ES2248852T3 - Oligonucleotidos de amplificacion met/fret marcados y procedimiento que se refieren a su utilizacion. - Google Patents

Abstract

EN LA PRESENTE INVENCION SE PRESENTAN OLIGONUCLEOTIDOS ETIQUETADOS DE AMPLIFICACION DE ACIDOS NUCLEICOS, QUE PUEDEN SER IMPRIMADORES LINEALES O EN HORQUILLA U OLIGONUCLEOTIDOS DE BLOQUEO. LOS OLIGONUCLEOTIDOS DE LA INVENCION SE ETIQUETAN CON FRACCIONES DONADORAS Y/O ACEPTORAS DE PARES DE TRANSFERENCIA DE ENERGIA MOLECULAR. LAS FRACCIONES PUEDEN SER FLUOROFOROS PARA QUE LA ENERGIA FLUORESCENTE EMITIDA POR EL DONADOR SEA ABSORBIDA POR EL ACEPTOR. EL ACEPTOR PUEDE SER UN FLUOROFORO QUE FLUORECE A UNA LONGITUD DE ONDA DIFERENTE A LA DE LA FRACCION DONADORA, O PUEDE SER UN EXTINTOR. LOS OLIGONUCLEOTIDOS DE LA INVENCION SE CONFIGURAN DE MODO QUE EN EL PRODUCTO DE LA AMPLIFICACION QUEDEN INCORPORADAS UNA FRACCION DONADORA Y UNA FRACCION ACEPTORA. EN LA INVENCION TAMBIEN SE PRESENTAN PROCEDIMIENTOS Y KITS PARA LA DETECCION DIRECTA DE LOS PRODUCTOS DE LA AMPLIFICACION UTILIZANDO IMPRIMADORES DE AMPLIFICACION DE ACIDOS NUCLEICOS. CUANDO SE UTILIZAN IMPRIMADORES LINEALES ETIQUETADOS, EL TRATAMIENTO CON UNA EXONUCLEASA O A UNA TEMPERATURA ESPECIFICA ELIMINA LA NECESIDAD DE TENER QUE SEPARAR LOS IMPRIMADORES QUE NO SE HAYAN INCORPORADO. ESTE FORMATO EN "TUBO CERRADO" REDUCE ENORMEMENTE LA POSIBILIDAD DE UNA CONTAMINACION POR ARRASTRE CON LOS PRODUCTOS DE LA AMPLIFICACION, PERMITE LA OBTENCION DE UNA GRAN CANTIDAD DE MUESTRAS Y SE PUEDE AUTOMATIZAR TOTALMENTE.

Description

Oligonucleotidos de amplificación MET/FRET marcados y procedimientos que se refieren a su utilización.

1. Introducción

La presente invención se refiere a oligonucleótidos para la amplificación de ácidos nucleicos que están marcados detectablemente con marcas de transferencia de energía molecular (MET). Asimismo se refiere a los métodos para detectar los productos de la amplificación de ácidos nucleicos utilizando estos oligonucleótidos. Adicionalmente se refiere a un método rápido, sensible, y fiable para detectar los productos de amplificación que disminuyen enormemente la posibilidad de transferir contaminación con los productos de amplificación y que es adaptable a muchos métodos para la amplificación de secuencias de ácidos nucleicos, incluyendo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la triamplificación, y otros sistemas de amplificación.

2. Antecedentes de las invención 2.1. Fluorescencia por transferencia de energía resonante (FRET)

La transferencia de energía molecular (MET) es un procedimiento mediante el cual se hace pasar energía no radiactivamente entre una molécula donadora y una molécula aceptora. La fluorescencia por transferencia de energía resonante (FRET) es una forma de MET. La FRET surge de las propiedades de ciertos compuestos químicos; cuando son excitados por la exposición a longitudes de onda concretas de luz, emiten luz (es decir, emiten fluorescencia) a una longitud de onda diferente. Tales compuestos se denominan fluoróforos. En la FRET, la energía se hace pasar no radiactivamente a través de una larga distancia (10-100 \ring{A}) entre una molécula donadora, que es un fluoróforo, y una molécula aceptora. El donador absorbe un fotón y transfiere su energía no radiactivamente al aceptor (Förster, 1949, Z. Naturforsch. A4: 321-327; Clegg, 1992, Methods Enzymol. 211:353-388).

Cuando dos fluoróforos cuyos espectros de excitación y emisión se solapan están en íntima proximidad, la excitación de un fluoróforo hará que emita luz a longitudes de onda que son absorbidas por el segundo fluoróforo y lo estimulan, haciendo que a su vez emita fluorescencia. En otras palabras, la energía en estado excitado del primer fluoróforo (donador) es transferida mediante una interacción dipolo - dipolo inducida por la resonancia al segundo fluoróforo vecino (aceptor). Como resultado, el tiempo de vida de la molécula donadora disminuye y su fluorescencia es extinguida, mientras la intensidad de fluorescencia de la molécula aceptora es intensificada y despolarizada. Cuando la energía del estado excitado del donador es transferida a un aceptor no fluoróforo, la fluorescencia del donador es extinguida sin la posterior emisión de fluorescencia por el aceptor. En este caso, el aceptor funciona como
extintor.

Los pares de moléculas que están comprometidos en la fluorescencia por transferencia de energía resonante (FRET) se denominan pares FRET. Con el fin de que se produzca la transferencia de energía, las moléculas de donador y aceptor deben estar típicamente en íntima proximidad (hasta 70 - 100 \ring{A}) (Clegg, 1992, Methods Enzymol. 211:353-388; Selvin, 1995, Methods Enzymol. 246: 300-334). La eficiencia de la transferencia de energía cae rápidamente con la distancia entre las moléculas de donador y aceptor. Según Förster (1949, Z. Naturforsch. A4: 321-327), la eficiencia de la transferencia de energía es proporcional a D x 10^{-6}, donde D es la distancia entre el donador y el aceptor. Efectivamente, esto significa que la FRET se pude producir muy eficientemente hasta distancias de aproximadamente 70 \ring{A}.

Entre las moléculas que se utilizan comúnmente en la FRET se incluyen fluoresceína, 5-carboxifluoresceína (FAM), 2',7'-dimetoxi-4',5'-dicloro-6-carboxifluoresceína (JOE), rodamina, 6-carboxirrodamina (R6G), N,N,N',N'-tetrametil-6-carboxirrodamina (TAMRA), 6-carboxi-X-rodamina (ROX), ácido 4-(4'-dimetilaminofenilazo)benzoico (DABCYL), y ácido 5-(2'-aminoetil)aminonaftaleno-1-sulfónico (EDANS). El que el fluoróforo sea un donador o un aceptor está definido por sus espectros de excitación y emisión, y por el fluoróforo con el cual está emparejado. Por ejemplo, FAM es excitado muy eficientemente por la luz con una longitud de onda de 488 nm, y emite luz con un espectro de 500 a 650 nm, y un máximo de emisión de 525 nm. FAM es un fluoróforo donador adecuado para su uso con JOE, TAMRA, y ROX (todos los cuales tienen su máximo de excitación a 514 nm).

En los años 70, las marcas FRET fueron incorporadas a los análisis de inmunofluorescencia utilizados para detectar antígenos específicos (Ullman y col., Patentes de los Estados Unidos 2.998.943; 3.996.345; 4.160.016; 4.174.384; y 4.199.559). Más tarde, a primeros de los 80, se recibieron numerosas patentes de Heller y colaboradores, concernientes a la aplicación de la transferencia de energía a la hibridación de polinucleótidos (Patente de los Estados Unidos Núms. 4.996.143, 5.532.129, y 5.565.322). En la Solicitud de Patente Europea 82303699.1 (número de publicación EP 0 070 685 A2 fechada el 26 de Enero de 1983), "Homogeneous nucleic acid hybridization diagnostics by non-radioactive energy transfer", los autores de la invención reivindican que pueden detectar una única secuencia de polinucleótidos de hebra sencilla con dos oligonucleótidos: uno que contiene el fluoróforo donador, el otro, un aceptor. Cuando ambos oligonucleótidos hibridan a fragmentos adyacentes de ADN analizado a cierta distancia, se puede detectar la transferencia de energía.

En la Solicitud de Patente Europea 86116652.8 (número de publicación EP 0 229 943 A2 fechada el 29 de Julio de 1987; "EP '943"), titulada "Fluorescent Stokes shift probes for polynucleotide hibridization assays", Heller y col. proponen el mismo esquema, pero con distancias especificadas entre el donador y el aceptor para una FRET máxima. Asimismo describen que las marcas donadora y aceptora pueden estar localizadas en la misma sonda (ver, v.g., EP '943: Reivindicación 2 y Figura 1).

Cardullo y col. describieron una aplicación similar de la transferencia de energía en un método de detección de hibridación de ácido nucleico (1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8790-8794). Se anclan fluoresceína (donador) y rodamina (receptor) a los extremos 5' de los oligonucleótidos complementarios. Tras la hibridación, se puede detectar la FRET. En otros experimentos, se producía la FRET tras la hibridación de dos oligonucleótidos marcados con fluoróforo a un ADN no marcado más largo. Este sistema es el sujeto de la Solicitud PCT PCT/US92/1591, de la Publicación Núm. WO 92/14845 fechada el 3 de Septiembre de 1992 ("PCT '845", titulada "Diagnosing cystic fibrosis and other genetic diseases using fluorescence resonance energy transfer"). En PCT '845 se describe un método para la detección de anomalías en el ADN cromosómico humano asociadas con la fibrosis quística mediante hibridación. La señal FRET utilizada en este método es generada de una manera similar a la descrita por Heller y col. (ver PCT '845 Figura 1). En otras publicaciones se ha descrito el uso de la transferencia de energía en un método para la estimación de distancias entre sitios específicos en el ADN (Ozaki y McLaughlin, 1992, Nucl. Acids. Res. 20: 5205-5214), en un método para el análisis de la estructura del empalme de ADN de cuatro vías (Clegg y col. 1992, Biochem. 31:4846-4856), y en un método para observar la geometría helicoidal del ADN (Clegg y col., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2994-2998).

2.2 Otros tipos de transferencia de energía molecular (MET)

Como se describe en la Sección 2.1, la fluorescencia por transferencia de energía resonante (FRET) es una forma de transferencia de energía molecular (MET). En la FRET, el donador de energía es fluorescente, pero el aceptor de energía puede ser fluorescente o no fluorescente. En el caso de un aceptor de energía fluorescente, la transferencia de energía produce un descenso en la emisión del donador o un incremento en la emisión del aceptor (Clegg, 1992, Methods Enzymol. 211: 353-388; Selvin, 1995, Methods Enzymol. 246: 300-334; Stryer, 1978, Ann. Rev. Biochem. 47:819-846). En el caso de un aceptor no fluorescente, v.g. un cromóforo o un extintor, la transferencia de energía produce un incremento en la emisión del donador (Matayoshi, y col., 1990, Science 247:954-958; Tyagi y Kramer, 1996, Nature Biotech. 14:303-309; Steinberg, 1991, Ann. Rev. Biochem. 40:83-114).

En otra forma de MET, el donador de energía no es fluorescente, v.g., un cromóforo, y el aceptor de energía es fluorescente. En este caso, la transferencia de energía produce un incremento de la emisión del aceptor (Heller, Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.532.129 y 5.565.322; Steinberg, 1991, Ann. Rev. Biochem. 40:83-114).

En otra forma más de MET, el donador de energía es luminiscente, v.g. bioluminiscente, quimioluminiscente, electroluminiscente, y el aceptor es fluorescente. En este caso, la transferencia de energía produce un incremento en la emisión del aceptor (Selvin, 1995, Methods Enzymol. 246: 300-334, Publicación de Patente Europea de Heller 0070685A2, fechada el 26 de Enero de 1993; Schutzbank y Smith, 1995, J. Clin. Microbiol. 33:2036-2041). Un ejemplo de semejante sistema de transferencia de energía es descrito por Selvin (supra), donde el donador es un quelato de lantánido luminiscente, v.g., quelato de terbio o quelato de lantánido, y el aceptor es un colorante orgánico tal como fluoresceína, rodamina o CY-5. Los sistemas de MET particularmente eficientes que utilizan esta estrategia incluyen terbio como donador y fluoresceína o rodamina como aceptor, y europio como donador y CY-5 como aceptor. La situación inversa, es decir, donde el donador es fluorescente y el aceptor es luminiscente, se denomina "luminiscencia sensibilizada", y la transferencia de energía produce un incremento en la emisión del aceptor (Dexter, 1953, J. Chem. Physics 21: 836-850).

En una forma teóricamente posible de MET, el donador de energía puede ser luminiscente y el aceptor de energía puede ser no fluorescente. La transferencia de energía produce un descenso en la emisión del donador.

2.3 Métodos de control de la amplificación de ácidos nucleicos

Antes de la presente invención, la aplicación de la transferencia de energía a la detección directa de productos de amplificación genética no se había intentado. En los métodos de control de las reacciones de amplificación de la técnica anterior en los que se utiliza la transferencia de energía, no se incorpora una marca al producto de la amplificación. Como resultado, estos métodos han contado con la medida indirecta de la reacción de amplificación.

Los métodos utilizados comúnmente para detectar los productos de amplificación de ácidos nucleicos requieren que el producto amplificado sea separado de los cebadores que no han reaccionado. Esto se logra comúnmente o bien por medio del uso de electroforesis en gel, que separa el producto de amplificación de los cebadores basándose en el tamaño diferencial, o bien por medio de la inmovilización del producto, permitiendo el lavado del cebador libre. No obstante, se han descrito tres métodos para controlar el procedimiento de amplificación sin la separación previa del cebador. Todos ellos se basan en la FRET, y ninguno de ellos detecta el producto amplificado directamente. En lugar de eso, los tres métodos detectan algún evento relacionado con la amplificación. Por esa razón, están acompañados del problema de un elevado fondo, y no son cuantitativos, como se discute más abajo.

En un método, descrito por Wang y col. (Patente de los Estados Unidos 5.348.853; Wang y col., 1995, Anal. Chem. 67:1197-1203; WO 95/32306), se utiliza un sistema de transferencia de energía en el que la transferencia de energía se produce entre dos fluoróforos de una sonda. En este método, la detección de la molécula amplificada tiene lugar en el recipiente de la reacción de amplificación, sin la necesidad de una etapa de separación. Este método produce una sensibilidad superior que los métodos que cuentan con cebadores monomarcados.

En el método de Wang y col. se utiliza un oligonucleótido "sumidero de energía" complementario al cebador inverso. Los oligonucleótidos "sumidero de energía" y cebador inverso tienen marcas donadoras y aceptoras, respectivamente. Antes de la amplificación, los oligonucleótidos marcados forman un cebador dúplex en el cual la transferencia de energía se produce libremente. Después, se lleva a cabo la PCR asimétrica hasta su fase logarítmica tardía antes de que se produzca significativamente una de las hebras diana.

Se añade un cebador dúplex complementario a la hebra diana sobreproducida para cebar una reacción "semi-anidada" (dos rondas de amplificación) conjuntamente con el cebador en exceso. A medida que la amplificación "semi-anidada" progresa, el cebador dúplex empieza a disociarse a medida que la secuencia diana se duplica. Como resultado, los fluoróforos configurados para la transferencia de energía son desacoplados entre sí, haciendo que el procedimiento de transferencia de energía preestablecido en todos los cebadores dúplex sea interrumpido para aquellos cebadores implicados en el procedimiento de amplificación. La intensidad de la fluorescencia medida es proporcional a la cantidad del cebador dúplex que queda en el extremo de cada ciclo de amplificación. La disminución de la intensidad de fluorescencia se corresponde proporcionalmente a la dosificación de diana inicial y al grado de amplificación.

Sin embargo, este método no detecta el producto amplificado, sino que más bien detecta la disociación del cebador del oligonucleótido "sumidero de energía". Por tanto, este método depende de la detección de una disminución de las emisiones; se debe utilizar una porción significativa de cebador marcado con el fin de lograr una diferencia fiable entre las señales antes y después de la reacción. Este problema fue observado aparentemente por Wang y col., que intentó compensarlo añadiendo una etapa de amplificación preliminar (PCR asimétrica) que se supone que incrementa la concentración de diana inicial y por consiguiente el uso del cebador marcado, pero también complica el procedimiento.

Un segundo método para la detección del producto de amplificación sin separación previa del cebador y el producto es el análisis mediante PCR con 5' nucleasa (también referido como análisis TaqMan®) (Holland y col., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7276-7280; Lee y col., 1993, Nucleic Acids Res. 21: 3761-3766). Este análisis detecta la acumulación de un producto de la PCR específico mediante hibridación y escisión de una sonda fluorogénica doblemente marcada (la sonda "TaqMan") durante la reacción de amplificación. La sonda fluorogénica consta de un oligonucleótido marcado con un colorante informador fluorescente y un colorante extintor. Durante la PCR, esta sonda es escindida por la actividad exonucleasa 5' de la ADN polimerasa si, y solo si, ésta hibrida con el segmento que esté siendo amplificado. La escisión de la sonda genera un incremento de la intensidad de fluorescencia del colorante informador.

En el análisis TaqMan, el donador y el extintor se localizan preferiblemente en los extremos 3' y 5' de la sonda, debido a que el requerimiento de que la hidrólisis 5'-3' sea realizada entre el fluoróforo y el extintor sólo puede ser satisfecha cuando estos dos radicales no están demasiado próximos entre sí (Lyamichev y col., 1993, Science 260:778-783). Sin embargo, este requerimiento es una seria desventaja del análisis, puesto que la eficacia de la transferencia de energía disminuye con el inverso de la sexta potencia de la distancia entre el informador y el extintor. En otras palabras, el análisis TaqMan no permite que el extintor esté suficientemente cerca del informador para lograr la extinción más eficaz. Como consecuencia, las emisiones del fondo de la sonda no hibridada pueden ser bastante elevadas.

Además, el análisis TaqMan no mide el producto de amplificación directamente, debido a que los cebadores de amplificación no están marcados. Este análisis mide un evento relacionado con la amplificación: la hidrólisis de la sonda que hibrida con el ADN diana entre las secuencias cebadoras. Como resultado, este método de análisis está acompañado de problemas significativos.

Primero, la hibridación nunca será cuantitativa a menos que el oligonucleótido esté presente en un gran exceso. No obstante, esto produce un fondo elevado (debido a que la extinción nunca es cuantitativa). Además, un gran exceso de oligonucleótido hibridado en el centro del ADN diana disminuirá la eficacia de la PCR. Además, no todos los oligonucleótidos hibridados con el ADN serán sujeto de la hidrólisis con la exonucleasa 5'-3': algunos serán desplazados sin hidrólisis, dando como resultado una pérdida de señal.

Otro método de detección de productos de amplificación que cuenta con el uso de la transferencia de energía es el método de la "baliza molecular" descrita por Tyagi y Kramer (1996, Nature Biotech. 14:303-309) que también es sujeto de las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.119.801 y 5.312.728 de Lizardi y col. Este método emplea sondas de hibridación de oligonucleótidos que pueden formar estructuras en horquilla. En un extremo de la sonda de hibridación (ya sea el extremo 5' o 3') existe un fluoróforo donador, y en el otro extremo, un radical aceptor. En el caso del método de Tyagi y Kramer, este radical aceptor es un extintor, esto es, el aceptor absorbe la energía liberada por el donador, pero después no emite fluorescencia por sí mismo. Así cuando la baliza está en conformación abierta, la fluorescencia del fluoróforo donador es detectable, mientras cuando la baliza está en conformación en horquilla (cerrada), la fluorescencia del fluoróforo donador es extinguida. Cuando se emplea en la PCR, la baliza molecular, que hibrida con una de las hebras del producto de la PCR, está en "conformación abierta", y se detecta fluorescencia, mientras aquellas que permanecen sin hibridar no emitirán fluorescencia Tyagi y Kramer, 1996, Nature Biotechnol. 14: 303-306. Como resultado, la cantidad de fluorescencia aumentará a medida que aumenta el producto de la PCR, y por tanto puede ser utilizada como medida del progreso de la PCR.

Sin embargo, puesto que este método está basado en la hibridación de la sonda al molde entre las secuencias cebadoras, tiene numerosos problemas asociados a él, algunos de los cuales son similares a los descritos antes en relación con el método TaqMan. Primero, es poco probable que las balizas moleculares hibriden cuantitativamente con una hebra del producto de la PCR de doble hebra, especialmente cuando el producto de la amplificación es mucho más largo que la baliza molecular. Incluso aquellas sondas que están hibridadas podrían ser desplazadas por una segunda hebra de ADN a lo largo de un corto período de tiempo; como resultado, este método no puede ser cuantitativo.

Se pueden encontrar ejemplos adicionales de métodos no cuantitativos de detección de amplicones sin la separación previa de cebador y producto en Cantor, Nature Biotechnology, 14:264 (1996) y en EP 601.889 A2. En estas referencias se describe el uso de sondas de hibridación oligonucleotídicas que pueden formar estructuras en
horquilla.

Los esfuerzos para incrementar la eficacia de la hibridación incrementando la concentración de baliza molecular darán como resultado un descenso de la eficacia de la amplificación, puesto que la necesidad de que la ADN polimerasa desplace las balizas moleculares hibridadas durante la reacción ralentizará la velocidad de la polimerización. Un exceso de sonda también incrementará el fondo. Además, la proporción entre el producto de amplificación y las balizas moleculares cambiará a medida que progrese la amplificación, y por tanto cambiará la eficacia de hibridación. Así, la detección del producto amplificado puede no ser cuantitativa.

Por lo tanto, en vista de las deficiencias en los métodos de la técnica anterior de detección de los productos de la amplificación, está claro que existe la necesidad en la técnica de un método mejorado de detección de los productos de la amplificación rápido, sensible, fiable y cuantitativo. La presente invención resuelve este problema proporcionando cebadores de amplificación de ácido nucleico que están marcados detectablemente con marcas de transferencia de energía. Asimismo resuelve este problema proporcionando métodos para detectar los productos de la amplificación que son adaptables a muchos métodos para la amplificación de secuencias de ácido nucleico y que disminuyen enormemente la posibilidad de transferir contaminación con los productos de la amplificación.

La mención de las presentes referencias no será considerada como una admisión de que tales referencias sean la técnica anterior para la presente invención.

3. Compendio de la invención

La presente invención se refiere a oligonucleótidos para la amplificación de ácidos nucleicos que están detectablemente marcados con marcas de transferencia de energía molecular (MET). Uno o más oligonucleótidos de la invención que contienen un radical donador y/o aceptor de un par MET son incorporados al producto amplificado de una reacción de amplificación, de manera que el producto amplificado contenga el radical tanto donador como aceptor de un par MET. Cuando el producto amplificado es de doble hebra, el par MET incorporado al producto amplificado puede estar en la misma hebra o, cuando la amplificación es una triamplificación, en hebras opuestas. En ciertos casos en los que la polimerasa utilizada en la amplificación tiene actividad exonucleasa 5'-3', uno de los radicales del par MET puede ser escindido de al menos alguna de las poblaciones del producto amplificado por esta actividad exonucleasa. Semejante actividad exonucleasa no es perjudicial para los métodos de amplificación de la invención.

La invención también se refiere a métodos para detectar productos de la amplificación de ácidos nucleicos utilizando estos oligonucleótidos marcados de la invención. Adicionalmente se refiere a un método rápido, sensible, y fiable para detectar productos de amplificación que disminuyen enormemente la posibilidad de transferir contaminación con los productos de la amplificación y que sea adaptable a muchos métodos para la amplificación de secuencias de ácido nucleico, incluyendo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la triamplificación, y otros sistemas de amplificación.

Los oligonucleótidos de amplificación de ácidos nucleicos de la invención utilizan el principio de la transferencia de energía molecular (MET) entre un radical donador y un radical aceptor. En una realización preferida, la MET es la fluorescencia de transferencia de energía resonante (FRET), en la cual los oligonucleótidos están marcados con radicales donadores y aceptores, donde el radical donador es un fluoróforo y el radical aceptor puede ser un fluoróforo, de manera que la energía fluorescente emitida por el radical donador es absorbida por el radical aceptor. El radical aceptor es un extintor.

Así, el cebador de amplificación es un cebador en horquilla que contiene radicales tanto donadores como aceptores, y está configurado de manera que el radical aceptor extinga la fluorescencia del donador. Cuando el cebador es incorporado al producto de amplificación su configuración cambia, se elimina la extinción, y la fluorescencia del radical donador puede ser detectada.

La presente invención proporciona cebadores de amplificación de ácidos nucleicos que forman una estructura en horquilla en la cual se producirá la MET cuando el cebador no esté incorporado al producto de amplificación. Así, un cebador de la invención forma una estructura en horquilla en la cual la energía de un fluoróforo donador es extinguida por un fluoróforo no fluorescente cuando el cebador no es incorporado al producto de amplificación.

La presente invención también proporciona un método para detectar directamente los productos de amplificación. Esta técnica mejorada satisface dos requerimientos principales. Primero, permite la detección del producto de amplificación sin la separación previa de oligonucleótidos no incorporados. Segundo, permite la detección del producto de amplificación directamente, incorporando el oligonucleótido marcado al producto.

En una realización adicional, la presente invención proporciona un método para la detección directa de productos de amplificación en los cuales la detección se puede llevar a cabo sin abrir el tubo de reacción. Esta realización, el formato de "tubo cerrado", reduce enormemente la posibilidad de transferir contaminación con los productos de amplificación que ha disminuido la aceptación de la PCR en muchas aplicaciones. El método del tubo cerrado también proporciona un elevado rendimiento total de las muestras y puede ser totalmente automatizado. La presente invención también se refiere a estuches para la detección o la medida de productos de amplificación de ácidos nucleicos. Tales estuches pueden ser estuches de diagnóstico en los que la presencia del ácido nucleico que está siendo amplificado se corresponde con la presencia o ausencia de una enfermedad o trastorno.

3.1 Definiciones

Según se utilizan aquí, los siguientes términos tendrán las abreviaturas indicadas.

ARMS,

sistema de amplificación de mutación refractaria

ASP,

reacción en cadena de la polimerasa alelo específica

pb,

pares de bases

CRCA,

amplificación mediante círculo rodador en cascada

DAB o DABCYL,

ácido 4-(4'-dimetilaminofenilazo)-benzoico

EDANS,

ácido 5-(2'-aminoetil)aminonaftaleno-1-sulfónico

FAM o Flu,

5-carboxifluoresceína

FRET,

fluorescencia por transferencia de energía resonante

JOE,

2',7'-dimetoxi-4',5'-dicloro-6-carboxi-fluoresceína

HPLC,

cromatografía de líquidos de alta resolución

MET,

transferencia de energía molecular

NASBA,

amplificación de ácido nucleico basada en secuencias

PSA,

antígeno específico de la próstata

Rod,

rodamina

ROX,

6-carboxi-X-rodamina

R6G,

6-carboxirrodamina

SDA,

amplificación por desplazamiento de hebras

TAMRA,

N,N,N',N'-tetrametil-6-carboxirrodamina

TRAP,

protocolo de amplificación de repeticiones teloméricas

4. Descripción de las figuras

La presente invención se puede comprender más completamente mediante la referencia a la siguiente descripción detallada de la invención, los ejemplos de las realizaciones específicas de la invención y las figuras adjuntas descritas más abajo:

Las Figuras 1A-B ilustran esquemáticamente la estructura de los cebadores en horquilla de la invención en los estados (A) cerrado (extinguido) y (B) abierto (emitiendo señal). \medcirc, fluoróforo donador; \bullet, fluoróforo extin-
tor.

La Figura 2 ilustra esquemáticamente el uso de cebadores en horquilla para medir directamente los productos de amplificación de una PCR en la cual la ADN polimerasa empleada carece de actividad exonucleasa 5'-3'. Se genera una señal de transferencia de energía tras la incorporación del cebador en horquilla al producto de la PCR de doble hebra. (a) y (b), hebras complementarias de la secuencia diana que se va a amplificar; \medcirc fluoróforo donador; \bullet, extintor; F, cebador directo; R, cebador inverso.

La Figura 3 (Etapas A a D) ilustra los productos de amplificación de una PCR en la cual la ADN polimerasa empleada tiene actividad exonucleasa 5'-3'. (a) y (b), hebras complementarias de la secuencia diana que se va a amplificar; \medcirc fluoróforo donador; \bullet, extintor; F, cebador directo; R, cebador inverso.

La Figura 4 proporciona un ejemplo esquemático de una secuencia diana seleccionada (SEC ID NUM: 1) ligada a una horquilla universal (SEC ID NUM: 2). (d) es la secuencia cebadora seleccionada de 8-40 nucleótidos, preferiblemente \sim15 nucleótidos, que es complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana que se va a amplificar. (d') es el extremo cohesivo 5' de la secuencia cebadora seleccionada. El extremo cohesivo tiene de 1-10 nucleótidos, preferiblemente 3-4 nucleótidos, y es complementaria al extremo cohesivo 5' (a') de la horquilla universal. (b) es un bucle de la horquilla universal que es suficientemente largo para proporcionar una distancia de 15-25 nucleótidos, preferiblemente 20 nucleótidos, entre el donador (F, FAM) y el extintor (D, DABCYL) cuando la horquilla está en configuración "abierta". (a) y (c) son las dos hebras del tallo de la horquilla universal. Cuando la secuencia cebadora seleccionada es ligada a la horquilla universal, el extintor (DABCYL) estará localizado en un nucleótido que sea interno con respecto al extremo 3'. El donador (FAM) puede estar localizado en un nucleótido o bien en el extremo 5' (como se muestra) o bien interno con respecto al extremo 5'. El único requerimiento es que el donador y el extintor estén suficientemente cerca para permitir la extinción cuando la horquilla esté en conformación "cerrada" ("silencio").

La Figura 5 ilustra esquemáticamente el uso de un cebador en horquilla marcado con donador-aceptor de FRET en una PCR. Ver la Sección 5.2.1 para una descripción detallada de los Ciclos 1-4.

