ES2248087T3 - Procedimiento para fabricar un producto par aumentar la respuesta inmune de animales de compañia usando una combinacion de antioxidantes. - Google Patents
Procedimiento para fabricar un producto par aumentar la respuesta inmune de animales de compañia usando una combinacion de antioxidantes.Info
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Abstract
El uso de una composición alimenticia para animales domésticos que contiene una combinación de vitamina E, luteína y a-caroteno para fabricar un producto alimenticio para animales domésticos utilizado para mejorar la respuesta inmune de un animal de compañía, en donde el producto alimenticio para animales domésticos comprende de 4 % a 20 % de fibra alimentaria total.
Description
Procedimiento para fabricar un producto para
aumentar la respuesta inmune de animales de compañía usando una
combinación de antioxidantes.
Esta invención se refiere a un método para
fabricar una composición que aumente la respuesta inmune y mejore la
salud en general de animales de compañía como los perros y, más
especialmente, a un método para fabricar una composición que
proporcione cantidades beneficiosas de antioxidantes a la dieta
animal.
Durante los últimos años, ha habido un interés
creciente por las ventajas que representan para la salud los
antioxidantes. Los antioxidantes son nutrientes que compensan el
efecto de las especies de oxígeno reactivo (conocidas también como
radicales libres). Estas moléculas nocivas son subproductos del
metabolismo normal. Los nutrientes antioxidantes compensan los
efectos de los radicales libres uniéndose a estas moléculas,
neutralizándolas y eliminándolas del cuerpo. La limpieza ineficaz de
los radicales libres está relacionada con la producción de daños a
humanos y se cree que produce ciertas enfermedades como Alzheimer,
enfermedades autoinmunes, cáncer, enfermedades cardiovasculares,
cataratas, diabetes, degeneración macular, esclerosis múltiple,
distrofia muscular, pancreatitis, enfermedad de Parkinson y artritis
reumatoide. Los daños ocasionados por la acumulación de estos
radicales libres pueden ser los responsables del proceso de
envejecimiento, pues la acumulación de estos radicales libres, con
el tiempo, causa la supresión de la respuesta inmune que se produce
con la edad, dando lugar a un aumento de la incidencia de
enfermedades entre la población mayor.
Los nutrientes antioxidantes son un grupo de
compuestos que tienen un papel similar de neutralización de
radicales libres nocivos. Este grupo puede incluir vitaminas
comúnmente conocidas como la vitamina A, la vitamina C y la vitamina
E. También incluyen otros compuestos clasificados como carotenoides.
Los ejemplos de carotenoides incluyen
\beta-caroteno, luteína, astaxantina, cantaxantina
y licopeno. Estos compuestos son responsables del desarrollo de la
pigmentación verde, amarilla, anaranjada y rosada que se encuentra
en las frutas, las flores y las verduras. Se sabe que estos
carotenoides desempeñan un papel importante en la modulación del
sistema inmune (por ejemplo, se ha comprobado que la cantaxantina
evita la carcinogénesis inducida químicamente en los ratones y
aumenta la proliferación de linfocitos en las ratas). Se ha
comprobado que la astaxantina y el \beta-caroteno
aumentan la respuesta de los anticuerpos ex vivo de los esplenocitos
de los ratones frente a antígenos T dependientes. Se ha comprobado
que la luteína dietética mejora la proliferación de linfocitos en
los esplenocitos de los ratones.
Aunque todos estos compuestos están clasificados
como antioxidantes, es evidente que no todos funcionan de la misma
manera. Por ejemplo, estudios históricos en humanos demuestran que
las poblaciones que consumen dietas ricas en antioxidantes (es
decir, con una alta ingesta de frutas y verduras) tienen una
incidencia menor de cáncer que otros grupos de personas. No
obstante, los estudios clínicos que proporcionan una suplementación
con antioxidantes como la vitamina E o el
\beta-caroteno no proporcionan por sí solos el
mismo grado de protección. Actualmente se piensa que la combinación
de diferentes nutrientes antioxidantes a bajos niveles proporciona
una ventaja para la salud humana mayor que un único antioxidante a
altos niveles.
Aunque el perro no ha evolucionado con una dieta
basada en altas cantidades de frutas y verduras, sí que cazaba y
comía pequeños herbívoros que consumían plantas con altas
concentraciones de estos compuestos. Por eso, es posible que la
necesidad del perro de consumir antioxidantes haya evolucionado de
manera natural. Por tanto, existe una necesidad en la técnica de
proporcionar antioxidantes beneficiosos a la dieta de un animal de
compañía como un perro para proporcionar ventajas a su salud.
La presente invención proporciona un método para
fabricar una composición que contiene una cantidad eficaz de una
combinación de antioxidantes para aumentar la respuesta inmune y
mejorar la salud general del animal. Preferiblemente, la composición
incluye una combinación de vitamina E, luteína y
\beta-caroteno. Este paquete de antioxidantes
proporciona al animal de aproximadamente 175 a aproximadamente 400
UI de vitamina E por kilogramo de dieta, de aproximadamente 1 a
aproximadamente 50 mg/día de luteína y de aproximadamente 1 a
aproximadamente 50 mg/día de \beta-caroteno. Se ha
comprobado que dicha dieta optimiza las células inmunes de los
perros y aumenta el reconocimiento de vacunas en los perros.
Por tanto, un objeto de la presente invención es
proporcionar un método para fabricar un alimento para animales
domésticos con el fin de aumentar su respuesta inmune y mejorar la
salud en general de animales de compañía como los perros,
proporcionando una cantidad eficaz de una combinación de
antioxidantes a la dieta del animal. Esta y otras características y
ventajas de la presente invención se harán evidentes a partir de la
siguiente descripción detallada, los dibujos que se acompañan y las
reivindicaciones adjuntas.
La Fig. 1 es un gráfico de la concentración de
anticuerpos en perros (mg/dl) por mg de
beta-caroteno/kg de dieta y
La Fig. 2 es un gráfico que ilustra el efecto de
la luteína dietética en el reconocimiento de vacunas en el
perro.
