ES2248087T5

ES2248087T5 - Procedimiento para fabricar un producto para aumentar la respuesta inmune de animales de compañía usando una combinación de antioxidantes.

Info

Publication number: ES2248087T5
Application number: ES00941153T
Authority: ES
Inventors: Michael G. Hayek
Original assignee: Iams Co
Current assignee: Mars Petcare US Inc
Priority date: 1999-05-27
Filing date: 2000-05-26
Publication date: 2012-02-21
Anticipated expiration: 2020-05-26
Also published as: KR20020005050A; CA2372614C; JP2003500076A; EP1179984A1; DE60022024T2; IL146438A0; TR200103413T2; WO2000072698A1; AU5590200A; AU767764B2; ES2248087T3; NZ514727A; US6310090B1; ATE301937T1; EP1179984B2; AU767764C; DE60022024D1; BR0010999A; CN1352529A; ZA200108642B

Abstract

El uso de una composición alimenticia para animales domésticos que contiene una combinación de vitamina E, luteína y ß-caroteno para fabricar un producto alimenticio para animales domésticos utilizado para mejorar la respuesta inmune de un animal de compañía, en donde el producto alimenticio para animales domésticos comprende de 4 % a 20 % de fibra alimentaria total.

Description

Procedimiento para fabricar un producto para incrementar la respuesta inmune en animales de compañía usando una combinación de antioxidantes

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Esta invención se refiere a una composición para potenciar la respuesta inmune en perros.

Durante los últimos años, ha habido un interés creciente por las ventajas que representan para la salud los antioxidantes. Los antioxidantes son nutrientes que compensan el efecto de las especies de oxígeno reactivo (conocidas también como radicales libres). Estas moléculas nocivas son subproductos del metabolismo normal. Los nutrientes antioxidantes compensan los efectos de los radicales libres uniéndose a estas moléculas, neutralizándolas y eliminándolas del cuerpo. La limpieza ineficaz de los radicales libres está relacionada con la producción de daños a humanos y se cree que produce ciertas enfermedades como Alzheimer, enfermedades autoinmunes, cáncer, enfermedades cardiovasculares, cataratas, diabetes, degeneración macular, esclerosis múltiple, distrofia muscular, pancreatitis, enfermedad de Parkinson y artritis reumatoide. Los daños ocasionados por la acumulación de estos radicales libres pueden ser los responsables del proceso de envejecimiento, pues la acumulación de estos radicales libres, con el tiempo, causa la supresión de la respuesta inmune que se produce con la edad, dando lugar a un aumento de la incidencia de enfermedades entre la población mayor.

Los nutrientes antioxidantes son un grupo de compuestos que tienen un papel similar de neutralización de radicales libres nocivos. Este grupo puede incluir vitaminas comúnmente conocidas como la vitamina A, la vitamina C y la vitamina E. También incluyen otros compuestos clasificados como carotenoides. Los ejemplos de carotenoides incluyen �-caroteno, luteína, astaxantina, cantaxantina y licopeno. Estos compuestos son responsables del desarrollo de la pigmentación verde, amarilla, anaranjada y rosada que se encuentra en las frutas, las flores y las verduras. Se sabe que estos carotenoides desempeñan un papel importante en la modulación del sistema inmune (por ejemplo, se ha comprobado que la cantaxantina evita la carcinogénesis inducida químicamente en los ratones y aumenta la proliferación de linfocitos en las ratas). Se ha comprobado que la astaxantina y el �-caroteno aumentan la respuesta de los anticuerpos ex vivo de los esplenocitos de los ratones frente a antígenos T dependientes. Se ha comprobado que la luteína dietética mejora la proliferación de linfocitos en los esplenocitos de los ratones.

Aunque todos estos compuestos están clasificados como antioxidantes, es evidente que no todos funcionan de la misma manera. Por ejemplo, estudios históricos en humanos demuestran que las poblaciones que consumen dietas ricas en antioxidantes (es decir, con una alta ingesta de frutas y verduras) tienen una incidencia menor de cáncer que otros grupos de personas. No obstante, los estudios clínicos que proporcionan una suplementación con antioxidantes como la vitamina E o el �-caroteno no proporcionan por sí solos el mismo grado de protección. Actualmente se piensa que la combinación de diferentes nutrientes antioxidantes a bajos niveles proporciona una ventaja para la salud humana mayor que un único antioxidante a altos niveles.

Aunque el perro no ha evolucionado con una dieta basada en altas cantidades de frutas y verduras, sí que cazaba y comía pequeños herbívoros que consumían plantas con altas concentraciones de estos compuestos. Por eso, es posible que la necesidad del perro de consumir antioxidantes haya evolucionado de manera natural. Por tanto, existe una necesidad en la técnica de proporcionar antioxidantes beneficiosos en la dieta de un perro para proporcionar ventajas a su salud.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La composición usada en la invención incluye una combinación de vitamina E, luteina, y �-caroteno. Este paquete de antioxidantes proporciona al animal de aproximadamente 175 a aproximadamente 400 UI de vitamina E por kilogramo de dieta, de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 mg/día de luteína y de aproximadamente 1 a aproximadamente 50 mg/día de �-caroteno. Se ha comprobado que dicha dieta optimiza las células inmunes de los perros y aumenta el reconocimiento de vacunas en los perros.

Estas características y ventajas de la presente invención se harán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, los dibujos que se acompañan y las reivindicaciones adjuntas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Fig. 1 es un gráfico de la concentración de anticuerpos en perros (mg/dl) por mg de beta-caroteno/kg de dieta y

La Fig. 2 es un gráfico que ilustra el efecto de la luteína dietética en el reconocimiento de vacunas en el perro.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS REALIZACIONES PREFERIDAS

La combinación de antioxidantes puede ser administrada al perro como un suplemento o contenida en la dieta suministrada al mismo. Dicho suplemento puede ser en forma de una pastilla o cápsula, una golosina o galleta o

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cualquier otra forma comestible. El término “dieta” significa el alimento o la bebida que son consumidos de forma regular por el perro. Se cree que el uso de una combinación de antioxidantes proporciona ventajas a la salud en muchas áreas del sistema inmune, por ejemplo, optimiza la activación de las células inmunes, aumenta los niveles de anticuerpos y mejora el reconocimiento de vacunas.

