ES2249759T3 - Anticuerpos monoclonales y fv especificos para antigeno cd2. - Google Patents
Anticuerpos monoclonales y fv especificos para antigeno cd2.Info
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Abstract
Un anticuerpo monoclonal monocatenario humanizado quimérico que tiene afinidad de unión específica para antígeno CD2, estando el anticuerpo monoclonal seleccionado del grupo constituido por: (a) anticuerpo monoclonal quimérico SFv-Ig CD2 obtenible por expresión del constructo clonado en cultivo de Escherichia coli recombinante ATCC nº 69.277; y (b) un anticuerpo monoclonal que puede competir con SFv-Ig CD2 obtenible por expresión del constructo clonado en cultivo de Escherichia coli recombinante ATCC nº 69.277 para unión a antígeno CD2 con una eficacia de al menos
Description
Anticuerpos monoclonales y Fv específicos para
antígeno CD2.
La presente invención se dirige a anticuerpos
monoclonales y a Fv que se unen específicamente a antígeno CD2 y al
uso de dichos anticuerpos monoclonales en la prevención de la
producción de virus de inmunodeficiencia humana
(VIH-1) en células T infectadas por
VIH-1.
El síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA)
se ha convertido en una de las enfermedades más temidas de la última
parte del siglo XX. Sólo en los Estados Unidos, cada año se
diagnostican aproximadamente 40.000 casos nuevos de SIDA, y al
menos se han producido 200.000 casos desde que la enfermedad fue
reconocida en 1981 aproximadamente. Se cree que entre 1 millón y 1,5
millones de estadounidenses están infectados por
VIH-1, lo que significa que están en riesgo de
desarrollar SIDA y es probable que lo hagan salvo que pueda
encontrarse un medio para prevenir el desarrollo de la dolencia de
forma abierta en pacientes infectados por el virus. En todo el
mundo, el número de casos de SIDA se cifra en millones, teniendo
ciertas zonas de África y el Caribe las tasas más altas de
infección.
Hasta ahora, aunque la cantidad de dinero
invertida para la investigación del SIDA es igual o superior a la
invertida en la investigación de enfermedades como el cáncer y la
enfermedad cardiovascular, todavía no existe cura disponible y la
enfermedad se considera letal uniformemente. Aunque se han
desarrollado varios tratamientos que parecen frenar la progresión de
la enfermedad, al menos en algunos pacientes, como los fármacos
azidotimidina (AZT) y didesoxinosina (DDI), estos tratamientos se
contemplan sólo como paliativos. No funcionan en todos los
pacientes, y su eficacia tiende a reducirse con el curso de la
enfermedad. Así, se necesitan urgentemente tratamientos adicionales
para el SIDA.
En general se cree que para el desarrollo del
SIDA se requiere la infección con el virus de inmunodeficiencia
humana (VIH-1), aunque otros factores pueden
contribuir al establecimiento y el avance de la enfermedad, dado que
la enfermedad se asocia a menudo con el consumo de drogas y con la
exposición a otros patógenos que pueden contribuir a o potenciar
los efectos inmunosupresores. El VIH-1 es un
retrovirus de la familia de los lentivirus. Como otros retrovirus,
su ciclo vital implica transcripción inversa e incorporación del
genoma de ARN viral como ADN en el genoma de la célula T infectada.
La activación del virus produce la transcripción y traducción,
conduciendo a la producción del virus y a la depleción de las
células T CD4^{+}.
Una de las características del SIDA es la
presencia de infecciones oportunistas. Estas infecciones incluyen
diarrea causada por varias especies bacterianas, tuberculosis
causada por micobacterias aviares y bovinas, infecciones virales
como infección por citomegalovirus y herpes zoster causado por
herpesvirus, infecciones fúngicas como candidiasis, aspergilosis e
histoplasmosis, e infecciones protozoarias como toxoplasmosis y
neumonía por Pneumocystis. Estas infecciones son
frecuentemente la causa real de muerte en pacientes con SIDA, y
causan gran morbilidad incluso cuando no son fatales. Aunque
existen tratamientos para una serie de estas infecciones
oportunistas, como pentamidina aerosolizada para neumonía por
Pneumocystis, estos tratamientos a menudo son infructuosos
debido a la salud general de los pacientes y a su resistencia
reducida a la infección que conlleva el SIDA en sí.
Así, se requieren procedimientos mejorados para
tratar dichas infecciones.
Como otros lentivirus, el VIH-1
puede permanecer latente dentro del ADN de linfocitos T CD4^{+}
infectados, a menudo durante largos períodos. Esta latencia no se
conoce bien, pero probablemente depende del estado de activación de
la célula T CD4^{+} del huésped (Z.F. Rosenberg & A.F. Fauci,
"Minireview: Induction of Expression of HIV in Latently or
Chronically Infected Cells", AIDS Res. Hum. Retro.
5:1-4 (1989)).
La activación de células T depende de un esquema
complejo de interacciones entre ellas y otras células diseñadas como
células presentadoras de antígeno (APC). Estas interacciones están
mediadas por unión específica entre moléculas de la superficie
celular de las células T y moléculas de las superficies de las APC.
Una interacción semejante se produce entre CD2 en la superficie de
las células T y su ligando LFA-3 en APC. La
molécula CD2, cuando se reticula con anticuerpos
anti-CD2, es capaz de activar directamente células
T. El ligando LFA-3 se refiere también como
contrarreceptor. Otros pares receptor/contrarreceptor son
ICAM-1/CD18 y CD28/B7.
Una de las paradojas que ha complicado el
esfuerzo de conocer el SIDA y el esfuerzo de tratar las infecciones
oportunistas asociadas con él es el hecho de que los intentos de
que los linfocitos infectados con VIH-1 respondan a
organismos responsables de infecciones oportunistas llevan a una
producción aumentada de virus VIH-1 por células
infectadas. Esto se muestra por resultados que indican que la
respuesta a la enterotoxina estafilocócica ("superantígeno" o
"SAg") aumenta la producción de VIH-1 de
células infectadas in vitro.
Queda mucho por conocer sobre la activación de
producción de VIH-1 en linfocitos infectados.
Diversos estímulos para los que se ha demostrado que inducen
producción de VIH-1 por líneas de células T
infectadas incluyen los siguientes: (1) antígenos de células T; (2)
mitógenos; (3) diversas citoquinas como TNF\alpha, IL1- e
IL-6; y (4) otros virus (Rosenberg y Fauci (1989),
más arriba; Z.F. Rosenberg y A.F. Fauci, "Activation of Latent
HIV Infection", J. NIH Res., 2:41-45
(1990)).
Sin embargo, se sabe relativamente poco de los
mecanismos que activan la expresión de VIH-1 en
células T CD4^{+} que contienen provirus VIH-1
integrados.
En consecuencia, existe una necesidad de un
procedimiento de supresión o bloqueo de producción de
VIH-1 sin alterar acusadamente las funciones
inmunológicas y la respuesta inmunitaria a patógenos distintos de
VIH-1 o, si se suprime alguna respuesta para
prevenir la producción de VIH-1, para hacerlo sin
deprimir el estado clínico del paciente. Dicho procedimiento sería
útil en el tratamiento de enfermedades oportunistas y en la
prolongación de la vida del paciente infectado por
VIH-1.
Como se enuncia en las reivindicaciones adjuntas,
la presente invención se refiere a un anticuerpo monoclonal
humanizado quimérico, SFv-Ig CD2, que se une
específicamente a antígeno CD2, que puede usarse para suprimir la
producción de virus VIH-1 en células T infectadas
por VIH-1, así como a otros anticuerpos que se unen
específicamente a antígeno CD2. También se proporcionan
procedimientos in vitro para suprimir la producción de virus
y el tratamiento de sujetos infectados con VIH-1
que usa SFv-Ig CD2 u otros anticuerpos que se unen
específicamente a antígenos implicados en la interacción
intercelular entre linfocitos T y monocitos, según se define en las
reivindicaciones.
Los anticuerpos según la presente invención
incluyen un anticuerpo monoclonal monocatenario humanizado quimérico
que tiene afinidad de unión específica a antígeno CD2, de manera que
el anticuerpo monoclonal seleccionado forma el grupo constituido
por:
(a) anticuerpo monoclonal quimérico
SFv-Ig CD2 obtenible por expresión del constructo
clonado en cultivo de Escherichia coli recombinante ATCC nº
69.277; y
(b) un anticuerpo monoclonal que puede competir
con SFv-Ig CD2 obtenible por expresión del
constructo clonado en cultivo de Escherichia coli
recombinante ATCC nº 69.277 para unión a antígeno CD2 con una
eficacia de al menos el 80% sobre una base molar con respecto a
SFv-Ig CD2.
Preferentemente, el anticuerpo monoclonal compite
con una eficacia de al menos el 90% sobre una base molar con
respecto a SFv-Ig CD2 para unión a antígeno CD2.
Las regiones determinantes de complementariedad
de origen de cadena H u origen de cadena L pueden ser idénticas en
secuencia a las de SFv-Ig CD2.
Preferentemente, el anticuerpo es anticuerpo
monoclonal quimérico SFv-Ig CD2.
Otro aspecto de la invención es un anticuerpo
modificado a partir del anticuerpo descrito anteriormente por
deleción de al menos una parte de la secuencia de aminoácidos
obtenida de Ig del mismo. Puede suprimirse la secuencia entera de
aminoácidos obtenida de Ig. Dicho anticuerpo puede obtenerse de
SFv-Ig CD2.
El anticuerpo monoclonal puede marcarse con un
marcador detectable. El marcador detectable puede seleccionarse del
grupo constituido por enzimas, materiales paramagnéticos, miembros
del par de unión específico avidina-biotina,
fluoróforos, cromóforos, quimioluminóforos, metales pesados y
radioisótopos.
Alternativamente, el anticuerpo monoclonal puede
conjugarse con un agente terapéutico. El agente terapéutico puede
seleccionarse del grupo constituido por agentes antineoplásicos,
linfocinas y toxinas. Las linfocinas adecuadas incluyen
interleucinas, interferones y factores de necrosis tumoral, en
particular interleucina-2. Las toxinas adecuadas
incluyen ricina, exotoxina de Pseudomonas y toxina de la
difteria.
Otro aspecto de la invención es una composición
farmacéutica que comprende:
(1) un anticuerpo anti-CD2
monoclonal humanizado quimérico según la presente invención en una
cantidad suficiente para inhibir la producción de virus
VIH-1 en células T infectadas en un paciente
infectado por VIH-1; y
(2) un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Otro aspecto de la invención es una célula de
Escherichia coli recombinante transformada de forma estable
por un constructo capaz de expresar anticuerpo monoclonal humanizado
quimérico SFv-Ig CD2 en células de mamífero y
depositado en la American Type Culture Commission como ATCC nº
69.277.
Otro aspecto más de la invención es un constructo
de ADN capaz de expresar anticuerpo monoclonal humanizado quimérico
SFv-Ig CD2 en células de mamífero y que incluye
regiones determinantes de complementariedad murinas y regiones
constantes humanas.
Otro aspecto más de la invención es un
procedimiento in vitro para inhibir la producción de
VIH-1 en células T infectadas por
VIH-1 El procedimiento comprende las etapas de:
(1) selección de células T infectadas por
VIH-1; y
(2) puesta en contacto de las células T
infectadas con un anticuerpo monoclonal capaz de interrumpir las
interacciones de superficie celular entre linfocitos T CD4^{+} y
monocitos para inhibir la producción de VIH-1 en las
células T infectadas, estando las células en contacto con el
anticuerpo en una cantidad suficiente para inhibir la producción de
VIH-1 en las células T puestas en contacto, en el
que el anticuerpo es específico de CD2 y bloquea la unión con
antígeno CD2 con su contrarreceptor LFA-3. Más
preferentemente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal según la
presente invención tal como se describe anteriormente; con la
máxima preferencia, el anticuerpo es SFv-Ig CD2. El
anticuerpo puede combinarse óptimamente con un anticuerpo monoclonal
a CD18, un anticuerpo monoclonal a contrarreceptor
LFA-3 o un anticuerpo monoclonal a contrarreceptor
ICAM-1. El anticuerpo puede conjugarse con un agente
terapéutico.
Otro aspecto de la presente invención es un
procedimiento in vitro para tratar a un sujeto infectado con
VIH-1. El procedimiento comprende las etapas
de:
(1) aislamiento de células T infectadas por
VIH-1 del sujeto;
(2) puesta en contacto de las células T
infectadas con un anticuerpo monoclonal capaz de interrumpir las
interacciones en superficie celular entre linfocitos T CD4^{+} y
monocitos para inhibir la producción de VIH-1 en las
células T infectadas, estando las células en contacto con una
cantidad de anticuerpo suficiente para inhibir la producción de
VIH-1 en las células T puestas en contacto;
en el que el anticuerpo monoclonal es específico
de CD2 y bloquea la unión de antígeno CD2 con su contrarreceptor
LFA-3.
Posteriormente, las células T puestas en contacto
pueden reinfundirse en el paciente para aumentar la proporción de
células T funcionales no productoras de VIH-1 en el
sujeto para tratar así al sujeto.
En algunos casos, puede ser deseable una etapa
adicional de activación de las células T antes de la reinfusión.
En este procedimiento se prefieren los mismos
anticuerpos que en el procedimiento, descrito anteriormente, de
inhibir la producción de VIH-1 en células
infectadas por VIH-1. El anticuerpo puede conjugarse
también en un agente terapéutico. El procedimiento puede comprender
además la etapa de tratar al sujeto con al menos un agente
específico para una infección oportunista asociada al SIDA. El
agente puede ser pentamidina aerosolizada, isoniazida, rifampina o
anfotericina B.
La reinfusión de las células T puestas en
contacto en el paciente puede reducir las complicaciones asociadas a
infección por VIH-1.