La presente invención proporciona un método para
fabricar una composición que contiene una combinación de
antioxidantes para aumentar la respuesta inmune y mejorar la salud
en general del animal. La combinación de antioxidantes puede ser
administrada al animal como un suplemento o contenida en la dieta
suministrada al animal. Dicho suplemento puede ser en forma de una
pastilla o cápsula, una golosina o galleta o cualquier otra forma
comestible. El término "dieta" se refiere al alimento o bebida
consumidos de forma regular por el animal. Se cree que el uso de una
combinación de antioxidantes proporciona ventajas a la salud en
muchas áreas del sistema inmune, por ejemplo, optimiza la activación
de las células inmunes, aumenta los niveles de anticuerpos y mejora
el reconocimiento de vacunas.
La dieta puede ser cualquier fórmula adecuada de
alimentos para animales domésticos que también proporcione una
nutrición adecuada al animal. Por ejemplo, una dieta canina típica
para su uso en la presente invención puede contener aproximadamente
de 18% a 40% de proteínas crudas, aproximadamente de 4% a 30% de
materias grasas y aproximadamente de 4% a 20% de fibra dietética
total. No obstante, no se requieren proporciones o porcentajes
específicos de éstos u otros nutrientes. La combinación de
antioxidantes se puede mezclar con dicha dieta para proporcionar las
cantidades beneficiosas necesarias.
Con el fin de hacer más fácilmente comprensible
la invención, se incluyen los siguientes ejemplos a título
únicamente ilustrativo y sin limitar el alcance de la invención.
Veinte Beagles jóvenes (con una edad media de 2
años) y 20 Beagles adultos (con una edad media de 9,2 años) fueron
alimentados con una dieta comercial estándar a base de pollo/maíz
formulada para contener 27 UI de vitamina E/kg de dieta
(recomendación del NRC) (dieta de control) durante 1 mes antes de
comenzar el experimento para estabilizar los niveles de vitamina E
en los perros. A continuación, se asignaron de manera aleatoria a
los perros jóvenes y adultos durante 8 semanas dietas que contenían
27 UI de vitamina E/kg de dieta ó 280 UI de vitamina E/kg de dieta.
Antes y después de las 8 semanas de tratamiento dietético se tomaron
muestras de sangre para medir los niveles de vitamina E en plasma y
valorar la respuesta mitogénica de los linfocitos a la ConA
(concanavalina A) y a la PHA (fitohemaglutinina). Antes del
tratamiento dietético, y de manera análoga a lo que ocurre en otras
especies, los perros adultos tenían una respuesta mitogénica a la
PHA y a la ConA significativamente inferior a la de los perros
jóvenes. Sorprendentemente, hubo una reducción significativa en el
nivel de vitamina E en plasma de los perros jóvenes y adultos
alimentados con 27 UI de vitamina E/kg de dieta, siendo los perros
jóvenes los que presentaron un porcentaje de reducción mayor (35% en
los adultos frente al 50% en los jóvenes, P = 0,12). El examen del
contenido en vitamina E de la comida comercial administrada a los
perros del estudio antes de su llegada al centro indicó que, como
media, la comida comercial contenía 60 UI de vitamina E/kg de dieta.
Así, la disminución de los niveles de vitamina E en plasma se puede
atribuir a que los niveles de vitamina E de la dieta de control eran
inferiores a los de la comida comercial para perros. Tanto los
perros jóvenes como los perros adultos que recibieron el suplemento
de vitamina E mostraron un aumento significativo de sus niveles de
vitamina E en plasma, presentando los perros jóvenes un porcentaje
de aumento significativamente superior al de los perros adultos (20%
en los adultos frente al 50% de aumento en los perros jóvenes, P =
0,02). Los perros jóvenes alimentados con 27 UI de vitamina E/kg de
dieta también presentaron una reducción significativa de la
proliferación estimulada por ConA y PHA durante las 8 semanas del
período de alimentación. En los perros suplementados con 280 UI de
vitamina E/kg de dieta no se observó ninguna reducción similar. Los
perros alimentados con 27 ó 280 UI de vitamina E/kg de dieta no
mostraron un cambio significativo en la proliferación de linfocitos
estimulada por mitógenos.
Las hembras Beagle (de 18 a 19 meses de edad; 7 a
9 kg de peso vivo) fueron alimentadas con una dieta basal (The Iams
Co., Lewisburg, OH) que cumplía o excedía los requisitos para todos
los nutrientes esenciales. Los animales fueron alojados en
habitaciones con iluminación (14 h de luz; 10 h de oscuridad) y
temperatura controladas. Se realizó una prueba para estudiar el
perfil de absorción de beta-caroteno tras una única
dosis oral de
beta-caroteno.
beta-caroteno.
Para estudiar la absorción de
beta-caroteno en perros a los que se les había
administrado una única dosis oral de beta-caroteno,
se administró una vez por vía oral a los perros (n = 6/tratamiento)
0, 50, 100 ó 200 mg de beta-caroteno (soluble en
agua fría al 10%; BASF Corp., Ludwigshafen, Alemania). La dosis
apropiada de beta-caroteno se disolvió en 5 ml de
agua y se administró por vía oral utilizando una jeringa de
alimentación. Con el fin de establecer los tiempos de muestreo
adecuados se utilizaron dos perros en un estudio preliminar. A estos
perros se les administró una vez 50 mg de
beta-caroteno y se tomaron muestras de sangre a las
0 (inmediatamente antes de administrar
beta-caroteno), 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 y 24
horas.
El plasma sanguíneo se separó mediante
centrifugación y las concentraciones de
beta-caroteno se analizaron utilizando cromatografía
líquida de alta resolución (HPLC) como se describe a continuación.
Todos los procesos fueron realizados bajo una luz tenue. Con una
mezcla 1:1 de éter dietílico y éter de petróleo en presencia de BHT,
se extrajeron alícuotas de plasma duplicadas, todos los
homogeneizados de leucocitos y todas las fracciones subcelulares con
leucocitos. La fase etérea fue eliminada y desecada bajo una
corriente de nitrógeno. El residuo se reconstituyó con fase móvil
para la determinación de beta-caroteno por HPLC. Las
muestras (50 \mul) se inyectaron en una columna esférica de fase
reversa C-18 de 5 \mum (3,9 x 150 mm; Resolve) y
se eluyeron en una mezcla 47:47:6 (v/v/v) de acetonitrilo, metanol y
cloroformo con un caudal de 1,0 ml/min.
Los resultados de este ejemplo mostraron que las
concentraciones máximas de beta-caroteno se
producían entre 3 y 6 horas después de la dosis y dejaban de ser
detectables a las 24 horas. Posteriormente, se tomaron muestras de
sangre del resto de los perros en los mismos períodos de tiempo. El
plasma se separó utilizando el mismo método y se analizó con
HPLC.
