ES2205572T3 - Construcciones de cebador pcr para su utilizacion en un sistema integrado de señalizacion. - Google Patents
Construcciones de cebador pcr para su utilizacion en un sistema integrado de señalizacion.Info
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Abstract
Procedimiento para la detección de un ácido nucleico objetivo, comprendiendo dicho procedimiento poner en contacto el ácido nucleico matriz de una muestra con (i) un sistema de señalización (ii) un cebador con ácido nucleico de cola que tiene una zona de unión a la plantilla y la cola que comprende un segmento de unión y una zona de unión al objetivo, en presencia de trifosfatos de nucleósido apropiados y un agente para su polimerización, en condiciones tales que la zona de unión a la plantilla del cebador se hibridará con una secuencia complementaria en el ácido nucleico matriz y se ampliará para formar un producto de ampliación del cebador, separando cualquiera de dichos productos de la matriz, tras lo cual la zona de unión al objetivo en la cola del cebador se hibridará con una secuencia en el producto de ampliación del cebador correspondiente con el ácido nucleico objetivo y en el que cualquier hibridación específica del objetivo produce un cambio detectable en el sistema de señalización, de modo que la presencia o ausencia del ácido nucleico objetivo en la muestra se detecta con relación a la presencia o ausencia de un cambio detectable en el sistema de señalización.
Description
Construcciones de cebador PCR para su utilización
en un sistema integrado de señalización.
La presente invención se refiere a un nuevo
sistema de detección que comprende nuevos cebadores y a un sistema
integrado de señalización. El sistema se utiliza para la detección
de secuencias objetivo de ácido nucleico.
Los procedimientos disponibles para la
amplificación y detección de las secuencias objetivo de ácido
nucleico incluyen la utilización de la reacción en cadena de
polimerasa (PCR), según se describe por ejemplo en las patentes US
nº 4.683.195 y nº 4.683.202.
Una mejora significativa de los procedimientos de
amplificación y detección anteriores es el sistema de mutación que
responde a la amplificación (ARMS) según se reivindica en la
patente europea nº 0 332 435 (Zeneca Limited) y en la patente US nº
5.595.890 correspondiente.
Los sistemas de detección basados en sondas
apropiadas incluyen Taqman (según se expone en las patentes US nº
5.210.015 y nº 5.487.972) y señalizaciones moleculares (según se
expone en el documento WO-95/13399). En Taqman una
molécula de la sonda que comprende especies de fluoróforo/extintor
hibridadas con productos de amplificación por PCR y se digiere
mediante la actividad de la polimerasa, 5-3'
exonucleasa. Esto conduce a la liberación de fluoróforo no
extinguido y a una señal detectable correspondiente. En las
señalizaciones moleculares una molécula de la sonda con una
estructura de troco-bucle que mantiene las especies
de fluoróforo y extintor en estrecha proximidad se ensancha en el
momento de la unión en su objetivo complementario, tras lo cual el
fluoróforo se vuelve no congelado conduciendo a una señal
detectable.
Nazarenko et al (NAR 1997, 25,
2516-2521) da a conocer los denominados cebadores
"Sunrise". Estos son cebadores que forman bucles en horquilla
en sus extremos 5' para unir un par fluoróforo y extintor,
asegurando de este modo baja fluorescencia. Cuando estos cebadores
se han incorporado en un producto de PCR, las colas se vuelven de
doble cadena y la horquilla se desenreda produciendo el aumento de
fluorescencia. Sin embargo la generación de la señal no depende del
amplicón, cualquier amplicón con doble cadena (incluyendo los
dímeros del cebador) pueden incorporar el cebador Sunrise y generar
de este modo una señal falsa.
El documento
US-A-5.573.906 (Bannwarth et
al.) describe un procedimiento que utiliza un cebador marcado
5' que contiene una secuencia autocomplementaria en un
procedimiento de amplificación o de ampliación junto con una etapa
de detección posterior utilizando una sonda marcada en 3' para la
zona amplificada o expandida. Las marcas pueden estar muy juntas en
el espacio después de hidratar la sonda junto a la pieza corta del
ADN de doble cadena resultante del desplegamiento de la zona
autocomplementaria del cebador incorporado en el producto
amplificado o expandido.
Sin embargo, los niveles de especificidad de
secuencia y sensibilidad de detección, así como la velocidad de la
aparición de la señal, que se pueden conseguir utilizando los
procedimientos de amplificación y detección anteriores son
limitados. Por consiguiente, existe todavía necesidad de
procedimientos adicionales de diagnóstico mejorados.
Se ha elaborado actualmente un nuevo sistema de
detección utilizando un cebador de cola y un sistema integrado de
señalización. El cebador tiene una zona de unión a la plantilla y
una cola que comprende un segmento de unión y una zona de unión al
objetivo. En su utilización la zona de unión al objetivo en la cola
se hibrida con la secuencia complementaria en un producto de
ampliación del cebador. Este caso de hibridación específica del
objetivo se acopla a un sistema de señalización en el que la
hibridación conduce a un cambio detectable.
Por consiguiente en un primer aspecto de la
presente invención se proporciona un procedimiento para la
detección de un ácido nucleico objetivo, procedimiento que
comprende poner en contacto el ácido nucleico matriz de una muestra
con (i) un sistema de señalización (ii) un cebador con ácido
nucleico de cola que tiene una zona de unión a la plantilla y la
cola que comprende un segmento de unión y una zona de unión al
objetivo, en presencia de trifosfatos de nucleósido apropiados y un
agente para su polimerización, en condiciones tales que la zona de
unión a la plantilla del cebador se hibridará con una secuencia
complementaria en el ácido nucleico matriz y se ampliará para formar
un producto de ampliación del cebador, separando cualquiera de
dichos productos de la matriz, tras lo cual la zona de unión al
objetivo en la cola del cebador se hibridará con una secuencia en el
producto de ampliación del cebador correspondiente con el ácido
nucleico objetivo y en el que cualquier hibridación específica del
objetivo produce un cambio detectable en el sistema de
señalización, de modo que la presencia o ausencia del ácido nucleico
objetivo en la muestra se detecta con relación a la presencia o
ausencia de un cambio detectable en el sistema de señalización.
El procedimiento de detección de la invención
tiene numerosas ventajas significativas. Estas incluyen las
siguientes. Solamente se necesita una sola especie de
cebador/detector. Esto significa simplicidad y proporciona un
aumento de especificidad basado en la disponibilidad preparada para
la hibridación de la zona de unión al objetivo con el producto
ampliación del cebador. El producto de ampliación del cebador recién
sintetizado es la especie objetivo de forma que la señal de salida
obtenible está directamente relacionada con la cantidad del cebador
expandido. No depende de casos de hibridación adicionales o de
etapas enzimáticas (tal como la escisión TaqMan). La competencia
intra- e intercadena por la zona de la sonda está limitada de forma
que el diseño de la sonda se simplifica. Se ha descubierto que las
sondas que fallan al unirse en las condiciones estándar de la
prueba, en formatos de sonda independiente operan bien en esta
invención. La invención también permite formatos de prueba
homogéneos para ser elaborados fácilmente. Una ventaja adicional
todavía es que, como la interacción es unimolecular, la reacción de
señalización es muy rápida, permitiendo velocidad de ciclación
aumentadas. Esta es una característica significativa para diseños
de la pruebas.
Wilton et al. (Human Mutation, 1998, 11,
252-258) da a conocer un procedimiento analítico
denominado poliformismo de conformación de una sola cadena con
retroceso instantáneo (SSCP). Esto implica la utilización de un
cebador de cola para introducir una estructura secundaria en una
sola cadena de un amplicón. Los cebadores constan de extremos en 3'
estándar con colas cortas en el extremo 5'. Estas colas son
complementarias de una zona interna del amplicón a la misma
distancia del cebador y se pueden utilizar para examinar la
conformación de las cadenas únicas formadas después de calentamiento
y enfriamiento. Los cambios conformacionales introducidos por una
mutación en la zona complementaria de la sonda se detectan mediante
cambios de velocidad de migración en un gel de poliacrilamida
teñido con plata. Sin embargo no existe anticipación de las
características o ventajas de la presente invención.