La Figura 6 ilustra esquemáticamente el uso de un cebador en horquilla marcado con donador-aceptor de FRET en una triamplificación. En esta realización de la triamplificación, a diferencia de la PCR, se liga un tercer oligonucleótido ("bloqueador") al cebador en horquilla extendido. La señal fluorescente es generada como resultado de la replicación, sin embargo, como ocurre en la PCR.

La Figura 7 ilustra esquemáticamente la triamplificación utilizando dos cebadores lineales, cada uno marcado con un radical de FRET. BL, bloqueador, R, cebador inverso; F, cebador directo; \blacksquare, un grupo modificador de 3' asequible comercialmente capaz de proteger el oligonucleótido de la prolongación por la ADN polimerasa o la hidrólisis por la exonucleasa 3'-5' en el extremo 3' del bloqueador; X, modificación 2'-O-metilo en el cebador inverso; D, fluoróforo donador; Ao, fluoróforo aceptor.

Las Figuras 8A-B ilustran el efecto de (A) la exonucleasa 3'-5' y (B) la temperatura elevada sobre los cebadores marcados con FRET no incorporados durante la triamplificación. BL, bloqueador, R, cebador inverso; F, cebador directo; P, 5'-fosfato; \blacksquare, un grupo de protección en el extremo 3' del bloqueador; X, modificación 2'-O-metilo en el cebador inverso; D, fluoróforo donador; Ao, fluoróforo aceptor.

La Figura 9 ilustra esquemáticamente el uso de cebadores en horquilla en la amplificación de ácido nucleico basada en secuencias (NASBA). NASBA depende de la ciclación continua de las reacciones de transcripción inversa y de transcripción del ARN a una temperatura. Ver la Sección 5.2.3 para una descripción detallada de las Etapas 1-9.

La Figura 10 ilustra esquemáticamente el uso de cebadores en horquilla en la amplificación por desplazamiento de hebras (SDA) de una diana de ADN de doble hebra. Los cebadores 1 y 2 difieren, siendo los cebadores directo e inverso, respectivamente. La SDA depende de la ciclación continua de las mellas y de las etapas de polimerización/desplazamiento a una temperatura. Ver la Sección 5.2.4 para una descripción detallada de las Etapas 1-4. pol, polimerasa; restrictasa, endonucleasa de restricción.

Las Figuras 11A-B ilustran un tubo de amplificación de dos cámaras en un formato de "tubo cerrado". El tubo puede ser invertido (Figura 11B) y utilizado para mezclar la exonucleasa 3'-5' con el producto de la amplificación sólo cuando se desee, sin abrir el tubo después de que la amplificación tenga lugar (ver la Sección 12, Ejemplo 6).

La Figura 12 ilustra porciones de dos hebras (hebra superior: SEC ID NUM: 3 y SEC ID NUM: 4; hebra inferior: SEC ID NUM: 8 y SEC ID NUM: 9) del molde, y los oligonucleótidos, PSA-I (SEC ID NUM: 5), PSA-P (SEC ID NUM: 6), y PSA-B (SEC ID NUM: 7), utilizados en la amplificación del ADN del antígeno de próstata humano (PSA) como se describe en todos los ejemplos excepto aquellos que emplean cebadores en horquilla, cuyas secuencias se proporcionan en la Sección 12.

Figuras 13A-C. La Figura 13A ilustra esquemáticamente el procedimiento de amplificación mediante PCR utilizado en el experimento descrito en la Sección 7 (Ejemplo 1). La porción izquierda de la Figura 13A ilustra una amplificación mediante PCR utilizando un cebador inverso modificado con rodamina. La porción derecha de la Figura 13A ilustra una amplificación mediante PCR utilizando un cebador inverso no modificado. Los resultados se muestran en el gel de poliacrilamida desnaturalizante al 6% adjunto (Figura 13B) y en gel de agarosa (Figura 13C). La Figura 13B compara los tamaños de las hebras de ADN que fueron amplificadas con el cebador directo marcado con [P^{32}] cuando no se utilizaba el cebador inverso no modificado (Calle 1) o el cebador inverso modificado con rodamina (Calle 2). La Figura 13C compara las cantidades del producto de amplificación mediante PCR de doble hebra obtenido con un cebador inverso no modificado (Calle 1) y con un cebador inverso modificado con rodamina (Calle 2).

Figuras 14A-B. La Figura 14A ilustra esquemáticamente el procedimiento experimental utilizado en la Sección 8 (Ejemplo 2). Los resultados se muestran en el gel de poliacrilamida desnaturalizante al 6% adjunto (Figura 14B). La Calle 1 del gel representa una hebra de ADN amplificado con el cebador inverso marcado con rodamina y [P^{32}] incorporado, mientras la Calle 2 representa una hebra de ADN amplificado con el cebador directo (F) marcado con [P^{32}] incorporado.

Figuras 15A-B. La Figura 15A ilustra esquemáticamente el procedimiento experimental utilizado en la Sección 9 (Ejemplo 3). Los resultados se muestran en el gel de poliacrilamida desnaturalizante al 15% adjunto (Figura 15B). La calle 1 del gel representa el cebador inverso marcado con rodamina y [P^{32}], las Calles 2-4 representan el cebador inverso marcado con rodamina y [P^{32}] tras la incubación con ADN polimerasa de T4 que tiene actividad exonucleasa 3'-5' durante 2 minutos (Calle 2), 5 minutos (Calle 3), y 15 minutos (Calle 4).

La Figura 16 ilustra la detección del producto de amplificación por FRET tras el tratamiento con nucleasa (Sección 10, Ejemplo 4). El espectro de emisión 1 fue obtenido tras la triamplificación con un molde de ADN y tratamiento con exonucleasa. El espectro 2 fue obtenido tras la triamplificación sin molde de ADN y tratamiento con exonucleasa (sin control de ADN).

Las Figuras 17A-B lustran el efecto de las temperaturas elevadas (75ºC) sobre FRET tras la triamplificación (A) sin y (B) con un molde de ADN (Sección 11, Ejemplo 5).

Figuras 18A-B. La Figura 18A representa la estructura del cebador en horquilla aguas arriba del ADNc de PSA (SEC ID NUM: 10). La porción de la secuencia complementaria al ADN diana se muestra en negrita. La Figura 18B muestra un espectro de emisión del cebador en horquilla marcado con fluoresceína en ausencia (1) y en presencia (2) de un radical DABCYL. Los espectros obtenidos a partir de 0,5 ml de una muestra 40 nM de oligonucleótido fueron medidos como se describe en la Sección 6.4 utilizando una longitud de onda de excitación de 488 nm.

La Figura 19 muestra la eficacia de la amplificación con los cebadores en horquilla. Los productos de la amplificación fueron separados en un gel de MDE® (FMC Bioproducts, Rockland ME). Se muestra un gel teñido con bromuro de etidio. Las Calles 1-3 muestran los productos de la amplificación de ADNc de PSA 10^{-9} M con un cebador lineal de control no marcado (Calle 1), un cebador en horquilla-FAM (Calle 2), y un cebador en horquilla FAM/DABCYL (Calle 3). Las Calles 4-6 muestran los productos de la amplificación de ADNc de PSA 10^{-11} M con un cebador de control (Calle 4), un cebador en horquilla-FAM (Calle 5), y un cebador en horquilla FAM/DABCYL (Calle 6). La Calle M contiene un marcador de 100 pb (Gibco BRL).

Las Figuras 20A-B ilustran esquemáticamente y muestran los resultados, respectivamente, de una amplificación mediante PCR en presencia de cebadores en horquilla. La amplificación mediante PCR de ADNc de PSA se realizó con dos cebadores: un cebador en horquilla aguas arriba marcado con FAM y DABCYL, y un cebador aguas abajo marcado con P^{32} en su extremo 5' (Figura 20A). Se utilizó como control un cebador aguas arriba sin la estructura en horquilla. La estructura del cebador en horquilla se presenta en la Figura 18A y las secuencias de los cebadores regulares se presentan en la Sección 12.3. La Figura 20B es un autorradiograma que muestra el tamaño del producto de PCR sintetizado. Las hebras marcadas con [P^{32}] de los productos de la PCR fueron sintetizadas en presencia del cebador lineal de control no marcado (Calle 1) o del cebador en horquilla marcado con FAM/DABCYL (Calle 2) y analizado en un gel de poliacrilamida desnaturalizante al 6%.

Figuras 21A-B. La Figura 21A muestra los espectros de fluorescencia de las reacciones de amplificación realizadas con los cebadores en horquilla marcados con FAM/DABCYL. La estructura del cebador en horquilla marcado con FAM/DABCYL se presenta en la Figura 18A y la secuencia del cebador aguas abajo regular se presenta en la Sección 12.3. Los espectros 1-6 muestran la intensidad de fluorescencia del ADNc de PSA amplificado tras 0 (1), 20 (2), 25 (3), 30 (4), 35 (5) o 40 (6) ciclos. La Figura 21B muestra la intensidad de fluorescencia de las mezclas de la reacción de amplificación y la fracción de los cebadores marcados con [P^{32}] incorporada a los productos de la PCR trazada frente al número de ciclos. La incorporación de los cebadores marcados con [P^{32}] a los productos de la PCR fue determinada mediante electroforesis en un gel desnaturalizante al 6% y cuantificada utilizando el PhosphorImager.

La Figura 22 muestra la sensibilidad de la PCR con los cebadores en horquilla. Los espectros 1-6 muestran los resultados de la amplificación cuando se utilizaban 0 (1), 10 (2), 10^{2} (3), 10^{3} (4), 10^{4} (5), 10^{5} (6) o 10^{6} (7) moléculas de ADNc de PSA clonado por reacción como ADN molde para los 40 ciclos de la PCR. La estructura del cebador en horquilla marcado con FAM/DABCYL se presenta en la Figura 18A y la secuencia del cebador aguas abajo regular se presenta en la Sección 12.3.

La Figura 23 muestra la fluorescencia visible de los productos de la PCR sintetizados con los cebadores en horquilla. Se utilizaron 10^{6} (Tubo 1), 10^{4} (Tubo 2), 10^{3} (Tubo 3) y 0 (Tubo 4) moléculas del molde de ADNc de PSA clonado como ADN molde para los 40 ciclos de la PCR con los cebadores en horquilla marcados con FAM/DABCYL. La fluorescencia del ADN fue visualizada en tubos para PCR de pared fina de 0,2 ml utilizando un sistema de análisis de imágenes con un transiluminador UV.

Las Figuras 24A-G muestran la intensidad de fluorescencia del ADNc de PSA amplificado con diferentes cebadores en horquilla marcados con FAM/DABCYL (Figuras 24A-G corresponden a las SEC ID NUM: 13-18, y 25, respectivamente). Todos los cebadores tenían al menos una secuencia de 18 nucleótidos complementaria a la diana, que constaba de una secuencia de cebado de hebra sencilla 3', una secuencia del tallo 3' y parte del bucle. Las secuencias complementarias al ADN diana se muestran en cursiva negrita sombreada. f, FAM; d, DABCYL; nucl, número de nucleótidos; (%) rel., porcentaje de intensidad de fluorescencia relativa al ADN amplificado con el Cebador A.

La Figura 25 ilustra esquemáticamente el uso de cebadores lineales para medir directamente los productos de amplificación de una PCR. Se genera una señal de transferencia de energía tras la incorporación del cebador al producto de la PCR de doble hebra. Tras la amplificación, la señal del cebador incorporado es eliminada mediante hidrólisis con la exonucleasa 3'-5'. D, radical donador; A, radical aceptor; F, cebador directo; R, cebador inverso.

La Figura 26 ilustra los tres grupos de cebadores de PCR utilizados en los experimentos de la Sección 13, Ejemplo 7. Uup (SEC ID NUM: 19) y Ud (SEC ID NUM: 20), son los cebadores aguas arriba y aguas abajo, respectivamente, para las secuencias de ADN no metilado tratado con bisulfito. Mup (SEC ID NUM: 21) y Md (SEC ID NUM: 22), son los cebadores aguas arriba y aguas abajo, respectivamente, para las secuencias del ADN metilado tratado con bisulfito. Wup (SEC ID NUM: 23) y Wd (SEC ID NUM: 24), son los cebadores aguas arriba y aguas abajo, respectivamente, para ADN no tratado con bisulfito. Uno de los cebadores de cada grupo tiene estructura en horquilla en su extremo 5', marcado con un par FRET FAM/DAB (DABCYL) en las posiciones ilustradas.

La Figura 27 muestra en ejemplo de la estructura de un cebador en horquilla, BSK38, (SEC ID NUM: 26) que puede ser utilizado en la PCR in situ de una secuencia viral gag, descrita en la Sección 17, Ejemplo 11.

Las Figuras 28A-B muestran la fluorescencia visual de los productos de la PCR sintetizados con un cebador en horquilla universal, descrito en la Sección 14, Ejemplo 8. Se utilizaron ADNc de PSA clonado (A; fila superior) y ADN genómico de Chlamydia (B; fila inferior) como diana. Columna (1), mezcla de reacción completa. Columna (2), Control 1, mezcla de reacción sin cebador provisto de cola. Columna (3), Control 2, mezcla de reacción sin molde de ADN.

Las Figuras 29A-B muestran un análisis TRAP (protocolo de amplificación de repeticiones teloméricas) que utiliza la PCR y análisis para las células con actividad telomerasa o tejidos de interés. En la Figura 29A (Etapa 1), la telomerasa añade numerosas repeticiones teloméricas (GGTTAG) (estando la repetición más larga mostrada en la línea inferior SEC ID NUM: 27) en el extremo 3' de un oligonucleótido sustrato (SEC ID NUM: 28) (TS, sustrato de la telomerasa).

En las Figura 29B (Etapa 2), los productos prolongados son amplificados mediante PCR utilizando el TS y un cebador inverso (RP), generando una escala de productos con incrementos de 6 bases que empieza a los 50 oligonucleótidos: 50, 56, 62, 68, etc.

La Figura 30A muestra la secuencia de un cebador en horquilla (SEC ID NUM: 37) que fue utilizada en el análisis TRAP descrito en el Ejemplo 9, Sección 15.

La Figura 30B muestra los resultados de un análisis TRAP realizado utilizando el cebador TS y un cebador RP en horquilla de la secuencia mostrada en la Figura 30A. Los análisis se realizaron sobre extractos celulares equivalentes a 10.000, 1.000, 100 o 10 células. Asimismo se realizaron tres controles negativos. No Taq, no se añadió polimerasa Taq a la reacción (control negativo 1). CHAPS, se utilizó tampón de lisis CHAPS, en lugar de extracto celular en la reacción (control negativo 2). +H, se trató con calor un extracto celular de 10.000 células antes del análisis (control negativo 3). 10, análisis TRAP con extracto celular de 10 células. 100, análisis TRAP con extracto celular de 100 células. 1.000,
análisis TRAP con extracto celular de 1.000 células. 10.000, análisis TRAP con extracto celular de 10.000 células.

La Figura 31 representa diagramáticamente la Amplificación de Círculo Rodador en Cascada (CRCA), que se describe en la Sección 5.2.6. Q, extintor; F, fluoróforo.

La Figura 32 muestra los cebadores en horquilla del círculo rodador (directo) 1 y 2 (SEC ID NUM: 46 y 47, respectivamente), los cebadores en horquilla inversos 1 y 2 (SEC ID NUM: 48 y 49, respectivamente), el cebador directo no dispuesto en horquilla (círculo rodador) (SEC ID NUM: 50), el cebador inverso no dispuesto en horquilla (SEC ID NUM: 51), como se describe en la Sección 19, Ejemplo 13. Las secuencias cebadoras en horquilla complementarias a la sonda o a los productos del círculo rodador están subrayadas. El cebador directo no dispuesto en horquilla (es decir, lineal) (SEC ID NUM: 50) tenía una secuencia que correspondía a la porción subrayada de las secuencias 1 y 2 del cebador en horquilla directo (círculo rodador). El cebador inverso no dispuesto en horquilla (SEC ID NUM: 52) tenía una secuencia que correspondía a la porción subrayada de las secuencias 1 y 2 del cebador en horquilla inverso. Las secuencias espaciadoras se muestran en negrita. Los nucleótidos a los cuales están anclados los dos radicales de un par MET se marcan con asteriscos (*).

También se representa en la Figura 32 un diagrama de una sonda circularizada para CRCA, que comprende una secuencia específica de la diana (5'-TGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCT-3') (SEC ID NUM: 52) para pUC19 y una secuencia espaciadora (genérica) que incluye una unión por ligadura como se describe en la Sección 19, Ejemplo 13. Asimismo se representa una secuencia específica de la diana para ras (5'-GTTGGAGCTGGTGGCGTAG-3') (SEC ID NUM: 53). Esta secuencia específica de ras fue utilizada como secuencia específica de la diana en un experimento adicional descrito en la Sección 19, Ejemplo 13. nucl, número de nucleótidos. pb, pares de bases. T*, nucleótido T con un radical DABCYL anclado. A*, nucleótido A con un radical FAM anclado.

La Figura 33 muestra los resultados de una serie de Amplificaciones mediante Círculo Rodador en Cascada (CRCA) con cebadores en horquilla, como se describe en la Sección 19, Ejemplo 13. El número de círculos molde, es decir la sonda circularizada elaborada utilizando pUC19 como diana, utilizados en cada reacción se indica en el eje de las X. Las señales de MET, medidas en unidades de fluorescencia (eje de las Y), fueron detectadas mediante análisis fluorométrico de los niveles de la señal en CRCA (más ligasa) en relación con los niveles de fondo en las reacciones de control (menos ligasa). -\square-, menos ligasa; -\Delta-, más ligasa.

La Figura 34 muestra células gag positivas en tejido de nódulo linfático de un paciente con infección temprana por VIH-1, tras realizar una PCR in situ utilizando un cebador lineal y un cebador en horquilla marcado con FRET de la invención, como se describe en la Sección 18, Ejemplo 12.

La Figura 35 muestra la misma vista de la muestra tisular que en la Figura 34, a mayor aumento. Las células gag positivas muestran una fuerte señal y hay un fondo bajo en la preparación.

La Figura 36 presenta una muestra tisular que servía como control negativo, en la cual se omitía la polimerasa de Taq del cóctel de amplificación descrito en la Sección 18, Ejemplo 12.

La Figura 37 muestra tejido de nódulo linfático de un paciente infectado por VIH-1, tras realizar una PCR in situ utilizando un cebador lineal y un cebador en horquilla marcado con FRET, como se describe en la Sección 18, Ejemplo 12. No obstante la razón de la señal con respecto al fondo es menor que en las Figuras 34 y 35; hay señal en algunas células pero fondo citoplásmico en otras debido a un lavado post-PCR inadecuado.

La Figura 38 muestra una neurona VIH-1 positiva en el cerebro de un paciente fallecido de demencia por SIDA, tras realizar una PCR in situ utilizando un cebador lineal y un cebador en horquilla marcado con FRET, como se describe en la Sección 18 Ejemplo 12. Obsérvese la buena proporción de la señal con respecto al fondo.

5. Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a oligonucleótidos para la amplificación de ácidos nucleicos que están marcados detectablemente con marcas de transferencia de energía molecular (MET). Uno o más oligonucleótidos de la invención que contienen un radical donador y/o aceptor de un par MET son incorporados al producto amplificado de una reacción de amplificación, de manera que el producto amplificado contiene un radical tanto donador como aceptor de un par MET.

Asimismo la invención se refiere a los métodos para detectar los productos de la amplificación de ácido nucleico utilizando estos oligonucleótidos marcados de la invención. Adicionalmente se refiere a un método rápido, sensible, y fiable para detectar los productos de amplificación que disminuyen enormemente la posibilidad de transferir contaminación con los productos de amplificación y que es adaptable a muchos métodos para la amplificación de secuencias de ácido nucleico, incluyendo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la triamplificación, y otros sistemas de amplificación.

Los oligonucleótidos de amplificación de ácido nucleico de la invención utilizan el principio de MET entre un radical donador y un radical aceptor. En una realización preferida, la MET es la fluorescencia por transferencia de energía resonante (FRET), en la cual los oligonucleótidos están marcados con radicales donadores y aceptores, donde el radical donador es un fluoróforo y el radical aceptor puede ser un fluoróforo, tal que la energía fluorescente emitida por el radical donador es absorbida por el radical aceptor.

El cebador de amplificación es un cebador en horquilla que contiene radicales tanto donadores como aceptores y está configurado de manera que el radical aceptor extinga la fluorescencia del donador. Cuando el cebador es incorporado al producto de amplificación su configuración cambia, la extinción se elimina, y la fluorescencia del radical donador puede ser detectada.

La presente invención proporciona cebadores de amplificación de ácido nucleico que forman una estructura en horquilla en la cual se produce MET cuando el cebador no es incorporado al producto de amplificación. Así, un cebador de la invención forma una estructura en horquilla en la cual la energía de un fluoróforo donador es extinguida por un fluoróforo no fluorescente cuando el cebador no es incorporado al producto de amplificación.

La invención proporciona un método para detectar o medir un producto de una reacción de amplificación de ácido nucleico que comprende: (a) poner en contacto una muestra que comprende ácidos nucleicos con al menos dos cebadores oligonucleotídicos, estando adaptados dichos cebadores oligonucleotídicos para su uso en dicha reacción de amplificación de manera que dichos cebadores sean incorporados al producto amplificado de dicha reacción de amplificación cuando está presente en la muestra una secuencia diana preseleccionada; siendo al menos uno de dichos cebadores un cebador en horquilla de la invención; (b) conduciendo la reacción de amplificación; (c) estimulando la emisión de luz desde dicho radical donador; y (d) detectando o midiendo la energía emitida por dicho radical donador o radical aceptor.

Los ácidos nucleicos de la muestra pueden ser purificados o no purificados.

En una realización específica, se utilizan los oligonucleótidos de la invención en reacciones de amplificación in situ, realizadas sobre muestras de tejidos o células frescas o conservadas. En las reacciones in situ, es ventajoso utilizar métodos que permitan la detección exacta y sensible de la diana directamente después de la reacción de amplificación. En contraste, la PCR in situ convencional requiere, en tejido embebido en parafina, detección mediante una etapa de hibridación, ya que el mecanismo de reparación del ADN presente invariablemente en las muestras de tejido por ejemplo, de SNC, nódulos linfáticos, y bazo, excluye la detección mediante incorporación directa de un nucleótido informador durante la etapa de PCR. Típicamente, cuando se emplean cebadores lineales convencionales marcados con biotina o digoxigenina en la PCR in situ, se incorpora poca o ninguna marca detectable durante la amplificación, que comprende etapas de recocido y prolongación. Por otra parte, cuando se modifican las condiciones de la reacción de amplificación para intensificar la incorporación de nucleótidos marcados con tales radicales, se obtienen un fondo inaceptablemente elevado y resultados falsos positivos. Esto puede ser atribuido a la actividad de las enzimas reparadoras de ADN endógenas, que incorporan los nucleótidos marcados al ADN con muescas de la muestra. Otros han intentado utilizar otros tipos de cebadores de PCR marcados individualmente (Nuovo, 1997, PCR In Situ Hybridization: Protocols and Applications, Third Edition, Lippincott-Raven Press, Nueva York), pero no han sido capaces de adecuar la sensibilidad, lo que puede conducir a resultados falsos negativos. Los requerimiento para una etapa de hibridación, seguida de una etapa de lavado, añaden tiempo y coste adicionales a los protocolos de PCR in situ convencionales. Por lo tanto es ventajoso utilizar métodos que permitan la detección exacta y sensible de la diana directamente después de la etapa de amplificación. Tales métodos son proporcionados por la presente invención.

La energía emitida por el radical donador que es detectada y medida tras llevar a cabo la reacción de amplificación de la invención se corresponde con la cantidad de la secuencia diana preseleccionada originalmente presente en la muestra, permitiendo de ese modo la determinación de la cantidad de la secuencia diana preseleccionada en la muestra original. Así, se pueden utilizar cuantitativamente los métodos de la invención para determinar el número de cromosomas, o la cantidad de ADN o ARN, que contiene la secuencia diana preseleccionada.

Un par de cebadores, que consta de un cebador directo y un cebador inverso, para su uso en la PCR o en la amplificación por desplazamiento de hebras, consta de cebadores que son cada uno complementario a una hebra diferente de las dos hebras del ácido nucleico complementarias, de manera que cuando se genera un producto de prolongación de un cebador en la dirección del otro cebador por medio de una polimerasa de ácido nucleico, ese producto de prolongación puede servir como molde para la síntesis del producto de prolongación del otro cebador. Un par de cebadores, que consta de un cebador directo y un cebador inverso, para su uso en la triamplificación, consta de cebadores que son cada uno complementario a una hebra diferente de las dos hebras del ácido nucleico complementarias, de manera que cuando se genera un producto de prolongación-ligadura de un cebador en la dirección del otro cebador por medio de una polimerasa de ácido nucleico y una ligasa de ácido nucleico, ese producto de prolongación-ligadura puede servir como molde para la síntesis del producto de prolongación-ligadura del otro cebador. El producto amplificado en estos casos es el contenido de ácido nucleico en la muestra entre, e incluyendo, las secuencias cebadoras.

Según se hace referencia aquí, los ácidos nucleicos que con "complementarios" pueden ser perfectamente o imperfectamente complementarios, con tal que la propiedad deseada resultante de la complementariedad no se pierda, v.g. la capacidad para hibridar.

Así, la invención proporciona un método para detectar o medir un producto de una reacción de amplificación de ácido nucleico que comprende (a) poner en contacto una muestra que comprende ácidos nucleicos con al menos dos cebadores oligonucleotídicos, estando adaptados dichos cebadores oligonucleotídicos para el uso en dicha reacción de amplificación de manera que dichos cebadores sean incorporados a un producto amplificado de dicha reacción de amplificación cuando una secuencia diana preseleccionada esté presente en la muestra; siendo al menos uno de dichos cebadores oligonucleotídicos un cebador en horquilla de la invención marcado con un radical donador y un radical aceptor; (b) llevar a cabo la reacción de amplificación; (c) estimular la emisión de energía desde dicho radical donador; y (d) detectar o medir la energía emitida por dicho radical donador.

La presente invención también proporciona un método para detectar directamente los productos de amplificación. Esta técnica mejorada satisface dos requerimientos principales. Primero, permite la detección del producto amplificado son separación previa de los oligonucléotidos incorporados. Segundo, permite la detección del producto de amplificación directamente, incorporando el o los oligonucléotidos marcados al producto.

En una realización adicional, la presente invención proporciona un método para la detección directa de productos de amplificación en el cual se puede realizar la detección sin abrir el tubo de reacción. Esta realización, el formato de "tubo cerrado", reduce enormemente la posibilidad de transferir contaminación con los productos de amplificación que ha disminuido la aceptación de la PCR en muchas aplicaciones. El método del tubo cerrado también proporciona un elevado rendimiento total de las muestras y puede ser totalmente automatizado. La presente invención también se refiere a estuches para la detección o la medida de productos de amplificación de ácidos nucleicos. Tales estuches pueden ser estuches de diagnóstico en los que la presencia del ácido nucleico que está siendo amplificado se corresponde con la presencia o ausencia de una enfermedad o trastorno.

Para una mayor claridad de la descripción, y en modo alguno como limitación, la descripción detallada de la invención se divide en las subsecciones mostradas más abajo.

5.1. Oligonucleótidos

La presente invención proporciona oligonucleótidos para la amplificación de ácido nucleico que son incorporados al producto amplificado y que utilizan el principio de la transferencia de energía molecular (MET) y, preferiblemente, la fluorescencia por transferencia de energía resonante (FRET). Los oligonucleótidos de la invención son marcados con un radical donador y/o aceptor, es decir, un par "MET". El radical aceptor puede simplemente extinguir la emisión del radical donador, o puede a su vez emitir energía tras la excitación por la emisión desde el radical donador. En una realización preferida, el radical donador es un fluoróforo y el radical aceptor puede o no ser un fluoróforo, de manera que la energía fluorescente emitida por el radical donador es absorbida por el radical aceptor. Los oligonucléotidos marcados son cebadores directo y/o inverso, y/o en el caso de la triamplificación, un oligonucleótido bloqueador. Los oligonucleótidos utilizados en la reacción de amplificación están marcados de manera que al menos un par MET se incorpore al producto amplificado (aunque la actividad exonucleasa 5'-3', si está presente, puede separar con posterioridad un radical de al menos alguno de la población de productos amplificados).

El radical aceptor es un extintor que extingue la fluorescencia del donador cuando los radicales donador y aceptor son incorporados al producto de amplificación suficientemente cerca para que se produzca la MET.

Se utiliza un cebador oligonucleotídico que forma una estructura en horquilla en la cual se produce FRET, cuando el cebador no es incorporado al producto de amplificación. En una realización preferida, el cebador en horquilla es marcado con un par FRET donador-extintor. Cuando el cebador en horquilla es incorporado al producto de amplificación, su configuración cambia (es decir, se linealiza), la extinción se elimina, y la fluorescencia del donador puede ser detectada.

Los oligonucleótidos para su uso en las reacciones de amplificación pueden ser de cualquier tamaño adecuado, y están preferiblemente en el intervalo de 10-100 o 10-80 nucleótidos, más preferiblemente 20-40 nucleótidos.

El oligonucleótido puede ser ADN o ARN o mezclas quiméricas o derivados o versiones modificadas de los mismos, con tal que todavía sea capaz de cebar la reacción de amplificación deseada, o, en el caso de un oligonucleótido bloqueador, de funcionar como oligonucleótido bloqueador. Además de ser marcado con un radical de MET, el oligonucleótido puede ser modificado en el radical base, el radical azúcar, o el esqueleto de fosfato, y puede incluir otros grupos adjuntos o marcas, con tal que todavía sea capaz de cebar la reacción de amplificación deseada, o de funcionar como oligonucleótido bloqueador, según sea el caso.

Por ejemplo, el oligonucleótido puede comprender al menos un radical base modificado que se selecciona del grupo formado por pero no limitado a 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroxilmetil)-uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico de ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético (v), 5-metil-2-tiouracilo, 3-(3-amino-N-2-carboxipropil)-uracilo, (acp3)w, y 2,6-diaminopurina.

