ES2248998T3 - Utilizacion de las osteoprotegerina para la prevencion y el tratamiento de enfermedades cardiovasculares. - Google Patents

Abstract

Uso de osteoprotegerina (OPG) para preparar un medicamento para tratar o prevenir enfermedad cardiovascular.

Description

Utilización de la osteoprotegerina para la prevención y el tratamiento de enfermedades cardiovasculares.

Composiciones y métodos para la prevención y tratamiento de enfermedades cardiovasculares.

Campo de la invención

La invención se refiere al tratamiento de enfermedades cardiovasculares. Más particularmente, la invención implica el uso de osteoprotegerina (OPG) para tratar y prevenir enfermedades cardiovasculares asociadas a la oclusión y calcificación de vasos sanguíneos, tales como aterosclerosis.

Antecedentes de la invención

El desarrollo y mantenimiento del esqueleto de mamíferos implica la regulación e interacción de sus componentes de tipo celular (Erlebacher et al. Cell 80, 371-380 (1995); Marks, Acta Med Dent Helv 2, 141-157 (1997)). Los contribuyentes principales a la arquitectura esquelética incluyen condrocitos que forman el cartílago, osteoblastos que sintetizan y depositan matriz ósea, y osteoclastos que resorben el hueso. Los condrocitos derivan de células mesenquimales y funcionan para generar un molde de cartílago inicial necesario para la formación de hueso endocondral. Los osteoblastos, derivados de células osteoprogenitoras mesenquimales, se localizan en la superficie del hueso donde sintetizan, transportan y ordenan las proteínas de matriz. Los osteoclastos derivan de precursores de granulocitos-monocitos presentes en la médula hematopoyética (Roodman, Endocrine Rev. 17, 308-332 (1996); Mundy, J. Bone Min. Res. 8, S505-S510 (1993); Manologas and Jilka New Eng. J. Med. 332, 305-311 (1995)). Después de establecer una fuerte adherencia a la superficie ósea, los osteoclastos forman zonas de resorción que se acidifican por una estructura especializada conocida como borde rugoso. El borde rugoso funciona como conducto secretor donde los protones y proteasas ácidas se secretan descalcificando y después digiriendo la matriz ósea. Durante el proceso de resorción mediado por osteoclastos, se cree que se elaboran factores proteicos que funcionan como moléculas de señalización para iniciar la renovación ósea por osteoblastos. Los osteoblastos, a su vez, pueden influir en la función de los osteoclastos a través de la expresión de reguladores solubles o unidos a membrana (Takahashi et al. Endocrinology 123, 2600-2602 (1988)). El acoplamiento entre las funciones de los osteoblastos y osteoclastos es crítico para el modelado, remodelado,
y reparación del esqueleto (Mundy, J. Cell Biochem. 53, 296-300 (1993); Mundy et al. Bone 17, 71S-75S F (1995)).

La osteoporosis posmenopáusica, la enfermedad ósea más habitual en el mundo desarrollado, se ha unido causalmente a la pérdida de estrógenos (para una revisión, véase Pacifici, J. Bone Min. Res. 11, 1043-1051 (1996)). La pérdida ósea posmenopáusica puede atribuirse a la pérdida del control de la regulación ejercido por los estrógenos sobre la producción de citoquinas y otros factores que regulan el desarrollo de osteoclastos. El cambio resultante en el equilibrio de actividad de osteoclastos y osteoblastos favorece la pérdida neta de masa ósea que conduce finalmente a osteoporosis.

La osteoporosis en poblaciones humanas se ha asociado a una incidencia más alta de calcificación arterial, un componente de muchas lesiones ateroscleróticas (Parhami and Demer, Curr. Opin. Lipidology 8, 312-314 (1997); Banks et al. Eur. J. Clin. Invest. 24, 813-817 (1994); Parhami et al. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17, 680-687 (1997)). Factores habituales pueden reforzar la patogénesis de estas dos enfermedades. De hecho algunos depósitos minerales de calcio arteriales parecen idénticos a hueso lamelar completamente formado, incluyendo trabéculas, lagunas, e islas de médula (Haust and Geer, Am. J. Pathol. 60, 329-346 (1970); Bunting, J. Exp. Med. 8, 365-376 (1906)). Además, se ha demostrado que las arterias calcificadas expresan varias proteínas de la matriz ósea, incluyendo colágeno Tipo I, proteína GLA de matriz, osteocalcina, osteonectina y proteína morfogenética ósea tipo 2 (Bostrom et al. J. Clin. Invest. 91, 1800-1809 (1993); O'Brien et al. Circulation 92, 2163-2168 (1995); Giachelli et al. J. Clin. Invest. 92, 1686-1696 (1993); Bostrom et al. Am. J. Cardiol. 75, 88B-91B (1995)). Estos descubrimientos han conducido a la especulación de que la calcificación arterial es un proceso organizado, regulado con mecanismos celulares y moleculares similares a la formación ósea organizada (Demer, Circulation 92, 2029-2032 (1995); Parhami et al. J. Atheroscler. Thromb. 3, 90-94 (1996)).

La osteoprotegerina (OPG), un miembro recientemente identificado de la superfamilia génica de receptores del factor de necrosis tumoral, es un factor secretado que inhibe el desarrollo de osteoclastos tanto in vitro como in vivo (Simonet et al. Cell 89, 309-319 (1997); Solicitud PCT Nº US96/20621 (documento WO97/23614). Ratones transgénicos que sobre-expresan OPG en el hígado, tienen altos niveles de proteína OPG en su circulación sistémica y muestran un aumento marcado en densidad ósea (osteopetrosis). En embriones de ratón normales, se ha localizado OPG en los rudimentos cartilaginosos de huesos en desarrollo, así como en el intestino delgado y la pared muscular de la aorta y varias arterias principales.

Dada la fuerte correlación entre la existencia de osteoporosis y la aparición de afecciones que podrían conducir a enfermedad cardiovascular, particularmente enfermedad caracterizada por calcificación arterial, y las similitudes en los procesos para depositar calcio en el hueso y a lo largo del interior de las paredes arteriales, es un objeto de la invención desarrollar composiciones farmacéuticas y usos de las mismas para la prevención y tratamiento de enfermedad cardiovascular. El desarrollo de un agente terapéutico para la prevención y tratamiento de enfermedades cardiovasculares potenciaría enormemente la longevidad y calidad de vida de pacientes afectados, evitando o retardando afecciones que podrían conducir a hipertensión, isquemia, ataques de corazón, y apoplejía.

