ES2248067T3 - Fosfatasas con actividad de fitasa mejorada. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona una fosfatasa que posee actividad de fitasa mejorada, una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la fosfatasa, un vector que porta la molécula de ácido nucleico, una célula hospedadora transformada con el vector y un pienso mejorado que comprende la fosfatasa, según se define en la reivindicación 1.

Description

Fosfatasas con actividad de fitasa mejorada.

La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud de Patente provisional de EE.UU., serie n.º 60/127.032, presentada el 31 de marzo de 1.999.

Antecedentes de la invención

Las fitasas son mioinositol-hexakisfosfato-fosfohidrolasas que catalizan la separación paso a paso de ortofosfato inorgánico procedente de fitato (mioinositol-hexakisfosfato) (1). Existen dos tipos de fitasas. Unas se denominan 3-fitasas (EC 3.1.3.8) y son las que inician la separación de los grupos fosfato de las posiciones 1 y 3 del anillo de mioinositol. Las otras se denominan 6-fitasas (EC 3.1.3.26) y son las que primero liberan el fosfato de la posición 6 del anillo. Mientras que no se han identificado fitasas en tejidos animales, las plantas normalmente contienen 6-fitasas, y una amplia variedad de microorganismos, que incluyen bacterias, hongos filamentosos y levaduras, producen 3-fitasas (2-9). Debido a que más del 70% del fósforo total presente en alimentos o en piensos de origen vegetal está en forma de fitato, el cual tiene una baja disponibilidad para animales monogástricos y para seres humanos, las fitasas son de gran utilidad en la mejora de la nutrición mineral de estas especies (10-16). Suplementos de fitasas microbianas en dietas para cerdos y pollos aumentan de manera efectiva la biodisponibilidad del fósforo fítico y reducen la necesidad del aporte de suplementos de fósforo inorgánico (11-15), dando como resultado una menor polución debida al fósforo en áreas de producción animal intensiva (8-15). Sin embargo, en dietas para animales es necesario un nivel relativamente alto de suplementos de fitasas (10-16), debido a que una cantidad considerable de la enzima es degradada en estómago e intestino delgado (13), probablemente por la proteolisis producida por pepsina y tripsina. Entretanto, los perfiles proteolíticos de diferentes fitasas no se estudiaron. Evidentemente, una mejor comprensión de las sensibilidades de las fitasas frente a la hidrólisis con tripsina y pepsina podría ayudar a mejorar el valor nutricional de las fitasas. El gen de fitasa de Aspergillus niger (phyA) ha sido sobreexpresado en su hospedador original (17) y la enzima recombinante (la r-PhyA, EC 3.1.3.8) se ha usado en dietas animales en forma de una fitasa comercial (13, 14). Esta enzima es una glicoproteína de aproximadamente 80 kDa. El gen de la fosfatasa ácida de pH 2,5 (appA) de Escherichia coli ha sido también caracterizado (18, 19). Experimentos realizados en animales han demostrado que la enzima recombinante
(r-AppA, EC 3.1.3.2) es igual de efectiva que la r-PhyA en cuanto a liberar fósforo fítico en dietas para animales (14).

Pero los costes de las limitadas existencias de las fitasas comerciales disponibles y la inestabilidad de la actividad de la enzima frente al calor del proceso de granulación de los piensos, impiden su uso práctico en la industria animal. Por lo tanto, se necesitan enzimas que tengan un nivel alto de actividad de fitasa y un nivel alto de estabilidad para usar en alimentación animal.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona una fosfatasa que posee actividad de fitasa mejorada, una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la fosfatasa, un vector que porta la molécula de ácido nucleico, una célula hospedadora transformada con el vector y un pienso mejorado que comprende la fosfatasa, según se define en la reivindicación 1.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra el cambio en la actividad de fitasa después de la digestión con una proteasa. La Figura 1A muestra los cambios en la actividad de fitasa de la r-PhyA y la r-AppA incubadas con relaciones diferentes de tripsina/proteína (p/p) (r = 0,001, 0,005, 0,01 y 0,025). Símbolos: r-PhyA (\blacksquare) y r-AppA (\medbullet). Los resultados son la media \pm ESM de cinco experimentos independientes. * Indica la significación estadística (p<0,01) frente a un control de r-PhyA o de r-AppA no tratadas. La Figura 1B muestra los cambios en la actividad de fitasa de la r-PhyA y la
r-AppA incubadas con relaciones diferentes de pepsina/proteína (p/p) (r = 0,001, 0,002, 0,005 y 0,01). Símbolos: r-PhyA (\square) y r-AppA (\medcirc). Los resultados son la media \pm ESM de siete experimentos independientes. *Indica la significación estadística (p<0,01) frente a un control de r-PhyA o de r-AppA no tratadas.

La Figura 2 muestra la actividad de fitasa residual de la r-PhyA y la r-AppA después de la hidrólisis con tripsina o pepsina y a lo largo del tiempo (0, 1, 5, 30 y 120 min). Símbolos: r-PhyA (\blacksquare) o r-AppA (\medbullet) digeridas con tripsina; r-PhyA (\square) y r-AppA (\medcirc) digeridas con pepsina. La relación tripsina/fitasa (p/p) usada fue: r = 0,01 (p/p). La relación pepsina/fitasa usada fue: r = 0,005. Los resultados son la media \pm ESM de seis experimentos independientes. *Indica la significación estadística (p<0,01) frente a un control de r-PhyA o de r-AppA no tratadas.

La Figura 3 muestra los resultados de una electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida de los productos resultantes de la digestión de la r-AppA (12%, Recuadro A) o de la r-PhyA (20%, Recuadro B) con diferentes cantidades de tripsina (r = 0,001, 0,005, 0,01 y 0,025 (p/p)). Las proteínas se tiñeron usando azul de Coomasie. T: control de tripsina, C: r-AppA purificada (Recuadro A) o r-PhyA purificada (Recuadro B). El marcador de proteínas (M) es una escala de razón 10 kDa (10, 20, 30, 40, 50, 70, 80, 90, 100, 110, 120 y 200 kDa) (Gibco). Los resultados son representativos de cuatro experimentos independientes.

La Figura 4 muestra los resultados de una electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (20%) de productos resultantes de la digestión de la r-AppA (Figura 4A) o de la r-PhyA (Figura 4B) con diferentes cantidades de pepsina
(r = 0,001, 0,002, 0,005 y 0,01 (p/p)). Las proteínas se tiñeron usando azul de Coomasie. P: control de pepsina, C: r-AppA purificada (Figura 4A) o r-PhyA purificada (Figura 4B). El marcador de proteínas (M) es una escala de razón 10 kDa (10, 20, 30, 40, 50, 70, 80, 90, 100, 110, 120 y 200 kDa) (Gibco). Los resultados son representativos de seis experimentos independientes.

La Figura 5 muestra las cantidades de fósforo inorgánico (iP) liberadas de harina de soja por acción de la r-PhyA y la r-AppA incubadas con diferentes concentraciones de tripsina (r = 0,001, 0,005, 0,01 y 0,025, p/p) (Figura 5A) o de pepsina (r = 0,001, 0,002, 0,005 y 0,01) (Figura 5B). Símbolos: r-AppA (\blacksquare), r-PhyA (\square). Los resultados son la media \pm ESM de tres experimentos independientes. *Indica la significación estadística (p<0,01) frente a un control de r-PhyA o de r-AppA no tratadas.

La Figura 6 muestra la secuencia de nucleótidos del gen appA2 (SEQ. ID No. 1) y la secuencia de aminoácidos de ella deducida (SEQ. ID No. 9). La región que no se traduce está indicada con letras minúsculas. Las secuencias subrayadas son los cebadores usados para amplificar appA2 (Pf1: 1-22 y K2: 1468-1490), appA2 (E2: 243-252 y K2: 1468-1490). Los sitios potenciales de N-glicosilación se encuentran recuadrados. La secuencia de appA2 se ha transmitido a la biblioteca de datos de GeneBank con el número de registro 250016.

La Figura 7 es una representación a lo largo del tiempo de las actividades de fitasa extracelular (\square) y de fosfatasa ácida extracelular (\medcirc), y de la expresión del mRNA de CIPPA2 (\blacktriangle) en Pichia pastoris transformada con appA2 después de la inducción. Los resultados están expresados en forma de la media \pm ESM de tres experimentos.