En otra realización, el oligonucleótido comprende al menos un radical azúcar modificado seleccionado del grupo que incluye pero no limitado a arabinosa, 2-fluoroarabinosa, xilulosa, y hexosa.

En otra realización más, el oligonucleótido comprende al menos un esqueleto de fosfato modificado seleccionado del grupo formado por un fosforotioato, un fosforoditioato, un fosforamidotioato, un fosforamidato, un fosforodiamidato, un metilfosfonato, un alquilfosfotriéster, y un formacetal o análogo del mismo.

Los oligonucleótidos de la invención pueden ser sintetizados mediante métodos normalizados conocidos en la técnica, v.g. mediante el uso de un sintetizador de ADN automatizado (tal como los asequibles comercialmente de Biosearch, Applied Biosystems, etc.). Como ejemplos, los oligonucléotidos de fosforotioato pueden ser sintetizados mediante el método de Stein y col., (1988, Nucl. Acids Res. 16:3209), los oligonucleótidos de metilfosfonato pueden ser preparados mediante el uso de soportes poliméricos de vidrio con poro controlado (Sarin y col., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:7448-7451), etc.

Los oligonucleótidos de la presente invención pueden ser derivados mediante métodos conocidos en la técnica, v.g., mediante la síntesis química de novo de polinucleótidos utilizando un sintetizador de ADN automatizado (tal como el asequible comercialmente de Biosearch, Applied Biosystems, etc.) y la química de la fosforamidita normalizada; o mediante escisión de un fragmento de ácido nucleico más grande utilizando productos químicos para la escisión de ácido nucleico no específica o enzimas o endonucleasa de restricción de sitio específico.

Un método preferible para sintetizar oligonucleótidos se lleva a cabo utilizando un sintetizador de ADN automatizado mediante métodos conocidos en la técnica. Como ejemplos, se pueden sintetizar oligonucleótidos mediante el método de Stein y col. (1988, Nucl. Acids Res. 16:3209-3221), se pueden preparar oligonucleótidos de metilfosfonato mediante el uso de soportes poliméricos de vidrio de poro controlado (Sarin y col., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:7448-7451), etc. Una vez que el oligonucleótido se ha sintetizado, se escinde del soporte sólido sobre el cual había sido sintetizado y tratado, mediante métodos conocidos en la técnica, para separar cualquiera de los grupos protectores presentes. El oligonucleótido puede ser purificado después mediante cualquier método conocido en la técnica, incluyendo la extracción y la purificación en gel. La concentración y la pureza del oligonucleótido pueden ser determinadas examinando el oligonucleótido que se ha separado sobre el gel de acrilamida, o midiendo la densidad óptica a 260 nm en un espectrofotómetro.

Los oligonucléotidos de la invención pueden ser marcados con radicales donadores y aceptores durante la síntesis química o la marca puede ser anclada tras la síntesis mediante métodos conocidos en la técnica. En una realización específica, se utilizan los siguientes pares donador y aceptor de MET: un quelato de lantánido luminiscente, v.g., quelato de terbio o quelato de lantánido, se utiliza como donador, y un colorante orgánico tal como fluoresceína, rodamina o CY-5, se utiliza como aceptor. Preferiblemente, se utiliza terbio como donador y fluoresceína o rodamina como aceptor, o se utiliza europio como donador y CY-5 como aceptor. En otra realización específica, el donador es fluorescente, v.g., fluoresceína, rodamina o CY-5, y el aceptor es luminiscente, v.g., un quelato de lantánido. En otra realización más, el donador de energía es luminiscente, v.g., un quelato de lantánido, y el aceptor de energía puede ser no fluorescente. La transferencia de energía produce como resultado la emisión del donador.

En otra realización específica, el radical donador es un fluoróforo. En otra realización específica, ambos radicales donador y aceptor son fluoróforos. Los radicales adecuados que se pueden seleccionar como donadores o aceptores en pares FRET se exponen en la Tabla 1.

TABLA 1 Radicales adecuados que pueden ser seleccionados como donadores o aceptores en los pares FRET

ácido 4-acetamido-4'-isotiocianatoestilbeno-2,2'-disulfónico

acridina y derivados:

acridina

isotiocianato de acridina

ácido 5-(2'-aminoetil)aminonaftaleno-1-sulfónico (EDANS)

4-amino-N-[3-vinilsulfonil)fenil]naftalimido-3,5-disulfonato (Amarillo Lucifer VS)

N-(4-anilino-1-naftil)maleimida

antranilamida

Amarillo Brillante

cumarina y derivados:

Cumarina

7-amino-4-metilcumarina (AMC, Cumarina 120)

7-amino-4-trifluorometilcumarina (Cumarina 151)cianosina

4',6-diaminidino-2-fenilindol (DAPI)

5',5''-dibromopirogalol-sulfoneftaleína (Rojo Bromopirogalol)

7-dietilamino-3-(4'-isotiocianatofenil)-4-metilcumarina

pentaacetato de dietilentriamina

ácido 4,4'-diisotiocianatodihidro-estilbeno-2,2'-disulfónico

ácido 4,4'-diisotiocianatoestilbeno-2,2'-disulfónico

cloruro de 5-[dimetilamino]naftaleno-1-sulfonilo (DNS, cloruro de dansilo

ácido 4-(4'-dimetilaminofenilazo)benzoico (DABCYL)

4-dimetilaminofenilazofenil-4'-isotiocianato (DABITC)

TABLA 1 (continuación)

eosina y derivados:

eosina

isocianato de eosina

eritrosina y derivados:

eritrosina B

isocianato de eritrosina

etidio

fluoresceína y derivados:

5-carboxifluoresceína (FAM)

5-(4,6-diclorotriazin-2-il)aminofluoresceína (DTAF)

2',7'-dimetoxi-4',5'-dicloro-6-carboxifluoresceína (JOE)

fluoresceína

isotiocianato de fluoresceína

QFITC (XRITC)

Fluorescamina

IR144

IR1446

Isotiocianato Verde Malaquita

4-metilumbeliferona

orto-cresolftaleína

nitrotirosina

pararosanilina

Rojo Fenol

B-ficoeritrina

o-ftaldialdehído

pireno y derivados:

pireno

butirato de pireno

succinimidil 1-pireno butirato

Rojo Reactivo 4 (Cibacron® Rojo Brillante 3B-4)

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TABLA 1 (continuación)

rodamina y derivados:

6-carboxi-X-rodamina (ROX)

6-carboxirodamina (R6G)

lisamina rodamina B cloruro de sulfonilo

rodamina (Rod)

rodamina B

rodamina 123

isotiocinato de rodamina X

sulforrodamina B

sulforrodamina 101

derivado cloruro de sulfonilo de sulforrodamina 101 (Rojo Texas)

N,N,N',N'-tetrametil-6-carboxirrodamina (TAMRA)

tetrametilrrodamina

isotiocianato de tetrametilrrodamina (TRITC)

riboflavina

ácido rosólico

derivados de quelato de terbio

Un experto normal en la técnica puede determinar fácilmente, utilizando mecanismos de espectrofotometría conocidos en la técnica qué fluoróforos formarán pares FRET donador-aceptor adecuados. Por ejemplo, FAM (que tiene un máximo de emisión de 525 nm) es un donador adecuado para TAMRA, ROX, y R6G (todos los cuales tienen un máximo de excitación de 514 nm) en un par FRET. Los cebadores son modificados preferiblemente durante la síntesis, de manera que se introduce una base T modificada en una posición diseñada mediante el uso del Amino-Modifier C6 dT (Glen Research), y se incorpora un grupo amino primario a la base T modificada, como describen Ju y col. (1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:4347-4351). Estas modificaciones pueden ser utilizadas para la posterior incorporación de colorantes fluorescentes en posiciones designadas de los oligonucleótidos.

La distancia óptima entre los radicales donador y aceptor será aquella distancia en la cual las emisiones del radical donador son absorbidas por el radical aceptor. Esta distancia óptima varía con los radicales específicos utilizados, y puede ser fácilmente determinada por un experto normal en la técnica utilizando mecanismos conocidos en la técnica. Para la transferencia de energía en la cual se desea que el radical aceptor sea un fluoróforo que emita energía para ser detectada, los fluoróforos donador y aceptor están separados preferiblemente por una distancia de hasta 30 nucleótidos, más preferiblemente de 3 a 20 nucleótidos, y aún más preferiblemente de 6 a 12 nucleótidos. Para la transferencia de energía en la cual se desea que el radical aceptor extinga las emisiones del donador, los radicales donador y aceptor estén separados preferiblemente por una distancia de menos de un nucleótido (v.g., en la hebra opuesta, nucleótidos complementarios de una estructura dúplex), aunque también resulta ventajoso utilizar una distancia de 5 nucleótidos (una vuelta de hélice).

En otra realización, los oligonucleótidos pueden estar marcados adicionalmente con cualquier marcador detectable conocido en la técnica, incluyendo marcas radiactivas tales como P^{32}, S^{35}, H^{3}, y similares, o con marcadores enzimáticos que producen señales detectables cuando se lleva a cabo una reacción química concreta, tal como fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano picante. Tales marcadores enzimáticos son preferiblemente estables al calor, con el fin de que sobrevivan a las etapas desnaturalizantes del procedimiento de amplificación.

Los oligonucléotidos también pueden estar marcados indirectamente incorporando un nucleótido unido covalentemente a un hapteno o a una molécula tal como biotina, a la cual se puede unir una molécula de avidina, o digoxigenina, a la cual se puede unir un anticuerpo anti-digoxigenina marcado. Los oligonucleótidos pueden estar marcados suplementariamente durante la síntesis química o la marca suplementaria puede ser anclada después de la síntesis mediante métodos conocidos en la técnica.

Los oligonucleótidos de la invención tienen uso en las reacciones de amplificación de ácidos nucleicos, como cebadores, para detectar o medir un ácido nucleico producto de la reacción de amplificación, detectando o midiendo de ese modo un ácido nucleico diana en una muestra que es complementaria a una secuencia cebadora 3'. Por consiguiente, los oligonucleótidos de la invención pueden ser utilizados en métodos de diagnosis, en los que una secuencia cebadora 3' es complementaria a una secuencia (v.g., genómica) de un agente de una enfermedad infecciosa, v.g., una enfermedad humana incluyendo pero no limitada a virus, bacterias, parásitos, y hongos, diagnosticando de ese modo la presencia del agente infeccioso en una muestra de ácido nucleico de un paciente. El ácido nucleico diana puede ser genómico o ADNc o ARNm o sintético, humano o animal, o de un microorganismo, etc. En otra realización que se puede utilizar en la diagnosis o prognosis de una enfermedad o trastorno, la secuencia diana es una secuencia genómica o de ARN o ADNc humana de tipo salvaje, cuya mutación está implicada en la presencia de una enfermedad o trastorno humano o, alternativamente, puede ser la secuencia mutada. En semejante realización, opcionalmente, la reacción de amplificación puede ser repetida para la misma muestra con diferentes grupos de cebadores que amplifican, respectivamente, la secuencia de tipo salvaje o la versión mutada. A modo de ejemplo, la mutación puede ser una inserción, una sustitución y/o una deleción de uno o más nucleótidos, o una translocación.

Cebadores en horquilla

La presente invención proporciona cebadores oligonucleotídicos que forman una estructura en horquilla en la cual se producirá la MET cuando el cebador no sea incorporado al producto de la amplificación.

Por consiguiente, la invención proporciona, en particular:

un oligonucleótido que comprende las siguientes secuencias contiguas en orden 5' a 3':

(a) una primera secuencia de nucleótidos de 6-30 nucleótidos, donde un nucleótido de la primera secuencia de nucleótidos está marcado con un primer radical seleccionado entre un radical donador y un radical aceptor de un par de transferencia de energía molecular, donde el radical donador emite fluorescencia a una o más longitudes de onda concretas cuando es excitado, y el radical aceptor absorbe y extingue dicha fluorescencia emitida por dicho radical donador;

(b) una segunda secuencia de nucleótidos de hebra sencilla de 3-20 nucleótidos;

(c) una tercera secuencia de nucleótidos de 6-30 nucleótidos; donde un oligonucleótidos de dicha tercera secuencia está marcado con un segundo radical seleccionado entre dicho radical donador y dicho radical aceptor, y dicho segundo radical es el miembro de dicho grupo que no marca dicha primera secuencia de nucleótidos, donde dicha tercera secuencia de nucleótidos es complementaria en orden inverso a dicha primera secuencia de nucleótidos de manera que se pueda formar un dúplex entre dicha primera secuencia de nucleótidos y dicha tercera secuencia de nucleótidos de manera que dichos primer radical y segundo radical estén próximos de manera que, cuando el radical donador es excitado y emite fluorescencia, el radical aceptor absorbe y extingue dicha fluorescencia emitida por dicho radical donador; y

(d) en el extremo 3' de dicho oligonucleótido, una cuarta secuencia de nucleótidos de hebra sencilla de 8-40 nucleótidos que comprende en su extremo 3' una secuencia complementaria a una secuencia diana preseleccionada y es capaz de cebar la síntesis por medio de una polimerasa de ácido nucleico de una secuencia de nucleótidos complementaria a una hebra de ácido nucleico que comprende dicha secuencia diana;

donde cuando no se forma dicho dúplex, dicho primer radical y dicho segundo radical están separados por una distancia que evita la transferencia de energía molecular entre dichos primer y segundo radicales.

En una realización específica en la que los radicales donador y aceptor son un par FRET, se observa la separación del primer y segundo radicales por la distancia que evita la FRET por el fracaso del segundo radical para extinguir la fluorescencia del primer radical (cuando el segundo radical es un extintor), o el fracaso del segundo radical para absorber la fluorescencia del primer radical y después emitir fluorescencia por sí mismo (cuando el segundo radical es un fluoróforo).

En una realización específica, la segunda secuencia de nucleótidos (la estructura en bucle) y/o la primera secuencia de nucleótidos (del dúplex) y/o la tercera secuencia de nucleótidos (del dúplex) no contienen una secuencia complementaria a la secuencia diana. Alternativamente, la segunda secuencia de nucleótidos y/o la primera secuencia de nucleótidos y/o la tercera secuencia de nucleótidos o cualquier porción de las secuencias anteriores también pueden contener una secuencia complementaria a la secuencia diana.

Así, un cebador de la invención forma una estructura en horquilla en la cual la energía de un fluoróforo donador es extinguida por un radical aceptor no fluorescente cuando el cebador no es incorporado al producto de amplificación. Un experto normal en la técnica puede determinar fácilmente, a partir de las estructuras y los caracteres hidrófobos conocidos de un par FRET dado, la disposición estérica que pondrá el par en la más íntima proximidad para la MET.

El cebador en horquilla comprende cuatro partes (Figura 1): la Parte (d) es una secuencia terminal 3' y comprende una secuencia complementaria a la secuencia diana; es un cebador para la ADN polimerasa. La parte (c) es una primera secuencia del tallo en el extremo 5' de la secuencia del cebador. La Parte (b) forma un bucle de hebra sencilla de nucleótidos. La Parte (a) es una segunda secuencia del tallo, que es complementaria a la primera secuencia del tallo. Las Partes (a), (b) y (c) o las porciones de las mismas pueden ser complementarias o no al ADN diana que se va a amplificar. La Parte (d) tiene preferiblemente una longitud de 8-30 nucleótidos; la Parte (c) tiene una longitud de aproximadamente 6-30 nucleótidos; la Parte (b) tiene una longitud de aproximadamente 3-20, y muy preferiblemente, una longitud de 4-6 nucleótidos.

La primera secuencia del tallo, la Parte (c), contiene el fluoróforo donador y la segunda secuencia del tallo, la Parte (a), contiene el extintor, o puede ser al revés. En un cebador en horquilla no incorporado, la emisión del donador será transferida al aceptor, puesto que los dos radicales estarán en íntima proximidad entre sí cuando las dos secuencias del tallo son un dúplex.

Los radicales donador y aceptor pueden estar localizados en cualquiera de los nucleótidos terminales del tallo de la horquilla (región dúplex), o localizados internamente. Así, en una realización de la invención, los radicales donador y extintor están localizados respectivamente en el extremo 5' de la secuencia del cebador en horquilla que es complementario a la diana y está localizado en el resto nucleotídico complementario del tallo de la horquilla (Figura 1), o viceversa. Cada radical puede estar localizado alternativamente en un nucleótido interno en la secuencia del tallo complementario. Alternativamente, uno de los radicales puede estar localizado en un nucleótido interno y el otro en el nucleótido terminal en el extremo 5'. Uno o ambos radicales pueden estar localizados alternativamente en el otro extremo de la región dúplex.

Preferiblemente, los radicales donador y aceptor están anclados a las hebras complementarias del tallo, un radical en el extremo 5' y el otro radical a 5 pb en la hebra complementaria. Por ejemplo, los dos radicales pueden ser desviados por una vuelta de 5 pb (180º) de la doble hélice formada por las dos hebras complementarias del tallo, y por lo tanto estarán en la más íntima proximidad estéricamente, y la emisión del donador será transferida y extinguida por el aceptor.

Alternativamente, los dos radicales pueden estar en hebras complementarias del tallo separadas por una distancia menor de 1 nucleótido (3,4 \ring{A}) cuando la horquilla esté en configuración cerrada. Muy preferiblemente, los dos radicales están en nucleótidos complementarios del tallo, directamente opuestos entre sí cuando la horquilla está en configuración cerrada.

Cuando un cebador en horquilla es linealizado, el radical donador debe estar separado del radical extintor por una secuencia intermedia que sea suficientemente larga para evitar sustancialmente la FRET. Cuando se utiliza un par FRET que consta de fluoróforos donador y aceptor, los dos radicales de FRET están separados por una secuencia intermedia, que comprende (a) al menos una porción de la primera secuencia del tallo, (b) el bucle, y (c) al menos una porción de la segunda secuencia del tallo; siendo la secuencia intermedia preferiblemente de 15-25 nucleótidos de longitud, y más preferiblemente, 20 nucleótidos de longitud.

El radical aceptor es un extintor y absorbe la energía emitida por el donador sin fluorescencia. La fluorescencia del donador puede ser detectada solamente cuando el cebador está en estado linealizado, abierto es decir, está incorporado al producto de la amplificación de doble hebra. La transferencia de energía en este estado será mínima y la fuerte señal de emisión del donador será detectada.

Un aspecto crítico de la invención es que la transición del estado cerrado al abierto se produce solamente durante la amplificación. Las Figuras 2 y 3 ilustran esquemáticamente el uso de cebadores en horquilla de la presente invención en la PCR. En la Figura 2, la ADN polimerasa utilizada en la PCR carece de actividad exonucleasa 5'-3', mientras en la Figura 3, tiene actividad 5'-3'. Para la PCR, cualquiera o ambos cebadores de la PCR pueden ser un cebador en horquilla.

En las Figuras 2 y 3, (a) y (b) son dos hebras complementarias de la secuencia diana que se va a amplificar y "R" y "F" son los cebadores inverso y directo, respectivamente, para la amplificación mediante PCR. A modo de ejemplo y no de limitación, el cebador en horquilla inverso es diseñado de manera que haya un fluoróforo donador y un extintor incorporados a él. El cebador en horquilla inverso que no es incorporado al producto de la PCR tendrá un fluoróforo y un extintor en íntima proximidad; así la fluorescencia del cebador inverso libre será extinguida. Ver la Sección 5.2.1 más abajo para los métodos de utilización de los cebadores en horquilla en la PCR.

Horquillas universales y cebadores en horquilla

En una realización, el oligonucleótido de la invención puede ser obtenido utilizando una horquilla "universal" que puede estar ligada, ya sea químicamente (v.g., utilizando bromuro de cianógeno) o enzimáticamente (v.g., utilizando una ligasa) a cualquier secuencia cebadora seleccionada y utilizada para amplificar una secuencia de ácido nucleico diana que contiene el complemento de la secuencia cebadora. La invención por tanto hace referencia a una horquilla "universal" que es un oligonucleótido, cuya secuencia de nucleótidos consta de las siguientes secuencias contiguas en orden 5' a 3':

(a)

una primera secuencia de nucleótidos de hebra sencilla de 1 a 10 nucleótidos;

(b)

una segunda secuencia de nucleótidos de 2-30 nucleótidos, donde un nucleótido de dicha primera secuencia de nucleótidos o de dicha segunda secuencia de nucleótidos está marcado con un primer radical seleccionado entre un radical donador y un radical aceptor de un par de transferencia de energía molecular, donde el radical donador emite fluorescencia a una o más longitudes de onda concretas cuando es excitado, y el radical aceptor absorbe y extingue dicha fluorescencia emitida por dicho radical donador;

(c)

una tercera secuencia de hebra sencilla de 3-20 nucleótidos; y

(d)

una cuarta secuencia de 2-30 nucleótidos, donde un nucleótido de dicha cuarta secuencia está marcado con un segundo radical seleccionado entre dicho radical donador y dicho radical aceptor, y dicho segundo radical es el miembro de dicho grupo que no marca dicha primera o segunda secuencia de nucleótidos, donde dicha cuarta secuencia de nucleótidos es complementaria en orden inverso a dicha segunda secuencia de nucleótidos de manera que se puede formar un dúplex entre dicha segunda secuencia de nucleótidos y dicha cuarta secuencia de nucleótidos de manera que dichos primer radical y segundo radical están próximos de modo que, cuando el radical donador es excitado y emite energía, el radical aceptor absorbe y extingue dicha fluorescencia emitida por dicho radical donador.

Un ejemplo de horquilla universal se muestra en la Figura 4. La horquilla universal de la invención comprende una primera secuencia del tallo en el extremo 3' (2-30 nucleótidos de longitud, preferiblemente 4-6 nucleótidos de longitud), un bucle (3-20 nucleótidos de longitud, preferiblemente 4-6 nucleótidos de longitud), una segunda secuencia del tallo esencialmente complementaria a la primera secuencia del tallo (2-30 nucleótidos de longitud, preferiblemente 4-6 nucleótidos de longitud), y una secuencia terminal cohesiva ("pegajosa") de hebra sencilla 5' (v.g., 1-20 nucleótidos de longitud, preferiblemente 3-4 nucleótidos de longitud). En una realización específica, la secuencia terminal "pegajosa" es 5'-GGC-3'.

Las secuencias del cebador seleccionadas que son complementarias a la secuencia de ADN diana y que son adecuadas para la ligadura a la horquilla universal pueden ser derivadas mediante métodos normalizados conocidos en la técnica, v.g., mediante la síntesis química de polinucleótidos de novo utilizando un sintetizador de ADN automatizado y la química de la fosforamidita normalizada; o mediante escisión de un fragmento de ácido nucleico más grande utilizando productos químicos o enzima de escisión de ácidos nucleicos no específicos o endonucleasas de restricción de sitio específico.

Con el fin de unir la horquilla universal a la secuencia del cebador seleccionada, la secuencia del cebador seleccionada debe contener una secuencia cohesiva en el extremo 5' esencialmente complementaria a la secuencia cohesiva de la horquilla universal (Figura 4). En una realización, el extremo cohesivo 5' de la secuencia del cebador seleccionada es sintetizado químicamente para complementar el extremo cohesivo 5' de la horquilla universal. En otra realización, el extremo cohesivo 5' de la secuencia del cebador seleccionada es producida mediante el corte escalonado de una endonucleasa de restricción.

Un radical de marcaje de la horquilla universal no debe estar situado de manera que interfiera sustancialmente en la ligadura en su extremo 3' a la secuencia del cebador seleccionada. Así, preferiblemente, un radical de marcaje no se localiza en el nucleótido 3' terminal de la horquilla universal (Figura 4). En el extremo 5' de la horquilla, se puede localizar un radical de marcaje o bien en el nucleótido terminal en el extremo 5' (como se muestra en la Figura 4) o bien en un nucleótido interno con respecto al extremo 5'.

Los restos donador (fluroescente) y aceptor (extintor) de una horquilla universal tal como la mostrada en la Figura 4 deben estar separados por una distancia tal que las emisiones del radical donador sean extinguidas por el radical aceptor. Preferiblemente, los radicales donador y aceptor están separados por una distancia de menos de 1 nucleótido (3,4 \ring{A}) cuando la horquilla está en la configuración cerrada.

En una realización, los dos radicales FRET están separados por una secuencia intermedia, que comprende una porción de la primera secuencia del tallo, el bucle, y una porción de la segunda secuencia del tallo, que tiene preferiblemente 15-25 nucleótidos de longitud. Más preferiblemente, el bucle de la horquilla universal es suficientemente largo para proporcionar una distancia de 20 nucleótidos entre un donador (v.g., FAM) y un extintor (v.g., DABCYL) cuando la horquilla está en configuración "abierta".

La Figura 4 proporciona un ejemplo esquemático de una secuencia diana seleccionada (8-40 nucleótidos, preferiblemente \sim15 nucleótidos) y una horquilla universal antes de su ligadura entre sí.

En otra realización, se utiliza un cebador en horquilla universal, que contiene una secuencia 3' que, en lugar de ser complementaria a una secuencia de ácido nucleico diana preseleccionada que se va a amplificar, es idéntica a la secuencia de hebra sencilla 5' de otro cebador utilizado en la reacción de amplificación. La secuencia 3' del otro cebador es complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana, mientras su secuencia 5' idéntica no es complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana (ver a modo de ejemplo, la Figura 5 y la Sección 5.2.1).

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5.2. Métodos para la detección de los productos de amplificación utilizando cebadores en horquilla

En una realización específica de un cebador en horquilla de la invención, el radical aceptor es un fluoróforo o extintor que absorbe la energía transmitida por el radical donador. En una realización preferida, el radical aceptor es un extintor; el cebador está configurado de manera que el radical aceptor del cebador libre extinga la fluorescencia del donador. Cuando el cebador es incorporado al producto de amplificación, su configuración cambia, la extinción se elimina, y la fluorescencia del radical donador es detectada.

El método de detección de la presente invención puede ser aplicado a cualquier sistema de amplificación en el cual se incorpore un oligonucleótido al producto de amplificación v.g., sistemas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Patente de los Estados Unidos Núm. 4.683.195 y 4.683.202), sistemas de triamplificación (TriAmp®, Oncor Inc.) presentada el 5 de Junio de 1995; Publicación Internacional PCT Núm. WO 9417206 A1, fechada el 4 de Agosto, de 1994; Publicación Internacional PCT Núm. WO 9417210 A1, fechada el 4 de Agosto de 1994), amplificación de ácido nucleico basada en secuencias (NASBA) (Patente de los Estados Unidos Núm. 5-409.818; Comton, 1991, Nature 350:91-92), y los sistemas de amplificación por desplazamiento de la hebra (SDA) (Walker y col., 1992, Nucl. Acids Res. 20:1691-1696). Como resultado de la amplificación, los cebadores en horquilla son incorporados a los productos de amplificación polinucleotídicos de doble hebra.

En una realización específica, los cebadores en horquilla se utilizan para cebar una amplificación in situ, en muestras de células o tejidos conservados o frescos (ver, v.g., Nuovo, 1997, PCR In Situ Hybridization: Protocols and Applications, Third Edition, Lippincot-Raven Press, Nueva York).

Aunque más abajo se describen diversas realizaciones específicas que implican un par FRET que implican un par FRET preferido que consta de un radical fluoróforo donador y un radical aceptor extintor, se entenderá que tales realizaciones también podrían haber sido descritas en términos de que el radical aceptor fuera un fluoróforo en lugar de un extintor.

5.2.1. Métodos de utilización de cebadores en horquilla en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

En una realización, los cebadores en horquilla de la invención se utilizan para cebar una reacción en cadena de la polimerasa (PCR), incorporándose de ese modo al producto de amplificación (siendo ilustrados los ejemplos en las Figuras 2 y 3A-D).

Los cebadores de la PCR contienen estructuras en horquilla en sus extremos 5' con los radicales donador y aceptor de FRET localizados en íntima proximidad (30 nucleótidos o menos) en el tallo de la horquilla. Los cebadores son diseñados de manera que la señal fluorescente del radical donador es generada solamente cuando los cebadores son incorporados al producto de amplificación. Los cebadores en horquilla modificados no interfieren en la actividad de la ADN polimerasa, y en un aspecto preferido, se puede utilizar polimerasa Pfu o polimerasa Taq termoestables. Los cebadores directo y/o inverso pueden ser cebadores en horquilla.

En el ejemplo mostrado en la Figura 3, el cebador en horquilla tiene un extintor en su nucleótido terminal 5', y contiene un fluoróforo donador en la hebra opuesta de su dúplex, siendo el fluoróforo y el extintor un par FRET. En el primer ciclo de la PCR (Figura 3B), ambos cebadores hibridarán con las respectivas hebras diana y serán prolongados por la ADN polimerasa. En el segundo ciclo (Figura 3C) el producto prolongado del cebador inverso se volverá un molde para el cebador directo y el producto prolongado del cebador directo se volverá un molde para el cebador inverso. Cuando el cebador directo se prolongado hasta el extremo 5' de la estructura en horquilla, suceden una de dos cosas, dependiendo de la ADN polimerasa utilizada: o bien la actividad exonucleasa 5'-3' de la ADN polimerasa hidrolizará los nucleótidos 5' con el extintor, y/o la ADN polimerasa desplazará el extremo 5' de la horquilla y copiará el molde. En ambos casos, el extintor y el fluoróforo estarán separados entre sí y se generará una señal (Figura 3D).

Los cebadores en horquilla pueden ser empleados en cualquier método de amplificación en el cual el cebador en horquilla no sea complementario a ningún otro oligonucleótido utilizado en la mezcla de reacción, y en el cual el cebador en horquilla sea incorporado al producto de amplificación de ADN de doble hebra, v.g., PCR, triamplificación, amplificación de ácido nucleico basada en secuencias (NASBA), y amplificación por desplazamiento de la hebra (SDA) (ver más abajo). Así, por ejemplo, en la triamplificación que implica el uso de un cebador en horquilla, el otro cebador no dispuesto en horquilla es complementario al oligonucleótido bloqueador.

