ES2248550T3

ES2248550T3 - Procedimiento para preparar maitansinol.

Info

Publication number: ES2248550T3
Application number: ES02726608T
Authority: ES
Inventors: Gerald J. Terfloth
Original assignee: SmithKline Beecham Corp
Current assignee: SmithKline Beecham Corp
Priority date: 2001-03-16
Filing date: 2002-03-12
Publication date: 2006-03-16
Anticipated expiration: 2022-03-12
Also published as: US20020156274A1; DE60206477T2; JP2004526734A; DE60206477D1; EP1373273A4; US20050113571A1; WO2002074775A1; EP1373273A1; ATE305934T1; EP1373273B1

Abstract

Un procedimiento para preparar maitansinol a partir de una mezcla que comprende maitansinoides no reducidos y sobrerreducidos que comprende separar el maitansinol por HPLC preparativa en una fase estacionaria de gel de sílice amorfa porosa con partículas angulares que tiene un diámetro medio de poros de 50 a 70 Å, un volumen de poros de 0, 8 a 1, 2 ml/g, una superficie específica de 500 a 600 m2/g, una densidad de relleno de 0, 5 g/ml, una pérdida al secado menor que 10%, un pH de la suspensión acuosa al 5% de 4, 0 a 5, 5, contenido en sodio menor que 60 ppm, contenido en aluminio menor que 100 ppm, contenido en hierro menor que 80 ppm, contenido en calcio menor que 80 ppm, contenido en sulfato menor que 25 ppm y contenido en cloruro menor que 25 ppm eluido con una fase móvil de diclorometano al 50%: acetato de etilo al 39, 3% : 2- propanol al 10, 7%.

Description

Procedimiento para preparar maitansinol.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a procedimientos para preparar maitansinol usando cromatografía líquida de alta resolución.

Antecedentes de la invención

En la patente de Estados Unidos nº 5.208.020 se han descrito fármacos maitansinoides de alta toxicidad y su uso terapéutico. Estos fármacos se pueden preparar a partir de derivados de maitansinol que a su vez se preparan a partir de precursores de ansamitocina.

Se puede producir una serie de ansamitocinas relacionadas en condiciones de cultivo definidas a partir de Actinosynnema spp. tal como Actinosynnema pretosium. Se han descrito procedimientos para la producción de ansamitocina a partir de Actinosynnema spp. en las patentes de Estados Unidos números 4.162.940; 4.228.239; 4.356.265; y 4.450.234.

Se puede preparar Maitansinol por ruptura reductora de ésteres C-3 de ansamitocina. Después de la reducción, es necesario purificar maitansinol en mezclas de reacción para una derivatización adicional para producir compuestos tales como el derivado de N-metil-L-alanina.

Procedimientos generales para la purificación de maitansinol a partir de mezclas de reacción pueden incluir extracción, destilación, cristalización o cromatografía en columna abierta. En general, la cromatografía en columna abierta proporciona el material más puro pero es difícil llevarlo a mayor escala desde una escala de laboratorio hasta una escala de producción industrial. Los problemas que se encuentran incluyen introducción de muestra irreproductible, variabilidad en la eficacia del lecho de la columna, variabilidad del tiempo del ciclo, variabilidad dependiente del operador en la calidad del producto y rendimiento y baja relación coste-beneficio para todo el proceso. Así, existe una necesidad de un procedimiento cromatográfrico reproductible y de preparación a mayor escala para la purificación de maitansinol.

Sumario de la invención

Un aspecto de la invención es un procedimiento para preparar maitansinol a partir de una mezcla que contiene maitansinoides no reducidos y sobrerreducidos separando el maitansinol por cromatografía líquida de alta resolución en fase normal en una fase estacionaria de gel de sílice amorfa porosa con partículas angulares.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra una separación cromatográfica de maitansinol en una fase estacionaria de gel de sílice.

Descripción detallada de la invención

Todas las publicaciones, incluyendo aunque sin quedar limitadas a las patentes y solicitudes de patente citadas en esta memoria descriptiva se incorporan en la presente memoria como referencia tal y como se describen en su integridad.

Con la expresión "Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC)" tal y como se usa en la presente memoria y en la reivindicaciones se entiende un procedimiento en el que una mezcla química soportada por una fase móvil se separa en componentes como resultado de distribución diferencial de los componentes tal como van fluyendo, sobre, o en contracorriente con, una fase sólida estacionaria. La fase móvil está compuesta de diclorometano al 50%: acetato de etilo al 39,3%: 2-propanol al 10,7% que tiene una velocidad de flujo de 0,001 a 50 cm/s a una presión de 1 x 10^{5} a 4 x 10^{7} Pa.

