ES2249061T3 - Procedimiento para determinar la susceptibilidad al asma. - Google Patents

Procedimiento para determinar la susceptibilidad al asma.

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ES2249061T3 ES99968477T ES99968477T ES2249061T3 ES 2249061 T3 ES2249061 T3 ES 2249061T3 ES 99968477 T ES99968477 T ES 99968477T ES 99968477 T ES99968477 T ES 99968477T ES 2249061 T3 ES2249061 T3 ES 2249061T3
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Abstract

Procedimiento in vitro para predecir la gravedad del asma en un individuo, que comprende: analizar una muestra biológica procedente de un individuo respecto a la presencia de una variante alélica R576 del receptor de IL-4, , en la que la variante alélica R576 proporciona una intensa señalización del receptor, en comparación con el receptor de IL-4 de tipo salvaje, y en la que dicha presencia de la variante alélica R576 en el individuo indica la gravedad del asma en el paciente.

Description

Procedimiento para determinar la susceptibilidad al asma.
Antecedentes de la invención Campo de la invención
La presente invención se refiere a sistemas y procedimientos para explorar pacientes en cuanto a la susceptibilidad y gravedad de su asma. Más específicamente, la presente invención se refiere a la determinación de la susceptibilidad o de la gravedad potencial del asma del paciente analizando el receptor de IL-4.
Descripción de la técnica relacionada
El asma es un trastorno inflamatorio crónico y, en individuos susceptibles genéticamente, esta inflamación conduce a un aumento de la sensibilidad de las vías aéreas a diversos estímulos, así como a su obstrucción recurrente. Es la enfermedad crónica más habitual de los niños y constituye la razón más frecuente para la admisión hospitalaria pediátrica. Aunque está claro que en su desarrollo son importantes influencias tanto ambientales como genéticas, la patogénesis de esta enfermedad permanece oscura.
Varios genes y loci candidatos se han relacionado con el asma y la atopía, que incluyen IL-4, el complejo HLA, Fc\varepsilonRI\beta, el receptor adrenérgico \beta2 y regiones cromosómicas tales como el grupo de citoquinas en 5q31-32, que soportan la naturaleza poligénica de estas complejas patologías. La delineación de los genes que contribuyen al desarrollo del asma, y la disección de los mecanismos por los cuales estos genes alteran la respuesta del huésped al estímulo medioambiental (antigénico, vírico, etc.) constituyen etapas clave para fomentar nuestro conocimiento de la patogénesis del asma.
IL-4 e IL-13 son citoquinas producidas por las células Th2, las células cebadas y los basófilos, y junto con señales procedentes de moléculas coestimulantes, inducen la producción de anticuerpos de tipo IgE por parte de las células B. Recientemente, un nuevo alelo de la cadena alfa del receptor interleuquina-4 (IL-4R) se ha relacionado con la susceptibilidad de la atopía en el hombre (Hershey et al., The Association of Atopy with a Gain-of-Function Mutation in the Subunit of the Interleukin-4 receptor, N. Engl. J. Med., 337, 1721-1725).
La variación alélica de la que se informa en Hershey provino de una sustitución adenina a guanina en el nucleótido 1902 del ADNc del receptor de IL-4, que predecía un cambio glutamina (Q) a arginina (R) en la posición 576 en el dominio citoplásmico de IL-4R. Este nuevo alelo se denomina la variación alélica "R576". A continuación, se ha informado de que el alelo R576 era dominante en pacientes con trastornos alérgicos inflamatorios y en adultos atópicos (Hershey et al., "Association of atopy with a novel IL-4 receptor alpha chain allele", FASEB, 12: resumen 6268).
A causa de que el asma puede convertirse en progresivamente más grave a lo largo del tiempo, es importante determinar los individuos que a una edad temprana son susceptibles a la enfermedad. Además, en los individuos que se han diagnosticado de asma, es clínicamente importante predecir la gravedad de su enfermedad a lo largo del tiempo. Así, lo que se requiere en la técnica es un mecanismo para determinar si un individuo presenta riesgo de asma. Además, es necesario asimismo un mecanismo para predecir la gravedad del asma de un individuo cuando éste envejece. La presente invención cumple dicho requerimiento.
Sumario de la invención
Las formas de realización de la presente invención se refieren al descubrimiento de que las variaciones alélicas del gen del receptor de interleuquina-4 que condujeron a un aumento en la señalización del receptor, resultaron (factores) pronósticos genéticos para el asma. Además, este aumento de las mutaciones en la señalización del receptor predijo la gravedad del asma en los individuos que padecen asma.
Más específicamente, descubrimos que el alelo R576 IL-4R juega un papel en el desarrollo del asma. Además, descubrimos que la presencia del alelo R576 IL-4R influye en la gravedad del asma en los individuos afectados. Nuestros experimentos mostraron que la presencia del alelo R576 se correlacionaba con la gravedad del asma en el hombre.
Específicamente, un individuo que es homocigótico para el alelo R576 presenta un riesgo mayor de padecer asma severa, cuando se compara con un individuo que es heterocigótico para el alelo R576, o bien posee sólo el gen de tipo salvaje del receptor de IL-4 (por ejemplo: homocigótico para el gen de tipo salvaje). A causa de que habitualmente no se conocen marcadores genéticos para la gravedad del asma, este descubrimiento tiene un potencial terapéutico importante.
Además, se identificaron otras variantes alélicas de la cadena alfa del receptor de IL-4. Se descubrió que los individuos que eran homocigóticos para las variantes del receptor de IL-4 que proporcionaban un aumento del nivel de la señalización del receptor, tenían un asma más grave que la de los individuos que eran heterocigóticos para las variantes del receptor, o que eran homocigóticos para el alelo de tipo salvaje.
De acuerdo con esto, las formas de realización de la presente invención se relacionaron con los procedimientos de determinación de la presencia en un individuo de riesgo de asma, analizando la estructura genética del individuo. Los individuos que son homocigóticos para un alelo del receptor de IL-4 que proporciona un aumento en la señalización del receptor, tienen más riesgo de padecer asma que los individuos que transportan sólo el alelo de tipo salvaje del receptor de IL-4.
Además, aquellos individuos que ya han sido diagnosticados de asma, pueden utilizar las formas de realización de la presente invención para predecir cómo de grave puede llegar a ser su asma a lo largo del tiempo. Tal como se informa a continuación, hemos descubierto que la gravedad del asma de un individuo está correlacionada con la presencia o ausencia de alelos del receptor de IL-4 que proporcionan un aumento de la señalización del receptor.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es un gráfico que muestra los resultados de un experimento en el que los individuos asmáticos se subdividieron en grupos respecto a su genotipo en el locus 576 de IL-4R. El porcentaje de pacientes en cada grupo con asma grave (triángulo hacia arriba) respecto al asma leve (triángulo hacia abajo) se muestra gráficamente. El asterisco significa una diferencia estadísticamente significativa (p= 0,015), El asma grave (valor basal de FEV1 \leq 60%) y el asma leve (valor basal FEV1 \geq 80%) se definieron según la "Guidelines for Diagnosis and Management of Asthma, Expert Panel report 2" (Normas para el diagnóstico y manejo del asma, Informe 2 del Grupo de Expertos).