En otra realización específica (Figura 5), se utiliza un cebador en horquilla universal, junto con dos cebadores lineales seleccionados, el Cebador 1 y el Cebador 2, para cebar una PCR. En este caso, el cebador en horquilla universal es incorporado al producto de amplificación y no está ligado a una de las dos secuencias del cebador lineal. En esta realización, la secuencia 3' del cebador en horquilla universal es idéntica a la secuencia 5' de uno de los del par de cebadores directo o inverso lineales utilizados en la amplificación, y esta secuencia 5' (secuencia "A" del Cebador 2 de la Figura 5) no debe ser complementaria a la secuencia diana.

Durante el primer ciclo de la PCR, el Cebador 1, que es complementario a una hebra del ADN diana (+) es prolongado. El Cebador 2 tiene una porción 3' que tiene una secuencia complementaria a la hebra diana (-) y una porción 5', denominada "A" en la Figura 5, que tiene una secuencia que no es complementaria a la diana. La secuencia A tiene preferiblemente 10-25 nucleótidos de longitud, y más preferiblemente, 12-15 nucleótidos de longitud.

Durante el segundo ciclo, el producto de la prolongación del Cebador 2 (mostrado mediante una flecha) se vuelve un molde para el Cebador 1. El cebador 1 es prolongado y el producto de la amplificación incluye ahora una secuencia, denominada "A'", complementaria a la secuencia A.

Durante el tercer ciclo, la secuencia A del cebador en horquilla se recuece con la secuencia A' del producto de la amplificación del ciclo previo.

Durante el cuarto ciclo, el cebador en horquilla se vuelve un molde para el Cebador 1. Durante la prolongación del Cebador 1, la horquilla se despliega, el extintor y el fluoróforo se separan, y la señal fluorescente es emitida desde el producto de la amplificación. De un modo similar, el método puede ser aplicado a la triamplificación. En este caso, el cebador en horquilla es el cebador no complementario al bloqueador.

5.2.1.1. Métodos de utilización de cebadores en horquilla en la PCR alelo-especifica (ASP)

En otra realización, los cebadores de la invención son utilizados para cebar una PCR alelo-especifica (ASP). En esta realización, uno o ambos cebadores de amplificación pueden ser cebadores en horquilla. En la ASP, un ADN diana es amplificado preferentemente si es completamente complementario al extremo 3' de un cebador de amplificación de la PCR. El extremo 3' del cebador debe terminar en o dentro de un sitio de mutación conocido en un gen (ADN diana) para el cual tiene una secuencia complementaria. En las condiciones de reacción apropiadas, el ADN diana no es amplificado si hay un desemparejamiento de bases (v.g., una sustitución de nucleótidos causada por una mutación) o una pequeña deleción o inserción, en el extremo 3' del cebador (Okayama y col., 1989, J. Lab. Clin. Med. 114:105-113; Sommer y col., 1992, BioTechniques 12:82-87). Así, la ASP puede ser utilizada para detectar la presencia o ausencia de al menos un único desemparejamiento entre la secuencia en horquilla que es complementaria a la secuencia diana preseleccionada y un ácido nucleico de la muestra; la amplificación indica la ausencia de semejante desemparejamiento individual.

5.2.2. Métodos de utilización de los cebadores en horquilla en la triamplificación 5.2.2.1. Etapas generales de las reacciones de triamplificación

Los cebadores en horquilla de la invención pueden ser utilizados en reacciones de triamplificación.

Una reacción de triamplificación está basada en tres oligonucleótidos: dos cebadores y un oligonucleótido bloqueador (bloqueador). Un ejemplo se muestra en la Figura 6. Los dos cebadores, un cebador directo y uno inverso de "prolongación", son complementarios a las dos hebras de un ADN diana (molde) seleccionado. Un tercer oligonucleótido, un bloqueador, es parcialmente complementario a uno de los dos cebadores de prolongación. En la triamplificación se utilizan dos enzimas termoestables: una ADN polimerasa y una ADN ligasa. Durante las etapas repetidas de la polimerización y la ligadura, uno de los cebadores prolongados es ligado al bloqueador.

En una versión de la triamplificación (la versión con "huecos"), el oligonucleótido directo es un cebador sustancialmente complementario a un primer segmento en un primer extremo de la secuencia diana que se va a amplificar. El oligonucleótido inverso es un cebador sustancialmente complementario a un segundo segmento en un segundo extremo de la secuencia de ácido nucleico diana en una hebra diferente del ácido nucleico diana. El tercer oligonucleótido (el "bloqueador" u "oligonucleótido bloqueador") es sustancialmente complementario al menos a una porción del cebador directo o inverso.

Una ilustración esquemática de la triamplificación por huecos, que consta de la elongación y ligadura repetidas del producto de la amplificación, se muestra en la Figura 7. El bloqueador puede ser utilizado a la misma concentración o a una concentración superior de cebadores directo e inverso. Preferiblemente, el bloqueador es utilizado a una concentración de 1,2 a 2 veces superior que la concentración de los cebadores directo e inverso. El cebador complementario al bloqueador es modificado preferiblemente para prevenir el desplazamiento de la hebra durante la amplificación; en una realización preferida, este cebador contiene 2'-O-metilo en una posición complementaria al extremo 5' del bloqueador con el fin de prevenir el desplazamiento de la hebra.

Una versión alternativa de triamplificación, la "versión sin huecos", es sustancialmente similar a la versión con huecos descrita antes, con la diferencia de que el extremo 5' del cebador directo es adyacente al extremo 3' del cebador inverso.

5.2.2.2. Utilización de cebadores en horquilla en las reacciones de triamplificación

En una realización de la invención, los cebadores en horquilla se utilizan para cebar una reacción de triamplificación, quedando de ese modo incorporados al producto de la amplificación. Cuando se utilizan cebadores en horquilla en la triamplificación, la estructura en horquilla es parte de cualquier cebador, ya sea el cebador directo o el inverso, que no es complementario al bloqueador (Figura 6). Este no puede ser utilizado en el cebador complementario al bloqueador, debido, a que en este caso, el bloqueador interferirá en la formación de la horquilla sobre el cebador que no está incorporado al producto de amplificación.

El cebador en horquilla es marcado preferiblemente con un par donador-aceptor de FRET de este tallo. Durante el primer ciclo de triamplificación, el cebador en horquilla será prolongado y se ligará al bloqueador. Durante el segundo ciclo, el cebador en horquilla prolongado se volverá un molde para el segundo cebador. En el transcurso de la prolongación del segundo cebador, la horquilla se abrirá, el extintor se separará del fluoróforo y el donador emitirá una señal fluorescente.

5.2.3. Métodos para la utilización de cebadores En horquilla en la amplificación de ácido nucleico basada en secuencias (NASBA)

Los cebadores de la invención pueden ser utilizados para cebar la amplificación de ácido nucleico basada en secuencias (NASBA), un ejemplo de la cual se muestra en la Figura 9. En la NASBA se utiliza una ciclación continua de reacciones de transcripción inversa y transcripción de ARN y se lleva a cabo a una temperatura. Se utilizan tres enzimas (transcriptasa inversa, ARNasa H, y ARN polimerasa de T7). En una realización, en el método se utilizan dos cebadores, uno de los cuales es un cebador en horquilla de la invención que está marcado con los radicales donador y aceptor (v.g., extintor) de FRET. En una realización alternativa, ambos cebadores son los cebadores en horquilla de la invención.

El Cebador 1 tiene preferiblemente aproximadamente 20 bases en su extremo 3' que son complementarias a un ARN diana y una secuencia promotora 5' con respecto a la secuencia complementaria de diana que es reconocida por la ARN polimerasa de T7. El Cebador 2 es un cebador en horquilla de la invención que es complementario a la secuencia de ARN (-) y tiene una estructura en horquilla en su extremo 5' que está marcada con radicales de transferencia de energía tales como los ilustrados a modo de ejemplo en la Figura 9.

La fase de NASBA sin ciclación continúa como sigue (Figura 9). En la Etapa 1, el Cebador 1 se recuece con la secuencia de ARN diana. La transcriptasa inversa utiliza dNTP para prolongar el extremo 3' del Cebador 1, formando un híbrido de ARN/ADN. En la Etapa 2, la ARNasa H hidroliza la hebra de ARN del híbrido. En la Etapa 3, el Cebador 2 en horquilla se recuece con la hebra de ADN sencilla que queda del híbrido. La transcriptasa inversa sintetiza la segunda hebra de ADN, convirtiendo la región promotora en una doble hebra. En la Etapa 4, la tercera enzima de la mezcla, la ARN polimerasa de T7, se une a la secuencia promotora y genera hasta 100 copias de ARN a partir de cada molécula del molde.

La fase de NSBA con ciclación continúa después como sigue. En la Etapa 5, el Cebador en horquilla 2 se une al molde de ARN a través de su secuencia cebadora del extremo 3', y la transcriptasa inversa lo prolonga y genera un híbrido de ARN/ADN. El extremo 5' de la horquilla es desplazado y copiado como resultado de la replicación. El extintor y el fluoróforo están separados ahora lo suficiente como para que el fluoróforo no sea extinguido más y su fluorescencia sea detectable. En la Etapa 6, la ARNasa H hidroliza la hebra de ARN. El ADN de hebra sencilla resultante es ahora "silencioso" (la fluorescencia es extinguida) debido a que la estructura en horquilla se ha formado de nuevo. En la Etapa 7, el Cebador 1 se une al ADN de hebra sencilla. La transcriptasa inversa se une a los extremos 3' tanto del cebador como del molde de ADN. En la Etapa 8, el extremo 3' del ADN de hebra sencilla es prolongado, rindiendo un promotor activo transcripcionalmente, de doble hebra. Simultáneamente, el extremo 3' del Cebador 1 es prolongado. El extremo 5' de la horquilla es desplazado y copiado como resultado de la replicación. El extintor y el fluoróforo están ahora suficientemente separados para que el fluoróforo no sea extinguido más y su fluorescencia sea detectable. En la Etapa 9, la ARN polimerasa de T7 genera múltiples copias de ARN a partir de cada molécula de molde.

Por tanto en esta realización, los productos de la amplificación de las etapas 5 y 8 tendrán incorporado el cebador en horquilla marcado con FRET y producirán una señal fluorescente durante la fase cíclica.

En el ejemplo anterior, se emplea un cebador en horquilla en el procedimiento de NASBA como describen Compton (1991, Nature 350:91-92). Sin embargo, si se encuentra presente la actividad exonucleasa 5'-3' específica de la polimerasa además de la transcriptasa inversa, la ARN polimerasa de T7 y la ARNasa H, el extremo 5' del cebador en horquilla será hidrolizado durante la replicación. Se generará una señal de fluorescencia no sólo en las etapas 5 y 8, sino también en las etapas 6 y 7, ya que no habrá extintor anclado al molde de ADN.

5.2.4. Métodos de utilización de cebadores en horquilla en la amplificación mediante desplazamiento de la hebra (SDA)

Los cebadores en horquilla de la invención pueden ser utilizados en la amplificación por desplazamiento de la hebra (SDA) de una diana de ADN de doble hebra. Los cebadores directo y/o inverso pueden ser cebadores en horquilla. La SDA depende de la ciclación continua de las etapas de formación de muescas y polimerización/desplazamiento y se lleva a cabo a una temperatura.

En una realización específica (Figura 10), el Cebador 1 y el Cebador 2 son ambos cebadores en horquilla de la invención. Cada uno tiene una secuencia cebadora de hebra sencilla en el extremo 3', un sitio de reconocimiento para la endonucleasa de restricción, y una estructura en horquilla marcada con FRET en el extremo 5'.

La SDA continúa como sigue. En la Etapa 1, el ADN diana es desnaturalizado y el Cebador 1 y el Cebador 2 se recuecen por medio de sus secuencias 3'. En la Etapa 2: Los extremos 3' de los cebadores son prolongados utilizando dNTP, uno de los cuales es un 5'-[\alpha-tio]trifosfato. Se forma un sitio de restricción de doble hebra con una hebra modificada (la hebra tio-modificada es resistente a la hidrólisis de la endonucleasa). Al mismo tiempo, el extremo 5' del cebador en horquilla es desplazado y copiado como resultado de la replicación. El extintor y el fluoróforo están ahora bastante separados para que el fluoróforo no se extinga más y su fluorescencia sea detectable. En la Etapa 3, la hebra no modificada del ADN de doble hebra es mellada por la endonucleasa de restricción. En la Etapa 4, la ADN polimerasa que carece de actividad exonucleasa 5'-3', preferiblemente el Fragmento Grande de la ADN polimerasa de Bst ("Polimerasa LF de Bst"), prolonga el extremo 3' de la muesca, desplazando el ADN diana de hebra sencilla, que pasará a través del mismo ciclo de nuevo.

Por tanto en esta realización, los productos de amplificación de las Etapas 2, 3 y 4 tendrán incorporado el cebador en horquilla marcado con FRET y producirán una señal fluorescente.

5.2.5. Métodos de utilización de cebadores en horquilla en protocolos de amplificacion de repeticiones teloméricas (TRAP)

Los telómeros son estructuras específicas encontradas en los extremos de los cromosomas en eucariotas. En los cromosomas humanos, los telómeros constan de miles de copias de 6 repeticiones de bases (TTAGGG) (Blackburn y Szostak, 1984, Ann. Rev. Biochem. 55:163); Blackburn, 1991, Nature 350: 569; Zakitan, 1989, Ann. Rev. Genet. 23:579). Los telómeros estabilizan los extremos de los cromosomas. Los cromosomas rotos que carecen de telómeros experimentan fusión, transposición, y translocación (Blackburn, 1991, Nature 350:569). En las células somáticas, la longitud de los telómeros se acorta progresivamente con cada división celular tanto in vivo como in vitro (Harley, y col., Nature 345:458; Hastie, y col., 1990, Nature 346:866, Lindsey, y col., 1991, Mutat. Res. 256:45; Counter, y col., EMBO J. 11:1921) debido a la incapacidad del complejo de la ADN polimerasa para replicar el mismo extremo 5' de la hebra retardada.

La telomerasa es una riboproteína que sintetiza y dirige las repeticiones teloméricas sobre el extremo 3' de los telómeros existentes utilizando su componente de ARN como molde. Se ha demostrado que la actividad telomerasa es expresada específicamente en células inmortales, células de cáncer y germinales (Kim, y col., 1994, Science 266: 2011; Shay y Wright, 1996, Current Opinion in Cancer 8:66-71), donde compensa el acortamiento telomérico durante la replicación del ADN y por tanto estabiliza la longitud del telómero. Estas observaciones han conducido a la hipótesis de que la longitud del telómero puede funcionar como "reloj mitótico" para percibir el envejecimiento celular y eventualmente la senescencia replicativa señal o la muerte celular programada (Shay y Wright, 1996, Current Opinion in Cancer 8:66-71; Harley, 1991, Mutat. Res 256:271; Greider, 1990, BioEssays 12:363; Piatyszek, y col., Methods in Cell Science 17:1).

El análisis TRAP (protocolo de amplificación de repeticiones teloméricas) es un sistema in vitro muy sensible que utiliza la PCR y es utilizado para la detección de la actividad telomerasa. Las células telomerasa positivas pueden ser detectadas empleando los cebadores en horquilla de la invención con un análisis TRAP, v.g., un análisis TRAP-eze® (Oncor, Inc., Gaithersburg, MD).

El análisis TRAP se lleva a cabo preferiblemente siguiendo las instrucciones proporcionadas con el estuche de TRAP-eze® (Oncor, Inc., Gaithersburg, MD). El análisis TRAP-eze® es un sistema de un tampón, dos enzimas que utiliza la PCR. Como resultará evidente, no obstante, los análisis de la telomerasa también pueden ser llevados a cabo utilizando métodos de amplificación distintos de la PCR, si bien se describen en términos más abajo de la PCR. En la primera etapa de una reacción de TRAP-eze®, la telomerasa añade un número de repeticiones teloméricas (GGTTAG) en el extremo 3' de un oligonucleótido sustrato (TS, sustrato de la telomerasa) (Figura 31).

Una secuencia específica, v.g., AGAGTT o TTAGGG, en el extremo 3' de un oligómero es crítica con el fin de que el oligómero sirva como TS (ver Morin, 1991, Nature 353:454-456). Preferiblemente, la secuencia tiene 5-6 nucleótidos de longitud, aunque también se pueden emplear secuencias más cortas, v.g., 4 nucleótidos.

En la segunda etapa, los productos prolongados son amplificados mediante PCR utilizando el TS y un cebador inverso (RP) que comprende una secuencia complementaria a la secuencia de las repeticiones teloméricas de producto de prolongación de TS-telomerasa, generando una escala de productos con incrementos de 6 bases comenzado a los 50 nucleótidos: 50, 56, 62, 68, etc. Así la amplificación mediante PCR de estas bandas de la escala tiene lugar solamente cuando la telomerasa está presente en las muestras, ya que los productos de reacción de la telomerasa activa sirven como moldes para la amplificación mediante PCR. El nivel de actividad telomerasa es evaluado midiendo la cantidad de productos de la PCR.

En un aspecto preferido, el RP es un cebador en horquilla de la invención. En una realización específica, un nucleótido de 17 pb de longitud, marcado con un par MET, 5'-ACGCAATGTATGCGT*GG-3' (SEC ID NUM: 29), es añadido al extremo 5' de un cebador RP lineal, formando un cebador en horquilla de la invención para su uso como RP (Ver el Ejemplo 15, Figura 30A). A modo de ejemplo, se puede anclar un radical donador al extremo 5' del oligómero, y anclar un radical aceptor al resto T.

Optimizando las condiciones de reacción, se puede detectar un nivel muy bajo de actividad telomerasa; la sensibilidad del análisis es comparable a los análisis convencionales que utilizan electroforesis en gel de poliacrilamida de productos de PR (Figura 30B).

En otra realización, la estructura en horquilla tallo-bucle puede ser anclada al extremo 5' del cebador TS. El oligómero TS modificado sirve por lo tanto no sólo como cebador para la amplificación mediante PCR sino también como sustrato para la telomerasa. Lo hace porque la especificidad de sustrato de la telomerasa parece estar determinada por las secuencias de nucleótidos del extremo 3' del oligómero TS.

En otra realización más, las células telomerasa positivas pueden ser detectadas en secciones tisulares utilizando TRAP in situ en secciones de tejido, y utilizando un cebador en horquilla de la invención, v.g., el cebador mostrado en la Figura 30A, como cebador para TRAP. El método descrito aquí puede ser utilizado para la detección de células individuales con actividad telomerasa. Semejante nivel de detección sensible es difícil de obtener mediante análisis TRAP en tubo de muestras de tejido.

Si bien el análisis TRAP basado en la PCR es suficientemente sensible para detectar pequeñas cantidades de actividad telomerasa en extracto de célula/tejido (es decir, se detectará la actividad telomerasa presente en el 1% de la población celular) es imposible identificar células telomerasa positivas individuales en la población heterogénea, y correlacionar la morfología de la célula/tejido con la expresión de la telomerasa. En contraste, la identificación de las células telomerasa positivas utilizando la microscopía de fluorescencia convencional en un análisis TRAP in situ permite el estudio tanto de la expresión de la telomerasa como de las condiciones patofisiológicas de una célula individual.

Como en el análisis TRAP en tubo, el análisis TRAP in situ (ver la Sección 15.1, Experimento 2) requiere activar enzimáticamente la telomerasa. El análisis TRAP in situ detecta la actividad telomerasa amplificando los productos prolongados por la telomerasa, que sirven como moldes de ADN para la reacción de amplificación, preferiblemente la PCR.

Para detectar los productos de la PCR en un análisis TRAP en tubo normalizado, son posibles numerosos procedimientos. Por ejemplo, en una realización, la sonda marcada para una diana génica de interés puede ser hibridada con productos de la PCR, seguido de la detección con anticuerpos de la sonda unida. Alternativamente, la incorporación de una marca al producto de la PCR puede ser detectada por un anticuerpo.

En contraste, la utilización de cebadores en horquilla de la invención en el análisis de TRAP in situ elimina la etapa de detección descrita antes. Como en el análisis TRAP en tubo, un análisis TRAP in situ puede utilizar un cebador en horquilla o bien para el TS o bien para el cebador RP. Puesto que sólo los cebadores en horquilla que están incorporados a los productos de la PCR resultantes emiten fluorescencia, tras la amplificación, los portas pueden ser visualizados directamente bajo un microscopio de fluorescencia sin las etapas de detección/lavado tras la amplificación mediante PCR. Las células sólo emitirán fluorescencia si la diana génica de interés es amplificada.

La utilización de cebadores en horquilla en los análisis TRAP in situ tiene grandes ventajas sobre otros métodos. Primero, elimina la etapa de detección. Uno de los problemas técnicos de la metodología de la PCR in situ es la difusión de los productos de la PCR, haciendo extremadamente difícil la identificación del sitio nativo de los productos amplificados. La eliminación de la etapa de detección minimiza este problema. Adicionalmente, la eliminación de las etapas tanto de detección como de lavado permite mantener la morfología de los tejidos.

Segundo, se puede incorporar un control interno. La heterogeneidad de las preparaciones del porta y la posible presencia de inhibidores de la amplificación mediante PCR pueden conducir a resultados falsos negativos. La incorporación de un control positivo interno para la amplificación mediante PCR obviará el problema. El control interno consta de un par de cebadores y un molde de ADN, y se añade a la mezcla de reacción de TRAP. Uno de los dos cebadores del control interno es un cebador en horquilla marcado con un par MET de la invención, v.g., un cebador en horquilla marcado con rodamina/DABCYL que realiza la FRET. La utilización de esta segunda marca fluorescente (v.g., rodamina) con un perfil de emisión que es distinto de la marca fluorescente del cebador en horquilla no de control permite la identificación simultánea de dos productos de amplificación diferentes: v.g., el producto de la telomerasa marcado con FAM y el control interno marcado con rodamina. Observando la muestra en un microscopio de fluorescencia a través de filtros separados apropiados para FAM y rodamina, respectivamente, se puede evaluar si la amplificación del control se ha producido.

La amplificación del control interno es independiente de la presencia o ausencia de actividad telomerasa en el espécimen. La presencia de inhibición de la PCR puede ser evaluada por el fracaso o el descenso marcado de la amplificación del control interno en los portas con la muestra. Por lo tanto, cuando una muestra no presenta productos de la telomerasa pero presenta amplificación del control interno, se puede interpretar que el resultado indica que la muestra es realmente negativa para la telomerasa, y que no es un resultado falso negativo causado por la inhibición de la PCR. Así, la fiabilidad de la metodología aumenta enormemente.

Finalmente, uno de los obstáculos más grandes en el establecimiento de los análisis TRAP en el entorno del laboratorio clínico es que el análisis es extremadamente proclive a que la PCR transmita contaminación. El formato en tubo cerrado del análisis TRAP descrito antes, que utiliza los cebadores en horquilla de la invención en lugar de los cebadores de la PCR convencionales, tendrá una gran utilidad en los laboratorios clínicos.

5.2.6. Métodos de utilización de cebadores en horquilla en la amplificación de circulo rodador en cascada (CRCA)

Los cebadores en horquilla de la invención pueden ser utilizados en la Amplificación de Círculo Rodador en Cascada (CRCA) (Lizardi y Caplan, Publicación Internacional PCT Núm. WO 97/19193, publicada el 29 de Mayo de 1997) (Figura 31). Como en la PCR, la CRCA es dirigida por dos cebadores. En una realización de la invención en la que se utiliza CRCA, uno o ambos cebadores es un cebador en horquilla marcado con un par MET, y preferiblemente, sólo un cebador en horquilla está marcado con un par MET. El cebador en horquilla sólo generará una señal MET cuando es incorporado a los productos de reacción en cascada. No obstante, a diferencia de la PCR, la reacción no requiere ciclos repetidos de desnaturalización por calor, y por tanto es isotérmica. En este procedimiento, un primer cebador directo hibrida con un molde de sonda circularizada, y es prolongado por la ADN polimerasa, v.g., el Fragmento Grande de la ADN polimerasa de Bst ("Polimerasa LF de Bst"), alrededor del círculo y eventualmente desplaza el extremo del cebador para formar una larga cola 5'. Un segundo cebador inverso inicia la síntesis por desplazamiento de la hebra sobre la cola que es desplazada de la síntesis del primer cebador.

Se produce una CRCA, donde ambos cebadores están continuamente ciclados para iniciar la síntesis sobre la hebra desplazada de la vuelta anterior de la síntesis. El uso de un cebador en horquilla de la invención, ya sea un cebador directo o inverso, hace posible la detección directa de los productos de la CRCA en un sistema cerrado. Cuando éste se acopla a una reacción de ligadura altamente discriminatoria inicial (ver más abajo) para circularizar una sonda lineal divalente en un sitio diana, la reacción de CRCA en la que se utilizan cebadores en horquilla de la invención puede servir como sistema extremadamente sensible y simple para la detección de agentes infecciosos, el alotipaje, y la detección de eventos raros tales como los diagnósticos del cáncer.

Con el fin de que comience la CRCA, debe tener lugar la ligadura de una sonda lineal (preferiblemente aproximadamente 90 bases de longitud) a una secuencia diana. Esta es catalizada por una ligasa termófila, v.g., Ampligase (Epicentre Technologies, Madison, WI). El cebador directo es añadido y recocido con la sonda circularizada. La CRCA se inicia tras la adición de una polimerasa con una actividad de desplazamiento de la hebra fuerte, preferiblemente ADN polimerasa de Bst, Fragmento Grande (8 unidades). Esta enzima termófila genera un producto provisto de cola de varias kilobases de longitud y produce muchas repeticiones en tándem, de la secuencia diana, y por tanto, muchos sitios de unión para el cebador inverso.

Tanto los cebadores directos como los inversos, uno o ambos los cuales pueden ser un cebador en horquilla marcado con un par MET, pero preferiblemente sólo uno marcado con un par MET, están preferiblemente presentes en exceso (1 \muM) para asegurar la rápida unión al ADN molde. A medida que cada cebador es prolongado, la polimerasa desplaza la hebra en crecimiento que va delante de él, creando un nuevo grupo de colas de hebra sencilla con sitios de unión para el otro cebador (Figura 31).

Este procedimiento continúa a lo largo de muchos ciclos y puede generar, a partir de unos pocos cientos de copias del círculo original, varios microgramos de producto de amplificación de doble hebra conteniendo los cebadores en horquilla incorporados. Tras disminuir la temperatura para la medida de la emisión de MET, cualquiera de los cebadores en horquilla no incorporados volverá a la configuración en horquilla. Cuando el par MET es un par FRET donador-extintor, ésta vuelta a la configuración en horquilla extinguirá la señal fluorescente. Así, cuando se utiliza con cebadores en horquilla marcados con pares FRET donador-extintor, no se debe obtener señal por encima del fondo en las muestras en las cuales no se produce ligadura o reacción en cascada.

Puesto que la CRCA tiene lugar a una temperatura, generalmente alrededor de 60-65ºC, los cebadores necesitan ser suficientemente largos (18 meros o más) para unirse eficazmente a estas temperaturas. Se seleccionan preferiblemente cebadores en horquilla que puedan formar una horquilla fuerte a las temperaturas ambiente aunque sean relativamente inestables a 60-65ºC de manera que la horquilla no inhiba la síntesis por desplazamiento de la hebra (Figura 32). La horquilla puede solaparse parcialmente con las secuencias de unión al cebador, lo que desestabilizará adicionalmente la horquilla durante la síntesis, o puede estar separada por una región espaciadora del sitio de unión al cebador.

En una realización preferida de la CRCA en la que se utilizan los cebadores en horquilla de la invención, entre otros componentes de la reacción se incluyen dNTP 200 \muM, MgSO_{4} 2 mM, Tris-HCl 20 mM, pH 8,8, KCl 10 mM, (NH_{4})_{2}SO_{4} 10 mM, y Triton X-100 al 0,1%. Las reacciones de ligadura y en cascada pueden tener lugar en el mismo tubo y a la misma temperatura, añadiendo la ligasa primero en presencia de NAD+ (0,5 mM) e incubando durante 10 minutos antes de la adición de la polimerasa.

5.3 Métodos de detección de los productos de amplificación utilizando exonucleasa 3'-5' y/o temperatura elevada

Puesto que el uso de cebadores en horquilla permite distinguir entre el producto amplificado y los cebadores no incorporados basándose en el tipo de señal detectada, el tratamiento con exonucleasa o calor no es necesario para el uso en procedimientos en los que se emplean los cebadores en horquilla de la invención.

5.3.1 Utilización de la exonucleasa 3'-5' en las reacciones de amplificación

Como se describe en algunas de las realizaciones, una vez completada la reacción de amplificación, se puede introducir la exonucleasa 3'-5' en el recipiente de reacción para escindir todo el cebador libre. Después, la marca donadora es estimulada con luz de la longitud de onda apropiada. Cuando el radical aceptor es un fluoróforo, la única marca aceptora que emitirá es la que quede en el cebador no escindido que haya sido incorporado al producto amplificado, dando de ese modo una indicación del grado de amplificación. Cuanto más amplificación se haya producido, más señal habrá.

En una realización, cuando se emplea la triamplificación, se añade exonucleasa 3'-5' específica de hebra sencilla al recipiente de reacción una vez que la amplificación se ha completado. Como se muestra en la Figura 8, el tratamiento con exonucleasa 3'-5' hidroliza el extremo de bases no emparejadas del cebador inverso. El extremo 3 del bloqueador es protegido y permanece intacto.

La interacción de los fluoróforos de FRET en el producto amplificado no resultará afectada por este tratamiento por dos razones. Primero, el extremo 3' del producto amplificado tendrá las bases emparejadas y por tanto no será un buen sustrato para la exonucleasa. Segundo, el cebador que es incorporado al producto de amplificación está prolongado en su extremo 3' y su resto nucleotídico marcado estará relativamente lejos del hidroxilo 3' no protegido. Por lo tanto, llevará mucho más tiempo a la nucleasa alcanzar el resto modificado. Como resultado, la única señal FRET detectable vendrá del producto amplificado y estará libre de fondo. Preferiblemente el donador debe estar en el cebador directo, y el aceptor en el bloqueador, pero también es posible a la inversa.