La dieta puede ser cualquier fórmula adecuada de alimentos para animales domésticos que también proporcione una nutrición adecuada al perro. Una dieta canina para usar según las reivindicaciones 1 y 5 de la presente invención contiene 18-40% de proteína en bruto, 4-30% de grasa, y 4-20% de fibra alimentaria total. Sin embargo, no se requieren relaciones o porcentajes específicos de estos u otros nutrientes a la vista del uso de un producto alimenticio para animales domésticos según las reivindicaciones 3 y 4. La combinación de antioxidantes se puede mezclar con dicha dieta para proporcionar las cantidades beneficiosas necesarias.

Con el fin de hacer más fácilmente comprensible la invención, se incluyen los siguientes ejemplos a título únicamente ilustrativo y sin limitar el alcance de la invención.

Ejemplo 1

Vitamina E

Veinte Beagles jóvenes (con una edad media de 2 años) y 20 Beagles adultos (con una edad media de 9,2 años) fueron alimentados con una dieta comercial estándar a base de pollo/maíz formulada para contener 27 UI de vitamina E/kg de dieta (recomendación del NRC) (dieta de control) durante 1 mes antes de comenzar el experimento para estabilizar los niveles de vitamina E en los perros. A continuación, se asignaron de manera aleatoria a los perros jóvenes y adultos durante 8 semanas dietas que contenían 27 UI de vitamina E/kg de dieta ó 280 UI de vitamina E/kg de dieta. Antes y después de las 8 semanas de tratamiento dietético se tomaron muestras de sangre para medir los niveles de vitamina E en plasma y valorar la respuesta mitogénica de los linfocitos a la ConA (concanavalina A) y a la PHA (fitohemaglutinina). Antes del tratamiento dietético, y de manera análoga a lo que ocurre en otras especies, los perros adultos tenían una respuesta mitogénica a la PHA y a la ConA significativamente inferior a la de los perros jóvenes. Sorprendentemente, hubo una reducción significativa en el nivel de vitamina E en plasma de los perros jóvenes y adultos alimentados con 27 UI de vitamina E/kg de dieta, siendo los perros jóvenes los que presentaron un porcentaje de reducción mayor (35% en los adultos frente al 50% en los jóvenes, P = 0,12). El examen del contenido en vitamina E de la comida comercial administrada a los perros del estudio antes de su llegada al centro indicó que, como media, la comida comercial contenía 60 UI de vitamina E/kg de dieta. Así, la disminución de los niveles de vitamina E en plasma se puede atribuir a que los niveles de vitamina E de la dieta de control eran inferiores a los de la comida comercial para perros. Tanto los perros jóvenes como los perros adultos que recibieron el suplemento de vitamina E mostraron un aumento significativo de sus niveles de vitamina E en plasma, presentando los perros jóvenes un porcentaje de aumento significativamente superior al de los perros adultos (20% en los adultos frente al 50% de aumento en los perros jóvenes, P = 0,02). Los perros jóvenes alimentados con 27 UI/kg de dieta de vitamina E también presentaron una reducción significativa de la proliferación estimulada por ConA y PHA durante las 8 semanas del período de alimentación. En los perros suplementados con 280 UI de vitamina E/kg de dieta no se observó ninguna reducción similar. Los perros alimentados con 27 ó 280 UI de vitamina E/kg de dieta no mostraron un cambio significativo en la proliferación de linfocitos estimulada por mitógenos.

�-caroteno

Las hembras Beagle (de 18 a 19 meses de edad; 7 a 9 kg de peso vivo) fueron alimentadas con una dieta basal (The Iams Co., Lewisburg, OH) que cumplía o excedía los requisitos para todos los nutrientes esenciales. Los animales fueron alojados en habitaciones con iluminación (14 h de luz; 10 h de oscuridad) y temperatura controladas. Se realizó una prueba para estudiar el perfil de absorción del �-caroteno tras una única dosis oral de �-caroteno.

Para estudiar la absorción de beta-caroteno en perros a los que se les había administrado una única dosis oral de caroteno, se administró una vez por vía oral a los perros (n = 6/tratamiento) 0,50, 100 ó 200 mg de �-caroteno (soluble en agua fría al 10%; BASF Corp., Ludwigshafen, Alemania). La dosis apropiada de �-caroteno se disolvió en 5 ml de agua y se administró por vía oral utilizando una jeringa de alimentación. Con el fin de establecer los tiempos de muestreo adecuados se utilizaron dos perros en un estudio preliminar. A estos perros se les administró una vez 50 mg de caroteno y se tomaron muestras de sangre a las 0 (inmediatamente antes de administrar �-caroteno), 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 y 24 horas.

El plasma sanguíneo se separó mediante centrifugación y las concentraciones de �-caroteno se analizaron utilizando cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) como se describe a continuación. Todos los procesos fueron realizados bajo una luz tenue. Con una mezcla 1:1 de éter dietílico y éter de petróleo en presencia de BHT, se extrajeron alícuotas de plasma duplicadas, todos los homogeneizados de leucocitos y todas las fracciones subcelulares con leucocitos. La fase etérea fue eliminada y desecada bajo una corriente de nitrógeno. El residuo se reconstituyó con fase móvil para la determinación de �-caroteno por HPLC. Las muestras (50 μl) se inyectaron en una columna esférica de fase reversa C18 de 5 μm (3,9 x 150 mm; Resolve) y se eluyeron en una mezcla 47:47:6 (v/v/v) de acetonitrilo, metanol y cloroformo con un caudal de 1,0 ml/min.

