ES2247817T3

ES2247817T3 - Metodo para la erradicacion de nanobacterias.

Info

Publication number: ES2247817T3
Application number: ES99934549T
Authority: ES
Inventors: E. Olavi Kajander
Original assignee: NANOBAC Oy
Current assignee: NANOBAC Oy
Priority date: 1998-07-06
Filing date: 1999-07-01
Publication date: 2006-03-01
Anticipated expiration: 2019-07-01
Also published as: EP1094711B1; JP2002519363A; KR100661413B1; KR20010085283A; EP1094711A1; ATE282959T1; WO2000001238A1; DE69922202T2; AU5029599A; DE69922202D1

Abstract

Método para desinfectar un artículo contaminado por nanobacterias que comprende: (a) exponer a las nanobacterias a una mezcla desinfectante, en la que la mezcla desinfectante es (a1) una mezcla al 1% de persulfato potásico al 50% y ácido sulfaminoico al 5% en agua destilada, o (a2) una mezcla al 3% de formaldehído al 4, 5%, glioxal al 6, 8%, ácido glioxílico al 1, 5%, y cloruro de dimetil-laurilbencilamonio al 6%, o (b) desmineralizar las nanobacterias, y después exponer el artículo a un químico desinfectante; o (c) desmineralizar las nanobacterias, y después someter el artículo al autoclave a una temperatura de al menos 121ºC durante al menos 20 minutos; o (d) desmineralizar las nanobacterias, y después exponer el artículo a radiación ultravioleta, exponiendo el artículo a una lámpara UV-C de al menos 15 W a una distancia de 60 cm o menos durante al menos 1 hora; o (e) desmineralizar las nanobacterias, y después calentar el artículo durante al menos 15 minutos, a una temperatura de al menos 60ºC.

Description

Método para la erradicación de nanobacterias.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos de desinfección de artículos infectados con nanobacterias, y a métodos para tratar pacientes infectados con nanobacterias.

Descripción de la técnica relacionada

La formación de estructuras cristalinas inorgánicas organizadas y diferenciadas dentro de matrices extracelulares macromoleculares es un fenómeno biológico generalizado que se denomina generalmente biomineralización. El esmalte óseo y dental de mamíferos son ejemplos de biomineralización que implican minerales de apatito. Las piedras de apatito del entorno tienen casi la misma composición química que en los huesos y en la dentina. Recientemente se ha implicado a las bacterias como factores en los ciclos bioquímicos de formación de minerales en sedimentos acuosos. El constituyente principal de los minerales fosfatados antígenos modernos en los sedimentos marinos es la carbonato(hidroxi)fluorapatito Ca_{10}(PO_{4})_{6-x}(CO_{3})_{x}(F,OH)_{2+x}. Los microorganismos pueden depositar apatito fuera del equilibrio termodinámico en agua de mar. Pueden segregar el Ca del Mg, y nuclear activamente el carbonato-apatito por medio de oligopéptidos específicos bajo condiciones de pH <8,5 y [Mg]:[Ca]>0,1. Tales condiciones se encuentran también en el cuerpo humano.

Las nanobacterias se acercan al límite teórico de vida autorreplicativa con un tamaño de tan sólo una centésima parte de una bacteria normal. Las nanobacterias pueden aislarse de la sangre de mamíferos y de hemoderivados (véase la patente de los EE.UU. 5.135.851 concedida a Kajander, cuyos contenidos se incorporan al presente documento como referencia). Los microanálisis por rayos X de dispersión de energía y los análisis químicos nos muestran que las nanobacterias producen apatito biogénico en su cubierta celular. El grosor del apatito depende sobre todo de las condiciones de cultivo de las nanobacterias. Las nanobacterias son las bacterias con pared celular formadoras de apatito más pequeñas que se pueden aislar de la sangre de mamífero y hemoderivados. Su pequeño tamaño (0,05-0,5 \mum) y sus propiedades únicas hacen que su detección sea difícil con métodos microbiológicos convencionales. En células de mamíferos infectadas con nanobacterias, la microscopía electrónica ha mostrado depósitos de cristales aciculares intra y extracelulares, que se pueden teñir con tinción de von Kossa y que parecen calcoesférulas que se encuentran en la calcificación patológica.

Los presentes inventores han descubierto nanobacterias en sangre humana y bovina que son citotóxicas in vitro e in vivo. Se han depositado en DSM, Braunschweig, Alemania, registro número 5819-5821. Las nanobacterias humanas y bovinas crecen de manera parecida, comparten los mismos antígenos de superficie y otras características especiales. Ambas también producen carbonato-apatito. Las nanobacterias poseen propiedades inusuales haciendo difícil su detección con métodos microbiológicos habituales. Aunque normalmente tienen diámetros de 0,2-0,5 \mum, también existen en formas minúsculas (0,05-0,2 \mum) tal como se observa utilizando microscopía electrónica de transmisión (TEM). Así, las nanobacterias consiguen pasar a través de filtros de 0,1 \mum. Las nanobacterias casi no se pueden romper, teñir y fijar y son excepcionalmente resistentes al calor. Su tiempo de duplicación es de aproximadamente 3 días. Altas dosis de radiación \gamma o de antibióticos aminoglucósidos impidieron su multiplicación. Según la secuencia genética de ARNr 16S (EMBL X98418 y X98419) las nanobacterias entran dentro del subgrupo \alpha-2 de las Proteobacterias, que incluye también las especies Brucella y Bartonella. Este último género incluye patógenos de seres humanos y animales que comparten similitudes con las nanobacterias, por ejemplo, algunos de los mismos antígenos y efectos citopáticos.

La competencia por los nutrientes necesarios para la vida es enorme en entornos naturales y así se hacen necesarias adaptaciones ingeniosas y estrategias de supervivencia para condiciones desfavorables. Las bacterias pueden formar esporas, quistes y biopelículas, que les permiten sobrevivir períodos de tiempo desfavorables. Las bacterias en tales estados tienen funciones metabólicas significativamente más lentas, pero las células vegetativas también pueden ralentizar su metabolismo. La mayor resistencia de las bacterias envueltas en biopelícula o como esporas no es sólo debida a su menor tasa metabólica. Las estructuras impermeables alrededor del microorganismo sirven de barreras mecánicas que bloquean la entrada de compuestos potencialmente perjudiciales. También se sabe que algunos mecanismos adicionales ayudan en la supervivencia de las bacterias. La resistencia al calor de las esporas bacterianas puede atribuirse a tres factores principales, siendo estos la deshidratación de protoplastos, la mineralización y la adaptación térmica. La resistencia a la radiación está comúnmente asociada con sistemas sofisticados de reparación de ADN. Las precondiciones principales para la supervivencia de las bacterias son obviamente la minimización de la tasa metabólica y de la multiplicación, lo que les permiten tiempo para la reparación del ADN y otros componentes celulares dañados. Un metabolismo muy lento y la capacidad de formar biopelículas son también características de las nanobacterias. Debido a su mínimo tamaño, la presencia de sistemas complicados de reparación de ácido nucleico en las nanobacterias parece muy poco probable. Una posible explicación para la resistencia a la radiación gamma observada puede ser su tamaño tan reducido, y las peculiaridades en la estructura de su ácido
nucleico.

El apatito tal vez tenga una función esencial en la formación de cálculos renales . Los componentes cristalinos de los cálculos del tracto urinario son oxalato cálcico, fosfato cálcico, estruvita, purinas, o cisteína. La mayoría de los cálculos urinarios son mezclas de dos o más componentes, siendo la mezcla principal oxalato cálcico y apatito. Además, estudios de modelos de fermentadores han mostrado que siempre se forman inicialmente nidos de fosfato cálcico, que posteriormente pueden revestirse de oxalato cálcico u otros componentes. Las infecciones del tracto urinario, que producen la formación de estruvita y carbonato-apatito, es una causa común de los cálculos de riñón. El tratamiento convencional ha consistido normalmente en la extracción quirúrgica del cálculo, en combinación con un ciclo corto de tratamiento antimicrobiano. Tal tratamiento es curativo en un 50% de los casos. En los que no se curan se produce formación recurrente de cálculos y pielonefritis progresiva . La morbilidad y el coste que resulta de esta enfermedad son significativos.

La calcificación tisular de carbonato-apatito es común en la naturaleza en otras enfermedades, las placas ateroescleróticas, por ejemplo, acumulan fosfato cálcico. Se encontró por medio de inmunoensayo y tinción inmunohistoquímica que el 25% de las placas ateroescleróticas en muestras de aorta humana contiene nanobacterias. Los pacientes de hemodiálisis pueden desarrollar calcificación metastásica y tumoral extendida. La periartritis aguda es una artropatía de apatito relacionada con calcificaciones intratendinosas. Los cristales de apatito también producen inflamación cuando se inyectan en el espacio sinovial. La calcificación del tejido se encuentra también en varios tipos de
cáncer.

Los dentículos o cálculos de la pulpa son cuerpos mineralizados polimórficos de varios tamaños que se encuentran ocasionalmente en el tejido conjuntivo de la pulpa de los dientes humanos. Su etiología permanece confusa aunque se han asociado frecuentemente con el proceso de envejecimiento o con la patología de la pulpa. Pueden estar presentes también en dientes permanentes que han recibido un impacto y están libres de patologías durante mucho tiempo. Aunque los cálculos de la pulpa han sido ampliamente estudiadas morfológicamente, su origen no se conoce aún y se sabe poco sobre su composición química. Un estudio histoquímico de las calcificaciones de la pulpa ha mostrado que la matriz orgánica consiste en fibras reticulares de tejido conjuntivo y una sustancia molida que contiene glucoproteínas y polisacáridos ácidos. La fase mineral de calcificación de la pulpa se ha estudiado con espectrometría de rayos X de dispersión de energía y análisis químico, y se ha demostrado que las sales de calcio se depositan en forma de apatito, posiblemente apatito que contiene carbonato. De hecho, no hay mucha diferencia entre la estructura química de un diente y la de los dentículos. La formación de huesos y de dientes en el organismo tienen mecanismos similares, dejando muchas preguntas sin respuesta. La formación de apatito en el organismo (excepto en los dientes y los huesos) se denomina biomineralización patológica, por ejemplo, cálculos de la pulpa dental, cálculos renales, y calcificaciones de las articulaciones.

La malacoplaquia es una rara enfermedad inflamatoria crónica de causa desconocida, pero que presenta un gran factor bacteriano. Puede ser letal. Esta enfermedad se caracteriza por una tinción de Von Kossa positiva, cuerpos calcificados laminares o con forma de diana denominados cuerpos de Michaelis-Gutmann que están compuestos de apatito. La estructura de estas calcoesférulas es muy parecida a las nanobacterias calcificadas.

Las calcificaciones de los tejidos se encuentran en varias enfermedades como en el tumor seroso de ovario, adenocarcinoma papilar del endometrio, carcinoma de mama, carcinoma papilar del tiroides, tumor carcinoide duodenal, y craneofaringioma. En muchos tumores malignos se encuentran cristales en forma de aguja en las células epiteliales. Para detectar este tipo de calcificación es necesario utilizar microscopía electrónica, ya que los cristales son demasiado pequeños para ser vistos con el microscopio óptico, y se desconoce su origen. Muchas células malignas tienen receptores para la adherencia de nanobacterias. Podrían introducir nanobacterias en el tumor con una calcificación posterior. Además, algunas células que se dividen bajo estímulos inflamatorios pueden tener receptores para la adherencia, por ejemplo, en las placas ateroscleróticas con reconocida acumulación de fosfato cálcico. En esta enfermedad, aunque el análisis por sonda de electrones mostró que la superficie y el interior del depósito mineral tenían la misma composición química, una microscopía electrónica de barrido (SEM) mostró diferentes tipos de estructuras como partículas esféricas y fibras que se asemejan a las nanobacterias. De modo similar, la periartritis aguda se ha asociado con la presencia de cristales de hidroxiapatita en las articulaciones.

Las placas de Alzheimer pueden marcarse con anticuerpos policlonales anti-nanobacterianos. Estos anticuerpos policlonales contienen algunos autoanticuerpos, y los presentes inventores han obtenido también algunos autoanticuerpos monoclonales en inmunizaciones nanobacterianas. Se ha sugerido que una infección bacteriana lenta desempeña un papel en enfermedades autoinmunológicas. A menudo se presenta calcificación del tejido en estas enfermedades. Las nanobacterias son un nuevo ejemplo de microorganismos con un crecimiento lento, que infectan al hombre durante largos períodos de tiempo. La estructura de apatito y los ácidos nucleicos anómalos pueden contribuir a las anomalías en la respuesta inmune frente a esta infección.

Se han determinado varios aspectos de la nucleación biogénica, el crecimiento de los cristales y la morfología del apatito tanto in vivo como in vitro. Sin embargo, muchos detalles siguen sin resolverse, incluyendo la naturaleza específica de las fases de precipitación iniciales, los mecanismos y factores que controlan la incorporación de impurezas iónicas en la red cristalina, detalles de la ultraestructura cristalográfica y la morfología en tejidos mineralizados (huesos, dentina), y la relación de los componentes inorgánicos con la compleja matriz basada en colágeno. El motivo de la deposición de fosfato cálcico en muchas enfermedades sigue siendo especulativo. Se ha demostrado que una acumulación de calcio en las mitocondrias, que es supuestamente dependiente del substrato residual para la producción de energía, parece producir la calcificación. El fosfato cálcico amorfo en la forma de esferoides, y posiblemente como finas fibrillas y gránulos, también parece desempeñar un papel en la calcificación por su transformación en
apatito.

Kajander et al. (Proc. SPIE-Int. Soc. Opt. Eng. (1997), 3111, págs. 420-428) enseñan nanobacterias de la sangre y hemoderivados y su resistencia al calor, la radiación gamma y los antibióticos. Se describe que los aminoglucósidos en altas concentraciones son bacteriostáticos. Además, el uso de 3 megarads de radiación gamma destruye a las nanobacterias, el quelante de calcio EDTA inhibe su crecimiento y el calentamiento a 100ºC durante 30 minutos impide el crecimiento de las nanobacterias en suero, mientras que las nanobacterias sin suero no se pudieron matar por exposición a 100ºC durante una hora. Finalmente, los autores afirman que las nanobacterias podrían estar en depósitos minerales de cálculos renales o cálculos urinarios.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona métodos para esterilizar artículos contaminados con nanobacterias. Tales métodos según la presente invención serán particularmente útiles para desinfectar y/o esterilizar equipos médicos y disoluciones utilizadas en el tratamiento y diagnóstico de pacientes.

La presente invención proporciona también métodos para prevenir infección por nanobacterias, y para tratar a pacientes infectados con nanobacterias. En particular, la presente invención proporciona un método para prevenir la recurrencia de cálculos renales en un paciente que padece de cálculos renales, que comprende la administración de un antibiótico en una cantidad eficaz para inhibir o prevenir el crecimiento y desarrollo de las nanobacterias.