La Figura 2 es un gráfico que muestra una comparación del volumen expiratorio forzado en un segundo (FEV1) entre individuos que tienen la cadena alfa del receptor de IL-4 de tipo salvaje, los que son heterocigóticos para la cadena alfa del receptor R576 IL-4, o que son homocigóticos para la cadena alfa del receptor de IL-4.
La Figura 3A es una fotografía de un gel que compara la sensibilidad de la fosforilación de Stat6 inducida por IL-4 en las progenies celulares B transformadas por EBV derivadas de individuos homocigóticos para R576 o Q576. La Figura 3B es un gráfico que muestra que la fosforilación máxima de Stat6 dependiente de IL-4 fue aproximadamente dos veces mayor en la progenie celular R576 comparada con la de las células Q576.
La Figura 4A es una fotografía de un gel que muestra el efecto de R576 en el curso del tiempo de la fosforilación de Stat 6 dependiente de IL-4. La Figura 4B es un gráfico que muestra los resultados de tres experimentos separados que utilizan cuatro progenies celulares distintas R576 y Q576 que se cuantificaron mediante densitometría. Los valores promedio y las desviaciones estándar (líneas de error) se calcularon para obtener los resultados de la Figura 4B.
La Figura 5 es un par de gráficos que muestran los resultados de transfectar células de linfoma de células B murinas con el ADNc IL-4R humano, tratando entonces las células control no transfectadas (Figura 5A) o las transfectadas (Figura 5B) con el IL-4 humano.
La Figura 6 es un gráfico lineal que muestra los resultados de un análisis Scatchard de la unión del IL-4 humano recombinante [^{125}I] a células murinas A201.1 transfectadas con el IL-4R humano. Se muestran dos clones representativos que expresan el tipo salvaje, (círculos) o variante (cuadrados) de los constructos Hu IL-4R.
Las Figuras 7A y 7B son gráficos que demuestran que la respuesta de los clones transfectantes al IL-4 humano permaneció en un 100% de la respuesta murina a lo largo del tiempo.
La Figura 8 es un gráfico lineal que demuestra que la variante polimórfica V75/R576 de IL-4R se asocia con un aumento de la sensibilidad de IL-4. Cuatro distintos clones transfectantes A201.1 que expresan el tipo salvaje I75Q576, (círculos cerrados), o la variante V75/R576 (círculos abiertos) de IL-4R, se trataron con dosis crecientes de IL-4 durante 48 horas, ensayándose entonces respecto a la expresión de CD23 mediante citometría de flujo, utilizando un anticuerpo anti-CD23 marcado con FITC.
Descripción detallada
Llevamos a cabo varios experimentos para determinar si la presencia y gravedad del asma se correlacionó con los individuos que presentan el alelo R576. Estos experimentos y resultados se muestran en los siguientes ejemplos. Brevemente, descubrimos que los individuos que presentaban riesgo de sufrir asma grave pueden identificarse rastreándolos para determinar si transportan un alelo del receptor de IL-4 que provoca niveles más altos que los normales de señalización del receptor en respuesta a la estimulación con IL-4.
En particular, descubrimos que las variantes alélicas R576 y V75 que causaron niveles mayores de señalización del receptor de IL-4, se correlacionaban asimismo intensamente con la gravedad del asma de un individuo. A partir de estos resultados, aquellos individuos que se descubrió que eran homocigóticos para los alelos R576 y V75, pueden identificarse tempranamente en el curso de su enfermedad y administrar tratamientos apropiados para alguien con un riesgo más alto de asma grave.
El régimen de potenciación del tratamiento podría retrasar o atenuar la gravedad o el comienzo del asma. Además, una intervención temprana puede proporcionar individuos con una mejor calidad de vida debido al retraso en el comienzo o a la reducción en la gravedad de esta enfermedad. Asimismo, los niños con un alto riesgo de asma grave pueden identificarse mediante el rastreo de estos alelos, pudiendo instituirse intervenciones medioambientales, que podrían retrasar, atenuar o evitar totalmente el comienzo del asma.
I. Cambios de señalización del alelo R576
La mutación sin sentido en el alelo R576 está asociada con una ganancia en la función del receptor de IL-4. Así, parece existir un aumento en la señalización en la unión del IL-4 al alelo R576, en comparación con la unión de IL-4 al receptor de IL-4 de tipo salvaje.
La mutación traduce un cambio desde una glutamina (Q) a una a arginina (R) en el dominio citoplásmico adyacente a un residuo clave de tirosina. El sitio de la sustitución de Q a R podría utilizarse como una diana para el nuevo desarrollo de agentes terapéuticos que podrían utilizarse para atenuar o regular por disminución la respuesta del IL-4. Estos agentes podrían ser útiles para cualquier proceso patológico que implique la inflamación alérgica o una respuesta de Th2.
El descubrimiento de que la variación alélica R576 tiene valor pronóstico de la gravedad del asma, puede ser útil para desarrollar medicamenntos que minimicen los efecto de esta enfermedad. Por ejemplo, hemos aprendido que la unión de IL-4 al alelo R576 da lugar a un nivel más alto de señalización celular, en comparación con la unión de IL-4 al receptor de tipo salvaje, tal como se considera a continuación.
Experimentos previos han encontrado que la molécula SHP-1 se une mucho menos intensamente al alelo mutante R576 que al alelo de tipo salvaje (véase Hershey et al.). Como es conocido, SHP-1 es una fosfotirosina fosfatasa implicada en la finalización de la señal en muchos sistemas citoquínicos, incluyendo el receptor de IL-4.
Así, con el descubrimiento de que el mutante R576 predice el asma, este descubrimiento puede utilizarse para descubrir medicamentos que, por ejemplo, aumenten el nivel de la unión de SHP-1 al receptor mutante IL-4. Estos medicamentos pueden así contrarrestar el efecto deletéreo del receptor mutante y proporcionar un beneficio médico a los pacientes.
A. Ejemplo 1
Estudio 1 de la correlación entre el alelo R576 y y el asma
Ciento cuarenta y nueve pacientes asmáticos adultos no relacionados, se reclutaron prospectivamente a partir de consultas alérgicas afiliadas a la University of Cincinnati Medical Center. El asma se diagnosticó de acuerdo con los criterios de la American Thoracic Society (ATS), demostrando un aumento del 12% o superior en la FEV1 después de un broncodilatador o después de un ensayo de 2 semanas con corticosteroides orales. El ensayo de la función pulmonar se llevó a cabo según las normas ATS revisadas en 1994 utilizando Pneumedics Dataloop (Norwalk, CT). Los individuos emprendieron pruebas de punción que incluían controles positivos y negativos, y un cuadro de 14 antígenos medioambientales habituales propios del valle de Ohio (A.L.K. Laboratories Inc., Wallingford, CT). Se les dieron normas para discontinuar los antihistamínicos antes de una prueba dérmica, de acuerdo con las normas publicadas.