En el procedimiento de detección de la invención,
la ampliación del cebador se puede repetir una o más veces por
ejemplo hasta 5, hasta 10, hasta 15, hasta 20, hasta 30, hasta 40,
hasta 50 o más veces. Prácticamente, el nuevo cebador de la
invención se utiliza como un cebador de amplificación en un sistema
de amplificación tal como la reacción en cadena de polimerasa
(PCR). En cuyo caso la zona de unión al objetivo y la zona de la
cola están dispuestas de forma ventajosa de tal modo que la zona de
la cola queda con una sola cadena, es decir sin copiar. De este
modo, la zona de la cola no es amplificable en los productos de
amplificación por PCR. Esta faceta del diseño del cebador se
reivindica en la patente europea nº 0 416 817 (Zeneca Limited) y en
la correspondiente patente US nº 5.525.494. Prácticamente el
segmento de unión comprende un grupo de bloqueo que impide la
ampliación de la cadena mediada por polimerasa en la plantilla del
cebador. Un grupo de bloqueo preferido es un monómero de
hexetilenglicol (HEG). Por otra parte la cola del cebador comprende
un material tal como 2-O-alquil ARN
que no permitirá la replicación de una cadena complementaria
mediada por la polimerasa. Como alternativa, la cola del cebador
comprende un ácido nucleico situado 5'-3' en el
terminal 5' del cebador, es decir las dos secuencias están situadas
"dorso con dorso", se valorará que en esta forma de
realización el ácido nucleico 5'-3' de la cola sirva
tanto de segmento de unión como de zona de unión al objetivo. Un
grupo segmento de unión independiente y distinto no es esencial.
La zona de unión a la plantilla del cebador se
hibrida con el ácido nucleico matriz de una muestra. La zona es de
cualquier diseño apropiado disponible para la persona experta y
está limitada solamente por consideraciones prácticas. Puede ser
ADN, ARN u otro con la condición de que proporcione un sustrato
para la ampliación del cebador mediada por la polimerasa. La unión
a la plantilla se puede efectuar a cualquier restricción deseada,
lo que equivale a decir que en condiciones apropiadas de restricción
de la hibridación la zona de unión a la plantilla del cebador puede
hibridarse con la zona de la plantilla (si está presente en la
plantilla) con exclusión de otras zonas. Como alternativa la unión a
la plantilla se puede efectuar con restricción reducida para
ampliar el cebador en cualquier número apropiado de secuencias
relacionadas de la plantilla, tal como por ejemplo los genes de
antígenos de leucocitos humanos (HLA), u otros genes conservados,
particularmente genes de ARN bacteriano o ribosómico. Se pueden
proporcionar cebadores en los que las zonas de unión a la plantilla
son elementos de una serie de secuencias aleatorias de hexámero. De
este modo, la expresión "una secuencia complementaria" se
propone que incluya todas las secuencias reseñadas anteriormente
con la condición de que la zona de unión a la plantilla y las
condiciones de hibridación permitan el grado deseado de
discriminación de secuencia. A título de ejemplo, la zona de unión
a la plantilla puede ser 100%, hasta el 95%, hasta el 90%, hasta el
85%, hasta el 80%, hasta el 75% o hasta el 70% complementaria con
la secuencia de la plantilla correspondiente. La zona de unión a la
plantilla es prácticamente de 6 a 50 nucleótidos, tal como de 10 a
40 nucleótidos, de 15 a 30 nucleótidos, particularmente de 20 a 30,
17 a 22, 16 a 23 ó 15 a 24 nucleótidos. Cada uno de los intervalos
anteriores es una forma de realización separada e independiente de
la invención. Todo lo anterior aplica de una manera análoga a la
zona de unión al objetivo del cebador con la condición de que la
zona de unión al objetivo sea más corta en general que la zona de
unión a la plantilla, más adelante se indican ejemplos de
intervalos adecuados y preferidos. Se reconocerá que la
selectividad global del procedimiento de la invención se puede
aplicar en una forma específico del alelo o de alelo múltiple para
las zonas de unión a la plantilla o de unión al objetivo
independientemente. Cada permutación es un aspecto particular de la
invención.
Como se bosquejó anteriormente, la zona de unión
al objetivo puede comprender, si se desea, una especie no copiable
tal como 2'-O-metil ARN, ácido
péptidonucleico (APN) y variantes de éstos. En este caso no se
requiere un segmento de unión identificable por separado y la zona
de unión al objetivo se considera que comprende un segmento de
unión que separa las zonas de unión a la plantilla y de unión al
objetivo. La zona de unión al objetivo puede ser más corta que las
diseñadas tradicionalmente para hibridación con amplicones
(productos de amplificación) ya que las interacciones
amplicón-objetivo de la presente invención están
más favorecidas unimolecular y, por consiguiente, cinéticamente (y
termodinámicamente) que las interacciones bimoleculares. A título de
ejemplo no limitativo, la zona de unión al objetivo puede
comprender no más de 6, como por ejemplo no más de 7, no más de 8,
no más de 9 o no más de 10 nucleótidos.
Debe entenderse que la cola del cebador puede
incluir nucleótidos adicionales complementarios como parte de la
zona de unión a la plantilla en el cebador. Éstos se pueden
utilizar para el "ajuste fino" de la afinidad de la cola del
cebador para las secuencias complementarias.
\newpage
El segmento de unión separa las zonas de unión a
la plantilla y de unión al objetivo. Las características óptimas
para el segmento de unión se pueden determinar por experimentación
de rutina. Mientras que no se desea estar ligado por consideraciones
teóricas, el segmento de unión puede comprender no más de 200
nucleótidos o menos como por ejemplo 100 ó 50 nucleótidos. En
general estas zonas se mantienen muy juntas, se cree que pueden
favorecer la hibridación de la zona de unión al objetivo con la zona
del objetivo. En un aspecto preferido el segmento de unión
comprende un grupo no amplificable tal como HEG, solo o combinado
con nucleótidos adicionales, más preferentemente solo. Cuando la
zona de unión a la plantilla y la zona de cola del cabador están
dispuestas para impedir la copia mediada por polimerasa de la cola
del cebador, el segmento de unión puede ser un enlace directo.
En un aspecto adicional de la invención se
proporcionan cebadores de ácido nucleico según las reivindicaciones
independientes 10 y 11. La zona de unión a la plantilla y la zona
de cola se organizan preferentemente de tal modo que la zona de cola
permanece de una sola cadena en los productos de amplificación por
PCR. Más preferentemente un grupo de bloqueo se sitúa entre la zona
del cebador de unión a la plantilla y la zona de cola, cuyo grupo
impide que la cadena mediada por la polimerasa copie de la zona de
cola de la plantilla del cebador. Un determinado grupo de bloqueo
es un monómero de hexetilenglicol (HEG). La zona de unión al
objetivo se selecciona preferentemente para hibridarse con una
secuencia complementaria del objetivo en el producto de ampliación
del cebador con menos de 200 como por ejemplo menos de 100 pares de
bases, como por ejemplo menos de 50 pares de bases, como por
ejemplo menos de 40 pares de bases, menos de 30 pares de bases,
menos de 25 o menos de 20 pares de bases como por ejemplo menos de
15, 10 o incluso 5 de una secuencia complementaria en la zona de
unión a la plantilla en el cebador.
La hibridación de la zona de unión al objetivo en
la cola del cebador a una secuencia complementaria en el producto
de ampliación del cebador al ácido nucleico del objetivo produce un
cambio detectable en el sistema de señalización. Se puede utilizar
cualquier sistema de señalización adecuado, a título de ejemplo no
limitativo nos referimos a la medición del cambio en la
polarización por fluorescencia de una especie marcada por
fluorescencia (patente europea nº 0 382 433 -Zeneca Limited), de
proteínas de unión al ADN, de zonas de creación o restricción en
especies por dublicado para la detección del punto final, la unión
de elementos para proporcionar una zona objetivo, la incorporación
de dNTP detectablemente (modificados) en los productos de ampliación
del cebador y especies de sonda adicionales. Además, se puede
utilizar cualquier especie específica con la secuencia adecuada,
los ejemplos incluyen intercaladores tales como intercaladores
específicos de longitud de onda, también especies utilizadas para
formar estructuras por triplicado. Los intercaladores adecuados se
reconocen por los científicos expertos en la técnica (véase Higuchi
et al. BioTechnology, 1992, 10, 413-417).
Los sistemas adicionales incluyen sistemas de dos
componentes en los que se crea o se suprime una señal cuando los
dos componentes se unen muy próximos entre sí. Como alternativa se
crea o se suprime una señal cuando los dos componentes se separan
después de la unión de la zona de unión al objetivo.