En ninguno de los períodos de tiempo estudiados
se pudieron detectar concentraciones de
beta-caroteno en plasma en perros sin suplementar.
Por el contrario, los perros que habían recibido una dosis oral de
beta-caroteno presentaban un aumento dependiente de
la dosis (P < 0,01) de beta-caroteno en plasma.
Las concentraciones máximas se observaron 6 horas después de la
dosis y fueron uniformes en todos los grupos de tratamiento. A
continuación, se produjo un rápido descenso (P < 0,01) de las
concentraciones de beta-caroteno en todos los perros
suplementados con beta-caroteno. Las concentraciones
no eran detectables transcurridas 24 horas después de la dosis. La
semivida del beta-caroteno en plasma fue
aproximadamente de 3 (dosis de 50 y 100 mg) a 4 (dosis de 100 mg)
horas. Las concentraciones máximas de beta-caroteno
en sangre se produjeron antes en los perros que en los gatos (véanse
los Ejemplos 4 y 5 más abajo). Además, la concentración de
beta-caroteno en el plasma de los perros es
aproximadamente de 10 a 16 veces inferior a la observada en los
gatos después de ajustar las diferencias de peso vivo.
En un segundo estudio, los perros (n =
6/tratamiento) fueron alimentados diariamente a las 08.00 horas
durante 7 días consecutivos con 0, 12,5, 25, 50 ó 100 mg de
beta-caroteno. El beta-caroteno
estaba sobre la superficie del alimento y era administrado en la
comida de la mañana. Se tomaron muestras de sangre una vez al día en
el día 0 (inmediatamente antes de la primera dosis) y,
posteriormente, 6 horas después de cada dosis (días 1 a 7). La
elección de la hora del muestreo de sangre se basó en los resultados
obtenidos en el Ejemplo 1, que mostraban concentraciones máximas de
beta-caroteno 6 horas después de una dosis. El
plasma se aisló y se analizó para determinar las concentraciones de
beta-caroteno.
La administración diaria de
beta-caroteno a perros durante 7 días produjo un
aumento dependiente de la dosis (P < 0,01) del
beta-caroteno circulante. Los perros alimentados con
100 mg de beta-caroteno mostraron el máximo aumento
de concentraciones diarias de beta-caroteno en
plasma. Las concentraciones máximas (18 \mug/l) de
beta-caroteno en plasma el día 1 en los perros
alimentados con 100 mg de beta-caroteno de este
ejemplo fueron similares a las observadas en el primer estudio. Las
concentraciones de beta-caroteno en plasma después
de la última dosis fueron, en general, de 2,5 a 4 veces superiores a
las observadas después de la primera dosis.
Se diseñó un tercer estudio para analizar la
absorción de beta-caroteno en los linfocitos
sanguíneos de los perros. Los perros (n = 8/tratamiento) recibieron
0, 50 ó 100 mg de beta-caroteno diariamente durante
30 días. Los días 10, 20 y 30 se tomaron muestras de sangre de todos
los perros a través de la vena yugular. Se separaron los linfocitos
y los neutrófilos de la sangre mediante centrifugación en gradiente
de densidad. Se hizo un recuento de células. Los linfocitos y los
neutrófilos se resuspendieron en PBS que contenía 3% de ascorbato
sódico como antioxidante. Se sonicó una alícuota de la suspensión de
células durante 30 segundos para romper las células. Se extrajeron
los homogeneizados de leucocitos para analizar por HPLC el
beta-caroteno.
El día 30 se tomó una alícuota de sangre mayor y
se prepararon suspensiones de leucocitos como se ha descrito
anteriormente para su posterior fraccionamiento subcelular. Se
rompieron las células mediante sonicación durante 20 segundos en 5
volúmenes de solución 0,25 M de sacarosa. Se añadió ascorbato sódico
como antioxidante. El homogeneizado se centrifugó (600 x g durante
10 min a 4ºC) y se separó el pelet nuclear del sobrenadante. El
sobrenadante postnuclear se centrifugó (17.300 x g durante 20 min a
4ºC) para separar la fracción mitocondrial. El sobrenadante
postmitocondrial se centrifugó (102.000 x g durante 60 min a 4ºC)
para separar la fracción microsomal de la fracción citosólica. Todas
las fracciones subcelulares fueron analizadas por HPLC para
determinar su contenido de beta-caroteno.
El día 0 (antes de la suplementación con
beta-caroteno), las concentraciones de
beta-caroteno en los linfocitos periféricos
sanguíneos eran indetectables en todos los perros. También el
beta-caroteno en los linfocitos de los perros sin
suplementar permaneció indetectable a lo largo del estudio. Por el
contrario, las concentraciones de beta-caroteno en
los linfocitos de los perros alimentados con
beta-caroteno, en general, aumentaron (P < 0,01)
de manera dependiente del tiempo. En los tratamientos no se apreció
una diferencia significativa entre las concentraciones de
beta-caroteno en los linfocitos al comparar los
perros alimentados con 50 mg de beta-caroteno y los
alimentados con 100 mg de beta-caroteno.
El beta-caroteno no era
detectable en las diversas fracciones subcelulares de linfocitos
obtenidas de los perros sin suplementar. Por el contrario, todas las
fracciones subcelulares de linfocitos sanguíneos aisladas en los
perros suplementados con beta-caroteno habían
absorbido beta-caroteno. A la fracción de citosol le
correspondía del 52% al 62% del total de
beta-caroteno de los linfocitos, mientras que los
núcleos contenían la cantidad menor (6% a 8%) del total de
beta-caroteno. La mitocondria (14% a 17%) y los
microsomas (16% a 23%) estaban en un nivel intermedio entre el
citosol y el núcleo. La dosis de beta-caroteno
dietética no tuvo una influencia significativa sobre la absorción de
beta-caroteno por las fracciones subcelulares el día
30 de alimentación. Los resultados muestran que todas las fracciones
subcelulares de linfocitos absorbieron
beta-caroteno. No obstante, el nivel de
beta-caroteno fue máximo en el citosol.
Al igual que los linfocitos, los neutrófilos
sanguíneos absorben beta-caroteno del mismo modo.
