JPH07147983A - ＣＤ２抗原に特異的なモノクローナル抗体及びＦｖ - Google Patents
ＣＤ２抗原に特異的なモノクローナル抗体及びＦｖInfo
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- JPH07147983A JPH07147983A JP6111160A JP11116094A JPH07147983A JP H07147983 A JPH07147983 A JP H07147983A JP 6111160 A JP6111160 A JP 6111160A JP 11116094 A JP11116094 A JP 11116094A JP H07147983 A JPH07147983 A JP H07147983A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 本発明はＡＩＤＳの治療を目的とする。
【構成】 本発明にかかわる抗ＣＤ２モノクローナル抗
体は（１）組換Ｅ．コリ培養物ＡＴＣＣ No. ６９２７
７の中にクローンされた構築体の発現により生産される
キメラモノクローナル抗体ＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇ；
（２）ＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇのそれと同一の相補性決定
領域を有するモノクローナル抗体；又はモラーベースで
ＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇの少なくとも約８０％の効率でＣ
Ｄ２ ＳＦｖ−Ｉｇと競合するモノクローナル抗体であ
りうる。本発明にかかわる抗体並びにＴリンパ球と単球
との間での相互作用を抑制しうるその他の抗体はＨＩＶ
−１感染患者中のＨＩＶ−１感染Ｔ細胞によるＨＩＶ−
１生産を阻害せしめるのに利用できる。
体は（１）組換Ｅ．コリ培養物ＡＴＣＣ No. ６９２７
７の中にクローンされた構築体の発現により生産される
キメラモノクローナル抗体ＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇ；
（２）ＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇのそれと同一の相補性決定
領域を有するモノクローナル抗体；又はモラーベースで
ＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇの少なくとも約８０％の効率でＣ
Ｄ２ ＳＦｖ−Ｉｇと競合するモノクローナル抗体であ
りうる。本発明にかかわる抗体並びにＴリンパ球と単球
との間での相互作用を抑制しうるその他の抗体はＨＩＶ
−１感染患者中のＨＩＶ−１感染Ｔ細胞によるＨＩＶ−
１生産を阻害せしめるのに利用できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はモノクローナル抗体及び
Ｆｖ特異的結合性ＣＤ２抗原、並びにＨＩＶ−１−感染
化Ｔ細胞におけるヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ−１）
の生産を阻害するうえでのかかるモノクローナル抗体の
利用に関する。
Ｆｖ特異的結合性ＣＤ２抗原、並びにＨＩＶ−１−感染
化Ｔ細胞におけるヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ−１）
の生産を阻害するうえでのかかるモノクローナル抗体の
利用に関する。
【０００２】
【従来の技術】後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）は２
０世紀後半の最も恐ろしい病気の一つとなっている。米
国だけで、年間約４０，０００人の新たなケースが診断
されており、そしておよそ１９８１年にてこの病気が認
識されてから少なくとも２００，０００件起きている。
米国人の１００万人から１５０万人がＨＩＶ−１で感染
されていると信じられており、これはそれらがＡＩＤＳ
を発症する危険性を有し、そしてこのウィルスで感染さ
れた患者における病気の完全発症を防ぐための手段が発
見されない限りそうなるであろう。世界で、ＡＩＤＳの
件数は何百万となっており、アフリカ及びカリブの特定
地域は最も高い感染率を有している。
０世紀後半の最も恐ろしい病気の一つとなっている。米
国だけで、年間約４０，０００人の新たなケースが診断
されており、そしておよそ１９８１年にてこの病気が認
識されてから少なくとも２００，０００件起きている。
米国人の１００万人から１５０万人がＨＩＶ−１で感染
されていると信じられており、これはそれらがＡＩＤＳ
を発症する危険性を有し、そしてこのウィルスで感染さ
れた患者における病気の完全発症を防ぐための手段が発
見されない限りそうなるであろう。世界で、ＡＩＤＳの
件数は何百万となっており、アフリカ及びカリブの特定
地域は最も高い感染率を有している。
【０００３】現在まで、ＡＩＤＳに対する研究のために