La Figura 8 muestra un análisis de transferencia Northern de la expresión del mRNA de appA2 en Pichia pastoris transformada con appA2 después de la inducción (Figura 8A). La hibridación se realizó usando como sonda appA2 marcado con [\alpha-^{32}P]. Se cargaron 20 \mug de RNA total en cada pista. El recuadro B representa la misma carga de RNA visualizada por medio del rRNA de la levadura con luz UV.

La Figura 9 muestra la dependencia que tiene del pH la actividad enzimática a 37ºC de la r-appA2 (\medbullet), la r-appA (\blacktriangle) y la r-phyA (\square) purificadas, cuando se utiliza fitato sódico como sustrato. Tampones: pH 1,5-4,5, glicina-HCl 0,2 M; pH 5,5-7,5, citrato 0,2 M; pH 8,5-11, Tris-HCl 0,2 M. Los resultados están expresados en forma de la media \pm ESM de tres experimentos.

La Figura 10 muestra un análisis de electroforesis en un gel no desnaturalizante (al 15%) de la actividad de fosfatasa ácida remanente de la r-appA2 después de incubada a diferentes temperaturas durante 20 min. Después del tratamiento con calor, las muestras se pusieron en hielo durante 5 min antes de cargarlas en el gel (200 \mug de proteína/pista).

La Figura 11 muestra la hidrólisis del fósforo fítico contenido en harina de soja, por acción de diferentes cantidades (100, 300, 600 y 900 PU) de las enzimas r-appA2 (\medbullet), r-appA (\blacktriangle) y r-phyA (\square) purificadas. *Indica las diferencias significativas (p<0,05) entre la r-appA2 y las otras dos enzimas. Los resultados están expresados en forma de la media \pm ESM de tres experimentos.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona una fosfatasa con actividad de fitasa mejorada.

La fosfatasa mejorada se puede usar en piensos para mejorar la accesibilidad del fosfato al animal.

La invención proporciona una fosfatasa con actividad de fitasa mejorada, que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ. ID No. 9 según se muestra en la Figura 6.

Preferiblemente, la proteína o polipéptido con actividad de fitasa es secretada por la célula al medio de cultivo. Esto permite obtener unos niveles de expresión más altos y un aislamiento más fácil del producto. La proteína o polipéptido con actividad de fitasa está acoplada a una secuencia señal capaz de dirigir la proteína al exterior de la célula. Preferiblemente, la secuencia señal es escindida de la proteína.

En una realización preferida, el gen heterólogo, que codifica una proteína o un polipéptido con actividad de fitasa, se procesa por corte y empalme en el marco de lectura junto con un elemento activador de la transcripción.

Una fosfatasa preferida está codificada por el gen appA de E. Coli. El gen, originariamente definido como gen de la fosfoanhidrido-fosfohidrolasa periplásmica (appA) de E. Coli, contiene 1.298 nucleótidos (GeneBank, número de registro: M58708). Se descubrió primero que el gen codificaba una proteína fosfatasa ácida de pH óptimo de 2,5 (EcAP) en E. Coli. La fosfatasa ácida es un monómero con una masa molecular de 44.644 daltons. La EcAP madura contiene 410 aminoácidos (18). Ostanin y col., sobreexpresaron appA en E. Coli BL21 usando un vector pT7 e incrementaron su actividad de fosfatasa ácida aproximadamente 400 veces (440 mU/mg de proteína) (20). No se conocía con anterioridad que el producto del gen appA tuviera actividad de fitasa.

La fosfatasa puede ser expresada en cualquier sistema de expresión procariótico o eucariótico. Se pueden usar diversos sistemas de hospedador-vector para expresar la secuencia(s) que codifica la proteína. Los vectores preferidos incluyen vectores víricos, plásmidos, cósmidos o un oligonucleótido. Principalmente, el sistema del vector debe ser compatible con la célula hospedadora utilizada. Sistemas de hospedador-vector incluyen, pero no se limitan a ellos, los siguientes: bacterias transformadas con DNA de bacteriófagos, DNA de plásmidos o DNA de cósmidos; microorganismos tales como levaduras que contienen vectores específicos para levaduras; sistemas de células de mamíferos infectadas con virus (p. ej., el virus de la viruela vacuna, adenovirus, etc.); sistemas de células de insectos infectadas con virus (p. ej., baculovirus); y células vegetales infectadas con bacterias. Los elementos de expresión de estos vectores varían en su fuerza y en sus especificidades. Dependiendo del sistema huésped-hospedador utilizado, se puede utilizar uno cualquiera de los elementos de transcripción y traducción utilizados.

Los hospedadores preferidos para expresar fosfatasa incluyen células fúngicas, que incluyen especies de levaduras u hongos filamentosos, y se pueden utilizar como células hospedadoras de acuerdo con la presente invención. Las células hospedadoras de levaduras preferidas incluyen diferentes cepas de Saccharomyces cerevisiae. También se pueden utilizar otras levaduras como Kluyveromyces, Torulaspora y Schizosaccharomyces. En una realización preferida, la cepa de levadura para sobreexpresar la proteína, es Saccharomyces cerevisiae. Células hospedadoras de tipo de hongos filamentosos incluyen Aspergillus y Neorospora.

La cepa de levadura puede ser una cepa de levadura metilotrófica. Las cepas de levadura metilotróficas son aquellos géneros de levadura capaces de utilizar metanol como fuente de carbono para la producción de los recursos energéticos necesarios para mantener la función celular, y que contienen un gen para la expresión de alcohol-oxidasa. Levaduras metilotróficas típicas incluyen los géneros Pichia, Hansenula, Torulopsis, Candida y Karwinskia. Estos géneros de levadura utilizan metanol como única fuente de carbono. En una realización preferida, la cepa de levadura metilotrófica es Pichia pastoris.

La proteína o polipéptido con actividad de fitasa puede tener una actividad óptima en un intervalo de temperatura de 57ºC a 65ºC. Una realización más preferida es una proteína o polipéptido con actividad de fitasa, cuando su intervalo de temperatura de actividad óptima es de 58ºC a 62ºC.

Otra realización preferida más la constituye una proteína o polipéptido con actividad de fitasa, cuando la proteína conserva al menos el 40% de su actividad después de calentar la proteína durante 15 minutos a 80ºC. Más preferida es una proteína o polipéptido con actividad de fitasa, cuando la proteína conserva al menos el 60% de su actividad después de calentar la proteína durante 15 minutos a 60ºC.

La proteína purificada se puede obtener por varios métodos. La proteína o polipéptido de la presente invención se produce preferiblemente en forma purificada (preferiblemente al menos aproximadamente el 80% pura, más preferiblemente el 90% pura) mediante técnicas convencionales. Típicamente, la proteína o polipéptido de la presente invención se secreta al medio de crecimiento de las células hospedadoras recombinantes. Como alternativa, la proteína o polipéptido de la presente invención se produce pero no se secreta al medio. En estos casos, para aislar la proteína, la célula hospedadora que porta un plásmido recombinante se propaga, se lisa por sonicación, tratamiento térmico o tratamiento químico, y el homogeneizado se centrifuga para separar los restos celulares. El sobrenadante se somete luego a una precipitación secuencial en sulfato amónico. La fracción que contiene el polipéptido o proteína de la presente invención se somete a filtración en gel en una columna de dextrano o poliacrilamida del tamaño apropiado para separar las proteínas. Si fuera necesario, la fracción que contiene la proteína se puede purificar de nuevo por HPLC.

La cepa de levadura puede contener un gen heterólogo que codifica una proteína o polipéptido con actividad de fitasa. El gen heterólogo debe estar funcionalmente unido a un promotor capaz de expresar fitasa en levaduras y debe ir seguido por un terminador de la transcripción.

Otro aspecto más de la invención consiste en un vector de expresión de fitasa en un hospedador. El vector porta un gen de fosfatasa que codifica una proteína o polipéptido con actividad de fitasa.