Los anticuerpos de la presente invención pueden
usarse también en el tratamiento in vivo de pacientes
infectados por VIH-1. Un procedimiento de
tratamiento in vivo comprende la administración a un paciente
cuyas células T están infectadas por VIH-1 de un
anticuerpo monoclonal capaz de interrumpir las interacciones en
superficie celular entre linfocitos T CD4^{+} y monocitos para
inhibir la producción de VIH-1 en las células T
infectadas, siendo administrado el anticuerpo al paciente en una
cantidad suficiente para inhibir la producción de
VIH-1 en células T infectadas en el paciente. El
anticuerpo puede conjugarse con un agente terapéutico. El
tratamiento puede comprender además la etapa de tratar al paciente
con al menos un agente específico para una infección oportunista
asociada al SIDA. El anticuerpo puede administrarse al paciente
durante la viremia.
Estas y otras características, aspectos y
ventajas de la presente invención se comprenderán mejor haciendo
referencia a la siguiente descripción, reivindicaciones anexas y a
los dibujos adjuntos, en los que:
la Figura 1a es un gráfico que indica el efecto
del tratamiento con anticuerpos monoclonales a
LFA-3, CD18, CD11b, CD7, CD2 e
ICAM-1 en la producción del antígeno
VIH-1 p24 en linfocitos infectados con
VIH-1 en presencia de
interleucina-2 exógena;
la Figura 1b es un gráfico que indica el efecto
del tratamiento con los mismos anticuerpos monoclonales que se usan
en la Figura 1a en ausencia de interleucina-2
añadida;
la Figura 2 es un gráfico que muestra una curva
dosis-respuesta para el tratamiento de células
infectadas con anticuerpo monoclonal humanizado quimérico
SFv-Ig CD2, anticuerpo monoclonal
anti-CD2 murino y anticuerpo de proteína de fusión
CD5-Ig como control, representado frente a la
inhibición de producción de antígeno p24 de VIH-1;
y
la Figura 3 es un gráfico que muestra, mediante
separación celular activada por fluorescencia, que el anticuerpo
monoclonal quimérico SFv-Ig CD2 compite eficazmente
con anticuerpo monoclonal anti-CD2 35.1 para unión a
antígeno CD2 en células T Jurkat.
A continuación se han reunido por comodidad las
definiciones de una serie de términos usados en la siguiente
descripción, Ejemplos y reivindicaciones anexas.
"Anticuerpo monoclonal" significa
moléculas que tienen actividad anticuerpo y que son uniformes en
estructura, afinidad de unión y especificidad, e incluye anticuerpos
monoclonales quiméricos y anticuerpos monoclonales producidos por
técnicas de ADN recombinante en células distintas de linfocitos.
"Anticuerpo monoclonal" incluye también fragmentos de
anticuerpos bivalentes o univalentes, salvo que se especifiquen
anticuerpos intactos.
"Idéntico", aplicado a moléculas de
anticuerpos y secuencias de aminoácidos obtenidas de moléculas de
anticuerpos o porciones de moléculas de anticuerpos, significa
idéntico en secuencias de aminoácidos primarios. Según esta
definición, dos moléculas de anticuerpos con la misma secuencia de
aminoácidos primarios, pero diferentes patrones de glicosilación,
siguen siendo idénticas.
"Afinidad de unión específica"
significa afinidad de unión determinada por interacciones no
covalentes como enlaces hidrófobos, enlaces de sales y enlaces de
hidrógeno en la superficie de las moléculas de unión. A no ser que
se indique lo contrario, "afinidad de unión específica" implica
una asociación constante de al menos 10^{6} litros/mol
aproximadamente para una reacción bimolecular.
"Origen humano" significa idéntico u
obtenible de forma reconocible en estructura o función de una
secuencia encontrada en el genoma humano y que no requiere que la
secuencia se obtenga físicamente de células, tejidos o líquidos
corporales humanos. Por ejemplo, una proteína o péptido producido
por traducción de un gen o un segmento génico obtenido originalmente
del genoma humano que se clona en células de mamífero no humanas, y
que se aísla después de expresión en células de mamífero no humanas,
sigue siendo de origen humano. Esto se cumple incluso si la proteína
o péptido aparece como una proteína de fusión asociada con una
proteína de las células de mamífero no humanas, siempre que el
producto de la traducción de la secuencia humana se mantenga
sustancialmente intacto con respecto a su aparición original en
células humanas.
"Regiones determinantes de
complementariedad" (RDC) se usa según se define en el
documento EP-A-0.293.400 y en las
referencias citadas en el mismo. Las RDC se conocen también como
regiones hipervariables de los dominios variables de cadenas de
inmunoglobina ligeras y pesadas. Las regiones de marco de un dominio
variable mantienen las RDC en estrecha proximidad y las RDC de la
cadena ligera y de la cadena pesada correspondiente contribuyen a la
formación del sitio de unión del antígeno.
Los términos "secuencia de aminoácidos
obtenida de Ig" o "región Ig" pretenden cubrir
aquellas regiones de una inmunoglobina que no afectan directamente a
la unión del antígeno (especificidad de antígeno). Por ejemplo, las
regiones constantes de inmunoglobina o las regiones de marco están
cubiertas por estos términos. Por tanto, la deleción o alteración
(por ejemplo, por adición, sustitución o deleción de aminoácidos) de
"regiones Ig" o "secuencias de aminoácidos obtenidas de
Ig" que están dentro del ámbito de la presente invención no
afectan sustancialmente a la unión del antígeno o a la especificidad
del antígeno. Este tipo de modificación se refiere en la técnica
como injerto de RDC, según se describe, por ejemplo, en el documento
EP-A-0.239.400.
Los autores de la invención han descubierto que
ciertos anticuerpos monoclonales a las moléculas de superficies
celulares implicados en las adhesiones entre células T y otras
células que participan en la respuesta inmunitaria, en particular
monocitos, pueden inhibir la producción de virus
VIH-1 por células T CD4^{+} infectadas por
VIH-1 sin inhibición de la función o proliferación
de células T. De los anticuerpos monoclonales adecuados para la
inhibición de producción VIH-1, entre los más útiles
hay un nuevo anticuerpo anti-CD2 humanizado
quimérico producido en células de mamífero recombinantes en cultivo
y conocido como SFv-Ig CD2. Según se describe, este
anticuerpo contiene regiones variables murinas y regiones constantes
humanas dentro de una sola cadena de aminoácidos.
Entre los anticuerpos monoclonales útiles para
inhibir la producción de virus VIH-1 por linfocitos
infectados hay varios anticuerpos monoclonales que interrumpen las
interacciones entre células T y monocitos. Estos anticuerpos se
dirigen a moléculas de superficies celulares implicadas en la
adhesión celular. Aunque los autores de la solicitud no pretenden
limitarse a esta teoría, creen que los procedimientos de adhesión
celular se requieren en la comunicación entre células necesaria para
el establecimiento de la respuesta inmunitaria, en particular para
el desarrollo de actividad inmunitaria específica mediante células T
presentadas con un antígeno.
Estos anticuerpos incluyen: (1) anticuerpos
monoclonales anti-CD2; (2) anticuerpos monoclonales
anti-CD18; (3) anticuerpos monoclonales
anti-LFA3 y (4) anticuerpos
anti-ICAM-1. Los antígenos CD2 y
CD18 están situados en linfocitos. Los antígenos
LFA-3 e ICAM-1 están situados en
monocitos, con los que los linfocitos T interaccionan en el curso de
la respuesta inmunitaria.
Entre los anticuerpos monoclonales más útiles
para supresión de producción de VIH-1 por células T
infectadas están los anticuerpos monoclonales
anti-CD2. Los anticuerpos monoclonales
anti-CD2 han demostrado que inhiben la producción de
VIH-1 entre el 80% aproximadamente y más del 99%
aproximadamente. La inhibición de producción de
VIH-1 se produjo en presencia o ausencia de
interleucina-2 (IL-2) exógena. Es
importante que la proliferación de células CD4^{+} se mantuvo en
presencia de IL-2 exógena, pero la producción de
VIH-1 se inhibió acusadamente. Los anticuerpos
monoclonales anti-CD2 inhibieron la producción de
VIH-1 en más del 90% a concentraciones tan bajas
como 0,1 \mug/ml de anticuerpo. La adición de anticuerpo
monoclonal anti-CD2 es eficaz para suprimir la
producción de VIH-1 incluso para células T activadas
por tratamientos con enterotoxina estafilocócica
("superantígeno" o "SAg").
Entre los anticuerpos anti-CD2
útiles están los anticuerpos monoclonales designados como 35.1, 9.6
y 9-1, aunque 9-1 se une a un
epítopo diferente en CD2. Sin embargo, de estos anticuerpos
monoclonales, 35.1 (Leucocyte Typing III (A.J. McMichael,
ed., Oxford University Press, Oxford, 1987); Leukocyte Typing
IV (W. Knapp y col., ed., Oxford University Press, Oxford,
1989)) es el más eficaz.
Como se muestra a continuación en el Ejemplo 2,
más adelante, los efectos inhibidores de los anticuerpos
monoclonales anti-CD2 no se deben a la
competencia por receptores Fc de monocitos humanos con activación de
anticuerpos monoclonales \alpha-CD3. Lo anterior
se desprende del resultado de que los fragmentos F(ab')_{2}
y Fab son eficaces para inhibir la producción de
VIH-1. Estos fragmentos no tienen la porción de Fc
del anticuerpo y, por tanto, no pueden competir por los receptores
Fc monocitarios. En consecuencia, el uso de dichos fragmentos está
dentro del ámbito de la invención.
Otro anticuerpo monoclonal específico de CD2 útil
para la supresión de producción de VIH-1 en células
T infectadas es un anticuerpo monoclonal anti-CD2
humanizado quimérico producido por expresión transitoria en células
COS y designado como SFv-Ig CD2. Este anticuerpo
monoclonal recombinante contiene una cadena de péptido único que
incorpora regiones variables de cadenas H y L del anticuerpo
monoclonal murino 35.1, y regiones constantes de IgG1 humana. El
vector usado para expresión transitoria de células COS se amplifica
en Escherichia coli, depositado en la American Type Culture
Collection como ATCC nº 69.277, depositado el 9 de abril de
1993.
La forma protomérica de este anticuerpo
monoclonal es monovalente, es decir, cada molécula de anticuerpo
recombinante tiene sólo un sitio de unión a antígeno. Sin embargo,
pueden producirse agregados de este anticuerpo monoclonal. La
producción de este anticuerpo monoclonal se describe en detalle más
adelante.
Otros anticuerpos que tienen afinidad de unión
específica por antígeno CD2 y que tienen al menos algunas secuencias
de origen humano se consideran dentro del ámbito de la invención.
Estos anticuerpos incluyen: (1) un anticuerpo monoclonal que tiene
regiones determinantes de complementariedad idénticas a las de
SFv-Ig CD2 y que tiene al menos un segmento de
secuencia de al menos cinco aminoácidos de origen humano; y (2) un
anticuerpo monoclonal que compite con SFv-Ig CD2
para unión a antígeno CD2 con una eficacia de al menos el 80%
aproximadamente sobre una base molar con respecto a
SFv-Ig CD2, y que tiene al menos un segmento de
secuencia de al menos cinco aminoácidos de origen humano.
Preferentemente, el anticuerpo monoclonal compite con una eficacia
de al menos el 90% aproximadamente sobre una base molar con respecto
a SFv-Ig CD2.
Los anticuerpos que tienen regiones determinantes
de complementariedad sustancialmente homóloga con las de
SFv-Ig CD2 pueden generarse a partir de
SFv-Ig CD2 mediante mutagénesis in vitro,
usando procedimientos conocidos en la técnica y descritos, por
ejemplo, en J. Sambrook y col., "Molecular Cloning: A Laboratory
Manual" (2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, Nueva York, 1989), vol. 2, cap. 15,
"Site-Directed Mutagenesis of Cloned DNA", pág.
15.1-15.113, incorporado en la presente memoria
descriptiva como referencia. Los anticuerpos monoclonales de
ingeniería genética recombinante que tienen regiones de
complementariedad idénticas a las de SFv-Ig CD2 se
obtienen de este anticuerpo monoclonal quimérico mediante mutaciones
en las regiones constantes o en aquellas porciones de las regiones
variables que no forman parte de las regiones determinantes de
complementariedad (RDC). Los anticuerpos monoclonales de ingeniería
genética con regiones determinantes de complementariedad
sustancialmente homólogos a los de SFv-Ig CD2 pueden
obtenerse de este anticuerpo monoclonal mediante mutaciones en
regiones constantes y en regiones variables, incluyendo RDC.
Entre las mutaciones que pueden introducirse en
las regiones constantes y variables que conservan sustancialmente la
afinidad y la especificidad están las mutaciones que producen
sustituciones de aminoácidos conservadoras. Existe en la química de
proteínas un principio bien establecido de que ciertas sustituciones
de aminoácidos, denominadas "sustituciones de aminoácidos
conservadoras", pueden realizarse frecuentemente en una proteína
sin alterar la conformación ni la función de la proteína. Dichos
cambios incluyen la sustitución de cualquiera de las isoleucina (I),
valina (V) y leucina (L) por cualquier otro de estos aminoácidos
hidrófobos; ácido aspártico (D) por ácido glutámico (E) y a la
inversa; glutamina (Q) por asparagina (N) y a la inversa; y serina
(S) por treonina (T) y a la inversa. Otras sustituciones pueden
considerarse asimismo conservadoras, dependiendo del entorno del
aminoácido en particular y de su función en la estructura
tridimensional de la proteína. Por ejemplo, glicina (G) y alanina
(A) pueden ser frecuentemente intercambiables, al igual que alinina
y valina (V). La metionina (M), que es relativamente hidrófoba,
puede intercambiarse frecuentemente con leucina e isoleucina, y a
veces con valina. Lisina (K) y arginina (R) son frecuentemente
intercambiables en posiciones en las que la característica
significativa del residuo de aminoácido es su carga y los diferentes
valores de pK de estos dos residuos de aminoácidos no son
significativos. Otros cambios pueden considerarse también
"conservadores" en entornos particulares. Los cambios que no
afectan a la estructura tridimensional o a la reactividad de la
proteína pueden determinarse mediante modelización
computarizada.