Con los anteriores objetos , ventajas y características de la invención y otros, que se harán evidentes en lo sucesivo, la naturaleza de la invención puede comprenderse más claramente por referencia a la siguiente descripción detallada de las realizaciones preferidas de la invención y de las reivindicaciones adjuntas.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Imágenes de microscopio óptico y electrónico de las nanobacterias y sus análisis con microanálisis por rayos X de dispersión de energía (EDX). (A) Imagen de contraste diferencial de interferencia de nanobacterias adheridas al fondo tras un período de cultivo de 2 meses. (B) Tinción de ADN de la misma zona (x1600) con el método de Hoechst modificado. (C) Tinción negativa de nanobacterias aisladas directamente de suero fetal bovino (Barra = 200 nm). (D) Micrografía SEM que muestra el tamaño variable de las nanobacterias (Barra = 1 \mum). (E) Una nanobacteria en división cubierta con una capa de apatito "peluda" (Barra = 100 nm). (F) Micrografía TEM de nanobacterias enterradas en una capa de apatito después de un período de cultivo de 3 meses (Barra = 1 \mum), (G) a mayor aumento (Barra = 200 nm). Las zonas centrales blancas en F son artefactos debidos a la pérdida de la capa mineral durante el seccionamiento. (H) Microanálisis por rayos X de dispersión de energía. SEM de nanobacterias que muestra picos de Ca y P similares a los de la hidroxiapatita (I).

Figura 2. Colonias de nanobacterias con aspecto de piedra y comparación con hidroxiapatita. (A) Colonias con medio Loeffler modificado en una placa de 10 cm. Las colonias penetraron a través del medio formando pilares petrificados. La flecha muestra una colonia grisáceo-marrón típica mostrada en B (x40). (C) Depósitos cristalinos con apariencia de agujas puestos de manifiesto por TEM (Barra = 200 nm). (D) Imagen TEM de cristales de apatito de referencia (Barra = 100 nm).

Figura 3. Nanobacterias cultivadas bajo condiciones sin suero (SF), y su interacción con las células. (A) Micrografía de microscopía óptica, (B) tinción de ADN de la misma zona con el método de tinción de Hoechst modificado. (C) Imágenes de contraste diferencial de interferencia de nanobacterias dentro de un refugio común de apatito, y (D) un grupo de nanobacterias parcialmente desmineralizado (A-D, x860). (E y F) Micrografías SEM de "moradas" de nanobacterias desprendidas del recipiente de cultivo (Barras = 1 \mum). (G) IIFS (tinción inmunofluorescente indirecta) de nanobacterias mineralizadas internalizadas (flechas blancas) en células 3T6. (H) Tinción de ADN de la misma zona con el método de Hoechst habitual (x540). (I-L) Micrografías TEM de calcificaciones intracelulares en células 3T6 producidas por nanobacterias SF (Barras, I y K = 2 \mum, J = 500 nm, L = 200 nm).

Figura 4. Ejemplos de calcificación por nanobacterias extra- e intracelular. (A) Micrografía TEM de nanobacterias en cultivo (Barra = 20 nm) de suero fetal bovino, y (B) una bacteria en un cálculo renal tras la desmineralización (Barra = 50 nm) (C) IIFS del mismo cálculo con el mAb (anticuerpo monoclonal) anti-nanobacterias. (D y E) Resultados de la tinción de von Kossa de células 3T6 expuestas a nanobacterias SF durante 24 horas, y (F) control negativo (x270).

Figura 5. Gráfico que muestra el efecto del calor en el crecimiento de las nanobacterias en suero. Las nanobacterias se expusieron a calor en PBS y se cultivaron durante 16 días. Sólo treinta minutos de ebullición dieron como resultado la inactivación de las nanobacterias. Se observó un crecimiento exponencial en los otros tratamientos. El medio que contenía 10% de suero irradiado con radiación gamma (control negativo) no mostró ningún crecimiento.

Figura 6. Gráfico que muestra el efecto de los antibióticos en el crecimiento de las nanobacterias. El crecimiento se compara con el de las nanobacterias cultivadas sin antibióticos. Fueron necesarias dosis de antibióticos diez veces mayores que las recomendadas para el uso en cultivo celular para impedir el crecimiento de las nanobacterias.

Figura 7. Imágenes SEM de nanobacterias cultivadas con y sin antibióticos durante un mes en medio que contiene un 10% de suero fetal bovino. Barras = 1 \mum. (A) Nanobacterias cultivadas sin antibióticos. (B) Nanobacterias cultivadas con 100 \mug/ml de gentamicina. Las flechas muestran cambios morfológicos.

Figura 8. Imágenes SEM de dientes con (A y B), y sin (C y D) cálculos dentales. El diente mostrado en (A) se extrajo por problemas periodontales y desorción ósea producida por formación grave de cálculos de la pulpa dental. Un mayor aumento de la zona mostrado por la flecha muestra calcificación redonda y fibrosa (B). El diente mostrado en (C) se extrajo por un problema ortodóntico. Este diente se sometió al autoclave y se expuso a un medio de cultivo DMEM durante un mes, en una condición de cultivo celular. No se observó ninguna cristalización en la superficie. (D) Muestra el mayor aumento de la zona marcada con una flecha en (C). La otra mitad del mismo diente cortada verticalmente se utilizó para el experimento descrito en la figura 9.

Figura 9. Micrografías SEM del diente sano mostrado en las figuras 8C y D después de someter al autoclave, e incubadas con nanobacterias SF durante un mes en condiciones de cultivo celular. (A) Imagen general que muestra la superficie del diente, un mayor aumento de la zona mostrado por la flecha se observa en (B). (C) Nanobacterias cultivadas durante 3 meses, y adheridas al recipiente de cultivo celular; la barra es 1 \mum. (D) Un zona en el mismo diente que tiene un voluminoso cálculo de la pulpa que apareció después de exposición a nanobacterias SF durante un mes. (E) Un mayor aumento de la misma zona mostrada con una flecha grande en (D). Las flechas pequeñas muestran el crecimiento de las nanobacterias SF en la superficie de los cálculos.

Figura 10. Imágenes SEM de nanobacterias SF creciendo en un trozo de dolomita en medio de cultivo.

Figura 11. Microanálisis por rayos X de dispersión de energía de un cálculo dental humano (O) y nanobacterias SF (B).

Figura 12. Interacción de nanobacterias SF con fibroblastos (células 3T6). (A) Nanobacterias SF internalizadas por un fibroblasto (la punta de la flecha muestra las nanobacterias dentro de una vacuola), (B) un mayor aumento que muestra la estructura de apatito con forma de aguja de las nanobacterias SF internalizadas, (C) resultado de la tinción von Kossa de los fibroblastos infectados, y (D) control negativo. El aumento en (C y D) es x270. La flecha en (C) muestra nanobacterias teñidas después de tinción con el método de von Kossa que es un método habitual de detección de calcificación utilizado en patología.

Figura 13. Micrografías TEM de un cálculo renal humano y nanobacterias de carbonato-apatito. (A) Un cálculo renal antes de la desmineralización, (B) nanobacterias SF cultivadas durante un mes, (C) el mismo cálculo renal después de la desmineralización, (D) nanobacterias cultivadas en medio que contiene suero durante 2 meses. El cálculo renal (C) se desmineralizó mediante la incubación del cálculo roto en pedazos en HCl 1N durante 10 minutos a temperatura ambiente, se neutralizó con NaOH y un tampón de fosfato potásico y se embebió en EPON. Ambos cultivos de nanobacterias (B y D) se adhirieron al fondo de sus recipientes de cultivo.

Figura 14. Imágenes TEM (A), y FITC (B) de nanobacterias desmineralizadas y positividad para la inmunofluorescia en diferentes tipos de cálculos renales (C-E). Los cálculos renales y las nanobacterias se tiñeron utilizando anticuerpos monoclonales antinanobacterias específicos, después de la desmineralización de las muestras tal como se describe en la figura 13. Las flechas anchas muestran partículas cocoides individuales con resultados positivos para la inmunofluorescencia. La inmunopositividad en la superficie de las pequeñas unidades que componen el cálculo se muestra con las flechas pequeñas. Aumentos: (B-D) x1600; (E) x640.

Figura 15. Gráficos que muestran el crecimiento nanobacteriano en el subcultivo de 20 cálculos renales diferentes, desmineralizados, neutralizados y filtrados en condiciones estériles, y las nanobacterias. * Indica que no hubo crecimiento en los primeros 6 días.

Figura 16. Efecto de trimetoprim sobre las nanobacterias en 12 días, expresado como concentración mínima inhibitoria (MIC).

Figura 17. Efecto de tetraciclina sobre las nanobacterias en 12 días, expresado como concentración mínima inhibitoria (MIC).

Figura 18. Efecto de nitrofurantoína sobre las nanobacterias en 12 días, expresado como concentración mínima inhibitoria (MIC).

Figura 19. Efecto de doxiciclina sobre las nanobacterias en 12 días, expresado como concentración mínima inhibitoria (MIC).

Figura 20. Efecto de gentamicina sobre las nanobacterias en 12 días, expresado como concentración mínima inhibitoria (MIC).

Figura 21. Efecto de neomicina sobre las nanobacterias en 12 días, expresado como concentración mínima inhibitoria (MIC).

Figura 22. Efecto de kanamicina sobre las nanobacterias en 12 días, expresado como concentración mínima inhibitoria (MIC).

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Figura 23. Efecto de vancomicina sobre las nanobacterias en 12 días, expresado como concentración mínima inhibitoria (MIC).

Figura 24. Transcurso en el tiempo de los efectos antibióticos de 4 \mug/ml de tetraciclina, trimetoprim, trimetoprim + sulf., nitrofurantoína, doxiciclina, y controles positivos y negativos.

Figura 25. Efecto de tetraciclina en nanobacterias humanas. La tetraciclina es eficaz para aislados de nanobacterias humanas de manera similar en comparación con la cepa patrón de nanobacterias bovinas.

Figura 26. Dosis/respuesta y transcurso en el tiempo para ampicilina.

Figura 27. Dosis/respuesta y transcurso en el tiempo para citrato.

Figura 28. Dosis/respuesta y transcurso en el tiempo para EDTA.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas de la invención

Los presentes inventores han descubierto, sorprendentemente, el primer microorganismo con revestimiento mineral en el que el mineral constituye una parte de la pared celular que es esencial para la estrategia de supervivencia del microorganismo. En las nanobacterias este mineral es el carbonato-apatito. Como resultado, los presentes inventores han encontrado que cualquier agente terapéutico que esté dirigido hacia el apatito puede ser de utilidad en un tratamiento antinanobacteriano.

Más particularmente, la presente invención se refiere a métodos para la desinfección de un artículo contaminado por nanobacterias. Tal como se usa en el contexto de la presente invención, un artículo que ha de desinfectarse es cualquier artículo para el cual se desee una esterilidad completa, incluyendo dispositivos médicos, instrumentos quirúrgicos, y suministros médicos y quirúrgicos que incluyen agujas, jeringuillas, tubos, y similares. También incluidas dentro del alcance de la presente invención están las disoluciones para uso en tratamiento médico, y para la formulación de fármacos, que incluyen agua esterilizada, solución salina, solución de Ringer, y otras disoluciones. Cualquier tipo de mezcla, por ejemplo, disoluciones o suspensiones, puede esterilizarse por el ejercicio médico incluyendo cualquier formulación para el diagnóstico o tratamiento médico, incluyendo, pero sin limitarse a, cualquier fármaco que se pretenda administrar a un paciente, incluyendo un ser humano o un animal.

En una realización preferida, la presente invención proporciona un método para desinfectar un artículo contaminado por nanobacterias que comprende exponer las nanobacterias a una disolución desinfectante. Una mezcla desinfectante según la presente invención es preferiblemente una mezcla de persulfato potásico y ácido sulfaminoico en agua, preferiblemente agua destilada. La mezcla puede ser una disolución, una suspensión, o similares. En una realización preferida, la mezcla será una disolución de desde aproximadamente el 35% hasta aproximadamente el 70% de persulfato potásico y aproximadamente desde el 1% hasta aproximadamente el 15% de ácido sulfaminoico. En una realización particularmente preferida, la mezcla será de aproximadamente el 50% de persulfato potásico y aproximadamente el 5% de ácido sulfaminoico. Esta mezcla puede utilizarse a concentración completa o diluirse para su uso en condiciones fisiológicas, preferiblemente hasta una concentración de desde aproximadamente el 0,1% hasta aproximadamente el 10%, más preferiblemente a una concentración de aproximadamente el 1%.

En una realización alternativa, una mezcla desinfectante según la presente invención es una mezcla de formaldehído, glioxal, ácido glioxílico y cloruro de dimetil-laurilbencilamonio en agua, preferiblemente agua destilada. La mezcla puede ser una disolución, una suspensión, o similares. En una realización preferida, la mezcla será una disolución de desde aproximadamente el 1% hasta aproximadamente el 10% de formaldehído, aproximadamente desde el 5% hasta aproximadamente el 10% de glioxal, aproximadamente desde el 0,1% hasta aproximadamente el 5% de ácido glioxílico, y aproximadamente desde el 3% hasta aproximadamente el 12% de cloruro de dimetil-laurilbencilamonio. En una realización particularmente preferida, la mezcla será de aproximadamente el 4,5% de formaldehído, aproximadamente el 6,8% de glioxal, aproximadamente el 1,5% de ácido glioxílico, y aproximadamente el 6% de cloruro de dimetil-laurilbencilamonio. Esta mezcla puede utilizase a concentración completa o diluirse para su uso en condiciones fisiológicas, preferiblemente hasta una concentración de aproximadamente el 0,1% hasta aproximadamente el 10%, más preferiblemente a una concentración de aproximadamente el 3%.

Alternativamente, un artículo puede descontaminarse por desmineralización de las nanobacterias seguido de exposición a un compuesto químico desinfectante. La desmineralización puede conseguirse exponiendo a las nanobacterias a bajo pH, preferiblemente con un ácido fuerte, preferiblemente ácido clorhídrico. Alternativamente, la desmineralización puede conseguirse por medio de la exposición a un quelante de calcio. Quelantes de calcio apropiados para su uso en la presente invención incluyen ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido cítrico, y compuestos de citrato. En relación con la desmineralización, pueden emplearse de manera adecuada cualquiera de un amplio espectro de desinfectantes químicos. Una mezcla desinfectante particularmente preferida para su uso con la desmineralización comprende uno o más de los siguientes:

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Agente	Concentración aceptable	Concentración preferida
etanol	>50%	>70%
glutaraldehído	>0,1%	>2%
formaldehído	>1%	>4%
hipoclorito	>0,1%	>0,5%
peróxido de hidrógeno	>0,1%	>3%
ácido clorhídrico	>0,1M	>1M
hidróxido de sodio	>0,1M	>1M
dodecilsulfato de sodio (SDS)	>0,1%	>1%
Tween 80	>0,1%	>1%
Tritón X-100	>0,1%	>1%
HCl de guanidinio	>1M	>3M
urea	>1M	>3M
Virkon®	>0,1%	>1%
Erifenol®	>0,1%	>1,5%
Klorilli®	>0,1%	>1%
Buraton®	>0,1%	>3%

Tras la desmineralización, tanto como una alternativa al uso de una disolución desinfectante, o como un complemento al uso de una disolución desinfectante, el artículo puede someterse opcionalmente al autoclave, preferiblemente a una temperatura de al menos 121ºC, preferiblemente durante al menos 20 minutos.