El uso de la exonucleasa 3'-5' en las amplificaciones de ácido nucleico utilizando cebadores lineales elimina la necesidad de separar el producto de la amplificación de los oligonucleótidos no incorporados tras la reacción. En una realización preferida, el método de la presente invención se puede llevar a cabo en el recipiente en el cual tiene lugar la amplificación, sin abrir el recipiente con el fin de permitir la separación del producto amplificado. La polimerasa y la exonucleasa pueden ser separadas mecánicamente durante la amplificación, por ejemplo, en un tubo de reacción de dos cámaras como se muestra en la Figura 11A. Tras la amplificación, el tubo de reacción es invertido, como en la Figura 11B, permitiendo que la exonucleasa se mezcle con la mezcla de amplificación, dando como resultado la hidrólisis del cebador marcado que no ha reaccionado. Esto proporciona una oportunidad muy disminuida de transferir contaminación, y por consiguiente, menos resultados falsos positivos en los estudios clínicos. Este formato de "tubo cerrado" es también muy susceptible de automatización.

En otra realización, se puede realizar la triamplificación o la amplificación mediante PCR, v.g., como se describe en la Sección 6, con la excepción de que la ADN polimerasa termoestable está presente como una combinación de dos enzimas, con y sin actividad exonucleasa 3'-5'. La proporción de polimerasa a exonucleasa puede ser ajustada de manera que predomine la polimerización durante los ciclos de amplificación. Tras la amplificación, cuando el ciclo ha terminado, no se generará más molde de hebra sencilla al cual se puedan unir los cebadores. Por tanto no habrá complejo molde/cebador para que la ADN polimerasa se una para la incorporación de los dNTP. Por lo tanto, la ADN polimerasa tendrá la oportunidad de unirse y digerir los cebadores que no han reaccionado utilizando su actividad exonucleasa 3'-5'.

5.3.2. Utilización de la elevación de la temperatura en las reacciones de amplificación

La fluorescencia de fondo de una reacción de amplificación tal como una reacción de triamplificación puede disminuir enormemente incrementando la temperatura del recipiente de amplificación, como alternativa al uso de la exonucleasa. Durante la detección, la temperatura del recipiente se eleva suficientemente para hacer que el dúplex corto formado entre el bloqueador no utilizado y el cebador inverso se disocien, evitando la FRET. Al mismo tiempo, el producto de amplificación mucho más largo permanece de doble hebra y genera una señal FRET (ver, v.g., el Ejemplo 5). En esta realización, la detección se llevará a cabo preferiblemente utilizando un fluorómetro de cubeta termoestable o un lector de placa. Esta realización también tiene la ventaja de que no se requiere la separación del producto de amplificación del cebador que no se ha utilizado. Así, como en la realización anterior en la que se utiliza el tratamiento con exonucleasa, los productos de la amplificación pueden ser detectados directamente, sin abrir el recipiente de reacción.

5.5. Métodos de utilización de cebadores en horquilla en análisis de multiplex

A través del uso de diversos grupos específicos de cebadores, se puede realizar la amplificación de numerosas dianas de ácido nucleico en la misma mezcla de reacción. En una realización preferida, uno o ambos cebadores para cada diana pueden ser cebadores en horquilla marcados con un radical fluorescente y un radical extintor que puedan llevar a cabo la FRET. La amplificación de diversas dianas de ácido nucleico requiere que sea utilizado un radical aceptor fluorescente diferente, con una longitud de onda de emisión diferente, para marcar cada grupo de cebadores.

Durante la detección y el análisis después de la amplificación, la mezcla de reacción es iluminada y leída a cada una de las longitudes de onda específicas características de cada uno de los grupos de cebadores utilizados en la reacción. Por tanto se puede determinar qué ADN diana específicos de la mezcla fueron amplificados y marcados. En una realización específica, se utilizan dos o más pares de cebadores para la amplificación de las diferentes secuencias diana respectivas.

5.6. Análisis del estado de metilación del ADN utilizando las reacciones de amplificación de la invención

Se sabe que la metilación de la citosina situada 5' con respecto a la guanosina tiene profundos efectos sobre la expresión de diversos genes eucarióticos (Bird, 1992, Cell 70: 5-8). En las células normales, se produce la metilación predominantemente en las regiones pobres en CG, mientras que en las regiones ricas en CG, denominadas "islas CpG", permanecen no metiladas. La excepción es la extensa metilación de las islas CpG asociada con la inactivación transcripcional de las regiones reguladoras de los genes no impresos (Li y col., 1993, Nature 366: 362-365) y con los genes completos del cromosoma X inactivo de las hembras (Pfeifer y col., 1989, Science 246: 810-813).

La metilación aberrante de las islas CpG normalmente no metiladas ha sido documentada como un evento relativamente frecuente en células inmortalizadas y transformadas (Antequera y col., 1990, Cell 62: 503-514], y ha sido asociada con la inactivación transcripcional de los genes supresores de tumores definidos en los cánceres humanos (Herman y col., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 93: 9821-9826). La detección sensible de la metilación de las islas CpG tiene el potencial de definir la función génica supresora de tumores y proporciona una nueva estrategia para la detección precoz de tumores.

La PCR específica para la metilación es un método de detección sensible para la metilación génica anómala en pequeñas muestras de ADN (Herman y col., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 9821-9826). La PCR específica para la metilación emplea una reacción con bisulfito inicial para modificar el ADN. Todas las citosinas no metiladas son dominadas en una reacción con bisulfito y convertidas en uracilos. Las citosinas metiladas no resultan afectadas por la reacción con bisulfito. Por consiguiente, una secuencia de ADN que esté metilada diferirá en la secuencia, tras el tratamiento con bisulfito, de una secuencia idéntica que no esté metilada. Por tanto, se pueden diseñar diferentes grupos de cebadores para amplificar específicamente cada una de esas secuencias (v.g., un par de cebadores para amplificar ADN no metilado, tratado con bisulfito tendrá uno o más restos G remplazados por un resto A (para que sea complementario a los nucleótidos que eran inicialmente citosinas no metiladas), y uno o más restos C remplazados por un resto T, respectivamente, para los dos cebadores del par, con respecto al par de cebadores para el ADN metilado o no tratado).

Como en cualquier otra técnica basada en la PCR, éste método es muy sensible. Cualquier transferencia de contaminación de fuentes externas a la PCR causará resultados falsos positivos. El uso de cebadores en horquilla marcados con MET de la presente invención elimina el riesgo de transferencia de contaminación, ya que la reacción puede ser realizada y controlada (en tiempo real, si fuera necesario) en un formato de tubo cerrado.

El uso del tratamiento con bisulfito en los métodos de la invención no está limitado a aquellos métodos en los que se emplea la PCR; se pueden emplear alternativamente otros métodos de amplificación. La invención proporciona por tanto un método para analizar el estado de metilación del ADN utilizando una reacción de amplificación de la invención, con cebadores en horquilla o lineales. El método comprende: antes de llevar a cabo la reacción de amplificación, poner en contacto una muestra que contiene ácidos nucleicos purificados con una cantidad de bisulfito suficiente para convertir las citosinas no metiladas de la muestra en uracilo; y llevar a cabo la reacción de amplificación en presencia de un par de cebadores específico para las secuencias diana preseleccionadas, v.g., el gen Fragile X, la región del síndrome de Prader-Willi, la región del síndrome de Angelman, el gen p15, el gen p16, el gen E-cadherin, el gen del síndrome de von Hippel-Lindau. Los pares de cebadores, utilizados en recipientes de reacción separados, son preferiblemente específicos de ácidos nucleicos metilados tratados con bisulfito, no metilados tratados con bisulfito, y no tratados con bisulfito (tipo salvaje), respectivamente. Las conclusiones sobre el estado de metilación de los ácidos nucleicos de la muestra pueden ser deducidas dependiendo de qué par o pares de cebadores den el producto de amplificación. En una realización preferida, la reacción de amplificación es la PCR en la que se utilizan uno o más cebadores en horquilla.

Asimismo se proporcionan los estuches así como los métodos para determinar el estado de metilación del ADN. En las realizaciones específicas, tales estuches comprenden en uno o más recipientes uno o más oligonucleótidos de la invención para llevar a cabo las amplificaciones, y bisulfito de sodio (opcionalmente combinado con polvo de hidroquinona). Opcionalmente, tales estuches comprenden adicionalmente en recipientes separados uno o más de los siguientes: aceite mineral, matriz de unión para el ADN, solución de NaI, glucógeno, tampón de amplificación, ADN de control no metilado, y ADN de control metilado.

5.7. Estuches para la amplificación y detección de secuencias de ADN diana seleccionadas

Un aspecto adicional de la presente invención hace referencia a estuches para la detección o medida de productos de amplificación de ácidos nucleicos. En las realizaciones específicas, los estuches comprenden uno o más oligonucleótidos cebadores en horquilla de la invención, en uno o más recipientes. El estuche puede comprender adicionalmente componentes adicionales para llevar a cabo las reacciones de amplificación de la invención. Cuando la secuencia de ácido nucleico diana que está siendo amplificada es una implicada en una enfermedad o trastorno, los estuches pueden ser utilizados para la diagnosis o prognosis. En una realización específica, se proporciona un estuche que comprende, en uno o más recipientes, los cebadores directo e inverso de la invención para llevar a cabo la amplificación, y opcionalmente, una ADN polimerasa o dos ADN polimerasas respectivamente con y sin actividad exonucleasa. Un estuche para la triamplificación puede comprender adicionalmente, en uno o más recipientes, un oligonucleótido bloqueador, y opcionalmente una ADN ligasa.

Los oligonucleótidos de los recipientes pueden estar en cualquier forma, v.g., liofilizados, o en solución (v.g., una solución de agua destilada o tamponada), etc. Los oligonucleótidos listos para su uso en la misma reacción de amplificación pueden ser combinados en un único recipiente o pueden estar en recipientes separados. Asimismo se pueden proporcionar estuches múltiplex, que contienen más de un par de cebadores de amplificación (directo e inverso), donde la señal que está siendo detectada de cada producto amplificado tiene una longitud de onda diferente, v.g., donde el radical donador de cada par de cebadores emite fluorescencia a una longitud de onda diferente. Tales estuches múltiplex contienen al menos dos de tales pares de cebadores.

En una realización específica, un estuche comprende, en uno o más recipientes, un par de cebadores preferiblemente en el intervalo de 10-100 o 10-80 nucleótidos, y más preferiblemente, en el intervalo de 20-40 nucleótidos, que son capaces de cebar la amplificación [v.g., mediante reacción en cadena de la polimerasa (ver, v.g., Innis y col., 1990 PCR Protocols, Academic Press, Inc., San Diego, CA), por ejemplo, PCR competitiva y PCR con transcriptasa inversa competitiva (Clementi y col., 1994, Genet. Anal. Tech. Appl. 11(1):1-6; Siebert y col., 1992, Nature 359:557-558); triamplificación, NASBA, desplazamiento de la hebra, u otros métodos conocidos en la técnica, en condiciones de reacción apropiadas, de al menos una porción de un ácido nucleico diana seleccionado.

En otra realización, el estuche para la detección de una diana de ADN seleccionada comprende en uno o más recipientes (a) cebadores para la PCR, uno o ambos de los cuales son cebadores en horquilla marcados con radicales fluorescente y extintor que pueden realizar una MET; y opcionalmente: (b) una secuencia diana de ADN de control; (c) un tampón optimizado para la amplificación; (d) enzimas apropiadas para el método de amplificación contemplado, v.g., una ADN polimerasa para la PCR o la triamplificación o la SDA, una transcriptasa inversa para NASBA; (d) un conjunto de instrucciones para llevar a cabo la amplificación, v.g., describiendo las condiciones óptimas, v.g., temperatura, número de ciclos para la amplificación. Opcionalmente, el estuche proporciona (e) medios para estimular y detectar las emisiones de luz fluorescente, v.g., un lector de placa de fluorescencia o una combinación de termociclador-lector de placa para realizar el análisis.

En otra realización más, se proporciona un estuche para la triamplificación. El estuche comprende cebadores de prolongación directo e inverso, y un oligonucléotido bloqueador. O bien el cebador directo o bien el inverso está marcado con un radical de un par de radicales de MET, y el oligonucleótido bloqueador está marcado con el otro radical de MET del par. Una realización de semejante estuche comprende, en uno o más recipientes: (a) un primer oligonucleótido; (b) un segundo oligonucleótido; donde dicho primer y segundo oligonucleótidos son cebadores lineales para su uso en la reacción de triamplificación; (c) un tercer oligonucleótido que es un oligonucleótido bloqueador que comprende una secuencia complementaria e hibridable con una secuencia de dicho primer oligonucleótido, estando marcados dichos primer y tercer oligonucleótidos con un primer y segundo radicales, respectivamente, que son miembros de un par de transferencia de energía molecular que consta de un radical donador y un radical aceptor, de manera que cuando dichos primer y tercer oligonucleótidos están hibridados entre sí y el radical donador es excitado y emite energía, el radical aceptor absorbe la energía emitida por el radical donador; y (d) en un recipiente separado, una ligasa de ácido nucleico.

Un estuche para llevar a cabo una reacción como la de la Figura 5 comprende en uno o más recipientes: (a) un primer cebador oligonucleotídico; (b) un segundo cebador oligonucleotídico, donde el primer y segundo cebadores oligonucleotídicos son cebadores directo e inverso para la síntesis de ADN en una reacción de amplificación para amplificar una secuencia de ácido nucleico, y donde dicho segundo cebador oligonucleotídico comprende (i) una secuencia 5' que no es complementaria a una secuencia diana preseleccionada de dicha secuencia de ácido nucleico, y (ii) una secuencia 3' que es complementaria a dicha secuencia diana preseleccionada; y (c) un tercer cebador oligonucleotídico que es un cebador en horquilla de la invención en el cual la cuarta secuencia de nucleótidos es de 10-25 nucleótidos y comprende en su extremo 3' una secuencia idéntica a dicha secuencia 5' de dicho segundo cebador oligonucleotídico. Cuando semejante estuche se utiliza para la triamplificación, también se puede proporcionar un oligonucleótido bloqueador.

Otro estuche de la invención comprende en uno o más recipientes: (a) un primer oligonucleótido; (b) un segundo oligonucleótido que es un cebador en horquilla de la invención, y (c) en un recipiente separado, una ligasa de ácido nucleico.

6. Ejemplos: métodos experimentales generales

Los siguientes métodos experimentales fueron utilizados para todos los experimentos detallados más abajo en los Ejemplos, Secciones 7-13, excepto cuando se indique de otro modo. En todos los Ejemplos, los experimentos se llevaron a cabo utilizando o bien la triamplificación o bien la PCR.

6.1. Secuencias oligonucleotidicas: síntesis y modificación

Se sintetizaron tres oligodesoxinucleótidos complementarios a segmentos del ADN de antígeno específico de próstata humano (PSA) (Figura 12). El cebador inverso contenía un radical 2'-O-metilo en una posición complementaria al extremo 5' del bloqueador. Esta modificación era esencial para la prevención del desplazamiento de la hebra durante el procedimiento de amplificación (ver la Sección 5.2.2.1). El bloqueador tenía biotina en su extremo 3', con el fin de protegerlo de la hidrólisis por la exonucleasa 3'-5' y de la prolongación no deseada durante la amplificación. Durante la síntesis del bloqueador y el cebador directo, el grupo amino primario fue incorporado a la base T modificada (Amino-Modifier C6 dT) como describen Ju y col., (1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4347-4351). Estas modificaciones fueron utilizadas para la posterior incorporación de colorantes fluorescentes en posiciones diseñadas de los oligonucleótidos. Los oligonucleótidos sintetizados fueron sometidos a eliminación de las sales y se anclaron FAM (como donador) y rodamina (como aceptor) a un resto timidina modificado del cebador inverso y el bloqueador, respectivamente, mediante el método publicado por Ju y col. (1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:4347-4351). Los oligonucleótidos marcados fueron purificados en un gel de poliacrilamida desnaturalizante al 15%.

Los espectros de absorción de los cebadores fueron medidos en un espectrofotómetro con un sistema de diodos Hewlett Packard 8452A y los espectros de emisión de fluorescencia fueron tomados en un espectrofluorofotómetro Shimadzu RF-5000 (Columbia, MD).

6.2. Amplificación de ADN diana de antígeno especifico de prostata humano (PSA)

Se realizó la triamplificación en 120 \mul de Tris-HCl 20 mM (pH 8,5), (NH_{4})_{2}SO_{4} 10 mM, BSA 0,1 mg/ml, NAD 2 mM, Triton X-100 al 0,1%, MgCl_{2} 2 mM, dNTP 200 \muM cada uno, molde 10^{-11} M, cebador directo 250 nM, cebador inverso marcado con FAM 250 nM, bloqueador marcado con Rod 500 nM, 6 unidades de ADN polimerasa Pfu-exo^{-} (polimerasa sin actividad exonucleasa 3'-5'; Stratagene) y 30 unidades de ADN ligasa Ampligase® (Epicentre Technologie, Madison, WI). La amplificación mediante PCR se realizó utilizando las mismas condiciones excepto que el bloqueador y la ligasa se omitían de la mezcla de reacción de PCR.

La ciclación térmica se realizó utilizando la desnaturalización durante 5 minutos a 94ºC, seguido de 35 ciclos de 30 seg a 95ºC y 2 minutos a 60ºC. La PCR se completó con una prolongación final de 6 minutos a 60ºC.

Como primer control, se realizó una reacción de triamplificación similar en ausencia de molde de ADN. Como segundo control, la mezcla de reacción no fue incubada en el termociclador.

6.3. Tratamiento con exonucleasa 3'-5'

Se añadieron cuatro unidades de ADN polimerasa Taq que tenía actividad exonucleasa 3'-5' al ADN amplificado o a la sonda de control en 120 \mul de tampón de amplificación y se incubaron a 37ºC durante 15 minutos, a menos que se indique de otro modo.

6.4. Medidas de la transferencia de energía

Las medidas de la transferencia de energía se realizaron en un espectrofluorofotómetro Shimadzu RF-5000. La longitud de onda de excitación era de 488 nm y los espectros de emisión fueron tomados entre 500 y 650 nm.

7. Ejemplo 1

La ADN polimerasa copia un molde de ADN con modificación de rodamina

Este experimento (Figura 13ª) se llevó a cabo para determinar los efectos de la modificación de un molde de ADN con rodamina sobre la actividad de la ADN polimerasa. Si el marcaje con rodamina del cebador inverso fuera para bloquear la incorporación de dNTP, la elongación del cebador directo se detendría en la base frente a la modificación. En este caso, las dos hebras de producto amplificado serían de tamaño diferente; aquella con el cebador directo incorporado sería más corta.

Se llevó a cabo una amplificación mediante PCR (Figura 13A) utilizando las condiciones para la triamplificación descritas en la Sección 6, pero sin utilizar bloqueador. Como se ilustra en la Figura 13B, las hebras sintetizadas en presencia de un cebador inverso modificado y no modificado eran del mismo tamaño, indicando que el marcaje con rodamina no interfiere en la amplificación.

También se estimaron los efectos del marcaje con rodamina sobre el rendimiento de la reacción de amplificación. Se realizó la amplificación mediante PCR y como control, se utilizó el cebador inverso no modificado. Como se muestra en el gel de agarosa de la Figura 13C, la cantidad de producto era similar cuando estaba presente el cebador inverso con rodamina o el cebador inverso no modificado.

Estos resultados llevan a la conclusión de que las modificaciones en el molde de ADN no afectan a la reacción de elongación catalizada por la ADN polimerasa.

8. Ejemplo 2

La modificación de un cebador inverso no afecta a la reacción catalizada por ADN ligasa

Puesto que en la triamplificación se utiliza ADN ligasa termoestable para la amplificación, era importante determinar si la modificación de los cebadores causaba efecto sobre la eficacia de la ligadura. La triamplificación se llevó a cabo como se ha descrito en la Sección 6 con un cebador inverso marcado con rodamina. Como se muestra en la Figura 14A, el bloqueador tenía cuatro nucleótidos más biotina en su extremo 3' que lo prolongaba más allá de la secuencia del cebador inverso.

En los casos en los que el cebador directo prolongado se ligaba al bloqueador, se podría esperar que la hebra resultante fuera aproximadamente 4 nucleótidos más larga que la hebra opuesta, que podría tener incorporado el cebador inverso prolongado. Si no tuviera lugar la ligadura y en vez de eso se desplazara el bloqueador, se podría esperar que ambas hebras fueran de la misma longitud. Utilizando un cebador directo o inverso marcado con [P^{32}] en experimentos en paralelo, se estimó la eficacia de la ligadura.

Como se muestra en la Figura 14B, la mayoría del producto con el cebador directo marcado era más largo que la hebra con el cebador inverso marcado, indicando que no había un efecto de modificación significativo sobre la reacción de ligadura.

9. Ejemplo 3

La endonucleasa puede retirar un resto nucleotidico marcado con rodamina

Se realizó la hidrólisis con exonucleasa de un cebador inverso marcado con rodamina marcado con [P^{32}] (Figura 15A) en una mezcla de reacción de amplificación en una amplificación mediante PCR utilizando los métodos descritos en la Sección 6. Se utilizó la ADN polimerasa de T4 con actividad exonucleasa 3'\rightarrow 5'. Los productos de la hidrólisis fueron analizados en un gel de poliacrilamida desnaturalizante en un 15%. Los resultados presentados en la Figura 15B demuestran una hidrólisis casi cuantitativa del oligonucleótido modificado al cabo de 5 minutos. Se obtuvieron resultados similares cuando el cebador inverso marcado con rodamina marcado con [P^{32}] estaba formando complejo con el bloqueador.

10. Ejemplo 4

Detección del producto de amplificación mediante transferencia de energía tras el tratamiento con nucleasa

Para detectar el producto de triamplificación mediante FRET entre el cebador inverso marcado con FAM y el bloqueador marcado con rodamina, se realizaron la triamplificación y el subsiguiente tratamiento con exonucleasa como se describe en la Sección 6. Como control, la reacción de triamplificación se realizó también en ausencia de molde de ADN.

Los espectros de emisión se presentan en la Figura 16. La señal FRET a 605 nm fue emitida por el producto de amplificación de doble hebra (Figura 16, Espectro 1) mientras que la señal FRET no era emitida desde la reacción de control dirigida sin molde de ADN (Figura 16, Espectro 2).

11. Ejemplo 5

Detección del producto de amplificación basada en la diferente termoestabilidad del producto amplificado y del complejo bloqueador/cebador inverso

El objetivo de este experimento era determinar si se podría encontrar una temperatura específica a la cual el bloqueador libre y el cebador inverso no formaran más dúplex, de manera que no se produjera transferencia de energía entre ellos. A esta temperatura, no obstante, el producto de triamplificación de doble hebra podría permanecer todavía en dúplex, de manera que los cebadores incorporados en él podrían generar una señal FRET.

Se llevó a cabo la triamplificación como se describe en la Sección 6. Se dirigió una reacción de control en ausencia de molde de ADN. Tras la amplificación, las mezclas de reacción se calentaron a 75ºC y se tomaron los espectros de emisión. Los resultados indican que a esta temperatura, no había señal de los cebadores no amplificados (Figuras 17A-B). No obstante, pudo detectarse claramente la emisión de la rodamina a 605 nm (esto es, una señal FRET) del producto amplificado.

12. Ejemplo 6

Formato en tubo cerrado utilizando cebadores en horquilla para la amplificación y detección de ADN basada en la transferencia de energía 12.1. Compendio

Se describe un nuevo método para la detección directa de ADN amplificado mediante PCR en un sistema cerrado. El método está basado en la incorporación de cebadores marcados mediante fluorescencia por transferencia de energía resonante al producto de la amplificación. Los cebadores de la PCR contienen estructuras en horquilla en sus extremos 5' con radicales donadores y aceptores de energía localizados en íntima proximidad EN el tallo de la horquilla. Los cebadores son diseñados de tal manera que se genera una señal fluorescente únicamente cuando los cebadores son incorporados a un producto de amplificación. Se obtuvo una razón de 35:1 de la señal con respecto al fondo utilizando los cebadores en horquilla marcados con FAM como donador y DABCYL como extintor. Los cebadores en horquilla modificados no interfieren en la actividad de la ADN polimerasa, y se puede utilizar tanto polimerasa Pfu como Taq termoestables. Este método fue aplicado a la detección de ADNc para el antígeno específico de la próstata. Los resultados demuestran que la intensidad de la fluorescencia del producto amplificado se corresponde con la cantidad de cebadores incorporados, y pueden ser detectadas tan pocas como diez moléculas del molde inicial. Esta tecnología elimina el riesgo de transferir contaminación, simplifica el análisis de amplificación, y explora nuevas posibilidades para la cuantificación en tiempo real del ADN amplificado a lo largo de un rango dinámico extremadamente
amplio.

12.2 Introducción

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y otras técnicas de amplificación de ácidos nucleicos proporcionan una herramienta para la amplificación geométrica de cantidades mínimas de secuencias diana iniciales (revisado por Mullis y Faloona, 1987, Methods in Enzymology 155: 335-350; Landergren, 1993, Trends Genet 9: 199-204). La extrema sensibilidad de los métodos de amplificación de ADN/ARN ha fomentado el desarrollo de diagnósticos para la detección temprana del cáncer y de agentes infecciosos. No obstante, entre los inconvenientes del uso clínico de la amplificación de ácidos nucleicos se incluye la posibilidad de resultados falsos positivos debidos a la transferencia de contaminación, y resultados falsos negativos ocasionados por reacciones no acertadas y/o condiciones de reacción no normalizadas (Orrego, 1990, de Innis y col. (eds.), PCR Protocols, A guide to methods and applications, Academic Press, San Diego, CA, págs. 447-454).

Una fuente principal para la transferencia de contaminación son los productos de la amplificación de las reacciones de amplificación previas. Debido a la extrema sensibilidad de la PCR, incluso una mínima contaminación puede generar un resultado falso positivo, y por consiguiente, han sido ideados diferentes enfoques para hacer frente a este problema. Entre estos se incluye la incorporación de dUTP con el tratamiento subsiguiente con uracil N-glicosilasa (Longo y col., 1990, Gene 93: 125-128), la incorporación de ribonucleótidos a los cebadores de la PCR seguido de tratamiento con una base (Walder y col., 1993, Nucleic Acid Res. 21: 4339-4343) o el uso de derivados de isopsoraleno que experimentan una reacción de cicloadición con restos timidina tras la exposición a luz UV (Cimino y col., 1991, Nucleic Acid Res. 19: 88-107). No obstante, una solución más sencilla y más acertada al problema sería un sistema cerrado, donde tanto la reacción de amplificación como la etapa de detección tuvieran lugar en el mismo recipiente, de manera que el tubo de reacción nunca se abra tras la amplificación. Además, el formato de "tubo cerrado" simplifica significativamente el procedimiento de detección, eliminando la necesidad de análisis de post-amplificación mediante métodos tales como la electroforesis en gel o el análisis de hibridación puntual.

El método descrito más abajo se diseña para medir directamente el ADN amplificado mediante la incorporación de cebadores oligonucleotídicos marcados al producto de reacción. Las transiciones conformacionales que experimentan los cebadores sirven como interruptores para la transferencia de energía entre las dos marcas. En este método, los radicales donador y aceptor (extintor) están anclados ambos a una estructura en horquilla en el extremo 5' del cebador para la amplificación. Los cebadores están diseñados de tal manera que la señal fluorescente se genera únicamente cuando son incorporados los oligonucleótidos marcados al producto de amplificación de doble hebra. Este método altamente sensible puede ser utilizado para obtener resultados cuantitativos o cualitativos. Entre las aplicaciones de este sistema para la detección de una secuencia de ADN específica se incluyen, además de la PCR, la triamplificación, la amplificación de ácidos nucleicos basada en la secuencia (NASBA), y la amplificación por desplazamiento de la hebra.

12.3. Materiales y métodos Cebadores oligonucleotídicos

Los siguientes oligodesoxinucleótidos complementarios al segmento de 172 pb del ADNc del antígeno específico de próstata humano (PSA) fueron sintetizados químicamente: 5'-CCCTCAGAAGGTGACCAAGTTCAT (SEC ID NUM:11), en forma de un cebador aguas arriba, y 5'-GGTGTACAGGGAAGGCCTTTCGGGAC (SEC ID NUM:12), en forma de un cebador aguas abajo. Las estructuras de los cebadores en horquilla aguas arriba con marcas de transferencia de energía se muestran en las Figuras 24A-G. La FAM fue incorporada al extremo 5' de los cebadores en horquilla utilizando FAM-fosforamidita en la última etapa de la síntesis química. Se introdujo una base de T modificada en una posición designada mediante el uso de Amino-Modifier C6 dT (Glen Research), y DABCYL fue anclado al grupo amino primario como describen Ju y col. (1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4347-4351). Los oligonucleótidos marcados fueron purificados mediante HPLC.

Preparación de ADNc de PSA

En los experimentos se utilizó la línea celular LNCaP que expresa PSA humano (American Type Culture Collection). Las células LNCaP fueron diluidas con linfocitos aislados de sangre completa a proporciones que oscilaban de 1 célula LNCaP por 10^{2} linfocitos a 1 célula LNCaP por 10^{6} linfocitos. El ARN mensajero fue aislado utilizando el estuche de purificación Dynal. El ADNc fue sintetizado a partir del ARNm aislado utilizando transcriptasa inversa (Appligene) y cebadores oligodT_{12-18} (Pharmacia) según el protocolo recomendado.

Condiciones de la PCR

Se realizó la amplificación del ADNc de PSA en 100 \mul de Tris-HCl 20 mM (pH 8,5), KCl 50 mM, MgCl_{2} 2 mM, dNTP cada uno 200 \muM, cebadores aguas arriba y aguas abajo 500 nM cada uno, y 5 unidades de la ADN polimerasa Pfu^{exo-} (que carece de actividad exonucleasa 3'-5'; Stratagene). Se llevó a cabo la ciclación térmica con 5 minutos de desnaturalización a 94ºC, seguido de 20-40 ciclos de 30 segundos a 95ºC, 45 segundos a 60ºC y 1,5 minutos a 72ºC, y se completó con una prolongación final de 5 minutos a 72ºC.