Entre los anticuerpos monoclonales quiméricos
dentro del ámbito de la invención están aquéllos en los que las
regiones determinantes de complementariedad de origen de cadena H
son idénticos en secuencia a los de SFv-Ig CD2, y
aquéllos en los que las RDC de origen de cadena L son idénticos en
secuencia a los de SFv-Ig CD2.
Algunas modificaciones adicionales de anticuerpos
según la presente invención que están dentro del ámbito de la
invención incluyen variantes que alteran o eliminan al menos parte
de la región Ig de la molécula quimérica, dejando las regiones
determinantes de complementariedad del anticuerpo. Estas variantes
incluyen variantes que eliminan la región Ig completa de la molécula
como, por ejemplo, la región constante completa. Estas variantes,
que son menores en peso molecular, pueden ser más deseables para uso
in vivo, ya que son más eficaces en la penetración de tejidos
linfoides. Estas variantes pueden producirse por mutagénesis in
vitro mediante la inducción de deleciones apropiadas.
Preferentemente, estas variantes de obtienen de
SFv-Ig CD2 y conservan las regiones determinantes de
complementariedad de ese anticuerpo quimérico. La deleción y la
alteración de diferentes partes de la región Ig pueden producirse
simultáneamente.
También están dentro del ámbito de la invención
para prevenir la replicación de VIH-1 los
anticuerpos anti-CD2, además de 35.1, que bloquean
el sitio de unión a LFA-3 en CD2, impidiendo así la
interacción de CD2 con LFA-3.
Otro anticuerpo monoclonal eficaz en la supresión
de la producción de VIH-1 en células T CD4^{+} es
el anticuerpo monoclonal anti-CD18. El antígeno CD18
es la subunidad \beta de un receptor de superficie celular
conocido como LFA-1, e interacciona con moléculas
designadas como ICAM-1, ICAM-2 e
ICAM-3 en monocitos. Al igual que los anticuerpos
monoclonales a CD2, el anticuerpo monoclonal a CD18 suprime la
producción de VIH-1 en presencia o ausencia de
IL-2 exógena. Un anticuerpo monoclonal
anti-CD18 es 60.3.
Otro anticuerpo útil para suprimir la producción
de VIH-1 en células T infectadas es un anticuerpo
monoclonal anti-LFA-3.
LFA-3 es una molécula presente normalmente en la
superficie de monocitos y que interacciona con CD2 en linfocitos de
células T. Así, los anticuerpos monoclonales
anti-LFA3-3 interrumpen las
interacciones entre CD2 y LFA-3 requeridas para la
síntesis de VIH-1 en linfocitos activados. Un
anticuerpo monoclonal anti-LFA-3
adecuado es Ts2/9.
Otro anticuerpo útil para la supresión de
producción de VIH-1 en células T infectadas es un
anticuerpo monoclonal anti-ICAM-1.
ICAM-1, situado en monocitos, se une al antígeno
CD18 en la superficie de linfocitos. CD18 es la subunidad \beta de
LFA-1. Un anticuerpo monoclonal
anti-ICAM-1 adecuado es 84H10.
Entre los anticuerpos preferidos útiles para
suprimir la producción de VIH-1 y linfocitos
CD4^{+} está un anticuerpo monocatenario humanizado quimérico
designado como SFv-Ig CD2. El uso de anticuerpos
monoclonales quiméricos se prefiere generalmente en el tratamiento
de sujetos humanos debido a que dichos anticuerpos monoclonales: (1)
pueden inducir menos respuesta inmunitaria antimurina y (2) pueden
tener un mayor tiempo de supervivencia in vivo (G. Hale y
col., "Remission Induction in Non-Hodgkin Lymphoma
With Reshaped Human Monoclonal Antibody
CAMPATH-1H", Lancet,
2:1394-1399 (1988); D. Yasmeen y col., "The
Structure and Function of Immunoglobin Domains. IV. The Distribution
of Some Effector Functions among the C\gamma_{2}C\gamma_{3}
Homology Regions of Human Immunoglobin G1", J. Immunol.
116:518-526 (1986)).
La producción de anticuerpo monoclonal humano
quimérico CD-2 SFv-Ig requiere el
aislamiento de los genes que codifican el anticuerpo monoclonal en
el hibridoma murino y la sustitución de las regiones constantes por
las correspondientes secuencias de genes de las regiones constantes
humanas. El producto final es una molécula monocatenaria que tiene
la actividad de anticuerpos monoclonales y se expresa en células COS
después de la amplificación del ADN que codifica el anticuerpo
quimérico en Escherichia coli.
La primera etapa en la producción de
SFv-Ig CD2 es la síntesis de ADNc de ARN mensajero
aislado de células de hibridoma que producen anticuerpo monoclonal
anti-CD2. Preferentemente, se usan células de
hibridoma murinas.
Normalmente, el ARN total se aísla por
procedimientos de extracción bien conocidos en la técnica, como
extracción con fenol a pH ácido o extracción con tiocianato de
guanidinio seguido de centrifugado en soluciones de cloruro de
cesio. Estos procedimientos, y otros para extracción de ARN, se
desvelan en J. Sambrook y col., "Molecular Cloning: A Laboratory
Manual" (2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, Nueva York, 1989), cap. 7, "Extraction, Purification, and
Analysis of Messenger RNA From Eukaryotic Cells", pág.
7.1-7.25. Opcionalmente, el ARNm puede aislarse del
ARNm total mediante cromatografía en
oligo(dT)celulosa, pero esta etapa no es
obligatoria.
Para sintetizar ADNc, se usan preferentemente
para iniciar la síntesis cebadores complementarios a la región
constante de cadena ligera \kappa o \lambda y a la región
constante de cadena pesada \gamma_{2a}. Con la máxima
preferencia, los cebadores usados son complementarios a los
nucleótidos 101-124 en la región constante de cadena
\kappa y a los nucleótidos 100-123 en las regiones
constantes \gamma_{2a}. Con menos preferencia, pueden usarse
otros cebadores, en la medida en que permitan la producción de ADNc
incorporando la región variable completa.
La amplificación puede llevarse a cabo mediante
cualquier procedimiento que permita una amplificación de alta
fidelidad sin deslizamiento. Preferentemente, la amplificación se
realiza mediante el procedimiento de la reacción en cadena de la
polimerasa (K.B. Mullis y F.A. Faloona, "Specific Synthesis of DNA
In Vitro Via a Polymerase-Catalyzed Chain
Reaction", Meth. Enzymol. 155:335-350
(1987); K. Mullis y col., "Specific Enzymatic Amplification of DNA
In Vitro: The Polymerase Chain Reaction", Cold Spring
Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263-273 (1986);
R.K. Saiki y col., "Primer-Directed Enzymatic
Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase",
Science, 238:487-491 (1988)).
Un procedimiento altamente preferido usa PCR
anclada o de un solo lado (E.Y. Loh y col., "Polymerase Chain
Reaction with Single-Sided Specificity: Analysis of
T-cell Receptor \delta Chain", Science
243:217-220 (1989)). Este procedimiento usa
terminación de homopolímero del extremo 3' del transcripto inverso;
entonces, la amplificación por PCR se realiza con un cebador 3'
específico y un segundo oligonucleótido constituido por una
terminación de homopolímero complementaria a la terminación de
homopolímero añadida al extremo 3' del transcripto unido a una
secuencia con un sitio de restricción conveniente, denominado
anclaje. En una versión, se usan oligonucleótidos degenerados (Y.L.
Chiang y col., "Direct cDNA Cloning of the Rearranged Immunoglobin
Variable Region", Biotechniques, 7:360-366
(1989)) para amplificar la región variable de cadena pesada
\gamma_{2a} mediante PCR estándar, y después de adición de un
extremo 3' de terminación poli (dG) al ADNc para la región variable
de cadena \kappa, se usa PCR anclada usando el cebador
complementario a los nucleótidos 101-124 de la
región constante de la cadena \kappa. Normalmente, se realizan
unas 30 tandas de amplificación, pero este número puede variar en
caso necesario.
Los productos de PCR se clonan en un huésped
bacteriano adecuado, más preferentemente E. coli, con un
vector de plásmido en el que puede incorporarse el ADN y que puede
replicarse de forma estable en el huésped bacteriano. Se conoce una
serie de vectores de clonación adecuados para clonación en E.
coli, y se describen en el vol. 1 de Sambrook y col., más
arriba, cap. 1, "Plasmid Vectors", pág.
1.1-1.110. Las manipulaciones exactas requeridas
dependen del vector de clonación particular elegido y de los sitios
de endonucleasa de restricción particulares usados para clonación en
el vector.
Un vector altamente preferido es pUC19. Para
clonación en pUC19, los productos de PCR se tratan con el fragmento
de Klenow de polimerasa I de ADN de E. coli y con los cuatro
trifosfatos de desoxirribonucleósido para obtener extremos romos
mediante rellenado de regiones monocatenarias en el extremo de las
cadenas de ADN. A continuación puede usarse PCR para añadir sitios
de restricción EcoRI y BamHI al extremo 5' y los extremos 3',
respectivamente, del fragmento amplificado de ADNc de origen de
cadena ligera (el fragmento VL). Análogamente, se añaden sitios de
restricción XbaI y HindIII al fragmento amplificado de ADNc de
origen de cadena pesada (el fragmento VH). Los fragmentos se
digieren con las endonucleasas de restricción apropiadas y se clonan
en vector pUC19 que se ha digerido con: (1) EcoRI y BamHI para VL y
(2) XbaI e HindIII para VH. Los constructos resultantes pueden
usarse para transformar una cepa de E. coli competente como
DH5\alpha.
Los clones que contienen VL y VH se identifican
preferentemente mediante secuenciación de ADN. Un procedimiento de
secuenciación de ADN apropiado es el procedimiento de terminación de
cadena de didesoxinucleótidos de Sanger. Dicho procedimiento puede
realizarse usando el kit Sequenase 2.0 (United States Biochemical,
Cleveland, Ohio), con cebadores directos e inversos que se hibridan
con las secuencias pUC19 que flanquean el sitio de policlonación.
Preferentemente, las secuencias de consenso VL y VH se determinan
por comparación de clones múltiples y alineación de las secuencias
con secuencias de región variable VL y VH murinas (E.A. Kabat y col,
"Sequences of Proteins of Immunological Interest" (4ª ed.,
Departamento de Salud y de Servicios Humanos de los Estados Unidos,
Bethesda, Maryland, 1987)).
La siguiente etapa es la preparación de una
casete de expresión que incorpora un constructo de anticuerpo
monocatenario que incluye las secuencias VL y VH separadas por un
ligador. En un procedimiento altamente preferido, la secuencia
delantera 5' se elimina de VL y se sustituye por una secuencia que
contiene un sitio SalI que precede al residuo 1 de la proteína
nativa. Los residuos de regiones constantes 33 del extremo 3' se
sustituyen por un cebador que añade una secuencia complementaria a
una secuencia que codifica la secuencia el ligador de 16 residuos
ESGSVS
SEELAFRSLD (ID. SEC. Nº 1) (J.K. Batra y col., "Anti-TAc (FV)-PE40, a Single Chain Antibody Pseudomonas Fusion Protein Directed at Interleukin-2 Receptor-Bearing Cells", J. Biol. Chem. 265:15198-15202 (1990)). Para la secuencia VH, un cebador VH añade la secuencia de "sentido" que codifica el ligador como, por ejemplo, la secuencia de ligador de 16 residuos dada anteriormente (ID. SEC. Nº 1) al extremo 5' de VH que precede al residuo 1 de la proteína madura y sustituye un sitio BclI por los residuos de región constante del extremo 3'.
SEELAFRSLD (ID. SEC. Nº 1) (J.K. Batra y col., "Anti-TAc (FV)-PE40, a Single Chain Antibody Pseudomonas Fusion Protein Directed at Interleukin-2 Receptor-Bearing Cells", J. Biol. Chem. 265:15198-15202 (1990)). Para la secuencia VH, un cebador VH añade la secuencia de "sentido" que codifica el ligador como, por ejemplo, la secuencia de ligador de 16 residuos dada anteriormente (ID. SEC. Nº 1) al extremo 5' de VH que precede al residuo 1 de la proteína madura y sustituye un sitio BclI por los residuos de región constante del extremo 3'.
A continuación puede usarse la reacción en cadena
de la polimerasa con una mezcla de ADNc VL y VH, modificada según se
indica, como plantillas, y una mezcla de los cuatro cebadores (dos
cebadores de ligador y dos cebadores que contienen sitios de
restricción). Esto crea un solo fragmento de ADN que contiene una
secuencia VL-ligador-VH flanqueada
por sitios SalI y BclI. A continuación se hace pasar el constructo
de ADN a través de células de E. coli dam^{-} como la cepa
NEB 208. El constructo transmitido se digiere a continuación con
SalI y BclI.
El ADN digerido de la etapa precedente se liga a
continuación en un vector pCDM8 que contiene la secuencia delantera
de cadena ligera k anti-L6 seguido de un sitio SalI
y un sitio BclI que preceden a la codificación de ADNc que codifica
una terminación de IgG1 humana en la que las cisteínas de la región
de bisagra se mutan en serinas para inhibir la dimerización (P.S.