Alternativamente, tras la desmineralización, tanto como una alternativa al uso de una disolución desinfectante, o como un complemento al uso de una disolución desinfectante, el artículo puede exponerse a radiación ultravioleta, por ejemplo, exponiendo el artículo a luz ultravioleta aproximadamente equivalente a la exposición de una lámpara UV-C de al menos 15 W a una distancia de aproximadamente 60 cm o menos durante al menos 1 hora, preferiblemente durante al menos 3 horas, todavía más preferiblemente, al menos durante la noche. Alternativamente, el artículo puede estar expuesto al menos a tres megarads aproximadamente de radiación gamma.

Las nanobacterias pueden también erradicarse de líquidos por sonicación. Se puede utilizar cualquier sonicador convencional; los tiempos de sonicación variarán con la potencia del sonicador y el volumen y las características del líquido que se va a desinfectar. Unos tiempos de sonicación adecuados pueden determinarse fácilmente por los expertos habituales en la técnica sin necesidad de experimentación excesiva. Normalmente, la sonicación de las muestras durante 5-10 minutos será suficiente para erradicar las nanobacterias de la mayoría de las disoluciones. La sonicación puede aplicarse a cualquier escala de muestras si la potencia del ultrasonido y el recipiente de la muestra tienen razones adecuadas entre sí. Fuentes de ultrasonidos de gran potencia permiten también aplicaciones de flujo continuo. El método es aplicable en el tratamiento de cualquier disolución. Es suave para las proteínas y otros componentes subcelulares de la muestra si se evita un calor excesivo mediante la refrigeración de la disolución, tanto continuamente (por ejemplo, poniendo el recipiente que contiene la disolución que se va a desinfectar en un baño de agua fría), como interrumpiendo periódicamente el proceso de sonicación para refrigerar la disolución (por ejemplo, poniendo el recipiente que contiene la disolución que se va a desinfectar en un baño de hielo).

En una realización particularmente preferida de la presente invención, las nanobacterias se destruyen secando el artículo que se va a desinfectar calentándolo durante al menos una hora a una temperatura de al menos 100ºC. Alternativamente, tras la desmineralización como se ha expuesto anteriormente, el artículo puede calentarse durante al menos 15 minutos aproximadamente, preferiblemente al menos 30 minutos aproximadamente, a temperaturas de al menos 60ºC, preferiblemente al menos 100ºC.

La presente invención proporciona, además, un medio de cultivo tisular formulado para estar libre de nanobacterias. Dicho medio de cultivo tisular libre de nanobacterias puede ser cualquier medio de cultivo de tejidos normal al alcance de un experto en la técnica, que comprende, además, una cantidad de antibiótico de nanobacterias eficaz de uno o más antibióticos, seleccionándose dichos antibióticos del grupo que consiste en antibióticos \beta-lactámicos, antibióticos aminoglucósidos, antibióticos de tetraciclina, y mezclas de los mismos. Antibióticos \beta-lactámicos adecuados para su uso en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, penicilina, feneticilina, ampicilina, azlocilina, bacampicilina, carbenicilina, ciclacilina, mezlocilina, piperacilina, epicilina, hetacilina, cloxacilina, dicloxacilina, meticilina, nafcilina, oxacilina, y sales de los mismos. Antibióticos aminoglucósidos adecuados para su uso en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, estreptomicina, kanamicina, gentamicina, amikacina, neomicina, paromomicina, tobramicina, viomicina, y sales de los mismos. Las tetraciclinas adecuadas incluyen tetraciclina, clortetraciclina, demeclociclina, doxiciclina, metaciclina, oxitetraciclina, rolitetraciclina, minociclina, sanciclina y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Adicionalmente, con anterioridad al uso, un medio de cultivo según la presente invención está preferiblemente esterilizado según uno de los métodos expuestos anteriormente. Un experto habitual en la técnica puede seleccionar el método de esterilización más conveniente para el medio de cultivo en cuestión.

La presente invención también proporciona un método para prevenir el desarrollo de calcificaciones in vivo, es decir, en un paciente que necesite tal tratamiento, que comprende administrar un antibiótico al paciente en una cantidad eficaz para inhibir o prevenir el crecimiento de las nanobacterias. En el contexto de la presente invención, las calcificaciones in vivo incluyen, pero no se limitan a, cálculos renales, aterosclerosis, periartritis aguda, cálculos de la pulpa dental o dentículos, malacoplaquia, enfermedad de Alzheimer, enfermedades autoinmunitarias que incluyen esclerodermia, y calcificación metastásica y tumoral que se encuentra en pacientes de hemodiálisis y calcifilaxis, tumores malignos que incluyen tumor seroso de ovario, adenocarcinoma papilar del endometrio, carcinoma de mama, carcinoma papilar del tiroides, tumor carcinoide duodenal, y craneofaringioma. En el contexto de la presente invención, un "paciente" es cualquier mamífero, preferiblemente un ser humano, que padece de calcificación de tejido, especialmente en conexión con uno de los trastornos enumerados anteriormente.

En una realización preferida, la presente invención proporciona un método para prevenir el desarrollo de calcificaciones in vivo en un paciente que necesite tal tratamiento que comprende administrar una cantidad de antibiótico de nanobacterias eficaz de uno o más antibióticos seleccionados del grupo que consiste en antibióticos \beta-lactámicos, antibióticos aminoglucósidos, antibióticos de tetraciclina, y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, y mezclas de los mismos. Antibióticos \beta-lactámicos adecuados para su uso en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, penicilina, feneticilina, ampicilina, azlocilina, bacampicilina, carbenicilina, ciclacilina, mezlocilina, piperacilina, epicilina, hetacilina, cloxacilina, dicloxacilina, meticilina, nafcilina, oxacilina, y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Antibióticos aminoglucósidos adecuados para su uso en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, estreptomicina, kanamicina, gentamicina, amikacina, neomicina, paromomicina, tobramicina, viomicina, y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Las tetraciclinas adecuadas incluyen tetraciclina, clortetraciclina, demeclociclina, doxiciclina, metaciclina, oxitetraciclina, rolitetraciclina, minociclina, sanciclina y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. En una realización particularmente preferida, los antibióticos son coadministrados con compuestos de citrato.

En una realización alternativa, la vitamina K, y/o sus análogos, pueden emplearse en los métodos de la presente invención. Análogos de la vitamina K apropiados para su uso en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, menadiona, fitonadiona (vitamina K), y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Para su uso en la presente invención, la vitamina K se emplea preferiblemente en una concentración de al menos 1 \mug/ml.

En una realización adicional, el ácido p-aminosalicílico, así como otros derivados de ácido salicílico pueden utilizarse en el método de la presente invención. Particularmente preferido es el ácido acetilsalicílico (es decir, la Aspirina).

En una realización adicional, se pueden usar bisfosfonatos en los métodos de la presente invención. Como familia, los bisfosfonatos se caracterizan farmacológicamente por su capacidad de inhibir la resorción ósea, mientras que farmacocinéticamente se clasifican por su similitud en absorción, distribución y eliminación.

Aunque todos los bisfosfonatos tienen propiedades fisicoquímicas similares, sus actividades inhibidoras de la resorción varían. La actividad aumenta espectacularmente cuando el grupo amino se encuentra dentro de la cadena alifática de carbono. El alendronato, por ejemplo, un aminobisfosfonato, es aproximadamente 700 veces más potente que el etidronato, tanto in vitro como in vivo. En general, los bisfosfonatos son mal absorbidos desde el tracto gastrointestinal como resultado de su baja lipofilicidad. Estudios in vitro e in vivo han mostrado que los bisfosfonatos se absorben desde el tracto intestinal por medio de transporte paracelular. Los bisfosfonatos sistémicamente disponibles desaparecen muy rápidamente del plasma, y son absorbidos en parte por el hueso y excretados en parte por los riñones. La contribución relativa de estos dos procesos a la eliminación global del plasma difiere entre los distintos bisfosfonatos. A día de hoy ninguno de los bisfosfonatos estudiados muestra evidencia alguna de metabolismo. La excreción renal es la única vía de eliminación. Estudios con alendronato en ratas indican que el fármaco es secretado activamente por un sistema renal de transporte indefinido, y no por los sistemas aniónicos o catiónicos de transporte renal.

Los bisfosfonatos tienen una unión P-C-P, en lugar de la unión P-O-P del pirofosfato inorgánico, que las hace resistentes a la degradación enzimática y les otorga una alta afinidad para la hidroxiapatita. Son potentes bloqueantes de la resorción ósea osteoclástica y se han utilizado satisfactoriamente para tratar enfermedades metabólicas óseas que implican una mayor resorción ósea. Es posible sintetizar una variedad de bisfosfonatos sustituyendo el hidrógeno en el átomo de carbono. Bisfosfonatos adecuados para su uso en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, ácido alendrónico, ácido etidrónico, ácido clodrónico, ácido oxidrónico y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Para el uso en la presente invención, los bisfosfonatos son administrados preferiblemente en una dosis de aproximadamente 5-20 mg/kg/día.

Todavía otra parte adicional de esta invención es una composición farmacéutica de materia adecuada para la prevención de calcificaciones in vivo que comprende al menos uno o más de los compuestos descritos anteriormente, mezclas de los mismos, y/o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, y un vehículo farmacéuticamente aceptable para los mismos. Tales composiciones se preparan de acuerdo con procedimientos farmacéuticamente aceptados, por ejemplo, como se describe en Remington's Pharmaceutical Sciences, decimoséptima edición, ed. Alfonso R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, PA (1985).

Para uso terapéutico en el método de la presente invención, un antibiótico, o su sal , puede administrarse convenientemente en forma de una composición farmacéutica que contiene uno o más antibióticos, o sales de los mismos, y un vehículo farmacéuticamente aceptable de los mismos. Los vehículos adecuados son bien conocidos en la técnica y varían con la forma y el modo de administración que se desee para la composición farmacéutica. Por ejemplo, pueden incluir diluyentes o excipientes tales como cargas, aglutinantes, agentes humectantes, disgregantes, agentes tensioactivos, lubricantes y similares. Normalmente, el vehículo puede ser un vehículo sólido, líquido o que se puede evaporar, o combinaciones de los mismos. Cada vehículo debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los demás componentes en la composición y no ser perjudiciales para el paciente. El vehículo debe ser biológicamente aceptable e inerte, es decir, debe permitir que el(los) compuesto(s) antibiótico(s) inhiba(n) el desarrollo de las nanobacterias y, en particular, de los cristales de apatito asociados con las nanobacterias.

Los compuestos antibióticos para su uso en el método de la presente invención, o las sales de los mismos, pueden formularse junto con el vehículo en cualquier forma farmacéutica unitaria deseada. Formas farmacéuticas unitarias normales incluyen comprimidos, píldoras, polvos, disoluciones, suspensiones, emulsiones, gránulos, cápsulas, y supositorios; los comprimidos y las cápsulas son particularmente preferidos. Las formulaciones incluyen las que sean apropiadas para administración oral, rectal; nasal, tópica (incluyendo bucal y sublingual), vaginal y parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa, intradérmica y transdérmica), prefiriéndose formulaciones apropiadas para administración oral.

Para preparar formulaciones adecuadas para su inyección, por ejemplo, las disoluciones y suspensiones se esterilizan y son preferiblemente isotónicas a la sangre. En la obtención de los preparados inyectables, también pueden utilizarse los vehículos comúnmente utilizados en este campo , por ejemplo, agua, alcohol etílico, propilenglicol, alcohol isoestearílico etoxilado, alcohol isoestearílico polioxilado, polioxietilen-sorbitol, ésteres de sorbitato, y similares. En estos casos, cantidades adecuadas de ajustadores de la isotonicidad como el clorato de sodio, la glucosa o la glicerina pueden añadirse para hacer que las preparaciones sean isotónicas. Las disoluciones acuosas y estériles para inyección pueden contener, además, antioxidantes, tampones, bacteriostatos, y adiciones similares aceptables para formulaciones parenterales.

Las formulaciones pueden presentarse convenientemente en forma farmacéutica unitaria y pueden prepararse mediante cualquier método conocido en la técnica farmacéutica. Tales métodos incluyen la etapa de asociar el principio activo con el vehículo que puede englobar uno o más componentes accesorios. En general, las formulaciones se preparan asociando el principio activo con vehículos líquidos o vehículo sólidos finamente divididos, o ambos, de manera uniforme e íntima, dando forma entonces al producto si fuese necesario. Pueden usarse varios recipientes de dosis única o múltiple, por ejemplo, ampollas y viales sellados, tal como se conoce bien en la técnica.

Además de los componentes específicamente mencionados anteriormente, las formulaciones de esta invención también pueden incluir otros agentes convencionales en la técnica para este tipo de formulación farmacéutica.

Un compuesto para el uso en la presente invención puede estar presente en la composición en una amplia proporción con respecto al vehículo. Por ejemplo, el compuesto puede estar presente en una cantidad del 0,01 al 99,9% en peso, y más preferiblemente en una cantidad de aproximadamente el 0,1 al 99% en peso. Todavía más preferiblemente, el compuesto puede estar presente en una cantidad de aproximadamente el 1 al 70% en peso de la composición.

La dosis de los antibióticos, las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, o mezclas de los mismos, administrados a un paciente según la presente invención variarán dependiendo de varios factores, incluyendo, pero sin limitarse a, la edad, peso y especie del paciente, la salud general del paciente, la gravedad de los síntomas, si la composición se administra sola o en combinación con otros agentes terapéuticos, la incidencia de efectos secundarios y similares.

En general, una dosis adecuada para su aplicación en el método de la presente invención es de aproximadamente 0,001 a 100 mg/kg de peso corporal/dosis, preferiblemente de aproximadamente 0,01 a 60 mg/kg de peso corporal/dosis, y todavía más preferiblemente de aproximadamente 0,1 a 40 mg/kg de peso corporal/dosis por día. La dosis deseada puede ser administrada como de 1 a 6 o más subdosis administradas a intervalos apropiados durante todo el día. Los compuestos antibióticos pueden administrarse repetidamente durante un período de meses o años, o puede administrarse lenta y constantemente mediante infusión al paciente. También se pueden administrar dosis mayores o menores.