Para la clonación en levaduras, el gen se debe clonar en un vector que se replica de manera autónoma o que se integra en el genoma de la levadura. El número de copias de los plásmidos de replicación autónoma, p. ej., los plásmidos YEp, puede ser elevado, pero su estabilidad mitótica puede ser insuficiente (48). Estos plásmidos pueden contener la secuencia plasmídica de 2 m\mu responsable de la replicación autónoma, y una secuencia de E. Coli responsable de la replicación en E. Coli. Los vectores preferiblemente contienen un marcador genético para la selección de los transformantes en levaduras, y un gen de resistencia a antibióticos para la selección en E. Coli. Los vectores episómicos que contienen las secuencias ARS y CEN se presentan en forma de una sola copia por célula, y son más estables que los vectores YEp. Los vectores integrativos se usan cuando un fragmento de DNA se integra en forma de una copia o de múltiples copias en el genoma de la levadura. En este caso, el DNA recombinante es estable y no es necesaria una selección (49-51). Algunos vectores contienen un origen de replicación, que es funcional en la célula hospedadora seleccionada. Los orígenes de replicación adecuados incluyen 2 \mu, ARS1, y 25 \muM de selección. Los vectores contienen sitios para endonucleasas de restricción, para la inserción de las secuencias del gen de fusión y del promotor, y de marcadores de selección. Los vectores se pueden modificar mediante la eliminación o la adición de sitios de restricción, o mediante la eliminación de otros nucleótidos no deseados.

El gen de fitasa se puede situar bajo el control de un promotor cualquiera (52). Se puede elegir un promotor constitutivo o un promotor regulado de levaduras. Secuencias promotoras adecuadas para vectores de levaduras incluyen, entre otras, los promotores de la metalotioneína, de la 3-fosfoglicerato-quinasa (53) o de otras enzimas glicolíticas (54), tales como la enolasa, gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato-descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato-isomerasa, 3-fosfoglicerato-mutasa, piruvato-quinasa, triosa-fosfato-isomerasa, fosfoglucosa-isomerasa y glucoquinasa. Otros vectores y promotores adecuados de uso en la expresión en levaduras se describen también en el documento EP A-73.657 de Hitzeman, que por ello se incorpora aquí como referencia. Otra alternativa es el promotor ADH2 represible por glucosa (56, 57), que por ello se incorporan aquí como referencia.

Se puede elegir un promotor constitutivo o un promotor regulado de levaduras. Los promotores fuertes, p. ej., del gen de la fosfoglicerato-quinasa (PGK) (del inglés, " PhosphoGlycerate Kinase"), de otros genes que codifican enzimas glicolíticas, y del gen del factor-alfa, son constitutivos. Cuando se usa un promotor constitutivo, el producto se sintetiza durante el cultivo celular. El promotor de ADH2 se regula con etanol y glucosa, los promotores de
GAL-1-10 y GAL7 se regulan con galactosa y glucosa, el promotor de PHO5 se regula con fosfato y el promotor de la metalotioneína se regula con cobre. Los promotores de choque térmico, a los que pertenece el promotor de HSP150, se regula con la temperatura. También se pueden usar promotores híbridos. Se usa un promotor regulado cuando la expresión continua de los productos deseados es perjudicial para las células hospedadoras. En lugar de promotores de levaduras, se puede usar un promotor fuerte procariótico, tal como el promotor de T7, pero en este caso la cepa de levadura tiene que ser transformada con un gen que codifica la respectiva polimerasa. Para la terminación de la transcripción, se usa el terminador de HSP150, o cualquier otro terminador funcional. En el presente documento, a los promotores y terminadores se les denomina elementos de control. La presente invención no está restringida a ningún vector, promotor o terminador específico.

El vector también puede portar un marcador seleccionable. Los marcadores seleccionables suelen ser genes de resistencia a antibióticos o genes capaces de complementar las cepas de levadura que tienen deficiencias metabólicas muy caracterizadas, tales como los mutantes deficientes en triptófano o histidina. Los marcadores seleccionables preferidos incluyen URA3, LEU2, HIS3, TRP1, HIS4, ARG4, o genes de resistencia a antibióticos.

El vector también puede contener un origen de replicación capaz de iniciar la replicación en una célula bacteriana. La manipulación de vectores es más eficiente en cepas bacterianas. Los orígenes de replicación bacterianos preferidos son ColE1, Ori u oriT.

Una secuencia conductora ya sea procedente de la levadura o de los genes de fitasa o de otras fuentes, se puede utilizar para ayudar a la secreción al medio de la enzima fitasa expresada. La presente invención no está restringida a ningún tipo específico de secuencia conductora o de péptido señal.

Las secuencias conductoras adecuadas incluyen la secuencia conductora del factor alfa de levaduras, que se puede utilizar para dirigir la secreción de la fitasa. La secuencia conductora del factor alfa se suele insertar entre la secuencia del promotor y la secuencia del gen estructural (58; Patente de EE.UU. n.º 4.546.082; y solicitud de Patente europea publicada n.º 324.274, que se incorporan aquí como referencia). Otra secuencia conductora adecuada es el MF alfa 1 de S. cerevisiae (factor alfa) que se sintetiza como una forma prepro de 165 aminoácidos que comprenden la secuencia señal o prepéptido de 19 aminoácidos seguida de una "secuencia conductora" o propéptido de 64 aminoácidos, y que abarcan 3 sitios de glicosilación ligados a N seguidos de (LysArg(Asp/Glu),Ala)2-3 factor alfa)4 (58). La parte de la secuencia señal-secuencia conductora del preproMF alfa 1 se ha utilizado de manera generalizada para obtener la síntesis y secreción de proteínas heterólogas en S. cerevisiae. El uso de péptidos señal/conductor homólogos a los de levadura se conoce por la Patente de EE.UU. n.º 4.546.082, las solicitudes de Patente europea n.^{os} 116.201; 123.294; 123.544; 163.529; y 123.289 y solicitud de Patente DK n.º 3614/83, que por ello se incorporan aquí como referencia. En la solicitud de Patente europea n.º 123.289, que se incorpora aquí como referencia, se describe la utilización del precursor del factor alfa de S. cerevisiae, mientras que el documento WO 84/01153, que se incorpora aquí como referencia, indica la utilización del péptido señal de la invertasa de Saccharomyces cerevisiae, y la solicitud de Patente alemana DK 3614/83, que se incorpora aquí como referencia, indica la utilización del péptido señal de PHO5 de Saccharomyces cerevisiae para la secreción de proteínas extrañas.

La secuencia señal-conductora del factor alfa procedentes de Saccharomyces cerevisiae (MF alfa 1 o MF alfa 2) se puede utilizar también en el proceso de secreción de proteínas heterólogas expresadas en levadura (Patente de EE.UU n.º 4.546.082, solicitudes de Patente europea n.^{os} 16.201; 123.294; 123.544; y 163.529, que se incorporan aquí como referencia). Fusionando una secuencia de DNA que codifica la secuencia señal/conductora de MF alfa 1 de S. cerevisiae en el extremo 5' del gen que codifica la proteína deseada, se demostró la secreción y el procesamiento de la proteína deseada. El uso del péptido señal de la amilasa salivar de ratón (o de uno de sus mutantes) para proporcionar la secreción de proteínas heterólogas expresadas en levaduras, se ha descrito en las solicitudes de PCT publicadas n.^{os} WO 89/02463 y WO 90/10075, que por ello se incorporan aquí como referencia.

La Patente de EE.UU. n.º 5.726.038 describe el uso del péptido señal de la aspártico-proteasa 3 de levaduras, que es capaz de proporcionar una secreción mejorada de las proteínas expresadas en levaduras. Los expertos en la técnica conocen otras secuencias conductoras adecuadas por facilitar la secreción de polipéptidos recombinantes en hospedadores de tipo levadura. Una secuencia conductora se puede modificar cerca de su extremo 3' para que contenga uno o más sitios de restricción. Esto facilitará la fusión de la secuencia conductora al gen estructural.

Los protocolos de transformación de levaduras son conocidos por los expertos en la técnica. Uno de esos protocolos se encuentra descrito en Hinnen y col. (59). El protocolo de Hinnen y col. selecciona los transformante Trp en un medio selectivo, en el que el medio selectivo que consiste en medio Yeast Nitrogen Base al 0,67%, casaminoácidos al 0,5%, glucosa al 2%, adenina 10 \mug/ml y uracilo 20 \mug/ml.

El gen puede ser mantenido en un vector de expresión estable, en un cromosoma artificial o por integración en el cromosoma de una célula hospedadora de tipo levadura. La integración en el cromosoma se puede realizar clonando el gen de fitasa en un vector que se recombinará dentro de un cromosoma de levadura. Los vectores adecuados pueden incluir secuencias de nucleótidos que son homólogas a las secuencias de nucleótidos del cromosoma de la levadura. Como alternativa, el gen de fitasa se puede colocar entre sitios de recombinación, tales como elementos transponibles, que pueden mover el gen dentro del cromosoma.