El producto de la PCR fue purificado utilizando QIAquick Spin PCR Purification Kit (Qiagen) y clonado en el plásmido pUC19. Se utilizaron geles MDE® (FMC Bioproducts) para la detección basada en gel de los productos de la PCR. Se utilizó la electroforesis en un gel de poliacrilamida al 6% con urea 7 M, y la posterior cuantificación en un PhosphorImager-SP (Molecular Dynamics) para estimar la cantidad de cebador incorporada al producto de amplificación.

Detección de la fluorescencia

Se utilizó un espectrofluorofotómetro Shimadzu RF-5000 para medir el espectro de fluorescencia de las muestras individuales. La mezcla de reacción de 100 \mul fue diluida hasta 500 \mul con Tris-HCl 20 mM, pH 8,5, NaCl 50 mM, y MgCl_{2} 2 mM, y se colocó en una cubeta de 10 x 3 (NSG Precision Cells, Inc.) a la temperatura ambiente. Para el par FAM/DABCYL (ácido 4-(4'-dimetilaminofenilazo)benzoico), se utilizó una longitud de onda de excitación de 488 nm y se tomó un espectro entre 500 y 650 nm. El producto de la PCR fluorescente también fue visualizado colocando directamente el tubo frente al sistema de análisis de imágenes con un transiluminador UV (Appligene), y se fotografió con una cámara montada utilizando un filtro D540/40 (Chroma Tecnology).

12.4. Resultados Diseño experimental de la PCR con cebadores en horquilla

En este método, la estructura en horquilla está presente en el extremo 5' de uno (o ambos) cebadores de la PCR (Figura 1). La secuencia del tallo y del bucle de la horquilla puede ser parcialmente complementaria a la secuencia de ADN diana, pero esto no es necesario. Hay dos radicales anclados a la secuencia del tallo de la horquilla: un extintor en el extremo 5' de la horquilla y un fluoróforo en el lado opuesto del tallo de la horquilla. Las posiciones del fluoróforo y del extintor pueden estar invertidas dependiendo de la disponibilidad de los precursores comerciales de estos radicales. DABCYL es un cromóforo no fluorescente cuyo espectro de absorción se solapa con el espectro de emisión de FAM. Cuando se estimula con luz con una longitud de onda pico de 488 nm, FAM emite fluorescencia con una longitud de onda pico de 516 nm. No obstante, cuando DABCYL se localiza suficientemente cercano al fluoróforo donador, la energía puede ser transferida a DABCYL y disipada en forma de calor. Por consiguiente, cuando el cebador modificado está en una configuración "cerrada" (horquilla), FAM y DABCYL están en íntima proximidad, y la emisión de la fluoresceína resulta extinguida por DABCYL.

Durante el primer ciclo de la PCR (Figura 2), los cebadores se prolongan y se vuelven moldes durante el segundo ciclo. Puesto que las estructuras en horquilla son muy estables (Varani, 1995, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 24: 379-404), los tallos se van a fundir poco probablemente durante la etapa de recocido de la PCR en cada molécula diana. En este caso, cuando la ADN polimerasa que carece de actividad exonucleasa 5'-3' alcanza el extremo 5' del tallo de la horquilla, la desplazará y copiará la secuencia. Así, el cebador en horquilla será linealizado mediante la incorporación a la estructura helicoidal de doble hebra durante la PCR, el donador y el aceptor estarán a aproximadamente 20 nucleótidos (\sim70 \ring{A}), no produciendo transferencia de energía significativa entre ellos (Selvin, 1995, Methods Enzymol. 246: 300-334), y la fluorescencia de FAM resultará notablemente aumentada.

Secuencia y propiedades espectroscópicas del cebador en horquilla

La estructura del cebador en horquilla para la amplificación del ADNc del antígeno específico de próstata (PSA) se muestra en la Figura 18A (SEC ID NUM:10). El cebador consta de una larga secuencia de cebado de hebra sencilla de 12 nucleótidos, un tallo de 7 pb, y un bucle de 6 nucleótidos. El radical fluorescente (FAM) está localizado en el extremo 5' del cebador y un extintor (DABCYL) está al otro lado de FAM en la hebra opuesta de la secuencia del tallo. La Figura 18B presenta los espectros de emisión del cebador en horquilla marcado con FAM antes y después de la incorporación de DABCYL. Cuando no está presente el extintor, FAM que resulta excitada a una longitud de onda de 488 nm emite una longitud de onda pico de 516 nm. Cuando el mismo nucleótido es marcado con DABCYL, la energía de fluorescencia es transferida al extintor y se detecta un pico mucho menor a 516 nm. La fluorescencia residual del oligonucleótido marcado con FAM/DABCYL esta ocasionada parcialmente por la presencia de pequeñas cantidades de oligonucleótidos marcados sólo con FAM. Por consiguiente era muy importante una extensa purificación mediante HPLC de los oligonucleótidos marcados para un fondo bajo en los experimentos subsiguientes.

Se obtuvieron resultados similares con rodamina como extintor (datos no presentados). En cuanto al extintor, no obstante, DABCYL tiene la ventaja de ser un cromóforo no fluorescente: absorbe la energía de la fluoresceína sin emitir luz por sí mismo. Como resultado, la emisión de la fluoresceína puede ser detectada más precisamente, sin la interferencia de la emisión del aceptor.

Uso de oligonucleótidos en horquilla como cebadores para la PCR

La PCR del fragmento de ADNc de PSA se realizó utilizando ADN polimerasa Pfu^{exo-} termoestable. Para la amplificación se utilizó el ADNc total de células LNCaP que expresan PSA humano mezcladas con linfocitos. Los experimentos preliminares utilizando geles teñidos con bromuro de etidio para el análisis mostraron que podía ser detectada una célula PSA por 10^{5} linfocitos. Con fines de cuantificación, el producto de la PCR fue clonado y utilizado para comparar la eficacia de la amplificación en presencia del cebador en horquilla con la del cebador de control, que carece de la estructura y las modificaciones de la horquilla. En la Figura 19 se muestra que la cantidad de producto amplificado era similar para el cebador de control, el cebador en horquilla que contiene sólo FAM y el cebador en horquilla marcado con el par FRET FAM/DABCYL.

Un requerimiento crucial para el método es la linealización del cebador en horquilla durante la amplificación. Por consiguiente la ADN polimerasa debe ser capaz de sintetizar la hebra complementaria al cebador en horquilla a lo largo de toda la horquilla hasta su extremo 5'. El siguiente experimento se llevó a cabo para determinar si las modificaciones de la estructura del cebador en horquilla afectan a la posterior síntesis del producto de la PCR en toda su longitud. La amplificación mediante PCR del ADNc de PSA se realizó con dos cebadores: un cebador en horquilla marcado con FAM/DABCYL aguas arriba y un cebador aguas abajo marcado con P^{32} en su extremo 5' (Figura 20A). Como control se utilizó un cebador aguas arriba sin la estructura en horquilla.

Si la estructura y/o las modificaciones del cebador en horquilla crean un obstáculo para la ADN polimerasa, este cebador no será copiado en todo su recorrido hasta su extremo 5', y la hebra marcada con [P^{32}] será más corta que la hebra correspondiente sintetizada en presencia del cebador de control.

Para estimar la longitud de las hebras individuales, se realizó la electroforesis en gel desnaturalizante. Como se ilustra mediante los resultados en la Figura 20B, la hebra marcada con [P^{32}] que fue sintetizada en presencia del cebador en horquilla era más larga que la hebra correspondiente elaborada con el cebador de control, indicando que la ADN polimerasa era capaz de leer la estructura en horquilla completa y sintetizar un producto en toda su longitud.

Otro aspecto importante de este método es la termoestabilidad del cebador en horquilla. Si los enlaces fosfodiéster del oligonucleótido o de los brazos del conector por medio de los cuales están trabados el donador y/o el aceptor al oligonucleótido son escindidos como resultado de la elevada temperatura, el extintor se separará del fluoróforo y se incrementará el fondo. En efecto, cuando se incubaron 50 pmoles del cebador en horquilla en una reacción de 100 \mul durante 40 ciclos, la señal del fondo se incrementó de 3,8 unidades a 12 unidades de intensidad de fluorescencia. No obstante, el fondo observado todavía era muy bajo: comprendía únicamente el 6% de la fluorescencia emitida por 50 pmoles de oligonucleótidos marcados con fluoresceína (200 unidades), que era la cantidad utilizada en los análisis.

Verificación de la PCR con cebadores en horquilla

Para demostrar que la fluorescencia del producto de la PCR podría ser utilizada para verificar la reacción, el ADNc total de la mezcla de 1 célula LNCaP que expresa PSA humano por 10^{4} linfocitos fue amplificada con el cebador en horquilla marcado con FAM/DABCYL. Tras diferentes números de ciclos, se determinó la intensidad de fluorescencia del producto amplificado utilizando un espectrofluorofotómetro (Figura 21A). Los resultados muestran que tras sólo 20 ciclos, la intensidad de fluorescencia aumentaba cinco veces en comparación con la mezcla de reacción no amplificada, y se detectó un incremento de treinta y cinco veces tras 40 ciclos de amplificación. Las mismas muestras fueron analizadas también mediante electroforesis en gel desnaturalizante con la posterior cuantificación en el PhosphorImager para determinar la fracción de cebadores marcados con [P^{32}] incorporados al producto. Los resultados de la Figura 21B demuestran que la intensidad de fluorescencia de la mezcla de reacción corresponde a la cantidad de cebadores incorporados al producto.

En otro experimento, se exploró la sensibilidad de este método. Con fines de cuantificación, se utilizó como molde el ADNc de PSA clonado. Se realizaron 40 ciclos de PCR con 0, 10, 10^{2}, 10^{3}, 10^{4}, 10^{5} o 10^{6} moléculas de ADNc de PSA clonado por reacción. Los resultados de la Figura 22 demuestran que el método es lo suficientemente sensible para detectar 10 moléculas del molde de ADN inicial con un espectrofluorofotómetro. El producto fluorescente de la PCR fue visualizado también colocando el tubo directamente en un transiluminador UV equipado con una cámara montada y un filtro D540/40. Este filtro permite la detección de la emisión en una estrecha ventana de longitud de onda: entre 515 y 560 nm. Como se muestra en la Figura 23, la fluorescencia de la reacción de la PCR realizada con 10^{4}, 10^{5} o 10^{6} moléculas del molde inicial podría ser fácilmente detectada mediante la inspección visual de los tubos.

Efecto de la estructura del cebador en horquilla marcado sobre la amplificación y la detección

Se sintetizaron diversos cebadores en horquilla con tamaños variables del tallo, del bucle y de las secuencias de hebra sencilla 3' para estimar cómo estos parámetros podrían afectar a la eficacia de la PCR y a la razón de la señal frente al fondo. Las estructuras y las intensidades de fluorescencia relativas se presentan en las Figuras 24A-G. Todos los cebadores sometidos a ensayo tenían al menos una secuencia de nucleótidos complementaria a la diana, que constaba de una secuencia cebadora de hebra sencilla 3', una secuencia del tallo 3' y una parte del bucle (resaltada en negrita en las Figuras 24A-G).

Se encontró que la longitud de la secuencia cebadora de hebra sencilla 3' era muy importante para la eficacia de los cebadores en horquilla en la reacción de la PCR. Casi no se detectaba producto cuando la longitud de la secuencia cebadora bajaba de doce nucleótidos en la Estructura A a seis nucleótidos en la Estructura G (Figura 24). Una posible explicación para este resultado es que la estructura en horquilla es la conformación preferida de este oligonucleótido, incluso a la temperatura de recocido de 60ºC, y que los nucleótidos del tallo y del bucle de la horquilla no están disponibles para la hibridación con el ADN diana. En este caso, la única parte de la molécula no implicada en la estructura secundaria es la secuencia de hebra sencilla 3'; no obstante, la secuencia de seis nucleótidos del extremo 3' de la Estructura G no es lo suficientemente larga para ser un cebador eficaz para la PCR.

Sólo se encontraron variaciones minoritarias en la cantidad de producto generado cuando los tamaños del tallo y del bucle cambiaron ligeramente. La PCR era ligeramente menos eficaz cuando la longitud del tallo era superior a 7 pb. La estabilización del tallo mediante la sustitución de un par de bases AT en el extremo 3' por GC incrementaba la razón de la señal frente al fondo en un 10%.

12.5. Discusión

El método para la detección de productos de amplificación en un formato en "tubo cerrado" es una etapa importante hacia un sistema de diagnóstico automatizado basado en la PCR, puesto que no sólo reduce la complejidad de la reacción, sino que también elimina las posibilidades de transferencia de contaminación y, como consecuencia minimiza las posibilidades de resultados falsos positivos. El cebador de amplificación contiene una estructura en horquilla con dos marcas en su tallo que pueden experimentar fluorescencia por transferencia de energía resonante. Una marca es un donador fluoróforo y el otro es un extintor que puede absorber la energía emitida por el fluoróforo. Se observó una extinción de la fluorescencia de treinta y cinco veces cuanto los cebadores oligonucleotídicos estaban en conformación en horquilla, de manera que se detecta menos del 3% de la fluorescencia máxima cuando los cebadores no estaban incorporados al producto. El cambio de la conformación en horquilla a la linealizada se produce como resultado de la replicación: el extremo 5' del tallo es desplazado por la ADN polimerasa, se sintetiza una hebra complementaria y ya no se puede formar la horquilla. En los cebadores incorporados, la distancia entre el fluoróforo y el extintor es de aproximadamente 20 pares de bases, lo que está cerca de 70 \ring{A}, distancia a la cual la transferencia de energía es despreciable (Selvin, 1995, Methods Enzymol. 246: 300-334) y de este modo se puede detectar la emisión cuantitativa del fluoróforo.

La ventaja principal de este método es la generación de la señal fluorescente por el propio producto, en lugar de por la sonda hibridada, como en los métodos previos (Holland, et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7276-7280; Lee et al., 1993, Nucleic Acid Res. 21: 3761-3766; Tyagi y Kramer, 1996, Nature Biotechnol. 14: 303-309). Esto mantiene el fondo bajo y permite la cuantificación en tiempo real del ADN amplificado a lo largo de un intervalo dinámico extremadamente amplio. Además, la detección no requiere un tampón especial o las condiciones de temperatura que son necesarias para los métodos que implican hibridación. La discriminación entre un producto de ADN de doble hebra largo y el cebador en horquilla corto es tan eficaz que la razón de la señal frente al fondo será la misma a lo largo de un amplio intervalo de temperatura bajo una diversidad de condiciones de reacción.

Este método puede ser aplicado a muchos sistemas de amplificación en los que un oligonucleótido de hebra sencilla es incorporado al producto de doble hebra, y es compatible con cualquier ADN polimerasa termoestable. En el presente ejemplo se utilizó ADN polimerasa Pfu^{exo-}, una enzima sin actividad exonucleasa 5'-3' ni 3'-5'. Se obtuvieron resultados similares con polimerasa Taq, que tiene actividad exonucleasa 5'-3' (datos no mostrados). La actividad exonucleasa 5'-3' es una parte de la función reparadora mediante la separación por corte de algunas ADN polimerasas, y no atacará a un cebador libre. No obstante, si el cebador en horquilla prolongado mantiene su conformación en horquilla cuando se recuece con el ADN molde, la ADN polimerasa hidrolizará el extremo 5' del tallo de la horquilla, y el nucleótido 5' con el donador o aceptor trabado será liberado a la solución. En cualquier caso, replicación o hidrólisis, el fluoróforo donador será separado del aceptor, se eliminará la extinción, y se detectará la señal de fluorescencia del producto de amplificación, permitiendo la utilización de una ADN polimerasa termoestable para el método de amplificación/detección propuesto.

La razón de la señal frente al fondo de treinta y cinco veces presentada en este ejemplo puede ser probablemente incrementada incluso adicionalmente. Los datos publicados sugieren que cuando el fluoróforo y el extintor están unidos covalentemente entre sí, se puede lograr una extinción de 200 veces (Wang et al., 1990, Tetrahedron Lett. 31: 6493-6496). Esto implica que la colocación de marcas FRET en íntima proximidad respecto al otro en la estructura del tallo incrementará la eficacia de la extinción. Este objetivo se puede lograr mediante diferentes enfoques, tales como la variación de los brazos del conector, el cambio de las posiciones de las marcas, o la utilización de pares FRET en los que el donador y el aceptor tengan alguna afinidad entre si. Otra manera de mejorar el sistema es incrementar la termoestabilidad de los oligonucleótidos marcados mediante FRET para evitar un incremento del fondo durante la amplificación debido a la liberación espontánea de las marcas en la solución.

El método descrito presentado en este ejemplo puede ser aplicado a cualquier procedimiento de diagnóstico en el que se vaya a detectar la presencia del ácido nucleico diana ya sea cualitativamente o cuantitativamente. Se puede aplicar a la detección de agentes de enfermedades infecciosas y de contaminación por microorganismos de alimentos o agua, así como para la detección de algunas formas de cáncer. Una etapa importante en el desarrollo de cualquier aplicación de este método es la optimización de la estructura de los cebadores y las condiciones de ciclación, puesto que cualquier producto secundario puede ocasionar una señal. No obstante, la optimización está facilitada por el hecho de que el tamaño y la pureza del producto pueden ser confirmados mediante electroforesis en gel, puesto que el ADN amplificado con los cebadores en horquilla marcados puede ser analizado mediante cualquiera de los métodos tradicionales.

El presente ejemplo demuestra la utilidad de este método para la detección de ADNc de antígeno específico de próstata. Los resultados muestran que la especificidad y la sensibilidad de la detección son comparables a las de otros métodos basados en la amplificación: se pueden detectar tan pocas como diez moléculas de la diana inicial. Este método también puede ser utilizado para un análisis "múltiplex" en el que se amplifican varias dianas en la misma reacción. Para este fin, se pueden utilizar cebadores en horquilla marcados con diferentes fluoróforos. Para las aplicaciones clínicas, en las que se van a someter a ensayo un gran número de muestras, se podría utilizar un lector de placa fluorescente para medir los resultados del análisis, ya sea separadamente o acoplado con la máquina de PCR.

13. Ejemplo 7

Análisis del estado de metilación de las islas de CpG utilizando PCR con cebadores en horquilla 13.1. Materiales y métodos

Se obtuvo ADN genómico de líneas celulares OH3 (ADN P16 no metilado) y HN 12 (ADN P16 metilado) (adquiridas de los Doctores S.B. Baylin y D. Sidransky, The Johns Hopkins Medical Institutions) y se trató con bisulfito (Herman et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 9821-9826).

Se sintetizaron químicamente tres grupos de cebadores para PCR (Figura 26) que amplifican respectivamente ADN no metilado tratado con bisulfito (Uup y Ud (SEC ID NUMS: 19 y 20, respectivamente)), ADN metilado tratado con bisulfito (Mup y Md) (SEC ID NUMS: 21 y 22, respectivamente), y el ADN no tratado con bisulfito (tipo salvaje, WT) (Wup y Wd) (SEC ID NUMS: 23 y 24, respectivamente). Uno de los dos cebadores de cada grupo tenía una estructura en horquilla en su extremo 5', marcada con FAM/DABCYL.

La PCR se realizó en 40 \mul de Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), KCl 50 mM, MgCl_{2} 2 mM, dNTP 0,25 mM cada uno, cada cebador 0,5 \muM, 100 ng del molde de ADN correspondiente y 1 unidad de polimerasa AmpliTaq Gold® (Perkin Elmer). Se realizó el ciclo térmico utilizando desnaturalización durante 12 minutos a 94ºC (estas condiciones también fueron requeridas para la activación de la polimerasa AmpliTaq Gold®), seguido de 35 ciclos de 45 seg. a 95ºC, 45 seg. a 65ºC y 1 minuto a 72ºC. La PCR se completó con una prolongación final de 5 minutos 72ºC.

13.2. Resultados

Los productos de reacción fueron analizados como se ha descrito en la Sección 6. Tras la amplificación mediante PCR, se midieron las intensidades de fluorescencia de las mezclas de reacción. La intensidad de fluorescencia de la mezcla de reacción amplificada en presencia del molde de ADN (+) difería significativamente de la intensidad de fluorescencia de la mezcla de reacción amplificada en ausencia del molde de ADN (-) (Tabla 2). Por ejemplo, cuando se utilizaba un grupo de cebadores U (para la amplificación de una secuencia de ADN U (no metilado tratado con bisulfito), ver la Tabla 2) con ADN U, éste fue amplificado y la intensidad de la señal difería significativamente de la intensidad de la mezcla de reacción sin molde. De un modo similar, el uso de un grupo de cebadores M conduce la amplificación del ADN M (metilado tratado con bisulfito), y el uso de un grupo de cebadores W conduce a la amplificación del ADN W (no modificado químicamente de tipo salvaje).

TABLA 2 La intensidad de la fluorescencia (expresada en forma de unidades de fluorescencia) en 20 \mul de la mezcla de reacción tras la PCR en presencia (+) y en ausencia (-) de molde de ADN. U, ADN genómico no metilado que experimenta modificación química con bisulfito; M, ADN genómico metilado que experimenta modificación química con bisulfito; W, ADN genómico que no experimenta modificación química

	ADN U		ADN M		ADN W
	+	-		+	-		+	-
	18	6		20	6		23	9

13.3 Conclusión

Los resultados muestran que los cebadores en horquilla marcados con MET pueden ser utilizados en una reacción de amplificación para detectar, fiablemente y sensiblemente, ADN metilado o no metilado.

14. Ejemplo 8

Amplificación mediante PCR utilizando un cebador en horquilla universal 14.1 Introducción

Este ejemplo presenta experimentos en los que se utilizó un cebador en horquilla universal, junto con dos cebadores lineales seleccionados, Cebador 1 y Cebador 2 "provisto de cola", para cebar una amplificación mediante PCR (ver la Sección 5.2.1). El cebador en horquilla universal fue incorporado al producto de amplificación y no fue ligado a una de las dos secuencias cebadoras lineales. La secuencia 3' del cebador en horquilla universal era idéntica a la secuencia 5' de uno del par de cebadores directo e inverso lineales utilizados en la amplificación, y esta secuencia 5' (secuencia "A" en el Cebador 2 de la Figura 5) y no era complementaria a la secuencia diana.

Durante el primer ciclo de PCR, se prolongó el Cebador 1 (Figura 5), que era complementario a la hebra (+) del ADN diana. El Cebador 2 (Figura 5) tenía una porción 3' que tiene una secuencia complementaria a la hebra (-) de la secuencia diana y una porción 5', denominada "A" en la Figura 5, que tiene una secuencia que no era complementaria a la secuencia diana. (Las secuencias para el Cebador 1 y el Cebador 2 aparecen abajo en la Sección 14.2.) La secuencia A tenía una longitud de 15 nucleótidos.

Durante el segundo ciclo, el producto de la extensión del Cebador 2 (mostrado por la flecha en la Figura 5) se vuelve un molde para el Cebador 1. El Cebador 1 se prolongó y el producto de amplificación adquirió una secuencia, denominada "A'", complementaria a la secuencia A.

Durante el tercer ciclo, la secuencia A del cebador en horquilla universal se recoció con la secuencia A' del producto de amplificación del ciclo anterior. El extremo 3' del molde se prolongó, el cebador en horquilla universal se desplegó y se copió, el extintor y el fluoróforo se separaron, y la señal fluorescente fue emitida desde el producto de amplificación.

Durante el cuarto ciclo, el cebador en horquilla universal prolongado se volvió un molde para el Cebador 1. Durante la prolongación del Cebador 1, la horquilla fue desplegada y copiada, el extintor y el fluoróforo se separaron, y la señal fluorescente fue emitida desde el producto de amplificación.

Las condiciones de la reacción y las concentraciones de los cebadores se optimizaron, de manera que >80% del producto de la PCR contenía el cebador universal incorporado y era detectable mediante detección por fluorescencia.

14.2 Materiales y métodos Condiciones de la PCR

En un grupo de experimentos (ver la Tabla 3, más abajo), se realizó la amplificación del ADNc del antígeno específico de próstata (PSA) clonado en el plásmido pUC 19, el ADN genómico de Chlamidia, y el gen P16 presente en el genoma humano total, utilizando amplificación mediante PCR con un cebador en horquilla universal marcado con Flu/DABCYL (ver "Secuencia del cebador en horquilla universal", más abajo) y tres pares del Cebador 1 lineal y el Cebador 2 provisto de cola lineal específicos para PSA, Chlamidia, y P16, respectivamente. Por reacción se utilizaron 10^{6} moléculas de secuencias de PSA y Chlamidia, y 100 ng de ADN humano.

Las amplificaciones se realizaron en 20 \mul de Tris-HCl 20 mM (pH 8,8), KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, gelatina al 0,001%, dNTP cada uno 200 \muM, 0,5 \muM del Cebador 1, 0,1 \muM del Cebador 2, 0,5 \muM del cebador en horquilla universal marcado con Flu/DABCYL y 1 unidad de ADN polimerasa Taq (Takara, Shiga, Japón). Para la amplificación del gen P16, no obstante, se realizó una amplificación Hot Start®, utilizando ADN polimerasa AmpliTaq Gold® (Perkin Elmer) en lugar de Taq. Para unas condiciones de amplificación óptimas, la concentración del cebador provisto de cola (Cebador 2) se mantuvo baja con el fin de obtener una mayoría de producto de amplificación de la PCR con el cebador en horquilla universal incorporado.

La ciclación térmica se realizó con 5 minutos de desnaturalización a 94ºC, seguido de 20-40 ciclos: 20 segundos a 95ºC, 30 segundos a 55ºC y 1 minuto a 72ºC, y se completó con una prolongación final de 5 minutos a 72ºC. El número requerido de ciclos depende de la concentración de la diana inicial. Una reacción PCR con un cebador en horquilla universal requiere usualmente 3-5 ciclos más que una PCR regular para obtener una cantidad comparable de producto. El cebador en horquilla universal sólo comienza a incorporarse en el ciclo 3 (Figura 5), y también existe la competición del cebador provisto de cola a lo largo de la amplificación.

Se pusieron en marcha dos reacciones de control por cada ADN diana. El Control 1 no contenía cebador provisto de cola en la mezcla de reacción. No se podría esperar producto en este caso si el cebador en horquilla universal fuera específico sólo para la secuencia complementaria a la secuencia de la cola y no podría hibridar con ninguna otra secuencia de la diana de ADN.

El Control 2 no contenía diana de ADN en la mezcla de reacción.

En un segundo grupo de experimentos (ver la Tabla 4), se puso en marcha un grupo de amplificaciones mediante PCR utilizando concentraciones variables de la diana de ADNc de PSA y del Cebador 1 y el Cebador 2 provisto de cola específicos de PSA, y del cebador en horquilla universal. Otro grupo de amplificaciones mediante PCR (convencionales) se puso en marcha utilizando el Cebador 1 y el Cebador 2 sin cola específicos de PSA.

La PCR en este segundo grupo de experimentos se realizó en 40 \mul de Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), KCl 50 mM, MgCl_{2} 2 mM, dNTP cada uno 0,25 mM, Cebador cada uno 0,5 \muM, 100 ng del molde de ADN correspondiente y 1 unidad de polimerasa AmplTaq Gold® (Perkin Elmer). Se realizó la ciclación térmica utilizando desnaturalización durante 12 minutos a 94ºC. Estas condiciones también fueron utilizadas para la activación de la polimerasa AmpliTaq Gold®, y estuvieron seguidas de 35 ciclos de 45 segundos a 95ºC, 45 segundos a 65ºC y 1 minuto a 72ºC. La PCR fue completada con una prolongación final de 5 minutos a 72ºC.

Los productos de la amplificación utilizando cebadores no marcados lineales fue visualizada con geles teñidos con bromuro de etidio.

Detección mediante fluorescencia

Se utilizó un espectrofluorofotómetro Shimadzu RF-5000 para medir los espectros de fluorescencia de las muestras individuales. Se diluyó una alícuota de 5 \mul de la mezcla de reacción hasta 600 \mul con Tris-HCl 20 mM, pH 8,8, KCl 50 mM, MgCl_{2} 2 mM y se colocó en una cubeta de 10 x 3 mm (NSG Precision Cells, Inc., Farmingdale, NY) a la temperatura ambiente. Para el par FRET de fluoresceína/ácido 4-(4'-dimetilaminofenilazo)benzoico (DABCYL), se utilizó una longitud de onda de excitación de 488 nm y el espectro se tomó entre 500 y 650 nm.

Las intensidades de fluorescencia fueron determinadas tras restar el fondo. El fondo se definió como la fluorescencia del cebador en horquilla universal en la mezcla de reacción antes de poner en marcha la reacción de amplificación mediante PCR.

Cuando la cantidad de la diana inicial no era demasiado baja (1.000 moléculas o más) el producto de amplificación de la PCR fluorescente también fue visualizado colocando el tubo directamente frente a un sistema de análisis de imágenes con un transiluminador UV (Appligene, Estrasburgo, Francia), y se fotografió con una cámara montada utilizando un filtro D540/40 de color verde (Chroma Tecnology, Brattleboro, VT).

Alternativamente, para obtener resultados cuantitativos, también se puede utilizar un lector de placa fluorométrico. En este caso la reacción se puede realizar en una placa para PCR de 96 pocillos sellada. La misma placa es transferida después al lector de placa, y se mide la fluorescencia emitida desde la parte superior de la placa. La medición se puede realizar después de la cantidad deseada de ciclos. Si la señal no es lo suficientemente fuerte la misma placa se puede volver a transferir a la máquina de PCR y se pueden realizar más ciclos tras la corta etapa de precalentamiento (1-2 minutos). Para determinar la cantidad exacta de la diana inicial, se debe incluir el control interno apropiado. Se debe utilizar un cebador en horquilla de un color diferente para el control interno. La cuantificación de la diana inicial se puede realizar más fácilmente si se utiliza la máquina para la detección mediante PCR en tiempo real, v.g., un Idaho Light-cycler (Idaho Technology, Inc., Idaho Falls, ID).