La dosis diaria puede ajustarse teniendo en cuenta, por ejemplo, la variedad de parámetros identificada anteriormente. Normalmente, las presentes composiciones pueden administrarse en una cantidad de aproximadamente 0,001 a 100 mg/kg de peso corporal/día. Sin embargo, también pueden administrarse otras cantidades. Para obtener buenas concentraciones plasmáticas, los antibióticos pueden administrarse, por ejemplo, por inyección intravenosa de una disolución de los antibióticos de aproximadamente el 0,1 al 1%, opcionalmente en solución salina, o administrada oralmente como un bolo.

El principio activo puede administrarse para tratamiento por cualquier vía apropiada, incluyendo las vías tópica, oral, rectal, nasal, vaginal y parental (incluyendo las vías intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, intravenosa, intradérmica y transdérmica). Se apreciará que la vía preferida variará con el estado y la edad del paciente, la naturaleza del trastorno y el principio activo elegido que incluye otros agentes terapéuticos. La vía oral es la vía preferida. También se prefiere la vía intravenosa. Sin embargo, también pueden utilizarse otras vías dependiendo del estado del paciente y de la duración del tratamiento.

Aunque es posible que el(los) antibiótico(s) se administre(n) solo, preferiblemente está presente como una formulación farmacéutica. Las formulaciones de la presente invención comprenden al menos un antibiótico, tal como se definió anteriormente, junto con uno o más vehículos aceptables del mismo y opcionalmente con otros agentes terapéuticos.

El método anterior puede ponerse en práctica mediante la administración de los compuestos por sí solos o en una combinación con otros antibióticos, incluyendo otros agentes terapéuticos en una composición farmacéutica. Otros agentes terapéuticos adecuados para su uso en el presente documento son cualquier fármaco compatible que sea eficaz por el mismo u otros mecanismos para el propósito deseado, o fármacos que son complementarios a aquellos antibióticos previamente enumerados. Los compuestos utilizados en tratamientos de combinación pueden administrarse de manera simultánea, en formulaciones tanto combinadas como separadas, o en tiempos diferentes que los presentes compuestos, por ejemplo, secuencialmente, de modo que se obtenga un efecto combinado. Las cantidades y el régimen de administración se ajustarán por el médico, preferiblemente reduciendo inicialmente las dosis normales y después valorando los resultados obtenidos. El método terapéutico de la invención puede utilizarse junto con otras terapias tal y como determine el médico.

Habiendo descrito ahora esta invención en términos generales, la misma se comprenderá mejor con referencia a ciertos ejemplos específicos, que se incluyen en el presente documento de manera únicamente ilustrativa y que no pretenden limitar la invención ni ninguna realización de la misma, excepto en caso de que se indique lo contrario.

Ejemplo 1 Mineralización por nanobacterias

En este estudio, los presentes inventores proporcionan evidencia de que las nanobacterias pueden actuar como centros de cristalización (nidos) para la formación de estructuras de apatito biogénicas. El proceso de mineralización fue estudiado in vitro con un aislado bovino de suero fetal bovino comercial y con un aislado humano. Estos resultados son de interés en la medicina porque la bacteriemia por nanobacterias se produce en humanos, y los nidos de nanobacterias podrían iniciar calcificación patológica.

Materiales y métodos Métodos de cultivo para nanobacterias

Las nanobacterias se cultivaron en DMEM (medio Eagle modificado por Dulbeco) (GIBCO) bajo condiciones de cultivo de células de mamíferos (37ºC; 5-10% CO_{2}/90-95% aire). Se utilizó suero al 10% de concentración final como complemento y fuente de nanobacterias, que eran suero fetal bovino (Sera Lab. lote 901045), o suero humano de un varón finlandés de 29 años de edad. Los cultivos se prepararon utilizando técnicas asépticas estrictas en una instalación para cultivos de células. Las muestras de nanobacterias se filtraron a través de filtros de 0,2 \mum antes del cultivo. Se hicieron subcultivos utilizando o bien el mismo suero o suero fetal bovino irradiado con radiación \gamma (\gamma-FBS) como complemento de cultivo. El suero fetal bovino y las nanobacterias fueron irradiados con radiación \gamma, cuando se indica, en una dosis mínima de 30 kGy dada a temperatura ambiente durante aproximadamente 16 horas por Kolmi-Set (Illomantsi, Finlandia).

Se realizó el subcultivo de nanobacterias en DMEM libre de suero (SF), transferidas mensualmente 1:11 durante cinco años. Las nanobacterias SF se adhirieron firmemente al fondo del recipiente de cultivo. Estos cultivos se transfirieron o se recogieron con un raspador de goma. Los cultivos se establecieron sobre medio Loeffler complementado con un 10% de medio condicionado de cultivo nanobacteriano, y con DMEM en lugar del agua de la fórmula. El período de incubación fue de 6 semanas bajo condiciones de cultivo celular.

Se utilizaron únicamente cultivos puros de nanobacterias. La identificación positiva de las nanobacterias implicaba tasas de crecimiento normales y propiedades ópticas, tinción específica con Hoechst 33258 y con tinción inmunofluorescente indirecta (IIFS), tal como se describe a continuación. Se realizaron experimentos de control para determinar si podía ocurrir cristalización espontánea en un medio de cultivo. El medio se incubó con o sin \gamma-FBS o nanobacterias \gamma-irradiadas. No se observó ni mineralización ni multiplicación de nanobacterias ni siquiera en el seguimiento 6 meses después.

Preparación e infección de células 3T6

Se cultivaron células 3T6 (ATCC CCL 96) en cubreobjetos. Se rasparon cultivos de nanobacterias SF y se añadieron porciones de 100 \mul a los cultivos celulares, incubándose durante 24 en la incubadora. Sólo se añadió DMEM en los experimentos control. Se utilizaron microscopía electrónica de transmisión (TEM), IIFS y tinción de ADN y de von Kossa para la observación de la interacción de las células con las nanobacterias SF.

Cálculos renales

Se desmineralizaron treinta cálculos renales recogidos aleatoriamente (K-SKS, Stone Analysis Central Laboratory (Laboratorio Central de Análisis de Cálculos), Finlandia) en HCl 1N, después se centrifugaron a 14,000 x g durante 15 minutos y se utilizaron los sedimentos para IIFS y TEM. Parte de los sedimentos se suspendió en DMEM, se filtró en condiciones estériles y se cultivó en DMEM complementado con \gamma-FBS bajo condiciones de cultivo de nanobacterias.

Métodos de tinción

La tinción de ADN con Hoechst 33258 fluocromo se llevó a cabo tal como se describe en el Hoechst Stain Kit (Kit de Tinción de Hoechst), Flow Laboratories, excepto, donde se indica, aumentando la concentración de tinte desde 0,5 \mug/ml hasta 5 \mug/ml. En IIFS se utilizaron anticuerpos monoclonales (mAb) antinanobacterianos de la clase IgG1, Nb 8/0 y Nb 5/2. El epítopo del último mAb se desactivó mediante su incubación en borohidrato sódico (3 x 1 min; 0,5 mg/ml en PBS), donde se indica, para comprobar la especificidad de la unión. Las muestras se observaron bajo un microscopio Nikon Microphot-FXA con óptica de fluorescencia y de contraste diferencial de interferencia (DIC). Se realizó la detección específica de calcificaciones con tinción de von Kossa. Se utilizaron como muestras células 3T6 expuestas a nanobacterias SF durante 48 horas.

Microscopía electrónica y microanálisis por rayos X de dispersión de energía

Para la tinción negativa, se aislaron nanobacterias por centrifugación a 40000 g durante 1 hora directamente a partir de suero fetal bovino diluido 1:5 en PBS. Se colocó durante 1 minuto sobre una gota de la suspensión de nanobacterias en PBS una rejilla de cobre revestida de carbono de 400 de malla, se lavó con agua y se tiñó sobre una gota de ácido fosfotúngstico al 1% durante 90 segundos. Se realizó microscopía electrónica de barrido (SEM) y TEM. Las características topográficas de las nanobacterias se investigaron con un SEM equipado con microanálisis por rayos X de dispersión de energía (EDX). Se utilizó hidroxiapatita (Sigma, No-H-0252, St. Louis, MO) como referencia.

Espectroscopia IR de transformada de Fourier (FTIR), análisis químico, y análisis enzimático

Se detectaron grupos hidroxilo y carbonato en los minerales de apatito utilizando FTIR por K-SKS, Laboratorio Central de Análisis de Cálculos, Finlandia, siguiendo los métodos habituales. El análisis químico de las nanobacterias se llevó a cabo mediante el análisis de la actividad de la enzima ureasa y de la fosfatasa alcalina (AP) con p-nitrofenilfosfato como substrato a un pH de 9,5.

Resultados Propuestas de cultivo, morfología, y formación de apatito por nanobacterias en un medio que contiene suero

La microscopía óptica con DIC reveló nanobacterias casi imperceptibles cerca del fondo del recipiente de cultivo tras un período de cultivo de una semana aproximadamente. En dos semanas, las nanobacterias aparecían como grupos fácilmente visibles al microscopio. Después de un mes, muchos se encontraban en grupos y comenzaban a adherirse al fondo del recipiente de cultivo, y al cabo de dos meses, la mayoría se encontraban dentro de una biopelícula blanca visible a simple vista. Los criterios para el cultivo puro de nanobacterias fueron agregados con capacidad de refracción de partículas con forma cocoide normal (figura 1A), que mostraban tinción de ADN (figura 1B) únicamente con el método modificado, un resultado negativo de cultivo en agar de sangre ovina y positividad IIFS con mAb antinanobacterianos.

La tinción negativa de las nanobacterias en suero fetal bovino no en cultivo reveló partículas cocoides de 0,2 - 0,3 \mum (figura 1C). Después de un período de cultivo de un mes, el SEM reveló formas cocoides similares con un diámetro de 0,2 a 0,5 \mum (figura 1D). Las superficies rugosas de los mismos se asemejaron a las observadas en TEM (figura 1E-G). Durante períodos de cultivo más largos estaban mayoritariamente adheridos al recipiente de cultivo y se encontraban finalmente en una capa mineral. (figura 1 F y G). El análisis químico utilizando EDX mostró picos de Ca y P similares a los que se detectaron para la hidroxiapatita (figura 1 H e I). Los cultivos del aislado humano dieron resultados idénticos (no mostrados). El análisis químico de las nanobacterias recogidas después de un período de cultivo de 3 meses reveló un mayor contenido de material inorgánico. El peso en seco de los sedimentos varió desde el 23% hasta el 39% y consistieron en: N (1-1,3%); P(12,3-14,6%); Ca (23,4-23,5%);Mg (1,4-1,9%); K (0,1%); y Na(1,2-1,4%). El FTIR reveló que el carbonato-apatito se encontraba presente en muestras de cultivos de todas las edades entre 7-180 días tanto en las nanobacterias humanas como en las bovinas. El control de hidroxiapatita se identificó correctamente en la prueba. Los métodos analíticos no excluyen la posible presencia de cantidades ínfimas de otras fases minerales. Para excluir esa posibilidad se necesitan análisis cristalográficos. Las nanobacterias no produjeron ureasa ni actividad AP, y su medio de cultivo permaneció a pH 7,4.

Formación de apatito por nanobacterias en medio Loeffler

Las colonias macroscópicas de nanobacterias en el medio Loeffler modificado (figuras 2 A y B) tenían aspecto de piedra, grisáceo-marrones, se podían transferir y atravesaban la capa del medio, adhiriéndose al fondo del recipiente de cultivo a los 6 meses de cultivo. IIFS con mAb antinanobacterianos (datos no mostrados), y TEM revelaron nanobacterias revestidas de cristales de apatito con forma de agujas (figura 2C), similares a los cristales de hidroxiapatita (figura 2D).

Formación de apatito por nanobacterias en medio SF

Cuando los sedimentos lavados de nanobacterias o las bacterias SF se cultivaron en SF-DMEM se observaron microorganismos cocoides adheridos al fondo al cabo de un día. La microscopía de contraste diferencial de interferencias reveló una capa mineral de varios micrómetros de grosor alrededor de cada nanobacteria, alcanzando el tamaño de una levadura al cabo de una semana (figura 3A). Su morfología difería en gran medida de la de las nanobacterias cocoides, pero se observó una tinción de ADN similar (figura 3B). Produjeron biomasa a una tasa aproximadamente la mitad de la observada en los cultivos que contenían suero. La incorporación metabólica de metionina [^{35}S] y uridina [5-^{3}H] es evidencia de que se estaban replicando. La microscopía de contraste diferencial de interferencias reveló multiplicación de las nanobacterias dentro de las formaciones minerales (figura 3C). Estos refugios de apatito, que se demostró por SEM que tenían interiores huecos, parecían ser las "moradas" de los microorganismos (figuras 3E y F). El tamaño de la cavidad probablemente depende del número de nanobacterias que contiene (figura 3F). Parece que las aberturas de las cavidades estaban orientadas hacia el fondo del recipiente de cultivo antes del rascado. Los refugios de apatito proporcionan, de este modo, una protección completa a los microorganismos. Los cultivos pudieron transferirse mensualmente durante 5 años y siempre seguían un patrón de crecimiento similar. Tras la adición de \gamma-FBS, estas formaciones nanobacterianas volvieron a las formas encontradas en cultivos en suero (véase la figura 3D). Se demostró que los refugios eran de naturaleza de apatito por EDX. El FTIR determinó que era carbonato-apatito. El aislado humano produjo formaciones similares.

Calcificación intra y extracelular en cultivos de fibroblastos

Células 3T6 infectadas con nanobacterias SF durante 48 horas mostraron alteraciones en su morfología celular, por ejemplo, gran vacuolización con nanobacterias SF internalizadas (figura 3G). Las células control fueron negativas (no mostradas). La tinción habitual de ADN de las células infectadas por nanobacterias no reveló ninguna contaminación común (figura 3H). El TEM reveló ocasionalmente nanobacterias SF adheridas a la superficie celular, pero se encontraron mayoritariamente en varios compartimentos dentro de la célula (figuras 3 I-L), incluyendo el núcleo (no mostrado). La tinción de von Kossa reveló calcificación intra y extracelular en estas células (figuras 4 D y E). Las células fuertemente infectadas mostraban anomalías nucleares, por ejemplo, macronúcleo, como se muestra en la figura 4E, y forma nuclear anómala (figuras 3 G, H, K y L). Las células control eran von Kossa negativas y no presentaban anomalías nucleares (figura 4F).