かけられた大金は癌及び心臓病の如きの病気に対して費
やされてきた金額に等しいか又はそれを超えているが、
治癒はいまだ得られず、従ってその病気は間違いなく致
死的であると考えられている。少なくとも一部の患者で
この病気の進行を遅くすることが認められたいくつかの
処置が開発されているが（例えば薬剤アジドチミジン
（ＡＺＴ）及びジデオキシイノシン（ＤＤＩ）、それら
の処置は軽減にすぎないことが認められている）。それ
らは全ての患者において有効でなく、そしてその効果は
病気の進行に伴って低下する傾向にある。従って、ＡＩ
ＤＳにとって更なる処置が緊急に必要とされている。
かけられた大金は癌及び心臓病の如きの病気に対して費
やされてきた金額に等しいか又はそれを超えているが、
治癒はいまだ得られず、従ってその病気は間違いなく致
死的であると考えられている。少なくとも一部の患者で
この病気の進行を遅くすることが認められたいくつかの
処置が開発されているが（例えば薬剤アジドチミジン
（ＡＺＴ）及びジデオキシイノシン（ＤＤＩ）、それら
の処置は軽減にすぎないことが認められている）。それ
らは全ての患者において有効でなく、そしてその効果は
病気の進行に伴って低下する傾向にある。従って、ＡＩ
ＤＳにとって更なる処置が緊急に必要とされている。
【０００４】ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ−１）によ
る感染はＡＩＤＳの発症にとって必要であると一般に信
じられているが、その他の要因もこの病気の樹立及び進
行に寄与しうるものであり、その理由はこの病気はしば
しば薬剤の乱用及び免疫抑制効果を担う又はそれを高め
うるその他の病原への暴露に関係しているからである。
ＨＩＶ−１はレンチウィルスサブファミリーのレトロウ
ィルスである。他のレトロウィルスと同様に、そのライ
フサイクルは、逆転写及び感染Ｔ細胞のゲノムの中への
ＤＮＡの如きのウィルスＲＮＡゲノムの一体化を包括す
る。ウィルスの活性化は転写及び翻訳をもたらし、ウィ
ルスの生産及びＣＤ４+ Ｔ細胞の枯渇を紹く。
る感染はＡＩＤＳの発症にとって必要であると一般に信
じられているが、その他の要因もこの病気の樹立及び進
行に寄与しうるものであり、その理由はこの病気はしば
しば薬剤の乱用及び免疫抑制効果を担う又はそれを高め
うるその他の病原への暴露に関係しているからである。
ＨＩＶ−１はレンチウィルスサブファミリーのレトロウ
ィルスである。他のレトロウィルスと同様に、そのライ
フサイクルは、逆転写及び感染Ｔ細胞のゲノムの中への
ＤＮＡの如きのウィルスＲＮＡゲノムの一体化を包括す
る。ウィルスの活性化は転写及び翻訳をもたらし、ウィ
ルスの生産及びＣＤ４+ Ｔ細胞の枯渇を紹く。
【０００５】ＡＩＤＳの特徴の一つは日和見感染症の存
在である。これらの感染症には、いくつかの細菌種によ
り起こる下痢、鳥類及び牛のミコバクテリアにより起こ
る結核、ウィルス感染症、例えばサイトメガロウィルス
感染症及びヘルペスウィルスにより生ずる帯状疱疹、菌
類感染症例えばカンジダ症、アスペルギルス症、及びヒ
ストプラスマ症、並びに原虫感染症、例えばトキソプラ
スマ症及びニューモシスティス症が含まれる。これらの
感染症はＡＩＤＳによる患者の実際の死因であることが
よくあり、そして致死的ではないにしてもかなりの罹病
率をもたらす。数多くのこのような日和見感染症にとっ
て処置が存在するが（例えばニューモシスティスに対す
るエーロゾル化ペンタミジン）、これらの処置はしばし
ば不成功に終わり、その理由は患者の一般的な健康及び
ＡＩＤＳ自身によりもたらされるその感染症に対する抵
抗の低下にある。
在である。これらの感染症には、いくつかの細菌種によ
り起こる下痢、鳥類及び牛のミコバクテリアにより起こ
る結核、ウィルス感染症、例えばサイトメガロウィルス
感染症及びヘルペスウィルスにより生ずる帯状疱疹、菌
類感染症例えばカンジダ症、アスペルギルス症、及びヒ
ストプラスマ症、並びに原虫感染症、例えばトキソプラ
スマ症及びニューモシスティス症が含まれる。これらの
感染症はＡＩＤＳによる患者の実際の死因であることが
よくあり、そして致死的ではないにしてもかなりの罹病
率をもたらす。数多くのこのような日和見感染症にとっ
て処置が存在するが（例えばニューモシスティスに対す
るエーロゾル化ペンタミジン）、これらの処置はしばし
ば不成功に終わり、その理由は患者の一般的な健康及び
ＡＩＤＳ自身によりもたらされるその感染症に対する抵
抗の低下にある。
【０００６】従って、かかる感染症の処置の改良法が必
要とされている。
要とされている。
【０００７】他のレンチウィルスと同様に、ＨＩＶ−１
は感染化ＣＤ４+ Ｔリンパ球のＤＮＡの中に通常長い間
潜在し続けうる。この潜在はあまり理解されていない
が、しかし宿主ＣＤ４+ Ｔ細胞の活性化状態に依存する
ようである（Z.F.Rosenberg とA.F.Fauci, "Minirevie
w: Induction of Expression of HIV in Latently or C
hronically Infected Cells," AIDS Res.Hum.Retro.