Los resultados de este ejemplo muestran concentraciones máximas de �-caroteno a las 3 y 6 horas de la dosificación, y no se pudieron detectar a las 24 h. Posteriormente, se tomaron muestras de sangre del resto de los perros en los mismos periodos de tiempo. El plasma se separó utilizando el mismo método y se analizó con HPLC.

En ninguno de los períodos de tiempo estudiados se pudieron detectar concentraciones de �-caroteno en plasma en perros sin suplementar. Por el contrario, los perros que habían recibido una dosis oral de �-caroteno presentaban un aumento dependiente de la dosis (P < 0,01) de �-caroteno en plasma. Las concentraciones máximas se observaron 6 horas después de la dosis y fueron uniformes en todos los grupos de tratamiento. A continuación, se produjo un rápido descenso (P < 0,01) de las concentraciones de �-caroteno en todos los perros suplementados con �-caroteno. Las concentraciones no eran detectables transcurridas 24 horas después de la dosis. La semivida del �-caroteno en plasma fue aproximadamente de 3 (dosis de 50 y 100 mg) a 4 (dosis de 100 mg) horas. Las concentraciones máximas de caroteno en sangre se produjeron antes en los perros que en los gatos (véanse los Ejemplos 4 y 5 más abajo). Además, la concentración de �-caroteno en el plasma de los perros es aproximadamente de 10 a 16 veces inferior a la observada en los gatos después de ajustar las diferencias de peso vivo.

En un segundo estudio, los perros (n = 6/tratamiento) fueron alimentados diariamente a las 08,00 horas durante 7 días consecutivos con 0, 12,5, 25, 50 ó 100 mg de �-caroteno. El �-caroteno estaba sobre la superficie del alimento y era administrado en la comida de la mañana. Se tomaron muestras de sangre una vez al día en el día 0 (inmediatamente antes de la primera dosis) y, posteriormente, 6 horas después de cada dosis (días 1 a 7). La elección de la hora del muestreo de sangre se basó en los resultados obtenidos en el Ejemplo 1, que mostraban concentraciones máximas de caroteno 6 horas después de una dosis. El plasma se aisló y se analizó para determinar las concentraciones de caroteno.

La administración diaria de �-caroteno a perros durante 7 días produjo un aumento dependiente de la dosis (P < 0,01) del beta-caroteno circulante. Los perros alimentados con 100 mg de �-caroteno mostraron el máximo aumento de concentraciones diarias de �-caroteno en plasma. Las concentraciones máximas (18 μg/l) de �-caroteno en plasma el día 1 en los perros alimentados con 100 mg de �-caroteno de este ejemplo fueron similares a las observadas en el primer estudio. Las concentraciones de �-caroteno en plasma después de la última dosis fueron, en general, de 2,5 a 4 veces superiores a las observadas después de la primera dosis.

Se diseñó un tercer estudio para analizar la absorción de �-caroteno en los linfocitos sanguíneos de los perros. Los perros (n = 8/tratamiento) recibieron 0, 50 ó 100 mg de �-caroteno diariamente durante 30 días. La sangre se extrajo de todos los perros mediante la vena yugular en los días 10, 20 y 30. Los linfocitos y los neutrófilos de la sangre se separaron mediante centrifugación por gradiente de densidad. Se hizo un recuento de células. Los linfocitos y los neutrófilos se resuspendieron en PBS que contenía 3% de ascorbato sódico como antioxidante. Se sonicó una alícuota de la suspensión de células durante 30 segundos para romper las células. Se extrajeron los homogeneizados de leucocitos para analizar por HPLC el �-caroteno.

El día 30 se tomó una alícuota de sangre mayor y se prepararon suspensiones de leucocitos como se ha descrito anteriormente para su posterior fraccionamiento subcelular. Se rompieron las células mediante sonicación durante 20 segundos en 5 volúmenes de solución 0,25 M de sacarosa. Se añadió ascorbato sódico como antioxidante. El homogeneizado se centrifugó (600 x g durante 10 min a 4°) y se separó el gránulo nuclear del sobrenadante. El sobrenadante postnuclear se centrifugó (17.300 x g durante 20 min a 4°) para separar la fracción mitocondrial. El sobrenadante postmitocondrial se centrifugó (102.000 x g durante 60 min a 4°) para separar la fracción microsomal de la fracción citosólica. Todas las fracciones subcelulares fueron analizadas por HPLC para determinar su contenido de caroteno.

El día 0 (antes de la suplementación con �-caroteno), las concentraciones de beta-caroteno en los linfocitos periféricos sanguíneos eran indetectables en todos los perros. También el �-caroteno en los linfocitos de los perros sin suplementar permaneció indetectable a lo largo del estudio. Por el contrario, las concentraciones de �-caroteno en los linfocitos de los perros alimentados con �-caroteno, en general, aumentaron (P < 0,01) de manera dependiente del tiempo. En los tratamientos no se apreció una diferencia significativa entre las concentraciones de �-caroteno en los linfocitos al comparar los perros alimentados con 50 mg de �-caroteno y los alimentados con 100 mg de �-caroteno.

El �-caroteno no era detectable en las diversas fracciones subcelulares de linfocitos obtenidas de los perros sin suplementar. Por el contrario, todas las fracciones subcelulares de linfocitos sanguíneos aisladas en los perros suplementados con �-caroteno habían absorbido �-caroteno. A la fracción de citosol le correspondía del 52% al 62% del total de �-caroteno de los linfocitos, mientras que los núcleos contenían la cantidad menor (6% a 8%) del total de caroteno. La mitocondria (14% a 17%) y los microsomas (16% a 23%) estaban en un nivel intermedio entre el citosol y el núcleo. La dosis de �-caroteno dietética no tuvo una influencia significativa sobre la absorción de �-caroteno por las fracciones subcelulares el día 30 de alimentación. Los resultados muestran que todas las fracciones subcelulares de linfocitos absorbieron �-caroteno. No obstante, el nivel de �-caroteno fue máximo en el citosol.