Sorprendentemente, se ha descubierto que la pérdida de OPG en un animal knockout para OPG da como resultado la calcificación de las arterias aorta y renal, que son sitios de expresión de OPG endógena en animales normales. Estos descubrimientos implican a OPG en la regulación de calcificación patológica de arterias de modo que, cuando está ausente OPG en circulación o presente a bajos niveles, la acumulación de depósitos de calcio en las paredes arteriales se acelera enormemente. La presencia de niveles normales o por encima de los normales de OPG (tal como en ratones transgénicos que expresan OPG) no están asociados a calcificación vascular.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere al uso de composiciones que comprenden osteoprotegerina para el tratamiento o prevención de enfermedades cardiovasculares. Se usará una cantidad terapéuticamente eficaz de OPG donde dicha cantidad es suficiente para tratar o prevenir una enfermedad cardiovascular.

La presente invención también se refiere a composiciones de OPG útiles para el tratamiento o prevención de enfermedad cardiovascular. Las composiciones de OPG típicamente son mezclas farmacéuticamente aceptables apropiadas para una diversidad de vías de administración.

Descripción de las figuras

Figura 1. Análisis de hibridación in situ de la expresión de OPG en secciones congeladas de corazón embrionario de rata E17 (Paneles A y B) y arteria ranal de rata adulta (Paneles C y D). En microscopía óptica la presencia de ARNm de OPG se ve como fibras oscuras sobre la aorta, la tinción de fondo es verde de Metilo (A). En microscopía de campo oscuro de la misma muestra, la fuerte expresión de ARNm de OPG se ve sobre los nervios y la aorta (B). Una señal un tanto más débil está presente en la arteria renal de la rata adulta en microscopía óptica y de campo oscuro (C y D, respectivamente).

Figura 2. Análisis de hibridación in situ de la expresión de OPG en secciones fijadas con formalina de embrión de rata E20.5. En microscopía óptica la presencia de ARN de OPG se ve en forma de fibras oscuras sobre la aorta, la tinción de fondo es hemalumbre (Paneles A, B y D). En microscopía de campo oscuro de la misma muestra la fuerte expresión de ARNm de OPG se ve sobre la aorta (Paneles C y E). Embrión de rata E20.5, aumento 1/2X, sección teñida con hematoxilina y eosina (A); 4X, H y E (B); 4X (C); 10X, H y E (D); 10X (E).

Figura 3. Calcificación arterial en ratones OPG^{-/-} macho. El ratón OPG^{-/-} Nº 26 tiene calcificación y proliferación intimal en la aorta descendente (Panel A) y la arteria renal (Panel B). El ratón OPG^{-/-} Nº 38 tiene calcificación pronunciada en el bulbo de la aorta (Panel C). La proliferación subintimal masiva podría ser la consecuencia de una disección de la pared de la aorta y sangrado posterior en el espacio entre las capas de la pared aórtica. La formación de aneurisma y disección de la pared de la aorta es una complicación habitual de arteriosclerosis grave. Hay una grave calcificación así como proliferación intimal y medial en la arteria renal (Panel D).

Figura 4. Calcificación arterial en ratones OPG^{-/-} hembra. La aorta del ratón de tipo silvestre Nº 82 se muestra como control negativo (Panel A). El ratón OPG^{-/-} Nº 86 tiene varias lesiones calcificadas en la aorta abdominal (Panel B). El ratón OPG^{-/-} Nº 77 tiene varias lesiones calcificadas en la aorta abdominal (Panel D) y en varias secciones más pequeñas (Panel C).

Descripción detallada de la invención

Los ratones knockout OPG^{-/-} homocigóticos presentaron osteoporosis grave cuando se analizaron por rayos X de cuerpo entero y por histología. La caracterización de la estructura ósea de los ratones knockout para OPG se describe en el documento de Estados Unidos Nº de serie 08/943.687 en trámite junto con la presente y del mismo propietario que la presente. Se encontró inesperadamente que los ratones knockout para OPG homocigóticos tanto macho como hebra también mostraron calcificación marcada y proliferación intimal en la arteria aorta y renal. Estos cambios arteriales no se observaron en ratones knockout OPG^{-/+} heterocigóticos, en ratones OPG^{+/+} normales, o en ratones transgénicos que muestran niveles elevados en circulación de OPG. Los ratones OPG^{+/-} muestran pérdida ósea a los 6 meses de edad. Tomadas juntas, estas observaciones indicaron un papel para OPG en la prevención o reducción de la calcificación arterial y disminución del riesgo de aterosclerosis.

Polipéptidos OPG

Los polipéptidos OPG de la invención incluyen OPG humana o un derivado, forma truncada, o modificada químicamente de la misma que tiene al menos una de las actividades biológicas de OPG. La secuencia de aminoácidos de OPG humana se muestra en SEC.ID.Nº 1 y SEC.ID.Nº 2. Un derivado de OPG se refiere a un polipéptido que tiene una adición, deleción, inserción o sustitución de uno o más aminoácidos de modo que el polipéptido resultante tiene al menos una de las actividades biológicas de OPG. Las actividades biológicas de OPG incluyen, aunque sin limitación, actividades que implican metabolismo óseo. En una realización, los polipéptidos OPG tienen actividad anti-resortiva sobre el hueso. En otra realización, los polipéptidos OPG tienen actividad de reducción o eliminación de la calcificación de las paredes arteriales.

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Los polipéptidos OPG serán polipéptidos OPG maduros que tienen la secuencia líder amino terminal de 21 aminoácidos retirada. Los polipéptidos incluyen los restos 22-401 como se muestra en SEC.ID.Nº 1 y derivados de los mismos que tienen deleciones o truncamientos carboxi-terminales de parte o todos los restos de aminoácidos 180-401 de OPG; uno o más cambios de aminoácidos en los restos 180-401; deleción de parte o todo el dominio rico en cisteínas de OPG, en particular deleción del dominio rico en cisteínas distal (carboxi-terminal); y uno o más cambios de aminoácidos en un dominio rico en cisteínas, en particular en el dominio rico en cisteínas distal (carboxi-terminal). En una realización, OPG tiene hasta aproximadamente 216 aminoácidos delecionados del extremo carboxi terminal. En otra realización, OPG tiene hasta aproximadamente 10 aminoácidos delecionados del extremo amino terminal maduro (donde el extremo amino terminal maduro está en el resto 22) y, opcionalmente, tiene hasta aproximadamente 216 aminoácidos delecionados del extremo carboxi terminal.