Se proporcionan procedimientos para preparar maitansinol (II) a partir de una mezcla que contiene maitansinoides no reducidos y sobrerreducidos separando el maitansinol por HPLC en fase normal en una fase estacionaria de gel de sílice amorfa con partículas angulares.

Como se muestra en el Esquema I, los ésteres maitansinoides que tienen una cadena lateral acilo C-3 tal como maitanacina, también conocida como ansamitocina P-1 (Ia), P-2 (Ib), P-3 (Ic), P-3' (Id), P-4 (Ie) y P-4' (If) pueden someterse a hidrólisis reductora para producir maitansinol (II), también conocido como forma P-0.

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La reacción de hidrólisis reductora se puede llevar a cabo como sigue. Se disuelve un éster C-3 maitansinoide
(Ia-f) en un disolvente anhidro, luego se coloca en una atmósfera de gas inerte y se enfría. Con preferencia, el éster
C-3 maitansinoide es maitanacina (Ia) o ansamitocina P-3 (Ie). Maitanacina (Ia) se puede obtener como se describe por Kupchan et al. en J. Org. Chem. 42, 2349-2357 (1977). Procedimientos para la preparación de ansamitocinas P-2, P-3, P-4 y P-4' se describen en Hatano et al., Agrie. Biol. Chem 48, 1721 -1729 (1984). P-3' se puede obtener como se describe en Tanida et al., J. Antibiot. (Tokyo) 34, 489-495 (1981).

Con preferencia, el disolvente anhidro es tetrahidrofurano (THF), éter 2-metoxietílico, dioxano o éter dietílico, aunque se pueden usar otros disolventes. Más preferiblemente, el disolvente anhidro es tetrahidrofurano. Con preferencia, se usan de 20 a 30 ml de disolvente anhidro por gramo de éster maitansinoide, más preferiblemente 25 ml/g. Con preferencia, el gas inerte es argon, nitrógeno o helio, aunque se pueden usar otros gases. Más preferiblemente, el gas inerte es argon. Con preferencia, la solución se mantiene de 0 a -80ºC, más preferiblemente, de aproximadamente -30 a -50ºC, lo más preferible de aproximadamente -35 a -5ºC, en un baño de acetona-hielo seco.

También se enfría un agente reductor y se transfiere seguidamente a la solución enfriada del éster C-3 maitansinoide. La reacción se mantiene en una atmósfera de gas inerte, a una baja temperatura y se agita. Con preferencia, el agente reductor es hidruro de litio y trimetoxialuminio (LiAl(OMe)_{3}H), hidruro de litio y trietoxialuminio
(LiAl(OEt)_{3}H), hidruro de litio y tripropoxialuminio (LiAl(OPr)_{3}H), hidruro de sodio y trimetoxialuminio
(NaAl(OMe)_{3}H), hidruro de sodio y trietoxialuminio (NaAl(OEt)_{3}H) o hidruro de sodio y tripropoxialuminio
(NaAl(OPr)_{3}H). Más preferiblemente, el agente reductor es hidruro de litio y trimetoxialuminio (LiAl(OMe)_{3}H). Con preferencia, el agente reductor se enfría hasta aproximadamente -30º a -40ºC en un baño de hielo seco-acetona. Con preferencia, el agente reductor enfriado se transfiere a la solución fría del éster C-3 maitansinoide anterior a través de una cánula. Con preferencia, el gas inerte es argon, nitrógeno o helio, aunque se pueden usar otros gases. Más preferiblemente, el gas inerte es argon.

Con preferencia, el agente reductor se usa en una concentración de aproximadamente 5 a 100 equivalentes por mol del éster C-3 maitansinoide, más preferiblemente, de aproximadamente 7,5 a 30 equivalentes por mol, lo más preferible, de aproximadamente 10 a 20 equivalentes por mol. Un experto en la técnica comprenderá que el uso de agente reductor en cantidades mayores de aproximadamente 100 equivalentes por mol del éster C-3 maitansinoide puede dar lugar a productos secundarios no deseados. Con preferencia, el agente reductor se añade a la solución enfriada de éster C-3 maitansinoide durante un período de tiempo que varía de aproximadamente 5 a 40 minutos, más preferiblemente, de aproximadamente 7 a 20 minutos, lo más preferible, de aproximadamente 8 a 12 minutos. Con preferencia, la reacción se mantiene en una atmósfera de gas inerte a un intervalo de temperatura que varía de aproximadamente -251ºC a -80ºC, más preferiblemente, de aproximadamente -27ºC a -45ºC, lo más preferible, de aproximadamente -30ºC a -35ºC. Con preferencia, la reacción se agita de aproximadamente 30 minutos a tres horas, más preferiblemente, durante aproximadamente tres horas.