La fitasa se puede producir disponiendo de un gen de fosfatasa aislado, que codifica una proteína o polipéptido con actividad de fitasa, y que expresa el gen en la célula hospedadora. La fosfatasa preferiblemente es una fosfatasa microbiana. En una realización más preferida la fosfatasa microbiana es una fosfatasa de Escherichia coli. También son preferidas las fosfatasas microbianas AppA y App2.

El fitato puede ser convertido en inositol y fósforo inorgánico. Un gen appA se aísla a partir de un organismo utilizando métodos muy conocidos en la técnica. Una proteína o polipéptido con actividad de fitasa es expresada luego por el gen en una célula hospedadora. La proteína o polipéptido resultante se mezcla o se pone en contacto con fitato. Esta técnica es especialmente útil para el tratamiento del fitato contenido en alimentos o piensos para animales.

El gen appA preferido se aísla procedente de Escherichia coli.

Aunque la enzima fitasa producida en un sistema en levaduras liberó P fítico en maíz y soja de manera igual de efectiva que la fitasa actualmente comercializada, resultó ser más termoestable. Este sistema de sobreexpresión de fitasa en levadura se puede utilizar para disponer de una fitasa termoestable de uso en la industria alimentaria y en la industria de piensos.

Ejemplos Ejemplo 1 Materiales y métodos correspondientes a los Ejemplos 2-6

Expresión de la r-appA. El gen appA (GeneBank, número de registro M58708) se obtuvo procedente de la cepa BL21 de E. coli transformada con un vector de expresión pAPPA1 (20). Un fragmento de DNA de 1,35 kb que contiene la región codificadora de appA se amplificó por PCR siguiendo las instrucciones del fabricante (Perkin Elmer). Los cebadores derivaron de las regiones 5' y 3' de la secuencia de nucleótidos (18), e incluyen: E2 [directo: 242-252]: 5'GGAATTCCAGAGTGAGCCGGA 3' (SEQ. ID. No. 2) y K2 [inverso: 1468-1490]: 5'GGGGTACCTTA
CAAACTGCACG 3' (SEQ. ID. No. 3). Estos dos cebadores se sintetizaron en la Oligonucleotide Synthesis Facility de la Universidad de Cornell (Ithaca, NY). El producto amplificado se recortó en tiras de un gel de agarosa al 1% y se eluyó con el kit GENECLEAN II (Bio 101). El fragmento purificado se clonó primero en el vector pGEM T-easy (Promega) y se insertó después en el vector pPIcZ\alphaA de expresión en levaduras (Invitrogen) en el sitio EcoRI. La cepa TOP10F' de E. coli (Invitrogen) se usó como hospedador inicial para amplificar estas dos construcciones. El vector pPIcZ\alphaA que contiene appA se utilizó para transformar la cepa X33 de P. pastoris por electroporación conforme a las instrucciones del fabricante (Invitrogen). Las células transformadas se sembraron en medio de agar YPD-Zeocina y las colonias positivas se incubaron en medio mínimo con glicerol (BMGY) durante 24 h. Cuando la densidad de células de levadura alcanzó 2,5 x 10^{8} células/ml (OD_{600} = 5), las células se centrifugaron y se suspendieron en un medio con metanol al 0,5% (BMMY) para inducir la expresión del gen appA. El DNA genómico total de levadura se extrajo de las células X33 transformadas después de la inducción y se usó como molde para comprobar la presencia del gen appA por PCR usando los mismos cebadores anteriormente descritos. El fragmento de DNA amplificado se secuenció en la DNA Services-Facility de la Universidad de Cornell utilizando una secuenciación automatizada de ciclos de Taq con terminadores Dye Deoxy (Applied Biosystems, Forster City, CA).

Purificación de la r-PhyA y la r-AppA. La r-PhyA se obtuvo procedente de BASF (Mt Olive, NJ). Ambas enzimas r-PhyA y r-AppA se suspendieron inicialmente en Tris-HCl 50 mM, pH 7, y se añadió sulfato amónico hasta alcanzar una saturación del 25%. Después de centrifugada la muestra (25.000 g, 20 min), el sobrenadante se reservó y se le añadió sulfato amónico hasta alcanzar una saturación del 75%. A continuación, la mezcla se centrifugó (25.000 g, 20 min) y el sedimento se suspendió en 10 ml de Tris-HCl 25 mM, pH 7. La suspensión se dializó toda la noche frente al mismo tampón y se cargó en una columna de DEAE-Sepharose (Sigma) equilibrada con Tris-HCl 25 mM, pH 7. Las proteínas se diluyeron con Nad 0,2 M, Tris-HCl 25 mM, pH 7 después de que la columna se hubo lavado con 200 n-LL de Tris-HCl 25 mM, pH 7. En todas las fracciones recogidas se determinó la actividad de fitasa y la concentración de proteínas (21). La purificación completa se llevó a cabo a 4ºC, y las fracciones se almacenaron a -20ºC antes de su análisis.

Proteolisis y electroforesis de las proteínas. La r-AppA y la r-PhyA purificadas (2 mg/ml) se incubaron con diferentes cantidades de pepsina y tripsina siguiendo las instrucciones del fabricante (Sigma). La pepsina (800 unidades/mg de proteína) y la tripsina (1.500 unidades BAEE/mg de proteína) se disolvieron en HCl 10 mM, pH 2 (0,1 mg/ml) y en bicarbonato amónico 80 mM, pH 7,5 (0,1 mg/ml) respectivamente. Una unidad BAEE se definió como un cambio en absorbancia de 0,001 a 253 nm por minuto, a pH 7,6 y a 250ºC, con BAEE como sustrato. En un volumen final de
100 \mul, 10 \mug de la r-PhyA purificada (0,1 PU) o de la r-AppA purificada (0,08 PU) se incubaron con tripsina o pepsina, en unas relaciones de proteasa/fitasa (p/p) que variaban de 0,001 a 0,01, a 37ºC, durante de 1 min a 120 min. La reacción se detuvo sobre hielo y el pH de la mezcla se ajustó a 8 para la electroforesis de las proteínas y para el ensayo de la actividad de fitasa. Las mezclas de proteínas digeridas se analizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato sódico (SDS) o en gel de poliacrilamida-urea-SDS de la manera previamente descrita (22, 23).

Actividad de fitasa e hidrólisis del fósforo fítico procedente de harina de soja. Las actividades de fitasa de la r-PhyA y la r-AppA, antes de la proteolisis o a diferentes tiempos de proteolisis, se determinaron de la manera previamente descrita (24). El fósforo inorgánico liberado (iP) se ensayó con el método de Chen y col. (25). Se define una unidad de fitasa (PU) (del inglés, " Phytase Unit") como la actividad que libera 1 \mumol de iP procedente de fitato sódico, por minuto, a 37ºC. Para confirmar los efectos proteolíticos de la tripsina y pepsina sobre las actividades residuales de la r-PhyA y la r-AppA, se realizó el seguimiento de la hidrólisis del fósforo fítico procedente de harina de soja por acción de estas dos enzimas incubadas con diferentes cantidades de tripsina o pepsina. En un volumen de reacción total de
5 ml, se incubaron 0,5 mg de la r-PhyA purificada (5 PU) o de la r-AppA purificada (4 PU) con 1 g de harina de soja y pepsina en HCl 10 mM, pH 2,5, o tripsina en citrato 0,2 M, pH 6,8, en 3 VC durante 2 h. El iP liberado se determinó de la manera anteriormente descrita.

Ejemplo 2 Preparación de la r-AppA y la r-PhyA

Más de 30 colonias de X33 transformada con el gen appA expresaron la actividad de fitasa extracelular que hidroliza el fitato sódico. La colonia 26 presentó la actividad más alta (88 U/ml) y se eligió para estudios posteriores. Después de que las muestras de la r-PhyA y la r-AppA eluyeran de la columna de DEAE-Sepharose, se recogieron 45 fracciones de 4 ml de cada una de las enzimas para analizarlas con respecto a la actividad de fitasa. Las fracciones utilizadas para la proteolisis presentaron una actividad específica de 9,6 U/mg y 8,1 U/mg de proteína correspondiente a la r-PhyA y la r-AppA respectivamente.