Los polipéptidos OPG adicionales incluidos por la invención incluyen los siguientes: fusión [22-180] humano-Fc, fusión [22-201] humano-Fc, fusión [22-401] humano-Fc, fusión [22-185] humano-Fc, y fusión [22-194] humano-Fc. Estos polipéptidos se producen en células hospedadoras de mamífero, tales como células CHO o 293. Los polipéptidos OPG adicionales incluidos por la invención que se expresan en células hospedadoras procariotas incluyen los siguientes: met[22-401] humano, fusión met Fc-[22-401] humano (la región Fc se fusiona al extremo amino terminal de la secuencia que codifica OPG de longitud completa), fusión met[22-401] humano-Fc (la región Fc se fusiona al extremo carboxi terminal de la secuencia que codifica OPG de longitud completa), fusión met Fc-[22-201] humano, fusión met[22-201] humano-Fc, met Fc-[22-194] humano, met[22-194] humano-Fc, met[27-401] humano, met[22-185] humano, met[22-189] humano, met[22-194] humano, met[22-194] humano (P25A), met[22-194] humano (P26A), met[27-185] humano, met[27-189] humano, met[27-194] humano, met-arg-gly-ser-(his)_{6} [22-401] humano, met-lys [22-401] humano, met-(lys)_{3}-[22-401] humano, met[22-401] humano-Fc (P25A), met[22-401] humano (P25A), met[22-401] humano (P26A), met[22-401] humano (P26D). Se entiende que los polipéptidos OPG anteriores producidos en células hospedadoras procariotas tienen un resto de metionina amino terminal, si dicho resto no se indica. En ejemplos específicos, los polipéptidos de fusión OPG-Fc se produjeron usando una región de 227 aminoácidos de IgG_{1}-\gamma1 humana que tiene la secuencia como se muestra en Ellison et al. (Nuc. Acids Res. 10, 4071-4079 (1982)). Sin embargo, también pueden usarse variantes de la región Fc de IgG humana.

El análisis de la actividad biológica de los truncamientos de OPG carboxi terminales fusionados a la región Fc de IgG_{1} humana indica que una porción de OPG de aproximadamente 164 aminoácidos es necesaria para la actividad. Esta región abarca los aminoácidos 22-185, preferiblemente aquellos en SEC.ID.Nº 1 y comprende cuatro dominios ricos en cisteínas característicos de los dominios ricos en cisteínas de los dominios extracelulares del receptor del factor de necrosis tumoral (TNFR).

Usando la homología entre los dominios ricos en cisteínas de OPG y los miembros de la familia TNFR, se generó un modelo tridimensional de OPG en base a la estructura cristalina conocida del dominio extracelular de TNFR-I (véase documento WO97/23614). Este modelo se usó para identificar los restos en OPG que pueden ser importantes para la actividad biológica. Se identificaron os restos de cisteína que están implicados en el mantenimiento de la estructura de los cuatro dominios ricos en cisteínas. Se identificaron los siguientes enlaces disulfuro en el modelo: Dominio 1: cys41 a cys54, cys44 a cys62, tyr23 a his66 puede funcionar para estabilizar la estructura de este dominio; Dominio 2: cys65 a cys80, cys83 a cys98, cys87 a cys105; Domino 3: cys107 a cys118, cys124 a cys142; Dominio 4: cys145 a cys160; cys166 a cys185. También se identificaron los restos que estaban en estrecha proximidad a TNF\beta como se muestra en las Figuras 11 y 12A-12B del documento WO97/23614. En este modelo, se supone que OPG se une a un ligando correspondiente; se usó TNF\beta como ligando modelo para simular la interacción de OPG con su ligando. En base a este modelo, los siguientes restos en OPG pueden ser importantes para la unión de ligando: glu34, lys43, pro66 a gln91 (en particular, pro66, his68, tyr69, tyr70, thr71, asp72, ser73, his76, ser77, asp78, glu79, leu81, tyr82, pro85, val86, lys88, glu90 y gln91), glu153 y ser155.

Alteraciones en estos restos de aminoácidos, de manera individual o en combinación, pueden alterar la actividad biológica de OPG. Por ejemplo, cambios en los restos específicos de cisteína pueden alterar la estructura de los dominios ricos en cisteína individuales, mientras que cambios en los restos importantes para la unión del ligando pueden afectar a las interacciones físicas de OPG con el ligando. Los modelos estructurales pueden ayudar a identificar análogos que tienen propiedades más deseables, tales como actividad biológica potenciada, mayor estabilidad, o mayor facilidad de formulación.

Las modificaciones de los polipéptidos OPG se incluyen por la invención e incluyen modificaciones post-traduccionales (por ejemplo, cadenas de carbohidratos unidas a N o unidas a O, procesamiento de los extremos N-terminal o C-terminal), unión de restos químicos a la estructura de aminoácidos, modificaciones químicas de cadenas de carbohidratos unidas a N o unidas a O, y adición de un resto de metionina N-terminal como resultado de la expresión de células hospedadoras procariotas. Los polipéptidos también pueden modificarse con un marcador detectable, tal como un marcador enzimático, fluorescente, isotópico o de afinidad para permitir la detección y aislamiento de la proteína.

Las modificaciones adicionales de OPG incluyen proteínas quiméricas o de fusión de OPG donde OPG se fusiona a una secuencia de aminoácidos heteróloga. La secuencia heteróloga puede ser cualquier secuencia que permite que la proteína de fusión resultante mantenga la actividad de OPG. Las secuencias heterólogas incluyen por ejemplo, fusiones de inmunoglobulina, tales como fusiones de Fc, que puede ayudar a la purificación de la proteína. Se prefiere una secuencia heteróloga que promueve la asociación de monómeros de OPG para formar dímeros, trímeros y otras formas multiméricas superiores.

En una realización, una proteína quimérica de OPG comprende una fusión de un polipéptido OPG truncado con una región Fc de IgG humana. Los truncamientos de OPG pueden suceder en los extremos amino o carboxi terminales, o ambos, y preferiblemente son truncamientos de hasta aproximadamente 216 aminoácidos desde el extremo carboxi terminal hasta el resto 401. La fusión a una región Fc puede suceder entre el extremo carboxi terminal de un Fc y el extremo amino terminal de un polipéptido OPG truncado, o como alternativa entre el extremo amino terminal de una región Fc y el extremo carboxi terminal de un polipéptido OPG truncado. Los ejemplos de polipéptidos OPG truncados fusionados a una región Fc incluyen los restos 22-185, 22-189, 22-194 ó 22-201 tales como los mostrados en SEC.ID.Nº 1 o variantes de la misma.

Los polipéptidos de la invención se aíslan y purifican de otros polipéptidos presentes en tejidos, líneas celulares y células hospedadoras transformadas que expresan OPG, o se purifican de componentes en cultivos celulares que contienen proteína secretada. En una realización, el polipéptido está libre de asociación con otras proteínas humanas, tales como el producto de expresión de una célula hospedadora bacteriana.

También se proporcionan por la invención derivados modificados químicamente de OPG que pueden proporcionar ventajas adicionales tales como aumento de la estabilidad y tiempo en circulación del polipéptido, o disminución de la inmunogenicidad (véase Patente de Estados Unidos Nº 4.179.337). Los restos químicos para la derivatización pueden seleccionarse entre polímeros solubles en agua tales como polietilenglicol, copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico y similares. Los polipéptidos pueden modificarse en posiciones aleatorias en la molécula, o en posiciones predeterminadas en la molécula y pueden incluir uno, dos, tres o más restos químicos unidos.