Linsley y col., "Binding of the B Cell Activation Antigen B7 to
CD28 Costimulates T-Cell Proliferation and
Interleukin-2 mRNA Accumulation", J. Exp.
Med. 191:721-730 (1991)).
El constructo resultante es capaz de expresar
anticuerpo monoclonal humanizado quimérico SFv-Ig
CD2 en células de mamífero. Este constructo incluye regiones
determinantes de complementariedad murinas y regiones constantes
humanas. A continuación, el constructo se amplifica preferentemente
en E. coli competente. Una cepa altamente preferible de E.
coli para transformación con el constructo es MC1061/63. La
E. coli transformada con el constructo se ha depositado en la
American Type Culture Collection como ATCC nº 69277.
A continuación se aísla y purifica ADN de
plásmido, por ejemplo, mediante centrifugado de gradiente de
densidad con cloruro de cesio. A continuación se transfecta el ADN
purificado en una línea celular eucariótica capaz de expresar dicho
ADN transfectado. Una línea celular altamente preferida es células
COS de mono. Un procedimiento preferido para introducir ADN es
mediante DEAE-dextrano, aunque se dispone de otros
procedimientos para transfección que son conocidos en la técnica.
Estos procedimientos incluyen transfección con coprecipitados de
fosfato de calcio y ADN, transfección por el uso de un policatión,
polibreno, y transfección por electroporación. Estos procedimientos
se describen en J. Sambrook y col., "Molecular Cloning: A
Laboratory Manual", más arriba, vol. 3, pág.
16.30-16.55.
Preferentemente, el ADN recombinante que contiene
la secuencia que codifica la proteína de fusión se expresa mediante
expresión transitoria, según se describe en A. Aruffo, "Transient
Expression of Proteins Using COS Cells", en Current Protocols
in Molecular Biology (2ª ed., F.M. Ausubel y col., ed. John
Wiley & Sons, Nueva York, 1991), pág.
16.13-16.13.7.
El anticuerpo humanizado quimérico a antígeno
CD2, SFv-Ig CD2, es una estructura monocatenaria que
contiene porciones de región variable de cadena H y L de origen
murino. Las regiones variables se unen a regiones constantes de
origen humano, en concreto, IgG1. La proteína monocatenaria
resultante se une a antígeno CD2 de manera monovalente; es decir,
existe un sitio de unión a antígeno por molécula de IgG. El
anticuerpo compite específicamente con anticuerpo monoclonal
anti-CD2 murino para unirse a CD2 en células T
Jurkat, según se determina mediante separación celular activada por
fluorescencia (FACS).
Los anticuerpos según la presente invención,
incluidos SFv-Ig CD2, pueden unirse a marcadores
detectables y agentes terapéuticos para su uso en el diagnóstico,
tanto in vivo como in vitro, y para su uso en
terapia. Entre los marcadores detectables a los que pueden unirse
los anticuerpos están enzimas, iones o compuestos paramagnéticos,
miembros del par de unión específico
avidina-biotina, fluoróforos, cromóforos,
quimioluminóforos, metales pesados y radioisótopos. Entre los
agentes terapéuticos a los que pueden unirse los anticuerpos están
agentes antineoplásicos, linfocinas y toxinas.
Dado que los marcadores detectables y los agentes
terapéuticos, al igual que los procedimientos de unión, son bien
conocidos en la técnica, la siguiente exposición pretende ser más
ilustrativa que limitadora. No debe interpretarse que la emisión de
un marcador detectable, agente terapéutico o procedimiento de
marcado en particular en la siguiente exposición implica que el
marcador detectable, agente terapéutico o procedimiento de marcado
no son adecuados para su uso con cualquiera de los anticuerpos
monoclonales de la presente invención.
Los procedimientos de unión adecuados incluyen
unión covalente, unión por quelación y unión por formación
coloidal.
La unión covalente incluye unión mediante un
agente de acoplamiento bifuncional y unión oxidativa. La primera es
aplicable generalmente cuando el anticuerpo monoclonal se une a una
molécula orgánica. El último se usa más comúnmente cuando el
anticuerpo se marca con yodo radiactivo.
Muchos agentes de acoplamiento son útiles para
acoplar moléculas orgánicas que poseen varios tipos de grupos
funcionales a proteínas, incluyendo moléculas de anticuerpos. La
conjugación de moléculas orgánicas a proteínas, incluyendo proteínas
que poseen especificidad por anticuerpos, es bien conocida en la
técnica y se describe, por ejemplo, en P. Tijssen, "Practice and
Theory of Enzyme Immunoassays" (Elsevier, Amsterdam, 1985), pág.
279-296, incorporado como referencia en la presente
memoria descriptiva.
Sucintamente, las moléculas orgánicas que
contienen grupos carboxilo o que pueden carboxilarse, pueden
acoplarse mediante la reacción de anhídrido mixta, por reacción con
una carbodiimida hidrosoluble o esterificación con
N-hidroxisuccinimida. La carboxilación puede
realizarse mediante reacciones como alquilación de sustituyentes de
oxígeno o nitrógeno con haloésteres, seguido por hidrólisis del
éster, o por la formación de ésteres de hemosuccinato o
carboximetiloximas en grupos de esteroides hidroxilo o cetona.
Las moléculas orgánicas con grupos amino o grupos
nitro reducibles a grupos amino pueden convertirse a sales de
diazonio y reaccionar con proteínas en pH ligeramente alcalino, para
dar aminas aromáticas. Las moléculas orgánicas con aminas alifáticas
pueden conjugarse en proteínas mediante diversos procedimientos,
incluyendo reacción con carbodiimidas, reacción con reactivo
homobifuncional
tolileno-2,4-diisocianato o reacción
con compuestos de maleimida. Las aminas alifáticas pueden
convertirse también en aminas aromáticas mediante reacción con
cloruro de p-nitrobenzoílo y posterior reducción a una
p-aminobenzoilamida, que a continuación puede acoplarse a
proteínas después de diazotización. Asimismo, pueden usarse ésteres
de imidato bifuncionales, como dimetilpimelimidato,
dimetiladipimidato o dimetilsuberimidato, para conjugar moléculas
orgánicas que contienen grupo amino a
proteínas.
proteínas.
Las moléculas orgánicas que contienen tiol pueden
conjugarse a proteínas con maleimidas, como éster de
N-hidroxisuccinimida de ácido
4-(N-maleimidoetil)-ciclohexano-1-carboxílico.
Para moléculas orgánicas con grupos hidroxilo,
una función alcohol puede convertirse en el hemisuccinato, que
introduce un grupo carboxilo disponible para conjugación.
Alternativamente, el reactivo bifuncional dicloruro de sebacoílo
convierte un alcohol en un cloruro ácido, que después reacciona con
proteínas.
Los fenoles pueden activarse con ácido
p-aminobenzoico diazotizado, que introduce un grupo
carboxilo, y a continuación pueden hacerse reaccionar con las
proteínas mediante la reacción de anhídrido mixta. Los azúcares
pueden activarse mediante formación de un
p-nitrofenilglicósido, seguido de reducción del grupo nitro a
un grupo amino y de la conjugación mediante diazotización. Otros
procedimientos incluyen la escisión de glicoles vecinos de azúcares
en aldehídos por reacción con peryodato, seguido de acoplamiento a
aminas por alquilación reductora con borohidrato de sodio.
Alternativamente, pueden conjugarse moléculas orgánicas que
contienen hidroxilo después de conversión a clorocarbonatos por
reacción con fosgeno.
Como moléculas orgánicas con grupos aldehído o
cetona, pueden introducirse grupos carboxilo a través de la
formación de O-carboximetiloximas. También pueden
derivarse grupos cetona con ácido p-hidrazinobenzoico para
producir grupos carboxilo. Las moléculas orgánicas que contienen
aldehídos pueden conjugarse directamente a través de la formación de
bases de Schiff que se estabilizan mediante reacción con un agente
reductor como borohidrato de sodio.
La unión oxidativa es particularmente útil cuando
se acopla yodo radiactivo a anticuerpos. Los procedimientos
adecuados incluyen: (1) oxidación química con
cloramina-T; (2) oxidación química con yodógeno
(1,3,4,6-tetracloro-3\alpha,6\alpha-difenilglicolurilo);
(3) oxidación con la enzima lactoperoxidasa. Aunque no es un
procedimiento oxidativo, otro procedimiento útil para marcado con
yodo es con 3-(4-hidroxifenilpropionato de
N-succinimidilo [^{125}I], conocido en general
como reactivo de Bolton-Hunter. Estas técnicas se
describen, por ejemplo, en E. Harlow y D. Lane, "Antibodies: A
Laboratory Manual" (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring
Harbor, Nueva York, 1988), pág. 324-339.
La unión mediante quelación es útil
particularmente para iones metálicos con carga positiva, que pueden
ser radiactivos. Un ejemplo de ion metálico adecuado que puede
unirse a anticuerpos por quelación es ^{111}In(III). Los
agentes de quelación adecuados incluyen derivados de ácido
etilendiamintetraacético (EDTA), como el agente de quelación ácido
dietilentetraminpentaacético (DTPA) y sus derivados. Los
procedimientos para marcado de anticuerpos por quelación se
describen, por ejemplo, en T.G. Wensel y C.F. Mears,
"Bifunctional' Chelating Agents for Binding Metal Ions to
Proteins", en Radioimmunoimaging and Radioimmunotherapy
(S.W. Burchiel & B.A. Rhodes, ed., Elsevier, Amsterdam, 1983),
pág. 185-196, y A.R. Bradwell y col.,
"Developments in Antibody Imaging", en Monoclonal
Antibodies for Cancer Detection and Therapy (Baldwin y col.,
ed., Academic Press, Londres, 1985), pág. 65-
85.
85.
La unión de anticuerpos a soles metálicos para
formar coloides es particularmente útil para marcar anticuerpos para
su uso en técnicas inmunohistoquímicas o inmunocitoquímicas. El
metal puede ser oro, platino, plata u otros metales. Esta técnica se
describe en detalle, por ejemplo, en J. DeMey y col., "Gold Probes
in Light Microscopy", en Immunocytochemistry: Modern Methods
and Applications (J.M. Polak y S. Van Noorden, ed., Wright,
Bristol, 1988), pág. 71-88 y J. DeMey, "The
Preparation and Use of Gold Probes", en Immunocytochemistry:
Modern Methods and Applications, pág.
115-145.
Entre los marcadores detectables útiles están
enzimas que producen productos detectables. En algunos casos, estos
productos son insolubles y forman precipitados coloreados que se
detectan fácilmente. Entre las enzimas adecuadas están
\beta-galactosidasa, fosfatasa alcalina y
peroxidasa de rábano picante, así como otras enzimas conocidas en la
técnica.
Los materiales paramagnéticos incluyen Mn^{2+},
Cr^{3+} y muchas tierras raras como cerio, gadolinio, terbio,
tulio y sus compuestos.
Los anticuerpos pueden marcarse con un miembro
del par de unión específico de avidina y el otro miembro del par de
unión específico puede marcarse con otro marcador detectable. Esto
proporciona un medio extremadamente específico de marcado indirecto
de anticuerpos, y permite la amplificación de la marca.
Preferentemente, el anticuerpo se marca con biotina y la marca
indirecta se conjuga con avidina. En algunos casos, puede ser
deseable invertir este patrón, marcando el anticuerpo con biotina y
uniendo la marca a avidina. La estreptavidina, una proteína de
Streptomyces avidinii, tiene una afinidad similar por la
biotina y puede usarse como alternativa a la avidina. Pueden usarse
varios ligadores para unir la biotina a anticuerpos, proporcionando
separadores de diversas longitudes.
Con frecuencia, las marcas fluorescentes
(fluoróforos) se usan para marcar anticuerpos para su detección.
Dichos fluoróforos incluyen fluoresceína, rodamina, ficoeritrina y
Texas Red, un derivado de cloruro de sulfonilo. Pueden usarse otros
fluoróforos, incluyendo derivados de los anteriores, para marcar
anticuerpos.
Puede usarse un gran número de tintes o
cromóforos como marcas para dar una indicación visual de la
concentración de anticuerpo, aunque otros procedimientos son en
general más sensibles y pueden detectar concentraciones menores de
anticuerpos. Prácticamente cualquier tinte puede acoplarse a
anticuerpos, usando uno de los procedimientos de acoplamiento
descritos anteriormente.
Una alternativa a los fluoróforos son los
quimioluminóforos (marcas quimioluminiscentes). Estas marcas
incluyen derivados de luminol e isoluminol, oxalatos de arilo,
ésteres de arilo de ácido
10-metil-acridinio-9-carboxílico
y ésteres de arilo de ácido
5-metil-fenantridinio-6-carboxílico,
entre otros.
Incluyen metales densos en electrones como oro,
plata o platino. Éstos se unen normalmente a anticuerpos mediante
formación coloidal, y se detectan por su alta densidad de electrones
en microscopia electrónica. Las marcas de metales pesados coloidales
pueden detectarse también por otras propiedades de los coloides.
Los radioisótopos son frecuentemente marcas
usadas que pueden detectarse con sensibilidad extraordinariamente
alta mediante recuento de centelleo para isótopos emisores de
radiación \beta o recuento de pocillos usando detectores de
cristal de yoduro de sodio activado con talio para isótopos que
emiten radiación \gamma. Los radioisótopos que adecuados para
marcado de anticuerpos monoclonales incluyen ^{3}H, ^{14}C,
^{35}S, ^{32}P, ^{125}I y ^{131}I. De ellos, probablemente
la marca radiactiva usada más comúnmente es el ^{125}I emisor de
radiación \gamma, que es barato y fácil de detectar con alta
eficacia.