Sin embargo, a diferencia de los linfocitos, la absorción máxima
ocurrió el día 10 sin que se observara un aumento posterior en las
concentraciones de beta-caroteno en los neutrófilos
el día 30. El citosol, la mitocondria y los microsomas de los
neutrófilos sanguíneos también presentaron una absorción
significativa de beta-caroteno. Por el contrario, no
se detectó beta-caroteno en los núcleos. Al igual
que ocurre en las fracciones subcelulares de linfocitos sanguíneos,
el nivel de beta-caroteno fue máximo (61 a 68) en la
fracción citosólica de los neutrófilos sanguíneos. No se observó
ningún efecto dependiente de la dosis.
En un cuarto estudio se suplementó diariamente
con 0, 25, 50 ó 100 mg de beta-caroteno a hembras
Beagle (de 4 a 5 meses de edad) para estudiar el papel del
beta-caroteno dietético en la mejora del sistema
inmunitario mediado por células y del sistema inmunitario humoral
del perro. En todos los animales o en los linfocitos sanguíneos
periféricos se evaluaron los siguientes parámetros: (1)
hipersensibilidad retardada (DTH) frente a PHA (inmunidad no
específica) y vacuna (inmunidad específica), (2) proliferación de
linfocitos, (3) poblaciones de linfocitos y (4) inmunoglobulinas
(Ig).
La suplementación con
beta-caroteno aumentó las concentraciones de
beta-caroteno en plasma de manera dependiente de la
dosis pero no influyó en el retinol o el
alfa-tocoferol en plasma. En general, estos cambios
reflejaron la respuesta DTH tanto al antígeno específico (vacuna)
como al no específico (PHA). La mayor respuesta a la prueba de
provocación con PHA se observó en los perros alimentados con 50 mg
de \beta-caroteno, mientras que los perros
alimentados con 20 mg o con 50 mg de beta-caroteno
mostraron una respuesta DTH a la vacuna significativamente superior.
La hipersensibilidad retardada es estrictamente una reacción celular
que afecta a las células T y a los macrófagos, sin implicar ningún
componente de anticuerpos. Las células que presentan antígenos (por
ejemplo, los macrófagos) presentan el antígeno o el alergeno a las
células T que se activa y libera linfocinas. Estas linfocinas
activan a los macrófagos y los convierten en destructores voraces de
los invasores externos. Por tanto, los datos muestran una elevada
respuesta mediada por células en los perros alimentados con
beta-caroteno.
La alimentación con beta-caroteno
también produjo cambios significativos en los subconjuntos de
linfocitos. Con respecto a los controles, los perros alimentados con
20 mg o 50 mg de beta-caroteno tenían una elevada
población de células CD4+ (semana 8). Los perros alimentados con 20
mg de beta-caroteno también tenían una elevada
población de células CD8 en las semanas 2 y 4. Las células T se
pueden clasificar según la expresión de las moléculas CD4 de la
membrana. La molécula CD4 funciona como molécula de adhesión y como
un co-receptor co-señalizador.
Interviene en la activación de las células T. Los linfocitos T CD4+
reconocen el antígeno asociado a las moléculas MHC de clase II y
funcionan en gran parte como células auxiliares. El aumento de la
población de células T auxiliares en este estudio puede explicar el
correspondiente aumento de la respuesta DTH de los perros
alimentados con de 20 mg a 50 mg de
beta-caroteno.
Las concentraciones de IgG, IgM e IgG total
aumentaron significativamente en los perros alimentados con
beta-caroteno ya desde la semana 1 después de la
suplementación dietética. Los aumentos de Ig fueron dependientes de
la dosis en los perros alimentados con de 0 mg a 20 mg de
beta-caroteno. El nivel más alto de
beta-caroteno (50 mg) no produjo un aumento
adicional. Los perros alimentados con 20 mg de
beta-caroteno tenían, consistentemente, la mayor
respuesta de ambos anticuerpos Ig. Una de las principales funciones
del sistema inmune es la producción de anticuerpos que circulan
libremente para proteger el cuerpo contra materiales externos. Los
anticuerpos sirven para neutralizar toxinas, inmovilizar ciertos
microorganismos, neutralizar la actividad viral, aglutinar
microorganismos o partículas antígenas y precipitar antígenos
solubles.
La alimentación con beta-caroteno
no influyó en la blastogénesis de linfocitos inducida por mitógenos
ni en la producción de IL-2. Los linfocitos están
implicados en la inmunidad mediada por células. Tras reconocer un
antígeno, los linfocitos se dividen rápidamente, clonándose para
prepararse a combatir una posible invasión. En la respuesta inmune
humoral, la IL-2 estimula tanto a las células T
auxiliares como a las células B para que proliferen y respondan a
los antígenos. Es necesaria para la expansión clonal de las células
T activadas por antígenos o por mitógenos. En la respuesta inmune
mediada por células, la IL-2 activa a las células
asesinas naturales, estimula la proliferación de timocitos e induce
la actividad de las células T citotóxicas.
Según los resultados de estos experimentos, el
perro absorbe una cantidad significativa de
beta-caroteno de la dieta y transfiere el
beta-caroteno a las organelas subcelulares de las
células inmunes y los fagocitos. En estas células, el
beta-caroteno parece mejorar el sistema inmune del
perro mediante la mejora de las respuestas inmunes mediadas por
células (respuesta DTH, desplazamiento en los subconjuntos de
linfocitos) y de la respuesta humoral (producción de IgG y de
IgM).
Cincuenta y seis hembras Beagle (de 17 a 18 meses
de edad; peso vivo promedio de 11,4 \pm 0,4 kg) fueron asignadas
de manera aleatoria para recibir una suplementación diaria con 0, 5,
10 ó 20 mg de luteína durante 17 semanas. La luteína contenía 76,66%
de luteína y 5,23% de zeaxantina. El suplemento de luteína fue
resuspendido en aceite de soja a una concentración adecuada y
administrado oralmente, en dosis de 1 ml, a las 08.00 h cada día.
Inmediatamente después de la suplementación con luteína se ofrecía
comida (200 g/perro/día). La dieta basal cumplía o excedía los
requisitos en cuanto a todos los nutrientes esenciales (NRC, 1985).
Todos los perros fueron alojados en corrales de 2 x 2 m (2
perros/corral) con temperatura (20 a 22ºC) e iluminación (14 h de
luz) controladas. Se registró el peso vivo en las semanas 0, 6 y
12.
En las semanas 0, 2, 4, 8 y 12 se recogió,
mediante punción venosa en la yugular, sangre en tubos al vacío
heparinizados y se utilizaron alícuotas para realizar análisis por
HPLC y evaluar las respuestas inmunes.