Ambos elementos del sistema de dos componentes
pueden estar provistos de las mismas o de diferentes moléculas. A
título de ejemplo los elementos se colocan en diferentes moléculas,
la unión específica al objetivo desplaza una de las moléculas en la
solución que conduce a una señal detectable.
Los sistemas de dos componentes adecuados se
pueden basar en la utilización de la transferencia de energía, por
ejemplo entre un fluoróforo y un extintor. En un aspecto particular
de la invención el sistema de detección comprende un par
fluoróforo/extintor. Se pueden determinar puntos de unión adecuados
y preferidos para la pareja de transferencia de energía mediante
experimentación de rutina. En la bibliografía se detallan numerosos
pares adecuados de fluoróforo/extintor (por ejemplo Glazer et
al., Current Opinion in Biotechnology, 1997, 8,
94-102) y en catálogos tales como los de Molecular
Probes, Glen y Applied Biosystems (ABI). Cualquier molécula
fluorescente es adecuada para la señalización con tal que se pueda
detectar con la instrumentación disponible. Las más preferidas son
las compatibles con el láser de 488 nm de ABI PRISM 7700 (derivados
de fluoresceína y rodamina). El extintor debe ser capaz de
extinguir la coloración en cuestión y esto puede ser mediante un
mecanismo de transferencia de energía de resonancia con
fluorescencia (FRET) que implica un segundo, fluoróforo receptor, o
más preferentemente mediante un mecanismo de colisiones que implica
un extintor no fluorógeno tal como DABCYL, que es un extintor
"Universal" de fluorescencia. Además se prefiere que los
fluoróforos y extintores seleccionados se incorporen fácilmente en
el oligonucleótido, más apropiadamente mediante la química de la
fosforamidita. Los donantes adecuados incluyen FAM, HEX y TET.
Se descubrió sorprendentemente que, sin la
inclusión de un extintor específico, la cola sola puede
proporcionar suficiente extinción de la fluorescencia. Cuando la
zona de unión al objetivo se hibrida con una secuencia
complementaria en el producto de ampliación del cebador se observa
una señal clara de fluorescencia. El punto óptimo de unión del
fluoróforo se puede determinar por experimentación de rutina. En un
aspecto adicional de la invención el sistema de señalización
comprende un fluoróforo unido a la zona de cola del cebador,
adecuadamente en o adyacente al terminal 5' de los extremos del
cebador. Mientras que no se desee estar limitado por
consideraciones teóricas, se puede utilizar como especie de
extintor cualquier secuencia rica en G de por lo menos 5 pares de
bases, como por ejemplo por lo menos 10 o por lo menos 15, como por
ejemplo por lo menos 20 pares de bases.
En una forma de realización específica adicional,
la cola del cebador incluye un colorante intercalador, la
hibridación de la zona de unión al objetivo da lugar a que el
colorante llegue a estar incorporado entre las bases del ADN de
doble cadena y de este modo fluorece. El colorante debería tener
preferentemente baja fluorescencia cuando no está intercalado y un
fuerte aumento de fluorescencia en el momento del intercalado. De
nuevo debería ser fácil unir las moléculas preferidas al
oligonucleótido por la química en fase sólida o por simple adición
después de la síntesis.
Se debe reconocer que la longitud total de la
cola del cebador se determinará principalmente por las funciones
deseadas de sus componentes individuales. En general, la cola del
cebador será por lo menos de 10 pares de bases, como por ejemplo por
lo menos 20, 30, 40 ó 50 pares de bases, por ejemplo 10 a 30 ó 15 a
25 pares de bases.
Es deseable que todos los colorantes, extintores,
segmentos de unión/bloqueantes toleren repetidas rondas de PCR que
incluyen múltiples exposiciones a altas temperaturas.
En un aspecto preferido de la invención por lo
menos un componente del sistema de señalización y el cebador del
ácido nucleico es una especie íntegra.
El ácido nucleico matriz es cualquier ácido
nucleico adecuado para análisis. Más comúnmente será el ADN
procedente de una reacción de amplificación tal como la PCR. Este
objetivo del ADN puede haberse derivado de una reacción de
transcripción inversa (RT). De hecho, el cebador de la invención se
puede utilizar en la propia reacción de RT y ser utilizado
directamente, sin amplificación adicional. Otras técnicas de
amplificación in vitro tales como la reacción en cadena de
ligasa (LCR), OLA, NASBA y la amplificación por desplazamiento de
la cadena (SDA) pueden ser también adecuadas. Es importante sin
embargo que exista un intermedio de una sola cadena que permita
hibridar la zona de unión al objetivo con una secuencia
complementaria en el producto de ampliación del cebador. En general
el procedimiento de esta invención se utiliza como última etapa
(detección) en los procedimientos anteriores. Se ha de reconocer que
se puede requerir alguna optimización/reconfiguración aunque las
etapas apropiadas se pondrán de manifiesto para el especialista con
experiencia habitual.
Las fuentes de ácido nucleico de la muestra
incluyen las células humanas tales como las de la sangre en
circulación, células epiteliales bucales, células cultivadas y
células tumorales. También otros tejidos de mamífero, sangre y
células cultivadas son fuentes adecuadas de ácidos nucleicos con
plantilla. Además, los virus, bacteriófagos, bacterias, hongos y
otros microorganismos pueden ser fuentes de ácidos nucleicos para
análisis. El ADN puede ser genómico o puede estar clonado en
plásmidos, bacteriófagos, cromosomas artificiales bacterianos
(BAC), cromosomas artificiales de levaduras (YAC) u otros vectores.
El ARN se puede aislar directamente de células apropiadas o se puede
producir por cebado in vitro a partir de un activador de ARN
adecuado o por transcripción in vitro.
La presente invención se puede utilizar para la
detección de la variación en el ADN genómico bien humano, animal u
otros. Encuentra particular utilización en el análisis de
enfermedades heredadas o adquiridas. Una utilización particular
consiste en la detección de la enfermedad heredada. Se reconocerá
que el ácido nucleico objetivo está directa o indirectamente unido
a la secuencia o a la zona en cuestión para análisis. En un aspecto
preferido el cebador de la invención se utiliza como cebador común
en una PCR en combinación con el cebador del ARMS (como se expuso
por ejemplo en el documento
EP-B1-0 332 435). Esto es un ejemplo
de enlace indirecto con la secuencia o zona en cuestión. Como
alternativa, la secuencia o zona en cuestión se identifica cuando
interactúa con la zona específica de la plantilla en una manera
específica del alelo, preferentemente como cebador del ARMS (véase
anteriormente). Como alternativa, la secuencia o zona en cuestión
se puede identificar por interacción específica del alelo con la
zona de unión al objetivo en la cola del cebador. Más aún, la
secuencia o zona de interés puede ser una combinación de la zona
objetivo y de la secuencia de unión a la plantilla en el cebador a
condición de que la hibridación de la zona de unión al objetivo en
la cola del cebador dependa de la formación de un producto de
ampliación del cebador.
Además de los diagnósticos basados en genes de la
enfermedad hereditaria humana, la invención será útil para la
detección de amplicones de otras fuentes. Una utilización
particular es en la detección de agentes infecciosos (bacterias,
virus, etc.), tal como VIH, en el que la combinación del cebado
específico del alelo y la discriminación alélica a través de la
zona de unión al objetivo ofrece oportunidades para controlar la
aparición de variantes particulares de VIH en una población de
virus en un paciente. Otros agentes infecciosos para los que serían
útiles los datos cuantitativos (medidos por PCR en tiempo real)
incluyen la hepatitis C, virus y otros.
En otras aplicaciones microbiológicas médicas es
importante ser capaz de detectar y cuantificar determinadas
especies de microorganismos. La utilización de cebadores
Escorpiones fluorescentes facilita esto en gran medida.
La presencia de bacterias en alimentos u otros
productos puede también controlarse útilmente utilizando la PCR en
tiempo real con procedimientos de fluorescencia de Escorpiones. La
especificidad de la detección de la sonda se puede modificar para
permitir o excluir la detección de los objetivos relacionados.