Los anticuerpos monoclonales según la presente
invención pueden conjugarse con agentes terapéuticos y usarse a
continuación para dirigir los agentes terapéuticos a linfocitos que
expresan CD2. Esto permite la administración de concentraciones
superiores de dichos agentes sin la necesidad de administrar altas
dosis sistémicas de ellos. Así se puede reducir la aparición de
efectos secundarios que en otro caso serían frecuentes con el uso de
dichos agentes terapéuticos. El uso de anticuerpos monoclonales
según la presente invención conjugados con agentes terapéuticos no
se limita necesariamente al tratamiento o paliación de SIDA, sino
que puede mostrarse beneficioso en otras dolencias que afectan a las
funciones linfocitarias, incluyendo trastornos autoinmunitarios.
Entre los agentes terapéuticos que pueden
conjugarse en anticuerpos monoclonales según la presente invención
están agentes antineoplásticos, linfocinas y toxinas. También pueden
usarse para la terapia anticuerpos monoclonales según la presente
invención que se conjugan en radioisótopos, según se describe
anteriormente.
Los expertos en la materia conocen una serie de
agentes antineoplásicos, que se describen, por ejemplo, en W.O.
Foye, ed., "Principles of Medicinal Chemistry" (3ª ed., Lea
& Febiger, Filadelfia, 1989), pág. 757-783, y se
incorporan como referencia en la presente memoria descriptiva. Entre
los agentes antineoplásicos ilustrativos se incluyen: (1)
antimetabolitos como metotrexato, 6-mercaptopurina,
6-tioguanina, citarabina,
5-fluorouracilo y dacarbazina; (2) agentes de
alquilación como trietilentiofosforamida ("tiotepa"),
clorambucilo, mefalán, ciclofosfamida, carmustina, lomustina,
busulfán, mitomicina C y cis-diclorodiaminoplatino; (3)
agentes de intercalación de ADN como doxorrubicina, daunorrubicina,
mitoxantrona y bisantreno; (4) fármacos con actividad antibiótica
como actinomicina D, bleomicina y antramicina; y (5) otros
compuestos como procarbazina, hidroxiurea y asparaginasa.
Las linfocinas adecuadas para unión a anticuerpos
monoclonales incluyen interferones, interleucinas, factores de
necrosis tumoral y factor de crecimiento transformante. Las
interleucinas incluyen IL-1\alpha,
IL-1\beta, IL-2,
IL-3, IL-4, IL-5,
IL-6, IL-7, IL-8,
IL-9, IL-10. Los factores de
necrosis tumoral incluyen TNF\alpha y TNF\beta. Los
interferones incluyen \alpha-INF, que tiene al
menos 20 subtipos, \beta-INF y
\gamma-INF. Las propiedades de estas linfocinas
se resumen sucintamente en E.S. Golub y D.R. Green, "Immunology:
a Synthesis" (2ª ed., Sinauer Associates, Inc. Sunderland,
Mass., 1991), pág. 444-461, incorporada como
referencia en la presente memoria descriptiva.
Las toxinas útiles para inmunoterapia incluyen
ricina, obtenida de aceite de castor, exotoxina de
Pseudomonas y toxina de la difteria. En la técnica se
conocen también otras toxinas semejantes.
Otro aspecto de la presente invención es el de
las composiciones farmacéuticas aceptables para su uso en la
reducción de la proliferación de VIH-1 en pacientes
infectados.
En general, una composición farmacéutica según la
presente invención comprende:
(1) un anticuerpo anti-CD2
monoclonal humanizado quimérico según la presente invención en una
cantidad suficiente para inhibir la producción de virus
VIH-1 en células T infectadas en un paciente
infectado con VIH-1; y
(2) un vehículo farmacéuticamente aceptable.
El anticuerpo anti-CD2 monoclonal
humanizado quimérico es preferentemente SFv-Ig CD2,
aunque pueden usarse también en la composición farmacéutica otros
anticuerpos según la presente invención.
Los vehículos farmacéuticamente aceptables
convencionales conocidos en la técnica pueden incluir alcoholes
como, por ejemplo, alcohol etílico, proteínas séricas, albúmina
sérica humana, liposomas, tampones como fosfatos, agua, solución
salina estéril y otras sales, electrolitos, glicerol,
hidroximetilcelulosa, propilenglicol, polietilenglicol,
polioxietilsorbitán, otros agentes activos superficiales, aceites
vegetales y agentes antifúngicos o antibacterianos convencionales,
como parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y
similares. Un vehículo farmacéuticamente aceptable dentro del ámbito
de la presente invención cumple los estándares industriales de
esterilidad, isotonicidad, estabilidad y no pirogenicidad. El
vehículo particular usado depende de la concentración del agente
capaz de bloquear el efecto supresor de defensa inmunitaria y de la
ruta pretendida de administración. Normalmente, una composición
farmacéutica según la presente invención se inyecta por una dentro
de una serie de rutas convencionales, como intravenosa,
intradérmica, intraperitoneal o intramuscular.
Otro aspecto de la invención es un procedimiento
para inhibir la producción de VIH-1 en células
infectadas por VIH-1 realizado in vitro. En
general, este procedimiento comprende:
(1) selección de células T infectadas por
VIH-1; y
(2) puesta en contacto de las células T
infectadas con un anticuerpo monoclonal capaz de interrumpir las
interacciones de superficie celular entre linfocitos T CD4^{+} y
monocitos para inhibir la producción de VIH-1 en las
células T infectadas, estando las células en contacto con el
anticuerpo en una cantidad suficiente para inhibir la producción de
VIH-1 en las células T puestas en contacto, según
se define en las reivindicaciones.
Los anticuerpos monoclonales descritos
anteriormente pueden usarse para inhibir la producción de
VIH-1 en células T infectadas por
VIH-1. En general se prefiere el uso de un
anticuerpo monocatenario monoclonal humanizado quimérico según la
presente invención, especialmente SFv-Ig CD2. Sin
embargo, pueden usarse también otros anticuerpos monoclonales, como
anticuerpo monoclonal divalente a CD2. Dichos anticuerpos a CD2
pueden combinarse con anticuerpos monoclonales a CD18, anticuerpos
monoclonales a contrarreceptor LFA-3 y anticuerpos
monoclonales a contrarreceptor ICAM-1, o el ligando
CD2 LFA-3 en una forma soluble, como proteína de
fusión de dominio extracelular.
En SFv-Ig CD2, concentraciones
tan bajas como 0,1 \mug/ml inhiben la producción de virus en más
del 50%. En anticuerpo monoclonal murino dimérico 35.1,
concentraciones tan bajas como 0,01 \mug/ml inhiben en más del
50%; concentraciones tan bajas como 0,10 \mug/ml inhiben en más
del 90%.
El anticuerpo usado puede conjugarse en un agente
terapéutico, si se desea.
A pesar de la concentración superior del
anticuerpo requerido, se prefiere generalmente el uso de anticuerpo
humanizado quimérico SFv-Ig CD2 para evitar la
posibilidad de reacciones inmunitarias indeseables de anticuerpos
murinos. Dichas interacciones no sólo pueden causar efectos
secundarios indeseables, sino que también pueden interferir con la
actividad de los anticuerpos administrados en sí mismos. La
concentración superior de los anticuerpos no es necesaria en
algunas circunstancias, como en el caso en que se genere un SFv
bivalente o se modifiquen secuencias de aminoácidos que rodean a
las regiones de unión para aumentar la eficacia de unión. Esta
modificación puede realizarse mediante técnicas estándar de
mutagénesis in vitro.
El procedimiento anterior forma la base de los
procedimientos para tratar a sujetos infectados con
VIH-1. Los sujetos infectados con
VIH-1 pueden tratarse con anticuerpos y
composiciones de la presente invención ex vivo o in
vivo.
En general, el procedimiento de tratamiento ex
vivo comprende: (1) selección de células T infectadas con
VIH-1; (2) puesta en contacto de las células T con
el anticuerpo, según se describe anteriormente; y (3) reinfusión de
las células T puestas en contacto en el paciente para aumentar la
proporción de células T funcionales no productoras de
VIH-1 en el sujeto, para tratar así al sujeto. En
algunos casos, puede ser preferible incluir una etapa adicional de
activación de las células T in vitro antes de reinfundirlas.
Esto puede ampliar la población eficaz de células T sin aumentar la
carga viral.
El intervalo de dosificación usado puede
seleccionarse de acuerdo con las dosis mínimas especificadas
anteriormente para anticuerpos determinados. La dosis puede
ajustare para el tratamiento médico según el estado clínico y la
respuesta del paciente. Esto incluye el recuento de células T del
paciente y la presencia o ausencia de infecciones oportunistas
determinadas. Este procedimiento puede reducir las complicaciones
de infección por VIH-1, incluyendo la aparición de
infecciones oportunistas y la demencia causada por la proliferación
de SIDA en tejido del sistema nervioso central.
El procedimiento puede usarse en conjunción con
la administración de antibióticos u otros agentes terapéuticos
específicos para tratar infecciones oportunistas asociadas con el
SIDA. Los ejemplos de dichos agentes terapéuticos incluyen
pentamidina aerosolizada para neumonía por Pneumocystis
carinii, isoniazida y/o rifampina para infecciones
micobacterianas y anfotericina B para candidiasis.
En general, el procedimiento de tratamiento in
vivo comprende la administración a un paciente cuyas células T
están infectadas con VIH-1 de un anticuerpo
monoclonal capaz de interrumpir las interacciones de superficie
celular entre linfocitos T CD4^{+} y monocitos para inhibir la
producción de VIH-1 en las células T infectadas.
Los anticuerpos monoclonales son los descritos anteriormente. La
cantidad de anticuerpo administrada es suficiente para aumentar la
proporción de células T funcionales no productoras de VIH en el
paciente o para inhibir la producción de VIH-1 en
las células T infectadas, de acuerdo con la guía de dosificación
dada anteriormente. La administración de anticuerpo in vivo
puede reducir las complicaciones asociadas con la infección por
VIH-1 y puede realizarse durante la
viremia.
viremia.
El anticuerpo monoclonal administrado in
vivo puede conjugarse con un agente terapéutico si se desea,
según se describe anteriormente.
Este procedimiento terapéutico puede combinarse
con la administración de antibióticos u otros agentes terapéuticos
específicos para tratar infecciones oportunistas asociadas con el
SIDA, según se describe anteriormente.
La invención se ilustra mediante los siguientes
Ejemplos. Estos Ejemplos tienen sólo fines ilustrativos y no
pretenden limitar la invención.
Se produjo un anticuerpo monoclonal monocatenario
quimérico que contiene regiones constantes humanas,
SFv-Ig CD2, mediante técnicas de ADN recombinante
del modo siguiente:
Se cultivaron células de hibridoma que expresan
anticuerpo CD2 antihumano de ratón 35.1 (P.J. Martin y col.,
"Functionally Distinct Epitopes of Human Tp50", J.
Immunol. 131:190-195 (1983)) en IMDM
suplementado con suero de ternera fetal (FCS) al 10% y se lisaron 5
x 10^{7} células mediante protocolo estándar (M. Gilman,
"Current Protocols in Molecular Biology" (John Wiley &
Sons, Nueva York, 1990), vol. I, pág. 4.1.2-4.1.6)
para aislar ARN celular total. Se sintetizó ADN de primera cadena
para la región variable de cadena ligera kappa de inmunoglobina
35.1 (VL) y la región variable de cadena pesada IgG2a 35.1 (VH)
usando transcriptasa inversa de virus de mieloblastosis aviar (AMV)
(Life Sciences, St. Petersburg, Florida) y cebadores específicos que
fueron complementarios a los nucleótidos 101-124 en
la región constante de cadena kappa murina (mck-1)
y los nucleótidos 101-123 en la región constante
lgG2a murina (mlgG2a).
Se añadió una terminación poli(dG) a la
cadena 3' de ADNc VL 35.1 usando transferasa de desoxinucleotidilo
terminal (Stratagene, La Jolla, California) y
mck-1. La segunda cadena se generó mediante la
reacción en cadena de la polimerasa anclada (E.Y. Loh y col.,
"Polymerase Chain Reaction with Single-Sided
Specificity: Analysis of T Cell Receptor & Chain",
Science 243: 217-220 (1989)) usando
mck-1 como cebador 3' específico.
Se usaron oligonucleótidos degenerados (Y.L.
Chiang y col., "Direct cDNA Cloning of the Rearranged Immunoglobin
Variable Region", Biotechniques 7:360-366
(1989)) para amplificar las secuencias VH 35.1 mediante un
procedimiento estándar de reacción en cadena de la polimerasa usando
polimerasa de ADN de Thermus aquaticus (Taq) termoestable
(R.K. Saiki y col., "Primer-Directed Enzymatic
Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase",
Science 239:487-491 (1988). Para reacciones
de PCR estándar y ancladas, se mezcló ADNc (0,1-1,0
\mug) con 1,25 mM de cada dNTP, 10 mM de Tris-HCl
(pH 8,3), 50 mM de KCl, 1,5 mM de MgCl_{2}, cebadores 5' y 3' a
entre 10 y 25 pmoles cada uno y 2 U de polimerasa de ADN de Taq
(Stratagene, La Jolla, California) en un volumen total de 100
\mul. Las muestras se sometieron a treinta tandas de ciclado de
temperatura usando un ciclador térmico Perkin-Elmer
Cetus (Norwalk, Connecticut). El ADN amplificado resultante se
purificó usando Geneclean (Bio101, La Jolla, California).
Los productos de PCR se trataron con el fragmento
de Klenow de polimerasa I de ADN de Escherichia coli (H.
Klenow e I. Henningsen, "Selective Elimination of the Exonuclease
Activity of the Deoxyribonucleic Acid Polymerase from
Escherichia coli by Limited Proteolysis", Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 65:168 (1970)) y dNTP para obtener fragmentos
con extremos romos. Se usó PCR para añadir sitios de restricción
EcoRI y BamHI a los extremos 5' y 3' del fragmento de ADNc VL.