Se extrajo sangre para realizar análisis de
luteína, zeaxantina, retinol y alfa-tocoferol.
Brevemente se precipitó la proteína del plasma añadiendo un volumen
igual de etanol que contenía 0,1% de butil hidroxitolueno (BHT)
(Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI). La mezcla se extrajo con 5 ml
de una mezcla 1:1 de éter de petróleo y éter dietílico anhidro.
El residuo seco fue resuspendido en fase móvil
que consistía en una mezcla 47:47:6 (v:v:v) de acetonitrilo de
calidad HPLC: metanol: cloroformo (Fisher Scientific, Fair Lawn,
NJ). La luteína, la zeaxantina y el alfa-tocoferol
se cuantificaron comparando el área bajo la curva mientras que el
retinol se cuantificó utilizando la altura máxima. La identidad de
los compuestos eluidos se confirmó comparando su espectro de
absorción con el de los patrones puros. Dado que no se realizó la
separación en la línea de base entre la luteína y la zeaxantina, las
concentraciones de plasma se indicaron como luteína +
zeaxantina.
En todos los perros se evaluó la respuesta a la
induración de la piel en las semanas 0, 6 y 12. Los perros
recibieron una inyección intradérmica en el área de la ijada con
solución salina (8,5 g/l; control), una vacuna polivalente atenuada
que contenía virus del moquillo canino, adenovirus canino tipo II,
virus de la parainfluenza canina y parvovirus (Vanguard 5,
Smithkline Beacham, West Chester, PA; antígeno específico) y PHA
(0,5 g/l; antígeno no específico). Las dosis de vacuna y de PHA se
determinaron previamente para proporcionar una óptima respuesta
cutánea en los perros Beagle de edades similares. El lugar de la
inyección se pinzó y limpió con alcohol etílico al 70%. El volumen
de la inyección fue de 100 \mul. La induración de la piel se midió
a las 0, 24, 48 y 72 horas después de la inyección con ayuda de un
micrómetro digital sensible a la presión (Mitsutoyo, Tokio, Japón) y
la respuesta se expresó como porcentaje del espesor de la piel
medido a las 0 horas.
La sangre recogida en las semanas 0, 2, 4, 8 y 12
se utilizó para evaluar la proliferación de linfocitos inducida por
mitógenos mediante células mononucleares de sangre periférica
(PBMC). El cultivo de sangre completa se utilizó para simular
condiciones in vivo. Los mitógenos que se utilizaron fueron
fitohemaglutinina (PHA), concanavalina A (Con A) y mitógeno de
fitolaca (PWM). La sangre completa se mezcló cuidadosamente y, a
continuación, se diluyó 1:12 con RPMl-1640 que
contenía 25 mM de Hepes, penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (100
\mug/ml) (Sigma, St. Louis, MO). Los estudios preliminares en los
que se utilizó sangre sin diluir y sangre diluida 1:2, 1:4, 1:8,
1:12 y 1:16 mostraron una respuesta proliferativa de las PBMC óptima
con una dilución 1:12. Con una pipeta, se introdujeron volúmenes de
150 \mul, por triplicado, sobre placas de 96 pocillos de fondo
redondo y se añadieron 50 \mul de los mitógenos apropiados. Las
concentraciones finales de mitógenos en el cultivo fueron de 2 y 10
\mug/ml de PHA, 1 y 5 \mug/ml de Con A y 0,5 y 2,5 \mug/ml de
PWM. Las dos concentraciones de mitógenos dieron respuestas
proliferativas máximas (la concentración más alta de mitógenos) y
subóptimas (la concentración más baja de mitógenos) en estudios
preliminares en los que se utilizó sangre de animales similares. La
mezcla se incubó durante 72 horas a 37ºC en una incubadora
humidificada bajo atmósfera de CO2 al 5%. Cuatro horas antes de
finalizar el período de incubación se añadieron 20 \mul de
timidina tritiada (1 [\muCi/pocillo). Se recogieron las células
sobre filtros de fibra de vidrio y se midió la radioactividad con un
contador de centelleo líquido. La respuesta proliferativa de las
PBMC se expresó como índice de estimulación (cpm de los cultivos
estimulados/cpm de los cultivos no estimulados).
Los leucocitos sanguíneos se separaron utilizando
Histopaque-1119 (Sigma, St. Louis, MO). Las células
se lavaron tres veces con solución salina tamponada con fosfato
(PBS, pH 7,4) y los eritrocitos contaminantes se lisaron con
NH_{4}CI (8,4 g/l). Los subconjuntos de linfocitos se determinaron
mediante citometría de flujo (FACScan, Becton Dickinson, San Jose,
CA). Las células mononucleares aisladas se volvieron a suspender a
una concentración de 1 x 10^{7} células/ml en PBS suplementado con
2% de suero libre de gammaglobulina, 5% de suero de cabra y 0,2 g/l
de azida de sodio. Para el análisis por inmunofluorescencia se
incubaron un total de 5 x 10^{5} células durante 30 minutos sobre
hielo con concentraciones óptimas de anticuerpos monoclonales de
ratón anti-caninos (mAb). Los mAb utilizados eran
específicos para los siguientes subconjuntos de linfocitos: células
T totales (anti-CD5), células T auxiliares
(anti-CD4), células T citotóxicas/supresoras
(anti-CD8), linfocitos que expresan el complejo
mayor de histocompatibilidad (antígenos MHQ de clase II
(anti-MHC de clase II) y células B
(anti-CD21). A continuación se lavaron las células
tres veces y se incubaron con un anticuerpo secundario, IgG+IgM
(H+L) de cabra F(ab')_{2} anti-ratón
conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Caltag,
Burlingame, CA), durante 30 minutos sobre hielo para visualizar el
mAb unido. Las células marcadas se fijaron con paraformaldehído al
4% para prepararse para la captación.
Se incluyeron los controles negativos necesarios
para corregir la fluorescencia de fondo. Los datos se expresaron
como el porcentaje de células con tinción positiva corregido para
las células teñidas de forma no específica con el anticuerpo
secundario.