El polímero puede ser de cualquier peso molecular y puede estar ramificado o no ramificado. Para polietilenglicol, el peso molecular preferido está entre aproximadamente 1 kDa y aproximadamente 100 kDa (el término "aproximadamente" indica que en las preparaciones de polietilenglicol, algunas moléculas pesarán más, otras menos, que el peso molecular indicado) para una fácil manejo y fabricación. Pueden usarse otros tamaños, dependiendo del perfil terapéutico deseado (por ejemplo, la duración de liberación sostenida deseada, los efectos, si los hay, sobre la actividad biológica, el fácil manejo, el grado o ausencia de antigenicidad y otros efectos conocidos del polietilenglicol sobre la proteína terapéutica o análogo).

Las moléculas de polietilenglicol (u otros restos químicos) deben unirse a la proteína considerando los efectos sobre los dominios funcional o antigénico de la proteína. Hay varios métodos de unión disponibles para los especialistas en la técnica, por ejemplo, el documento EP 401 384 incorporado en este documento como referencia (acoplamiento de PEG a G-CSF), véase también Malik et al., Exp. Hematol. 20: 1028-1035 (1992) (que informa de la pegilación de GM-CSF usando cloruro de tresilo). Por ejemplo, el polietilenglicol puede unirse covalentemente a través de restos de aminoácidos mediante un grupo reactivo, tal como, un grupo amino o carboxilo libre. Los grupos reactivos son aquéllos a los que puede unirse una molécula de polietilenglicol activada. Los restos de aminoácidos que tienen un grupo amino libre pueden incluir restos de lisina y los restos de aminoácidos N-terminales; aquéllos que tienen un grupo carboxilo libere pueden incluir restos de ácido aspártico, restos de ácido glutámico y el resto de aminoácido C-terminal. También pueden usarse grupos sulfhidrilo como grupo reactivo para unir la molécula o moléculas de polietilenglicol. Para propósitos terapéuticos se prefiere la unión a un grupo amino, tal como la unión al grupo N-terminal o lisina.

La invención también prevé OPG modificado químicamente de manera selectiva en el extremo amino terminal. Usando polietilenglicol a modo de ilustración de las presentes composiciones, se puede seleccionar una diversidad de moléculas de polietilenglicol (por peso molecular, ramificaciones, etc.), la proporción de moléculas de polietilenglicol a moléculas de proteína (o péptido) en la mezcla de reacción, el tipo de reacción de pegilación a realizar, y el método para obtener la proteína pegilada en el extremo N-terminal seleccionada. El método para obtener la preparación pegilada en el extremo N-terminal (es decir, separar este resto de otros restos no pegilados si es necesario) puede ser por purificación del material pegilado en el extremo N-terminal a partir de una población de moléculas de proteína pegiladas. La modificación química N-terminal selectiva puede conseguirse por alquilación reductora que aprovecha la reactividad diferencial de diferentes tipos de grupos amino primarios (lisina frente al extremo N-terminal) disponibles para derivatización en una proteína particular. Bajo las condiciones de reacción apropiadas, se consigue un derivatización sustancialmente selectiva de la proteína en el extremo N-terminal con un polímero que contiene un grupo carbonilo.

La invención también prevé un multímero de OPG que comprende monómeros de OPG. Parece que OPG es activo como multímero (por ejemplo, dímero, trímero o un número más alto de monómeros). Preferiblemente, los multímeros de OPG son dímeros o trímeros. Los multímeros de OPG pueden comprender monómeros que tienen la secuencia de aminoácidos de OPG suficiente para promover la formación del multímero o pueden comprender monómeros que tienen secuencias heterólogas tales como una región Fc de anticuerpo. El análisis de deleciones carboxi-terminales de OPG sugiere que al menos una porción de la región 186-401 está implicada junto con los polipéptidos OPG. La sustitución de parte o toda la región de los aminoácidos 186-401 de OPG con una secuencia de aminoácidos capaz de auto-asociación también se incluye por la invención. Como alternativa, los polipéptidos OPG o derivados de los mismos pueden modificarse para formar dímeros o multímeros por mutagénesis dirigida de sitio para crear restos de cisteína desapareados para la formación de enlaces disulfuro intercatenarios, por entrecruzamiento fotoquímico, tal como exposición a luz ultravioleta, o por entrecruzamiento químico con moléculas enlazadoras bifuncionales tales como polietilenglicol bifuncional y similares. En una realización, los multímeros de OPG se forman por unión covalente de monómeros de OPG que carecen de parte o toda la región 186-401 de modo que la asociación de los monómeros de OPG sucede en gran medida a través de modificación con el grupo enlazador.

Los multímeros de OPG pueden prepararse por diversos procedimientos de entrecruzamiento químico. Los monómeros de OPG pueden unirse químicamente de cualquier modo que mantenga o potencie la actividad biológica de OPG. Puede usarse una diversidad de entrecruzantes químicos dependiendo de qué propiedades del dímero proteico se desean. Por ejemplo, los entrecruzantes pueden ser cortos y relativamente rígidos o más largos y más flexibles, pueden ser biológicamente reversibles, y pueden proporcionar inmunogenicidad reducida o vida media farmacocinética más larga.

Las moléculas de OPG se unen a través del extremo amino terminal por un procedimiento de dos etapas donde OPG se modifica químicamente en el extremo amino terminal para introducir un tiol protegido, que después de purificación se desprotege y se usa como punto de unión para conjugación específica de sitio a través de una diversidad de entrecruzantes con una segunda molécula de OPG. Los entrecruzantes amino-terminales incluyen, aunque sin limitación, un enlace disulfuro, enlaces tioéter usando entrecruzantes alifáticos bifuncionales de cadena corta, y enlaces tioéter para entrecruzantes de polietilenglicol bifuncional de longitud variable ("pesas" [dumbell] de PEG). También se incluyen por la síntesis de dímeros de OPG con pesas de PEG un producto secundario de dicha síntesis, llamado una "monopesa" (monobell). Una monopesa de OPG consta de un monómero acoplado a un PEG bifuncional lineal con un terminal polimérico libre. Como alternativa, OPG puede entrecruzarse directamente a través de una diversidad de técnicas de entrecruzamiento homobifuncional específico de amina que incluyen reactivos tales como: dianhídrido dietilentriaminopentaacético (DTPA), p-benzoquinona (pBQ) o bis(sulfosuccinimidil) suberato (BS^{3}) así como otros conocidos en la técnica. También es posible tiolar OPG directamente con reactivos tales como iminotiolano en presencia de una diversidad de entrecruzantes bifuncionales específicos de tiol, tales como bismaleimida de PEG, y conseguir la dimerización y/o pesas en un proceso de una etapa.