Un experto en la técnica apreciará que la cantidad de agente reductor usado, la temperatura mantenida durante la reacción, el período de tiempo durante el cual se añade el agente reductor y el tiempo de reacción dependen cada uno de los demás. Por ejemplo, a medida que se reduce la cantidad del agente reductor, mayor es el tiempo de reacción. De igual modo, a medida que se reduce la temperatura mayor es el exceso de agente reductor requerido y mayor es el tiempo requerido para completar la reacción. Por otro lado, a medida que se reduce la velocidad a la que se añade el agente reductor, mayor es el tiempo de reacción requerido para completar la reacción.

La reacción se inactiva, se extrae, se seca y se filtra. El disolvente se evapora a presión reducida proporcionando maitansinol bruto. Con preferencia, la reacción se inactiva mediante la adición de solución saturada de cloruro sódico, agua o solución de cloruro de amonio, más preferiblemente mediante la adición de solución saturada de cloruro sódico. Con preferencia, la reacción se inactiva usando de aproximadamente 20 a 40 ml de solución por gramo de éster maitansinoide usado. Con preferencia, la reacción se extrae con acetato de etilo, diclorometano, tolueno, cloroformo o éter, más preferiblemente con acetato de etilo. Con preferencia, la reacción se extrae a la velocidad de aproximadamente 4 x 80 a 4 x 200 ml/g de éster maitansinoide usado. Con preferencia, los extractos reunidos de acetato de etilo se secan sobre sulfato de sodio o sulfato de magnesio, más preferiblemente sulfato de sodio y se filtran.

En una realización de la invención, se purifica maitansinol bruto a partir de maitansinoides no reducidos y sobrerreducidos por HPLC en una fase estacionaria de gel de sílice eluida con diclorometano al 50%: acetato de etilo al 39,3%: 2-propanol al 10,7%.

En una realización preferida, la fase estacionaria de sílice es gel de sílice amorfa porosa que tiene un diámetro medio de poro de 50-70 \ring{A}, un volumen de poros de 0,8 a 1,2 ml/g, una superficie específica de 500-600 m^{2}/g, una densidad de relleno de 0,5 g/ ml, una pérdida al secado menor que 10% durante 20 minutos a 205ºC y un pH de suspensión acuosa al 5% de 4,0-5,5. El diámetro medio de poros y el volumen de poros se determinan por desabsorción de nitrógeno. La superficie específica se determina usando el procedimiento de Brunauer, Emmett y Teller (BET). Sodio, aluminio, hierro y calcio, determinados por absorción atómica o plasma acoplado inductivamente (ICP) de digeridos de HF son <60 ppm, <100 ppm, <80 ppm y <80 ppm, respectivamente. El sulfato y cloruro, determinados por cromatografía iónica de extractos acuosos son individualmente <25 ppm. El diámetro de poros de la fase estacionaria de sílice puede ser 60, 100 ó 200 \ring{A}. Lo más preferible, el diámetro de poros es 60 \ring{A}. El tamaño de partículas de la fase estacionaria de sílice puede ser 5, 10, 20, 40, 80 ó 150 \mum. Con preferencia, el tamaño de partículas es 20 ó 40 \mum. Las fases estacionarias de sílice preferidas se pueden preparar como se describe en las patentes de Estados Unidos números 4.131.542 y 5.108.595 o están disponibles como gel de sílice IMPAQ® de SiliCycle, Inc., Québec, Qc, Canadá. La fase móvil es diclorometano al 50%: acetato de etilo al 39,3%: 2-propanol al 10,7%.