Al igual que los linfocitos, los neutrófilos sanguíneos absorben �-caroteno del mismo modo. Sin embargo a diferencia de los linfocitos, la absorción máxima se produjo el día 10, sin incremento adicional en las concentraciones de �-caroteno en los neutrófilos observadas en el día 30. El citosol, la mitocondria y los microsomas de los neutrófilos sanguíneos también mostraron una absorción significativa de �-caroteno. Por el contrario, no se detectó �-caroteno en los núcleos. Al igual que ocurre en las fracciones subcelulares de linfocitos sanguíneos, el nivel de �-caroteno fue máximo (61 a 68) en la fracción citosólica de los neutrófilos sanguíneos. No se observó ningún efecto dependiente de la dosis.

En un cuarto estudio se suplementó diariamente con 0, 25, 50 ó 100 mg de �-caroteno a hembras Beagle (de 4 a 5 meses de edad) para estudiar el papel del �-caroteno dietético en la mejora del sistema inmunitario mediado por células y del sistema inmunitario humoral del perro. Se evaluaron los siguientes parámetros en todos los animales o en los linfocitos de sangre periférica: (1) hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) contra PHA (inmunidad no específica) y la vacuna (inmunidad específica), (2) proliferación de linfocitos, (3) poblaciones de linfocitos e (4) inmunoglobulinas (Ig).

La suplementación con �-caroteno aumentó las concentraciones de �-caroteno en plasma de manera dependiente de la dosis pero no influyó en el retinol o �-tocoferol en plasma. En general, estos cambios reflejaron la respuesta DTH tanto al antígeno específico (vacuna) como al no específico (PHA). La mayor respuesta a la prueba de provocación con PHA se observó en los perros alimentados con 50 mg de �-caroteno, mientras que los perros alimentados con 20 mg o con 50 mg de �-caroteno mostraron una respuesta DTH a la vacuna significativamente superior. La hipersensibilidad retardada es estrictamente una reacción celular que afecta a los linfocitos T y a los macrófagos, sin implicar ningún componente de anticuerpos. Las células que presentan antígenos (por ejemplo, los macrófagos) presentan el antígeno o el alérgeno a los linfocitos T que se activa y libera linfocinas. Estas linfocinas activan a los macrófagos y los convierten en destructores voraces de los invasores externos. Por tanto, los datos muestran una elevada respuesta mediada por células en los perros alimentados con �-caroteno.

La alimentación con �-caroteno también produjo cambios significativos en los subconjuntos de linfocitos. Con respecto a los controles, los perros alimentados con 20 mg o 50 mg de �-caroteno tenían una elevada población de células CD4+ (semana 8). Los perros alimentados con 20 mg de �-caroteno mostraron también una elevada población de células CD8 en las semanas 2 y 4. Los linfocitos T se pueden clasificar según la expresión de las moléculas CD4 en la membrana. La molécula CD4 funciona como molécula de adhesión y como un co-receptor co-señalizador. Interviene en la activación de los linfocitos T. Los linfocitos T CD4+ reconocen el antígeno asociado a las moléculas MHC de clase II y funcionan en gran parte como células auxiliares. El aumento de la población de linfocitos T auxiliares en este estudio puede explicar el correspondiente aumento de la respuesta DTH de los perros alimentados con de 20 mg a 50 mg de �-caroteno.

Las concentraciones de IgG, IgM e IgG total aumentaron significativamente en los perros alimentados con �-caroteno ya desde la semana 1 después de la suplementación dietética. Los aumentos de Ig fueron dependientes de la dosis en los perros alimentados con de 0 mg a 20 mg de �-caroteno. El nivel más alto de �-caroteno (50 mg) no produjo un aumento adicional. Los perros alimentados con 20 mg de �-caroteno tenían, consistentemente, la mayor respuesta de ambos anticuerpos Ig. Una de las principales funciones del sistema inmune es la producción de anticuerpos que circulan libremente para proteger el cuerpo contra materiales externos. Los anticuerpos sirven para neutralizar toxinas, inmovilizar ciertos microorganismos, neutralizar la actividad viral, aglutinar microorganismos o partículas antígenas y precipitar antígenos solubles.

La alimentación con �-caroteno no influyó en la blastogénesis de linfocitos inducida por mitógenos ni en la producción de IL-2. Los linfocitos están implicados en la inmunidad mediada por células. Tras reconocer un antígeno, los linfocitos se dividen rápidamente, clonándose para prepararse a combatir una posible invasión. En la respuesta inmune humoral, la IL2 estimula tanto a los linfocitos T auxiliares como a los linfocitos B para que proliferen y respondan a los antígenos. Es necesaria para la expansión clonal de los linfocitos T activados por antígenos o por mitógenos. En la respuesta inmune mediada por células, la IL-2 activa a las células asesinas naturales, estimula la proliferación de timocitos e induce la actividad de los linfocitos T citotóxicos.

Según los resultados de estos experimentos, el perro absorbe una cantidad significativa de �-caroteno de la dieta y transfiere el �-caroteno a las organelas subcelulares de las células inmunes y los fagocitos. En estas células, el caroteno parece mejorar el sistema inmune del perro mediante la mejora de las respuestas inmunes mediadas por células (respuesta DTH, desplazamiento en los subconjuntos de linfocitos) y de la respuesta humoral (producción de IgG y de IgM).

Luteína

Cincuenta y seis hembras Beagle (de 17 a 18 meses de edad; peso vivo promedio de 11,4 ± 0,4 kg) fueron asignadas de manera aleatoria para recibir una suplementación diaria con 0, 5, 10 ó 20 mg de luteína durante 17 semanas. La luteína contenía 76,66% de luteína y 5,23% de zeaxantina. El suplemento de luteína fue resuspendido en aceite de soja a una concentración adecuada y administrado oralmente, en dosis de 1 ml, a las 08,00 h cada día. Inmediatamente después de la suplementación con luteína se ofrecía comida (200 g/perro/día). La dieta basal cumplía o excedía los requisitos en cuanto a todos los nutrientes esenciales (NRC, 1985). Todos los perros fueron alojados en corrales de 2 x 2 m (2 perros/corral) con temperatura (20 a 22 °C) e iluminación (14 h de luz) controladas. Se registró el peso vivo en las semanas 0, 6 y 12.