Los multímeros de OPG también pueden formarse uniendo monómeros de OPG con péptidos de longitud variada. Los péptidos se eligen para que tengan una secuencia y composición de aminoácidos para funcionar como enlazadores flexibles entre los monómeros de OPG. Los enlazadores peptídicos pueden unir monómeros de un modo cabeza con cabeza (N-terminal con N-terminal o C-terminal con C-terminal) o de un modo cabeza con cola (N-terminal con C-terminal). Los enlazadores peptídicos preferiblemente tendrán aproximadamente 15-60 aminoácidos de longitud.

También se incluye un método para la purificación de OPG de fuentes naturales y de células hospedadoras transfectadas. El proceso de purificación puede emplear una o más etapas de purificación de proteínas convencionales en un orden apropiado para obtener la proteína purificada. Las etapas de cromatografía pueden incluir intercambio iónico, filtración en gel, interacción hidrófoba, fase inversa, cromatoenfoque, cromatografía de afinidad empleando un anticuerpo anti-OPG o complejo de afinidad biotina-estreptavidina y similares.

Ácidos Nucleicos

También se proporcionan moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos OPG de la invención. Las moléculas de ácido nucleico se seleccionan entre las siguientes:

a) la secuencia de ácidos nucleicos como se muestra en SEC.ID.Nº 1 o la cadena complementaria de la misma;

b) los ácidos nucleicos que hibridan en condiciones rigurosas con la región que codifica el polipéptido en SEC.ID.Nº 1; y

c) las secuencias de ácidos nucleicos que son degeneraciones de las secuencias de (a) y (b).

Las condiciones para la hibridación generalmente son de alta rigurosidad tales como 5xSSC, formamida al 50% y 42ºC o el equivalente que puede obtenerse fácilmente ajustando las concentraciones salina y de disolvente orgánico y la temperatura. Por ejemplo, las condiciones de rigurosidad equivalente pueden usarse aumentando la temperatura de la etapa de hibridación y lavado (a un intervalo de 50-65ºC) y disminuyendo la concentración salina (a un intervalo de 1 a 0,2 x SSC) mientras que se suprime el disolvente orgánico. Las condiciones de hibridación para los ácidos nucleicos se describen con más detalle en Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989).

La longitud de los ácidos nucleicos de hibridación de la invención puede ser variable ya que la hibridación puede suceder en parte o toda la región que codifica el polipéptido como se muestra en SEC.ID.Nº 1 y puede también suceder en regiones no codificantes adyacentes. Los ácidos nucleicos de hibridación pueden ser más cortos o más largos en longitud que la secuencia complementaria mostrada en SEC.ID.Nº 1. Los ácidos nucleicos truncados o ampliados que hibridan con SEC.ID.Nº 1 pueden mantener una o más de las propiedades biológicas de OPG, tales como actividad anti-resortiva sobre el hueso o protección frente a calcificación arterial. Los ácidos nucleicos de hibridación también pueden incluir regiones no codificantes adyacentes que están 5' y/o 3' de la región que codifica OPG. Las regiones no codificantes incluyen regiones reguladoras implicadas en la expresión de OPG, tales como promotores, potenciadores, sitios de iniciación de la traducción, sitios de terminación de la transcripción y similares.

También se proporcionan por la invención derivados de las secuencias de ácidos nucleicos como se muestra en SEC.ID.Nº 1. Como se usa en este documento, los derivados incluyen secuencias de ácidos nucleicos que tienen una adición, sustitución, inserción o deleción de uno o más restos de modo que las secuencias resultantes codifican polipéptidos que tienen uno o más restos de aminoácidos que se han añadido, delecionado, insertado o sustituido y el polipéptido resultante tiene la actividad de OPG, tal como actividad anti-resortiva sobre el hueso o protección frente a calcificación arterial. Los derivados de ácidos nucleicos pueden ser de origen natural, tal como por variación de corte y empalme o polimorfismo, o pueden construirse usando técnicas de mutagénesis dirigida de sitio disponibles para un especialista en la técnica. Un ejemplo de una variante de origen natural de OPG es un ácido nucleico que codifica un cambio de lys a asn en el resto 3 en la secuencia líder (véase documento WO97/23614). Se espera que los derivados de ácido nucleico codifiquen cambios de aminoácidos en regiones de la molécula que son menos probables de alterar la actividad biológica.

En una realización, los derivados de OPG incluyen ácidos nucleicos que codifican formas truncadas de OPG de longitud completa (OPG de longitud completa incluye los restos 22 a 401 de SEC.ID.Nº 1) que tiene uno o más aminoácidos delecionados del extremo carboxi terminal. Los ácidos nucleicos que codifican OPG pueden tener hasta aproximadamente 216 aminoácidos delecionados del extremo carboxi terminal. Opcionalmente, una región Fc de anticuerpo puede extenderse desde el nuevo extremo carboxi terminal para producir un polipéptido de fusión OPG-Fc biológicamente activo, o una región Fc puede extenderse desde el extremo amino terminal del OPG truncado. En realizaciones preferidas, los ácidos nucleicos que codifican OPG que tiene la secuencia de aminoácidos de los restos 22-185, 22-189, 22-194 ó 22-201 (usando la numeración de SEC.ID.Nº 1) y opcionalmente, que codifican una región Fc de IgG humana.

También se incluyen ácidos nucleicos que codifican formas truncadas de OPG que tienen uno o más aminoácidos delecionados del extremo amino terminal. Las formas truncadas incluyen aquéllas que carecen de parte o todos los 21 aminoácidos que comprenden la secuencia líder. OPG maduro carece de toda la secuencia líder de 21 aminoácidos. Adicionalmente, la invención prevé ácidos nucleicos que codifican OPG que tienen de 1 a 10 aminoácidos delecionados del extremo amino terminal maduro (en el resto 22) y, opcionalmente, que tienen de 1 a 216 aminoácidos delecionados del extremo carboxi terminal (en el resto 401). Opcionalmente, los ácidos nucleicos pueden codificar un resto de metionina en el extremo amino terminal.

Los ejemplos de los ácidos nucleicos de la invención incluyen ADNc, ADN genómico, ADN sintético y ARN. El ADNc se obtiene de bibliotecas preparadas a partir de ARNm aislado de diversos tejidos que expresan OPG. En seres humanos, las fuentes tisulares de OPG incluyen riñón, hígado, placenta y corazón. El ADN genómico que codifica OPG se obtiene de bibliotecas genómicas que están disponibles en el mercado de una diversidad de especies. El ADN sintético se obtiene por síntesis química de fragmentos oligonucleotídicos solapantes seguido de ensamblaje de los fragmentos para reconstituir parte o toda la región codificante y las regiones flanqueantes (véase Patente de Estados Unidos Nº 4.695.623 que describe la síntesis química de genes de interferón). El ARN se obtiene más fácilmente por vectores de expresión procariotas que dirigen la síntesis a alto nivel de ARNm, tales como vectores que usan promotores y ARN polimerasa de T7.