Secuencia del cebador en horquilla universal

\vskip1.000000\baselineskip

100

\vskip1.000000\baselineskip

La secuencia en negrita es idéntica a la cola de los cebadores específicos

Secuencias de los cebadores lineales específicos

En cada secuencia, la secuencia de la cola del Cebador 2 aparece en letras minúsculas en negrita.

PSA

Cebador 1

5'-ggt gta cag gga agg cct ttc ggg ac

SEC ID NUM: 31

Cebador 2

5'-cct gca ggc tga ggt gaa ggt gac caa gtt cat

SEC ID NUM: 32

\vskip1.000000\baselineskip

ADN genómico de Chlamidia

Cebador 1

5'-gta cta gag gac tta cct ctt ccc

SEC ID NUM: 33

Cebador 2

5'-cct gca ggc tga ggt ctg taa caa caa gtc agg tt

SEC ID NUM: 34

\vskip1.000000\baselineskip

P16

Cebador 1

5'-CAG AGG GTG GGG CGG ACC GC

SEC ID NUM: 35

Cebador 2

5'-cct gca ggc tga ggt CCC GGG CCG CGG CCG TGG

SEC ID NUM: 36

14.3. Resultados

Como se muestra en la Tabla 3, se puede utilizar un cebador en horquilla universal en una reacción de amplificación mediante PCR para detectar específicamente tres dianas diferentes. Se amplificaron las tres secuencias genómicas, de PSA, de ADN genómico de Chlamidia, y de P16, y sus productos de amplificación fueron detectados midiendo los espectros de fluorescencia de las reacciones de amplificación con un espectrofluorofotómetro.

TABLA 3 Intensidades de fluorescencia de las mezclas de reacción para PCR con el cebador en horquilla universal en diferentes dianas de ADN*

Diana	Reacción	Cebador desprovisto	Sin ADN
	completa	de cola control 1	control 2
PSA	303	15	10
ADN genómico	286	14	5
De Chlamidia
Gen P16	140	10	9
* \begin{minipage}[t]{150mm} La intensidad de fluorescencia fue determinada tras restar el fondo presente antes de poner en marcha la reacción de amplifiacción mediante PCR.\end{minipage}

Además, los productos de amplificación de PSA y Chlamidia fueron visualizados colocando los tubos en un transiluminador y fotografiándolos a través de un filtro de color verde. Los resultados se presentan en las Figuras 28A-B. La fluorescencia resultaba significativamente aumentada tras la amplificación en comparación con los controles, indicando que las dianas de ADN habían sido amplificadas.

La sensibilidad de las amplificaciones mediante PCR utilizando el Cebador 1, el Cebador 2 provisto de cola, y el cebador en horquilla universal se comparó con la de las amplificaciones mediante PCR utilizando el Cebador 1 y el Cebador 2 desprovisto de cola. Como se demuestra en la Tabla 4 (más abajo), la sensibilidad de una reacción PCR utilizando el Cebador 1, el Cebador 2 provisto de cola, y el cebador en horquilla universal es comparable a la obtenida en una reacción PCR utilizando el Cebador 1 y el Cebador 2 desprovisto de cola. En condiciones y concentraciones optimizadas de los cebadores, como se ha descrito en la sección 14.2, se podrían detectar tan pocas como 10 moléculas de la diana de PSA utilizando o bien el cebador en horquilla universal o los cebadores de secuencia específica lineales (desprovistos de cola) convencionales. La intensidad de fluorescencia fue determinada tras restar el fondo presente antes de poner en marcha la reacción de amplificación mediante PCR.

TABLA 4 Intensidades de fluorescencia de la reacción PCR en presencia de los cebadores en horquilla específico y universal y diferentes números de moléculas de la diana de ADN de PSA inicial*

Número de moléculas
diana por reacción:	0	10	10^{2}	10^{4}	10^{6}
Cebador marcado
Específico	4	55	165	250	320
Universal	7	42	140	220	244
* \begin{minipage}[t]{150mm} La intensidad de fluorescencia fue determinada tras restar el fondo presente antes de poner en marcha la reacción de amplificación mediante PCR.\end{minipage}

14.4 Discusión

Los resultados presentados en este ejemplo demuestran que existen varias ventajas evidentes en la utilización de los cebadores en horquilla universales, en lugar de los cebadores para PCR lineales convencionales, en una amplificación mediante PCR.

Primero, un cebador en horquilla universal puede ser utilizado para la amplificación con cualquier grupo de cebadores para PCR optimizados previamente. Segundo, el uso del cebador en horquilla universal permite el formato del tubo cerrado; la amplificación y la detección se realizan en el mismo tubo, sin ni siquiera abrirlo. Esto asegura que no habrá transferencia de contaminación con el amplicon (productos de amplificación de reacciones previas) y por consiguiente resultados falsos positivos. Semejante minimización de la transferencia de contaminación es especialmente importante cuando se analizan un gran número de muestras clínicas. En el pasado, la contaminación era generalmente difícil de evitar cuando se analizaban grandes números de muestras clínicas y los resultados falsos positivos eran perjudiciales. El uso de los cebadores en horquilla universales de la invención en las amplificaciones mediante PCR en tubo cerrado evita la posibilidad de semejante contaminación. Utilizando este formado de tubo cerrado y los cebadores en horquilla de la invención en un análisis basado en PCR, pueden ser detectadas específicamente al menos tres dianas diferentes en un solo análisis.

Tercero, utilizando los cebadores en horquilla universales de la invención en la amplificación mediante PCR, se pueden obtener resultados cuantitativos. Se puede cuantificar la cantidad de producto de amplificación utilizando, v.g., un lector de placa fluorimétrico, siempre que se utilicen los controles internos apropiados, v.g., un número conocido de moléculas de una segunda secuencia diana conocida y los cebadores correspondientes para esta diana.

Cuarto, utilizando los cebadores en horquilla universales de la invención en la amplificación mediante PCR, no se necesita realizar un análisis de post-amplificación que lleva tiempo como la electroforesis o la hibridación puntual. Omitiendo esta etapa, se ahorran 2-3 horas en cada grupo de reacciones de amplificación.

Finalmente, los resultados presentado aquí indican que el cebador en horquilla universal puede ser utilizado para amplificar el gen P16. Por tanto un cebador en horquilla universal es adecuado para su inclusión en un estuche para la detección del estado de metilación del gen P16, que es un supresor tumoral.

15. Ejemplo 9

Utilización de cebadores en horquilla en un análisis mediante el prototoco de amplificación de repeticiones teloméricas (TRAP) para la detección de células telomerasa positivas

En el presente ejemplo se demuestra la detección de células telomerasa positivas en la que se utiliza un análisis TRAP con el cebador en horquilla de la invención.

15.1. Métodos y resultados

Experimento 1

Se añadió un nucleótido de 17 pb de longitud, 5'-ACGCAATGTATGCGT*GG-3' (SEC ID NUM: 29), al extremo 5' del cebador RP (Figura 30A). FAM fue anclada al extremo 5' del oligómero y DABCYL fue anclado al resto T*. Cuando se formó el tallo-bucle intracatenario del cebador en horquilla, los restos FAM y DABCYL se colocaron opuestos entre sí (Figura 30A). En esta configuración, la emisión de fluorescencia de FAM 5' fue mínima en el oligómero no incorporado debido a la FRET entre FAM y DABCYL.

Una serie de análisis TRAP utilizando este cebador RP en horquilla demostraron que la modificación 5' del RP no altera significativamente la eficacia del análisis TRAP (Figura 30B). Se realizaron análisis TRAP utilizando el cebador TS y la secuencia del cebador RP (SEC ID NUM: 37) mostrada en la Figura 30A, con un extracto celular equivalente a 10.000, 1.000, 100, o 10 células. También se pusieron en marcha tres controles negativos (Figura 30B): "Sin Taq", en los que no se añadía polimerasa Taq a la reacción (control negativo 1); "CHAPS", en los que se utilizaba tampón de lisis CHAPS en lugar del extracto celular de la reacción (control negativo 2); "+H", el extracto celular de 10.000 células fue tratado con calor antes del análisis (control negativo 3). Se prepararon cuatro tubos de reacción (0,05 ml por tubo) para cada extracto o control y se realizó la amplificación mediante PCR en un ciclador térmico (condiciones del ciclo: 94ºC durante 30 segundos y 55ºC durante 30 segundos) durante el número de ciclos indicado en la Figura 30B. A la finalización de los ciclos, los tubos se retiraron del bloque de calentamiento del ciclador térmico y se almacenaron en la oscuridad hasta que se midió la fluorescencia. Para realizar las mediciones de la fluorescencia, se mezclaron 0,02 ml de la mezcla de reacción con 0,60 ml de tampón (tris-HCl 10 mM, pH 7,6, NaCl 150 mM, MgCl_{2} 2 mM) y se midió la emisión a 516 nm excitada mediante luz de 488 nm con un espectrofluorofotómetro Shimadzu RF5000U.

Optimizando las condiciones de reacción, se detectó un nivel de actividad telomerasa muy bajo; la sensibilidad del análisis es comparable a la de los análisis convencionales en los que se utiliza electroforesis en gel de poliacrilamida de los productos PR (Figura 30B).

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Experimento 2

En la primera etapa de un análisis TRAP in situ, se prepara un porta de tejidos o células seleccionados de interés. Los tejidos no fijados se congelan rápidamente en nitrógeno líquido y se preparan secciones congeladas seccionando con un microtomo. Se prepararon capas unicelulares mediante la centrifugación de las suspensiones celulares utilizando, v.g., Cytospin® (Shandon Lipshaw Inc., Pittsburgh, PA). Los portas preparados se trataron después con una solución que contenía ADNasa sin ARNasa en Tris-HCl 40 mM de pH 7,4, MgCl_{2} 6 mM y CaCl_{2} 2 mM durante 5-15 horas.

Se utilizó un sistema de sellado de portas tal como Probe-Clips (GraceBio-Labs, Pontiac, MI). Los Probe-Clips se anclan a los portas y los especímenes se recubren con la solución de ADN y se incuban durante 5 a 15 horas. Los Probe-Clips, que forman una cámara sellada en torno al espécimen sin el uso de adhesivos u otros disolventes tóxicos, pueden ser utilizados también en la reacción de amplificación con prolongación TRAP.

El análisis TRAP se pone en marcha sobre las muestras en los portas preparados siguiendo las instrucciones proporcionadas con el estuche TRAP-eze®. Se pueden utilizar las condiciones experimentales para los análisis TRAP en tubo normalizados con mínimas modificaciones. Tras la amplificación, los portas se visualizan directamente en un microscopio de fluorescencia sin etapas de detección/lavado tras la amplificación mediante PCR. Las células sólo manifestarán fluorescencia si la diana génica de interés resulta amplificada.

16. Ejemplo 10

Utilización de cebadores en horquilla en un análisis de un sistema de mutación refractario a la amplificación (ARMS) 16.1 Introducción

Se puso en marcha la PCR alelo específica, utilizando cebadores en horquilla, para amplificar la secuencia normal y la mutación W64R del gen del receptor beta-3-adrenérgico (B3AR). El producto normal del gen es un receptor anclado a la proteína G que es expresado predominantemente en la grasa visceral. Se cree que es un regulador de la tasa metabólica en reposo y de la lipolisis, y la mutación W64R ha sido asociada con la obesidad (Clement y col., 1995, New Engl. J. Med. 333: 352-354).

16.2. Métodos

El análisis de un sistema de mutación refractario a la amplificación (ARMS) (Newton y col., 1989, Nucl. Acids Res. 17: 2503-2516) fue utilizado para la PCR alelo específica. Los cebadores alélicos aguas arriba en el análisis ARMS tenían un formato en horquilla, y se utilizaron como un cebador común aguas abajo. El análisis ARMS está diseñado de manera que existe un desemparejamiento en el extremo 3' del cebador cuando el cebador se empareja con el alelo incorrecto.

La secuencia del gen B3AR y de los cebadores alélicos se muestran en la Tabla 5 (más abajo). La letra en negrita ha sido utilizada para destacar el codón 64 de la secuencia B3AR, y las secuencias subrayadas indican el área para la cual fueron diseñados los cebadores alelo específicos. Los cebadores en horquilla fueron modificados en una timina interna, como se indica en la Tabla 5, utilizando DABCYL como extintor, y en el extremo 5' con FAM como fluoróforo.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 5 Secuencia de la diana génica B3AR y de los Cebadores alélicos utilizados para el análisis ARMS

101

El análisis ARMS se puso en marcha en tampón Tris-HCl 10 mM, pH 8,3 conteniendo KCl 50 mM, MgCl_{2} 2 mM, dATP, dCTP, dTTP, y dGTP cada uno 400 \muM, y dimetilsulfóxido al 10% (DMSO). Los cebadores fueron utilizados a una concentración 1 \muM cada uno, la polimerasa Taq (Takara, Shiga, Japón) a 1,5 U por reacción de 20 \mul. Las reacciones de PCR de 20 \mul se pusieron en marcha en un termociclador PE-2400 (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) durante 4 minutos a 94ºC, seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 55ºC y 30 segundos a 72ºC, seguido de incubación durante 10 minutos a 72ºC y mantenimiento a 4ºC.

16.3. Resultados

Utilizando las condiciones de reacción descritas antes, se sometieron a ensayo los moldes normal (W64) y mutante (R64) clonados para la especificidad y el rendimiento de la amplificación. También se puso en marcha un control negativo sin diana con cada reacción. Tras la PCR, se pusieron en marcha 3 \mul de cada reacción PCR sobre un gel y se tiñeron con bromuro de etidio. Utilizando el sistema PCR descrito antes, la diana normal (W64) sólo producía una banda visible cuando estaba presente el cebador normal y la diana mutante (R64) sólo producía una banda visible cuando estaba presente el cebador mutante. No se observaron artefactos en el fondo de la PCR en el control negativo o en las reacciones PCR dirigidas con la diana desemparejada. También se sometió a ensayo cada reacción PCR para el rendimiento de la fluorescencia diluyendo 5 \mul de cada reacción en 0,6 ml de tampón Tris-HCl 15 mM, pH 8,0, NaCl 50 mM, MgCl_{2} 2 mM. La fluorescencia de cada reacción se midió en un espectrofluorofotómetro Shimadzu RF-5000U utilizando una longitud de onda de excitación de 488 nm y una longitud de onda de emisión de 516 nm.

Tras restar la fluorescencia de fondo del control negativo de cada muestra, la PCR dirigida con el cebador alélico normal (W64) y el ADN diana normal (W64) tenía una fluorescencia relativa de 37, mientras que la fluorescencia de la PCR dirigida con el cebador alélico normal (W64) y la diana mutante (R64) era la misma que la del control negativo. La PCR dirigida con el cebador alélico mutante (R64) y el ADN diana normal (W64) tenía una fluorescencia relativa de 2, y la PCR dirigida con el cebador alélico mutante (R64) y la diana mutante (R64) tenía una fluorescencia relativa de 19. Estos resultados indican un buen rendimiento de producto de la PCR y de fluorescencia a partir de la PCR alelo específica utilizando cebadores en horquilla con un diseño ARMS, y la capacidad para distinguir alelos normales y mutantes basándose sólo en la fluorescencia, sin la necesidad de poner en marcha una electroforesis en gel.

17. Ejemplo 11

Análisis de la región gag del genoma viral del VIH-1 utilizando una PCR in situ con cebadores en horquilla 17.1. Introducción

El provirus VIH-1 es muy difícil de detectar mediante hibridación in situ normalizada pero puede ser detectado rutinariamente y fiablemente tras la PCR in situ, pero con el tiempo adicional y el gasto de las etapas de hibridación y lavado. En el presente ejemplo se describen los métodos de la invención que permiten la detección exacta y sensible de la diana directamente tras la etapa de amplificación.

Los siguientes métodos se utilizan para detectar una diana de ADN de VIH-1, y se emplean cebadores en horquilla marcados con FRET en una PCR in situ. Estos métodos evitan la etapa de hibridación y no conducirán a resultados falsos positivos debidos a la reparación del ADN. Otra ventaja de este método es que la generación de la señal fluorescente es mediante el propio producto, en lugar de por la sonda hibridada como en los métodos de la PCR in situ anteriores. La utilización primordial de la PCR in situ en la actualidad es la detección de ADN o de ARN viral. La mejora de la sensibilidad, según se proporciona mediante la utilización de los cebadores marcados de la invención, permitirá aplicaciones más amplias tales como la detección de pequeñas deleciones génicas o la detección de mutaciones mediante PCR in situ alelo específica.

17.2. Materiales y métodos

Se someten a ensayo el ADN de VIH-1 de tejidos que comprenden un amplio intervalo de células potencialmente infectadas por VIH-1, incluyendo las del sistema nervioso central, los nódulos linfáticos, y el bazo, utilizando los cebadores marcados con FRET de la invención y los métodos para PCR in situ normalizados conocidos comúnmente en la técnica (ver, v.g., Nuovo and Bloch, Patente de los Estados Unidos Núm. 5.538.871; Bagasra y Seshamma, 1994, Protocol: In situ amplification and Hybridization, Segunda Ed., John Wiley and Sons, Somerset, NJ).

Se sintetizan químicamente un par de cebadores para la PCR aguas arriba y aguas abajo (SEQ ID NUMS:43-44, ver más abajo) y se utilizan para amplificar una porción de una secuencia de la región gag de un ADN genómico viral de VIH-1. Uno o ambos cebadores oligonucleotídicos que se utilizan para la PCR pueden tener una estructura en horquilla en el extremo 3', marcado con un par MET, v.g., FAM/DABCYL.

Por ejemplo, se puede utilizar un cebador en horquilla en el que la secuencia oligonucleotídica de hebra sencilla en su extremo 3' comprende la secuencia de la SEC ID NUM:43 o de la SEC ID NUM:44 con el fin de que sea capaz de cebar la síntesis mediante una polimerasa de ácido nucleico de una secuencia de nucleótidos complementaria a una hebra de ácido nucleico que comprende la secuencia diana gag.

Un ejemplo de semejante cebador en horquilla, BSK38 (SEC ID NUM:26) se muestra en la Figura 27. El cebador muestra una estructura en horquilla en la que se producirá MET cuando el cebador no sea incorporado al producto de amplificación. Cuando es incorporado al producto de amplificación, su configuración cambia (esto es, se linealiza), y, en el caso del par FRET FAM/DABCYL, se elimina la extinción, y se detecta la fluorescencia del donador.

Alternativamente, el par de cebadores puede ser de cebadores lineales marcados con MET que no forman una configuración en horquilla (ver Sección 5.4).

Cuando uno o ambos cebadores son cebadores lineales, estos pueden tener las siguientes secuencias que son complementarias a la secuencia gag:

Cebador SK 38

ATAATCCACCTATCCCAGTAGGAGAAAT

(SEC ID NUM:43)

Cebador SK 39

TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATGC

(SEC ID NUM:44)

En experimentos de control, se dirige una PCT in situ convencional (v.g., Nuovo, 1997, PCR In Situ Hybridization: Protocols and Applications, Third Edition, Lippincott-Raven Press, New York) utilizando dos cebadores lineales complementarios a la secuencia gag, v.g., SK 38 (SEC ID NUM:43) y SK 39 (SEC ID NUM:44). Los productos de amplificación son detectados a través de una etapa de hibridación in situ utilizando la secuencia SK 19 como sonda.

SK 19 (sonda de hibridación)

ATCCTGGGATTAAATAAAATAGTAAGAATGTATAGCCCTAC

(SEC ID NUM:45).

La PCR in situ utilizando los cebadores marcados con FRET de la invención se realiza llevando a cabo las siguientes etapas. Primero, se coloca una muestra en un porta para microscopio de vidrio y después se fija mediante métodos normalizados. Entre los fijadores comunes se incluyen, v.g., etanol, metanol, metanol:ácido acético, formaldehído, paraformaldehído y glutaraldehído, o cualquier otro fijador conocido en la técnica.

La muestra es pretratada opcionalmente con una proteasa, v.g., proteinasa K, para ayudar a la penetración de los reactivos de amplificación. La concentración de proteasa y el tiempo de tratamiento se determina empíricamente para cada muestra.

Después se añade un cóctel de amplificación, que consta de nucleótidos, los cebadores en horquilla (o lineales) de la invención, un tampón de amplificación, y una ADN polimerasa termoestable, v.g., polimerasa Taq. Se pone un cubre u otro dispositivo de contención para mantener la concentración del cóctel constante durante las subsiguientes etapas de la ciclación térmica. (Para los métodos generales y las composiciones del tampón para la PCR in situ, ver, v.g., Nuovo, 1997, PCR In Situ Hybridization: Protocols and Applications, Third Edition, Lippincott-Raven Press, New York; Nuovo, et al., Patente de los Estados Unidos Núm. 5.538.871).

La amplificación in situ se realiza después en un termociclador, durante v.g., 30-40 ciclos, utilizando las condiciones para el recocido y la prolongación previamente establecidas mediante PCR en solución, v.g., primer ciclo térmico, desnaturalización durante 3 minutos a 94ºC, y recocido/prolongación durante 2 minutos a 55ºC; los 39 ciclos restantes constan de 1 minuto de desnaturalización a 94ºC y 2 minutos de recocido/prolongación.

Puesto que los cebadores en horquilla no incorporados no producen señal post-amplificación, las etapas de lavado se reducen o eliminan. Esto mejora la sensibilidad de la detección puesto que no se pierde producto de la amplificación durante las etapas de lavado de la post-amplificación.

Tras la amplificación mediante PCR, se miden las intensidades de la señal MET de las mezclas de reacción utilizando, v.g., un microscopio de fluorescencia. Las células positivas para el molde gag del VIH deberán mostrar una señal, v.g., fluorescencia; las células negativas para gag no deben mostrar señal.

18. Ejemplo 12

Caracterización de la región gag del genoma viral de VIH-1 Utilizando PCR in situ con cebadores en horquilla 18.1. Introducción

En este ejemplo, se sometieron a ensayo una serie de tejidos infectados con VIH-1 del bazo, nódulo linfático, cerebro, y cérvix para la región gag del genoma viral de VIH-1 utilizando PCR in situ con cebadores en horquilla.

18.2. Materiales y métodos

Se sintetizaron químicamente un cebador en horquilla y un cebador lineal y se utilizaron para amplificar una porción de una secuencia de la región gag de un ADN del genoma viral de VIH-1.

El cebador lineal utilizado fue SK 39 (SEC ID NUM:44).

El cebador en horquilla utilizado, BSK38 (SEC ID NUM:26) se muestra en la Figura 27 (ver también la Sección 17 anterior). La secuencia de nucleótidos de hebra sencilla del cebador en horquilla constaba en su extremo 3', de una porción 3' de la secuencia de SK 38 (SEC ID NUM:43). La porción 5' del cebador constaba de una horquilla marcada con el par MET FAM/DABCYL. Puesto que la secuencia de hebra sencilla 3' era complementaria a la secuencia gag, esta servía como cebador.

El cebador forma una estructura en horquilla en la que se producirá MET cuando el cebador no esté incorporado al producto de amplificación. Cuando esté incorporado al producto de amplificación, su configuración cambia (esto es, se linealiza), y, en el caso del par FRET FAM/DABCYL, se elimina la extinción, y se detecta la fluorescencia del donador.

En experimentos de control, se dirigió una PCR in situ convencional (Nuovo, 1997, PCR In Situ Hybridization: Protocols and Applications, Third Edition, Lippincott-Raven Press, New York) utilizando dos cebadores lineales SK 38 (SEC ID NUM:43) y SK 39 (SEC ID NUM:44) complementarios a la secuencia gag en el cóctel de amplificación (ver más abajo). Los productos de amplificación fueron detectados a través de una etapa de hibridación in situ utilizando la secuencia SK 19 (SEC ID NUM:45) como sonda.

Se realizó una PCR in situ utilizando el cebador lineal y el cebador en horquilla marcado con FRET de la invención esencialmente como se ha descrito en la Sección 17 con unas pocas modificaciones. Las secciones de tejido fueron fijadas a portas de microscopio de vidrio recubiertos con silano y se fijaron durante una semana en formalina tamponada neutra al 10%, después se embebieron en un medio de imbibición de parafina utilizando métodos normalizados conocidos en la técnica. Las secciones fueron desparafinizadas (mediante incubación con xileno durante 5 minutos, seguido de etanol al 100% durante 5 minutos). La muestra fue pretratada con 2 mg/ml de pepsina durante 30 minutos. Después se añadieron al porta 10-20 \mul por muestra de un cóctel de amplificación, que después se cubrió con un cubre de polipropileno sometido a autoclave y se recubrió con aceite mineral precalentado.

El cóctel de amplificación constaba de los siguientes reactivos por 50 \mul de cóctel:

5 \mul de tampón para PCR II (Perkin-Elmer)

9 \mul de MgCl_{2} (concentración final 4,5 mM)

8 \mul de dNTP (concentración final 200 \mul cada uno)

1.5 \mul de BSA al 2%

2 \mul de oligonucleótido SK 38 modificado (concentración final 0,2 \muM)

2 \mul de oligonucleótido SK 39 (concentración final 0,2 \muM)

21,5 \mul de agua tratada con DEPC

1 \mul de polimerasa Taq (Perkin-Elmer 5 U/\mul)

Después se llevó a cabo la amplificación in situ en un termociclador durante 35 ciclos utilizando un protocolo de "arranque en caliente". La polimerasa Taq fue apartada del cóctel de amplificación hasta que el bloque alcanzó 55ºC, después la mezcla de ADN se desnaturalizó inicialmente calentando a 94ºC durante 3 minutos, después de lo cual comenzó la ciclación, con desnaturalización durante 1 minuto a 94ºC, y recocido/prolongación durante 1,5 minutos a 60ºC.

Tras la amplificación mediante PCR, se realizó un lavado altamente riguroso (60ºC en sal 15 mM y BSA al 2% durante 10 minutos después de la PCR). Las intensidades de señal MET de las células en las muestras se midieron después utilizando un microscopio de fluorescencia.

18.3. Resultados

La Figura 34 muestra las células positivas para gag en tejido de nódulo linfático de un paciente con infección temprana por VIH-1, tras la realización de una PCR in situ utilizando el cebador lineal y el cebador en horquilla marcado con FRET de la invención.

La Figura 35 muestra la misma vista de la muestra de tejido a un aumento mayor. Las células positivas para gag muestran una fuerte señal y hay un fondo bajo en la preparación.

La Figura 36 es un control negativo en el que la polimerasa Taq fue omitida del cóctel de amplificación. No se observaron células positivas para gag.

La Figura 37 muestra también tejido de nódulo linfático de un paciente infectado con VIH-1 tras la realización de una PCR in situ utilizando un cebador lineal y un cebador en horquilla marcado con FRET. Se observan células positivas para gag. No obstante la razón de la señal frente al fondo es menor que en las Figuras 34 y 35; existe señal en algunas células pero fondo citoplásmico en otras debido a un lavado post-PCR inadecuado.

La Figura 38 muestra una neurona positiva al VIH-1 en el cerebro de un paciente fallecido debido a demencia por SIDA, tras realizar la PCR in situ utilizando un cebador lineal y un cebador en horquilla marcado con FRET. Obsérvese la buena razón de la señal frente al fondo.

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18.4. Discusión

Las células de pacientes infectados por VIH, y por tanto conocidas por ser positivas al molde gag del VIH, mostraron una señal fluorescente mientras que las células que se esperaba que fueran negativas para gag no mostraron señal.

19. Ejemplo 13

Utilización de cebadores en horquilla en un analisis de amplificacion mediante circulo rodador en cascada (CRCA) 19.1. Métodos y resultados

La amplificación mediante círculo rodador en cascada (CRCA) realizada con un cebador en horquilla (MET) y un cebador no dispuesto en horquilla fue utilizada para amplificar una sonda "candado" circularizada mediante ligadura con ADN ligasa tras la hibridación con una secuencia diana modelo (Nilsson, y col., 1994, Science 265:2085-2088), pUC19, y se lograron razones altas de la señal frente al fondo y sensibilidad de hasta \sim10 círculos molde. Cuando se marcaba o un cebador 1 o 2 en horquilla para el círculo rodador (directo) (SEC ID NUMS:46-47) o un cebador 1 o 2 en horquilla inverso (SEC ID NUMS:48-49) con un par MET (FAM/DABCYL) (ver la Figura 32), se observaban productos en cascada normales, mediante análisis en gel de agarosa, cuando se utilizaban 8 unidades de ADN polimerasa Bst, un fragmento largo en la reacción de amplificación.

Las reacciones CRCA se dirigieron con los siguientes pares de cebadores (ver la Figura 32): cebador 1 directo (círculo rodador) en horquilla marcado con MET (SEC ID NUM:46) y cebador inverso no dispuesto en horquilla (SEC ID NUM:51); cebador 2 directo en horquilla marcado con MET (SEC ID NUM:47) y cebador inverso no dispuesto en horquilla (SEC ID NUM:51); cebador directo (círculo rodador) no dispuesto en horquilla (SEC ID NUM:50) y cebador 1 inverso en horquilla marcado con MET (SEC ID NUM:48); y cebador directo (círculo rodador) no dispuesto en horquilla (SEC ID NUM:50) y cebador 2 inverso en horquilla marcado con MET (SEC ID NUM:49).

Se generaron varios microgramos de producto de ADN de doble hebra, en una reacción de 25 \mul, en 1 hora a 64ºC. Se detectaron señales MET fuertes mediante análisis fluorométrico con respecto a los niveles de fondo de las reacciones de control (menos ligasa). También se observaron productos fluorescentes mediante la visualización directa de los tubos de reacción en un transiluminador.

Como se representa en la Figura 33, se observaron claramente señales MET por encima del fondo con tan pocos como 10 círculos molde (+ ligasa). La CRCA representada en la Figura 33 se puso en marcha utilizando el cebador 1 directo (círculo rodador) no dispuesto en horquilla no marcado (SEC ID NUM:46) y el cebador 1 inverso en horquilla marcado con MET (SEC ID NUM:48). Los círculos molde eran sondas circularizadas elaboradas utilizando pUC19 como diana. Se utilizaron 8 unidades de polimerasa Bst, fragmento largo, y la reacción CRCA se puso en marcha durante 1 hora a 64ºC. Las señales de las muestras fueron medidas después en un espectrofluorómetro. Las señales permanecían bajas a todas las concentraciones de las sondas en ausencia de ligasa, demostrando que se requiere un molde circularizado para la CRCA, y que se suprimen las reacciones no específicas, a las que se podrían incorporar potencialmente los cebadores en horquilla.