En las semanas 0, 2, 4, 8 y 12 se recogió, mediante punción venosa en la yugular, sangre en tubos al vacío heparinizados y se utilizaron alícuotas para realizar análisis por HPLC y evaluar las respuestas inmunes.

Extracción y análisis por HPLC

Se extrajo sangre para realizar análisis de luteína, zeaxantina, retinol y a-tocoferol. En resumen, las proteínas del plasma se precipitaron agregando un volumen equivalente de etanol que contenía hidroxitolueno butilado (BHT) al 0,1% (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI). La mezcla se extrajo con 5 ml de una mezcla 1:1 de éter de petróleo y éter dietílico anhidro.

El residuo seco se resuspendió en la fase móvil que consiste en una mezcla 47:47:6 (v:v:v) de acetonitrilo: metanol: cloroformo de calidad HPLC (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ). La luteína, la zeaxantina y el a-tocoferol se cuantificaron comparando el área bajo la curva mientras que el retinol se cuantificó utilizando la altura máxima. La identidad de los compuestos eluidos se confirmó comparando su espectro de absorción con el de los patrones puros. Dado que no se realizó la separación en la línea de base entre la luteína y la zeaxantina, las concentraciones de plasma se indicaron como luteína + zeaxantina.

Respuesta de hipersensibilidad retardada

La respuesta de induración de la piel fue evaluada en todos los perros en las semanas 0, 6, y 12. Los perros recibieron una inyección intradérmica en el área de la ijada con solución salina (8,5 g/l; control), una vacuna polivalente atenuada que contenía virus del moquillo canino, adenovirus canino tipo II, virus de la parainfluenza canina y parvovirus (Vanguard 5, Smithkline Beacham, West Chester, PA; antígeno específico) y PHA (0,5 g/l; antígeno no específico). Las dosis de vacuna y de PHA se determinaron previamente para proporcionar una óptima respuesta cutánea en los perros Beagle de edades similares. El lugar de la inyección se pinzó y limpió con alcohol etílico al 70%. El volumen de la inyección fue de 100 Il. La induración de la piel se midió a las 0, 24, 48 y 72 horas después de la inyección con ayuda de un micrómetro digital sensible a la presión (Mitsutoyo, Tokio, Japón) y la respuesta se expresó como porcentaje del espesor de la piel medido a las 0 horas.

Proliferación de linfocitos

La sangre recogida en las semanas 0, 2, 4, 8 y 12 se utilizó para evaluar la proliferación de linfocitos inducida por mitógenos mediante células mononucleares de sangre periférica (PBMC). El cultivo de sangre completa se utilizó para simular condiciones in vivo. Los mitógenos que se utilizaron fueron fitohemaglutinina (PHA), concanavalina A (Con A) y mitógeno de fitolaca (PWM). La sangre completa se mezcló cuidadosamente y, a continuación, se diluyó 1:12 con RPMl1640 que contenía 25 mM de Hepes, penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (100 Ig/ml) (Sigma, St. Louis, MO). Los estudios preliminares en los que se utilizó sangre sin diluir y sangre diluida 1:2, 1:4, 1:8, 1:12 y 1:16 mostraron una respuesta proliferativa de las PBMC óptima con una dilución 1:12. Con una pipeta, se introdujeron volúmenes de 150 Il, por triplicado, sobre placas de 96 pocillos de fondo redondo y se añadieron 50 Il de los mitógenos apropiados. Las concentraciones finales de mitógenos en el cultivo fueron de 2 y 10 Ig/ml de PHA, 1 y 5 Ig/ml de Con A y 0,5 y 2,5 Ig/ml de PWM. Las dos concentraciones de mitógenos dieron respuestas proliferativas máximas (la concentración más alta de mitógenos) y subóptimas (la concentración más baja de mitógenos) en estudios preliminares en los que se utilizó sangre de animales similares. La mezcla se incubó durante 72 horas a 37 °C en una incubadora humidificada bajo atmósfera de CO2 al 5%. Cuatro horas antes de finalizar el período de incubación se añadieron 20 IL de [3H]-timidina (1 [ICi/pocillo). Se recogieron las células sobre filtros de fibra de vidrio y se midió la radioactividad con un contador de centelleo líquido. La respuesta proliferativa de las PBMC se expresó como índice de estimulación (cpm de los cultivos estimulados/cpm de los cultivos no estimulados).

Subconjuntos de linfocitos

Los leucocitos de la sangre se separaron mediante Histopaque-1119 (Sigma, St. Louis, MO). Las células se lavaron tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4) y los eritrocitos contaminantes se lisaron con NH4CI (8,4 g/l). Los subconjuntos de linfocitos se determinaron mediante citometría de flujo (FACScan, Becton Dickinson, San Jose, CA). Las células mononucleares aisladas se volvieron a suspender a una concentración de 1 x 107 células/ml en PBS suplementado con 2% de suero libre de gammaglobulina, 5% de suero de cabra y 0,2 g/l de azida de sodio. Para el análisis por inmunofluorescencia se incubaron un total de 5 x 105 células durante 30 minutos sobre hielo con concentraciones óptimas de anticuerpos monoclonales de ratón anti-caninos (mAb). Los mAb usados eran específicos de los siguientes subconjuntos de linfocitos: linfocitos T totales (anti-CD5), linfocitos T auxiliares (anti-CD4), células supresores/citotóxicas para los linfocitos T (anti-CD8), linfocitos que expresan el complejo mayor de histocompatibilidad (antígenos contra MHQ de clase II (anti-MHC de clase II), y linfocitos B (anti-CD21). A continuación se lavaron las células tres veces y se incubaron con un anticuerpo secundario, IgG+IgM (H+L) de cabra F(ab')2 anti-ratón conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC)(Caltag, Burlingame, CA), durante 30 minutos sobre hielo para visualizar el mAb unido. Las células marcadas se fijaron con paraformaldehído al 4% para prepararse para la captación.