Los pacientes se dividieron en grupos alérgicos y no alérgicos basados en los resultados de los ensayos dérmicos. Aquellos con reacciones positivas (ronchas \geq3 mm con eritema) a 1 o más antígenos ensayados se denominaron alérgicos. Los valores basales de FEV1 se utilizaron para clasificar los pacientes en grupos con asma leve, moderada y grave. Tal como se ha señalado en las Normas para el diagnóstico y manejo del asma, Informe 2 del Grupo de Expertos, aquellos con una FEV1 de base mayor que o igual al 80% de la predicha, se clasificaron como asma leve; aquellos con una FEV1 entre 60 y 80% de la predicha, se clasificaron como asma moderada; y aquellos con una FEV1 de base de menos del 60% de la predicha, se clasificaron como asma severa.
Existieron proporciones iguales (24%) de fumadores (historia presente o pasada) en los grupos de asma alérgicos y no alérgicos, y no existieron diferencias significativas en el fumar entre los grupos genotípicos. Para el grupo de control de los no asmáticos y no alérgicos, voluntarios sanos y no relacionados se reclutaron prospectivamente del conjunto de empleados de la University of Cincinnati Medical Center y del Children's Hospital Medical Center de Cincinnati. Se excluyeron de este grupo los individuos si informaban de una historia de alergias, asma, tos crónica, COPD, o de fumar. Emprendieron pruebas de punción tal como se ha comentado anteriormente, y aquéllos que no demostraron reacciones positivas (excluyendo la histamina) se incluyeron en el grupo de control. Se obtuvo autorización de todos los participantes en estos estudios. Estos estudios se aprobaron por el Comité de Revisión Institucional del Children's Hospital Medical Center.
Se llevó a cabo el aislamiento de células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMCs) y derivaciones de progenies de células B transformadas por el virus Epstein-Barr (EBV), según procedimientos estándar. La progenie de células del linfoma de Burkitt EBV-negativa, JBAB fue una donación del Dr. Elliot Kieff (Harvard Medical School, Boston). Las células se cultivaron en medio RPMI suplementado con suero bovino fetal al 10%, manteniéndose a 37ºC en una atmósfera de dióxido de carbono al 5%.
1. Análisis del polimorfismo conformacional monocatenario (SSCP)
El ADNc se derivó de las progenies celulares EBV o de PBMC utilizando un kit de transcripción inversa de Promega (Madison, WI) y se analizó mediante SSCP para los alelos Q576R IL-4R, tal como se describe en Hershey utilizando cebadores de Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, Iowa). Se utilizó una reacción en cadena de la polimerasa focalizada (PCR) para amplificar los nucleótidos 1840 a 2125 del ADNc alfa interleuquina-4, utilizando los siguientes cebadores:
5' GCCCA CACTG GAAGA ATTGT CTTAC'3 (con sentido) SEC ID nº:1
5' TTTTG GGGGT CTGGC TTGAG'3 (antisentido) SEC ID nº:2
como el par cebador externo. El par cebador interno fue:
5' CCGAA ATGTC CTCCA GCATG'3 (con sentido) SEC ID nº:3
5' CCAGT CCAAA GGTGA ACAAG GGG'3 (antisentido) SEC ID nº:4
La secuenciación final PCR se realizó con el sistema de secuenciación fmol de Promega (Madison, Wisconsin).
2. Ensayo (RFLP) del polimorfismo con una longitud del fragmento de restricción basado en PCR, para la detección de los alelos Q576 y R576
El ADN genómico aislado de la sangre completa anticoagulada con EDTA, utilizando el kit Genomic-Prep de Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ), se analizó respecto a la presencia de los alelos Q576 o R576 mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El cebador con sentido se construyó con una guanina en posición 1898, en vez de una timidina. Esto generó un sitio de restricción Pvul sólo en el alelo R576 que posee una guanina en la posición 1902 en vez de una adenina. Los cebadores utilizados fueron:
TCTCGG CCCCCACCAGTGGCGATC (antisentido) SEC ID nº:5
GAGGTCTTGGAAAGGCTTATAC (con sentido) SEC ID nº:6
La PCR se llevó a cabo en un volumen total de 50 \mul bajo las condiciones siguientes: 94ºC durante 20 segundos; 32 ciclos de 94ºC durante 20 segundos, 58ºC durante 30 segundos, y 72ºC durante 30 segundos; y entonces, 72ºC durante 5 minutos. Después de la amplificación PCR, 10 \mul del volumen original se digirieron con 5 unidades de Pvul (New England Biolabs, Beverly, MA) y los fragmentos se resolvieron en un gel NuSieve al 4% (FMC Bioproducts). Los alelos Q576 y R576 produjeron bandas de 209 y 186 pares de bases, respectivamente.
3. Resultados
Para discernir la función del alelo R576 en el asma, se determinó el genotipo en 149 individuos, tal como se ha descrito anteriormente. Los resultados se sumarizan en la Tabla 1. Las frecuencias alélicas para los alelos Q576 y R576 en esta población (n= 149) fueron 71 (211/298) y 29% (87/298) respectivamente, comparadas con el 81% (92/114) y el 19% (22/114) en el control del grupo de no asmáticos y no alérgicos (n= 57). Se apreció que existía una intensa asociación entre la homocigosidad para el alelo R576 y el asma, con un 13% (19/149) de los individuos asmáticos analizados siendo homocigotos para el R576, comparados con sólo el 1,7% (1/57) de los controles (p= 0,03, ji-cuadrado; riesgo relativo, 8,2).
Así, los individuos que poseen dos alelos de R576 tienen un riesgo relativo aumentado 8,2 veces respecto al asma, comparado con los individuos no homocigóticos para el R576. Ya que el alelo R576 está asociado con la atopía, la población asmática se subdividió en grupos alérgicos y no alérgicos, basándose en las pruebas de punción dérmica para 14 antígenos ambientales habituales, para revelar cualquier efecto del alelo R576, independiente de la atopía. Mediante este criterio, 107 (el 71,8%) de los 149 asmáticos se encontró alérgico y 42 (el 28,2%), no eran alérgicos, que se acerca a los informes publicados respecto a la preponderancia de la atopía en los pacientes asmáticos.
Existió una asociación significativa del alelo R576 con el asma alérgica (p=0,034, ji-cuadrado) tal como se esperaba, dada la conocida asociación con la atopía. Específicamente, la frecuencia del alelo para R576 fue del 31% (66/214) en el grupo de asma alérgica comparado con el 19% (22/114) en el grupo control. Además, la homocigosidad para el alelo R576 estuvo asociada intensamente con el asma alérgica (p=0,018, ji-cuadrado; riesgo relativo 9,8). De este modo, un individuo homocigoto para R576 posee un riesgo relativo aumentado 9,8 veces respecto al asma alérgica que un individuo con el genotipo Q/Q576 o Q/R576. En el grupo del asma alérgica, el 15% (16/107) de individuos eran homocigóticos para el R576, comparado con sólo el 1,7% (1/57) de los controles.
Se exploraron entonces relaciones potenciales entre las variantes alélicas R576 y Q576, explorándose entonces la gravedad del asma. Los valores FEV1 de base se utilizaron para clasificar los pacientes en grupos de asma leve, moderada y grave. Como se definió en las Normas para el diagnóstico y manejo del asma, Informe 2 del Grupo de Expertos, aquellos pacientes con una FEV1 basal mayor que o igual al 80% de la predicha, se clasificaron como asma leve; los pacientes con una FEV1 entre 60 y 80% de la predicha, se clasificaron como de asma moderada; y los pacientes con una FEV1 basal de menos del 60%, se clasificaron como de asma grave.