Además, los productos de la CRCA fueron digeridos con una endonucleasa de restricción, HaeIII, que únicamente corta en la junta de ligadura de la sonda original. Esta digestión rindió productos de doble hebra que tenían el tamaño de la unidad de longitud de la sonda, demostrando que los productos amplificados eran productos genuinos de la CRCA.

También se realizó una CRCA en la que el cebador inverso era un cebador en horquilla marcado con un par MET FAM/DABCYL (cualquiera de los cebadores 1 o 2 inversos en horquilla como se muestra en la Figura 32), mientras que el cebador directo era un cebador en horquilla no modificado (idéntico a cualquiera de los cebadores 1 o 2 en horquilla directos, como se muestra en la Figura 32, menos los radicales MET). De una manera similar a los resultados descrito antes utilizando un cebador directo en horquilla y un cebador inverso no dispuesto en horquilla, se observaron claramente señales MET por encima del fondo, y se observaron señales de fondo bajas, normales. El uso de dos cebadores en horquilla puede mejorar la especificidad y reducir el fondo con otros sistemas diana evitando las interacciones no específicas entre la diana y/o el ADN genómico y los cebadores.

Se realizó una CRCA utilizando un cebador directo (círculo rodador) no dispuesto en horquilla (SEC ID NUM:50), un cebador 1 inverso en horquilla marcado con MET (SEC ID NUM:48) y una secuencia específica diana de ras (SEC ID NUM:53) para detectar el mutante ras y secuencias de tipo salvaje. Se realizaron reacciones de ligadura en las que la junta de ligadura contenía pares de bases correctos o incorrectos en el codón 12 de la secuencia ras (SEC ID NUM:53). Se detectaron señales MET cuando una reacción de ligadura A\cdotT correctamente emparejada se diluyó por debajo de \sim10^{4} moléculas diana de entrada, mientras que se requerían 10^{8} moléculas de una reacción A\cdotG desemparejada para la detección, demostrando una discriminación de aproximadamente 10.000 veces entre los pares de bases correctos e incorrectos.

El alcance de la presente invención no está limitado por las reacciones específicas descritas aquí.

Claims (86)

1. Un oligonucleótido que comprende las siguientes secuencias contiguas en orden 5' a 3':

(a)

una primera secuencia de nucleótidos de 6-30 nucleótidos, donde un nucleótido de dicha primera secuencia de nucleótidos está marcado con un primer radical seleccionado entre un radical donador y un radical aceptor de un par de transferencia de energía molecular, donde el radical donador emite fluorescencia en una o más longitudes de onda concretas cuando se excita, y el radical aceptor absorbe y extingue dicha fluorescencia emitida por dicho radical donador;

(b)

una segunda secuencia de nucleótidos de hebra sencilla de 3-20 nucleótidos;

(c)

una tercera secuencia de nucleótidos de 6-30 nucleótidos, donde un nucleótido de dicha tercera secuencia de nucleótidos está marcado con un segundo radical seleccionado entre dicho radical donador y dicho radical aceptor, y dicho segundo radical es el miembro de dicho grupo que no marca dicha primera secuencia de nucleótidos, donde dicha tercera secuencia de nucleótidos es complementaria en orden inverso a dicha primera secuencia de nucleótidos de manera que se puede formar un dúplex entre dicha primera secuencia de nucleótidos y dicha tercera secuencia de nucleótidos de manera que dichos primer radical y segundo radical están próximos de manera que, cuando el radical donador es excitado y emite fluorescencia, el radical aceptor absorbe y extingue dicha fluorescencia emitida por dicho radical donador; y

(d)

en el extremo 3' de dicho oligonucleótido, una cuarta secuencia de oligonucleótidos de hebra sencilla de 8-40 nucleótidos que comprende en su extremo 3' una secuencia complementaria a una secuencia diana preseleccionada y capaz de cebar la síntesis mediante una polimerasa de ácido nucleico de una secuencia de nucleótidos complementaria a una hebra de ácido nucleico que comprende dicha secuencia diana;

donde cuando no se forma dicho dúplex, dicho primer radical y dicho segundo radical están separados por una distancia que evita que la energía molecular se transfiera entre dichos primer y segundo radicales.

2. El oligonucleótido de la reivindicación 1, donde dicha distancia está en el intervalo de 15-25 nucleótidos.

3. El oligonucleótido de la reivindicación 2, donde dicha distancia es de 20 nucleótidos.

4. El oligonucleótido de la reivindicación 1, donde dicho radical donador es un fluoróforo.

5. El oligonucleótido de la reivindicación 1, donde dicha secuencia diana preseleccionada es una secuencia genómica o de ARNm.

6. El oligonucleótido de la reivindicación 1, 2 o 5, donde dicha secuencia diana preseleccionada es una secuencia genómica, de ADNc, o de ARNm humana.

7. El oligonucleótido de la reivindicación 1, donde dicha secuencia diana preseleccionada es una secuencia genómica de un agente de una enfermedad infecciosa.

8. El oligonucleótido de la reivindicación 1, donde dicha secuencia diana preseleccionada es una secuencia genómica humana de tipo salvaje, cuya mutación está implicada en la presencia de una enfermedad o trastorno humano.

9. El oligonucleótido de la reivindicación 4, donde dicho radical donador y dicho radical aceptor se seleccionan entre 5-carboxifluoresceína (FAM), 2',7'-dimetoxi-4',5'-dicloro-6-carboxifluoresceína (JOE), rodamina, 6-carboxirrodamina (R6G), N,N,N'-tetrametil-6-carboxirrodamina (TAMRA), 6-carboxi-X-rodamina (ROX), ácido 5-(2'-aminoetil)aminonaftalen-1-sulfónico (EDANS), antranilamida, cumarina, derivados quelato de terbio, Verde malaquita, Rojo Reactivo 4, DABCYL, tetrametilrrodamina, butirato de pireno, eosina nitrotirosina, etidio y Rojo Texas.

10. El oligonucleótido de la reivindicación 1, donde dicho radical donador se selecciona entre fluoresceína, 5-carboxifluoresceína (FAM), rodamina, ácido 5-(2'-aminoetil)aminonaftalen-1-sulfónico (EDANS), antranilamida, cumarina, derivados quelato de terbio, Verde malaquita, y Rojo Reactivo 4, y dicho reactivo aceptor se selecciona entre DABCYL, rodamina, tetrametilrrodamina, butirato de pireno, eosina nitrotirosina, etidio y Rojo Texas.

11. El oligonucleótido de la reivindicación 1, donde dicho radical donador es la fluoresceína o un derivado de la misma, y dicho radical aceptor es DABCYL.

12. El oligonucleótido de la reivindicación 1 o 4, que es un oligodesoxinucleótido.

13. El oligonucleótido de la reivindicación 1, donde dicha cuarta secuencia de nucleótidos comprende adicionalmente un sitio de reconocimiento para una endonucleasa de restricción.

14. El oligonucleótido de la reivindicación 1, cuya secuencia consta de las secuencias de nucleótidos (a)-(d).

15. El oligonucleótido de la reivindicación 1, donde dicho primer radical y dicho segundo radical están situados en nucleótidos complementarios que están opuestos entre sí en dicho dúplex.

16. El oligonucleótido de la reivindicación 1, donde dicho primer radical y dicho segundo radical están situados en nucleótidos de hebras opuestas que están a cinco nucleótidos en dicho dúplex.

17. Un oligonucleótido de la reivindicación 1, donde dicha cuarta secuencia de nucleótidos de hebra sencilla (d) comprende 10-25 nucleótidos.

18. El oligonucleótido de la reivindicación 17, donde dicho radical donador y dicho radical aceptor son un par FRET.

19. El oligonucleótido de la reivindicación 1, donde dicha segunda secuencia de nucleótidos de hebra sencilla consta de 4-6 nucleótidos.

20. El oligonucleótido de la reivindicación 1 que está purificado.

21. El oligonucleótido de la reivindicación 1, donde dicho primer radical es el radical donador y dicho segundo radical es el radical aceptor.

22. Un método para elaborar un cebador en horquilla oligonucleotídico que comprende:

A. hibridar un primer oligonucleótido, cuya secuencia de oligonucleótidos consta de las siguientes secuencias contiguas en orden 5' a 3':

(a)

una primera secuencia de nucleótidos de hebra sencilla de 1 a 10 nucleótidos;

(b)

una segunda secuencia de nucleótidos de 2-30 nucleótidos, donde un nucleótido de dicha primera secuencia de nucleótidos o dicha segunda secuencia de nucleótidos está marcado con un primer radical seleccionado entre un radical donador y un radical aceptor de un par de transferencia de energía molecular, donde el radical donador emite fluorescencia en una o más longitudes de onda concretas cuando se excita, y el radical aceptor absorbe y extingue dicha fluorescencia emitida por dicho radical donador;

(c)

una tercera secuencia de nucleótidos de hebra sencilla de 3-20 nucleótidos; y

(d)

una cuarta secuencia de nucleótidos de 2-30 nucleótidos, donde un nucleótido de dicha cuarta secuencia de nucleótidos está marcado con un segundo radical seleccionado entre dicho radical donador y dicho radical aceptor, y dicho segundo radical es el miembro de dicho grupo que no marca dicha primera o segunda secuencia de nucleótidos, donde dicha cuarta secuencia de nucleótidos es complementaria en orden inverso a dicha segunda secuencia de nucleótidos de manera que se puede formar un dúplex entre dicha segunda secuencia de nucleótidos y dicha cuarta secuencia de nucleótidos de manera que dichos primer radical y segundo radical están próximos de manera que, cuando el radical donador es excitado y emite fluorescencia, el radical aceptor absorbe y extingue dicha fluorescencia emitida por dicho radical dona-dor;

a un segundo oligonucleótido, comprendiendo dicho segundo oligonucleótido:

(i)

una secuencia 5' complementaria a dicha primera secuencia de nucleótidos de hebra sencilla (a) de dicho primer oligonucleótido e hibridable a ella, y

(ii)

una secuencia 3' de 8-40 nucleótidos complementaria a una secuencia diana preseleccionada de manera que sea capaz de cebar la síntesis mediante una polimerasa de ácido nucleico de una secuencia de nucleótidos complementaria a una hebra de ácido nucleico que comprende dicha secuencia diana; y

B. ligar el extremo 5' de dicha secuencia 5' al extremo 3' de dicha cuarta secuencia de nucleótidos (d) de dicho primer oligonucleótido.

23. El método de la reivindicación 22, donde dicha primera secuencia de nucleótidos (a) de dicho primer oligonucleótido está en el intervalo de 3-4 nucleótidos, dicha segunda secuencia de nucleótidos (b) de dicho primer oligonucleótido está en el intervalo de 4-6 nucleótidos, dicha tercera secuencia de nucleótidos (c) de dicho primer oligonucleótido está en el intervalo de 4-6 nucleótidos, y dicha cuarta secuencia de nucleótidos (d) de dicho primer oligonucleótido está en el intervalo de 4-6 nucleótidos.

24. El método de la reivindicación 23, donde dicha primera secuencia de nucleótidos es 5'-GGC-3'.

25. El método de la reivindicación 22, donde dicho radical donador es un fluoróforo.

26. El método de la reivindicación 25, donde dicho radical donador se selecciona entre fluoresceína, 5-carboxifluoresceína (FAM), rodamina, ácido 5-(2'-aminoetil)aminonaftalen-1-sulfónico (EDANS), antranilamida, cumarina, derivados quelato de terbio, Verde malaquita, y Rojo Reactivo 4, y dicho reactivo aceptor se selecciona entre DABCYL, rodamina, tetrametilrrodamina, butirato de pireno, eosina nitrotirosina, etidio y Rojo Texas.

27. El método de la reivindicación 22, donde dicho primer oligonucleótido es un oligodesoxinucleótido.

28. Un estuche que comprende en un recipiente el oligonucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21.

29. Un estuche de la reivindicación 28, que comprende el oligonucleótido de la reivindicación 1.

30. Un estuche de la reivindicación 28, que comprende el oligonucleótido de la reivindicación 12.

31. Un estuche de la reivindicación 28, que comprende el oligonucleótido de la reivindicación 17 o 18.

32. Un estuche de la reivindicación 31, que comprende en uno o más recipientes:

(a)

un primer oligonucleótido de la reivindicación 17; y

(b)

un segundo oligonucleótido;

donde dicha cuarta secuencia de nucleótidos de hebra sencilla de dicho primer oligonucleótido de la reivindicación 17 también está presente en el extremo 5' de dicho segundo oligonucleótido.

33. Un estuche de la reivindicación 28, que comprende, además de dicho oligonucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, un oligonucleótido adicional, donde dicho oligonucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 y dicho oligonucleótido adicional son cebadores para su uso en una reacción de amplificación de ácido nucleico para amplificar una secuencia de ácido nucleico diana preseleccionada; y están contenidos en uno o más recipientes.

34. El estuche de la reivindicación 33, donde ambos dichos primer y segundo oligonucleótidos son los oligonucleótidos de la reivindicación 1.

35. El estuche de la reivindicación 33, que comprende adicionalmente un tercer oligonucleótido que es parcialmente complementario a uno del primer y segundo oligonucleótidos.

36. El estuche de la reivindicación 35, que comprende adicionalmente en uno o más recipientes:

(c)

una ADN polimerasa; y

(d)

una ADN ligasa.

37. El estuche de la reivindicación 33, que comprende adicionalmente en uno o más recipientes:

(c)

una tampón para dicha reacción de amplificación;

(d)

un ácido nucleico de control que comprende la secuencia diana preseleccionada; y

(e)

una ADN polimerasa.

38. El estuche de la reivindicación 37, que comprende adicionalmente:

(f)

una serie de instrucciones para llevar a cabo dicha reacción de amplificación.

39. El estuche de la reivindicación 38, que comprende adicionalmente los medios para estimular y detectar las emisiones de luz fluorescente.

40. El estuche de la reivindicación 33, que comprende adicionalmente en dicho recipiente o en uno o más recipientes diferentes: un tercer oligonucleótido; y un cuarto oligonucleótido, donde dichos tercer y cuarto oligonucleótidos son cebadores para su uso en dicha reacción de amplificación de ácido nucleico para amplificar una segunda secuencia diana preseleccionada; y al menos uno de dichos tercer y cuarto oligonucleótidos es un oligonucleótido de la reivindicación 1, y donde dicho radical donador de dicho primer o segundo oligonucleótido emite luz fluorescente de una longitud de onda diferente a la de dicho radical donador de dicho tercer o cuarto oligonucleótido.

41. El estuche de la reivindicación 33, donde dichos primer y segundo oligonucleótidos son oligodesoxi-nucleótidos.

42. Un estuche según la reivindicación 28 que comprende en uno o más recipientes:

(A)

un primer cebador oligonucleotídico;

(B)

un segundo cebador oligonucleotídico, donde el primer y el segundo cebador oligonucleotídico son cebadores directos e inversos para la síntesis de ADN en una reacción de amplificación para amplificar una secuencia de ácido nucleico, y donde dicho segundo cebador oligonucleotídico comprende:

(i)

una secuencia 5' que no es complementaria a una secuencia diana preseleccionada de dicha secuencia de ácido nucleico, y

(ii)

una secuencia 3' que es complementaria a dicha secuencia diana preseleccionada; y

(C)

un tercer cebador oligonucleotídico, siendo dicho tercer cebador oligonucleotídico un oligonucleótido de la reivindicación 1 donde, en dicho oligonucleótido de la reivindicación 1, la cuarta secuencia de nucleótidos de hebra sencilla (d) de dicho oligonucleótido de la reivindicación 1 es una secuencia de 10-25 nucleótidos que comprende en su extremo 3' una secuencia idéntica a dicha secuencia 5' de dicho segundo cebador oligonucleotídico de (B).

43. El estuche de la reivindicación 42, donde dicha secuencia diana preseleccionada es de un ácido nucleico seleccionado del grupo formado por el gen X Fragil, la región del síndrome de Prader-Willi, la región del síndrome de Angelman, el gen P15, el gen P16, el gen E-cadherin, y el gen del síndrome von Hippel-Lindau.

44. El estuche de la reivindicación 33, donde dicho primer oligonucleótido es el oligonucleótido de la reivindicación 1, y cuyo estuche comprende adicionalmente un oligonucleótido bloqueador que comprende una secuencia complementaria e hibridable con una secuencia de dicho segundo oligonucleótido; y opcionalmente comprende adicionalmente en un recipiente separado ADN ligasa.

45. El estuche de la reivindicación 33, donde dicha reacción de amplificación es la reacción en cadena de la polimerasa.

46. El estuche de la reivindicación 36, donde dicha reacción de amplificación comprende repetidas etapas de polimerización y ligadura, de manera que uno de dichos primer y segundo oligonucleótidos es ligado a dicho tercer oligonucleótido.

47. El estuche de una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 46, donde el oligonucleótido está en una solución de agua destilada o tamponada.

48. El estuche de una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 47, que comprende adicionalmente en un recipiente separado bisulfito de sodio.

49. El estuche de la reivindicación 48, que comprende adicionalmente en uno o más recipientes un tampón para una reacción de amplificación de un ácido nucleico.

50. El estuche de una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 49, que comprende adicionalmente en recipientes separados: una mezcla de bisulfito de sodio y polvo de hidroquinona; aceite mineral; una matriz de unión para el ADN; solución de NaI; glucógeno; tampón de amplificación; ADN de control no metilado; y ADN de control metilado.

51. Un método de la reivindicación 27, donde dicho primer oligonucleótido consta de:

(a)

la SEC ID NUM:1, opcionalmente con fluoresceína o un derivado de la misma anclado a la G 5' y DABCYL anclado a la T en el nucleótido número 22;

(b)

la SEC ID NUM:13, opcionalmente con fluoresceína o un derivado de la misma anclado a la A 5' y DABCYL anclado a la T en el nucleótido número 20;

(c)

la SEC ID NUM:14, opcionalmente con fluoresceína o un derivado de la misma anclado a la A 5' y DABCYL anclado a la T en el nucleótido número 24;

(d)

la SEC ID NUM:15, opcionalmente con fluoresceína o un derivado de la misma anclado a la A 5' y DABCYL anclado a la T en el nucleótido número 24;

(e)

la SEC ID NUM:16, opcionalmente con fluoresceína o un derivado de la misma anclado a la A 5' y DABCYL anclado a la T en el nucleótido número 22;

(f)

la SEC ID NUM:17, opcionalmente con fluoresceína o un derivado de la misma anclado a la A 5' y DABCYL anclado a la T en el nucleótido número 22; o

(g)

la SEC ID NUM:18, opcionalmente con fluoresceína o un derivado de la misma anclado a la C 5' y DABCYL anclado a la T en el nucleótido número 20.

52. Un método para detectar o medir un producto de una reacción de amplificación de ácido nucleico que comprende:

(a)

poner en contacto una muestra que comprende ácidos nucleicos con al menos dos cebadores oligonucleotídicos, estando dichos cebadores oligonucleotídicos adaptados para su uso en dicha reacción de amplificación de manera que dichos cebadores sean incorporados a un producto amplificado de amplificación de dicha reacción de amplificación cuando esté presente en la muestra una secuencia diana preseleccionada; siendo al menos uno de dichos cebadores oligonucleotídicos el oligonucleótido de la reivindicación 1;

(b)

llevar a cabo la reacción de amplificación;

(c)

estimular la emisión de fluorescencia desde dicho radical donador; y

(d)

detectar o medir dicha fluorescencia emitida por dicho radical donador.

53. El método de la reivindicación 52, donde dicho radical donador es un fluoróforo.

54. El método de la reivindicación 52, donde dicha secuencia diana preseleccionada es una secuencia genómica.

55. El método de la reivindicación 52, donde dicha secuencia diana preseleccionada es una secuencia genómica humana.

56. El método de la reivindicación 52, donde dicha secuencia diana preseleccionada es una secuencia genómica de un agente de una enfermedad infecciosa.

57. El método de la reivindicación 52, donde dicha secuencia diana preseleccionada es una secuencia genómica humana de tipo salvaje, cuya mutación está implicada en la presencia de una enfermedad o trastorno humano.

58. El método de la reivindicación 52, donde dicho radical donador y dicho radical aceptor se seleccionan entre fluoresceína, 5-carboxifluoresceína (FAM), 2',7'-dimetoxi-4',5'-dicloro-6-carboxifluoresceína (JOE), rodamina, 6-carboxirrodamina (R6G), N,N,N',N-tetrametil-6-carboxirrodamina (TAMRA), 6-carboxi-X-rodamina (ROX), ácido 5-(2'-aminoetil)aminonaftalen-1-sulfónico (EDANS), antranilamida, cumarina, derivados quelato de terbio, Verde malaquita, Rojo Reactivo 4, DABCYL, tetrametilrrodamina, butirato de pireno, eosina, nitrotirosina, etidio y Rojo Texas.

59. El método de la reivindicación 52, donde dicho radical donador se selecciona entre fluoresceína, 5-carboxifluoresceína (FAM), rodamina, ácido 5-(2'-aminoetil)aminonaftalen-1-sulfónico (EDANS), antranilamida, cumarina, derivados quelato de terbio, Verde malaquita, y Rojo Reactivo 4; y dicho reactivo aceptor se selecciona entre DABCYL, rodamina, tetrametilrrodamina, butirato de pireno, eosina nitrotirosina, etidio y Rojo Texas.

60. El método de la reivindicación 52, donde dicho radical donador es la fluoresceína o un derivado de la misma, y dicho radical aceptor es DABCYL.

61. El método de la reivindicación 52, donde el oligonucleótido es un oligodesoxinucleótido.

62. El método de la reivindicación 53, donde el oligonucleótido es un oligodesoxinucleótido.

63. El método de la reivindicación 52, donde dicha cuarta secuencia de nucleótidos comprende adicionalmente un sitio de reconocimiento para una endonucleasa de restricción.

64. El método de la reivindicación 52, donde la secuencia de nucleótidos de dicho oligonucleótido de la reivindicación 1 consta de las secuencias de nucleótidos (a)-(d).

65. El método de la reivindicación 52, donde dicho primer radical y dicho segundo radical están situados en nucleótidos complementarios que están opuestos entre sí en dicho dúplex.

66. El método de la reivindicación 52, donde dicho primer radical y dicho segundo radical están situados en nucleótidos de hebras opuestas que están a cinco nucleótidos en dicho dúplex.

67. El método de la reivindicación 52 o 53, donde dichos cebadores oligonucleotídicos comprende una pluralidad de diferentes oligonucleótidos de la reivindicación 1, comprendiendo cada oligonucleótido en su extremo 3' dicha secuencia complementaria a una secuencia diana preseleccionada diferente con lo que dichos oligonucleótidos diferentes son incorporados a diferentes productos amplificados cuando dicha secuencia diana está presente en dicha muestra, estando cada uno de dichos oligonucleótidos marcados con un radical donador que emite luz fluorescente de una longitud de onda diferente que la emitida por los otros radicales donadores.

68. El método de la reivindicación 52, donde dicha reacción de amplificación es la reacción en cadena de la polimerasa.

69. El método de la reivindicación 52, donde dicha reacción de amplificación es la reacción en cadena de la polimerasa alelo específica.

70. El método de la reivindicación 52 o 53, donde la etapa (a) se produce en presencia de una ADN polimerasa y una ADN ligasa, y donde dicha reacción de amplificación comprende repetidas etapas de polimerización y ligadura, de manera que uno de los cebadores oligonucleotídicos es ligado a un tercer oligonucleótido que es parcialmente complementario a uno de los cebadores oligonucleotídicos.

71. El método de la reivindicación 52, donde dicha reacción de amplificación es por desplazamiento de la hebra.

72. El método de la reivindicación 52, donde dicha reacción de amplificación es amplificación NASBA.

73. El método de la reivindicación 52, donde dicha reacción de amplificación es por triamplificación, y al menos los dos cebadores oligonucleotídicos mencionados comprenden un cebador directo para cebar la síntesis de ADN y un cebador inverso para cebar la síntesis de ADN; y dicha etapa de contacto comprende poner en contacto también dicha muestra con un oligonucleótido bloqueador.

74. El método de la reivindicación 52 o 53, donde dicho producto de amplificación no es separado de dichos cebadores oligonucleotídicos no incorporados después de llevar a cabo dicha reacción de amplificación y antes de dichas etapas de estimulación y detección.

75. Un método de la reivindicación 52, donde la etapa (a) comprende:

poner en contacto una muestra que comprende ácidos nucleicos con un primer oligonucleótido, un segundo oligonucleótido, y un tercer oligonucleótido, siendo dicho primer oligonucleótido el oligonucleótido de la reivindicación 17, siendo dichos segundo y tercer oligonucleótidos cebadores adaptados para su uso en una reacción de amplificación de ácido nucleico de manera que dichos cebadores sean incorporados a un producto amplificado de dicha reacción de amplificación cuando esté presente en la muestra una secuencia diana preseleccionada; donde dicha cuarta secuencia de nucleótidos de hebra sencilla predeterminada de dicho primer oligonucleótido también está presente en el extremo 5' de dicho segundo oligonucleótido, y donde dicha cuarta secuencia de nucleótidos de hebra sencilla predeterminada no es complementaria a dicha secuencia diana preseleccionada.

76. El método de la reivindicación 75, donde dicho radical donador y dicho radical aceptor son un par FRET.

77. El método de la reivindicación 52, donde la energía emitida por dicho radical donador o radical aceptor se mide en la etapa (d), y donde la cantidad de dicha energía medida se corresponde con la cantidad de dicha secuencia diana preseleccionada que estaba presente en dicha muestra, permitiéndose de ese modo la determinación de la cantidad de dicha secuencia diana preseleccionada que estaba presente en dicha muestra.

78. El método de la reivindicación 77, donde se determina la cantidad de ADN que contiene dicha secuencia diana preseleccionada en la muestra.

79. El método de la reivindicación 77, donde se determina la cantidad de ARN que contiene dicha secuencia diana preseleccionada en la muestra.

80. El método de la reivindicación 77, donde se determina el número de cromosomas que contiene dicha secuencia diana preseleccionada en la muestra.

81. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 52 a 80, donde la reacción de amplificación se lleva a cabo in situ.

82. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 52 a 81, donde dicha reacción de amplificación es una amplificación de círculo rodador en cascada.

83. Un método para determinar el estado de metilación del ADN que comprende las siguientes etapas en el orden establecido:

(a)

poner en contacto una muestra que comprende ácidos nucleicos con una cantidad de bisulfito suficiente para convertir las citosinas no metiladas de la muestra en uracilo;

(b)

poner en contacto dicha muestra con un primer oligonucleótido, un segundo oligonucleótido, y un tercer oligonucleótido, siendo dicho primer oligonucleótido el oligonucleótido de la reivindicación 17, siendo dichos segundo y tercer oligonucleótidos cebadores adaptados para su uso en una reacción de amplificación de ácido nucleico de manera que dichos cebadores sean incorporados a un producto amplificado de dicha reacción de amplificación cuando esté presente en la muestra una secuencia diana preseleccionada; donde dicha cuarta secuencia de nucleótidos de hebra sencilla predeterminada de dicho primer oligonucleótido también está presente en el extremo 5' de dicho segundo oligonucleótido, y donde dicha cuarta secuencia de nucleótidos de hebra sencilla predeterminada no es complementaria a dicha secuencia diana preseleccionada;

(c)

llevar a cabo la reacción de amplificación;

(d)

estimular la emisión de fluorescencia desde dicho radical donador de dicho primer oligonucleótido; y

(e)

detectar o medir dicha fluorescencia emitida por dicho radical donador.

donde la cantidad de fluorescencia detectada o medida indica la presencia o la cantidad de dicho producto amplificado, indicando la presencia o la cantidad de dicho producto amplificado el estado de metilación de dicha secuencia diana preseleccionada en dicha muestra.

84. El método de la reivindicación 83, donde dicha secuencia diana preseleccionada es de un ácido nucleico seleccionado del grupo formado por el gen X Fragil, la región del síndrome de Prader-Willi, la región del síndrome de Angelman, el gen P15, el gen P16, el gen E-cadherin, y el gen del síndrome von Hippel-Lindau.

85. Un método para detectar actividad telomerasa que comprende:

(a)

poner en contacto una muestra que se supone que tiene actividad telomerasa con al menos dos cebadores oligonucleotídicos que comprenden un primer cebador y un segundo cebador, donde o bien:

(i)

dicho primer cebador comprende una secuencia en su extremo 3' que es un sustrato para una telomerasa, y dicho segundo cebador es el oligonucleótido de la reivindicación 1; donde dicha secuencia diana preseleccionada a la que es complementaria dicha cuarta secuencia de nucleótidos de hebra sencilla de dicho segundo cebador, comprende repeticiones teloméricas que resultan de la actividad de dicha telomerasa; o

(ii)

dicho primer cebador es un oligonucleótido de la reivindicación 1 que comprende en su extremo 3' una secuencia que es un sustrato para la telomerasa; y donde dicho segundo cebador comprende en su extremo 3' una secuencia capaz de hibridar con las repeticiones teloméricas que resultan de la actividad de dicha telomerasa;

(b)

someter la muestra a condiciones adecuadas para la actividad telomerasa;

(c)

llevar a cabo una reacción de amplificación de un ácido nucleico en condiciones adecuadas para dichos primer y segundo cebadores para cebar una síntesis de ADN;

(d)

estimular la emisión de fluorescencia desde dicho radical donador; y

(e)

detectar o medir la fluorescencia emitida por dicho radical donador;

indicando la presencia o la cantidad de dicha fluorescencia la presencia o la cantidad de actividad telomerasa.

86. El método de la reivindicación 85, donde la reacción de amplificación se lleva a cabo in situ.