5: 1-4 (1989)) 。
は感染化ＣＤ４+ Ｔリンパ球のＤＮＡの中に通常長い間
潜在し続けうる。この潜在はあまり理解されていない
が、しかし宿主ＣＤ４+ Ｔ細胞の活性化状態に依存する
ようである（Z.F.Rosenberg とA.F.Fauci, "Minirevie
w: Induction of Expression of HIV in Latently or C
hronically Infected Cells," AIDS Res.Hum.Retro.
5: 1-4 (1989)) 。
【０００８】Ｔ細胞の活性化は、それらと、抗原表示細
胞（ＡＰＣｓ）として示すその他の細胞との複雑な相互
作用の系に依存する。これらの相互作用はＴ細胞の細胞
表層上の分子とＡＰＣｓの表層上の分子との特異的な結
合によって媒介される。かかる相互作用の一つはＴ細胞
の表層上のＣＤ２とＡＰＣ上のそのリガンドＬＦＡ−３
との間にある。ＣＤ２分子は、抗ＣＤ２抗体により架橋
されたとき、Ｔ細胞を直接活性化可能である。ＬＦＡ−
３リガンドはカウンターレセプターとしても呼ばれてい
る。その他のレセプター／カウンターレセプターペアー
はＩＣＡＭ−１／ＣＤ１８及びＣＤ２８／Ｂ７である。
胞（ＡＰＣｓ）として示すその他の細胞との複雑な相互
作用の系に依存する。これらの相互作用はＴ細胞の細胞
表層上の分子とＡＰＣｓの表層上の分子との特異的な結
合によって媒介される。かかる相互作用の一つはＴ細胞
の表層上のＣＤ２とＡＰＣ上のそのリガンドＬＦＡ−３
との間にある。ＣＤ２分子は、抗ＣＤ２抗体により架橋
されたとき、Ｔ細胞を直接活性化可能である。ＬＦＡ−
３リガンドはカウンターレセプターとしても呼ばれてい
る。その他のレセプター／カウンターレセプターペアー
はＩＣＡＭ−１／ＣＤ１８及びＣＤ２８／Ｂ７である。
【０００９】ＡＩＤＳを理解しようとする研究及びそれ
に関連する日和見感染症を処置する研究の両者を複雑に
しているパラドックスの一つは、日和見感染症の原因で
ある生物に応答しようとするＨＩＶ−１−感染リンパ球
による試みが、感染細胞によるＨＩＶ−１ウィルスの生
産の上昇をもたらしてしまうことにある。これはスタフ
ィロコッカス エンテロキシン（「超抗原」又は「ＳＡ
ｇ」）に対する応答性がインビトロで感染細胞からのＨ
ＩＶ−１生産を高めることを示唆する結果により示され
ている。
に関連する日和見感染症を処置する研究の両者を複雑に
しているパラドックスの一つは、日和見感染症の原因で
ある生物に応答しようとするＨＩＶ−１−感染リンパ球
による試みが、感染細胞によるＨＩＶ−１ウィルスの生
産の上昇をもたらしてしまうことにある。これはスタフ
ィロコッカス エンテロキシン（「超抗原」又は「ＳＡ
ｇ」）に対する応答性がインビトロで感染細胞からのＨ
ＩＶ−１生産を高めることを示唆する結果により示され
ている。
【００１０】感染リンパ球におけるＨＩＶ−１生産の活
性化について、たくさんの理解すべきことが残ってい
る。感染Ｔ細胞系によるＨＩＶ−１生産を誘発すること
が示されている様々な刺激因子には下記のものが含まれ
る：（１）Ｔ細胞抗原；（２）ミトゲン；（３）様々な
サイトカイン、例えばＴＮＦα，ＩＬ−１及びＩＬ−
６；並びに（４）その他のウィルス（Rosenberg とFauc
i (1989)前掲；Z.F.Rosenberg とA.F.Fauci,「Activati
on of Latent HIV Infection」J.NIH Res. 2: 41-45 (1
990)) 。
性化について、たくさんの理解すべきことが残ってい
る。感染Ｔ細胞系によるＨＩＶ−１生産を誘発すること
が示されている様々な刺激因子には下記のものが含まれ
る：（１）Ｔ細胞抗原；（２）ミトゲン；（３）様々な
サイトカイン、例えばＴＮＦα，ＩＬ−１及びＩＬ−
６；並びに（４）その他のウィルス（Rosenberg とFauc
i (1989)前掲；Z.F.Rosenberg とA.F.Fauci,「Activati
on of Latent HIV Infection」J.NIH Res. 2: 41-45 (1
990)) 。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】ところで、組込ＨＩＶ
−１プロウィルスを含むＣＤ４+ Ｔ細胞においてのＨＩ
Ｖ−１発現を活性化するメカニズムについては比較的あ
まり理解されていない。
−１プロウィルスを含むＣＤ４+ Ｔ細胞においてのＨＩ
Ｖ−１発現を活性化するメカニズムについては比較的あ
まり理解されていない。
【００１２】従って、免疫機能及びＨＩＶ−１以外の病
原に対する免疫応答を変えることのないＨＩＶ−１生産