Se incluyeron los controles negativos necesarios para corregir la fluorescencia de fondo. Los datos se expresaron como el porcentaje de células con tinción positiva corregido para las células teñidas de forma no específica con el anticuerpo secundario.

Citotoxicidad de las células NK

Para evaluar la actividad citotóxica de las células NK se utilizaron células de adenocarcinoma de tiroides canina como células diana. Previamente se había demostrado que esta línea celular es susceptible de ser destruida por las células NK caninas. Las células diana se cultivaron en un matraz T75 con 20 ml de medio esencial mínimo (MEM; Sigma Chem. Co., St. Louis, MO) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FCS), 100 U/ml de penicilina y 100 Ig/ml de estreptomicina. Tras la confluencia, las células diana fueron tripsinizadas, lavadas 3 veces y resuspendidas a una concentración de 5 x 105 células/ml en medio completo (RPMI-1640 + 10% FCS + 100 U/ml de penicilina + 100 Ig/ml de estreptomicina). Con una pipeta, se introdujeron alícuotas de 100 Il de las células diana, por triplicado, sobre placas de 96 pocillos de fondo en U (Costar, Cambridge, MA) y se incubaron durante 8 horas para permitir la adherencia celular. Linfocitos (células efectoras; 100 Il) aislados mediante separación percoll (según se describe anteriormente en la presente memoria) se añadieron a las células diana para proporcionar una relación célula efectora: célula diana (E:T) de 10:1. Después de 10 horas de incubación a 37 °C, se añadieron 20 Il de un sustrato que contenía 5 Ig de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5difeniltetrazolio bromuro (MTT). La mezcla se incubó durante 4 horas a 370 °C, después de las cuales se extrajo el MTT no metabolizado mediante aspiración. Los cristales de formazán se disolvieron añadiendo 200 Il de etanol al 95%. La densidad óptica se midió a 570 nm utilizando un lector de microplacas. El porcentaje de lisis específica de células NK se calculó del siguiente modo:

Citotoxicidad específica (%) = 100 x {1 - [(DO de las células diana- DO de las células efectoras) / (DO de las células diana)]}

Producción de IL-2

La sangre completa se diluyó 1:2 con RPMl-1640 suplementado con Hepes y antibióticos (según se ha descrito anteriormente) y 400 Il de la sangre diluida se llevaron a placas de 48 pocillos (Costar, Cambridge, MA) utilizando pipetas. Las células se estimularon con PHA (400 Il de una solución de 5 Ig/ml) durante 48 horas a 37 °C en una atmósfera de CO2 al 5%. Las placas se centrifugaron a 200 x g durante 10 minutos y el sobrenadante se congeló a 80 °C. El contenido en IL-2 del sobrenadante del cultivo se determinó por triplicado mediante ELISA (Intergen, Purchase, NY). Como patrón se utilizó IL-2 anti-humana policlonal en reacción cruzada con IL-2 canina e IL-2 recombinante humana.

IgG e IgM en suero

Los sueros recogidos en las semanas 0, 2, 4, 8 y 12 fueron analizados por inmunodifusión radial simple (SRID) para determinar las concentraciones de IgG e IgM. Además, todos los perros fueron vacunados con la vacuna polivalente (Vanguard 5, Smithkline Beacham, West Chester, PA) en la semana 13 y, de nuevo, en la semana 15 para estudiar el posible efecto anamnésico de la luteína dietética. La sangre se recogió semanalmente desde la semana 13 hasta la semana 17. Se mezcló suero de cabra dirigido contra IgG (10%, molécula completa) o IgM (7,5%, específica de cadena I) de tipo canino (ICN, Aurora, OH) con agarosa fundida (10 g/l en PBS; Sigma Chem. Co., St. Louis, MO) y la mezcla se solidificó en las placas de SRID. Se cargaron los pocillos, por duplicado, con volúmenes de 5 Il de suero o patrón de IgG (0, 2,88, 5,75, 11,5 y 23,0 mg/ml) o de IgM (0, 0,25, 0,5, 1,0 y 2,0 mg/ml). Tras incubar durante 24 horas a temperatura ambiente en una cámara humidificada se midieron los diámetros de los aros utilizando un lector de SRID (Transidyne General Corp., Ann Arbor, MI).

Ensayo de peroxidación lipídica (TBARS)

La actividad de peroxidación lipídica en el plasma se determinó midiendo la producción de malondialdehído (MDA). El patrón utilizado fue 1,1,3,3-tetrametoxipropano JMP) (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO). Utilizando pipetas, se introdujeron muestras de 500 Il de plasma, por duplicado, en tubos de vidrio de 15 ml y se añadieron 3 ml de ácido fosfórico 10 g/l y 1 ml de solución TBA 6 g/l. La mezcla se hirvió en un baño de agua durante 45 minutos. Los tubos se dejaron enfriar y se extrajo el complejo TBA-MDA con 4 mL de n-butanol. La capa de butanol se separó por centrifugación a 1.000 x g durante 10 minutos y se midió la absorbencia a 532 nm (Beckman, Fullerton, CA). La actividad TBARS se expresó en nmol de MDA/l de plasma.

Estadísticas

El análisis de los datos se realizó mediante un ANOVA factorial mixto utilizando el Modelo Lineal General del SAS. El modelo estadístico fue Yijk = I + Dietai + Perroj(Dieta) (término de error utilizado para comprobar los efectos de la dieta) + Períodok + Dietai *Períodok + eijk. Las diferencias entre las medias del tratamiento fueron comparadas utilizando contraste ortogonal y se consideraron estadísticamente significativas cuando P < 0,05.