Los grupos de asma grave, leve y moderada se separaron entonces por su genotipo en el locus 576 de IL-4R (Figura 1). En el grupo homocigótico para el alelo Q576, no existieron diferencias significativas entre los números relativos de pacientes con asma grave, leve o moderada en el grupo. Sin embargo, en el grupo homocigótico para el alelo R576, el 52,6% (10/19) presentaba asma grave y sólo un 10,5% (2/19) presentaba asma leve (0=0,015, ji-cuadrado), demostrando una asociación significativa entre la gravedad del asma y la homocigosidad para el alelo R576. Además, el grupo heterocigoto que transportaba una copia del alelo R576 presentó un 36,7% (18/49) de asmáticos graves, un valor que está entre el apreciado en aquellos que transportaban dos copias de R576 (52,6%, 10/19) y los homocigotos Q576 (32,1%, 26/81). La proporción de asmáticos leves en el grupo heterocigótico (20,4%, 10/49) descendió entre el observado en los grupos Q/Q576 (27,1%, 22/81) y R/R576 (10,5%, 2/19).
Los valores promedio de la FEV1 de base para cada grupo se muestran en la tabla 2 y en la Figura 2. Una comparación de los valores promedio de FEV1 entre los grupos, reveló que el grupo homocigótico para R576 presentaba un promedio de la FEV1 de base significativamente inferior (57,8) cuando se comparó con el grupo homocigótico para el alelo Q576 de tipo salvaje, con un promedio = 67,5 (p<0,05). Los valores promedio de la FEV1 basal para los grupos R/R576, Q/R576, y Q/Q576 exhibieron la misma tendencia que los valores promedio de base (59, 66 y 70, respectivamente). Así, la homocigosidad para el alelo R576 está asociada con un fenotipo asmático grave, tal como se define por la FEV1 de base.
Las proporciones promedio FEV1/FVC fueron comparables en todos los grupos (tipo salvaje 0,67, heterocigoto 0,66, y homocigoto, 0,66). De forma interesante, los valores medio y promedio de la FEV1 de base en los heterocigotos, estuvieron entre los grupos homocigóticos Q576 y los homocigóticos R576. Así, la presencia del alelo R576 se correlaciona con la gravedad del asma.
B. Ejemplo 2
Evidencia de que el alelo R576 IL-4R está asociado con la potenciación de la señalización de IL-4
Tal como se ha considerado anteriormente, hemos mostrado que la variante R576 está asociada con el aumento de la sensibilidad de IL-4. Para determinar el efecto de la sustitución de Q576R en la señalización de IL-4, se comparó la sensibilidad de la fosforilación de Stat6 inducida por IL-4 en las progenies celulares B transformadas por EBV derivadas de homocigotos individuales para R576, con la señalización de IL-4 en los pacientes homocigóticos para el alelo Q576 (Figura 3).
Las progenies celulares transformadas por EBV derivadas de homocigotos individuales para R576 o Q576 IL-4R, se estimularon con dosis crecientes de IL-4 humana (hulL-4) durante 15 minutos. Los lisados celulares se analizaron entonces respecto a la fosforilación de Stat6 mediante inmunoprecipitación, seguida por inmunotransferencia. Las membranas de nitrocelulosa que se muestran en los 2 cuadros superiores de la Figura 3A, se sometieron a inmunotransferencia con un anticuerpo antifosfotirosina (4G10).
Tal como se ha indicado en los dos cuadros inferiores de la Figura 3A, las membranas idénticas se deshicieron y se volvieron a sondear con un anticuerpo anti-Stat6 para demostrar la carga idéntica de los carriles. Los resultados de 3 experimentos separados utilizando 4 distintas progenies celulares Q576 y R576 se cuantificaron mediante densitometría. Los valores promedio y las desviaciones estándar (líneas de error) se muestran en el cuadro B.
La presencia de la variante R576 estaba asociada con el aumento de la señalización de IL-4 (Figura 3A). La fosforilación máxima de Stat6 se alcanzó con ambas variantes IL-4R con una dosis de IL-4 de 5,0 ng. Sin embargo, la máxima fosforilación de Stat6 dependiente de IL-4 fue aproximadamente dos veces mayor en la progenie celular R576, comparada con las células Q576 (Figura 3B). Esta diferencia se reprodujo en 3 experimentos separados utilizando 4 distintas progenies celulares Q576 y R576, y fue estadísticamente significativa (p<0,001 para una dosis de 5,0 ng y p= 0,003 para 50 ng; ensayo t).
C. Ejemplo 3
El efecto de R576 sobre el curso temporal de la fosforilación de Stat6 dependiente de IL-4
Examinamos a continuación el efecto de R576 en el curso temporal de la fosforilación de Stat6 dependiente de IL-4 (Fig 4). Las células que expresaban las variantes R576 o Q576 mostraron una fosforilación máxima de Stat6 después de 15 a 30 minutos de la estimulación de IL-4.
Las progenies celulares transformadas por EBV se derivaron de homocigotos individuales para R576 o Q576 IL-4R. Las progenies celulares se estimularon con 10 ng/ml de huIL-4 durante los tiempos designados, analizándose entonces los lisados respecto a la fosforilación de Stat6 mediante inmunoprecipitación, seguido por inmunotransferencia. Tal como se muestra en la Figura 4A, las membranas de nitrocelulosa mostradas por los 2 cuadros superiores se sometieron a inmunotransferencia con un anticuerpo anti-fosfotirosina (4G10).
Las membranas idénticas se deshicieron y se volvieron a sondear con un anticuerpo anti-Stat6 para demostrar una carga idéntica de los carriles. Éstos se muestran en los 2 cuadros inferiores de la Figura 4A. En la Figura 4A, sólo se muestra un experimento representativo. Los resultados de 3 experimentos separados utilizando 4 distintas progenies celulares Q576 y R576 se cuantificaron mediante densitometría; los valores promedio y las desviaciones estándar (líneas de error) se muestran en la Figura 4B. La fosforilación de Stat6 se representa como el porcentaje de Stat6 fosforilada en cada carril, respecto a la cantidad total de Stat6 detectada en cada carril. Diferencias estadísticamente significativas, ensayo-t, se señalan con un asterisco. Q576: círculos; R576:cuadrados.
Tal como se muestra en los resultados de la Figura 4B, la variante R576 se asoció de nuevo con una magnitud mayor de la fosforilación de Stat6, cuando se comparó con las células de tipo salvaje. Esto fue más evidente a los 15 y 60 minutos, en los que la fosforilación de Stat6 dependiente de IL-4 en las células R576 no disminuyó hasta el nivel apreciado en las células Q576 (0=0,002 y 0,048, respectivamente).