Una ventaja particular es que los nuevos
cebadores de la invención no necesitan ser utilizados a la
concentración del cebador al 100%, esto es como decir que el método
de detección actúa bien incluso cuando se utiliza solamente una
pequeña proporción de cebador nuevo a convencional. En tanto que no
se desee estar ligado a consideraciones teóricas se piensa que como
poco un pequeño porcentaje, es decir se utiliza hasta el 10%, hasta
el 20%, como por ejemplo hasta el 30%, hasta el 40% o hasta el 50% ó
60% del nuevo cebador. Como alternativa se utiliza por lo menos el
50%, 60%, 70%, 80%, 90% ó 100% del nuevo cebador.
El/los cebador(es) se puede(n)
añadir en cualquier etapa adecuada en una reacción de
amplificación, por ejemplo en el ciclo de amplificación final, todo
lo que se necesita es una o más reacciones de ampliación del
cebador. Para los sistemas de detección homogéneos es preferible
añadir el/los cebador(es) al principio de cualquier
procedimiento de amplificación.
La cola del cebador se puede configurar de
numerosas formas diferentes, el único requisito es que la zona de
unión al objetivo en la cola esté disponible después de la
ampliación del cebador para hibridarse con la secuencia
complementaria (si está presente) en el producto de ampliación del
cebador. En su forma más sencilla la cola del cebador se enrolla al
azar, si se utilizan medios de detección fluorescentes el cebador se
autoextingue antes de la hibridación de la zona de unión al
objetivo.
El cebador puede incluir una o más zonas de
hibridación interna que ayudan a estabilizar el sistema de
señalización en una posición dada, es decir, en una configuración
determinada. Dicha(s) zona(s) se sitúa(n)
adecuadamente en la cola del cebador y puede ser una de cada 2 o
más pares de bases. Las configuraciones adoptadas están limitadas
solamente por consideraciones prácticas y pueden incluir la
utilización de una o más estructuras seleccionadas de entre
horquillas, brazos, codos, troncos, burbujas y bucles. Una vez se
han elaborado las estructuras adecuadas, éstas se pueden utilizar
como características generales en los cebadores de cola de la
invención.
La zona de unión al objetivo puede presentar
cualquier número adecuado de bases adicionales en su extremo 5'.
Todas o algunas de estas bases adicionales pueden formar parte de
alguna(s) zona(s) de hibridación interna.
En un aspecto adicional de la invención el
cebador puede comprender una zona de captura. Ésta puede estar
situada en cualquier posición adecuada, preferentemente en la cola
del cebador. La zona de captura puede ser una estructura contigua o
ramificada (véase Figura 8c). La zona de captura se hibrida con la
secuencia complementaria sobre una fase sólida, por ejemplo.
Se puede utilizar cualquier polimerasa adecuada
dependiente de la plantilla, ésta es preferentemente una enzima
termoestable de polimerasa tal como taq, más preferentemente taq
Gold.
Igualmente se pueden utilizar cualquiera de los
trifosfatos de nucleósido adecuados para emparejamiento con bases
convencionales. Si se necesitan éstos se pueden modificar por
fluorescencia. Como éstos pueden afectar las cantidades de
polimerización, para mejores resultados se modifica hasta sólo
aproximadamente 1 de cada 20 dNTP utilizados.
Se dan detalles adicionales de polimerasas
adecuadas, trifosfatos de nucleósido, otros reactivos de PCR,
diseño de cebadores, instrumentos y consumibles en "PCR" C.R.
Newton y A. Graham (The Introduction to Biotechniques series,
segunda edición 1997, ISBN 1 85996011 1, Bios Scientific Publishers
Limited, Oxford). Se puede hallar orientación adicional en
"Laboratory protocols for mutation detection" editado por Ulf
Landegren, publicado por Oxford University Press, Oxford, 1996,
ISBN 0 19 857795 8.
La invención se ilustra además por la siguiente
descripción específica no limitativa, en la que los cebadores de
cola de la invención se denominan cebadores Escorpiones.
El diseño de cebadores Escorpiones puede
seguir orientaciones bien conocidas para amplímeros de PCR; el
extremo 3' de los cebadores Escorpiones y/o la zona de unión
al objetivo se pueden tomar, por ejemplo, directamente de una PCR
existente o de pruebas del ARMS.
Las zonas de unión al objetivo típicamente son
aproximadamente 17 bases (ADN) aunque (dependiendo de la
temperatura a la que se tomen las mediciones) se pueden utilizar
zonas de unión al objetivo más cortas (tan pequeñas como de 6 a 10
bases). En este contexto está previsto que los ácidos nucleicos no
naturales tales como PNA o
2'-O-alquil-ARN
(particularmente 2'-O-metil ARN)
serán útiles, ya que poseen T_{m} mayores cuando se unen a sus
objetivos. La separación en una cadena de ADN entre la zona de unión
al amplicón y su secuencia complementaria en el amplicón puede ser
tan pequeña como 30 bases (que está directamente contigua a la zona
del cebador) o puede ser tan grande como aproximadamente 200 a 300
bases. Es de esperar que la eficacia de la interacción molecular
disminuya a medida que aumenta esta distancia.
Cuando se utilizan zonas del tronco, pueden
oscilar desde 2 bases (especialmente útiles para
2'-O-metil ARN o APN) hasta
aproximadamente 6, 8, 10 más bases. El equilibrio entre la longitud
del tronco y la longitud de unión al amplicón es importante: el
complejo sonda-objetivo debería tener una \DeltaG
(energía libre) más acusada (más negativa) que el tronco de doble
cadena a la temperatura de la prueba.
Cualquier grupo bloqueante de la polimerización
tal como los descritos en la patente
EP-B1-0 416817 (Zeneca Limited) es
adecuado. Sin embargo, se prefiere que se incorpore fácilmente por
la química de oligonucleótidos en fase sólida y debería también
formar un sustrato para la ampliación posterior en la misma química.
Ejemplos adecuados incluyen fosforamiditas de hexetilenglicol (HEG)
y de tetraetilenglicol (TEG).
El intervalo de pruebas que se puede realizar
utilizando los cebadores Escorpiones es extenso. La
detección puede efectuarse, por ejemplo, después de la amplificación
por PCR y a temperatura ambiente, ya que los casos de hibridación
unimolecular suceden rápidamente y son estables durante periodos
prolongados (por lo menos toda la noche). Además, las señales
positivas de fluorescencia son tan altas y los fondos tan bajos, que
la fluorescencia se puede observar a simple vista con iluminación
apropiada y a temperatura ambiente. Estas son ventajas
significativas.
Cuando se emplea la discriminación alélica como
punto final, esto puede requerir la utilización del control de
temperatura para desestabilizar selectivamente el objetivo
incompatible.
Los cebadores Escorpiones de la presente
invención se adecuan particularmente a las pruebas en tiempo real
ya que la generación de la señal es rápida y requiere únicamente
una interacción unimolecular. Además, los fondos son bajos y las
señales son altas, permitiendo mucha flexibilidad en el diseño de
la prueba. El control continuo de la fluorescencia mediante la PCR
es posible con el equipo informático apropiado.
Los cebadores Escorpiones presentan
también sustanciales beneficios para las técnicas in situ
tales como la PCR in situ (ISPCR) y la síntesis cebada in
situ (PRINS). Únicamente producen señales los casos de cebado
que generan el producto deseado y esto proporciona sustanciales
beneficios sobre otras técnicas para detectar productos en una
célula.
Generalmente es deseable incluir los cebadores
Escorpiones al comienzo de la reacción y medir la
fluorescencia en el tubo cerrado (homogéneo) bien continuamente o
después de la PCR. Como alternativa, los cebadores
Escorpiones se pueden añadir en una etapa posterior a la
amplificación; el único requisito es que los cebadores
Escorpiones deben experimentar una sola ronda de ampliación y
producir la doble cadena unimolecular cola/objetivo.
Utilizando sistemas de señalización apropiados
(por ejemplo fluoróforos diferentes) es posible combinar la salida
de varios cebadores Escorpiones (de doble cadena) en una
única reacción. El número de cebadores que se pueden utilizar está
limitado únicamente por consideraciones experimentales.
Se exponen a continuación las siguientes formas
de realización no limitativas:
Véase la Figura 1. La extinción se consigue por
el plegamiento aleatorio de la cola acercando el par
fluoróforo/extintor (F/Q) al azar (Figura 2). Para maximizar esta
extinción, aunque no es esencial, se prefiere tener el fluoróforo en
medio de la molécula con el extintor en el extremo 5'. La señal
"conectado" es por la misma pérdida de extinción producida por
hibridación de la sonda (Figura 3). En esta forma de realización, no
es crítica que F y Q estén en extremos opuestos de la sonda, y
puede ser beneficioso colocarlos muy próximos en la zona de la
sonda. Es importante, sin embargo, no para interrumpir la función de
unión al objetivo de la cola introducir elementos voluminosos, sin
bases apareadas, aunque tanto el fluoróforo como el extintor se
podrían introducir en los monómeros de uracilo, sustituyendo las
timidinas en la sonda. Se cree que esta forma de realización puede
actuar mejor que un detector de amplicón.