Resultados

Plasma

Las concentraciones plasmáticas de luteína + zeaxantina en los perros suplementados con luteína aumentaron rápidamente después de 2 semanas de alimentación (Figura 1). Las concentraciones plasmáticas continuaron aumentando a partir de ese momento, aunque más gradualmente, en los perros alimentados con 10 mg y 20 mg de luteína. Por el contrario, la luteína + zeaxantina en plasma no era detectable en los perros sin suplementar. Las concentraciones de luteína + zeaxantina en plasma en las semanas 2 a 12 fue significativamente superior (P < 0,05) en los perros alimentados con luteína que en los animales sin suplementar. La suplementación con luteína no influyó en las concentraciones de retinol y a-tocoferol en plasma. Por término medio, las concentraciones de estas vitaminas en todos los tratamientos y en todos los períodos fueron de 3,63 ± 0,14 y 37 ± 2 Imol/l, respectivamente.

Respuesta de hipersensibilidad retardada

Durante todos los períodos estudiados la respuesta DTH a la solución salina fue baja (aumento de 3% a 10% del espesor de la piel) y no fue significativamente diferente entre los grupos de tratamiento. Antes de administrar la luteína (semana 0), las respuestas DTH a PHA y a la vacuna fueron similares en todos los grupos dietéticos. Independientemente del período de tratamiento, la respuesta DTH máxima a PHA se observó aproximadamente 24 horas después de la inyección, mientras que la respuesta máxima a la vacuna se produjo entre las 48 y las 72 horas. También la respuesta del espesor de la piel a PHA fue aproximadamente dos veces superior a la de la vacuna.

En la semana 6, hubo una respuesta DTH a PHA relacionada con la dosis 24 horas después de la inyección. La respuesta DTH disminuyó a las 48 y 72 horas y no se observó ninguna diferencia significativa entre los tratamientos en estos tiempos. La respuesta DTH a la vacuna fue relacionada con la dosis 48 y 72 horas después de la inyección y no fue significativa a las 24 horas.

En la semana 12 hubo un aumento dependiente de la dosis general en la respuesta DTH a PHA a las 24, 48 y 72 horas; no obstante, la respuesta fue significativamente superior en los perros alimentados con 20 mg de luteína que en los perros sin suplementar. En contraste con la semana 6, no se observó un efecto dietético significativo en la respuesta DTH a la vacuna.

Proliferación de PBMC inducida por mitógenos

La luteína dietética no influyó significativamente en la proliferación espontánea por PBMC no estimuladas. No se produjo un efecto significativo de la luteína de la dieta sobre la respuesta de PBMC estimuladas mediante PHA en las semanas 0 y 4. Sin embargo, la respuesta proliferativa quedó potenciada (P < 0,01) en las semanas 8 (10 pg/ml HA y 12 (2 y 10 Ig/ml de PHA) en perros alimentados con 20 mg de luteína en comparación con perros sin suplemento. Los perros alimentados con 5 mg y 10 mg de luteína también tuvieron una proliferación de PBMC superior en la semana 8 en respuesta a 10 Ig/m/ml de PHA.

Los efectos de la luteína dietética sobre la respuesta proliferativa de PBMC estimulada con Con A fueron en general similares a los observados en la proliferación inducida por PHA. En las semanas 8 y 12 los perros alimentados con 20 mg de luteína tuvieron una proliferación de PBMC superior en respuesta a ambas concentraciones de Con A. Los perros alimentados con 10 mg de luteína también mostraron una proliferación de PBMC superior en las semanas 8 y 12 en respuesta a 5 Ig/ml de Con A. En general, la proliferación de PBMC fue superior con 5 Ig/ml de Con A que con 1 Ig/ml de Con A.

La proliferación de PBMC en respuesta al PWM fue similar en general a las observadas con PHA y Con A. Los perros alimentados con 20 mg de luteína tuvieron una proliferación de PBMC significativamente superior en las semanas 8 y 12 en respuesta a ambas concentraciones de PWM que los controles sin suplementar. Los alimentados con 10 mg de luteína también tuvieron una respuesta proliferativa superior en la semana 8. De nuevo, no se observaron diferencias significativas de tratamiento en las semanas 0 y 4.

Actividad citotóxica de las células asesinas naturales

La luteína dietética no influyó significativamente en la actividad citotóxica de las células NK. Por término medio, la lisis específica de las células diana mediante PBMC fue de 49,1 ± 1,1% en todos los tratamientos y períodos de muestreo.

Subpoblaciones de linfocitos

Antes de la suplementación con luteína dietética (semana 0) no había diferencias significativas en los porcentajes de ninguno de los marcadores de linfocitos. En la semana 12, el porcentaje de células CD4+ era superior en los perros alimentados con 5 mg y 10 mg de luteína, mientras que esta dieta no influyó sobre la población de CD8+. Por otro lado, los perros alimentados con 20 mg de luteína tenían un porcentaje de linfocitos T citotóxicos CD8+ significativamente superior en la semana 8 que los del control. La relación de CD4: CD8 fue similar entre los tratamientos en las semanas 0, 4 y 8 pero tendió a ser superior (P < 0,08) en los perros alimentados con 10 mg (2,5 0 ± 0,16) en comparación con el control (2,10 ± 0,16).

En las semanas 4 y 8, los perros alimentados con luteína tenían, en general, porcentajes superiores de células CD5+ que los perros de control sin suplementar y esta diferencia era estadísticamente significativa en los perros alimentados con 5 mg y 20 mg de luteína. Los perros alimentados con 20 mg de luteína también tenían porcentajes de poblaciones de

5

10

15

20

25

30

35

40

células MHC de clase II en las semanas 8 y 12 más elevados que los perros sin suplementar. Los perros alimentados con cantidades inferiores de luteína tenían poblaciones de MHC de clase II similares a las del control.

A diferencia de otras subpoblaciones de linfocitos, la luteína dietética no afectó significativamente a la población de linfocitos B CD21+.

Producción de interleucina-2

La producción de IL-2 por parte de PBMC estimuladas por PHA en cultivos de sangre completa no fue significativamente diferente entre los tratamientos dietéticos a lo largo del período experimental. Por término medio, las concentraciones de IL-2 en el medio de cultivo fueron por término medio de 15,7 ± 0,4 ng/ml a lo largo del estudio.