Así, las progenies celulares transformadas por EBV que transportaban la variante R576, mostraron un aumento máximo de la fosforilación de Stat6 dependiente de IL-4, y una activación prolongada de Stat6, cuando se comparó con las células que poseían la variante Q576. Esto apoya la hipótesis de que el polimorfismo de R576 IL-4R altera la señalización de IL-4. Además, las diferencias más grandes entre las células que transportan Q576 y R576 coincidieron con la defosforilación de Stat6, sugiriendo que la sustitución de Q576R puede interferir con una etapa reguladora negativa en la vía de la desactivación de Stat6.
II. Otros alelos IL-4 se correlacionan con el asma
A. Ejemplo 4
Desarrollo de un modelo de transfección in vitro para analizar las consecuencias funcionales de las variantes de IL-4R
Además de la variante polimórfica R576 IL-4R, se han descubierto cinco polimorfismos adicionales de IL-4R. Una variante, I75V, se ha encontrado asimismo asociada con la presencia y gravedad del asma.
Como parte de nuestros experimentos para determinar cómo funcionaba IL-4R, dirigimos nuestra atención a las consecuencias funcionales de los polimorfismos aislados del IL-4R, y en combinaciones que representen haplotipos que existen naturalmente. Para dilucidar las consecuencias funcionales de cada sustitución de un aminoácido específico de IL-4R, independiente de otros polimorfismos, desarrollamos un sistema modelo de transfección. Se ha encontrado que IL-4 es absolutamente específico de especie. Así, el IL-4 humano se une solamente al IL-4R humano, y no al IL-4R murino. De modo similar, el IL-4 murino se une sólo al IL-4R murino.
Además, se ha comprobado que las células murinas transfectadas con el ADNc IL-4R humano ganan en capacidad para unirse y responder al IL-4 humano. Para determinar la función de las variantes alélicas, transfectamos el ADNc IL-4R humano de tipo salvaje (subclonado en pREP9, un vector de expresión de mamíferos), en la progenie celular del linfoma de células B murinas, A201.1 (ATCC), mediante electroporación, obteniéndose transfectantes estables después de 2 semanas de selección antibiótica en presencia de 1000 g/ml de G418.
Específicamente, las células A201.1 se transfectaron con 20 g de ADNc IL-4R humano en el vector de expresión pREP9. Después de llevar a cabo la selección antibiótica, los transfectantes se ensayaron respecto a su capacidad para responder al IL-4 murino y humano. La Figura 5A muestra los resultados de células no transfectadas, mientras que la Figura 5B muestra los resultados de experimentos sobre células transfectadas. Tal como se muestra en la Figura 5A, las células se incubaron durante 48 horas en presencia de sólo medio (línea punteada), de 50 ng/ml de IL-4 humano (línea en negrita), o de 50 ng/ml de IL-4 murino (línea continua) durante 48 horas, ensayándose entonces respecto a la expresión mediante citometría de flujo utilizando un anticuerpo anti-CD23 marcado con FITC.
Las células A201.1 se escogieron para nuestros estudios, a causa de que exhibían una respuesta positiva intensa al IL-4 murino (Figura 5A). Las células que estaban transfectadas con éxito, adquirieron la capacidad para responder al IL-4 humano (Figura 5B), mientras que las células no transfectadas permanecían sólo sensibles al IL-4 murino.
La expresión de CD23 en los transfectantes era casi equivalente después de la estimulación con el IL-4 murino y humano, sugiriendo que la expresión del IL-4R humano en las células transfectadas se aproximaba al del receptor murino endógeno. Para asegurar que los transfectantes expresaban niveles similares de IL-4R, los conjuntos de células transfectantes se clonaron mediante dilución limitante. Se aislaron un mínimo de 3 clones por constructo, basándose en la expresión de CD23 inducida por IL-4, que se aproximó a la respuesta murina endógena. Mediante análisis Scatchard se confirmaron niveles casi iguales de la expresión de IL-4R humano y de la de IL-4R murino
(Figura 6).
Tal como se muestra en la Figura 6, se muestran dos clones representativos que expresan los constructos HulL-4R IQ, de tipo salvaje, (círculos) o VQ (cuadrados). Ambos clones expresaron entre 1600 y 1900 receptores/célula con una Kd de entre 1,5 y 2,0 x 10^{-9} M^{-1}.
Esto establece que los clones utilizados para el análisis expresan niveles similares del IL-4R superficial humano, y valida las comparaciones propuestas entre los clones. Utilizando el análisis Scatchard, se determinaron asimismo los valores Kd para las variantes IL-4R humanas transfectadas, tal como se demuestra en la Fig 6. No existió diferencia en las afinidades de unión para el IL-4 humano, entre estos dos clones. De este modo, la mutación V75 no alteró la afinidad de unión de IL4R para IL-4.
El IL-4 murino indujo la expresión de CD23 igualmente bien en las células no transfectadas que en las células transfectadas. De acuerdo con esto, la sobreexpresión del IL-4R humano no interfirió con la expresión de o la señalización a través del IL-4R murino endógeno. Ya que ambos, el IL-4R murino endógeno y el IL-4R transfectado humano utilizan la cadena c murina endógena, estos datos indican que la cadena c no es limitante.
En las Figuras 7A y 7B, la respuesta del clon transfectante al IL-4 humano permaneció al 100% de la respuesta murina a lo largo del tiempo. Las células A201.1 transfectadas establemente con el IL-4R humano, se incubaron durante 48 horas en presencia de sólo el medio (línea de puntos), de 50 ng/ml del humano (línea en negrita), o de 50 ng/ml de IL-4 murino (línea continua) durante 48 horas, ensayándose entonces respecto a la expresión de CD23 mediante citometría de flujo, utilizando un anticuerpo anti-CD23 marcado con FITC. Se expone un clon representativo.
La estabilidad y homogeneidad de la expresión del IL-4R humano mediante los clones transfectantes ha permanecido estable durante varios meses en cultivo. Asimismo, hemos comprobado la estabilidad del nivel de expresión mediante el análisis Scatchard. Los clones continúan expresando aproximadamente 1800 receptores/célula después de 3 a 9 meses en cultivo.
B. Ejemplo 5
Generación y transfección de constructos ADNc IL-4R humanos en células A201.1 murinas
Cada uno de las seis variantes polimórficas conocidas de IL-4R proviene de una distinta mutación sin sentido. Generamos cinco de las mutaciones sin sentido en el ADNc IL-4R mediante la mutagénesis sitio-dirigida utilizando el kit de mutagénesis QUICKCHANGE (Stratagene, San Diego, CA). Este dato se sumariza a continuación en la Tabla III. La secuencia de tipo salvaje, y la totalidad de los 5 constructos mutantes se comprobó mediante secuenciación, y se subclonaron en el vector de expresión pREP9 de mamíferos (Invitrogen).
TABLA III Generación y transfección de constructos ADNc IL-4R utilizados para analizar los polimorfismos de IL-4R
Constructo Mutagénesis Sec. MUT Sec. WT Transfectado
ADNc IL-4R sitio-dirigida confirmada confirmada en células A201.1
Ile75Val + + + +
Glu400Ala + + + -
Cys431Arg + + + -
Ser436Leu - - - -
Gln576Arg + + + +
Ser786Pro + + + -
A (+) indica que la acción se ha llevado a cabo con éxito.