Vectores y Células Hospedadoras

Los vectores de expresión que contienen secuencias de ácidos nucleicos que codifican OPG, células hospedadoras transformadas con dichos vectores y métodos para la producción de OPG también se proporcionan por la invención. Se encuentra una visión de conjunto de la expresión de proteínas recombinantes en Methods of Enzymology v. 185, Goedel, D.V. ed. Academic Press (1990).

Las células hospedadoras para la producción de OPG incluyen células hospedadoras procariotas, tales como E. coli, células hospedadoras de levaduras, vegetales, de insecto y de mamífero. Las cepas de E. coli tales como HB101 o JM101 son apropiadas para la expresión. Las células hospedadoras de mamífero preferidas incluyen células COS, CHOd-, 293, CV-1, 3T3, de riñón de cría de hámster (BHK) y otras. Se prefieren células hospedadoras de mamífero cuando las modificaciones post-traduccionales, tales como glicosilación y procesamiento del polipéptido, son importantes para la actividad de OPG. La expresión en mamíferos permite la producción de polipéptidos secretados que pueden recuperarse del medio de crecimiento.

Los vectores para la expresión de OPG contienen un mínimo de secuencias necesarias para la propagación del vector y para la expresión del inserto clonado. Estas secuencias incluyen un origen de replicación, un marcador de selección, un promotor, un sitio de unión al ribosoma, secuencias potenciadoras, sitios de corte y empalme del ARN y un sitio de terminación de la transcripción. Los vectores apropiados para la expresión en las células hospedadoras mencionadas están fácilmente disponibles y los ácidos nucleicos de la invención se insertan en los vectores usando técnicas de ADN recombinante convencionales. Los vectores para la expresión específica de tejido de OPG también se incluyen. Dichos vectores incluyen promotores que funcionan específicamente en hígado, riñón u otros órganos para la producción en ratones, y vectores virales para la expresión de OPG en células humanas marcadas.

Usando un sistema hospedador-vector apropiado, se produce OPG de manera recombinante cultivando una célula hospedadora transformada con un vector de expresión que contiene secuencias de ácidos nucleicos que codifican OPG en condiciones tales que se produce OPG, y aislando el producto de expresión. OPG se produce en el sobrenadante de las células de mamífero transfectadas o en cuerpos de inclusión de células hospedadoras bacterianas transformadas. OPG producida de este modo puede purificarse por procedimientos conocidos por los especialistas en la técnica como se describe a continuación. La expresión de OPG en sistemas hospedadores de mamífero y bacterianos se describe en el documento WO97/23614. Los vectores de expresión para hospedadores de mamífero se ejemplifican por plásmidos tales como pDSR\alpha descrito en el documento WO90/14363. Los vectores de expresión para células hospedadoras bacterianas se ejemplifican por los plásmidos pAMG21 y pAMG22-His descritos en el documento WO97/23614. Se espera que los plásmidos específicos y células hospedadoras descritas sean para propósitos ilustrativos y que también puedan usarse otros plásmidos y células hospedadoras disponibles para expresar los polipéptidos.

La invención también prevé la expresión de OPG a partir de ácidos nucleicos endógenos por sucesos de recombinación in vivo o ex vivo. Una estrategia implica la activación de un gen OPG endógeno habitualmente silencioso por la introducción de secuencias reguladoras exógenas (por ejemplo, promotores y potenciadores) capaces de dirigir la expresión de OPG a partir del gen endógeno, o a partir de un gen variante del mismo que está presente en el genoma hospedador o se genera por la introducción de secuencias exógenas. Típicamente, las secuencias exógenas las llevan los vectores capaces de recombinación homóloga con el genoma hospedador. Además, las secuencias reguladoras endógenas o exógenas capaces de dirigir la producción de OPG pueden activarse o estimularse para expresar OPG después de la exposición a ciertos factores activadores o estimuladores para la transcripción y/o traducción.

Composiciones Farmacéuticas de OPG

Las composiciones farmacéuticas de OPG típicamente incluyen una cantidad terapéuticamente eficaz de producto proteico OPG en mezcla con uno o más materiales de formulación farmacéutica y fisiológicamente aceptables. Los materiales de formulación apropiados incluyen, aunque sin limitación, antioxidantes, conservantes, colorantes, agentes aromatizantes y de dilución, agentes de emulsión, agentes de suspensión, disolventes, cargas, agentes para dar volumen, tampones, vehículos de suministro, diluyentes, excipientes y/o adyuvantes farmacéuticos. Por ejemplo, un vehículo apropiado puede ser agua para inyección, solución salina fisiológica u otros materiales habituales en composiciones para administración parenteral. Solución salina tamponada neutra o solución salina mezclada con albúmina de suero son vehículos ejemplares adicionales.

El disolvente principal en un vehículo puede ser de naturaleza acuosa o no acuosa. Además, el vehículo puede contener otros excipientes farmacéuticamente aceptables para modificar o mantener el pH, osmolaridad, viscosidad, transparencia, color, esterilidad, estabilidad, velocidad de disolución, u olor de la formulación. De manera similar, el vehículo puede contener también otros excipientes farmacéuticamente aceptables para modificar o mantener la estabilidad, velocidad de disolución, o velocidad de liberación de OPG. Dichos excipientes son aquellas sustancias habitual y normalmente empleadas para formular dosificaciones para administración parenteral en forma de dosis unitaria o multi-dosis.

Una vez se ha formulado la composición terapéutica, puede almacenarse en viales estériles en forma de solución, suspensión, gel, emulsión, sólido, o polvo deshidratado o liofilizado. Dichas formulaciones pueden almacenarse en una forma lista para su uso o en una forma por ejemplo, liofilizada, que requiere reconstitución antes de su administración.

La formulación farmacéutica óptima se determinará por un especialista en la técnica dependiendo de la vía de administración y dosificación deseada. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) páginas 1435-1712, la descripción de la cual se incorpora por la presente como referencia.

Otras formas de administración eficaz, tales como formulaciones de liberación lenta parenteral, brumas inhalantes, formulaciones oralmente activas, o supositorios, también se prevén. En una realización, las composiciones farmacéuticas de OPG se formulan para administración parenteral. Dichas composiciones terapéuticas administradas parenteralmente están típicamente en forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable libre de pirógeno que comprende OPG en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un vehículo preferido es solución salina fisiológica.