の抑制もしくは阻止の方法、又はＨＩＶ−１生産を防ぐ
ために一部の応答が抑えられているなら、患者の臨床的
状態を低下させることなくそれを行う方法についての要
望がある。かかる方法は日和見感染症を処置するうえ
で、及びＨＩＶ−１で感染された患者の寿命を伸ばすう
えで有用であろう。
原に対する免疫応答を変えることのないＨＩＶ−１生産
の抑制もしくは阻止の方法、又はＨＩＶ−１生産を防ぐ
ために一部の応答が抑えられているなら、患者の臨床的
状態を低下させることなくそれを行う方法についての要
望がある。かかる方法は日和見感染症を処置するうえ
で、及びＨＩＶ−１で感染された患者の寿命を伸ばすう
えで有用であろう。
【００１３】
【課題を解決するための手段】我々は、ＣＤ２抗原に特
異的に結合性で、ＨＩＶ−１−感染Ｔ細胞中でのＨＩＶ
−１ウィルス生産を抑えるのに利用できるキメラヒト化
モノクローナル抗体、ＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇ、並びにＣ
Ｄ２抗原に特異的に結合性なその他の抗体を開発した。
我々はまた、Ｔリンパ球と単球との間での分子間相互作
用に包括されるＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇ又はその他の抗体
を利用する、ウィルス生産を抑える及びＨＩＶ−１で感
染した対象体を処置するための方法も開発した。
異的に結合性で、ＨＩＶ−１−感染Ｔ細胞中でのＨＩＶ
−１ウィルス生産を抑えるのに利用できるキメラヒト化
モノクローナル抗体、ＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇ、並びにＣ
Ｄ２抗原に特異的に結合性なその他の抗体を開発した。
我々はまた、Ｔリンパ球と単球との間での分子間相互作
用に包括されるＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇ又はその他の抗体
を利用する、ウィルス生産を抑える及びＨＩＶ−１で感
染した対象体を処置するための方法も開発した。
【００１４】本発明にかかわる抗体には： （１）組換エッシェリヒア コリ培養物ＡＴＣＣ No.
６９２７７の中にクローンされた構築体の発現により生
産されるキメラモノクローナル抗体ＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉ
ｇ； （２）ＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇのそれと同一の相補性決定
領域を有するモノクローナル抗体；及び （３）モラーベースで、ＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇの少なく
とも約８０％の効率で、ＣＤ２抗原に対する結合に関し
てＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇと競合するモノクローナル抗
体；より成る群から選ばれるモノクローナル抗体が含ま
れる。
６９２７７の中にクローンされた構築体の発現により生
産されるキメラモノクローナル抗体ＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉ
ｇ； （２）ＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇのそれと同一の相補性決定
領域を有するモノクローナル抗体；及び （３）モラーベースで、ＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇの少なく
とも約８０％の効率で、ＣＤ２抗原に対する結合に関し
てＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇと競合するモノクローナル抗
体；より成る群から選ばれるモノクローナル抗体が含ま
れる。
【００１５】好ましくは、このモノクローナル抗体はモ
ラーベースで、ＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇの少なくとも約９
０％の効率で、ＣＤ２抗原に対する結合についてＣＤ２
と競合するモノクローナル抗体である。
ラーベースで、ＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇの少なくとも約９
０％の効率で、ＣＤ２抗原に対する結合についてＣＤ２
と競合するモノクローナル抗体である。
【００１６】Ｈ鎖起源又はＬ鎖起源のいづれかの相補性
決定領域はＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇのそれと配列において