Ejemplo 3 Efectos de la digestión con tripsina sobre las actividades de fitasa de ambas enzimas

Después de 2 h de digestión con tripsina, hubo diferencias significativas en las actividades de fitasa residuales entre la r-PhyA y la r-AppA (Figura 1A). Aunque ambas enzimas conservaron más del 85% de sus actividades originales a los valores correspondientes a la relación tripsina/fitasa de 0,001 y 0,005, la r-AppA perdió el 64% y el 74% de su actividad original a la relación de 0,01 y de 0,025 respectivamente. Entretanto, la r-PhyA perdió solamente el 14% y el 23% de su actividad original respectivamente. Debido a la evidente diferencia en las sensibilidades de estas dos enzimas frente a la digestión con tripsina a la relación de 0,01, se realizó un estudio a lo largo del tiempo con esta relación. Hasta las 2 horas de digestión con tripsina, la r-PhyA conservaba todavía el 90% de su actividad original (Figura 2). En cambio, la r-AppA perdió el 64%, 77%, 87% y 95% de su actividad original después de una digestión de 1, 5, 30 y 120 minutos respectivamente.

Ejemplo 4 Efecto de la digestión con pepsina sobre las actividades de fitasa de ambas enzimas

Después de 2 horas de digestión con pepsina la actividad de fitasa residual de la r-AppA fue completamente inesperada. En los valores correspondientes a las relaciones de 0,001 y 0,002 la actividad de fitasa o permaneció inalterable o se incrementó ligeramente. En los valores correspondientes a las relaciones de 0,005 y 0,01, la actividad de fitasa aumentó en el 30% comparada con el valor inicial. Sin embargo, la r-PhyA perdió el 58% y el 77% de su actividad original a estas dos relaciones altas (Figura 1B). Debido a las respuestas significativamente diferentes entre la r-PhyA y la r-AppA a la relación de 0,005, esta relación se utilizó para realizar un estudio de seguimiento a lo largo del tiempo. Hubo un aumento paulatino de la actividad de fitasa a lo largo del tiempo cuando la r-AppA se incubó con pepsina de 0 min a 30 min. Después de este tiempo, no se observó aumento posterior (Figura 2). Sin embargo, la
r-PhyA perdió el 42%, 73%, 82% y 92% de su actividad original después de una incubación de 1, 5, 30 y 120 minutos respectivamente.

Ejemplo 5 Electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS

Cuando la r-AppA se incubó con tripsina, la proteína enzimática fue degradada en los valores de las relaciones superiores a 0,01 y se hizo invisible en la relación de 0,025. Se encontró una banda principal de 28 kDa, con varias otras bandas situadas entre esta banda y la proteína intacta, en los valores correspondientes a las tres relaciones de tripsina bajas. Sin embargo, esa banda principal se encontraba claramente reducida y las otras bandas desaparecían a la relación más alta de tripsina (Figura 3A). Se encontraron muchas bandas intermedias cuando la r-PhyA se incubó con distintas cantidades de tripsina y se encontraron al menos tres bandas visibles en el valor correspondiente a la relación más alta de tripsina (Figura 3B). Una banda única de aproximadamente 8,4 kDa apareció cuando la r-AppA se incubó con pepsina a una relación superior a 0,002 (Figura 4A). Por otra parte, la proteolisis de la r-PhyA producida por diferentes cantidades de pepsina dio como resultado la aparición de muchas bandas difusas y borrosas, además de un fragmento principal de aproximadamente 14 kDa (Figura 4B).

Ejemplo 6 Efectos de la proteolisis sobre la hidrólisis del fósforo fítico por acción de la r-PhyA y la r-AppA

Cuando la r-AppA se incubó con una harina de soja y con diferentes cantidades de tripsina durante 2 h a 37ºC, la disminución en el iP liberado de la harina de soja fue del 3%, 13%, 34% y 52%, en las relaciones de 0,001, 0,005, 0,01 y 0,025 respectivamente (Figura 5A). Al mismo tiempo, la disminución debida a la r-PhyA en las mismas condiciones fue de 3%, 6%, 13% y 28% respectivamente. La adición de pepsina a la mezcla de la r-AppA (relación 0,005) y harina de soja dio como resultado un aumento de aproximadamente el 30% en el iP liberado de la harina de soja, comparado con el del control (Figura 5B). En cambio, los mismos tratamientos produjeron una disminución de más del 50% en la liberación de iP por acción de la r-PhyA.

Hasta la fecha, no se han obtenido datos específicos sobre las sensibilidades de las fitasas microbianas frente a tripsina y pepsina. En este estudio, dos fitasas recombinantes parcialmente purificadas se expusieron a digestiones con solo una proteasa y se midieron los efectos de las proteolisis sobre sus actividades residuales y sobre la capacidad de estas fitasas para liberar el fósforo fítico procedente de harina de soja. Estos resultados han demostrado que la r-PhyA es más resistente a la tripsina y menos resistente a la pepsina que la r-AppA. Los patrones proteolíticos de estas dos fitasas, mostrados mediante análisis por SDS-PAGE, también son claramente diferentes. Presumiblemente, estas diferentes susceptibilidades frente a las proteasas entre la r-PhyA y la r-AppA pueden estar asociadas con las características que presentan de secuencia de aminoácidos primaria y de plegamiento de los péptidos, debido a que existe una baja homología (-15%) entre las secuencias de aminoácidos de estas dos enzimas (17, 18). Sin embargo, se debe tener cautela en la consideración del mecanismo molecular de la proteolisis de las fitasas, consideración que sobrepasa el alcance original del presente estudio. Los recientes avances en la cristalización y(o) en análisis preliminares con rayos X de la fitasa PhyA (26) y de una fitasa de E. coli (27), quizá contribuyan al conocimiento de las bases estructurales de sus respuestas proteolíticas.

Inesperadamente, la r-PhyA mostró un aumento del 30% en la actividad de fitasa residual después de la digestión con pepsina. Así mismo, esta enzima también liberó el 30% más de iP de la harina de soja en presencia de pepsina. En los análisis de SDS-PAGE se observa que la r-AppA fue claramente degradada en péptidos pequeños por acción de la pepsina a lo largo de los diferentes períodos de incubación. Probablemente, puede ser que existan polipéptidos potenciales resistentes a pepsina, con una actividad de fitasa mayor que la de la proteína r-AppA intacta. Aunque el análisis de SDS-PAGE no ofreció ninguna información específica sobre estos péptidos, se ha observado que la pepsina convierte proteínas naturales o sintéticas en polipéptidos activos, tal como la conversión de la endotelina porcina en una endotelina activa de 21 residuos (28). La pepsina también puede modular la estructura y funciones de algunas proteínas (29, 30). Según se ha mencionado anteriormente, la disponibilidad de los recientes datos obtenidos por cristalización sobre la phyA (26) y las fitasas de E. coli (27), facilitaría dirigir las mutagénesis o las deleciones de sitio específico del gen appA. Por lo tanto, puede ser posible descubrir los mecanismos moleculares del aumento de la actividad de fitasa de la r-AppA asociados con la hidrólisis por acción de pepsina. A pesar de la incertidumbre bioquímica de los péptidos r-AppA resistentes a pepsina, este descubrimiento tiene una gran implicación nutricional. Ya que la pepsina, una aspártico-proteasa perfectamente descrita, es la principal proteasa en el estómago (31), los polipéptidos de fitasas resistentes a pepsina permitirían aportar a las dietas suplementos de un nivel bajo de enzima con actividad suficiente. De esta manera, se reducirá el coste del uso de fitasa dietética en producción animal.

Es difícil comparar los niveles de actividad de las proteasas usadas en el presente estudio con los de las condiciones fisiológicas, porque las concentraciones in vivo de pepsina y tripsina no han sido bien descritas. Se ha publicado una actividad media de la tripsina de 20 a 25 U/mg de proteína en intestino de cerdo (32), que es una actividad mucho más alta que la de las dosis aquí utilizadas. Sin embargo, se usaron múltiples niveles de tripsina y pepsina, con unas diferencias que variaban de 10 a 25 veces entre el nivel más bajo y el nivel más alto. Además, el iP liberado de la harina de soja por acción de la r-AppA o la r-PhyA se midió en presencia de pepsina o tripsina, condición de una digestión simulada in vivo. Aunque tanto la r-AppA como la r-PhyA se encontraban parcialmente purificadas, todos los datos apuntaron consistentemente hacia unos modelos de respuesta diferentes de estas dos enzimas recombinantes frente a pepsina y tripsina. Por ello, esta observación in vitro podría tener importancia en condiciones fisiológicas.