Los constructos I75Q576 (de tipo salvaje), I75R576, y V75Q576 se transfectaron establemente con éxito en las células A201.1. Los análisis Scatchard han confirmado que todos los transfectantes expresan niveles similares de IL-4R humano superficial, aproximadamente 1500-2000 receptores/célula. Además, todas las variantes estudiadas mostraron similares constantes de afinidad para el IL-4 humano (Figura 6), y de este modo, las mutaciones aisladas Q576R o I75V no afectan a la afinidad de unión del ligando del IL-4R humano.
C. Ejemplo 6
Generación de variantes que tienen variaciones alélicas múltiples
Para examinar combinaciones de las variantes alélicas, generamos constructos que contienen 2 ó 3 de las mutaciones polimórficas. Hemos generado con éxito transfectantes estables que expresan la combinación V75R576 IL-4R. En contraste con el R576 o el V75 en aislamiento, la combinación de V75 y R576 juntos dieron lugar a un aumento en la sensibilidad de IL-4, como se evidencia por el aumento de la sensibilidad del transfectante V75/R576 respecto IL-4 comparado con el tipo salvaje (I75/Q576) (Figura 8).
Tal como se muestra en la Figura 8, la variante polimórfica V75/R576 de IL-4R está asociada con el aumento de la sensibilidad de IL-4. Cuatro distintos clones transfectantes A201.1 que expresan el tipo salvaje I75Q576, (círculos cerrados), o la variante V75/R576 (círculos abiertos) de IL-4R, se trataron con dosis crecientes de IL-4 durante 48 horas, ensayándose entonces respecto a la expresión de CD23 mediante citometría de flujo, utilizando un anticuerpo anti-CD23 marcado con FITC. La expresión de CD23 se representa como un porcentaje de la respuesta máxima alcanzada con el IL-4 murino a través del receptor endógeno. Los resultados se expresan como los promedios y las desviaciones estándar (líneas de error) de 3 experimentos que analizan 4 clones que expresan cada variante del transfectante.
Los datos presentados en la Figura 8 representan los promedios y las desviación estándar de 3 experimentos separados utilizando 4 clones diferentes de los transfectantes V75/R576 y de (I75/Q576) de tipo salvaje. Estos datos, combinados con nuestros datos genéticos, que demuestran que R576 se correlaciona con la gravedad del asma, validan nuestra hipótesis central de que los polimorfismos múltiples de IL-4R alteran la señalización de IL-4, y que, cuando se encuentran en combinación, actúan de forma concertada para determinar el estado funcional completo de IL-4R y el fenotipo asmático.
D. Ejemplo 7
Detección de las variantes alélicas IIe75 y Val75
Se aisló ADN genómico de individuos que se sabía eran homocigóticos para el alelo I75 de tipo salvaje de IL-4R, homocigótico para el alelo variante V75, o heterocigótico (I75/V75). El ADN genómico se amplificó mediante PCR utilizando los siguientes cebadores exónico 3' e intrónico 5', bajo condiciones estándar PCR:
5'-GGAAGAGTCTGATGCGGTTCC-3' SEC ID nº: 7
cebador hacia adelante nº 21
5'-CAGCCCACAGGTCCAGTGTATAG-3' SEC ID nº: 8
cebador hacia atrás nº 23
Estos cebadores amplificaron un fragmento de 207 pares de bases que contenía el polimorfismo de I75V. La digestión ulterior de este fragmento con Msll dio lugar a fragmentos de 164 y 43 pares de bases en presencia del alelo I75; y de bandas de 98, 66 y 43 pares de bases en presencia del alelo V75, porque la sustitución da lugar a un sitio Msll adicional en el alelo V75. En el caso del heterocigoto, se detectan la totalidad de 4 bandas (de 164, 98, 66 y 43 pares de bases). Este ejemplo proporciona un mecanismo rápido y exacto para detectar la presencia del alelo V75 en un individuo.
E. Ejemplo 8
Detección de las variantes alélicas Cys431 y Arg431
Se aisló ADN genómico de individuos que se sabía eran homocigóticos para el alelo Cys431 de tipo salvaje de IL-4R, homocigótico para el alelo variante Arg431, o heterocigótico (Cys431/Arg431). El ADN genómico se amplificó mediante PCR utilizando los siguientes cebador 5' y el par de cebadores 3', bajo condiciones PCR estándar:
5'-GAAAAAGGGAGCTTCTGTGCATC-3' SEC ID nº: 9
cebador hacia adelante nº 23
5'-CGTCTCTGTGCAAGTCAGGTTGTC-3' SEC ID nº: 10
Cebador hacia atrás nº 24
El alelo Arg431, utilizando el par de cebadores anteriormente citados, crea un sitio Tsp45I que no se encuentra en el alelo de tipo salvaje. Así, la restricción del producto amplificado con Tsp45l da lugar a los siguientes fragmentos:
alelo Cys: 1 fragmento-tamaño de 324 pares de bases
alelo Arg: 2 fragmentos-tamaño de 175 y 149 pares de bases
Heterocigoto: 149 pares de bases, 175 pares de bases, 324 pares de bases
Así, el ejemplo anterior proporciona un mecanismo para determinar rápidamente si un individuo es homocigótico para el alelo Cys431, heterocigótico para los alelos Cys431/Arg431, u homocigótico para el alelo Arg431.
\newpage
F. Ejemplo 9
Detección de las variantes alélicas Ser786 y Pro786
Se aisló ADN genómico de individuos que se sabía eran homocigóticos para el alelo Ser786 de tipo salvaje de IL-4R, homocigótico para el alelo variante Pro786, o heterocigótico (Ser786/Pro786). El ADN genómico se amplificó mediante PCR utilizando los siguientes cebador 5' y el par de cebadores 3' bajo condiciones estándar PCR:
5'-AACAGTGTCATGGCCAGGAGGATG-3'' SEC ID nº: 11
cebador hacia adelante nº 24
5'-TCCCACGGAGACAAAGTTCACG-3' SEC ID nº: 12
Cebador hacia atrás nº 22
Utilizando la restricción D del sobre los fragmentos PCR amplificados a partir de los individuos que son homocigóticos para el alelo Ser786, heterocigóticos para los alelos Ser786/Pro786, u homocigótico para el alelo Pro786, da lugar a los fragmentos siguientes:
Alelo Ser: 102 pares de bases, 80 pares de bases
Alelo Pro: 130 pares de bases, 102 pares de bases
Heterocigoto: 130 pares de bases, 102 pares de bases, 80 pares de bases
Así, mediante la amplificación PCR del ADN genómico de un individuo utilizando el par de cebadores al que anteriormente se ha hecho referencia, se puede determinar rápidamente qué alelo se encuentra en un individuo.
G. Ejemplo 10
Descubrimiento de compuestos que promueven la unión de SHP-1 a R576
Se llevaron a cabo ensayos de unión para determinar compuestos que promueven la unión de SHP-1 al alelo R576. Se utilizaron los siguientes péptidos sintéticos que corresponden al sitio de unión de Y575 SHP-1 sobre el receptor de IL-4:
NH_{3}-SAPTSG(pY)QEFVHAVE-COOH SEC.ID nº: 13
(Sitio de unión del SHP-1 fosforilado de tipo salvaje)
NH_{3}-SAPTSG(pY)REFVHAVE-COOH SEC.ID nº: 14
(Sitio de unión del SHP-1 R576 fosforilado)
Los péptidos se conjugan a perlas de Affigel 10 (BioRad Laboratories, Hercules, CA), a razón de 3 mg de péptido por mililitro de las perlas.