同一であってよい。
決定領域はＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇのそれと配列において
同一であってよい。
【００１７】好ましくは、この抗体はキメラモノクロー
ナル抗体ＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇである。
ナル抗体ＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇである。
【００１８】本発明の別の観点は、Ｉｇ由来アミノ酸配
列の少なくとも一部の欠失により上記の抗体から改質さ
れた抗体である。全Ｉｇ由来アミノ酸配列が欠失してい
てよい。かかる抗体はＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇに由来しう
る。
列の少なくとも一部の欠失により上記の抗体から改質さ
れた抗体である。全Ｉｇ由来アミノ酸配列が欠失してい
てよい。かかる抗体はＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇに由来しう
る。
【００１９】モノクローナル抗体は検出可能マーカーで
ラベルされていてよい。この検出可能マーカーは酵素、
常磁性材料、アビジン−ビオチン特異的結合性ペアのメ
ンバー、蛍光団、発色団、化学発光団、重金属及びラジ
オアイソトープより選ばれうる。
ラベルされていてよい。この検出可能マーカーは酵素、
常磁性材料、アビジン−ビオチン特異的結合性ペアのメ
ンバー、蛍光団、発色団、化学発光団、重金属及びラジ
オアイソトープより選ばれうる。
【００２０】他方、このモノクローナル抗体は治療剤に
コンジュゲートしてよい。この治療剤は抗腫瘍薬、リン
ホカイン及び毒素より成る群から選ばれうる。適当なリ
ンホカインにはインターロイキン、インターフェロン及
び腫瘍壊死因子、特にインターロイキン−２が含まれ
る。適当な毒素にはリシン、シュードモナス エキソト
キシン及びジフテリア毒素が含まれる。
コンジュゲートしてよい。この治療剤は抗腫瘍薬、リン
ホカイン及び毒素より成る群から選ばれうる。適当なリ
ンホカインにはインターロイキン、インターフェロン及
び腫瘍壊死因子、特にインターロイキン−２が含まれ
る。適当な毒素にはリシン、シュードモナス エキソト
キシン及びジフテリア毒素が含まれる。
【００２１】本発明の別の観点は、薬理組成物であっ
て： （１）ＨＩＶ−１で感染した患者における感染Ｔ細胞中
でのＨＩＶ−１ウィルスの生産を阻害するのに十分な量
の本発明にかかわるキメラヒト化モノクローナル抗−Ｃ
Ｄ２抗体；及び （２）薬理学的に許容されている担体；を含んで成る組
成物にある。
て： （１）ＨＩＶ−１で感染した患者における感染Ｔ細胞中
でのＨＩＶ−１ウィルスの生産を阻害するのに十分な量
の本発明にかかわるキメラヒト化モノクローナル抗−Ｃ
Ｄ２抗体；及び （２）薬理学的に許容されている担体；を含んで成る組
成物にある。
【００２２】本発明の別の観点は、哺乳動物細胞の中で
ＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇキメラヒト化モノクローナル抗体
を発現することの可能な構築体によって安定的に形質転
換されており、且つアメリカン タイプ カルチャー
コミッションにＡＴＣＣ No. ６９２７７として寄託さ
れている組換エッシェリヒア コリ細胞にある。
ＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇキメラヒト化モノクローナル抗体
を発現することの可能な構築体によって安定的に形質転
換されており、且つアメリカン タイプ カルチャー
コミッションにＡＴＣＣ No. ６９２７７として寄託さ
れている組換エッシェリヒア コリ細胞にある。
【００２３】本発明の更なる別の観点は、哺乳動物細胞
の中でＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇキメラヒト化モノクローナ
ル抗体を発現することが可能であり、且つネズミ相補性
決定領域及びヒト定常領域を含むＤＮＡ構築体にある。
の中でＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇキメラヒト化モノクローナ
ル抗体を発現することが可能であり、且つネズミ相補性
決定領域及びヒト定常領域を含むＤＮＡ構築体にある。
【００２４】本発明の別の観点は、ＨＩＶ−１−感染Ｔ
細胞の中でのＨＩＶ−１の生産を阻害するための方法で