Ejemplo 7 Materiales y métodos correspondientes a los Ejemplos 8-12

Aislamiento y purificación de colonias bacterianas productoras de fitasas. Se obtuvieron los contenidos de colon de cerdos cruzados Hampshire-Yorkshire-Duroc (de 13 semanas de edad) criados en condiciones de confinamiento en la granja porcina de la Universidad de Cornell. Estos cerdos fueron alimentados con una dieta práctica de harinas de maíz-soja. Inmediatamente después de que los cerdos fueran sacrificados, se extrajo el contenido del colon mediante procedimientos asépticos y se guardó en bolsas de plástico estériles para anaerobiosis. Una muestra de 10 g se diluyó con 190 ml de un medio anaerobio de glucosa y fluido de rumen, en un matraz Erlenmeyer de 250 ml provisto de tapón de caucho. La mezcla se agitó vigorosamente durante 3 min en atmósfera de CO_{2}. Se realizaron las consiguientes diluciones seriadas sucesivas.

Las muestras diluidas se cultivaron a 37ºC durante 3 días en un medio modificado de Agar-celobiosa-glucosa-fluido de rumen, que contenía fitato cálcico insoluble (43, 44). Las colonias que presentaban una zona clara se ensayaron como productoras potenciales de actividad de fitasa intracelular y extracelular. La actividad de fitasa se midió usando fitato sódico como sustrato (24). Una unidad de fitasa (PU) se definió como la actividad que libera un \mumol de fósforo inorgánico procedente de fitato sódico, por minuto a 37ºC. La actividad de fosfatasa ácida se determinó utilizando como sustrato fosfato de p-nitrofenilo (P-NPP) (del inglés, " P-Nitrophenil Phosphate") conforme a las instrucciones del fabricante (Sigma, St. Louis, MO). La identificación de la colonia seleccionada se realizó en el Diagnostic Laboratory of Cornell Veterinary College (Ithaca, NY). Las características morfológicas y fisiológicas de la colonia aislada se determinaron mediante procedimientos estándar.

Amplificación y secuenciación de DNA. Debido a que la colonia que produjo las actividades más altas de fosfatasa ácida y de fitasa fue identificada como una cepa de E. coli, para aislar el gen se usaron cebadores derivados de la secuencia de DNA del gen de la fosfatasa ácida de pH 2,5 de E. coli, (appA, GeneBank, número de registro 145283) (18). Los cebadores Pf1 [directo: 1-22]: 5'-TAAGGAGCAGAAACAATGTGGT-3' (SEQ. ID. No. 4), E2 [directo: 254-264]: 5'-GGAATTCCAGAGTGAGCCGGA-3' (SEQ. ID. No. 5), y K2 [inverso: 1.468-1.491]: 5'-GGGGTACCTTACAAACTGCACG-3' (SEQ. ID. No. 6) se sintetizaron en la Oligonucleotide Synthesis Facility de la Universidad de Cornell. La secuencia completa y la región codificadora se amplificaron usando los cebadores
[Pf1-K2] y [E2-K2] respectivamente. La mezcla de la reacción de PCR (100 \mul) contuvo 500 ng de DNA genómico usado como molde, 100 pmoles de cada uno de los cebadores, 5 U de la DNA-polimerasa AmpliTaq (Perkin Elmer, Norwalk, CT), Tris-HCl 10 mM pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl_{2} 12,5 mM y una concentración 200 \muM de cada uno de los dNTP (Promega, Madison, WI). La reacción se realizó con el sistema GeneAmp PCR 2400 system (Perkin Elmer). El programa térmico incluyó 1 ciclo de 94ºC (3 min), 30 ciclos de [94ºC (0,8 min), 54ºC (1 min) y 72ºC (2 min)] y un ciclo de 72ºC (10 min). Los productos amplificados resultantes de la PCR se resolvieron mediante electroforesis en gel de agarosa de bajo punto de fusión al 1% (Gibco BRL, Grand Island, NY). Una tira de gel que contenía la banda del tamaño esperado se recortó y su DNA se eluyó con el kit GENECLEAN II (Bio101, Vista, CA). Los productos resultantes de la PCR se secuenciaron en la DNA Service Facility de la Universidad de Cornell usando un secuenciador automático Taq Cycle con terminadores Dye Deoxy (Applied Biosystems, Forster City, CA). Los experimentos de secuenciación se realizaron 5 veces y la secuencia de aminoácidos deducida se alineó con las de otras fosfatasas ácidas y fitasas usando el programa Multi-align Program CLUSTAL BLAST (45). Los dos fragmentos de PCR identificados [Pf1-K2] y [E2-K2] fueron descritos respectivamente como appA2 y appA2 en el texto que viene a continuación. Con fines comparativos, el gen appA se amplificó procedente de E. coli BL21 (DE3) usando los cebadores [E2-K2]. Las reacciones de PCR y los fragmentos resultantes se procesaron de la manera anteriormente descrita.

Subclonación y construcción de vectores de expresión. Los productos [E2-K2] y [Pf1-K2] resultantes de la PCR se clonaron en el vector pGEM®T-easy (Promega) conforme a las instrucciones del fabricante y se utilizaron para transformar TOP10F para el escrutinio de las colonias positivas. Los fragmentos appA2 y appA aislados se insertaron en pPICZáA (Invitrogen, San Diego, CA) en los sitios EcoRI y KpnI, según se describe en las instrucciones del fabricante. Estas construcciones se utilizaron para transformar células TOP10F que se sembraron en placa en medio LB que contenía 25 \mug de zeocina/ml. Las colonias positivas se cultivaron después para preparar DNA para la transformación.

Transformación y expresión en levaduras. La cepa X33 de Pichia pastoris (Invitrogen) se cultivó en medio YPD y se preparó para la transformación, conforme a las instrucciones del fabricante. Se linearizaron 2 \mug del DNA plasmídico usando BglII y luego se utilizaron para transformar Pichia por electroporación. Después de una incubación durante 3 h a 30ºC en sorbitol 1 M y sin agitación, las células se sembraron en placa en un medio de agar YPD-zeocina para el escrutinio de la integración del gen responsable de la transformación en la región 5'AOX1 del DNA cromosómico hospedador. Después de 2 días, los transformantes se incubaron en medio mínimo con glicerol (medio GMGY) durante 24 h. Después de que el cultivo hubo alcanzado una densidad de aproximadamente 2,5 x 10^{8} células/ml
(OD_{600} = 5), las células se sedimentaron por centrifugación (3.500 g, 5 min) y luego se suspendieron en medio con metanol al 0,5% (medio GMMY) para inducir la expresión del gen de fitasa.

Cuantificación de RNA. El RNA total se extrajo de los transformantes appA2 a diferentes tiempos después de la inducción. El RNA se separó en gel de agarosa-formaldehído al 1%, se transfirió a una membrana Hybond N+ (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) mediante transferencia capilar y se sometió a reticulación con luz UV durante 2 min. La membrana se sometió luego a una prehibridación durante 4 h a 42ºC. La sonda fue el fragmento appA2 [E2-K2] resultante de la PCR, y estaba marcada con [\alpha-^{32}P]-dCTP (DuPont, Boston, MA) usando bolitas Ready-To-Go TM DNA Labeling Beads (Amersham Pharmacia Biotech). La membrana se hibridó con la sonda toda la noche a 42ºC, y se lavó tres veces durante 20 min a 25ºC y dos veces a 50ºC en SSC 2X (NaCl 0,15 M, citrato sódico 0,015 M), dodecilsulfato sódico (SDS) al 1% y por último dos veces a 50ºC en SSC 0,2X , SDS al 0,1%. El autorradiograma se produjo exponiendo la membrana a una pantalla intensificadora de BAS-III FUJI Imagine Plate (Fuji, Japón) durante 10 h y se cuantificó usando un Bio-Imaging Analyzer (Kohshin Graphic Systems, Fuji, Japón). Los resultados se normalizaron con los niveles relativos de rRNA 18S.