Las composiciones para liberación sostenida y/o suministro de OPG comprenden polipéptidos OPG modificados con polímeros solubles en agua como se ha descrito anteriormente para aumentar la solubilidad o estabilidad. Las composiciones también pueden comprender la incorporación de OPG en liposomas, microemulsiones, micelas o vesículas para suministro controlado durante un periodo prolongado de tiempo. Específicamente, las composiciones de OPG pueden comprender la incorporación en matrices poliméricas tales como hidrogeles, siliconas, polietilenos, copolímeros de etileno-acetato de vinilo, o polímeros biodegradables. Los ejemplos de hidrogeles incluyen polihidroxialquilmetacrilatos (p-HEMA), poliacrilamida, polimetacrilamida, polivinilpirrolidona, alcohol polivinílico y diversos complejos de polielectrolitos. Los ejemplos de polímeros biodegradables incluyen ácido poliláctico (PLA), ácido poliglicólico (PGA), copolímeros de PLA y PGA, poliamidas y copolímeros de poliamidas y poliésteres. Otras formulaciones de liberación controlada incluyen microcápsulas, microesferas, complejos macromoleculares y perlas poliméricas que pueden administrarse por inyección. También puede usarse ácido hialurónico, y este puede tener el efecto de promover la duración sostenida en circulación. Dichas composiciones pueden influir en el estado físico, estabilidad, velocidad de liberación in vivo, y velocidad de eliminación in vivo de las presentes proteínas y derivados.

También se contempla que ciertas formulaciones que contienen OPG son para administrarlas por vía oral. OPG que se administra de este modo puede encapsularse y puede formularse con o sin aquéllos vehículos usados normalmente en la composición de formas de dosificación sólida. La cápsula puede diseñarse para liberar la porción activa de la formulación en el punto del trato gastrointestinal en el que la biodisponibilidad está maximizada y la degradación pre-sistémica está minimizada. Pueden incluirse excipientes adicionales para facilitar la absorción. También pueden emplearse diluyentes, aromatizantes, ceras de bajo punto de fusión, aceites vegetales, lubricantes, agentes de suspensión, agentes disgregantes de comprimidos, y aglutinantes.

Administración de OPG

Los polipéptidos OPG también pueden administrarse por vía parenteral mediante vía subcutánea, intramuscular, intravenosa, transpulmonar, o transdérmica. Para conseguir la dosis deseada de OPG, pueden administrarse inyecciones repetidas a diario o menos frecuentes. La frecuencia de dosificación dependerá de los parámetros farmacocinéticos del polipéptido OPG formulado, y la vía de administración.

Sin tener en cuenta el modo de administración, la dosis específica se calcula típicamente de acuerdo con el peso corporal o área superficial corporal. Se hace de forma rutinaria por los especialistas en la técnica un refinamiento de los cálculos necesarios para determinar la dosificación apropiada para el tratamiento que implica cada una de las formulaciones mencionadas anteriormente, especialmente en vista de la información de dosificación y los ensayos descritos en este documento. Las dosificaciones apropiadas pueden determinarse a través del uso de los ensayos establecidos para determinar dosificaciones utilizadas junto con datos de respuesta a dosis apropiados. El régimen de dosificación final implicado en un método para tratar una afección específica se determinará por el médico que está atendiendo, considerando diversos factores que modifican la acción de los fármacos, por ejemplo, la edad, condición, peso corporal, sexo y dieta del paciente, la gravedad de cualquier infección, tiempo de administración y otros factores clínicos. En una realización, el intervalo de dosis para una proteína de fusión Fc-OPG, donde el extremo carboxi terminal de una región Fc se une al resto amino terminal de un polipéptido OPG truncado (por ejemplo, Fc-OPG [22-194]), es aproximadamente 10 \mug/kg a aproximadamente 10 mg/kg.

También se prevé la terapia génica con OPG in vivo donde una secuencia de ácidos nucleicos que codifica OPG, un derivado de la misma, o una proteína quimérica OPG se introduce directamente en el paciente. Por ejemplo, una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido OPG se introduce en células diana mediante inyección local de una construcción de ácidos nucleicos con o sin un vector de suministro apropiado, tal como un vector de virus adeno-asociado. Los vectores virales alternativos incluyen, aunque sin limitación, vectores de retrovirus, adenovirus, virus del herpes simple y virus del papiloma. La transferencia física puede conseguirse in vivo por inyección local de la construcción de ácido nucleico deseada u otro vector de suministro apropiado que contiene la secuencia de ácidos nucleicos deseada, transferencia mediada por liposoma, inyección directa (ADN desnudo), transferencia mediada por receptor (complejo ligando-ADN), o bombardeo de micropartículas (pistola génica).

La aterosclerosis provoca la enfermedad arterial más degenerativa y la calcificación de la pared arterial típicamente sucede en lesiones clínicamente significativas. El estrechamiento y la oclusión de la arteria son las características más habituales de la enfermedad, aunque la resistencia de la pared arterial también puede verse comprometida por la pérdida de elastina y colágeno. Las consecuencias de la oclusión arterial incluyen disección, aneurismas, isquemia, trombosis, y enfermedades cardiacas agudas y crónicas. En muchos casos, se necesitan tratamientos quirúrgicos o angioplásticos y, según la eficacia, dichos tratamientos son necesariamente invasivos, no evitan la oclusión de otros sitios arteriales, y en algunos casos pueden necesitar repetirse en los sitios originales (por ejemplo, en restenosis).

OPG puede usarse para prevenir o tratar aterosclerosis y arteriosclerosis de Monckenberg (esclerosis con calcificación medial), y otras afecciones caracterizadas por calcificación arterial. OPG puede administrarse sola o en combinación con otros fármacos para tratar aterosclerosis, tales como fármacos anti-hipertensivos y fármacos que disminuyen los niveles de colesterol. Los fármacos anti-hipertensivos incluyen diuréticos, fármacos que de bloqueo \alpha-adrenérgico, fármacos de bloqueo \beta-adrenérgico, fármacos que bloquean la entrada de calcio, inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina y vasodilatadores. Los fármacos que disminuyen los niveles de colesterol que reducen los niveles de colesterol de lipoproteína de baja densidad (LDL) incluyen secuestrantes de ácido biliar, inhibidores de la HMG-CoA reductasa, derivados de ácido fíbrico y ácido nicotínico. OPG también puede administrarse con agentes anti-resortivos que pueden mostrar beneficio cardiovascular, tales como hormonas (estrógenos), vitamina D y derivados de la vitamina D, y moduladores selectivos del receptor de estrógenos (SERM), tales como raloxifeno (EVISTA). Además, OPG puede administrarse junto con tratamientos quirúrgicos y angioplásticos, tales como angioplastia con prótesis arterial y globo.

La invención se entenderá más completamente por referencia a los siguientes ejemplos. Estos ejemplos no son para interpretarlos de ningún modo como limitantes del alcance de esta invención.

Ejemplo 1 Expresión de OPG analizada por hibridación in situ

Se ha descrito previamente la preparación de embriones y tejidos para experimentos de hibridación in situ y la preparación de sondas oligonucleotídicas marcadas radiactivamente para detectar los niveles de ARNm de OPG, en Simonet et al. supra. La localización de altos niveles de ARNm de OPG en la parte naciente de la aorta en embrión de ratón de 18,5 días de edad se muestra en la Figura 1A-1D. La expresión de OPG en la rata adulta también es evidente en la pared de músculo liso de la arteria renal como se muestra en la Figura 2A-2E.