Detección de antígenos nanobacterianos en cálculos renales

Los presentes inventores supervisaron un estudio realizado en 30 cálculos renales humanos en un intento de detectar la presencia de nanobacterias. Anticuerpos monoclonales (mAb) específicos para nanobacterias revelaron cocos en diferentes concentraciones en todos los cálculos desmineralizados utilizando IIFS. Se puede ver una imagen de una muestra relevante en la figura 4C. Los resultados se repitieron con otro mAb específico para nanobacterias, Nb 5/2, que detecta un epitopo de carbohidrato, y se pudo abolir la unión con el anticuerpo con un tratamiento de borohidrato de sodio, que destruye a los antígenos del carbohidrato. Se demostró la especificidad adicionalmente con resultados de tinción negativos para 4 mAb diferentes (clase IgG1) que detectaron antígenos irrelevantes (datos no mostrados). Se encontraron bacterias de tamaño y morfología (figura 4B) similares a las de las nanobacterias (figura 4A) por TEM en cálculos con gran positividad (figuras 4 B y C). Extractos filtrados en condiciones estériles de todos los cálculos en condiciones de cultivo de nanobacterias mostraron microorganismos que presentaban la tasa de crecimiento, la morfología, la mineralización, y las propiedades de tinción propias de las nanobacterias.

Discusión

Los presentes inventores han encontrado sistemas de cultivo de nanobacterias que permiten la producción reproducible de calcificación de apatito in vivo. Dependiendo de las condiciones de cultivo, se pueden producir partículas diminutas de tamaño nanocoloide cubiertas de apatito, o biopelícula, arena, cálculos y crecimientos de tipo tumoral (tabla 1).

TABLA 1

Capacidad de cultivo de las nanobacterias y formación de apatito
Condiciones de cultivo	Replicación	Tamaño	Apatito y su forma
Suero	+	P	+, nanocoloide
10-50% de suero en DMEM	+	P	++, nanocoloide
DMEM	+	G	+++, arena
50% de DMEM - 50% de orina	+	G	+++, arena
Orina	+/-	n.e.	n.e.
Medio Loeffler modificado	+	G	+++, de tipo tumoral
\begin{minipage}[t]{145mm} P, tamaño pequeño (200-400 nm); G, tamaño grande (1 \mu m a 1 mm, incluyendo el mineral); n.e., no evaluado por formación cristalina. Los signos positivos en la última columna se refieren a la cantidad. \end{minipage}

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La precondición principal para la mineralización fue niveles bajos de suero intacto en el medio de cultivo. El suero contiene potentes inhibidores proteináceos de la formación de cristales de apatito, osteopontina, osteocalcina y fetuina, que podrían explicar la inhibición observada e incluso la disolución de los minerales formados después del reposición de suero fetal bovino. En los casos de cultivos de nanobacterias en medio que contiene suero, los inhibidores permitían tan sólo una mineralización marginal. La mineralización aumentó en paralelo a la dilución del suero en el medio de cultivo celular. Finalmente, en medio SF, la formación de apatito fue extensa y rápida. Aunque el medio modificado de Loeffler contiene un 75% de suero, las proteínas del suero se desnaturalizaron en las etapas de esterilización. De este modo, la formación de apatito no se inhibió, lo que dio como resultado colonias de apatito sólido de un diámetro de aproximadamente 1-5 mm en 6 semanas. Las nanobacterias vivientes son necesarias para producir apatito en el modelo nanobacteriano. Nanobacterias irradiadas con radiación \gamma no se multiplicaron y, aunque podían acumular apatito, no se produjo ninguna calcificación medible ni siquiera después de incubaciones de 6 meses de
duración.

El análisis químico reveló que la composición general de la formación de biopelícula y de mineral sólido era similar a la del hueso, excepto en que se formaba carbonato-apatito, como en la mayoría de calcificaciones de tejido extraesquelético y cálculos, mientras que en el hueso la forma predominante es la hidroxiapatita. En el modelo nanobacteriano, el apatito se formó a [Ca] 1,8 mM y [P_{j}] 0,9 mM o menos, sin reposición del medio.

Se encontraron nanobacterias en los 30 cálculos renales humanos que estos inventores han seleccionado. Anteriormente, sólo los cálculos de estruvita (4-15% de todos los cálculos renales) compuestos de fosfato magnésico amónico y pequeñas cantidades de apatito se consideraron de origen bacteriano. Se forman in vitro y probablemente in vivo por Proteus, Staphylococci y E. coli productoras de ureasa, elevando el pH local a niveles más litogénicos. La fosfatasa alcalina (AP) posiblemente aumente la litogenicidad. Las nanobacterias no producen ureasa ni AP, sino carbonato-apatito nucleado directamente sobre sus superficies a un pH de 7,4, lo que sugiere la presencia de moléculas nucleantes. Dado que las nanobacterias son se pueden cultivar bajo condiciones fisiológicas en medios con una composición similar a la de los filtrados glomerulares, las nanobacterias ofrecen un modelo único para la formación de cálculos renales.

Ejemplo 2 Erradicación de las nanobacterias

La selección de una prueba apropiada para la desinfección de nanobacterias no es sencilla, y comparaciones exactas de los resultados obtenidos de diferentes pruebas son problemáticas, debido a la cantidad de factores que afectan a la desinfección. Estos factores incluyen la duración de la exposición, la presencia de carga orgánica, el tipo, edad, concentración y diluyente del desinfectante, y el número, edad, forma de crecimiento de los microorganismos presentes, y la temperatura. Existen actualmente varios tipos de pruebas de desinfección, pero estos son apropiados principalmente para bacterias de crecimiento rápido. Las pruebas de desinfección de Mycobacteria de crecimiento lento, algunas de las cuales son extremadamente resistentes, han sufrido durante mucho tiempo la falta de una normalización apropiada y fidedigna. Normalmente, se ha utilizado la centrifugación o diluciones muy altas para la eliminación de los efectos de concentraciones residuales de desinfectantes. Seguidamente se siembran en placa en medio de agar para el recuento de colonias para evaluar la reducción de viabilidad. Tales pruebas no son apropiadas para las nanobacterias. La recuperación de nanobacterias por centrifugación da como resultado generalmente pérdidas impredecibles. Debido a su tasa de crecimiento lenta, diluciones altas dan como resultado tiempos de incubación muy largos, y una capacidad de cultivo extremadamente pobre en medios sólidos hace imposible la evaluación de un recuento de
nanobacterias.

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La mineralización es la propiedad más característica de las nanobacterias, y probablemente el principal mecanismo de patología producido por el microorganismo. El mineral formado bajo condiciones normales de cultivo es el carbonato- o hidroxi-apatito, tal como se observa por diferentes métodos, incluyendo microanálisis por rayos X de dispersión de energía y espectroscopia IR de transformada de Fourier. Una de las funciones primarias del mineral podría ser para protegerlo contra condiciones medioambientales adversas. El apatito puede prevenir la penetración de compuestos perjudiciales al interior del microorganismo. Se han observado varios grados de mineralización, dependiendo del tiempo de cultivo y de las condiciones de cultivo. La mineralización por nanobacterias cultivadas sin suero (nanobacterias SF) es mucho mas extensa que la que se observa en las nanobacterias cultivadas con medios que contienen suero. El tiempo de duplicación de las nanobacterias de suero y las nanobacterias SF, es de aproximadamente tres días y seis días, respectivamente, medido por incorporación de aminoácidos.

Se han probado ahora desinfectantes químicos a las concentraciones normalmente utilizadas contra nanobacterias en cultivo. Los productos químicos seleccionados representan una amplia variedad de mecanismos de los que se sabe que afectan a sistemas biológicos. La supervivencia de las nanobacterias a altas temperaturas, en el secado y bajo radiación UV-C también se probó. Hay varios mecanismos para la resistencia a antibióticos en bacterias que no se han tratado aquí. Los presentes inventores evaluaron el efecto de cuatro antibióticos contra las nanobacterias. Los antibióticos son los usados comúnmente en cultivos celulares.

Diseño experimental Cultivo de nanobacterias en medio que contiene suero

Se cultivaron las nanobacterias con suero fetal bovino al 10% en medio DMEM (nanobacterias en suero) durante un mes a 37ºC y en una atmósfera de 5% de CO_{2} - 95% de aire. Los cultivos se recogieron por centrifugación. Para los tratamientos en autoclave, UV, microondas, calentamiento y secado, las nanobacterias recogidas se suspendieron en solución salina tamponada con fosfato (pH 7,4; PBS). Después de los tratamientos, se realizó el subcultivo de las nanobacterias en suero fetal bovino irradiado con radiación gamma al 10% en medio DMEM. El crecimiento de las nanobacterias en suero se siguió por microscopía óptica y medición de la absorbancia con un espectrómetro a
650 nm.

Cultivo de nanobacterias en medio sin suero

Las nanobacterias SF se cultivaron en medio DMEM durante una semana a 37ºC en una atmósfera de 5% de CO_{2} - 95% de aire, y todos los cultivos se adhirieron firmemente a los recipientes de cultivo. Se expusieron los cultivos a los desinfectantes después de su extracción del medio de cultivo. Para los tratamientos de autoclave, UV, microondas y secado, se extrajo el medio y se sustituyó por una cantidad igual de PBS en su lugar. Para los tratamientos térmicos, las nanobacterias SF se recogieron raspando los recipientes de cultivo seguido de centrifugación del medio. El sedimento así obtenido se suspendió en PBS y se utilizó en la prueba. Después de los tratamientos se subcultivaron las nanobacterias SF en medio DMEM y se siguió el crecimiento por microscopía óptica para ver la adherencia y la mineralización normal.

Desinfección química para nanobacterias SF

Las concentraciones de productos químicos utilizadas fueron las comúnmente utilizadas para la desinfección o las indicadas por el fabricante. Los productos químicos incluyeron etanol al 70%, glutaraldehído al 2%, formaldehído al 4%, hipoclorito al 0,5%, peróxido de hidrógeno al 3%, ácido clorhídrico (HCl) 1M, hidróxido de sodio (NaOH) 1M, dodecilsulfato de sodio (SDS) al 1%, Tween 80 al 1%, Triton X-100 al 1%, clorhidrato de guanidinio 3M, urea 3M, Virkon® 1% (Antek International Ltd., Suffolk, Inglaterra; el producto al 100% contiene persulfato de potasio al 50%, ácido sulfaminoico al 5%), Erifenol® la 1,5% (Orion OY, Finlandia; el producto al 100% contiene NaOH <5%, o-benzoil-p-clorofenol <5%, p-cloro-m-cresol al 5-15%), Klorilli® al 1% (Orion OY, Finlandia; el producto al 100% contiene metasilicato de sodio, N-cloro-p-toluensulfonamida-3-hidrato de sodio y 20.000 ppm de cloro activo), y Buraton® al 3% (Schülke & Mayr, Alemania; el producto al 100% contiene formaldehído al 4,5%, glioxal al 6,8%, ácido glioxílico al 1,5%, cloruro de dimetil-laurilbencilamonio al 6%). Las diluciones que tenían que utilizarse se prepararon recientes en el día de la exposición en agua destilada estéril. Como control positivo se utilizó solo el diluyente. El control negativo contenía sólo medio de cultivo.

Las nanobacterias SF se expusieron a los productos químicos durante un período de 10 a 30 minutos a temperatura ambiente después de extraerse del medio de cultivo. Tras la exposición se extrajo la disolución de desinfectante y se añadió medio reciente (con una etapa de neutralización en el caso de HCl y NaOH). Si se produjo algún desprendimiento significativo, se recuperaron las nanobacterias por centrifugación y se subcultivaron. Los cultivos libres de suero expuestos se transfirieron 1:10 tras 48 horas y se siguió el crecimiento por microscopía óptica durante 3
semanas.

Tratamientos de autoclave, UV y secado

Las nanobacterias en suero y las SF se sometieron al autoclave en un volumen pequeño de solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4 a 121ºC durante 20 minutos. Se dio el tratamiento de UV a ambos tipos de nanobacterias en PBS en una campana laminar bajo una lámpara UV-C Philips de 15 W durante períodos de 1 a 3 horas y durante la noche en placas Petri con las tapas quitadas. La distancia de los cultivos a la lámpara era de aproximadamente 60 cm. Los tratamientos de secado se llevaron a cabo mediante secado de las nanobacterias durante la noche a temperatura ambiente o mediante su calentamiento durante una hora a 100ºC. Las nanobacterias SF se secaron únicamente durante la noche a temperatura ambiente. El tratamiento de microondas se realizó llevando las muestras a ebullición (100ºC) diez veces en un horno microondas de 1400 W.

Calentamiento de las nanobacterias

El efecto del calor en la supervivencia de las nanobacterias se determinó exponiendo a las nanobacterias en forma de sedimento a PBS durante 15 y 30 minutos, a temperaturas que variaban entre 60ºC y 100ºC. Las nanobacterias SF expuestas se cultivaron en medio DMEM y el crecimiento se siguió por microscopía como anteriormente. El crecimiento de los cultivos de nanobacterias en suero se siguió por microscopía óptica y la medición de absorbancia con un espectrómetro a 650 nm.

Pruebas de sensibilidad de antibióticos

La sensibilidad de los antibióticos de nanobacterias en suero se probó con una mezcla de penicilina (\beta-lactámica) y estreptomicina (aminoglucósido) (PS) a concentraciones de 1x y 10x (penicilina 100 UI, estreptomicina 100 \mug/ml = 1x), kanamicina (aminoglucósido), a concentraciones de 1x y 10x (100 \mug/ml = 1x) y gentamicina (aminoglucósido) a una concentración de 1x (100\mug/ml). Las concentraciones 1x son las recomendables para cultivo celular. Tras un cultivo de 10 días en suero que contenía DMEM con el antibiótico, se comparó el crecimiento con el de los cultivos de nanobacterias sin presencia de antibióticos.

Resultados Desinfección química

Las nanobacterias SF mostraron una amplia resistencia a los desinfectantes utilizados. Sólo el Virkon® fue eficaz en matar las nanobacterias SF tras 30 minutos. El tratamiento con ácido clorhídrico disolvió la capa de apatito de las nanobacterias, pero se observó remineralización tras la adición de medio de cultivo. Los tratamientos con clorhidrato de guanidinio y Buraton dieron como resultado el desprendimiento de las nanobacterias SF, pero la eficacia de desinfección del Buraton era ligeramente menor que la del clorhidrato de guanidinio. Los resultados de los tratamientos químicos se presentan en la tabla 2. La supervivencia se determinó tras el subcultivo por comparación con el tratamiento únicamente con diluyente.

Tratamientos en autoclave, UV y secado

El secado a una temperatura de 100ºC mató las nanobacterias en suero, pero el secado a temperatura ambiente no lo hizo. El tratamiento en autoclave no fue perjudicial para las nanobacterias SF, pero se observó una marcada reducción en la supervivencia de las nanobacterias en suero. Las nanobacterias SF toleraron la luz UV sin efectos en su crecimiento, pero las nanobacterias en suero se vieron significativamente inactivadas. Las muestras de nanobacterias se secaron durante el tratamiento UV nocturno, y así presentaron un estrés adicional para los microorganismos. El secado obviamente tuvo poco o ningún efecto sobre los resultados, dado que la supervivencia de las nanobacterias con todos los tratamientos de UV fue similar. Debido a la falta de un radiómetro de UV, no se pudo calcular ninguna dosis de UV, y se deberían llevar a cabo ensayos más precisos con nanobacterias en medios de cultivo. El tratamiento por microondas era más como un tratamiento de choque térmico que una etapa de esterilización, siendo las ebulliciones cortas completamente ineficaces. Los resultados de un seguimiento de la supervivencia de las nanobacterias tras someterlas a tratamientos en autoclave, UV, microondas y secado se presentan en la tabla 3. Las nanobacterias SF fueron mucho más resistentes que las nanobacterias cultivadas con suero. Las nanobacterias SF sobrevivieron a todas las condiciones de ensayo sin una reducción notable de viabilidad. Las nanobacterias en suero se murieron por secado durante una hora a 100ºC, y la supervivencia se redujo notablemente en todas las demás condiciones de ensayo.