Para determinar un nivel basal de unión de las proteínas celulares SHP-1 a los péptidos receptores de tipo salvaje de la interleuquina-4 sintética, 20 \mul de perlas conjugadas con el péptido de tipo salvaje se incubaron con lisados de células-BJAB (2 x 10^{7} células) y se analizaron entonces respecto a la presencia del péptido asociado SHP-1, mediante inmunotransferencia con un antisuero específico contra SHP-1. El antisuero antihumano SHP-1 de conejo se ha descrito previamente por Matthews et al. (Mol. Cell. Bio., 12: 2396-2405, 1992).
Para determinar un nivel basal de unión de las proteínas celulares SHP-1 a los péptidos receptores R576 de la interleuquina-4 sintética, 20 \mul de perlas conjugadas con el péptido R576 se incubaron con lisados celulares-BJAB (2 x 10^{7} células) y se analizaron entonces respecto a la presencia del péptido asociado SHP-1, mediante inmunotransferencia con un antisuero específico contra SHP-1. Se comprobó que el nivel de unión de SHP-1 a los péptidos de tipo salvaje es aproximadamente el doble del nivel de unión a los péptidos conjugados a R576.
El compuesto X, sospechoso de aumentar la unión de SHP-1 a la proteína del receptor de IL-4, se mezcla con lisados celulares- BJAB (2 x 10^{7} células). Esta mezcla se incuba con 20 \mul de perlas conjugadas con el péptido R576. Se mide el nivel de unión de SHP-1 con los péptidos mutantes R576 de IL-4, en el que un nivel alto de unión indica que el Compuesto X constituye un candidato potencial para tratar el asma.
III. Stat-6 juega un papel crucial en el asma
Se sabe que el factor de transcripción Stat-6 juega un papel crucial en el desarrollo de la señalización mediada por el receptor de IL-4. Una compañía, Tularik, ha preparado ratones "noqueados" que han perdido completamente su capacidad para producir el factor Stat-6. Se encontró que estos ratones no poseían la capacidad para producir IgE en respuesta a una estimulación de IL-4. Presumiblemente, la capacidad para eliminar o reducir clínicamente los niveles de Stat-6 en el hombre podría conducir a un tratamiento para el asma grave.
Sin embargo, para descubrir dicho tratamiento, sería importante identificar todos los alelos del receptor de IL-4 que está unidos por Stat-6. Por ejemplo, un candidato particular del medicamento podría derogar la señalización de Stat-6 en células que tuvieran receptores de IL-4 de tipo salvaje, pero ser completamente ineficaz para evitar la señalización de Stat-6 en las células mutantes R576. Así, es importante para las pruebas que vayan a realizarse, que ensayen la señalización de Stat-6 con la totalidad de los alelos de IL-4.
A. Ejemplo 11
Determinación de los niveles de señalización de Stat-6 de los receptores de IL-4
Se sabe que el factor Stat-6 es fosforilado al unirse la interleuquina 4 al receptor de IL-4. Por tanto, se podría ensayar el Stat-6 fosforilado como una medida de la señalización del receptor de IL-4.
Por ejemplo, las células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC) se extraen de un paciente del que se sabe es homocigótico para el alelo R576. Las PBMC se extraen también de un paciente del que se sabe que es homocigótico para el receptor de IL-4 de tipo salvaje. Las células se tratan con una dosis activante de IL-4. Después de incubación con IL-4, se mide el nivel de fosforilación de Stat-6 mediante técnicas convencionales, como medida de la señalización del receptor de IL-4.
Una vez que este nivel basal de señalización se ha establecido, un compuesto del que se sospeche que (puede) constituir un tratamiento efectivo para el asma, se mezcla con IL-4 y se pone en contacto con las PBMC que tienen receptores de IL-4 mutantes R576 y, (asimismo), de tipo salvaje. Comparando los niveles de Stat-6 en presencia y ausencia del compuesto, se puede determinar si el compuesto sería efectivo para el tratamiento del asma. A causa de que el alelo R576 se encontró en más del 20% de los pacientes humanos ensayados, es muy importante probar tratamientos potenciales del asma respecto a su actividad, tanto con los receptores mutantes R576 como con los de tipo salvaje.
En un experimento adicional relacionado, el alelo R576 puede insertarse en células B de ratón, tales como las de la progenie celular A201.1 descritas anteriormente. Las células B de ratón expresarán entonces el receptor de IL-4 humano mutante en su superficie. Las células de ratón serán entonces activadas por el IL-4 humano sólo a través del receptor R576 humano. Como es conocido, los receptores del ratón no son activados por el IL-4 humano. Por tanto, puede crearse una progenie celular que se señaliza en respuesta al IL-4, sin que exista un cruzamiento con la señalización procedente de otros receptores relacionados. Con este sistema, puede estudiarse la actividad particular del alelo R576.
En un experimento, las células A201.1 se transfectan mediante técnicas estándar con el gen del receptor de IL-4 humano R576. Estos genes se expresan entonces en la superficie de la progenie celular del ratón. Se lleva a cabo una comparación entre la activación de las células B del ratón en presencia de sólo IL-4, o de IL-4 y de un compuesto del que se sospeche que tiene efecto sobre el asma. Una diferencia en la señalización de las células del ratón en presencia del compuesto, cuando se compara con el nivel de señalización de IL-4 sin el compuesto, indica que éste constituye un agente terapéutico potencial para tratar el asma.
IV. Conclusión
La naturaleza familiar del asma está bien establecida. Existe una evidencia creciente de que muchos genes distintos tienen influencia en el desarrollo del asma. Los hallazgos presentes demuestran que la presencia de los alelos del receptor de IL-4 se correlaciona con la presencia del asma, y con la gravedad del asma en los individuos. Una o dos copias del R576 se asociaron con un asma más grave, tal como se define por la FEV1 basal cuando se compara con un grupo asmático homocigótico para el alelo Q576 del tipo salvaje.
La homocigosidad para R576 se asoció significativamente con el asma y representó un riesgo relativo 8,2 veces superior para que el asma se presentase y un riesgo relativo 9,8 veces superior para el asma atópica, comparado con Q576. Se sugirió un efecto de dosificación génica, tanto en términos de fenotipo asmático como de preponderancia. Dos copias de R576 se asociaron con un aumento en la preponderancia y gravedad del asma, cuando se comparó con una copia. Esto se mostró por el grupo heterocigoto R/Q576, que tenía valores FEV1 medios y promedios intermedios, comparado con los grupos Q/Q576 y R/576, y contenía proporciones intermedias de asmáticos leves y graves, comparados con los dos grupos homocigóticos.