Purificación de las enzimas expresadas. Todas las operaciones se llevaron a cabo a 4ºC. Las dos enzimas r-appA y r-appA2 expresadas, y la fitasa r-phyA expresada en A. niger (amablemente proporcionada por BASF, Mt. Olive, NJ), se suspendieron en Tris-HCl 50 mM, pH 7, con una saturación del 25% de sulfato amónico. La suspensión se centrifugó luego a 25.000 g durante 20 min. El sobrenadante se mezcló con sulfato amónico saturado al 75%, con agitación, durante 12 h, y la mezcla se centrifugó a 25.000 g durante 20 min. El sedimento se suspendió luego en 10 ml de Tris-HCl 25 mM, pH 7, y se dializó toda la noche frente al mismo tampón. La muestra dializada se cargó en una columna de DEAE-Sepharose (Sigma) equilibrada con Tris-HCl 25 mM, pH 7. Después de que la columna se hubo lavado con 200 ml del mismo tampón, la fitasa unida se eluyó con NaCl 1 M en Tris-HCl 25 mM, pH 7. Se reunieron las tres fracciones que exhibieron las actividades más altas de fitasa y de fosfatasa ácida y se dializaron frente a Tris-HCl 25 mM, pH 7,5, durante toda la noche, para los estudios que vienen a continuación.

Análisis electroforéticos. La concentración de proteína se midió mediante el método de Lowry (21). Una electroforesis en gel no desnaturalizante y una SDS-PAGE (15%) se realizaron de la manera descrita por Laemmli (22). Las proteínas en la SDS-PAGE se tiñeron con azul brillante de Coomassie R-250. La actividad de fosfatasa ácida o de fitasa presente en las bandas del gel no desnaturalizante se detectó de la manera previamente descrita (17). Después de la electroforesis, el gel se incubó durante 20 min a 25ºC en \alpha-19-naftilfosfato (o fitato sódico) al 0,2%, sales Fast Garnet GBC al 0,1%, CaCl_{2} 1 mM y tampón de Tris-HCl 0,5 M, pH 7,0.

Desglicosilación de las enzimas. La desglicosilación de la r-appA2 se hizo usando 0,3 IU de la endoglicosidasa H_{f} (Endo H_{f}) durante 4 h a 7ºC conforme a las instrucciones del fabricante (New England Biolabs, Beverly, MA). Las proteínas desglicosiladas se analizaron en una SDS-PAGE al 15% según se ha descrito anteriormente.

Propiedades de las enzimas e hidrólisis del fósforo fítico contenido en harina de soja. La actividad de fitasa a diferentes pH se determinó a 33ºC usando tres tampones diferentes. La temperatura óptima de cada una de las enzimas se determinó a su pH óptimo. Los valores de K_{m} y V_{max} correspondientes a la r-appA2 y la r-appA se determinaron al pH óptimo de cada una de las enzimas y a 37ºC. La hidrólisis del fósforo fítico producida por la r-appA2 se comparó con la producida por la r-appA y la r-phyA. Se incubaron cantidades diferentes de las enzimas purificadas con 1 g de harina de soja en 5 ml de tampón (HCl 10 mM o citrato 0,2 M) a sus respectivos pH óptimos (2,5 en el caso de la r-appA, 3,5 en el caso de la r-appA2 y 5,5 en el caso de la r-phyA) a 37ºC durante 2 h. El fósforo inorgánico liberado se determinó de la manera previamente descrita (25). Se compararon las termoestabilidades de estas tres enzimas. Cada una de las enzimas (2 mg/ml) se diluyó en proporción 1:200 en citrato sódico 0,2 M, pH 5,5, y se incubó durante 20 min a 25ºC, 37ºC, 55ºC, 65ºC, 80ºC y 100ºC. Las muestras se pusieron sobre hielo durante 30 min y la actividad de fitasa remanente se midió a 37ºC.

Prueba estadística utilizada. La prueba U de Mann-Withney se utilizó en todas las evaluaciones estadísticas (46).

Ejemplo 8 Escrutinio e identificación de las colonias bacterianas

Se aislaron un total de 93 colonias. Más de 70 colonias presentaron una actividad de fitasa intracelular menor que 500 U/g de proteína y 6 colonias presentaron actividades mayores que 1.000 U/g de proteína. La colonia 88 mostró la actividad de fitasa más alta (2.927 U/g de proteína), con una actividad de fosfatasa ácida de (1.391 U/g de proteína). Por ello, esta colonia se escogió para los experimentos posteriores. La producción de las actividades de fitasa y fosfatasa ácida por parte de esta colonia fueron mayores en Sweet E que en caldo LB, y mayores en condiciones anaerobias que en condiciones aerobias. Posteriormente, esa colonia se identificó como una E. coli Gram negativa. Esto se confirmó, en particular, con el perfil de fermentación del sustrato.

Ejemplo 9 Clonación y secuenciación del gen appA2 procedente de cerdos y de E. coli

Un fragmento de 1.482 pb (longitud completa) y un fragmento de 1.241 pb (región codificadora) se amplificaron procedentes del DNA genómico de la colonia 88 (Figura 6). Excepto en el caso del gen appA de E. coli y en el del gen de fitasa de Bacillus, no se encontraron homologías significativas entre las secuencias en el banco de datos GenPro (versión 61), ni en las bases de datos GeneBank o EMBL usando el programa BLAST. La secuencia de nucleótidos completa presentó una homología del 47% y del 95% con la del gen de fitasa de Bacillus sp. DS11 (GeneBank, número de registro 3150039) y con la del gen appA de E. coli respectivamente. A pesar de esta homología tan alta en las secuencias de nucleótidos, existían diferencias claras entre appA y appA2 y entre los polipéptidos que codifican por ellas. En primer lugar, siete aminoácidos eran diferentes en las secuencias peptídicas deducidas: uno en el péptido señal, L4F; seis en la región codificadora, S102P, P195S, S197L, K202N, K298M y T299A. En segundo lugar, la región que no se traduce de 73 pb, localizada entre la secuencia conductora y la región codificadora, era 6 pb más corta que la de appA. Sin embargo, los tres sitios de N-glicosilación putativos seguían localizados en la región codificadora en el mismo lugar. El fragmento de DNA se secuenció cinco veces para verificar estas diferencias. Comparado con phyA, appA2 presentó una homología en la secuencia de aminoácidos de solamente el 19%. La secuencia se ha transmitido a la biblioteca de datos de GeneBank con el número de registro 250016.

Ejemplo 10 Expresión de appA2 en Pichia pastoris

Un total de 42 transformantes se analizaron con respecto a las actividades de fitasa y de fosfatasa ácida a intervalos diferentes. Tres días después de la inducción con metanol, 13 transformantes produjeron una actividad de fitasa desde 18 U/ml hasta 114 U/ml de medio, y una actividad de fosfatasa ácida desde 7 U/ml hasta 42 U/ml. Entretanto, 22 transformantes appA expresaron una actividad de fitasa desde 25 U/ml hasta 130 U/ml, y una actividad de fosfatasa ácida desde 59 U/ml hasta 85 U/ml. Los transformantes appA2 que presentaron las actividades más altas se usaron en los estudios de la expresión a lo largo del tiempo (Figura 7) y en otros estudios. El nivel de mRNA de appA2 alcanzó el máximo a las 4 h (Figuras 7 y 8), permaneció alto hasta las 12 h, y después declinó significativamente. No se detectó señal de mRNA de appA2 en las células de control. Ambas actividades extracelulares de fitasa y de fosfatasa ácida, producidas por el transformante aumentaron bruscamente entre las 0 y las 24 horas. Después de este tiempo, la actividad de fosfatasa ácida permaneció casi inalterada mientras que la actividad de fitasa aumentó mucho menos con el tiempo que en la fase temprana.

Ejemplo 11 Caracterización de las enzimas purificadas

La actividad de fitasa específica de las enzimas r-appA2, r-appA y r-phyA purificadas fue 28,9 U/mg, 30,7 U/mg y 19,8 U/mg de proteína respectivamente. La r-appA2 purificada presentó una afinidad más alta por fitato sódico que por pNNP, como se muestra por los valores de K_{m} y V_{max} (Tabla 1). Cuando el fitato sódico se usó como sustrato, la curva de pH fue significativamente diferente entre las tres enzimas.