TABLA 2

Resistencia de las nanobacterias SF a los desinfectantes químicos.
	Tiempo de exposición
Producto químico	10 minutos	30 minutos
etanol al 70%	+++	+++
glutaraldehído al 2%	+++	+++
formaldehído al 4%	+++	+++
hipoclorito al 0,5%	+++	+++
H_{2}O_{2} al 3%	+++	+++

TABLA 2 (continuación)

	Tiempo de exposición
Producto químico	10 minutos	30 minutos
HCl 1 M	s.d.	++*
NaOH 1 M	+++	+++
SDS al 1%	+++	+++
Tween 80 al 1%	+++	+++
Tritón X-100 al 1%	+++	+++
HCl de guanidinio 3	s.d.	0
M	+++	+++
urea 3 M	s.d.	-*
Virkon® al 1%	+++	+++
Erifenol® al 1,5%	+++	+++
Klorilli® al 1%	s.d.	++*
Buraton® al 3%
\begin{minipage}[t]{140mm} +++: Sin efectos; ++: Supervivencia reducida; +: Supervivencia marcadamente reducida; -: Sin supervivencia; * = desprendimiento total o parcial resultado de la exposición; s.d. = sin determinar \end{minipage}

TABLA 3

Supervivencia de las nanobacterias tras exposición física.
Tratamiento	Supervivencia de nanobacterias	Supervivencia de nanobacterias
	en suero	libres de suero
Autoclave	+	+++
Radiación UV (1h)	+	+++
Radiación UV (3h)	+	+++
Radiación UV (toda la noche)	+	+++
Microondas	+++	+++
Secado (TA)	+	+++
Secado (100ºC)	-	s.d.
\begin{minipage}[t]{145mm} +++: Sin efectos; ++: Supervivencia reducida; +: Supervivencia marcadamente reducida; -: Sin supervivencia; * = desprendimiento total o parcial resultado de la exposición; s.d. = sin determinar \end{minipage}

Resistencia al calor de las nanobacterias

Las nanobacterias eran muy resistentes al calor. Una ebullición durante 15 minutos no fue suficiente para matar a las nanobacterias en suero, pero treinta minutos las inactivaron. Las curvas de crecimiento de las nanobacterias después del tratamiento térmico se muestran en la figura 5. De manera importante, el crecimiento de las nanobacterias en suero fue muy similar, no habiéndose observado ningún período de latencia, ni siquiera tras la ebullición de quince minutos. Observaciones al microscopio de los cultivos de nanobacterias SF tras el tratamiento térmico revelaron que habían sobrevivido todas las condiciones de prueba, incluida la ebullición a 100ºC durante 30 minutos. Inicialmente se observó una reducción en la cantidad de nanobacterias SF viables con las mayores temperaturas, pero tras dos semanas no había diferencias entre los resultados del cultivo de prueba por comparación al control no calentado.

Resistencia a los antibióticos de las nanobacterias

Se observó una gran resistencia a los antibióticos probados. Se necesitaron concentraciones diez veces mayores que las que se utilizan normalmente en cultivo celular para impedir el crecimiento de las nanobacterias. La figura 6 muestra el efecto de los antibióticos sobre el crecimiento de las nanobacterias cultivadas con medio que contiene suero. De manera interesante, se produjo un efecto profundo sobre la morfología de las nanobacterias como se vio en SEM (figuras 7A y 7B) a concentraciones de antibiótico que no producían ningún efecto sobre el crecimiento. Esto sugiere que las nanobacterias poseen medios adaptativos para protegerse de ataques perjudiciales, por ejemplo, mediante la secreción de capas viscosas.

Conclusiones

Las nanobacterias pueden tolerar condiciones extremas extremadamente bien. Las nanobacterias SF fueron mucho más resistentes que las nanobacterias cultivadas en medio que contenía suero. Los extremos de pH, agentes oxidantes, cloro libre, y productos químicos que afectan a las proteínas así como la radiación, el calor y el secado tuvieron muy poco efecto sobre las nanobacterias SF. Esto indica que la capa mineral ofrece una protección adicional al microorganismo. Una supervivencia excepcional de las nanobacterias se ha observo también en asociación con los cálculos renales humanos. Se recuperaron nanobacterias viables de casi todos los cálculos renales mediante la desmineralización de los cálculos con ácido clorhídrico (véase a continuación).

Una manera eficaz de erradicar las nanobacterias con productos químicos desinfectantes debería incluir una etapa de desmineralización. El apatito puede disolverse a bajo pH o por medio de quelantes de calcio tales como el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). Una segunda etapa debería incluirse entonces para matar al microorganismo por otro mecanismo. El Virkon, constituido por compuestos de peroxígeno, tensioactivo, ácidos orgánicos y un sistema de tampón inorgánico, demostró ser eficaz contra las nanobacterias lo más probablemente debido a su acidez (una disolución en agua al 1% tiene un pH de 2,6) combinado con otros mecanismos de desinfección.

Dosis de tres megarads de radiación gamma son necesarias para garantizar de la destrucción de las nanobacterias. La radiación gamma es probablemente el mejor método y el más fiable para matar a las nanobacterias. El secado a temperaturas elevadas o por ebullición durante períodos prolongados, también puede usarse en la erradicación de nanobacterias. La ebullición durante 30 minutos es eficaz contra casi todos los microorganismos vivientes, excepto algunas endosporas, especialmente las esporas de Bacillus stearothermophilus y las archaeas hipertermofílicas, que tienen temperaturas óptimas de crecimiento a 90ºC o más. Este tratamiento tampoco es suficiente para matar a las nanobacterias SF. De manera importante, el procedimiento normal de autoclave (121ºC durante 20 minutos) tampoco fue suficiente para erradicar a las nanobacterias.

La resistencia de las nanobacterias a los antibióticos ensayados fue muy alta. Los antibióticos de cultivos celulares utilizados en este estudio son eficaces tan sólo en concentraciones muy altas. Un posible mecanismo de protección es la producción de una capa viscosa protectora, como se observó por SEM. La modificación de la pared celular es una estrategia común para muchas bacterias para adquirir resistencia a antibióticos. Cuando una nanobacteria se enfrenta a condiciones adversas comienza a secretar polímeros y a formar minerales sobre ellos. Los antibióticos probados eran principalmente aminoglucósidos.

La resistencia observada de las nanobacterias en suero muestra que son al menos tan resistentes como las esporas de Mycobacteria y Bacillus subtilis, que son los microorganismos modelo para la resistencia a la desinfección. La resistencia de las nanobacterias SF es claramente superior a éstas.

El mineral de apatito alrededor del microorganismo sirve como un escudo protector primario contra varios productos químicos y contra la irradiación. La supervivencia de las nanobacterias, claramente, no se debe únicamente al mineral, porque el tratamiento con ácido clorhídrico 1M no pudo matar a las nanobacterias, y se pudo observar remineralización en el cultivo más tarde. Una doble defensa con la capa de apatito y la membrana impermeable combinada con un metabolismo muy lento es una explicación probable para la resistencia observada de las nanobacterias. La mayor resistencia de las nanobacterias SF se debe probablemente a la mineralización extensa, el metabolismo más lento y la adherencia a las superficies. Los mecanismos de resistencia nanobacterianos parecen ser multiplicativos: por tanto, las nanobacterias que tienen una cubierta de apatito, una pared celular impermeable, un metabolismo lento y posiblemente otros mecanismos aún desconocidos, se vuelven extremadamente resistentes a la mayoría de los métodos desinfectantes.

Ejemplo 3 Cálculos de la pulpa dental producidos por nanobacterias

El propósito de los experimentos realizado en este ejemplo era investigar si las nanobacterias participan en la formación de cálculos de la pulpa dental. El diseño del estudio era para cultivar nanobacterias en un diente sano, sin cálculo de la pulpa dental, y comparar los resultados con los obtenidos de un diente con cálculo de la pulpa dental. Se observaron formaciones minerales bajo SEM. Adicionalmente, se realizó una investigación epidemiológica sobre la posible correlación entre las enfermedades de cálculos de la pulpa dental y cálculos renales, y de otras calcificaciones corporales en 18 pacientes utilizando un cuestionario.

Correlación entre los cálculos de la pulpa dental y otras formaciones de cálculos en el organismo

Se seleccionaron aleatoriamente 18 pacientes de una consulta dental privada en Turquía basándose en sus problemas periodontales producidos por formación grave de cálculos de la pulpa. Se almacenaron los cálculos recogidos en PBS que contenía 0,05% de NaN_{3} a +4ºC. Las muestras se desmineralizaron en HCl 1N durante 10 minutos a temperatura ambiente, se neutralizaron con NaOH y tampón de fosfato potásico, e inmunotiñeron utilizando anticuerpos monoclonales anti-nanobacterias. El tratamiento de las muestras con HCl 1N no afectó a los epítopos reconocidos por los anticuerpos monoclonales utilizados en estos experimentos. La inmunotinción reveló cocos pequeños y positivos en diferentes concentraciones en todas las muestras. La especificidad a la tinción se demostró adicionalmente con tres anticuerpos monoclonales diferentes que detectaron antígenos irrelevantes.

Los resultados obtenidos del cuestionario de los pacientes mostraron una alta incidencia de cálculos renales y biliares tanto en los pacientes como en sus progenitores (tabla 4).

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TABLA 4

Presencia de calcificación y formación de cálculos en pacientes con cálculos de la pulpa dental, y en sus progenitores.
	Pacientes (9H + 9M)	Madres	Padres
Cálculos renales	5/18 (28%)	3/18 (17%)	6/18 (33%)
Arena urinaria	6/18 (33%)	1/18 (6%)	0/18 (0%)
Cálculos biliares	2/18 (11%)	7/18 (39%)	3/18 (17%)
Calcificaciones tisulares	1/18 (6%)	5/18 (28%)	1/18 (6%)

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Hay un aumento de la formación de cálculos en los dientes entre los animales de laboratorio en cuanto se les daba de beber agua potable común, lo que sugiere que la flora se transfiere de un animal a otro. Adicionalmente, la eritromicina inhibe fuertemente la formación de cálculos, mientras que el cloranfenicol y la penicilina no lo inhiben. Esto sugiere que los microorganismos involucrados en la acumulación de cálculos puedan ser muy específicos. Estas conclusiones proporcionan una posible explicación a los resultados mostrados en la tabla 4, indicando una gran incidencia en la formación de cálculos y en la calcificación en los miembros de la familia.

Las nanobacterias producen la formación de cálculos dentales in vitro

En observaciones SEM del diente con cálculos de la pulpa dental (figura 8A) a gran aumento, se observaron fibras mineralizadas y numerosos cuerpos globulares pequeños cerca de éstas (figura 8B). No se observaron calcoesférulas en el diente control (figuras 8C y D).

Cuando los inventores expusieron un diente sano a un cultivo de nanobacterias SF durante un mes, la SEM reveló una formación mineral voluminosa, que se asemejaba a cálculos de la pulpa dental, en la superficie del diente (figuras 9A, B, D, y E).

La estructura de tipo cavidad indicada por las flechas grandes en la figura 9 es una estructura muy habitual para las nanobacterias SF (véase anteriormente). Se sugiere que las diferentes características estructurales corresponden a las diversas etapas de mineralización de los cálculos de la pulpa.

Hay muchas ideas sobre el motivo de la formación de cálculos dentales, por ejemplo, la dieta y la edad. Experimentos en animales han demostrado que la adición de Ca y P a la dieta aumenta la tasa de formación de cálculos dentales. Los presentes inventores han demostrado que el Ca es un elemento muy necesario para la producción de apatito por las nanobacterias. La adición de un pedazo de dolomita esterilizado a un cultivo de nanobacterias SF aumentó su tasa de multiplicación. El SEM reveló nanobacterias SF adheridas multiplicándose en la superficie de la dolomita (figura 10).

Composición química de los cálculos de la pulpa dental

Las características de los componentes cristalinos de los cálculos dentales humanos se han atribuido a la proporción molar de Ca/P: i) formas calcificadas de microorganismos, incluyendo cocos y bacilos con una proporción de Ca/P cercana a 1,7, hidroxiapatita carbonatada; ii) calcificaciones calcoforíticas y calcificaciones densas con proporciones de Ca/P cercanas a 1,7, hidroxiapatita carbonatada; iii) placas o agregados de plaquetas y agregaciones con forma de abanico con proporciones de Ca/P cercanas a 1,33, fosfato octacálcico; iv) formas cuboidales de diferentes tamaños con proporciones de Ca/P cercanas a 1,4, "Whitlockite". Las concentraciones de algunos otros elementos en los cálculos de la pulpa dental es mucho más baja que las de Ca y P (F 0,88%; Na 0,75%; Mg 0,51%). Los otros constituyentes analizados (K, Cl, Mn, Zn, Fe) están presentes en concentraciones traza.

De acuerdo con el objetivo de este estudio, para clarificar la relación entre la morfología, la composición química del material en los cálculos dentales, y las nanobacterias, los resultados del EDX se compararon como se puede ver en la figura 11. Anteriormente, los inventores identificaron por EDX y análisis químicos que todas las fases de crecimiento de las nanobacterias producían apatito biogénico en su cubierta celular. La espectroscopia IR de transformada de Fourier reveló el mineral como carbonato-apatito.

Conclusión

Estos datos indican que los cálculos de la pulpa dental están asociadas con las nanobacterias formadoras de apatito.

Ejemplo 4 Formación de cálculos y calcificación por nanobacterias en el cuerpo humano

En estos experimentos, los inventores proporcionan evidencia adicional de que las nanobacterias pueden actuar como centros (nidos) de cristalización para la formación de estructuras de apatito biogénico en el cuerpo de los mamíferos, y en fuentes medioambientales.

Calcificación producida por nanobacterias en un modelo de cultivo celular

Las nanobacterias son citotóxicas in vitro e in vivo. Células 3T6 fibroblastoides infectadas durante 48 horas con nanobacterias (cultivadas en condiciones libres de suero, nanobacterias SF), mostraron una morfología celular alterada debido a las nanobacterias SF internalizadas (figuras 12A y B). La tinción de von Kossa mostró calcificación intra y extracelular en las células infectadas (figura 12C). Las células fuertemente infectadas mostraron anomalías nucleares, por ejemplo, macronúcleos. No hubo calcificación ni anomalías nucleares en las células control teñidas con el método de von Kossa (figura 12D).