Análogamente, se añadieron sitios de restricción XbaI e HindIII al
ADNc VH. Los fragmentos resultantes se digirieron con enzimas
apropiadas y se clonaron en vector pUC19 digerido con EcoRI y BamHI
o digerido con XbaI e HindIII. Los constructos se usaron para
transformar E. coli competente (cepa DH5\alpha).
Los clones que contienen VL y VH se identificaron
mediante secuenciación de ADN usando el kit Sequenase 2.0 (United
States Biochemical, Cleveland, Ohio) y cebadores directos e inversos
que se hibridan a secuencias pUC19 que flanquean el sitio de
policlonación. Las secuencias de consenso para VL y VH de 35.1 se
determinaron comparando múltiples clones y mediante alineación de
las secuencias con otras secuencias de regiones variables VL y VH
murinas (E.A. Kabat y col., "Sequences of Proteins of
Immunological Interest" (4ª ed., Departamento de Salud y
Servicios Humanos de los Estados Unidos, NIH, Bethesda, Md.,
1987)).
Se diseñaron nuevos cebadores que eliminan la
secuencia delantera de 5' de VL y se añadió un residuo 1 precedente
del sitio SalI de la proteína madura. Se sustituyeron los residuos
de la región constante 33 del extremo 3' por PCR usando un cebador
que añadió una secuencia complementaria a la secuencia que codifica
la secuencia de ligador de 16 residuos ESGSVSSEELAFRSLD (ID. SEC.
Nº: 1) (J.K. Batra y col.,
"Anti-Tac(FV)-PE40, a
Single Chain Antibody Pseudomonas Fusion Protein Directed at
Interleukin 2 Receptor-Bearing Cells", J.
Biol. Chem. 265:15198-15202 (1990)).
Asimismo, se diseñó un cebador VH que añadió la
secuencia de "sentido" que codifica el ligador en el residuo 1
precedente del extremo 5' de VH de la proteína madura y se
sustituyó un sitio BclI por los residuos de región constante en el
extremo 3'. Se usó reacción en cadena de la polimerasa con una
mezcla de ADNc de VL y VH como plantilla y una mezcla de los
cebadores de 4 (100 pmol de cada uno de los cebadores del ligador y
25 pmol de cada uno de los cebadores que contienen los sitios de
restricción; los demás reactivos, como antes), para crear un único
fragmento de ADN que contiene una secuencia
VL-ligador-VH flanqueada por sitios
SalI y BclI. El ADN se hizo pasar a través de células de E.
coli (cepa NEB208), purificado usando Geneclean (Bio101, La
Jolla, California) y digerido con SalI y BclI.
Se ligó el ADN que codifica VL y VH de CD2 unidas
en un vector pCDM8 que contenía la secuencia delantera de cadena
ligera de inmunoglobina anti-L6 después de un sitio
SalI y de un sitio BclI que precede a ADNc que codifica una
terminación de IgG1 humana en la que las cisteínas de la región
bisagra mutaron a serinas para inhibir la dimerización (P.S.
Linsley y col., "Binding of the B Cell Activation Antigen B7 to
CD28 Costimulates T Cell Proliferation and Interleukin 2 mRNA
Accumulation", J. Exp. Med. 173:721-730
(1991) ("Linsley y col. (1991a)").
El constructo se amplificó en cepa de E.
coli MC1061/P3 y el ADN de plásmido se purificó en gradientes de
CsCl. Se verificó el ADN mediante secuenciación antes de
transfección en células COS con DEAE-dextrano y a
continuación se expresó en células COS mediante transfección
transitoria (A. Aruffo, "Transient Expression of Proteins Using
COS Cells", en Current Protocols in Molecular Biology (2ª
ed., F.M. Ausubel y col., ed., John Wiley & Sons, Nueva York,
1991), pág. 16.13.1-16.13.7). Las células COS se
cultivaron durante toda la noche en DMEM complementado con FCS al
10% y durante 6 días más en DMEM sin suero. Se recogió el
sobrenadante sin suero y se purificó en una columna que contenía
Proteína A-Sefarosa (Repligen, Cambridge,
Massachussets). Se eluyó la proteína unida en tampón de citrato y
se dializó en PBS. La concentración de proteínas se determinó
usando un kit de ensayo de proteínas (BioRad, Richmond,
California).
Para determinar el efecto de una serie de
anticuerpos monoclonales, incluyendo el anticuerpo
anti-CD2 humanizado quimérico del Ejemplo 1 en la
producción de VIH-1 en células T CD4^{+}
infectadas con VIH-1, se midió la generación del
antígeno p24 de VIH-1 en células tratadas con varios
anticuerpos monoclonales.
Se obtuvo OKT3 (anti-CD3) de
hibridoma de la American Type Culture Collection, Rockville,
Maryland. Se purificó el sobrenadante del cultivo, que contenía el
anticuerpo, mediante cromatografía de proteína A sefarosa. Se
obtuvieron anticuerpos purificados para LFA-3 (Ts
2/9) e ICAM-1 (84H10) del Dr. Nitin K. Damle, del
Bristol-Myers Squibb Pharmaceutical Research
Institute, Seattle, Washington. mAbs 9.3
(anti-CD28), 35.1 (anti-CD2),
G10-1 (anti-CD8), 60.3
(anti-CD18), 10.2 (anti-CD5),
G3-7 (anti-CD7),
FC-1 (anti-CD16), 1F5
(anti-CD20), 60.1 (anti-CD11b) y BB1
(anti-B7) purificados se han descrito anteriormente
(A.J. McMichael (ed.), "Leukocyte Typing III" (Oxford
University Press, Oxford, Inglaterra, 1987); W. Knapp y col. (ed.),
"Leucocyte Typing IV" (Oxford University Press, Oxford,
Inglaterra, 1989). Se produjo inmunoglobina (Ig)
CTLA-4 purificada por afinidad mediante células CHO
que se transfectaron con el gen de expresión de ADNc de Ig
CTLA-4 según se ha descrito anteriormente (P.S.
Linsley y col., "CTLA-4 Is a Second Receptor for
the B Cell Activation Antigen B7", J. Exp. Med.
174:561-569 (1991) ("Linsley y col. (1991b)").
Se obtuvo mAb, cL6 quimérico de ratón humano purificado del Dr.
Hellstrom, Bristol-Myers Squibb, Seattle,
Washington. Se usaron anticuerpos de bloqueo a CD2 (mAb 35.1
(purificado)) y a contrarreceptor de CD2 LFA-3 (mAb
Ts 2/9 (como ascitis)), a 10 \mug/ml para anticuerpo purificado, o
en una dilución de ascitis final de 1:250 en medio completo. Se
usaron también anticuerpo purificado a ICAM-1 (mAb
84H10); al contrarreceptor de ICAM-1
LFA-1 (también conocido como CD-18)
(mAb 60.3); al contrarreceptor de CD28 B7 (mAb BB1) y al CD7 mAbs
de control, G3-7, y CD6 humano a 10 \mug/ml. Se
generaron líquidos de ascitis que contenían el mAb respectivo (Ts
2/9 y KB61) en ratones Balb/c cebados con pristano y se purificó
parcialmente mediante precipitación con sulfato de amonio.
Se obtuvo sangre heparinizada con consentimiento
informado de individuos asintomáticos infectados por
VIH-1, así como de individuos no infectados.
Se aislaron células mononucleares de sangre
periférica (PBMC) mediante centrifugado por gradiente de densidad de
Ficoll-Hypaque. Excepto cuando se advierte, en las
PBMC de todos los experimentos se suprimieron CD8^{+}, células B
y células NK mediante tratamiento con mAb anti-CD8
G10, mAb anti-CD20 IF5 específico de células B y
FC1 mAb anti-CD16 específico de células NK durante
30 minutos a 4ºC, seguido de complemento (C', C' de cría de conejo
de baja toxicidad, Pel-Freez, Brown Deer, Wisconsin)
durante 45 minutos a 37ºC. Las células se lavaron y se volvieron a
suspender en medio completo (medio RPMI 1640 (Gibco, Grand Island,
Nueva York)) suplementado con suero humano normal de reserva
inactivada por calor al 10% de donantes seronegativos, 10 mM de
HEPES, 2 mM de L-glutamina, 100 U/ml de penicilina
y 100 \mug/ml de estreptomicina) y se volvieron a suspender a 1 x
10^{6} células/ml.
En la mayoría de los experimentos, excepto cuando
se advierte, se estimularon 1 x 10^{5} células en 0,1 ml con mAb
anti-CD3 soluble (1 \mug/ml), ya sea OKT 3 (ATCC)
o G19-4 (H. Kaneoka y col., "Human T Lymphocyte
Proliferation Induced by a Pan-T Monoclonal
Antibody (Anti-Leu 4): Heterogeneity of Response in
a Function of Monocytes", J. Immunol.
131:158-164 (1983); W.J.M. Tax y col.,
"Polymorphism in Mitogenic Effect of IgG1 Monoclonal Antibodies
Against T3 Antigen on Human T Cells", Nature
304:445-447 (1983)) en placas de cultivo de tejidos
de 96 pocillos de base redonda (Falcon, Lincoln Park, Nueva Jersey).
Se añadieron factores (mAb de bloqueo o control a 10 \mug/ml,
CTLA-4 a 10 \mug/ml e IL-2
purificada +/- (Pharmacia) a 30 U/ml) en el momento de activación
para un volumen final de 0,25 ml, y a continuación se incubó a 37ºC
con CO_{2} al 5% durante 7 días o más para recogida de
sobrenadantes mediante ensayo de proteína específica de
VIH-1 p24 con ELISA (Genetic Systems, Seattle
Washington).
Para experimentos de superantígeno (SAg), se
añadieron enterotoxinas estafilocócicas (Toxin Technology,
Sarasota, Florida) como un cóctel con una concentración final de
antígeno total de 1,8 \mug/ml. Se incubaron PBMC junto con
estimulaciones anti-CD3 y se recogieron
sobrenadantes para ensayo de captura de antígeno p24 después de 7
días de cultivo.
Cuatro días después de activación, se
transfirieron partes alícuotas de células de 100 \mul
cuadruplicadas de cada pocillo a placas de base redonda de 96
pocillos y se marcaron con 1,0 \muCi/pocillo de timidina tritiada
([^{3}H]TdR, New England Nuclear, Boston, Massachussets),
seguido de incubación a 37ºC con CO_{2} al 5%. Se recogieron las
células de 6 a 16 horas después usando un recolector de células y
se contaron mediante centelleo líquido. Se calcularon los índices
de estimulación, I.E., dividiendo la incorporación media de
[^{3}H]TdR de células estimuladas (no tratadas) por la
incorporación media de [^{3}H]TdR de células no
estimuladas. Se realimentaron los pocillos de los que se habían
tomado las células para ensayos de proliferación con medio completo
y se reincubó a 37ºC y con CO_{2} al 5%, para medida final de
antígeno p24 según se describe a continuación.
En el día 7, excepto cuando se advierte, se
eliminaron los sobrenadantes de los pocillos cuadruplicados de
cultivos de PBMC y se midió el antígeno p24 mediante ELISA (Genetic
Systems, Seattle, Washington). Se generó una curva estándar para
cada ensayo a partir de la cual se calcularon los valores de p24 de
valores de sobrenadante desconocido. Los porcentajes de inhibición
de p24 se basaron en la media total de p24 de 4 a 8 pocillos
replicados, inducida después de estimulación con
anti-CD2 o SAg en solitario.
La estimulación de PBMC de pacientes con
anti-CD3 soluble indujo altos niveles de producción
de VIH-1 (hasta 10 \mug/ml de p24 o más). En
contraste, la estimulación con anti-CD3
inmovilizado indujo niveles muy bajos (inferiores a 10 ng/ml de
p24). El nivel de p24 en sobrenadantes de PBMC activado es
proporcional al nivel de VIH-1 presente según se
determina mediante infectividad en blastos PHA, y así es un
indicador útil de proliferación de VIH-1.
Para investigar la función de las moléculas de
interacción célula-célula que participan en la
producción de VIH-1 después de activación con
anti-CD3 soluble, los autores de la invención
probaron el efecto de mAb en varias moléculas de adhesión a
superficie celular que, según se sabe, son importantes para la
adhesión (la unión de moléculas de superficie celular encontrada en
monocitos a moléculas de superficie celular encontradas en células
T).
Las Figuras 1a y 1b muestran que mAb a
LFA-3 o su contrarreceptor CD2, o mAb a CD18 (la
subunidad \beta para LFA-1) o su contrarreceptor
ICAM-1, inhibió acusadamente la producción de
VIH-1 mediante PBMC, lo que sugiere que se requiere
la participación cooperativa de estos pares receptor/contrarreceptor
para la interacción de monocitos/células T que lleva a la
producción de VIH-1.
El mAb a CD2, LFA-3 o
ICAM-1 inhibió la producción de
VIH-1 desde el 80% a más del 99%. La inhibición de
la producción de VIH-1 por mAb a CD2, o
LFA-3, o CD18, o ICAM-1 ocurrió en
presencia o ausencia de IL-2 exógena. Sin embargo,
sin IL-2 exógena, la proliferación de células T
CD4^{+} se redujo acusadamente en cultivos activados de
anti-CD3 tratados con mAb a CD2, o CD18, o
LFA-3 (mAb a ICAM-1 inhibió la
proliferación en menor medida en alguna PBMC de donante). Es
importante que la proliferación de células T CD4^{+} se mantuvo en
presencia de IL-2 exógena (Figura 1a) se redujo
acusadamente incluso la producción de VIH-1. Esto
es significativo porque la proliferación de células T CD4^{+} es
importante para desarrollar resistencia a las infecciones
oportunistas que caracterizan el SIDA.