ある。この方法は： （１）ＨＩＶで感染したＴ細胞を選別する；次いで （２）この感染Ｔ細胞を、その中でのＨＩＶ−１の生産
を阻害するために、ＣＤ４+ Ｔリンパ球と単球との間で
の細胞表層相互作用を崩壊することの可能なモノクロー
ナル抗体と接触させること；の段階を含んで成り、ここ
でこの細胞はその接触Ｔ細胞中でのＨＩＶ−１の生産を
阻害するのに十分な量の抗体を接触させる。
細胞の中でのＨＩＶ−１の生産を阻害するための方法で
ある。この方法は： （１）ＨＩＶで感染したＴ細胞を選別する；次いで （２）この感染Ｔ細胞を、その中でのＨＩＶ−１の生産
を阻害するために、ＣＤ４+ Ｔリンパ球と単球との間で
の細胞表層相互作用を崩壊することの可能なモノクロー
ナル抗体と接触させること；の段階を含んで成り、ここ
でこの細胞はその接触Ｔ細胞中でのＨＩＶ−１の生産を
阻害するのに十分な量の抗体を接触させる。
【００２５】好ましくは、この抗体はＣＤ２に対して特
異的であり、そしてＣＤ２抗原のそのカウンターレセプ
ターＬＦＡ−３との結合を阻止する。より好ましくは、
この抗体は上記の本発明にかかわるモノクローナル抗体
である；最も好ましくは、この抗体はＣＤ２ ＳＦｖ−
Ｉｇである。この抗体はＣＤ１８に対するモノクローナ
ル抗体、カウンターレセプターＬＦＡ−３に対するモノ
クローナル抗体、又はカウンターレセプターＩＣＡＭ−
１に対するモノクローナル抗体でもありうる。この抗体
は治療剤にコンジュゲートされていてよい。
異的であり、そしてＣＤ２抗原のそのカウンターレセプ
ターＬＦＡ−３との結合を阻止する。より好ましくは、
この抗体は上記の本発明にかかわるモノクローナル抗体
である；最も好ましくは、この抗体はＣＤ２ ＳＦｖ−
Ｉｇである。この抗体はＣＤ１８に対するモノクローナ
ル抗体、カウンターレセプターＬＦＡ−３に対するモノ
クローナル抗体、又はカウンターレセプターＩＣＡＭ−
１に対するモノクローナル抗体でもありうる。この抗体
は治療剤にコンジュゲートされていてよい。
【００２６】本発明の別の観点はＨＩＶ−１で感染した
対象体を処置するための方法である。この方法は： （１）この対象体からＨＩＶ−１で感染したＴ細胞を単
離する； （２）この感染Ｔ細胞を、その中でのＨＩＶ−１の生産
を阻害するためにＣＤ４+ Ｔリンパ球と単球との間での
細胞表層相互作用を崩壊可能なモノクローナル抗体と接
触させる（ここでこの細胞は、接触Ｔ細胞中でのＨＩＶ
−１の生産を阻害するのに十分な量の抗体と接触させ
る）；次いで （３）この対象体の中の機能性非ＨＩＶ−１生産性Ｔ細
胞の比率を高めるためにこの患者の中にこの接触Ｔ細胞
を再導入し、これによりその対象体を処置すること；の
段階を含んで成る。
対象体を処置するための方法である。この方法は： （１）この対象体からＨＩＶ−１で感染したＴ細胞を単
離する； （２）この感染Ｔ細胞を、その中でのＨＩＶ−１の生産
を阻害するためにＣＤ４+ Ｔリンパ球と単球との間での
細胞表層相互作用を崩壊可能なモノクローナル抗体と接
触させる（ここでこの細胞は、接触Ｔ細胞中でのＨＩＶ
−１の生産を阻害するのに十分な量の抗体と接触させ
る）；次いで （３）この対象体の中の機能性非ＨＩＶ−１生産性Ｔ細
胞の比率を高めるためにこの患者の中にこの接触Ｔ細胞
を再導入し、これによりその対象体を処置すること；の
段階を含んで成る。
【００２７】あるケースにおいては、再導入前のＴ細胞
の活性化の追加の工程が所望されうる。
の活性化の追加の工程が所望されうる。
【００２８】この手順のためには、ＨＩＶ−１−感染細
胞中でのＨＩＶ−１生産を阻害する上記の手順と同じ抗
体が好ましい。この抗体は治療剤にコンジュゲートされ
ていてもよい。この方法は更に、ＡＩＤＳに関連する日
和見感染症に対して特異的な少なくとも一種の薬剤でそ
の対象体を処置する段階を含んで成りうる。この薬剤は
ペンタミジン、イソニアジド、リファンピン又はアンホ
テリシンＢでありうる。
胞中でのＨＩＶ−１生産を阻害する上記の手順と同じ抗
体が好ましい。この抗体は治療剤にコンジュゲートされ
ていてもよい。この方法は更に、ＡＩＤＳに関連する日
和見感染症に対して特異的な少なくとも一種の薬剤でそ
の対象体を処置する段階を含んで成りうる。この薬剤は
ペンタミジン、イソニアジド、リファンピン又はアンホ
テリシンＢでありうる。
【００２９】患者への接触Ｔ細胞の再導入はＨＩＶ−１
感染症に関連する合併症を抑えることができる。
感染症に関連する合併症を抑えることができる。
【００３０】本発明の抗体はＨＩＶ−１で感染した患者
のインビボ処置のために利用することもできうる。イン
ビボ処置手順は、Ｔ細胞がＨＩＶ−１で感染されている
患者に、ＣＤ４+ Ｔリンパ球と単球との間での細胞表層
相互作用を崩壊可能なモノクローナル抗体を投与して、