Las nanobacterias y los cálculos renales

Los componentes cristalinos de los cálculos del tracto urinario son de cinco tipos: oxalato cálcico, fosfato cálcico, relacionados con bacterias, purinas o cistinas. La mayoría de los cálculos del tracto urinario son mezclas de dos o más componentes, siendo la mezcla principal oxalato con apatito. Se investigó la viabilidad y la ubicación de las bacterias dentro de los cálculos de la infección (cálculos de estruvita [MgNH_{4}PO\cdot6H2O] y/o de carbonato-apatito [Ca_{10}(PO_{4})_{6}
CO_{3}]). Se encontró que existía un gran número de impresiones y cuerpos bacterianos en los intersticios rodeados de cristales de apatito y estruvita desde el núcleo hasta las capas periféricas. La presencia de colonias bacterianas incluso en la porción nuclear de los cálculos sugiere que las bacterias participan en la formación inicial de los cálculos, así como en el crecimiento de los cálculos de la infección. Se encontraron, en el trabajo de los inventores, bacterias de tamaño y morfología similares (figuras 13A y C) a las nanobacterias (figuras 13B y D), en cálculos renales humanos por TEM.

Los presentes inventores seleccionaron 60 cálculos renales humanos en busca de nanobacterias, utilizando métodos inmunofluorescentes de tinción y de cultivo. Las nanobacterias muestran una gruesa capa envoltorio de apatito en su superficie por TEM (figura 14A). La desmineralización bajo condiciones adversas (por ejemplo, incubación con HCl 1N) no afectó a sus epítopos, reconocidos por los anticuerpos monoclonales utilizados en estos experimentos. Anticuerpos monoclonales específicos a las nanobacterias revelaron cocos positivos y pequeños en diferentes concentraciones en todas las muestras de cálculos desmineralizados (figuras 14C-E) y nanobacterias (figura 14B). Se observaron diferentes patrones de distribución de nanobacterias en los cálculos, por ejemplo, ubicación central y/o periférica (figura 14E) en las unidades de cálculos pequeños, o distribución aleatoria (figura 14D). La especificidad de la tinción se demostró con resultados de tinción negativos con la detección de antígenos irrelevantes por cuatro anticuerpos monoclonales diferentes.

Las muestras de cálculos renales desmineralizados y seleccionados se filtraron en condiciones estériles a través de un filtro 0,2 \mum, y se cultivaron bajo condiciones de cultivo de nanobacterias durante tres semanas, tal como se describió anteriormente. Se utilizó suero irradiado con radiación gamma a una concentración del 10% como control negativo, y no se observó ningún crecimiento.

De modo interesante, los presentes inventores observaron crecimiento nanobacteriano en el 90% de las muestras de cálculos a pesar de la fuerte etapa de desmineralización. Además, los cálculos se habían guardado a temperatura ambiente durante más de un mes antes de su selección. Las nanobacterias desmineralizadas control, los controles positivos, se multiplicaron bien (figuras 15A y B). La tinción de ácidos nucleicos utilizando la tinción de Hoechst (#33258) demostró que no había ningún otro tipo de crecimiento bacteriano presente en los cultivos. Para una mayor prueba de ello, se infectaron células 3T6 con las nanobacterias cultivadas de muestras de cálculos, y se tiñeron con anticuerpos monoclonales anti-nanobacterias. Se observaron cinco tipos diferentes de interacciones de las células con las nanobacterias (datos no mostrados).

Conclusiones

Las nanobacterias son patógenos de aparición novedosa y pueden estar relacionadas con pequeñas bacterias formadoras de minerales que se encuentran en rocas sedimentarias, enlazando la medicina con la geología. Éstas producen apatito biogénico in vitro y también parecen hacerlo in vivo. Dado que el apatito está considerado como el principal nido que inicia la formación de la mayoría de los cálculos renales, las nanobacterias parecen ser excelentes candidatas para provocar este proceso. Se demostró que las nanobacterias inyectadas en la circulación sanguínea de animales de laboratorio penetraban a través de las células del riñón y pasaban a la orina. En la orina, la formación de apatito por las nanobacterias aumenta aún más. De ahí otros minerales pueden entonces unirse a este nido.

Ejemplo 5 Tratamiento de un paciente humano infectado por nanobacterias

Los presentes inventores han tratado ahora a una mujer finlandesa de 35 años de edad que padecía un síndrome de fatiga crónica por infección de nanobacterias. La paciente dio resultados positivos a las nanobacterias en tres muestras de orina y suero recogidas antes del comienzo del tratamiento con tetraciclina. Recibió 500 mg de tetraciclina HCl 4 veces al día durante un mes, seguido de 500 mg dos veces al día durante 5 meses. La paciente dio resultados negativos a las nanobacterias después de un mes de tratamiento. Su condición mejoró simultáneamente y permaneció negativa en muestras mensuales.

Ejemplo 6 Susceptibilidad de las nanobacterias a los antibióticos

Se llevaron a cabo ensayos de sensibilidad de los antibióticos mediante la medición de la concentración mínima inhibitoria (MIC), una práctica común en microbiología clínica.

Métodos

Las pruebas se realizaron en placas de 96 pocillos. Se utilizó DMEM (medio comercial de cultivo celular) que contenía 10% de suero fetal bovino (FBS) irradiado con radiación gamma (dosis de aproximadamente 3 Mrads; este tratamiento inactiva las nanobacterias en el suero de manera que el medio básico sea estéril) como medio de cultivo básico. Estos componentes están disponibles comercialmente, por ejemplo, de Gibco. Las disoluciones madre de antibióticos fueron filtradas en condiciones estériles a través de filtros de 0,2 micrómetros. Las disoluciones madre fueron entonces diluidas en serie (en el medio de cultivo basal) para proporcionar una concentración final de partida de 0,5 mg/ml y diluciones 1:2 de ésta, a menos que se especifique lo contrario. Se realizaron para cada antibiótico tres pruebas paralelas utilizando todas las diluciones de los antibióticos y, además, pruebas de controles positivos y negativos. Los controles positivos tenían nanobacterias sin la adición de ningún antibiótico, mientras que los controles negativos tenían tan sólo el medio básico. Se cultivaron las nanobacterias de FBS, suero humano de un paciente que padecía la enfermedad poliquística del riñón (PKD), y de cálculos renales humanos tal como se describe en un trabajo anterior (Kajander y Ciftcioglu, PNAS 95:8274-8279, 1998). Se añadieron 100 \mul de las diluciones del inóculo de nanobacterias a todos los pocillos excepto los de los controles negativos. Las placas se incubaron en condiciones de cultivo celular de mamíferos (37º Celsius, 5% de dióxido de carbono, 95% de humedad). Se registraron los valores de absorbancia a 650 nm mediante la utilización de un lector ELISA al comienzo, y a los 4, 8, 12, 14 días. Los valores finales de MIC (inhibición de 50% a 90%) se calcularon en el punto de tiempo del día 12. Los cálculos se basaron en las curvas de absorbancia donde se trazó la absorbancia contra la concentración del antibiótico.

Resultados

Los resultados de estos experimentos están resumidos en la tabla 5.

TABLA 5

Resumen de los valores de MIC 50 y MIC 90 para antibióticos seleccionados (mg/l):
Compuestos	MIC 50	MIC 90
Trimetoprim-sulfametoxazol	15	>500
Trimetoprim	0,7	5
Tetraciclina	0,3	1,3
Doxiciclina	50	80
Nitrofurantoína	0,6	1,5
Gentamicina	60	250
Neomicina	16	30
Kanamicina	50	200

TABLA 5 (continuación)

Compuestos	MIC 50	MIC 90
Vancomicina	130	250
Ampicilina	500
Cefuroxima	>500
Pirazinamida	>500
Etambutol	>500
Metronidazol	>500
Ciprofloxacina	>500
Rifampicina	>500
Claritromicina	>500
Clindamicina	>500
Espectinomicina	>500
Estreptomicina	>500
Cefalotina	>500
Eritromicina	>500
Lincomicina	>500
Cloranfenicol	>500
Penicilina	>500
Polimixina B	>500

Como puede observarse a partir de los resultados presentados en la tabla 5, la combinación de trimetoprim-sulfametoxazol no fue tan eficaz como el trimetoprim por sí solo. (figura 24). Esto es algo sorprendente en vista del hecho de que esta combinación es muy utilizada en el tratamiento de infecciones del tracto urinario. El trimetoprim es altamente eficaz, pero sólo fue bacteriostático en el ensayo in vitro (figura 16). El trimetoprim es un fármaco antinanobacteriano muy potencial para terapia en seres humanos y animales.

La tetraciclina es altamente eficaz y fue bactericida en el ensayo in vitro (figuras 17, 25). Los pacientes de cálculos renales tratados con 4 x 500 mg/día tenían inicialmente resultados positivos de nanobacterias de cultivos de orina, pero comenzaron a tener cultivos de orina negativos durante el tratamiento. Esto indica que el tratamiento con tetraciclina puede ser eficaz en tratamientos para la erradicación de nanobacterias en seres humanos y en animales. Como se dijo anteriormente, la tetraciclina se une y se concentra en la superficie mineral de las nanobacterias. Esto puede explicar por qué la tetraciclina tiene un efecto bactericida sobre las nanobacterias. Este efecto bactericida es único para las nanobacterias: otras bacterias muestran tan sólo efectos bacteriostáticos. Por tanto, las tetraciclinas son fármacos potenciales para la eliminación de las nanobacterias de los cultivos celulares y de los productos biológicos. Como el fármaco está unido a las nanobacterias, incluso los períodos de exposición cortos tienen efectos antinanobacterianos considerables.

La nitrofurantoína es altamente eficaz pero se mostró bacteriostática in vitro (figura 18). Este compuesto se utiliza para infecciones del tracto urinario solamente por su rápida eliminación en la orina. Además de terapias antinanobacterianas en seres humanos y animales, la nitrofurantoína puede ser útil para eliminar o reducir el número de nanobacterias en cultivos celulares y en productos y fluidos biológicos.

La doxiciclina, que es también un compuesto de tetraciclina, fue eficaz para inhibir el crecimiento de las nanobacterias (figura 19). Este compuesto no era estable bajo las condiciones de prueba. Los valores de MIC calculados de los resultados del día 8 indicaron una efectividad de alrededor de 1 mg por litro. Así, la doxiciclina podría ser también un buen candidato para las terapias con seres humanos y animales. Debería constatarse que las tetraciclinas han sido utilizadas en el tratamiento de calcificaciones patológicas y enfermedades autoinmunológicas frecuentemente con resultados sorprendentemente buenos.

Los antibióticos aminoglucósidos gentamicina, neomicina, kanamicina (figuras 20-22), y estreptomicina muestran todos ellos efectos bacteriostáticos antinanobacterianos para altas concentraciones de los antibióticos. Tales concentraciones están presentes en formas farmacéuticas locales, como cremas para la piel, pomadas, tiritas o disoluciones para lavado y en gotas para los oídos o para los ojos. Su efecto antinanobacteriano ofrece una nueva explicación para la conocida eficacia de gentamicina y estreptomicina en el tratamiento de problemas del oído interno que implican calcificación patológica, tales como la enfermedad de Ménière.

La vancomicina es bacteriostáticamente eficaz contra las nanobacterias en concentraciones relativamente altas (figura 23). Tales concentraciones pueden estar presentes en terapias locales con este fármaco. La vancomicina no se absorbe desde el tracto gastrointestinal u otras superficies mucosas, pero puede ser utilizado para tratar infestaciones bacterianas de las mucosas. La vancomicina puede así ser eficaz en la erradicación de nanobacterias gastrointestinales o en otras aplicaciones locales.

La ampicilina es un antibiótico de amplio espectro del grupo de la penicilina. La ampicilina muestra un efecto bacteriostático débil sobre las nanobacterias (figura 26). Dado que la ampicilina y los fármacos relacionados se administran en dosis muy altas y se concentran en la orina a niveles que sobrepasan los valores MIC observados, pueden ser útiles en el tratamiento de infecciones nanobacterianas del tracto urinario.

Se encontró que otros antibióticos ensayados tenían valores MIC que sobrepasaban los 500 mg por litro. Es así poco probable que estos antibióticos sean eficaces en la erradicación de las nanobacterias cuando se utilicen en terapias de un único fármaco, aunque pueden resultar eficazmente empleadas en conjunción con otros antibióticos en un régimen de tratamiento de múltiples fármacos.

Tal como se muestra en la figura 2, los bisfosfonatos, tal como se ilustra aquí por el clodronato y el etidronato, son agentes antinanobacterianos extremadamente eficaces que ejercen un efecto bactericida sobre las nanobacterias a concentraciones mucho menores que las encontradas en los pacientes tratados con el fármaco. Esta es una conclusión novedosa en microbiología, ya que estos fármacos no han sido utilizados para terapias antibacterianas. Estos fármacos están en uso médico por sus efectos sobre la resorción ósea en cáncer o en osteoporosis. Publicaciones recientes indican que los bisfosfonatos pueden reducir la calcificación ósea, una reacción contraria a su utilización aceptada, en ateroesclerosis. La ateroesclerosis implica calcificación, cuya naturaleza no se comprende bien todavía. Se sugiere que la ateroesclerosis pueda ser parcialmente una enfermedad infecciosa que implica nanobacterias como copatógenos con Chlamydia pneumoniae u otros agentes, incluyendo infecciones víricas locales.

TABLA 6

Resumen de los valores de MIC 50 y MIC 90 para quelantes del calcio y otros compuestos:
Compuestos	MIC 50	MIC 90
Clodronato	0,1 mg/l	0,5 mg/l
Etidronato	0,1 mg/l	0,5 mg/l
Citrato	0,2 mM	1 mM
EDTA	0,3 mM	2,5 mM
Vitamina K (Menadiona)	2 mg/l
Vitamina D	>0,025 mM
Ácido acetilsalicílico	0,5 g/l

Los bisfosfonatos pueden utilizarse para la eliminación de nanobacterias en cultivos celulares y en productos y fluidos biológicos. Están concentrados sobre el apatito nanobacteriano y matan a las nanobacterias relativamente rápido, incluso tras una única exposición. Pueden ser así útiles en la eliminación industrial de nanobacterias, por ejemplo, de FBS. FBS u otros sueros pueden exponerse a niveles bajos, por ejemplo, de microgramos a gramos por litro, de un bisfosfonato que inactivará a las nanobacterias y prevendrá su multiplicación cuando se utilice el suero para propósitos industriales o de investigación (en cultivos de tejidos o celulares, por ejemplo). Puede utilizarse un enfoque similar para tratar la sangre humana o hemoderivados, vacunas, productos de cultivo celular y productos biotecnológicos. El tiempo de tratamiento puede variar de minutos a días y la temperatura de tratamiento de 0 - 100º Celsius. El tratamiento puede llevarse a cabo en disoluciones con un pH 3-10. El fármaco es inocuo para los humanos o los animales a niveles bajos. Si es necesario, el fármaco puede extraerse del suero o del producto tras la exposición, por diálisis, por ejemplo, o reducirse a niveles bajos por absorción en superficies minerales de fosfato cálcico (el apatito y otros minerales de calcio conseguirán el efecto), utilizando filtros o partículas de apatito, por ejemplo. Como los bisfosfonatos son excretados y altamente concentrados en la orina, son fármacos muy potentes para el tratamiento de enfermedades nanobacterianas como los cálculos renales.