Se ha mostrado previamente que el alelo R576 altera las interacciones entre Y575 y el dominio SH2 que contiene tirosina fosfatasa, SHP-1, que se ha mostrado recientemente que regula por disminución la señalización de IL-4. IL-4R contiene 5 residuos conservados de tirosina en su dominio citoplásmico, uno de los cuales, Y713, forma parte de una secuencia de reconocimiento ITIM (motivo inmunorreceptor inhibitorio basado en la tirosina), y se ha implicado como un sitio de acoplamiento para SHP-1. Ya que SHP-1 contiene 2 dominios SH2, Y575 e Y713 pueden actuar de forma concertada para reclutar SHP-1, conduciendo a la finalización de la señalización de IL-4.
Una disminución en la eficiencia de la interacción entre IL-4R y SHP-1, debida a la sustitución Q a R adyacente a Y575, podría conducir a una falta de regulación de las respuestas de IL-4. Este puede ser un mecanismo que subyace a la predisposición genética conferida por R576. Si este es el caso, los transfectantes que expresan Q576 o R576 pueden examinarse respecto a cambios en la tasa de recambio o defosforilación de Stat-6 y de otros intermediarios de la señalización. Podemos asimismo determinar los efectos de los polimorfismos de IL-4R sobre otras moléculas señalizadoras importantes en la vía de transducción de la señal a IL-4, tales como las quinasas JAK, que se han implicado como sustratos de SHP-1.
Como se ha mencionado anteriormente, se ha informado de otros cinco polimorfismos de IL-4R, y uno de éstos, lle75, se encontró asociado con el aumento en la señalización de IL-4 y en la gravedad del asma.
La homocigosidad para R576 representa un aumento de 8,2 veces del riesgo relativo para padecer asma, y se asocia con un aumento de la gravedad del asma. La asociación de R576 con la gravedad del asma mediante la determinación de su genotipo IL-4R576, seguido por un estrecho seguimiento médico y una intervención farmacológica y/o ambiental tempranas, puede retrasar, atenuar, o evitar la progresión de la enfermedad. En los adultos identificados como "de riesgo" de asma grave en el momento del diagnóstico, el estrecho seguimiento médico y la temprana institución de la terapia, puede alterar su desenlace clínico.
TABLA 1
Frecuencia de los alelos R576 y Q576 del receptor alfa IL-4 alfa, en el asma alérgica, el asma no alérgica,
y los grupos de control
Población Genotipo
Q576/Q576 Q576/R576 R576/R576
Asmáticos Individuos: \hskip1cm Total 149
\hskip0.5cm Número 81 49 19
\hskip0.5cm Porcentaje 54% 33% 13%*
Alelos: Total 298 Q576 R576
\hskip0.5cm Número 211 87+
\hskip0.5cm Frecuencia alélica 71% 29%
Alérgicos Asmáticos: \hskip1cm Total 107
\hskip0.5cm Número 57 34 16
\hskip0.5cm Porcentaje 53% 32% 15%**
Alelos: Total 214 Q576 R576
\hskip0.5cm Número 148 66#
\hskip0.5cm Frecuencia alélica 69% 31%
No alérgicos Asmáticos: \hskip1cm Total 42
\hskip0.5cm Número 24 15 3
\hskip0.5cm Porcentaje 57% 36% 7%
Alelos: Total 84 Q576 R576
\hskip0.5cm Número 63 21^
\hskip0.5cm Frecuencia alélica 75% 25%
Controles: Total 57
\hskip0.5cm Número 36 20 1
\hskip0.5cm Porcentaje 63% 35% 1.7%
Alelos: Total 114 Q576 R576
\hskip0.3cm Número 92 22
\hskip0.3cm Frecuencia alélica 81% 19%
^{*} Asociación de homocigosidad para R576 y asma; p=0,03, ji- cuadrado; riesgo relativo, 8,2.
^{**} Asociación de homocigosidad para R576 y asma alérgica p=0,017, ji-cuadrado; riesgo relativo, 9,8.
# Asociación del alelo R576 y atopía; p=0,034, prueba de ji-cuadrado.
^{+} Asociación del alelo R576 y el asma; p=0,056 prueba de ji-cuadrado.
^ Asociación del alelo R576 y el asma (independiente de atopía); p=0,431, prueba de ji-cuadrado.
TABLA 2
Efecto de las variantes alélicas R576 y Q576 IL-4R\alpha en la gravedad del asma.
Genotipo
Grupo del asma Q576/Q576 Q576/R576 R576/R576
Leve (FEV1>80%) 22 (27,1%) 10 (20,4%) 2 (10,5%)
Moderada (FEV1 60-80%) 33 (40,7%) 21 (42,9%) 7 (36,8%)
Grave (FEV1<60%) 26 (32,1%) 18 (36,7%) 10 (52,6%)
Valor p para asma grave respecto a leve 0,6 0,118 0,015^{**}
Q576/Q576 Q576/R576 R576/R576
FEV1 promedio (% predicho) 67,5 66 57,8
valor p, ensayo t NA 0,667 0,049^{*}
media de FEV1 (% predicho) 70 66 59
valor p, ensayo t NA 0,246 0,025^{*}
<110> Children's Hospital Research Foundation Hershey, Gurjit K. K.
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<120> Procedimiento para determinar la susceptibilidad al asma
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<130> CHMC6.001A
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<150> 60/111,936
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<151> 1998-12-11
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<160> 14
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<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0
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<210> 1
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<211> 25
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens 
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<400> 1
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gcccacactg gaagaattgt cttac 
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25 
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ttttgggggt ctggcttgag 
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ccgaaatgtc ctccagcatg 
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20 
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<211> 23
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ccagtccaaa ggtgaacaag ggg 
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23 
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<210> 5
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<213> Homo sapiens 
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<400> 5
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tctcggcccc caccagtggc gatc 
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24 
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gaggtcttgg aaaggcttat ac 
\hfill
22 
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<211> 21
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<212> DNA
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21 
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cagcccacag gtccagtgta tag 
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<210> 9
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24 
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<212> DNA
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<400> 13
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\sa{Ser Ala Pro Thr Ser Gly Tyr Gln Glu Phe Val His Ala Val Glu}
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<211> 15
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
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\sa{Ser Ala Pro Thr Ser Gly Tyr Arg Glu Phe Val His Ala Val Glu}
\vskip1.000000\baselineskip

Claims (7)

1. Procedimiento in vitro para predecir la gravedad del asma en un individuo, que comprende:
analizar una muestra biológica procedente de un individuo respecto a la presencia de una variante alélica R576 del receptor de IL-4,
en la que la variante alélica R576 proporciona una intensa señalización del receptor, en comparación con el receptor de IL-4 de tipo salvaje, y en la que dicha presencia de la variante alélica R576 en el individuo indica la gravedad del asma en el paciente.
2. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la presencia de la variante alélica en el individuo comprende la presencia de un conjunto homocigótico de las variantes alélicas.
3. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el análisis de la muestra biológica comprende la reacción en cadena de la polimerasa.
4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el análisis de la muestra biológica comprende el análisis del polimorfismo conformacional monocatenario.
5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el análisis de la muestra biológica comprende la detección de un alelo V75 del receptor de IL-4.
6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha muestra biológica comprende ADN genómico.
7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha muestra biológica es una muestra de sangre.
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