Anti-CD2 (mAb 35.1) inhibió la
producción de VIH-1 en más del 90% en
concentraciones tan bajas como 0,1 \mug/ml de anticuerpo (Figura
2). La acusada inhibición de producción de p24 observada con mAb
35.1 se observó consistentemente en seis experimentos separados, con
PBMC de dos donantes por experimento. La adición de
anti-CD2 hasta, pero no después de, 24 horas
post-estimulación con anti-CD3 fue
eficaz para inhibir la producción de VIH-1.
Estos resultados sugieren que la interrupción de
interacciones de CD2/LFA-3 en puntos de tiempo
precoces después de la activación es más importante para inhibir
la producción de VIH-1 que el bloqueo de
interacciones de células T-monocitos en puntos de
tiempo tardíos (es decir, después de 24 horas
post-activación).
El bloqueo de la interacción
CD2/LFA-3 con mAb 35.1 a CD2 fue compartido por
otros mAb de CD2, 9.6 y 9.1; sin embargo, 35.1 tuvo la máxima
eficacia para inhibir la producción de VIH-1, ya sea
reflejando diferencias de afinidad o epítopos en mAb de CD2. La
inhibición de producción de VIH-1 por
anti-LFA-3 fue también reproducible
en experimentos en los que se activaron PBMC de una serie de
donantes seropositivos con anti-CD3.
Ig CTLA-4, un homólogo de CD28,
inhibe también producción de VIH-1 inducida por
anti-CD3. CTLA-4 es análogo a CD28
en células T en las que estas dos moléculas unen B7 en monocitos
(Linsley y col. (1991b), más arriba). La coestimulación (es decir,
aumento de señalización de receptores de células T (TCR) por
moléculas de superficie celular como CD28, CD2,
LFA-1 y otros) de CD28 y TCR ha demostrado que
induce altos niveles de producción de IL-2 (R.A.W.
Van Lier y col, "Signals Involved in T Cell Activation: T Cell
Proliferation Induced Through the Synergistic Action of
Anti-CD28 and Anti-CD2 Monoclonal
Antibodies", Eur. J. Immunol. 18:167-172
(1988)) y acumulación de ARNm de IL-2 (Linsley y
col. (1991a), más arriba). Para determinar qué efecto tuvo el
bloqueo de la vía CD28/B7 sobre la producción de
VIH-1, se añadió proteína de fusión de Ig
CTLA-4 recombinante soluble (Linsley y col, (1991b),
más arriba)) o mAb a CD28 (9.2) o B7 (BB1) a PBMC activada
anti-CD3 en presencia o ausencia de
IL-2 exógena.
Los resultados de la Tabla 1 muestran que la Ig
CTLA-4 inhibió la producción de
VIH-1 en más del 70%. Los mAb BB1 y 9.3,
anti-B7 y anti-CD28,
respectivamente, no inhibieron la producción de
VIH-1. La Ig CTLA-4 se une a B7 con
mayor afinidad que el mAb BB1 (Linsley y col. (1991b), más arriba) y
es un inhibidor más potente de la participación de B7/CD28.
Anti-CD28 tuvo también efectos
marginales en la producción de VIH-1, ya que este
mAb puede sustituir la interacción B7/CD28 y estimular parcialmente
el receptor CD28 en células T. Esto se indica por los niveles muy
superiores de proliferación de células T observado con
anti-CD3 en presencia de anti-CD28,
sin adición de IL-2 exógena (Tabla 1). Sin embargo,
la inhibición de VIH-1 por Ig
CTLA-4 fue inferior al 40% cuando se añadió
IL-2 a PBMC activada con anti-CD3.
Se ha demostrado que la Ig CTLA-4 inhibe la
producción de IL-2 endógena. Por tanto, la
inhibición por CTLA-4 de la producción de
VIH-1 estuvo relacionada parcialmente con la
producción de IL-2 endógena reducida, con el
resultado de una menor proliferación de células T CD4^{+} y
probablemente un descenso en la producción y/o dispersión de
VIH-1.
| Estimulación anti- | Proteína añadida | p24, ng/ml | % inhibición VIH | I.E. |
| CD3 de PBMC | ||||
| +IL-2 | ninguna | 716 | - | 232 |
| Ig CTLA-4 | 454 | 36 | 270 | |
| \alpha-cL6 | 796 | 0 | 281 | |
| \alpha-B7 | 634 | 11 | 257 | |
| \alpha-CD28 | 730 | 0 | 286 | |
| -IL-2 | ninguna | 601 | - | 79 |
| Ig CTLA-4 | 164 | 72 | 36 | |
| \alpha-cL6 | 444 | 26 | 100 | |
| \alpha-B7 | 564 | 6 | 150 | |
| \alpha-CD28 | 401 | 33 | 217 |
PBMC que fueron estimuladas con
anti-CD soluble (OKT3) y luego cultivadas en
presencia o ausencia de adición de 30 U/ml de IL-2
exógena. mAb a L6 (cL6) o B7 (BB1) o CD28 (9.3) o la proteína de
fusión Ig CTLA-4 se añadieron a 10 \mug/ml de
concentración final en el momento de la activación de
anti-CD3. La inhibición porcentual de p24 se basó en
la media de VIH-1 inducido por OKT3 de siete
pocillos replicados. I.E. = índice de estimulación (media de cpm
estimulados/media de no estimulados) a partir de incorporación de
[^{3}H]Tdr.
La inhibición de producción de
VIH-1 por mAb a moléculas de adhesión no se debió a
competencia con anti-CD3 por receptores Fc. Para
garantizar que los efectos inhibidores virales de mAb a moléculas de
adhesión no se debió a competencia por receptores Fc de monocitos
con la mAb \alpha-CD3 activadora, se añadió
anticuerpo F(ab')_{2} o Fab a CD18/LFA-1
(60.3) y CD2 (9.6), respectivamente, a PBMC activadas con
anti-CD3.
La Tabla 2 muestra que con estos mAb de no unión
a Fc se logró más del 80% de inhibición de producción de
VIH-1. Estos resultados muestran que la inhibición
de producción de VIH-1 mediada por mAb a moléculas
de adhesión se debe a la interrupción de las interacciones
célula-célula necesarias para la producción eficaz
de VIH-1. La inhibición de producción de
VIH-1 no se debió, así, a la competencia por
receptor Fc con el agente activador,
\alpha-CD3.
| Estimulación anti- | mAb | p24, ng/ml | % inhibición VIH | I.E. |
| CD3 de PBMC | ||||
| Z31 | ninguna | 122 | - | 33 |
| \alpha-CD18 Fab'2 | 7 | 94 | 30 | |
| \alpha-CD2 Fab | 22 | 82 | 38 | |
| Z35 | ninguna | 2328 | - | 57 |
| \alpha-CD18 Fab'2 | 337 | 85 | 54 | |
| \alpha-CD2 Fab | 389 | 84 | 62 |
Se añadieron mAb (10 mg/ml) e
IL-2 (30 U/ml) de Fab a-CD2 (9.6) o
Fab'2 \alpha-CD18 (60.3) a PBMC en el momento de
la estimulación. Las PBMC se estimularon con
anti-CD3 soluble (G19-4, 1
\mug/ml) en presencia o ausencia de mAb a CD2 o CD18 para medida
de p24 en el día 11 post-activación. Z31 y Z35
indican PBMC, con deleción de CD8^{+}, células B y células NK de
pacientes seropositivos de VIH-1 asintomáticos. I.E.
= índice de estimulación (media de cpm estimulados/media de no
estimulados) a partir de incorporación de [^{3}H]Tdr.
Los mAb a moléculas de adhesión inhibió también
la producción de VIH-1 inducida por enterotoxina
estafilocócica (SAg). A diferencia de \alpha-CD3
soluble, SAg requiere presentación de antígeno de
histocompatibilidad principal monocitaria de clase II (MHC II),
pero la mayoría de SAg no requieren procesamiento de antígenos.
La Tabla 3 muestra que todas las moléculas de
adhesión, excepto B7/CD28, que son importantes para producción de
VIH-1 por activación de anti-CD3,
también son importantes para la producción de VIH-1
después de activación por SAg. Sin embargo, la Ig
CTLA-4 soluble no inhibe la producción de
VIH-1 inducida por SAg incluso en ausencia de
IL-2 exógena. La falta de inhibición por Ig
CTLA-4 en PBMC estimulada por SAg se debió
probablemente a la producción de IL-2 exógena. Se
han comunicado concentraciones picomolares de SAg para inducir
intensa proliferación de células T y liberación de grandes
cantidades de IL-2, \gamma-IFN y
TNF (C.D. Tsoukas y col. "Activation of Resting T Lymphocytes by
Anti-CD3 (T3) Antibodies in the Absence of
Monocytes", J. Immunol. 135:1719-1723
(1985); H. Fischer y col., "Production of
TNF-\alpha y TNF-\beta by
Staphylococcal Enterotoxin A Activated Human T Cells", J.
Immunol. 144:4663-4669 (1990)) y así el efecto
inhibidor potencial de Ig CTLA-4 puede haber sido
superado por IL-2 endógena producida después de
estimulación SAg.
El anticuerpo monoclonal monocatenario humanizado
quimérico SFv-Ig CD2 del Ejemplo 1 fue eficaz en el
bloqueo de proliferación de VIH-1 en células T
infectadas por VIH-1 CD4^{+}. Concentraciones tan
bajas como 0,1 \mug/ml de SFv-Ig CD2 inhibieron
la producción de VIH-1 inducida por
anti-CD3 en más del 50% (Figura 2).
SFv-Ig CD2 no inhibió la proliferación de células T
CD4^{+} en la misma medida que mAb 35.1. En un experimento para
probar el efecto de SFv-Ig CD2 en la producción de
VIH-1 inducida por SAg, SFv-Ig CD2
inhibió la producción de VIH-1 inducida por SAg con
respecto a PBMC en el 50 al 96% a 0,1-10 \mug/ml
sin inhibición de proliferación de células T, se añadiera o no
IL-2 exógena.
El mAb a CD6, CD5, CD14, CD11C (p180, 95) y CD44
no inhibió la producción de VIH-1. Asimismo, el mAb
a CD28, B7, CD11b (MAC-1) o CD7 no tuvo efectos
inhibidores consistentes en la producción de VIH-1
(Figura 1, y Tablas 1 y 3).
| Estimulación | mAb o proteína | p24, ng/ml | % inhibición VIH | I.E. |
| SAg de PBMC | añadido | |||
| Parte a) | ninguna | 83 | 79 | 79 |
| \alpha-LFA-3 | 3 | 96 | 50 | |
| \alpha-CD2 | 7 | 92 | 40 | |
| \alpha-ICAM-1 | 2 | 98 | 54 | |
| \alpha-CD18 | 4 | 97 | 69 | |
| \alpha-MAC-1 | 77 | 7 | 48 | |
| (CD18/CD11b) | ||||
| Parte b) | ninguna | 24 | - | 60 |
| Ig CTLA-4 | 91 | 0 | 60 | |
| \alpha-cL6 | 67 | 0 | 69 |
\vskip1.000000\baselineskip
Parte a) Las PBMC, con deleción de CD8^{+},
células B y células NK, se activaron con un cóctel de SAg (SEE, SEC2
y toxina exfoliativa, 0,6 \mug/ml cada una). MAb a
LFA-3 (Ts 2/9), o CD2 (35.1), o
ICAM-1 (84H10), o CD18 (60.3), o CD18/CD11b (60.1)
se añadieron con 30 U/ml de IL-2 a una concentración
final de 10 \mug/ml después de activación de SAg de PBMC.
Parte b) En un experimento separado, las PBMC se
activaron con el mismo cóctel que en la parte (a) sin adición de
IL-2 exógena. Se añadió proteína Ig
CTLA-4 o mAb cL6 humano, control, (10 \mug/ml) a
PBMC en el momento de la activación y se sometió a ensayo el
sobrenadante después de 7 días. I.E. = índice de estimulación (media
de cpm estimulados/media de no estimulados) a partir de
incorporación de [^{3}H]Tdr.
Estos resultados sugieren que la terapia de
pacientes infectados con VIH-1 puede dirigirse a las
interacciones células T-monocitos que han demostrado
ser importantes para la producción de VIH-1. El
anticuerpo anti-CD2 humanizado quimérico,
SFv-Ig CD2, puede ser útil para esta terapia.
Para garantizar que el anticuerpo humanizado
quimérico SFv-Ig CD2 unido al mismo epítopo que el
anticuerpo monoclonal murino 35.1 del cual procede, se realizaron
experimentos de competencia en los que mAb 35.1 y
SFv-Ig CD2 competían con mAb 35.1 marcado para unión
a CD2 en células T Jurkat, según se determina por FACS.
Las células T Jurkat (10^{6}) se incubaron con
diluciones 10 veces en serie de anti-CD2 (35.1) no
marcado, SFv-Ig CD2 o control
CD5-Ig, durante 90 minutos en hielo en medio de
tinción (medio RPMI 1640, + suero de ternera fetal al 5% + azida de
sodio al 0,1%) en un volumen total de 0,2 ml, antes de la adición de
mAb (anti-CD2) 35.1 marcado con isotiocianato de
fluoresceína (FITC) a dilución de 1:3.000 en medio de tinción. Las
células se lavaron y analizaron por FACS.
Los resultados se muestran en la Figura 3.
SFv-Ig CD2 compitieron eficazmente con mAb 35.1 para
unión a antígeno CD2, lo que indicó que se unían al mismo
epítopo.