El citrato es un agente antinanobacteriano eficaz a concentraciones que pueden alcanzarse por tratamientos orales o intravenosos o locales en seres humanos o en animales. El citrato quela el calcio. El calcio es un elemento clave para la integridad de la pared celular nanobacteriana. De modo similar, otros ácidos orgánicos de cadenas cortas son quelantes del calcio débiles y pueden ser útiles en la erradicación de las nanobacterias. Tales ácidos incluyen el ácido láctico, el ácido acético y productos naturales que contengan tales ácidos, por ejemplo, el zumo de arándano. Este último ha sido utilizado para tratar infecciones del tracto urinario. Sin embargo, el mecanismo de acción contra las nanobacterias parece ser un debilitamiento de la pared celular de apatito, mientras que se piensa que el zumo de arándano previene la adhesión de bacterias comunes en el tracto urinario. De modo similar, se han realizado ensayos con citrato para el tratamiento de cálculos renales porque el citrato reduce los niveles de calcio. Sin embargo, los presentes inventores han descubierto que estos ácidos ejercen un efecto antinanobacteriano (figura 27). De manera más importante, el citrato es mucho más eficaz que los ácidos fuertes, el HCl, por ejemplo, en matar a las nanobacterias. Otros ácidos orgánicos de cadenas cortas se han probado más tarde: el ácido acético, el ácido láctico, y el ácido ascórbico mostraron todos un efecto inhibidor sobre las nanobacterias en pruebas de cultivo. Sus valores de MIC 50 fueron de 10-50 mM, lo que indica un potencial para el tratamiento antinanobacteriano.

El EDTA y EGTA son quelantes del calcio que ejercen efectos antinanobacterianos (figura 28). Pueden utilizarse en el tratamiento de pacientes como se ilustra mediante su uso en envenenamiento por un catión divalente, por plomo, por ejemplo. Además, tales agentes pueden ser utilizados en preparaciones de fármacos y de biotecnología para prevenir el crecimiento de nanobacterias o para inactivarlas.

La vitamina K es tóxica para las nanobacterias a concentraciones que no son perjudiciales para las células de los mamíferos. El compuesto es adsorbido por el apatito y así es concentrado por las nanobacterias. La vitamina K puede ser utilizada como un agente antinanobacteriano en el tratamiento de productos de suero o de biotecnología. Después del tratamiento, las cantidades excesivas pueden extraerse por extracción con disolventes orgánicos o filtros lipófilos, cromatografía hidrófoba o técnicas de afinidad cromatográfica utilizando matrices de afinidad que se unen con la vitamina K o métodos similares.

La vitamina D modifica el metabolismo del calcio y tiene un efecto inhibidor sobre las nanobacterias muy débil.

El ácido acetilsalicílico es estructuralmente bastante parecido al ácido paraminosalicílico, que se utiliza como un agente antituberculoso. Estos compuestos afectan a la pared celular o a otros objetivos en las nanobacterias. El efecto es débil pero tales agentes pueden utilizarse en concentraciones altas, lo que los hace fármacos potenciales contra las nanobacterias. De un modo importante, se ha encontrado que el ácido paraminosalicílico que se utiliza en el tratamiento de la tuberculosis tiene un efecto similar: su valor de MIC era idéntico al del ácido acetilsalicílico. Esto puede aplicarse para otros fármacos antiinflamatorios que tengan un resto de un ácido de cadena corta.

Los cálculos de la pulpa dental contienen apatito en una biomatriz. Se ha demostrado que pueden encontrarse nanobacterias de los cálculos de la pulpa dental y que las nanobacterias crecen sobre dientes humanos produciendo cálculos idénticos a los cálculos de la pulpa dental naturales. Se encontró que el fluoruro inhibe la formación de cálculos de las nanobacterias en dientes humanos bajo un modelo de cultivo in vitro utilizando las concentraciones de fluoruro normalmente presentes en los dentífricos.

Las nanobacterias también absorben algunos metales pesados. Las nanobacterias se pueden teñir bien con compuestos de plata o de cobre. Además, los iones de plata o de cobre que se añaden al medio de cultivo de las nanobacterias a niveles submilimolares impidió el crecimiento de las nanobacterias. Las piezas o los chapados de plata en superficies, tales como catéteres o stents (endoprótesis vasculares), pueden proporcionar un efecto antinanobacteriano mediante la prevención de la formación de la biopelícula nanobacteriana. En pruebas in vitro las nanobacterias formaron ávidamente biopelículas en dos stents comerciales diferentes hechos de un material de tipo plástico. Se impidió esta formación de biopelícula mediante la adición de sales de plata o de cobre al medio de cultivo.

Combinaciones de fármacos

El antibiótico más potente, la tetraciclina, se probó en combinación con el fármaco no-antibiótico más potente, el etidronato. Se encontró que las combinaciones de estos fármacos, en concentraciones que son ineficaces cuando se administran solas, produjeron un marcado efecto antinanobacteriano. El valor de MIC 90 era de aproximadamente 0,01 mg por litro para la combinación, mientras que los compuestos individuales tenían valores de MIC mucho más altos. Así, se ve que había presente un efecto sinérgico. Tal efecto puede ser útil en el diseño de combinaciones de fármacos para efecto antinanobacteriano. Específicamente, las terapias con la combinación de un antibiótico junto a un bisfosfonato, un quelante del calcio, un ácido débil (tal como el ácido cítrico, el ácido láctico o el ácido acético), o un fármaco antiinflamatorio ácido (tal como la aspirina), son útiles en el tratamiento de infecciones nanobacterianas, especialmente de la calcificación patológica y de los cálculos, tales como los cálculos renales o los cálculos salivares. Para el tratamiento de las nanobacterias en los cálculos de la pulpa dental se puede incluir fluoruro en la combinación. Los fármacos pueden administrarse en la forma de un dentífrico, un enjuague bucal o un recubrimiento dental adhesivo.

Ejemplo 6 Susceptibilidad de las nanobacterias a la sonicación

La erradicación de las nanobacterias en disoluciones se ensayó también utilizando sonicación con un sonicador B.Braun Labsonic 2000. La muestra, FBS (suero fetal bovino) comercial contaminado con nanobacterias, se sometió a sonicación a la máxima potencia en porciones de 100 ml utilizando contenedores cónicos redondos (valor nominal de 175 ml, Cat. Nalgene No 3143). El procedimiento siguió las instrucciones del fabricante. Se seleccionó la punta de sonido para producir sonicación de alta potencia, y se introdujo un centímetro sobre el fondo del tubo. Se dio ultrasonido en pulsos de 1 minuto con pausas de 1 minuto en baño de hielo para impedir el calentamiento de la muestra. Los tiempos reales de sonicación fueron 0, 1, 2, 3, 5, y 10 minutos. Después de esto, las muestras se sometieron a cultivo normal de nanobacterias. Las muestras de las sonicaciones de 5 y 10 minutos no revelaron ningún microorganismo cultivable.

Aunque la invención se ha descrito e ilustrado en el presente documento por referencia a varios materiales, procedimientos y ejemplos específicos, se entiende que la invención no queda restringida al material particular, las combinaciones de material, y los procedimientos seleccionados con ese propósito. Pueden deducirse numerosas variaciones de tales detalles y serán apreciadas por los expertos en la técnica.

Claims

1. Método para desinfectar un artículo contaminado por nanobacterias que comprende

(a) exponer a las nanobacterias a una mezcla desinfectante, en la que la mezcla desinfectante es

(a1): una mezcla al 1% de persulfato potásico al 50% y ácido sulfaminoico al 5% en agua destilada, o

(a2): una mezcla al 3% de formaldehído al 4,5%, glioxal al 6,8%, ácido glioxílico al 1,5%, y cloruro de dimetil-laurilbencilamonio al 6%, o

(b) desmineralizar las nanobacterias, y después exponer el artículo a un químico desinfectante; o

(c) desmineralizar las nanobacterias, y después someter el artículo al autoclave a una temperatura de al menos 121ºC durante al menos 20 minutos; o

(d) desmineralizar las nanobacterias, y después exponer el artículo a radiación ultravioleta, exponiendo el artículo a una lámpara UV-C de al menos 15 W a una distancia de 60 cm o menos durante al menos 1 hora; o

(e) desmineralizar las nanobacterias, y después calentar el artículo durante al menos 15 minutos, a una temperatura de al menos 60ºC.

2. Método según la reivindicación 1 (b), (c), (d) o (e), en el que la desmineralización se consigue exponiendo el artículo a una mezcla con bajo pH.

3. Método según la reivindicación 2, en el que la mezcla con bajo pH es un ácido fuerte.

4. Método según la reivindicación 3, en el que el ácido fuerte es ácido clorhídrico.

5. Método según la reivindicación 1 (b), (c), (d) o (e), en el que la desmineralización se consigue exponiendo el artículo a una cantidad eficaz de un quelante de calcio o a un ácido orgánico de bajo peso molecular que se une o quela con calcio, seleccionándose dicho ácido del grupo que consiste en ácido cítrico, ácido acético, ácido láctico, ácido ascórbico, ácido salicílico y sus derivados acetilo y aminoacetilo.

6. Método según la reivindicación 5, en el que el quelante de calcio es EDTA.

7. Método según la reivindicación 1 (b), en el que el químico desinfectante se selecciona del grupo que consiste en etanol, glutaraldehído, formaldehído, hipoclorito, peróxido de hidrógeno, ácido clorhídrico, hidróxido de sodio, SDS, Tween 80, Tritón X-100, clorhidrato de guanidinio, urea, Virkon®, Erifenol®, Klorilli®, Buraton®, y mezclas de los mismos.

8. Método según la reivindicación 7, en el que el químico desinfectante se selecciona del grupo que consiste en

etanol (una disolución al menos al 70%);

glutaraldehído (una disolución al menos al 2%);

formaldehído (una disolución al menos al 4%);

hipoclorito (una disolución al menos al 0,5%);

peróxido de hidrógeno (una disolución al menos al 3%);

ácido clorhídrico (una disolución al menos 1 M);

hidróxido de sodio (una disolución al menos 1 M);

dodecilsulfato de sodio (una disolución al menos al 1%);

Tween 80 (una disolución al menos al 1%);

Tritón X-100 (una disolución al menos al 1%);

clorhidrato de guanidinio (una disolución al menos 3 M);

urea (una disolución al menos 3 M);

Virkon® (una disolución al menos al 1%);

Erifenol® (una disolución al menos al 1,5%);

Klorilli® (una disolución al menos al 1%);

Buraton® (una disolución al menos al 3%);

y mezclas de los mismos

9. Método según la reivindicación 1 (b), que comprende además someter el artículo al autoclave a una temperatura de al menos 121ºC durante al menos 20 minutos.

10. Método según la reivindicación 1 (b), que comprende además exponer el artículo a radiación ultravioleta, exponiendo el artículo a una lámpara UV-C de al menos 15 W a una distancia de 60 cm o menos durante al menos 1 hora.

11. Método según la reivindicación 1 (e), en el que el calentamiento se lleva a cabo durante al menos 30 minutos a una temperatura de al menos 100ºC.

12. Uso de un antibiótico seleccionado del grupo que consiste en antibióticos \beta-lactámicos, antibióticos de tetraciclina, y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, y mezclas de los mismos, en una cantidad suficiente para inhibir o prevenir el crecimiento de nanobacterias para preparar una composición antinanobacteriana para la prevención o el tratamiento del desarrollo de calcificaciones producidas por nanobacterias in vivo en un paciente que necesite tal prevención o tratamiento.

13. Uso según la reivindicación 12, en el que los antibióticos \beta-lactámicos se seleccionan del grupo que consiste en penicilina, feneticilina, ampicilina, azlocilina, bacampicilina, carbenicilina, ciclacilina, mezlocilina, piperacilina, epicilina, hetacilina, cloxacilina, dicloxacilina, meticilina, nafcilina, oxacilina, y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

14. Uso según la reivindicación 12, en el que los antibióticos de tetraciclina se seleccionan del grupo que consiste en tetraciclina, clortetraciclina, demeclociclina, doxiciclina, metaciclina, oxitetraciclina, rolitetraciclina, minociclina, sanciclina y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

15. Uso de un antibiótico seleccionado del grupo que consiste en antibióticos \beta-lactámicos, antibióticos aminoglucósidos, antibióticos de tetraciclina, sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, y mezclas de los mismos, en una cantidad suficiente para inhibir o prevenir el crecimiento de nanobacterias para preparar una composición antinanobacteriana para la prevención o el tratamiento del desarrollo de calcificaciones producidas por nanobacterias in vivo en un paciente que necesite tal prevención o tratamiento, en el que el antibiótico se coadministra con un compuesto de citrato.

16. Uso de un bisfosfonato en una cantidad suficiente para inhibir o prevenir el crecimiento de nanobacterias para preparar una composición farmacéutica para la prevención o el tratamiento del desarrollo de calcificaciones producidas por nanobacterias in vivo en un paciente que necesite tal prevención o tratamiento.

17. Uso según la reivindicación 16, en el que el bisfosfonato se selecciona del grupo que consiste en ácido alendrónico, ácido etidrónico, ácido clodrónico, ácido oxidrónico, y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

18. Uso según la reivindicación 16, en el que los bisfosfonatos se administran en una dosis de aproximadamente 5-20 mg/kg/día.

19. Uso según la reivindicación 16, en el que los bisfosfonatos se coadministran con un antibiótico.

20. Uso según la reivindicación 19, en el que el antibiótico es un antibiótico de tetraciclina, seleccionado del grupo que consiste en tetraciclina, clortetraciclina, demeclociclina, doxiciclina, metaciclina, oxitetraciclina, rolitetraciclina, minociclina, sanciclina, y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

21. Uso de un antibiótico según la reivindicación 12 en una cantidad eficaz para inhibir o prevenir el crecimiento de nanobacterias para preparar una composición farmacéutica para prevenir el desarrollo de cálculos renales producidos por nanobacterias en un paciente que haya padecido previamente de cálculos renales.

22. Método para erradicar nanobacterias de materiales líquidos, que comprende la sonicación de dicho líquido.

23. Método según la reivindicación 22, en el que dicho líquido se refrigera durante la sonicación.

24. Método según la reivindicación 22, en el que dicho líquido se sonica durante al menos cinco minutos.