En otra realización preferida, la fase estacionaria de sílice es gel de sílice que tiene un diámetro medio de poros de 60 \ring{A}, un volumen de poros de aproximadamente 0,9 ml/g, una superficie específica de aproximadamente 700 m^{2}/g, una densidad aparente de aproximadamente 0,4 g/ml, un pH de la suspensión acuosa al 15% de 6,5 a 7,5, un contenido en hierro menor que 0,02% y un contenido en cloruro menor que 0,02%. El gel de sílice que cumple estas especificaciones está disponible como Merck LICHROSPHER® Si 60 de E. Merck, Darmstadt, Alemania. Los eluyentes isoleutrópicos se describen por L.R. Snyder and J.J. Kirkland en Introduction to Modern Liquid Chromatography, Wiley and Sons, Nueva York, páginas 255-271 (1974).

En una realización cualquiera, la cromatografía se lleva a cabo en un intervalo de temperatura de aproximadamente -80ºC a aproximadamente 200ºC, una velocidad de flujo lineal de aproximadamente 0,08 a aproximadamente 1,6 cm/s a una presión de aproximadamente 5 a aproximadamente 1 x 10^{7} Pa. Con preferencia, la temperatura varía de aproximadamente 20ºC a aproximadamente 25ºC. En particular, se prefiere la temperatura ambiente.

Se prefiere además por los expertos en la técnica que los procedimientos de la invención se puedan llevar a cabo por cromatografía por cargas o de forma continua. Un modo continuo ejemplo es cromatografía de lecho móvil simulada. Véase Charton et al., J. Chromatogr. 702, 97-112 (1995).

El procedimiento de la invención se puede usar para preparar complejos de agente de unión celular/maitansinoide que son útiles como profármacos que se activan en tumores. Maitansinol producido por el procedimiento de la invención se puede usar como se describe en la patente de Estados Unidos nº 5.208.020, para producir derivados maitansinoides que contienen N-metil-L-alanina. Estos derivados se conjugan seguidamente con agentes de unión celular, con preferencia anticuerpos, a través de diversos elementos de unión tales como un puente disulfuro.

Un complejo de agente de unión celular/maitansinoide ejemplo se puede preparar por un procedimiento que comprende las siguientes etapas:

(1): esterificar maitansinol con derivados N-metil-L-alanina para formar un éster maitansinoide que contiene disulfuro;

(2): reducir el éster maitansinoide que contiene disulfuro preparado por la etapa (1) a un maitansinoide que contiene tiol;

(3): introducir grupos ditiopiridilo en un agente de unión celular; y

(4): unir el maitansinoide que contiene tiol producido por la etapa (2) al agente de unión celular ditiopiridilo de la etapa (3) mediante un puente disulfuro.

La presente invención se describirá ahora con referencia a los siguientes ejemplos específicos no limitantes.

Ejemplo 1 Purificación de maitansinol por HPLC preparativa a gran escala

La cromatografía se llevó a cabo usando un sistema de HPLC preparativa Varex con bomba, bomba de alimentación y detector UV de longitud de onda variable. Se rellenó una columna de acero inoxidable de 101,6 mm de diámetro interno x 250 mm con aproximadamente 1 kg de gel de sílice IMPAQ®, una fase estacionaria de gel de sílice amorfa porosa que tiene un diámetro de poros de 50 a 70 \ring{A}, un volumen de poros de 0,8 a 1,2 ml/g, una superficie específica de 500-600 m^{2}/g, una densidad de relleno de 0,5 g/ml, pérdida al secado menor que 10% durante 20 min a 205ºC, un pH de la suspensión acuosa al 5% de 4,0-5,5, contenido en sodio menor que 60 ppm, contenido en aluminio menor que 100 ppm, contenido en hierro menor que 80 ppm, contenido en calcio menor que 80 ppm, contenido en sulfato menor que 25 ppm y contenido en cloruro menor que 25 ppm y un tamaño de partículas de 10 \mum. Este gel de sílice se puede obtener de SiliCycle, Inc. como IMPAQ® 60 \ring{A}, 10 \mum, con el número de producto B1007B. Se usó una fase móvil de cloruro de metileno: acetato de etilo: 2-propanol (50 : 39,3 : 10,7) a un caudal de 500 ml/min (0,145 cm/s). La detección se realizó a 280 nm. La columna se equilibró al menos 10 minutos antes de cada experimento.