La presente invención proporciona un anticuerpo
monoclonal humanizado quimérico a antígeno CD2,
SFv-Ig CD2, que puede inhibir la proliferación de
virus VIH-1 en células T infectadas. El anticuerpo
monoclonal evoca una respuesta inmunitaria mínima y se tolera mejor
que los anticuerpos monoclonales murinos nativos. La presente
invención proporciona también procedimientos para usar anticuerpos
monoclonales, que incluyen anticuerpos monoclonales humanizados
quiméricos según la presente invención, para inhibir la
proliferación de VIH-1 como procedimiento de
tratamiento o paliación del SIDA, ya sea in vivo o ex
vivo. Este procedimiento conserva la función de células T a la
vez que suprime la replicación de VIH-1. Es
particularmente útil en el tratamiento de infección oportunista que
acompaña frecuentemente al SIDA y puede usarse junto con terapias
para dichas infecciones oportunis-
tas.
tas.
Aunque la presente invención se ha descrito en
considerable detalle con respecto a ciertas versiones preferidas de
la misma, son posibles otras versiones. Por tanto, el espíritu y el
ámbito de las reivindicaciones adjuntas no debe limitarse a las
descripciones de las versiones preferidas contenidas en la presente
memoria descriptiva.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Diegel, Michael L
\hskip4cmLinsley, Peter S
\hskip4cmGilliland, Lisa K
\hskip4cmZarling, Joyce M
\hskip4cmMoran, Patricia A
\hskip4cmLedbetter, Jeffrey A
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Anticuerpos monoclonales y Fv específicos para antígeno CD2
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 1
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Sheldon & Mak
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 225 South Lake Avenue, Ninth Floor
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Pasadena
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: California
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Estados Unidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 91101
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMATO LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE SOPORTE: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión#1.25
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: EE.UU. ___/___, ___
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DE AGENTE/ABOGADO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Farber, Michael B
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 32.612
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/REGISTRO: 9569
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (818) 796-4000
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FAX: (818) 795-6321
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID. SEC. Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 16 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Secuencia de ligador sintético
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID. SEC. Nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Glu Leu Ala
Phe Arg Ser Leu Asp}
Claims (38)
1. Un anticuerpo monoclonal monocatenario
humanizado quimérico que tiene afinidad de unión específica para
antígeno CD2, estando el anticuerpo monoclonal seleccionado del
grupo constituido por:
(a) anticuerpo monoclonal quimérico
SFv-Ig CD2 obtenible por expresión del constructo
clonado en cultivo de Escherichia coli recombinante ATCC nº
69.277; y
(b) un anticuerpo monoclonal que puede competir
con SFv-Ig CD2 obtenible por expresión del
constructo clonado en cultivo de Escherichia coli
recombinante ATCC nº 69.277 para unión a antígeno CD2 con una
eficacia de al menos el 80% sobre una base molar como
SFv-Ig CD2.
2. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación
1 en el que el anticuerpo monoclonal compite con
SFv-Ig CD2 para unión a antígeno CD2 con una
eficacia de al menos el 90% sobre una base molar con respecto a
SFv-Ig
CD2.
CD2.
3. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación
1 en el que las regiones determinantes de complementariedad de
origen de cadena H son idénticas en secuencia a las de
SFv-Ig CD2; y/o en el que las regiones determinantes
de complementariedad de origen de cadena L son idénticas en
secuencia a las de SFv-Ig CD2.
4. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación
1 en el que el anticuerpo es anticuerpo monoclonal quimérico
SFv-Ig CD2.
5. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación
1 marcado con un marcador detectable.
6. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación
5 en el que el marcador detectable se selecciona del grupo
constituido por enzimas, materiales paramagnéticos, miembros del par
de unión específico avidina-biotina, fluoróforos,
cromóforos, quimioluminóforos, metales pesados y radioisótopos.
7. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación
1 conjugado con un agente terapéutico.
8. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación
7 en el que el agente terapéutico se selecciona del grupo
constituido por fármacos antineoplásicos, linfocinas y toxinas.
9. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación
8 en el que la linfocina se selecciona del grupo constituido por
interleucinas, interferones y factores de necrosis tumoral; o en el
que la toxina se selecciona del grupo constituido por ricina,
exotoxina de Pseudomonas y toxina de la difteria.
10. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación
9 en el que el agente terapéutico es interleucina 2.
11. Un anticuerpo modificado a partir del
anticuerpo de la reivindicación 1 por alteración o deleción de al
menos una porción de la secuencia de aminoácido obtenida de Ig del
mismo.
12. Un anticuerpo modificado a partir del
anticuerpo de la reivindicación 4 por alteración o deleción de al
menos una porción de la secuencia de aminoácido obtenida de Ig del
mismo.
13. Una composición farmacéutica que
comprende:
(a) al menos un anticuerpo monoclonal de las
reivindicaciones 1 a 12 en una cantidad suficiente para inhibir la
producción de VIH-1 en células T infectadas en un
paciente infectado con VIH-1; y
(b) un vehículo farmacéuticamente aceptable.
14. La composición farmacéutica de la
reivindicación 13 en la que el anticuerpo monoclonal es
SFv-Ig CD2.
15. Una línea celular de Escherichia coli
recombinante transformada establemente por un constructo capaz de
expresar anticuerpo monoclonal humanizado quimérico
SFv-Ig CD2 en células de mamífero y depositada en la
American Type Culture Commission como ATCC nº 69277.
16. Un constructo de ADN capaz de expresar
anticuerpo monoclonal humanizado quimérico SFv-Ig
CD2 en células de mamífero y que incluye regiones determinantes de
complementariedad murinas y regiones constantes humanas.
17. Un procedimiento in vitro para inhibir
la producción de VIH-1 en células T infectadas por
VIH-1 que comprende las etapas de:
(a) selección de células T infectadas por
VIH-1; y
(b) puesta en contacto de las células T
infectadas con un anticuerpo monoclonal capaz de interrumpir las
interacciones de superficie celular entre linfocitos T CD4^{+} y
monocitos para inhibir la producción de VIH-1 en
células T infectadas, estando en contacto las células con una
cantidad de anticuerpo suficiente para inhibir la producción de
VIH-1 en las células T puestas en contacto, en las
que el anticuerpo es específico para CD2 y bloquea la unión de
antígeno CD2 con su contrarreceptor LFA-3.
18. Un procedimiento in vitro para inhibir
la producción de VIH-1 en células T infectadas por
VIH-1 que comprende las etapas de:
(a) selección de células T infectadas por
VIH-1; y
(b) puesta en contacto de las células T
infectadas con al menos un anticuerpo que es específico de CD2 y
bloquea la unión de antígeno CD2 con su contrarreceptor
LFA-4, y opcionalmente al menos uno de los
siguientes anticuerpos o ligandos en una cantidad suficiente para
inhibir la producción de VIH-1 en las células T
puestas en contacto:
- (i)
- un anticuerpo seleccionado del grupo constituido por un anticuerpo monoclonal a CD18, un anticuerpo monoclonal a contrarreceptor LFA-3 y un anticuerpo monoclonal a contrarreceptor ICAM-1; y
- (ii)
- un ligando LFA-3 que comprende el dominio extracelular de LFA-3 en forma soluble.
19. El procedimiento de la reivindicación 18 en
el que el anticuerpo es específico de CD2 y bloquea la unión de
antígeno CD2 con su contrarreceptor LFA-3, siendo
dicho anticuerpo un anticuerpo monoclonal CD2.
20. El procedimiento de la reivindicación 19 en
el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal que tiene afinidad
de unión específica para antígeno de CD2, estando seleccionado el
anticuerpo monoclonal a partir del grupo constituido por:
(i) un anticuerpo monoclonal quimérico
SFv-Ig CD2;
(ii) un anticuerpo monoclonal que tiene regiones
determinantes de complementariedad idénticas a las de
SFv-Ig CD2 y que tiene al menos un segmento de
secuencia de al menos cinco aminoácidos de origen humano; y
(iii) un anticuerpo monoclonal que compite con
SFv-Ig CD2 para unión al antígeno CD2 con una
eficacia de al menos el 80% sobre una base molar con respecto a
SFv-Ig CD2 y que tiene al menos un segmento de
secuencia de al menos cinco aminoácidos de origen humano.
21. El procedimiento de la reivindicación 18 en
el que el anticuerpo es según se define en una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, 11 ó 12; o se conjuga con un agente
terapéutico, según se define en una cualquiera de las
reivindicaciones 7 a 10.
22. El uso de células T pretratadas de un sujeto
infectado por VIH-1 obtenibles mediante puesta en
contacto de las células T infectadas con al menos un anticuerpo
monoclonal capaz de interrumpir las interacciones de superficie
celular entre linfocitos T CD4^{+} y monocitos para inhibir la
producción de VIH-1 en las células T infectadas,
estando en contacto las células con una cantidad del anticuerpo
suficiente para inhibir la producción de VIH-1 en
las células T puestas en contacto; en el que el anticuerpo es
específico de CD2 y bloquea la unión de antígeno CD2 con su
contrarreceptor LFA-3, para preparación de una
composición farmacéutica para el tratamiento de un sujeto infectado
con VIH-1 con el fin de aumentar la proporción de
células T funcionales no productoras de VIH-1 en el
sujeto.
23. El uso de células T pretratadas de un sujeto
infectado con VIH-1 obtenibles mediante puesta en
contacto de las células T infectadas con al menos un anticuerpo que
es específico de CD2 y bloquea la unión de antígeno CD2 con su
contrarreceptor LFA-3, y opcionalmente al menos un
anticuerpo seleccionado del grupo constituido por un anticuerpo
monoclonal a CD18, un anticuerpo monoclonal a contrarreceptor
LFA-3 y un anticuerpo monoclonal a contrarreceptor
ICAM-1, en una cantidad suficiente para inhibir la
producción de VIH-1 en las células T puestas en
contacto, para preparación de una composición farmacéutica para el
tratamiento de un sujeto infectado con VIH-1 con el
fin de aumentar la proporción de células T funcionales no
productoras de VIH-1 en el sujeto.
24. El uso de la reivindicación 22 ó 23 en el que
las células T puestas en contacto se activaron in vitro.
25. El uso de la reivindicación 23 para reducir
las complicaciones asociadas a la infección por
VIH-1.
26. El uso de la reivindicación 23 en el que el
anticuerpo es específico de CD2 y bloquea la unión de antígeno CD2
con su contrarreceptor LFA-3, siendo el anticuerpo
seleccionado entre los anticuerpos monoclonales de las
reivindicaciones 1 a 12 o un anticuerpo monoclonal a CD2.
27. El uso de la reivindicación 26 en el que el
anticuerpo es un anticuerpo monoclonal que tiene afinidad de unión
específica por antígeno CD2, siendo seleccionado el anticuerpo
monoclonal del grupo constituido por:
(i) anticuerpo monoclonal quimérico
SFv-Ig CD2;
(ii) un anticuerpo monoclonal que tiene regiones
determinantes de complementariedad idénticas a las de
SFv-Ig CD2 y que tiene al menos un segmento de
secuencia de al menos cinco aminoácidos de origen humano; y
(iii) un anticuerpo monoclonal que compite con
SFv-Ig CD2 para unión a antígeno CD2 con una
eficacia de al menos el 80% sobre una base molar con respecto a
SFv-Ig CD2 y que tiene al menos un segmento de
secuencia de al menos cinco aminoácidos de origen humano.
28. El uso de la reivindicación 27 en el que el
anticuerpo es anticuerpo monoclonal quimérico SFv-Ig
CD2.
29. El uso de la reivindicación 23 en el que el
anticuerpo se conjuga con un agente terapéutico según se define en
una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10.
30. El uso de la reivindicación 23 a 29 en
combinación con al menos un agente específico de una infección
oportunista asociada a SIDA.
31. El uso de la reivindicación 30 en el que el
agente se selecciona del grupo constituido por pentamidina
aerosolizada, isoniazida, rifampina y anfotericina B.
32. El uso de al menos un anticuerpo monoclonal
capaz de interrumpir las interacciones de superficie celular entre
linfocitos T CD4^{+} y monocitos para inhibir la producción de
VIH-1 en las células T infectadas, estando
presentes los anticuerpos en una cantidad suficiente para inhibir la
producción de VIH-1 en células T infectadas en el
paciente, para preparar una composición farmacéutica para tratar a
un sujeto infectado con VIH-1, en la que el
anticuerpo es específico de CD2 y bloquea la unión de antígeno CD2
con su contrarreceptor LFA-3.
33. El uso de la reivindicación 32 en el que el
anticuerpo reduce las complicaciones asociadas con infección por
VIH-1.
34. El uso de la reivindicación 33 en el que el
anticuerpo es un anticuerpo monoclonal que tiene afinidad de unión
específica por antígeno CD2, siendo seleccionado el anticuerpo
monoclonal del grupo constituido por:
(i) anticuerpo monoclonal quimérico
SFv-Ig CD2;
(ii) un anticuerpo monoclonal que tiene regiones
determinantes de complementariedad idénticas a las de
SFv-Ig CD2 y que tiene al menos un segmento de
secuencia de al menos cinco aminoácidos de origen humano; y
(iii) un anticuerpo monoclonal que compite con
SFv-Ig CD2 para unión a antígeno CD2 con una
eficacia de al menos el 80% sobre una base molar con respecto a
SFv-Ig CD2 y que tiene al menos un segmento de
secuencia de al menos cinco aminoácidos de origen humano.
35. El uso de la reivindicación 33 en el que el
anticuerpo se conjuga con un agente terapéutico según se define en
una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10.
36. El uso de las reivindicaciones 32 a 35 en
combinación con al menos un agente específico de una infección
oportunista asociada a SIDA.
37. El uso de la reivindicación 36 en el que el
agente se selecciona del grupo constituido por pentamidina
aerosolizada, isoniazida, rifampina y anfotericina B.
38. El uso de la reivindicación 32 para preparar
una composición farmacéutica para tratar a un paciente durante la
viremia.
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