentro de una región homóloga al sitio de unión de apo (a) en la apoB humana. Ya que la parte relevante de la apoB de conejo no ha sido publicada, la región del extremo carboxi del clon de cDNA de apoB de conejo fue secuenciada. Se muestra la secuencia de la proteína derivada para la apoB de conejo en la Figura 6 alineada dentro de una región de homología significativa a cuatro otras secuencias publicadas de apoB, incluyendo a la humana (SEC. ID Nº.S:7-11). Como en roedores y cerdos, dos mamíferos en los cuales ha sido demostrada que la apoB es incapaz de formar un enlace covalente con apo (a) humana in vitro, la apoB de conejo también carece de una cisteína en una posición homóloga al sitio de unión de apo (a) en apoB humana (cys 4326). Estos resultados, en contraste con dos informes anteriores que sugieren que se requiere un resto de cisteína en esta posición para la interacción covalente con apo (a) (Callow, M. J., y Rubin, E. M., J Biol Chem (1995) 270, 23914-23917; McCormick, S. P. A., Ng, J. K., Taylor, S., Flynn, L. M., Hammer, R. E., y Young, S. G., (1995) 92, 10147-10151), indican que las cisteínas en otra parte en la molécula de apoB de conejo son capaces de interaccionar covalentemente con la apo (a).

<110> Rouy, Didier

\hskip1cm

Duverger, Nicolas

\hskip1cm

Emmanuel, Florence

\hskip1cm

Denefle, Patrice

\hskip1cm

Houdebine, Louis-Marie

\hskip1cm

Viglietta, Celine

\hskip1cm

Rubin, Edward M.

\hskip1cm

Hughes, Steven D.

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<120> CONEJO TRANSGÉNICO QUE EXPRESA UNA LIPOPROTEÍNA (A) HUMANA FUNCIONAL

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<130> 22841A USA

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<140>

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<141>

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<150> 60/070727

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<151> 1998-01-08

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<160> 11

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<170> PatentIn Ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 24

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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\hskip-.1em\dddseqskip

agaaggttcc agatgtctat gagg

\hfill

24

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<210> 2

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<211> 25

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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\hskip-.1em\dddseqskip

tccaagtatc tgtcttcaag aaacc

\hfill

25

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<210> 3

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<211> 26

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

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\hskip-.1em\dddseqskip

gatgaccaag cttggcaggt tcttcc

\hfill

26

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<210> 4

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<211> 31

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

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\hskip-.1em\dddseqskip

ccacattttg aatccaggat gcagtactac t

\hfill

31

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<210> 5

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<211> 19

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 5

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\hskip-.1em\dddseqskip

acctgagcaa agccatgtg

\hfill

19

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<210> 6

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<211> 20

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<400> 6

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\hskip-.1em\dddseqskip

agtactccca cctgacaccg

\hfill

20

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<210> 7

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<211> 50

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<212> PRT

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<213> Oryctolagus cuniculus

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<400> 7

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1

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<210> 8

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<211> 50

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 8

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2

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<210> 9

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<211> 50

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<212> PRT

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<213> Rattus sp.

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<400> 9

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3

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<210> 10

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<211> 50

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<212> PRT

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<213> Sus scrofa

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<400> 10

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4

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<210> 11

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<211> 50

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<212> PRT

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<213> Gallus gallus

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<400> 11

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5

Claims (10)

1. Un conejo transgénico que tiene en su DNA genómico secuencias que codifican polipéptidos de la apolipoproteína (a) humana y la apolipoproteína B humana que son capaces de combinarse para producir la lipoproteína (a) humana.

2. El conejo de la reivindicación 1, en el que dicho conejo desarrolla lesiones ateroscleróticas similares a las de un humano cuando se alimenta con una dieta rica en colesterol.

3. El conejo de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que dichas secuencias de DNA se seleccionan del grupo que consiste en DNA genómico y cDNA.

4. El conejo de la reivindicación 1 o la reivindicación 2 que tiene células de hígado que expresan dichas secuencias.

5. El conejo de la reivindicación 1 o la reivindicación 2 que tiene células de testículos que expresan dichas secuencias.

6. El conejo de la reivindicación 1 que tiene un nivel estable en plasma del polipéptido de la apolipoproteína (a) humana en todos los momentos de su madurez sexual.

7. Un método para determinar si un compuesto puede inhibir una enfermedad o trastorno vinculado a la expresión o el metabolismo de la lipoproteína (a) que comprende comparar un primer conejo transgénico que es capaz de producir la lipoproteína (a) humana y que manifiesta una enfermedad o trastorno vinculado a la lipoproteína (a) humana y que ha sido tratado con dicho compuesto, con un segundo conejo transgénico que es capaz de producir la lipoproteína (a) humana y que manifiesta una enfermedad o trastorno vinculado a la lipoproteína (a) y que no ha sido tratado con dicho compuesto.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la enfermedad o trastorno se selecciona del grupo que consiste en aterosclerosis, enfermedad cardiovascular, isquemia, infarto, reestenosis, enfermedad de arteria coronaria, enfermedad oclusiva arterial periférica, infarto de miocardio, trombosis y un perfil lipídico indeseable.

9. Un método para determinar si un compuesto puede inhibir el ensamblaje de una partícula de lipoproteína (a) que comprende comparar el nivel de producción de lipoproteína (a) humana en un primer conejo transgénico que ha sido tratado con dicho compuesto y que es capaz de producir la lipoproteína (a) humana al nivel de producción de lipoproteína (a) humana en un segundo conejo transgénico que no ha sido tratado con dicho compuesto y que es capaz de producir la lipoproteína (a) humana.

10. El método de la reivindicación 9, en el que dicho compuesto se selecciona del grupo que consiste en ácidos nucleicos antisentido y proteínas de unión intracelulares.