Producción de inmunoglobulinas

Las concentraciones de IgG en plasma tendieron a aumentar (P > 0,05) a lo largo del período de muestreo de 17 semanas. Las concentraciones fueron similares en los distintos tratamientos dietéticos durante las 12 primeras semanas de suplementación dietética. Sin embargo, tras revacunación en la semana 15, la IgG en plasma fue superior (P < 0,05) en la semana 16 en perros alimentados con 5 mg de luteína (P < 0,05) y en las semana 17 en perros alimentados con 20 mg de luteína mientras que la concentraciones de IgM en plasma no varió.

Peroxidación lipídica

La suplementación con luteína no afectó significativamente a la actividad TBARS en plasma, cuyo término medio fue de 95,8 ± 0,1 nmol de MDA/l en todos los tratamientos y a lo largo de todos los períodos.

Discusión

Los resultados muestran que la luteína dietética mejora significativamente la respuesta inmune mediada por células en el perro. La suplementación con luteína estimuló la respuesta proliferativa de PBMC a PHA, Con A y PWM. Se observó un marcado aumento de la proliferación de PBMC en respuesta a PHA y Con A en la semana 12 en los perros alimentados con 20 mg de luteína.

Los datos muestran que la mejora en la mitogénesis mediante luteína dietética se atribuye probablemente a un aumento de la población de linfocitos. Los perros suplementados con luteína tenían poblaciones mayores de células CD5+ y CD4+. La luteína dietética puede actuar específicamente sobre los linfocitos T porque no se observaron cambios en la población de linfocitos B con la suplementación con luteína.

Los datos también demostraron que la suplementación con luteína aumentó significativamente la proliferación de PBMC inducida por PWM en las semanas 8 y 12.

La luteína dietética también aumentó significativamente la respuesta DTH a vacunas, lo que es indicativo de una respuesta inmune específica. La suplementación con luteína aumentó significativamente el número de células con tinción positiva para las moléculas MHC de clase II con respecto a los perros sin suplementar.

La luteína no afectó significativamente a la producción de anticuerpos policlonales (IgG e IgM) ex vivo en los perros durante las primeras 12 semanas de suplementación. No obstante, tras la reexposición al antígeno, las concentraciones de IgG en plasma aumentaron en los perros alimentados con luteína, sugiriendo un efecto anamnésico de la luteína dietética que aumenta la capacidad en memoria de los linfocitos B para secretar IgG.

En resumen, la luteína dietética mejoró la población de linfocitos T auxiliares caninos y la expresión de moléculas MHC de clase II, lo que produce un aumento de la proliferación de PBMC caninas inducida por mitógenos y de la respuesta DTH. También, se piensa que la luteína aumenta la producción de Ig.

En la Tabla 1 se muestra un resumen de los resultados de los diferentes estudios.

Tabla 1 La Fig. 1 ilustra un aumento del 20% en los niveles de anticuerpos en la sangre con la adición de �-caroteno a la dieta.

Ventaja: Vitamina E �-caroteno Luteína

Optimizar la actividad de las células inmunes: � (Linfocitos T) � (Linfocitos B)

Optimizar los tipos de células presentes en la sangre: �

Aumentar los niveles de anticuerpos en la sangre: �

Optimizar el reconocimiento de vacunas en el perro: � �

La Fig. 2 demuestra la capacidad del perro para reconocer una vacuna. Como se ha mostrado, el reconocimiento mejora hasta un 32% cuando se añade luteína a la dieta. Esto proporciona al perro una mejor respuesta a las vacunaciones y 5 una protección adicional frente a las enfermedades.

Hay que señalar que ningún antioxidante proporcionó ventajas para todos los aspectos del sistema inmune examinados. Por ejemplo, aunque tanto la vitamina E como la luteína optimizaron la activación de las células inmunes, la vitamina E trabajó sobre los linfocitos T y la luteína trabajó sobre los linfocitos B. La mejora de la función de los linfocitos T es importante para luchar contra las infecciones virales y el cáncer, mientras que la mejora de la función de los linfocitos B

10 es importante para luchar contra las infecciones bacterianas. Por tanto, una combinación de antioxidantes proporciona un efecto sinérgico sobre el sistema inmune que supera a las ventajas obtenidas al aumentar el nivel de un solo antioxidante.

Claims

REIVINDICACIONES

1. El uso de una composición alimenticia para animales domésticos que contiene una combinación de vitamina E, luteína y �-caroteno para fabricar un producto alimenticio para animales domésticos utilizado para mejorar la respuesta

5 inmune de un perro, en donde el producto alimenticio para animales domésticos comprende de 4% a 20% de fibra alimentaria total, de 18% a 40% de proteína en bruto y de 4% a 30% de grasa.
2.

Un uso según la reivindicación 1, en el que dicha composición incluye de 175 a 400 UI de vitamina E por kilogramo de dieta, de 1 a 50 mg/día de luteína y de 1 a 50 mg/día de �-caroteno.
3.

El uso de una composición alimenticia para animales domésticos que contiene una combinación de vitamina E,

10 luteína y �-caroteno para fabricar un producto alimenticio para animales domésticos que optimice las células inmunes de un perro.
4. El uso de una composición alimenticia para animales domésticos que contiene una combinación de vitamina E, luteína y �-caroteno para fabricar un producto alimenticio para animales domésticos que optimice el reconocimiento de vacunas en un perro.

15 5. Una composición alimenticia para animales domésticos para mejorar la respuesta inmune en un perro que comprende una combinación de vitamina E, luteína y �-caroteno, en donde dicha composición comprende de 4% a 20% de fibra alimentaria total, de 18% a 40% de proteína en bruto y de 4% a 30% de grasa.
6. La composición alimenticia para animales domésticos según la reivindicación 5, que comprende de 175 a 400 UI de vitamina E por kilogramo de dieta, de 1 a 50 mg/día de luteína y de 1 a 50 mg/día de �-caroteno.

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