Para evaluar la actividad citotóxica de las
células NK se utilizaron células de adenocarcinoma de tiroides
canina como células diana. Previamente se había demostrado que esta
línea celular es susceptible de ser destruida por las células NK
caninas. Las células diana se cultivaron en un matraz T75 con 20 ml
de medio esencial mínimo (MEM; Sigma Chem. Co., St. Louis, MO)
suplementado con 10% de suero bovino fetal (FCS), 100 U/ml de
penicilina y
100 \mug/ml de estreptomicina. Tras la confluencia, las células diana fueron tripsinizadas, lavadas 3 veces y resuspendidas a una concentración de 5 x 10^{5} células/ml en medio completo (RPMI-1640 + 10% FCS + 100 U/ml de penicilina + 100 \mug/ml de estreptomicina). Con una pipeta, se introdujeron alícuotas de 100 \mul de las células diana, por triplicado, sobre placas de 96 pocillos de fondo en U (Costar, Cambridge, MA) y se incubaron durante 8 horas para permitir la adherencia celular. Los linfocitos (células efectoras; 100 \mul) aislados mediante separación por percoll (según se ha descrito anteriormente) se añadieron entonces a las células diana para obtener una relación de células efectoras:dianas (E:T) de 10:1. Tras 10 horas de incubación a 37ºC, se añadieron 20 \mul de un sustrato que contenía 5 \mug de bromuro de 3-(4,5-dimeti-tiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT). La mezcla se incubó durante 4 horas a 370ºC, después de las cuales se extrajo el MTT no metabolizado mediante aspiración. Los cristales de formazano se disolvieron añadiendo 200 \mul de etanol al 95%. La densidad óptica se midió a 570 nm utilizando un lector de microplacas. El porcentaje de lisis específica de células NK se calculó del siguiente modo:
100 \mug/ml de estreptomicina. Tras la confluencia, las células diana fueron tripsinizadas, lavadas 3 veces y resuspendidas a una concentración de 5 x 10^{5} células/ml en medio completo (RPMI-1640 + 10% FCS + 100 U/ml de penicilina + 100 \mug/ml de estreptomicina). Con una pipeta, se introdujeron alícuotas de 100 \mul de las células diana, por triplicado, sobre placas de 96 pocillos de fondo en U (Costar, Cambridge, MA) y se incubaron durante 8 horas para permitir la adherencia celular. Los linfocitos (células efectoras; 100 \mul) aislados mediante separación por percoll (según se ha descrito anteriormente) se añadieron entonces a las células diana para obtener una relación de células efectoras:dianas (E:T) de 10:1. Tras 10 horas de incubación a 37ºC, se añadieron 20 \mul de un sustrato que contenía 5 \mug de bromuro de 3-(4,5-dimeti-tiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT). La mezcla se incubó durante 4 horas a 370ºC, después de las cuales se extrajo el MTT no metabolizado mediante aspiración. Los cristales de formazano se disolvieron añadiendo 200 \mul de etanol al 95%. La densidad óptica se midió a 570 nm utilizando un lector de microplacas. El porcentaje de lisis específica de células NK se calculó del siguiente modo:
Citotoxicidad específica (%) = 100
x {1 - [(DO de las células diana - DO de las células
efectoras)/
(DO de las células diana)]}
(DO de las células diana)]}
La sangre completa se diluyó 1:2 con
RPMl-1640 suplementado con Hepes y antibióticos
(según se ha descrito anteriormente) y 400 \mul de la sangre
diluida se colocó sobre placas de 48 pocillos (Costar, Cambridge,
MA) utilizando pipetas. Las células se estimularon con PHA (400
\mul de una solución de 5 \mug/ml) durante 48 horas a 370ºC en
una atmósfera de CO2 al 5%. Las placas se centrifugaron a 200 x g
durante 10 minutos y el sobrenadante se congeló a -80ºC. El
contenido en IL-2 del sobrenadante del cultivo se
determinó por triplicado mediante ELISA (Intergen, Purchase, NY).
Como patrón se utilizó IL-2
anti-humana policlonal en reacción cruzada con
IL-2 canina e IL-2 recombinante
humana.
Los sueros recogidos en las semanas 0, 2, 4, 8 y
12 fueron analizados por inmunodifusión radial simple (SRID) para
determinar las concentraciones de IgG e IgM. Además, todos los
perros fueron vacunados con la vacuna polivalente (Vanguard 5,
Smithkline Beacham, West Chester, PA) en la semana 13 y, de nuevo,
en la semana 15 para estudiar el posible efecto anamnésico de la
luteína dietética. La sangre se recogió semanalmente desde la semana
13 hasta la semana 17. Se mezcló antisuero de cabra
anti-IgG (10%, molécula completa) o IgM (7,5%,
específica de cadena \mu) canina (ICN, Aurora, OH) con agarosa
fundida (10 g/l en PBS; Sigma Chem. Co., St. Louis, MO) y la mezcla
se solidificó en las placas de SRID. Se cargaron los pocillos, por
duplicado, con volúmenes de 5 \mul de suero o patrón de IgG (0,
2,88, 5,75, 11,5 y 23,0 mg/ml) o de IgM (0, 0,25, 0,5, 1,0 y 2,0
mg/ml). Tras incubar durante 24 horas a temperatura ambiente en una
cámara humidificada se midieron los diámetros de los aros utilizando
un lector de SRID (Transidyne General Corp., Ann Arbor, MI).
La actividad de peroxidación lipídica en el
plasma se determinó midiendo la producción de malondialdehído (MDA).
El patrón utilizado fue 1,1,3,3-tetrametoxipropano
JMP) (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO). Utilizando pipetas, se
introdujeron muestras de 500 \mul de plasma, por duplicado, en
tubos de vidrio de 15 ml y se añadieron 3 ml de ácido fosfórico 10
g/l y 1 ml de solución TBA 6 g/l. La mezcla se hirvió en un baño de
agua durante 45 minutos. Los tubos se dejaron enfriar y se extrajo
el complejo TBA-MDA con 4 ml de
n-butanol. La capa de butanol se separó por
centrifugación a 1.000 x g durante 10 minutos y se midió la
absorbencia a 532 nm (Beckman, Fullerton, CA). La actividad TBARS se
expresó en nmol de MDA/l de plasma.
El análisis de los datos se realizó mediante un
ANOVA factorial mixto utilizando el Modelo Lineal General del SAS.
El modelo estadístico fue Y_{ijk} = \mu + Dieta_{i} +
Perro_{j} (Dieta) (término de error utilizado para comprobar los
efectos de la dieta) + Período_{k} + Dieta_{i} *Período_{k} +
e_{ijk}. Las diferencias entre las medias del tratamiento fueron
comparadas utilizando contraste ortogonal y se consideraron
estadísticamente significativas cuando P < 0,05.