感染Ｔ細胞中でのＨＩＶ−１の生産を阻害することを含
んで成り、ここでこの抗体は患者の中での感染Ｔ細胞中
でのＨＩＶ−１の生産を阻害するのに十分な量でこの患
者に投与する。この抗体は治療剤にコンジュゲートされ
ていてよい。この処置は、ＡＩＤＳに関連する日和見感
染症に対して特異的な少なくとも一種の薬剤で患者を処
置する段階を更に含んで成りうる。この抗体はウィルス
血症にかかっている患者に投与してよい。
のインビボ処置のために利用することもできうる。イン
ビボ処置手順は、Ｔ細胞がＨＩＶ−１で感染されている
患者に、ＣＤ４+ Ｔリンパ球と単球との間での細胞表層
相互作用を崩壊可能なモノクローナル抗体を投与して、
感染Ｔ細胞中でのＨＩＶ−１の生産を阻害することを含
んで成り、ここでこの抗体は患者の中での感染Ｔ細胞中
でのＨＩＶ−１の生産を阻害するのに十分な量でこの患
者に投与する。この抗体は治療剤にコンジュゲートされ
ていてよい。この処置は、ＡＩＤＳに関連する日和見感
染症に対して特異的な少なくとも一種の薬剤で患者を処
置する段階を更に含んで成りうる。この抗体はウィルス
血症にかかっている患者に投与してよい。
【００３１】定義 「モノクローナル抗体」とは、抗体活性を有し、且つ構
造、親和性及び特異性において一慣している分子を意味
し、そしてキメラモノクローナル抗体、及びリンパ球以
外の細胞の中で組換ＤＮＡ技術によって製造されたモノ
クローナル抗体が含まれる。「モノクローナル抗体」は
インタクト抗体と特定しない限り、二価又は一価の抗体
フラグメントも含む。
造、親和性及び特異性において一慣している分子を意味
し、そしてキメラモノクローナル抗体、及びリンパ球以
外の細胞の中で組換ＤＮＡ技術によって製造されたモノ
クローナル抗体が含まれる。「モノクローナル抗体」は
インタクト抗体と特定しない限り、二価又は一価の抗体
フラグメントも含む。
【００３２】抗体分子及び抗体分子又は抗体分子の一部
に由来するアミノ酸配列について用いている「同一」と
は、一次アミノ酸配列において同一であることを意味し
ている。同じ一次アミノ酸配列を有するが、しかし異な
るグリコシル化のパターンを有する２種類の抗体分子は
この定義ではまだ同一である。
に由来するアミノ酸配列について用いている「同一」と
は、一次アミノ酸配列において同一であることを意味し
ている。同じ一次アミノ酸配列を有するが、しかし異な
るグリコシル化のパターンを有する２種類の抗体分子は
この定義ではまだ同一である。
【００３３】「特異的な結合親和性」とは、結合性分子
の表層に対する非共有相互作用、例えば疎水性結合、塩
連結及び水素結合により決定される結合親和性を意味す
る。何らかの反論がない限り、「特異的な結合親和性」
は、二分子反応について少なくとも約１０6 リッター／
モルの会合定数を意味する。
の表層に対する非共有相互作用、例えば疎水性結合、塩
連結及び水素結合により決定される結合親和性を意味す
る。何らかの反論がない限り、「特異的な結合親和性」
は、二分子反応について少なくとも約１０6 リッター／
モルの会合定数を意味する。
【００３４】「ヒト起源」とは、ヒトゲノムの中で見い
出せる配列と同一又は構造的もしくは機能的に明らかに
由来するものを意味し、その配列がヒトの細胞、組織又
は体液から物理的に獲得したものである必要はない。例
えば、非ヒト哺乳動物細胞の中にクローンせしめたヒト
ゲノムより最初に獲得した遺伝子又は遺伝子セグメント
の転写により生成され、そしてかかる非ヒト哺乳動物細
胞の中での発現の後に単離されたタンパク質又はペプチ
ドは、ヒト起源である。このことは、そのタンパク質又
はペプチドが非ヒト哺乳動物細胞由来のタンパク質と会
合した融合タンパク質であったとしても、ヒト配列の転
写生成物がヒト細胞の中でのその本来の発生に比してほ
ぼ完全に残っているなら、真実であり続ける。
出せる配列と同一又は構造的もしくは機能的に明らかに
由来するものを意味し、その配列がヒトの細胞、組織又
は体液から物理的に獲得したものである必要はない。例
えば、非ヒト哺乳動物細胞の中にクローンせしめたヒト
ゲノムより最初に獲得した遺伝子又は遺伝子セグメント
の転写により生成され、そしてかかる非ヒト哺乳動物細
胞の中での発現の後に単離されたタンパク質又はペプチ
ドは、ヒト起源である。このことは、そのタンパク質又
はペプチドが非ヒト哺乳動物細胞由来のタンパク質と会
合した融合タンパク質であったとしても、ヒト配列の転
写生成物がヒト細胞の中でのその本来の発生に比してほ
ぼ完全に残っているなら、真実であり続ける。
【００３５】我々は、Ｔ細胞と、免疫応答に関与するそ
の他の細胞、特に単球との間での接着に関与する細胞表