En esta forma de realización, está además
simplificado el diseño del cebador Escorpiones, no habiendo
ningún extintor implicado. En su lugar, la cola lleva un colorante
intercalador que es capaz de incorporarse entre las bases de una
molécula de ácido nucleico de doble cadena, en el momento en que se
vuelve muy fluorescente. De este modo, se consigue el intercalado
específico de la secuencia (Figura 4a, b). En contraste con el
método "sin tronco" discrito en la forma de realización
anterior, el fluoróforo intercalador está mejor situado en el
terminal 5' de la molécula Escorpiones o como parte interna
del bucle. El plegamiento interno dentro del cebador se minimiza al
máximo para asegurar la ausencia del ADN de doble cadena que se
puede intercalar a continuación, conduciendo a un ruido de fondo
elevado. Si el colorante se coloca en la parte del bucle de la
molécula, puede ser posible tener una estructura en horquilla (que
aumentaría la especificidad por el alelo de la hibridación). El
colorante utilizado no es preferentemente un fluoróforo normal sino
más bien un intercalador con baja fluorescencia en ausencia del
objetivo de doble cadena y un aumento alto cuando se intercala. Los
fluoróforos adecuados incluyen los colorantes de cianina
desarrollados por Molecular Probes, bromuro de etidio, acridina y
otros. Los colorantes pueden necesitar ser modificados para
asegurar su fácil unión al cebador Escorpiones o la
incorporación mediante la química de la fosforamidita (fase
sólida).
En esta modificación del sistema básico, los
colorantes implicados forman un par de transferencia de energía.
Uno de los colorantes se sitúa próximo al extremo 3' de la zona de
unión al objetivo, mientras que el otro se coloca próximo al
terminal 3' de la zona de unión al amplicón (véase Figura 5a, b).
La sonda se debe hibridar muy cerca del cebador uniendo de este
modo el par de FRET y produciendo un aumento de la señal de
fluorescencia.
Un fluoróforo se une a la cola del cebador
Escorpiones (véase la Figura 6 (a), (b) y (c)). El
plegamiento aleatorio del cebador Escorpiones alrededor del
fluoróforo proporciona suficiente extinción del fluoróforo. Se cree
que puede ser debido principalmente al nucleótido, ácido guanílico.
Para maximizar la extinción es preferible, pero no esencial, tener
el fluoróforo en o alrededor de la mitad del cebador, con ADN
adicional suficiente para extinguirlo eficazmente. La eficacia de
la extinción depende de la secuencia del ADN circundante. La unión
de la zona de unión al objetivo de la cola a la zona objetivo altera
suficientemente la conformación del ADN para eliminar esta
extinción. Se prefiere esta forma de realización como detector del
amplicón.
El fluoróforo y el extintor se pueden introducir
en dos moléculas independientes pero complementarias (Figura 7a).
El fluoróforo y el extintor pueden estar en ambos extremos de la
sonda o en cadenas complementarias, con tal que la hibridación de
las dos cadenas lleve el par fluoróforo/extintor muy próximo.
Después de una ronda de desnaturalización, hibridación y
ampliación, el fluoróforo permanece extinguido a medida que el
grupo bimolecular se reconstruye (Figura 7b). La cadena libre, sin
Escorpión está en exceso para asegurar que tiene lugar esta
interacción bimolecular y por esta razón se prefiere que esta
molécula lleve el extintor, para minimizar los fondos. Sin embargo,
después de otra ronda de desnaturalización e hibridación, las
formas con cadena de autosonda (Figura 7c) y el extintor libre
(oligo) sones incapaces de competir con este caso cinética o
termodinámicamente, conduciendo de este modo a un aumento de la
fluorescencia.
Si se necesita una de las moléculas puede
comprender una estructura secundaria tal como una estructura en
horquilla con el fin de permitir la unión de, por ejemplo, más
especies de extintor para la extinción más eficaz de un fluoróforo
en la otra molécula.
Además de las formas de realización expuestas
anteriormente, los amplicones pueden ser específicamente capturados
y probados utilizando la misma cola no amplificable (véase las
Figuras 8a y 8b). En una forma de realización específica adicional
la captura y las secuencias de cola están provistas de
características no contiguas, es decir, junto con la zona de unión
a la plantilla forman una estructura ramificada del cebador (véase
la Figura 8c). Después de la amplificación se puede capturar el
amplicón en una superficie sólida, mientras la generación de
señales permanece específica al amplicón. Como alternativa las
secuencias de captura y el sistema de señalización pueden estar en
los extremos opuestos de los amplicones. De esta forma, se pueden
utilizar los "chips" genéricos con las mismas secuencias de
captura para analizar muchos objetivos diferentes; las zonas de
captura permanecen inalteradas mientras que el amplificador y los
elementos de la sonda varían.
En esta forma de realización la cola del cebador
comprende troncos autocomplementarios (también ADN, ARN,
2'-O-metil ARN, APN y otras
variantes) que flanquean la zona de unión al amplicón y que llevan
un par fluoróforo/extintor, de modo que la formación en horquilla
por los dos troncos une el par F/Q dando lugar a que la
fluorescencia esté prácticamente extinguida ("apagada"). El
fluoróforo y el extintor se pueden colocar en ambos brazos,
dependiendo de la preferencia o de la simplicidad de la síntesis;
es preferible tener el extintor en el brazo 3' (es decir adyacente
al bloqueador en medio de la molécula).
A altas temperaturas, se rompe la doble cadena
del tronco y no se extingue el fluoróforo (es decir
"encendido" - Figura 9a); a temperaturas más bajas, sin
embargo, las formas de doble cadena del tronco y la fluorescencia
están prácticamente apagadas (Figura 9b).
Después de una desnaturalización, hibridación y
ampliación iniciales, el amplicón Escorpiones comprende una
zona complementaria de la zona del bucle en su extremo 5' (Figura
10a). En una segunda ronda de desnaturalización (Figura 10b) y de
hibridación, la cola se hibrida con la zona recién sintetizada con
gran eficacia (interacción unimolecular) y la fluorescencia
permanece sin extinguir (Figura 10c). Los cebadores inextinguidos,
sin embargo, continuarán para formar su confirmación extinguida.
Mientras tanto, el cebador "inverso" se habrá hibridado con la
misma cadena y la síntesis continúa. Se cree que la Taq polimerasa
desplaza la cola (al menos parcialmente) y el resto se deshace
fácilmente ya que las sondas son cortas. En esta etapa, la Taq
polimerasa completa la síntesis de esta cadena hasta que encuentra
el bloqueador de la amplificación. Debido a que las señales son
acusadas y que la función de cebado es idéntica a la variante sin
Escorpiones, no todo el cebador necesita estar en forma de
Escorpiones. De hecho, se han obtenido señales acusadas
cuando el 10% o menos del cebador estaba en forma de
Escorpiones. Esto permite reacciones más económicas y
también permite el equilibrio de las intensidades de las señales en
las que se utilicen dos fluoróforos diferentes.
Los cebadores Escorpiones de la invención
se pueden utilizar en lugar de los cebadores de amplificación
convencionales, como por ejemplo los cebadores para PCR y no es de
esperar que interfieran con su función de amplificación. En una
prueba del ARMS en dos troncos (normal y mutante) el cebador
Escorpiones puede ser adecuadamente el cebador común (Figura 11a),
con la producción de la señal dependiente de la amplificación de
ARMS.
Sin embargo, es igualmente viable colocar la
entidad de señalización en los cebadores del ARMS. Cada cebador del
ARMS puede estar marcado con diferentes fluorocromos (F1, F2),
permitiendo de este modo que el genotipado en un solo tubo (STG), se
realice en ambas reacciones en el mismo tubo y los amplicones se
distingan por su "color" característico (Figura 11b).