Las concentraciones plasmáticas de luteína +
zeaxantina en los perros suplementados con luteína aumentaron
rápidamente después de 2 semanas de alimentación (Figura 1). Las
concentraciones plasmáticas continuaron aumentando a partir de ese
momento, aunque más gradualmente, en los perros alimentados con 10
mg y 20 mg de luteína. Por el contrario, la luteína + zeaxantina en
plasma no era detectable en los perros sin suplementar. Las
concentraciones de luteína + zeaxantina en plasma en las semanas 2 a
12 fueron significativamente superiores (P < 0,05) en los perros
alimentados con luteína que en los animales sin suplementar. La
suplementación con luteína no influyó en las concentraciones de
retinol y alfa-tocoferol en plasma. Por término
medio, las concentraciones de estas vitaminas en todos los
tratamientos y en todos los períodos fueron de 3,63 \pm 0,14 y 37
\pm 2 \mumol/l, respectivamente.
Durante todos los períodos estudiados la
respuesta DTH a la solución salina fue baja (aumento de 3% a 10% del
espesor de la piel) y no fue significativamente diferente entre los
grupos de tratamiento. Antes de administrar la luteína (semana 0),
las respuestas DTH a PHA y a la vacuna fueron similares en todos los
grupos dietéticos. Independientemente del período de tratamiento, la
respuesta DTH máxima a PHA se observó aproximadamente 24 horas
después de la inyección, mientras que la respuesta máxima a la
vacuna se produjo entre las 48 y las 72 horas. También la respuesta
del espesor de la piel a PHA fue aproximadamente dos veces superior
a la de la vacuna.
En la semana 6, hubo una respuesta DTH a PHA
relacionada con la dosis 24 horas después de la inyección. La
respuesta DTH disminuyó a las 48 y 72 horas y no se observó ninguna
diferencia significativa entre los tratamientos en estos tiempos. La
respuesta DTH a la vacuna fue relacionada con la dosis 48 y 72 horas
después de la inyección y no fue significativa a las 24 horas.
En la semana 12 hubo un aumento dependiente de la
dosis general en la respuesta DTH a PHA a las 24, 48 y 72 horas; no
obstante, la respuesta fue significativamente superior en los perros
alimentados con 20 mg de luteína que en los perros sin suplementar.
En contraste con la semana 6, no se observó un efecto dietético
significativo en la respuesta DTH a la vacuna.
La luteína dietética no influyó
significativamente en la proliferación espontánea por PBMC no
estimuladas. No se observó un efecto significativo de la luteína
dietética sobre la respuesta de las PBMC estimuladas por PHA en las
semanas 0 y 4. No obstante, la respuesta proliferativa mejoró (P
< 0,01) en las semanas 8 (10 pg/ml de PHA) y 12 (2 y 10 \mug/ml
de PHA) en los perros alimentados con 20 mg de luteína con respecto
a los perros sin suplementar. Los perros alimentados con 5 mg y 10
mg de luteína también tuvieron una proliferación de PBMC superior en
la semana 8 en respuesta a 10 \mug/ml de PHA.
Los efectos de la luteína dietética sobre la
respuesta proliferativa de PBMC estimulada con Con A fueron en
general similares a los observados en la proliferación inducida por
PHA. En las semanas 8 y 12 los perros alimentados con 20 mg de
luteína tuvieron una proliferación de PBMC superior en respuesta a
ambas concentraciones de Con A. Los perros alimentados con 10 mg de
luteína también mostraron una proliferación de PBMC superior en las
semanas 8 y 12 en respuesta a 5 \mug/ml de Con A. En general, la
proliferación de PBMC fue superior con 5 \mug/ml de Con A que con
1 \mug/ml de Con A.
La proliferación de PBMC en respuesta al PWM fue
similar en general a las observadas con PHA y Con A. Los perros
alimentados con 20 mg de luteína tuvieron una proliferación de PBMC
significativamente superior en las semanas 8 y 12 en respuesta a
ambas concentraciones de PWM que los controles sin suplementar. Los
perros alimentados con 10 mg de luteína también tuvieron una
respuesta proliferativa superior en la semana 8. De nuevo, no se
observó ninguna diferencia significativa entre los tratamientos en
las semanas 0 y 4.
La luteína dietética no influyó
significativamente en la actividad citotóxica de las células NK. Por
término medio, la lisis específica de las células diana mediante
PBMC fue de 49,1 \pm 1,1% en todos los tratamientos y períodos de
muestreo.
Antes de la suplementación con luteína dietética
(semana 0) no había diferencias significativas en los porcentajes de
ninguno de los marcadores de linfocitos. En la semana 12, el
porcentaje de células CD4+ era superior en los perros alimentados
con 5 mg y 10 mg de luteína, mientras que esta dieta no influyó
sobre la población de CD8+. Por otro lado, los perros alimentados
con 20 mg de luteína tenían un porcentaje de células T citotóxicas
CD8+ significativamente superior en la semana 8 que los del control.
La relación CD4:CD8 fue similar entre los tratamientos en las
semanas 0, 4 y 8, pero tendía a ser superior (P < 0,08) en los
perros alimentados con 10 mg (2,5 0 \pm 0,16) que en los del
control (2,10 \pm 0,16).
En las semanas 4 y 8, los perros alimentados con
luteína tenían, en general, porcentajes superiores de células CD5+
que los perros de control sin suplementar y esta diferencia era
estadísticamente significativa en los perros alimentados con 5 mg y
20 mg de luteína. Los perros alimentados con 20 mg de luteína
también tenían porcentajes de poblaciones de células MHC de clase II
en las semanas 8 y 12 más elevados que los perros sin suplementar.
Los perros alimentados con cantidades inferiores de luteína tenían
poblaciones de MHC de clase II similares a las del control.
A diferencia de otras subpoblaciones de
linfocitos, la luteína dietética no afectó significativamente a la
población de células B CD21+.
La producción de IL-2 por parte
de PBMC estimuladas por PHA en cultivos de sangre completa no fue
significativamente diferente entre los tratamientos dietéticos a lo
largo del período experimental. Por término medio, las
concentraciones de IL-2 en el medio de cultivo
fueron por término medio de 15,7 \pm 0,4 ng/ml a lo largo del
estudio.