Ejemplo 2 Preparación de Ratones Knockout para OPG

Los procedimientos para preparar Ratones Knockout para OPG que incluyen la construcción de vectores para dirigir las secuencias de OPG en el genoma de ratón y la introducción de dichos vectores en los embriones de ratón se describen en el documento de Estadios Unidos Nº de serie 08/943.687 en trámite junto con la presente y del mismo propietario que la presente, que se incorpora por la presente como referencia.

Ejemplo 3 Análisis Fenotípico de Ratones Knockout para OPG

Se sometieron a necropsia grupos de ratones knockout para OPG homocigóticos (OPG^{-/-}), ratones knockout heterocigóticos (OPG^{-/+}) y ratones de control (OPG^{+/+}) en embriones de 18 días y 7 días, 14 días, 60 días y 180 días después del nacimiento. Se realizó una radiografía antes de la disección ordinaria. En el suero de ratones se analizó la química clínica y hematología completa. Se pesó el cuerpo completo y los órganos principales y se fijaron en formalina.

Se muestra un resumen de la necropsia que experimentan los ratones en la Tabla 1.

TABLA 1

Tipo silvestre (+/+)	Heterocigóticos (+/-)	Homocigóticos (-/-)
1-34 Macho	1-28 Macho	1-27 Macho
1-37 Macho	1-29 Macho	1-26 Macho \blacklozenge
1-45 Macho	1-35 Macho	1-38 Macho ?
1-25 Macho	1-36 Macho	77 Hembra
81 Hembra	1-46 Macho	80 Hembra
82 Hembra	75 Hembra	86 Hembra
83 Hembra	76 Hembra
	78 Hembra
\blacklozenge \begin{minipage}[t]{158mm} El ratón OPG^{-/-} 1-26 fue el enano de la camada, aproximadamente la mitad del tamaño de un ratón normal. Se volvió moribundo y murió poco antes del sacrificio programado, presentó los signos de insuficiencia poco antes de morir. La sangre para hematología y los procesos químicos del suero se realizaron inmediatamente después de su muerte por punción cardiaca y se realizó una necropsia regular.\end{minipage}
? \begin{minipage}[t]{158mm}El ratón OPG^{-/-} 1-38 se colocó en una jaula con el ratón OPG^{-/-} 1-27 en preparación para los procedimientos y murió en la última hora antes del sacrificio, no se pudo recoger nada de sangre para el ensayo. El resto de la autopsia se realizó de modo habitual y los órganos se sometieron a histología.\end{minipage}

Se ha informado del análisis y resultados de morfología, histología y densidad ósea, y los parámetros químicos séricos y de hematología en ratones knockout para OPG en el documento de Estados Unidos Nº de serie 08/943.687 presentado junto con la presente y del mismo propietario que la presente.

Dos de los tres ratones OPG^{-/-} macho tuvieron cambios arteriales. En el corazón del ratón Nº 26 estuvo presente calcinosis subendocárdica grave extensa. La proliferación intimal y las calcificaciones podrían ser detectables en la arteria aorta (Figura 3A) y renal (Figura 3B). El nivel de calcio en suero se elevó a 11 frente a 8,8\pm0,17 en el grupo OPG^{+/+}. El ratón OPG^{-/-} Nº 38 tuvo proliferación intimal y tejido con granulación crónica subintimal en la parte inicial de la arteria aorta (Figura 3C) y renal (Figura 3D). El valor de calcio en suero no estaba disponible.

Dos de los tres ratones OPG^{-/-} hembra tuvieron calcificaciones y proliferación intimal en la arteria aorta y renal (Figura 4B, 4C y 4D), los valores de calcio en suero estuvieron en el intervalo normal. El tercer ratón OPG^{-/-} hembra presentó osteoporosis en el hueso, tuvo niveles de calcio normales y sin cambios arteriales.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE: Simonet, Scott Sarosi, Ildiko

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA LA PREVENCIÓN Y TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES CARDIOVASCULARES

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 2

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(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

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(A)

DESTINATARIO: Amgen Inc.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: One Amgen Center Drive

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(C)

CIUDAD: Thousand Oaks

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(D)

ESTADO: California

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(E)

PAÍS: USA

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(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): 91320-1789

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(v)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

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(A)

TIPO DE MEDIO: Disco flexible

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(B)

ORDENADOR: PC IBM compatible

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D)

SOFTWARE: PatentIn Release Nº 1.0, Versión Nº 1.30

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(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

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(viii)

INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:

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(A)

NOMBRE: Winter, Robert B.

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(B)

NÚMERO DE REFERENCIA/CERTIFICADO: A-525

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 1355 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

CADENA: sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

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(ix)

CARACTERÍSTICA:

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(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

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(B)

LOCALIZACIÓN: 94..1297

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:

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1

2

3

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 401 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:

4

Claims (16)

1. Uso de osteoprotegerina (OPG) para preparar un medicamento para tratar o prevenir enfermedad cardiovascular.

2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde la enfermedad cardiovascular está asociada a aterosclerosis o arteriosclerosis de Monckenberg.

3. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho medicamento es para co-administración con un fármaco anti-hipertensivo.

4. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho medicamento es para co-administración con un fármaco que disminuye los niveles de colesterol.

5. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde el medicamento es para administración antes de, concurrente con, o después de la aparición de enfermedad cardiovascular.

6. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde el medicamento es para administración junto con tratamiento quirúrgico o angioplástico.

7. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho medicamento es para co-administración con agente anti-resortivo seleccionado entre el grupo compuesto por estrógenos, compuestos de vitamina D y moduladores selectivos del receptor de estrógenos.

8. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde la osteoprotegerina es una OPG truncada.

9. Uso de acuerdo con la reivindicación 8, donde el polipéptido truncado tiene hasta 216 aminoácidos delecionados desde el extremo carboxi terminal como se muestra en SEC.ID.Nº 2.

10. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde la osteoprotegerina comprende un polipéptido quimérico que comprende un polipéptido OPG trucado fusionado a una región Fc de IgG humana.

11. Uso de acuerdo con la reivindicación 10, donde el extremo carboxi terminal de la región Fc está fusionado al extremo amino terminal del polipéptido OPG truncado.

12. Uso de acuerdo con la reivindicación 10, donde el extremo amino terminal de la región Fc está fusionado al extremo carboxi terminal del polipéptido OPG truncado.

13. Uso de acuerdo con la reivindicación 9, donde el polipéptido OPG truncado es un multímero unido covalentemente.

14. Uso de acuerdo con las reivindicaciones 11 ó 12 donde el polipéptido OPG truncado comprende los restos 22-185, 22-189, 22-194, ó 22-201 como se muestra en SEC.ID.Nº 2.

15. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, donde la osteoprotegerina comprende los restos 22-401 como se muestra en SEC.ID.Nº 2.

16. Uso de un ácido nucleico que codifica osteoprotegerina para preparar un medicamento para tratar o prevenir enfermedad cardiovascular.