Como alternativa, la entidad de señalización
puede llevar la especificidad alélica (véase el Ejemplo 2): los
cebadores son cebadores (no ARMS) estándar y dos diferentes
secuencias de sonda para compatibilizar las dos variantes alelas se
introducen en dos variantes de uno de los cebadores (Figura 12a,
b). Se ha observado que las sondas que pueden formar horquillas en
ausencia del objetivo son mejores discriminadoras de bases únicas
incompatibles que las versiones sin cola de las mismas sondas. En
otra manifestación, se pueden introducir sondas para cada variante,
una cada dos amplímeros (Figura 12c, d) sondando de este modo
diferentes cadenas de la reacción. Por último, son posibles
combinaciones de estas ideas: un subconjunto de cebadores
Escorpiones se puede utilizar para discriminación de alelos,
mientras que otros cebadores en la misma mezcla pueden actuar como
sondas de referencia para detectar al propio amplicón (Figura 12e).
La discriminación entre estos casos se consigue bien mediante la
longitud de onda de fluorescencia o como alternativa mediante la
utilización de elementos de sonda con el mismo fluoróforo pero
diferentes T_{m} que pueden ser discernidos a continuación
midiendo la fluorescencia en un intervalo de temperaturas.
La invención se ilustra a continuación pero no
está limitada por las siguientes Figuras y Ejemplos, en los
que:
La Figura 1 presenta las propiedades básicas de
un diseño de cebador apropiado, la zona de unión a la plantilla
está indicada por la flecha sombreada, la zona de cola comprende un
grupo de bloqueo indicado por H, también se presentan un extintor y
un fluoróforo, la zona de unión al objetivo está en la zona
indicada por la línea llena entre el extintor y el fluoróforo.
La Figura 2 presenta la extinción conseguida por
el enrollamiento aleatorio de la cola que lleva el par fluoróforo y
extintor en estrecha proximidad.
La Figura 3 presenta la hibridación de la zona de
unión al objetivo con una secuencia complementaria en el producto
de ampliación del cebador correspondiente a la zona objetivo.
La Figura 4(a) presenta la inclusión de un
fluoróforo intercalador (IF) en la cola del cebador y la ampliación
del cebador en una plantilla de muestra, (b) presenta el
intercalado después de la hibridación de la zona de unión al
objetivo en una secuencia complementaria en el producto de
ampliación del cebador correspondiente a la zona objetivo.
La Figura 5(a) presenta la utilización de
colorantes (R y F) incorporados en el cebador y que forman un par
de transferencia de energía, (b) presenta su posición relativa en
la hibridación.
La Figura 6(a) presenta la utilización del
cebador con un solo fluoróforo (F) unido al terminal 5', se
presenta un grupo de bloqueo (H), la zona de unión al objetivo está
indicada por la flecha de la derecha, (b) presenta el enrollamiento
aleatorio y la extinción del fluoróforo en solución y (c) presenta
la hibridación de la zona de unión al objetivo después de la
ampliación del cebador.
La Figura 7(a) presenta la forma de
realización bimolecular de la invención, el fluoróforo y el
extintor están provistos de especies independientes, en (b) el
cebador se prolonga en una plantilla de la muestra, y en (c) se
presenta la separación del fluoróforo y el extintor en la
hibridación de la zona de unión al objetivo.
La Figura 8(a) presenta la forma de
realización de la sonda de captura de la invención, en (b) los
amplicones están capturados en una fase sólida y sondados utilizando
la misma cola no amplificable, en (c) el cebador comprende una
estructura ramificada de la cola y secuencias de captura.
La Figura 9 presenta la forma de realización
troncal de la invención, (a) a alta temperatura, la doble cadena
del tronco se rompe y el fluoróforo deja de estar extinguido, es
decir "encendido"; (b) a bajas temperaturas, sin embargo, las
formas de doble cadena del tronco y la fluorescencia están
prácticamente apagadas.
La Figura 10 presenta el cebador utilizado en el
ciclo de amplificación. (a) después de la desnaturalización,
hibridación y ampliación iniciales, el amplicón Escorpiones
comprende una zona complementaria de la zona del bucle en su extremo
5'; (b) en una segunda ronda de desnaturalización y de hibridación,
la cola se hibrida (c) con la zona recién sintetizada con gran
eficacia (interacción unimolecular) y la fluorescencia permanece
inextinguida (Figura 10c). Los cebadores inextinguidos, sin embargo,
continuarán para formar su confirmación extinguida.
La Figura 11 presenta la utilización del cebador
como (a) un cebador común en una prueba del ARMS en dos tubos y (b)
como cebadores específicos del alelo "a" y "b" en una
prueba del ARMS en un solo tubo.
La Figura 12 presenta la utilización del cebador
en la que la hibridación de la zona de unión al objetivo tiene
lugar de una manera específica del alelo, en (a) la ampliación del
cebador proporciona un producto correspondiente al alelo "a" o
"b", en (b) la hibridación es específica del alelo o
incompatible en (c) y (d) se proporcionan sondas para cada variante
en cada uno de los dos amplímeros, proporcionando de este modo
diferentes cadenas de la reacción, y en (e) se pueden utilizar
diferentes cebadores en la misma mezcla para la discriminación del
alelo y como cebadores de referencia para la detección del
amplicón.
La Figura 13 presenta la detección de la
amplificación en tiempo real, la señal fluorescente se genera en el
momento de la hibridación de una zona de unión al objetivo
compatible a diferencia de un objetivo incompatible.
La Figura 14 presenta la discriminación del
alelo, la señal fluorescente se genera en el momento de la
hibridación de una zona de unión al objetivo compatible a
diferencia de una referencia sin plantilla y de un objetivo
incompatible.
La Figura 15 presenta la valoración del cebador,
la señal fluorescente se genera en el momento de la hibridación de
una zona de unión al objetivo compatible a diferencia de un
objetivo compatible. Se utilizaron las siguientes proporciones de
cebador Escorpión: (a) 100%, (b) 80%, (c) 50%, (d) 20% y (e)
10%.
La Figura 16 presenta el análisis de la
heteroplasmia, se utilizaron mezclas variables de homozigoto C y
homocigoto A como se muestra y lecturas tomadas después de 40
ciclos de PCR.
La Figura 17 presenta una comparación entre la
presente invención y un equivalente bimolecular. En (a) objetivos
incompatibles no presentan amplificación apreciable, en (b) y (c)
solamente los cebadores Escorpiones compatibles producen una
señal importante específica del alelo. En la Figura 17 se presentan
como triángulos y cruces los resultados obtenidos utilizando
cebadores Escorpiones.
La Figura 18 presenta la utilización de la forma
de realización sin extintor, la señal fluorescente se genera en el
momento de la hibridación de una zona de unión al objetivo
compatible a diferencia de una referencia sin plantilla.
La Figura 19 demuestra que el enrollamiento
aleatorio de un cebador de la invención es suficiente para unir al
fluoróforo y al extintor.
La Figura 20 presenta la forma de realización
bimolecular de la invención, se añadieron diferentes cantidades de
oligonucleótido del extintor, (a) ninguna, (b) 0,5 \muM, (c) 2
\muM y (d) 20 \muM.
La Figura 21 presenta (a) la proporción de
extintor flotante libre en el cebador Escorpiones, es decir,
40X, 4X, 1X y 0X respectivamente y (b) el efecto sin extintor.
B2098-Escorpiones BRCA:
FAM-CGCACGATGTAGCACATCAGAAGCGTGCG-MR-HEG-TTGGAGATTTT
GTCACTTCCACTCTCAAA
GTCACTTCCACTCTCAAA
Las zonas subrayadas son las partes que forman
horquilla, FAM es el colorante fluoresceína, MR es un fluoróforo no
fluorógeno unido a un uracilo, HEG es el monómero de
hexaetilenglicol que bloquea la duplicación. La sonda es compatible
con la "variante C" del polimorfismo BRCA2 y es compatible con
la "variante A".
R186-98: equivalente sin cola de
B2098: TTGGAGATTTTGTCACTTCCACTCTCAAA
R187-98: cebador opuesto al
R186-98 y al Escorpiones equivalente.
Z3702: segmento de la sonda de los Escorpiones
B2098:
FAM-CGCACGATGTAGCACATCAGAAGCGTGCG-MR
ADN matriz: se utilizó ADN genotipado
previamente preparado por extracción con proteinasa K y
fenol/cloroformo a 50 ng por 50 \mul de reacción. Los genotipos
fueron típicamente un homozigótico A/A, un homozigótico C/C y un
heterozigoto (A/C).