Se disolvieron en 217 ml de fase móvil 10,8 g de maitansinol impuro preparado por reducción con hidruro de litio y trimetoxialuminio de ansamitocina P-3 dando una concentración de 49,8 mg/ml. Esta solución de muestra se recirculó durante 10 minutos a través de una columna de 10 mm ID x 40 mm (rellena con la misma sílice que la columna preparativa) antes de bombear sobre la columna preparativa. La inyección analítica de la solución de muestra tuvo un tiempo de retención de 13 minutos. Se realizaron un experimento de 3 gramos (Experimento 1) y dos experimentos de 4 gramos (Experimentos 2 y 3). Se realizó una inyección de 80 ml para un experimento de 4 gramos.

En la Figura 1 se muestra un cromatograma obtenido en una columna de 4,6 mm de diámetro interno x 250 mm. El compuesto de interés se separa bien de las impurezas que eluyen antes y después. Se tomó una pequeña fracción (Fr1, 125 ml) delante del pico de maitansinol (10 min) seguido por una fracción principal (Fr2, 3000 ml) y una pequeña fracción de la cola (Fr3, 1400 ml). Fr1 tenía una pureza del 90,8%, Fr2 del 99,4% y Fr3 del 99,7%. Las fracciones segunda y tercera de los tres experimentos se combinaron y se eliminó el disolvente usando un evaporador rotatorio obteniendo un residuo. Este residuo se volvió a disolver en 200 ml de acetato de etilo y se volvió a eliminar el disolvente. El matraz se bombeó durante 2 horas a alto vacío dando 9,3 g de maitansinol purificado.

En otro experimentos en condiciones idénticas, se disolvió maitansinol (3,9 g) impuro en 89 ml de la fase móvil dando una concentración de 44 mg/ml. La inyección analítica tuvo un tiempo de retención de 14 minutos. Se purificó toda la muestra en una inyección dando 3,1 g de maitansinol con una pureza del 99,3% por área. Las diferencias en el tiempo de retención se pueden atribuir a la carga de la columna, la variabilidad entre lotes de la fase estacionaria, la variabilidad de la fase móvil y la temperatura.

Ejemplo 2

(Referencia)

Purificación de maitansinol por HPLC

Se llevó a cabo una cromatografía HPLC usando un sistema analítico Hewlett Packard 1100 con desgasificador de disolvente, bomba cuaternaria, automuestreador, horno en la columna y detector Diode Array. El sistema se controló por el programa Chemstation. Se preparó maitansinol bruto como se ha descrito antes y se disolvió en la fase móvil a una concentración de 2 g/l. Todos los experimentos se llevaron a cabo a 25ºC. Los volúmenes típicos de inyección fueron 1 y 100 ul. La detección se llevó a cabo a una longitud de onda de 280 nm. Los disolventes de calidad HPLC se adquirieron de Mallinckrodt-Baker.

Se rellenó una columna de acero inoxidable de 4,6 mm de diámetro interno x 250 mm con LICHROSPHER® Si 60, fase estacionaria de sílice de 10 \mum (E. Merck, Darmstadt, Alemania). Se usó una fase móvil de diclorometano al 30%: acetato de etilo al 55%: 2-propanol al 15% a un caudal de 2 ml/minuto.

Se disolvieron en la fase móvil como se ha descrito antes 200 ug de maitansinol impuro preparado por reducción de ansamitocina P-3 con hidruro de litio y trimetoxialuminio. El maitansinol se separó del resto de picos y eluyó a 5 minutos con salida hasta 8,5 minutos.

Claims

1. Un procedimiento para preparar maitansinol a partir de una mezcla que comprende maitansinoides no reducidos y sobrerreducidos que comprende separar el maitansinol por HPLC preparativa en una fase estacionaria de gel de sílice amorfa porosa con partículas angulares que tiene un diámetro medio de poros de 50 a 70 \ring{A}, un volumen de poros de 0,8 a 1,2 ml/g, una superficie específica de 500 a 600 m^{2}/g, una densidad de relleno de 0,5 g/ml, una pérdida al secado menor que 10%, un pH de la suspensión acuosa al 5% de 4,0 a 5,5, contenido en sodio menor que 60 ppm, contenido en aluminio menor que 100 ppm, contenido en hierro menor que 80 ppm, contenido en calcio menor que 80 ppm, contenido en sulfato menor que 25 ppm y contenido en cloruro menor que 25 ppm eluido con una fase móvil de diclorometano al 50%: acetato de etilo al 39,3%: 2-propanol al 10,7%.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la fase estacionaria tiene un tamaño de partículas de 5, 10, 20, 40, 80 ó 150 \mum.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la fase estacionaria es Silicycle IMPAQ®.