TABLA 1

Parámetros cinéticos de la r-appA y la r-appA2 expresadas en Pichia pastoris y purificadas
		r-appA	r-appA2
Km, mM
	Fitato sódico	1,03	0,66
	p-NNP	2,26	1,43
V_{max}, \mumoles\cdotmin^{-1}\cdotmg^{-1}
	Fitato sódico	89	117
	p-NPP	310	340

El pH óptimo fue de entre 2,5 y 3,5 para la fitasa r-appA2, de 2,5 para la fitasa r-appA y de 5,5 para la fitasa r-phyA (Figura 9). Sin embargo, las dos enzimas de E. coli mostraron el mismo pH óptimo (2,5) para el sustrato pNNP. Además, tanto la r-appA como la r-appA2 presentaron el mismo óptimo de temperatura (55ºC) que fue ligeramente más bajo que el de la r-phyA. Estas dos enzimas también presentaron termoestabilidades muy similares de actividad de fitasa, que fueron ligeramente mas altas entre 37ºC y 60ºC y más bajas entre 65ºC y 100ºC que la de la r-phyA. La actividad de fosfatasa ácida de la r-appA2 que quedó después de tratamientos a temperaturas diferentes se puso de manifiesto en el gel no desnaturalizante, en forma de una banda única de 71 kDa (Figura 10). La actividad se perdió en gran medida o por completo a 65ºC u 80ºC, pero de alguna manera se recuperó parcialmente a 100ºC. Cuando las tres enzimas recombinantes purificadas se incubaron con harina de soja, la proteína r-appA2 liberó significativamente más fósforo procedente de fitato que las otras dos enzimas (Figura 11).

Ejemplo 12 Efectos de la desglicosilación sobre las propiedades de las enzimas

Después de que las tres enzimas purificadas fueran tratadas con \beta-mercaptoetanol y Endo H_{f} se perdieron más del 90% de sus actividades tanto con respecto a fitato sódico como con respecto a pNNP. Pero Endo H_{f} por si solo no tuvo efecto significativo sobre sus actividades catalíticas. La desglicosilación de la r-appA2 produjo una banda única con un Mr aparente de 46,3 kDa en comparación con las tres bandas distinguidas de las formas glicosiladas, con Mr aparentes de 50,5 kDa, 53 kDa y 56 kDa. Esto dio un intervalo de glicosilación para la r-appA2 entre el 8,3% y el 17,3%.

En los ejemplos anteriores, una cepa de E. coli productora de fitasa se aisló procedente de contenido colónico de cerdo. Utilizando cebadores basados en el gen de la fosfatasa ácida de pH 2,5 (appA) de E. coli, descrito por Dassa y col., (18), se amplificó un fragmento de DNA de 1.487 pb a partir del DNA genómico de la cepa. Este fragmento, denominado appA2, codifica una proteína de 433 aminoácidos que contiene tres sitios de N-glicosilación putativos. El péptido deducido contiene tanto el motivo N-terminal (RHGXRXP, posición: 38-44) (SEQ. ID. No. 7) como el motivo C-terminal (HD, posición: 325-326), característicos de las histidina-fosfatasas ácidas (8). Además, lleva una secuencia conductora de 30 aminoácidos y una región que no se traduce de 73 pb. Entre las bases de datos de secuencias disponibles, únicamente los genes de la fosfatasa ácida de pH 2,5 appA de E. coli y de la fitasa de Bacillus sp. DS11 comparte cierta homología con appA2 (del 95% y 47% en la secuencia de nucleótidos respectivamente. A pesar de esta alta homología entre appA y appA2, existen diferencias claras entre estos dos genes y sus respectivas proteínas. En primer lugar, siete aminoácidos difieren entre estas dos secuencias polipeptídicas deducidas; uno dentro del péptido señal y seis en la región codificadora. En segundo lugar, la región que no se traduce de 73 pb, situada entre la secuencia conductora y la región codificadora, fue 6 pb más corta que la de appA. Todas estas diferencias han sido confirmadas con cinco análisis repetidos de secuenciación de nucleótidos.

Y lo que es más importante, cuando estos dos genes se utilizan para transformar el mismo hospedador, Pichia pastoris, las proteínas r-appA y r-appA2 expresadas muestran de manera diferente las características bioquímicas. Aunque ambas exhiben el mismo pH óptimo de 2,5 para el pNNP, la r-appA2 tiene un pH óptimo amplio entre 2,5 y 3,5 mientras que la r-appA tuvo el pH óptimo a 2,5 para el fitato sódico. Comparada con la r-appA, la r-appA2 presenta una afinidad más alta por ambos sustratos, según se manifiesta por el valor de K_{m} más bajo y por el valor de V_{max} más alto, y libera más fósforo procedente del fitato contenido en harina de soja in vitro. Por lo tanto, la función catalítica de la r-appA2, con respecto a la hidrólisis del fósforo procedente de fosfato o fitato, parece ser mejor que la de la r-appA. Según parece, los cambios de seis aminoácidos en el polipéptido, pueden no ser solo un polimorfismo de la enzima, sino que pueden ser responsables de las diferencias cinéticas observadas. Así, parece razonable afirmar que el appA2 es un gen diferente del appA, aunque se necesita un análisis estructural más definido para elucidar la relación entre los cambios de aminoácidos específicos y las alteraciones funcionales de estas dos enzimas. Será necesario producir primero el cristal de las dos enzimas para futuros estudios estructurales (27).

En estudio previos, se ha publicado que algunas enzimas de E. coli hidrolizan pNNP o fitato sódico (18, 19, 39-41). Greiner y col. (39) caracterizaron dos fitasas de E. coli (P1 y P2). Encontraron que la fitasa P2 de E. coli purificada comparte una gran identidad con la fosfatasa ácida de pH 2,5 de E. coli en la secuencia N-terminal, propiedades químicas y la cinética. Por ello, sugirieron que estas dos enzimas pudieran ser la misma proteína y que la fosfatasa ácida de pH 2,5 de E. coli debería ser considerada más bien como una fitasa. De hecho, tanto la fosfatasa ácida r-appA como la r-appA2 no son solamente capaces de hidrolizar el fitato en forma química pura o el fitato contenido en alimentos naturales, sino que también presentan una afinidad más alta por fitato sódico que por el pNNP. Por lo tanto, estas dos enzimas se podrían clasificar como fitasas.

Comparada con la fitasa P2 purificada (39), la r-appA2 tiene la misma temperatura óptima (55ºC) y una masa molecular similar después de la desglicosilación (46,3 kDa). Tomando como base la SDS-PAGE y los análisis en geles no desnaturalizantes, la proteína es también monomérica. Sin embargo, la r-appA2 tiene un pH óptimo más ácido (de 2,5 a 3,5 frente a 4,5 en el caso de P2) y contiene del 8% al 14% de restos de azúcares debido a la N-glicosilación que tiene lugar en Pichia. La desglicosilación de la r-appA2 con Endo H_{f} reduce el tamaño molecular pero tiene un efecto mínimo sobre su actividad. En cambio, cuando la proteína se incuba con P-mercaptoetanol y Endo H_{f}, las actividades de fitasa y de fosfatasa ácida de la r-appA2 se reducen considerablemente. Esto indica que la enzima requiere enlaces disulfuro para su actividad de fitasa como se ha demostrado anteriormente en el caso de la fitasa de A. ficuum (47).

Aunque las realizaciones preferidas se han expuesto y descrito aquí con detalle, resultará evidente a los expertos en la técnica relevante que se pueden realizar distintas modificaciones, adiciones, sustituciones, etc. sin apartarse del espíritu de la invención, y estas modificaciones se consideran por lo tanto que están dentro del alcance de la invención según se define en las reivindicaciones que vienen a continuación.

Referencias

Las siguientes referencias que aquí se citaron, se incorporan por ello como referencia en esta solicitud:

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Claims (12)

1. Una fosfatasa que tiene actividad de fitasa, que comprende:

un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ. ID. No. 9.

2. La fosfatasa según la reivindicación 1, en la que la fosfatasa se expresa en levaduras.

3. La fosfatasa según la reivindicación 2, en la que la levadura es Pichia pastoris.

4. La fosfatasa según la reivindicación 2, en la que la levadura es Saccharomyces cerevisiae.

5. La fosfatasa según la reivindicación 1, en la que la fosfatasa está codificada por un gen recombinante que comprende:

un promotor;

una región codificadora que codifica la fosfatasa según la reivindicación 1; y

un terminador.

6. Un pienso que comprende la fosfatasa según la reivindicación 1.

7. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la fosfatasa según la reivindicación 1.

8. Un vector que porta la molécula de ácido nucleico según la reivindicación 7.

9. Una célula hospedadora transformada con el vector según la reivindicación 8.

10. La célula hospedadora según la reivindicación 9, en la que la célula hospedadora es una levadura.

11. La célula hospedadora según la reivindicación 10, en la que la levadura es Pichia pastoris.

12. La célula hospedadora según la reivindicación 10, en la que la levadura es Saccharomyces cerevisiae.