Tampón (1x): Tris-HCl 10
mM (pH 8,3), MgCl_{2} 1,2 mM o 3,5 mM, KCl 50 mM, dNTP (cada uno
a 100 \muM) y gelatina al 0,01% (p/v).
Enzima: Se incluyó AmpliTaq Gold
(Perkin-Elmer/ABI) en la mezcla de reacción a 2
unidades/50 \mul de reacción.
Para controlar el funcionamiento de un cebador
Escorpiones en una reacción de amplificación homogénea, se
realizó una PCR utilizando cebadores que flanquean un polimorfismo
en el gen BRCA2. La secuencia del objetivo seleccionada había sido
seleccionada anteriormente para la discriminación alélica de las dos
variantes, pero fue demasiado corta para la detección en tiempo
real (la sonda no pudo hibridarse a 60ºC, la temperatura más baja
en la prueba de termociclación). Se sintetizó la entidad de la
sonda (cadena superior) como parte de un cebador de la cadena
inferior con un HEG de bloqueo entre los dos grupos funcionales. El
ADN objetivo se podría seleccionar para producir el amplicón que
sería compatible o incompatible con la sonda.
Condiciones de la reacción: después de la adición
del ADN matriz, se sellaron los tubos y se ciclaron las reacciones
en las condiciones siguientes: 20 min a 94ºC para activar el
Amplitaq Gold; y 40 ciclos de {94ºC durante 45 s, 60ºC durante 45
s}. Se realizaron las reacciones en una máquina para PCR de
fluorescencia ABI PRISM 7700.
Resultados: Véase la Figura 13. Es muy evidente
que a medida que se acumula el aplicón, se genera una señal
fluorescente. Existen varias lecturas de fluorescencia para cada
punto de tiempo y la naturaleza definida, escalonada, del aumento de
la señal refleja la rápida producción del par
sonda-objetivo en la parte inicial del dominio del
termociclo. Esto es debido al modo unimolecular de acción de un
cebador Escorpión, que permite el reconocimiento instantáneo de un
amplicón apropiado.
Materiales y procedimientos como
anteriormente.
Resultados: Véase la Figura 14. En este
experimento, la sonda es compatible o incompatible con los
amplicones en la base polimórfica. Ambas amplificaciones fueron
igualmente eficaces (según se observó mediante geles de agarosa
[resultados no mostrados]), pero el producto compatible se detectó
mucho más fácilmente que el incompatible. Esto ilustra la fuerte
especificidad del sistema aún bajo un cambio de una sola base en el
amplicón.
Materiales y procedimientos, véase anteriormente.
La valoración del cebador B2098 con su equivalente sin cola
(R186-98) fue de Escorpiones al 100% a
Escorpiones al 10%; el cebador total fue constante a 500
nM.
Resultados: Véase la Figura 15. En todas las
proporciones de Escorpiones: cebador sin cola, las reacciones
fueron claramente detectables en el ABI7700. De hecho, el Ct (punto
en el que la señal atraviesa un umbral anterior "fondo") fue
idéntico con respecto a la proporción de Escorpiones a
cebador sin cola, indicando los mismos niveles de eficacia del
cebado en toda la serie. La única variable fue la señal de
fluorescencia absoluta (como sería de esperar). La eficacia de este
sistema está en marcado contraste con los procedimientos
disponibles en los que se necesitan concentraciones más altas de
sonda para conducir cinéticamente el caso de sondeo
bimolecular.
Materiales y procedimientos: Se realizaron las
reacciones como anteriormente pero se llevaron a cabo a dos
diferentes concentraciones de magnesio (1,2 y 3,5 mM). Se
utilizaron los ADN de los tres genotipos y una referencia sin
plantilla (NTC) y se midió la fluorescencia antes y después de la
amplificación. Los números de fluorescencia son las medias de por
lo menos 6 lecturas independientes de las muestras duplicadas.
| Muestra | CC | AC | AA | NTC | ||||
| Mg | 1,2 | 3,5 | 1,2 | 3,5 | 1,2 | 3,5 | 1,2 | 3,5 |
| Antes | 6396 | 3706 | 5700 | 2958 | 6157 | 3299 | 6257 | 3685 |
| Después | 12144 | 10316 | 8614 | 6140 | 6818 | 4641 | 6616 | 4453 |
| Cambio | 5748 | 6610 | 2914 | 3182 | 661 | 1342 | 359 | 768 |
Las lecturas de fluorescencia aumentaron mediante
la PCR de una manera dependiente del objetivo. De hecho las señales
generadas para heterozigotos son aproximadamente la mitad de los
homozigotos CC y esto puede ser útil para el genotipado de una
forma sencilla o para el análisis de heteroplasmia en el que las
proporciones de alelo pueden variar en mayor medida de 100:0, 50:50
ó 0:100. Además, las señales generadas para objetivos incompatibles
fueron similares a los niveles de fondo demostrando que aunque la
amplificación haya tenido lugar, la sonda no se hibrida eficazmente
a no ser que exista una correspondencia perfecta. Al aumentar la
concentración de magnesio disminuyó esta discriminación pero
también se aseguró que los fondos fueran más bajos, supuestamente
al activar la hibridación en general.
Además al observar estos cambios de señal por el
fluorímetro, el aumento de fluorescencia podría ser detectado
mediante inspección visual del destello de los tubos por el
transiluminador de UV. Esta es una observación destacable ya que el
colorante FAM presenta una excitación óptima a \sim 490 nm de
modo que la caja UV se ilumina a \sim 330-360 nm.
Esto significa que el rendimiento fluorescente estaba lejos del
óptimo y se puede mejorar sustancialmente mediante la utilización
de longitudes de onda más apropiadas.
Las reacciones se realizaron como en el Ejemplo
4, pero el ADN matriz fue en cantidad normal con mezclas variables
de homozigoto C a homozigoto A: 100%:0%, 90:10, 50:50, 10:90, 0:100
y NTC. Después de 40 ciclos de PCR, se tomaron lecturas de
fluorescencia de FAM y se sustrajo NTC de cada una. Los datos de
muestran en la Figura 16.
Para examinar el rendimiento relativo de
Escorpiones frente a un equivalente bimolecular, se utilizaron el
mismo amplicón y las secuencias de sonda en cada formato. El
formato bimolecular estaba constituido por 500 nM de cada uno de los
cebadores R186-98 y R187-98, más la
señalización moleculares Z3702 500 nM, mientras que la versión
unimolecular contenía B2098 y R187-98 cada una a 500
nM. Otros constituyentes de la reacción fueron idénticos a los
experimentos anteriores (con Mg 1,2 mM) y la ciclación fue durante
40 ciclos como anteriormente. Los resultados de estas
amplificaciones en tiempo real con objetivos que son homozigóticos
C, homozigóticos A o heterozigóticos A/C se muestran en la Figura
17. Evidentemente, no hubo ninguna amplificación importante por
encima del fondo para las reacciones con un modo de acción con
sondeo bimolecular, mientras que se produjeron señales específicas
sustanciales en el alelo en las reacciones con Escorpiones. Merece
la pena destacar que el nivel final de la señal para el heterozigoto
fue la mitad que el generado por la amplificación del homozigoto C.
Este experimento ilustra las ventajas cinéticas sustanciales del
planteamiento de la hibridación unimolecular de la presente
invención.
Ejemplos 7 y
8
Escorpión B2731:
fam-AGGTAGTGCAGAGAGTG-mr-h-GAGCCTCAACATCCTGCTCCCCTCCTACTAC
Escorpión B4249 (sin extintor en la misma
molécula)
fam-AGGTAGTGCAGAGAGTG-h-GAGCCTCAACATCCTGCTCCCCTCCTACTAC
Oligonucleótido del extintor (complemento de la
cola de B4249):
CACTCTCTGCACTACCT-mr
Cebador R284-97 del ARMS:
TTCGGGGCTCCACACGGCGACTCTCAAC
Cebador R283-97 del ARMS:
TTCGGGGCTCCACACGGCGACTCTCAAG
El objetivo es el polimorfismo H63D del gen de la
hemocromatosis hereditaria humana (HH), B2731 y B4249 son cebadores
"comunes" que se oponen a los cebadores
R283-97 y R283-97 del ARMS. Las
condiciones de ciclación y la composición de la reacción son como
anteriormente. Se utilizaron cebadores (incluyendo cebadores
Escorpión) a una concentración de 500 nM.