Las concentraciones de IgG en plasma tendieron a
aumentar (P > 0,05) a lo largo del período de muestreo de 17
semanas. Las concentraciones fueron similares en los distintos
tratamientos dietéticos durante las 12 primeras semanas de
suplementación dietética. No obstante, después de la revacunación en
la semana 15, la IgG en plasma fue superior (P < 0,05) en la
semana 16 en los perros alimentados con 5 mg de luteína (P <
0,05) y en la semana 17 en los perros alimentados con 20 mg de
luteína, mientras que la concentración de IgM en plasma no
varió.
La suplementación con luteína no afectó
significativamente a la actividad TBARS en plasma, cuyo término
medio fue de 95,8 \pm 0,1 nmol de MDA/l en todos los tratamientos
y a lo largo de todos los períodos.
Los resultados muestran que la luteína dietética
mejora significativamente la respuesta inmune mediada por células en
el perro. La suplementación con luteína estimuló la respuesta
proliferativa de PBMC a PHA, Con A y PWM. Se observó un marcado
aumento de la proliferación de PBMC en respuesta a PHA y Con A en la
semana 12 en los perros alimentados con 20 mg de luteína.
Los datos muestran que la mejora en la
mitogénesis mediante luteína dietética se atribuye probablemente a
un aumento de la población de linfocitos. Los perros suplementados
con luteína tenían poblaciones mayores de células CD5+ y CD4+. La
luteína dietética puede actuar específicamente sobre los linfocitos
T porque no se observaron cambios en la población de células B con
la suplementación con luteína.
Los datos también demostraron que la
suplementación con luteína aumentó significativamente la
proliferación de PBMC inducida por PWM en las semanas 8 y 12.
La luteína dietética también aumentó
significativamente la respuesta DTH a vacunas, lo que es indicativo
de una respuesta inmune específica. La suplementación con luteína
aumentó significativamente el número de células con tinción positiva
para las moléculas MHC de clase II con respecto a los perros sin
suplementar.
La luteína no afectó significativamente a la
producción de anticuerpos policlonales (IgG e IgM) ex vivo en
los perros durante las primeras 12 semanas de suplementación. No
obstante, tras la reexposición al antígeno, las concentraciones de
IgG en plasma aumentaron en los perros alimentados con luteína,
sugiriendo un efecto anamnésico de la luteína dietética que aumenta
la capacidad en memoria de las células B para secretar IgG.
En resumen, la luteína dietética mejoró la
población de células T auxiliares caninas y la expresión de
moléculas MHC de clase II, lo que produce un aumento de la
proliferación de PBMC caninas inducida por mitógenos y de la
respuesta DTH. También, se piensa que la luteína aumenta la
producción de Ig.
En la Tabla 1 se muestra un resumen de los
resultados de los diferentes estudios.
\vskip1.000000\baselineskip
| Ventaja | Vitamina E | \beta-caroteno | Luteína |
| Optimizar la actividad de las células inmunes | \ding{51} (Células T) | \ding{51}(Células B) | |
| Optimizar los tipos de células presentes en la sangre | \ding{51} | ||
| Aumentar los niveles de anticuerpos en la sangre | \ding{51} | ||
| Optimizar el reconocimiento de vacunas en el perro | \ding{51} | \ding{51} |
\newpage
La Fig. 1 ilustra un aumento del 20% en los
niveles de anticuerpos en la sangre con la adición de
\beta-caroteno a la dieta.
La Fig. 2 demuestra la capacidad del perro para
reconocer una vacuna. Como se ha mostrado, el reconocimiento mejora
hasta un 32% cuando se añade luteína a la dieta. Esto proporciona al
perro una mejor respuesta a las vacunaciones y una protección
adicional frente a las enfermedades.
Hay que señalar que ningún antioxidante
proporcionó ventajas para todos los aspectos del sistema inmune
examinados. Por ejemplo, aunque tanto la vitamina E como la luteína
optimizaron la activación de las células inmunes, la vitamina E
trabajó sobre las células T y la luteína trabajó sobre las células
B. La mejora de la función de las células T es importante para
luchar contra las infecciones virales y el cáncer, mientras que la
mejora de la función de las células B es importante para luchar
contra las infecciones bacterianas. Por tanto, una combinación de
antioxidantes proporciona un efecto sinérgico sobre el sistema
inmune que supera a las ventajas obtenidas al aumentar el nivel de
un solo antioxidante.
Claims (10)
1. El uso de una composición alimenticia para
animales domésticos que contiene una combinación de vitamina E,
luteína y \beta-caroteno para fabricar un producto
alimenticio para animales domésticos utilizado para mejorar la
respuesta inmune de un animal de compañía, en donde el producto
alimenticio para animales domésticos comprende de 4% a 20% de fibra
alimentaria total.
2. Un uso según la reivindicación 1, en el que
dicha composición incluye de 175 a 400 UI de vitamina E por
kilogramo de dieta, de 1 a 50 mg/día de luteína y de 1 a 50 mg/día
de \beta-caroteno.
3. Un uso según la reivindicación 1, en el que
dicho animal de compañía es un perro.
4. Un uso según la reivindicación 1, en el que
dicho producto alimenticio para animales domésticos comprende de 18
a 40% de proteína en bruto y 4 a 30% de grasa.
5. El uso de una composición alimenticia para
animales domésticos, que contiene una combinación de vitamina E,
luteína y \beta-caroteno para fabricar un producto
alimenticio para animales domésticos que optimice las células
inmunes de un perro.
6. El uso de una composición alimenticia para
animales domésticos, que contiene una combinación de vitamina E,
luteína y \beta-caroteno para fabricar un
producto alimenticio para animales domésticos que optimice el
reconocimiento de vacunas en un perro.
7. Una composición alimenticia para animales
domésticos para mejorar la respuesta inmune de un animal de
compañía, que comprende una combinación de vitamina E, luteína y
\beta-caroteno, en la que dicha composición
comprende de 4% a 20% de fibra alimentaria total.
8. La composición alimenticia para animales
domésticos según la reivindicación 7, que comprende de 175 UI a 400
UI de vitamina E por kilogramo de dieta, de 1 a 50 mg/día de luteína
y de 1 a 50 mg/día de \beta-caroteno.
9. La composición alimenticia para animales
domésticos según las reivindicaciones 7 u 8, en la que dicha
composición comprende de 18 a 40% de proteína en bruto y de 4 a 30%
de grasa.
10. Una composición alimenticia para animales
domésticos según las reivindicaciones 7, 8 ó 9, en la que dicho
animal de compañía es un perro.
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