Para el ejemplo de dos moléculas, se incorporó el
oligonucleótido del extintor a 0, 0,5, 2 y 20 mM, esto es: 0, 1, 4,
40 veces en comparación con el cebador Escorpión. La forma de
realización de enrollamiento aleatorio (Figura 19) confirma que el
enrollamiento aleatorio solo puede ser suficiente para unir la
sonda y el extintor y que un aumento de la señal se obtiene
fácilmente en el control continuo de PCR. (Además, debe indicarse
que este amplicón particular había demostrado previamente ser
resistente al sondeo en una prueba con TaqMan o señalizaciones
moleculares).
La forma de realización bimolecular también dio
buenos resultados (véase las Figuras 20 y 21). Cuanto, más extintor
se añadió, más bajos fueron los fondos en ausencia de amplicón. El
rendimiento general óptimo (teniendo en cuenta la intensidad de la
señal absoluta y la señal/ruido) fue con el extintor equimolar y en
exceso 4x.
Escorpión B4249 (sin extintor)
fam-AGGTAGTGCAGAGAGTG-h
GAGCCTCAACATCCTGCTCCCCTCCTACTAC
Cebador R284-97 del ARMS:
TTCGGGGCTCCACACGGCGACTCTCAAC
Las reacciones se realizaron tal como se
describió en los ejemplos anteriores. Se incluyeron cebadores a 500
nM. El objetivo fue la mutación H63D del gen de la hemocromatosis
hereditaria humana (HH). Se añadió 25 ng de ADN por reacción. B4249
fue el cebador común en combinación con el cebador
R284-97 del mutante ARMS. La ciclación fue tal como
se describió en los ejemplos anteriores. Los resultados se
presentan en la Figura 18.
En este ejemplo, se generó la señal específica de
la mutación en ausencia de un extintor. El plegamiento aleatorio
del cebador Escorpión alrededor del fluoróforo proporciona
suficiente extinción del fluoróforo. Se obtiene fácilmente un
aumento de la señal durante el control continuo de PCR.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Zeneca Ltd
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 15 Stanhope Gate
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Londres
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Greater London
\vskip0.333000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Inglaterra
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: (ZIP): W1Y 6LN
\vskip0.333000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: 0171 304 5000
\vskip0.333000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: 0171 304 5151
\vskip0.333000\baselineskip
- (I)
- TÉLEX: 0171 934 2042
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PROCEDIMIENTOS
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 7
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA INFORMÁTICO: PatentIn Release nº 1.0. Versión nº 1.30 (EPO)
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: GB 9812768.1
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 13-JUN-1998
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 1:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 1:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCGCACGATGT AGCACATCAG AAGCGTGCG
\hfill29
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 2:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 2:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipTTGGAGATTT TGTCACTTCC ACTCTCAAA
\hfill29
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 3:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 3:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipAGGTAGTGCA GAGAGTG
\hfill17
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 4:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 4:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGAGCCTCAAC ATCCTGCTCC CCTCCTACTA C
\hfill31
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 5:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 5:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCACTCTCTGC ACTACCT
\hfill17
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 6:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 6:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipTTCGGGGCTC CACACGGCGA CTCTCAAC
\hfill28
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 7:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 28 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: una
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 7:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipTTCGGGGCTC CACACGGCGA CTCTCAAG
\hfill28
Claims (22)
1. Procedimiento para la detección de un ácido
nucleico objetivo, comprendiendo dicho procedimiento poner en
contacto el ácido nucleico matriz de una muestra con (i) un sistema
de señalización (ii) un cebador con ácido nucleico de cola que tiene
una zona de unión a la plantilla y la cola que comprende un
segmento de unión y una zona de unión al objetivo, en presencia de
trifosfatos de nucleósido apropiados y un agente para su
polimerización, en condiciones tales que la zona de unión a la
plantilla del cebador se hibridará con una secuencia complementaria
en el ácido nucleico matriz y se ampliará para formar un producto
de ampliación del cebador, separando cualquiera de dichos productos
de la matriz, tras lo cual la zona de unión al objetivo en la cola
del cebador se hibridará con una secuencia en el producto de
ampliación del cebador correspondiente con el ácido nucleico
objetivo y en el que cualquier hibridación específica del objetivo
produce un cambio detectable en el sistema de señalización, de modo
que la presencia o ausencia del ácido nucleico objetivo en la
muestra se detecta con relación a la presencia o ausencia de un
cambio detectable en el sistema de señalización.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que el cebador del ácido nucleico de cola se utiliza como cebador
de amplificación en un sistema de amplificación.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el
que el sistema de amplificación es la reacción en cadena de
polimerasa (PCR).
4. Procedimiento según la reivindicación 2 o la
reivindicación 3, en el que la cola del cebador del ácido nucleico
permanece sin copiar durante la amplificación.
5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el
que el segmento de unión en la cola comprende un grupo de bloqueo
para impedir la copia de la cola.
6. Procedimiento según la reivindicación 4, en el
que la cola del cebador del ácido nucleico comprende una especie no
copiable.
7. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la hibridación del cebador
de cola en el ácido nucleico matriz se realiza con una restricción
de modo que permite la ampliación del cebador en la secuencias de la
plantilla relacionadas.
8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el
que las secuencias de la plantilla relacionadas son secuencias del
antígeno de leucocitos humanos (HLA).
9. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la hibridación de la zona de
unión a la plantilla y/o de la zona de unión al objetivo del
cebador con una secuencia complementaria es específica del
alelo.
10. Cebador de diagnóstico para su utilización en
un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y
que comprende (i) una zona de unión a la plantilla y (ii) una cola
que comprende una zona de unión al objetivo y en el que la zona de
unión al objetivo se hibrida con una secuencia complementaria en un
producto de ampliación del cebador correspondiente al ácido
nucleico objetivo y la secuencia complementaria es inferior a 200
pares de bases de la zona de unión a la plantilla, comprendiendo
además el cebador por lo menos un componente de un sistema de
señalización integrado para indicar la hibridación de la zona de
unión al objetivo con una secuencia complementaria en un producto
del cebador de ampliación del cebador.
11. Cebador de diagnóstico para su utilización en
un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y
que comprende (i) una zona de unión a la plantilla y (ii) una cola
que comprende un segmento de unión y una zona de unión al objetivo y
en el que la zona de unión al objetivo se hibrida con una secuencia
complementaria en un producto de ampliación del cebador
correspondiente al ácido nucleico objetivo, comprendiendo además el
cebador por lo menos un componente de un sistema de señalización
integrado para indicar la hibridación de la zona de unión al
objetivo con una secuencia complementaria en un producto del
cebador de ampliación del cebador.
12. Cebador según la reivindicación 10 o la
reivindicación 11, en el que la zona de unión a la plantilla y la
zona de cola están dispuestas de tal modo que la zona de cola
permanece sin copiar durante la amplificación.
13. Cebador según cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 12, en el que el segmento de unión comprende
un grupo de bloqueo que impide la copia de la cola del cebador
mediada por la polimerasa.
14. Cebador según cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 13, en el que la cola del cebador lleva un
colorante intercalador.
15. Cebador según cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 13, en el que la cola del cebador comprende
un fluoróforo para la detección de la unión al objetivo por
polarización de fluorescencia.
\newpage
16. Cebador para diagnóstico según cualquiera de
las reivindicaciones 10 a 13 y que presenta además una especie
independiente que comprende por lo menos un componente de un
sistema de señalización integrado unido débilmente a la cola del
cebador.
17. Cebador según la reivindicación 16, en el que
el sistema de señalización comprende la transferencia de energía
entre las especies fluoróforo y extintor.
18. Cebador según cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 13, en el que la cola del cebador actúa como
una especie de extintor.
19. Cebador según la reivindicación 13, en el que
la cola del cebador incluye una o más zonas de hibridación interna
para estabilizar uno o más componentes del sistema de señalización
en una posición dada.
20. Cebador según la reivindicación 19, en el
que la cola del cebador comprende un tronco de doble cadena
autocomplementario con un fluoróforo extinguido por una especie de
extintor y en el que el fluoróforo se llega a extinguir cuando se
rompe el tronco de doble cadena.
21. Cebador según cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 20, que comprende además una zona de captura
que se hibrida con la secuencia complementaria en una fase
sólida.
22. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9 y que utiliza más de un cebador de ácido
nucleico para la detección de más de una secuencia de ácido
nucleico objetivo.
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