層分子に対する一定のモノクローナル抗体が、Ｔ細胞の
機能又は増殖性の阻害を伴うことなく、ＨＩＶ−１−感
染ＣＤ４+ Ｔ細胞によるＨＩＶ−１ウィルスの生産を阻
害できることを発見した。ＨＩＶ−１生産の阻害に適す
るモノクローナル抗体のうちで最も有用なのは、培地中
で組換哺乳動物細胞の中で生産され、且つＣＤ２ ＳＦ
ｖ−Ｉｇとして知られている新規のキメラヒト化抗ＣＤ
２抗体である。上述した通り、この抗体はネズミ可変領
域及びヒト定常領域を一本のアミノ酸鎖内で含む。
の他の細胞、特に単球との間での接着に関与する細胞表
層分子に対する一定のモノクローナル抗体が、Ｔ細胞の
機能又は増殖性の阻害を伴うことなく、ＨＩＶ−１−感
染ＣＤ４+ Ｔ細胞によるＨＩＶ−１ウィルスの生産を阻
害できることを発見した。ＨＩＶ−１生産の阻害に適す
るモノクローナル抗体のうちで最も有用なのは、培地中
で組換哺乳動物細胞の中で生産され、且つＣＤ２ ＳＦ
ｖ−Ｉｇとして知られている新規のキメラヒト化抗ＣＤ
２抗体である。上述した通り、この抗体はネズミ可変領
域及びヒト定常領域を一本のアミノ酸鎖内で含む。
【００３６】１．ＨＩＶ−１生産の抑制にとって有用な
モノクローナル抗体 感染リンパ球によるＨＩＶ−１ウィルスの生産を阻害す
るのに有用なモノクローナル抗体は、Ｔ細胞と単球との
間での相互作用を崩壊するいくつかのモノクローナル抗
体である。
モノクローナル抗体 感染リンパ球によるＨＩＶ−１ウィルスの生産を阻害す
るのに有用なモノクローナル抗体は、Ｔ細胞と単球との
間での相互作用を崩壊するいくつかのモノクローナル抗
体である。
【００３７】これらの抗体は細胞接着にかかわる細胞表
層分子に向けられている。本出願人はこの理論に拘束さ
れるつもりはないが、細胞接着の過程は免疫応答の樹立
にとって必要な細胞間連絡において、特に抗原の供され
たＴ細胞による特異的な免疫活性の発生において必要で
ある。
層分子に向けられている。本出願人はこの理論に拘束さ
れるつもりはないが、細胞接着の過程は免疫応答の樹立
にとって必要な細胞間連絡において、特に抗原の供され
たＴ細胞による特異的な免疫活性の発生において必要で
ある。
【００３８】これらの抗体には：（１）抗ＣＤ２モノク
ローナル抗体；（２）抗−ＣＤ１８モノクローナル抗
体；（３）抗ＬＦＡ３モノクローナル抗体及び（４）抗
ＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体が含まれる。ＣＤ２及
びＣＤ１８抗原はリンパ球上に位置している。ＬＦＡ−
３及びＩＣＡＭ−１抗原は単球上に位置しており、免疫
応答の際にこれにＴリンパ球が相互作用する。
ローナル抗体；（２）抗−ＣＤ１８モノクローナル抗
体；（３）抗ＬＦＡ３モノクローナル抗体及び（４）抗
ＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体が含まれる。ＣＤ２及
びＣＤ１８抗原はリンパ球上に位置している。ＬＦＡ−
３及びＩＣＡＭ−１抗原は単球上に位置しており、免疫
応答の際にこれにＴリンパ球が相互作用する。
【００３９】Ａ．抗ＣＤ２モノクローナル抗体 感染Ｔ細胞によるＨＩＶ−１生産の抑制にとって最も有
用なモノクローナル抗体は抗ＣＤ２モノクローナル抗体
である。抗ＣＤ２モノクローナル抗体はＨＩＶ−１生産
を約８０％〜約９９％阻害することを示す。ＨＩＶ−１
の生産の阻害は外因性インターロイキン−２（ＩＬ−
２）の存在下又は非存在で認められた。重要には、ＣＤ
４+ 細胞増殖は外因性ＩＬ−２の存在下で維持される
が、ＨＩＶ−１生産はめざましく阻害される。抗ＣＤ２
モノクローナル抗体はＨＩＶ−１生産を、０．１μｇ／
mlほどの低い抗体濃度で９０％阻害した。抗ＣＤ２モノ
クローナル抗体の添加はスタフィロコッカスエンテロト
キシン（「超抗原」又は「ＳＡＧ」）による処置により
活性化されたＴ細胞についてさえもＨＩＶ−１生産を抑
制するのに有効である。
用なモノクローナル抗体は抗ＣＤ２モノクローナル抗体
である。抗ＣＤ２モノクローナル抗体はＨＩＶ−１生産
を約８０％〜約９９％阻害することを示す。ＨＩＶ−１
の生産の阻害は外因性インターロイキン−２（ＩＬ−
２）の存在下又は非存在で認められた。重要には、ＣＤ
４+ 細胞増殖は外因性ＩＬ−２の存在下で維持される
が、ＨＩＶ−１生産はめざましく阻害される。抗ＣＤ２
モノクローナル抗体はＨＩＶ−１生産を、０．１μｇ／
mlほどの低い抗体濃度で９０％阻害した。抗ＣＤ２モノ
クローナル抗体の添加はスタフィロコッカスエンテロト
キシン（「超抗原」又は「ＳＡＧ」）による処置により
活性化されたＴ細胞についてさえもＨＩＶ−１生産を抑
制するのに有効である。
【００４０】有用な抗−ＣＤ２抗体は、３５．１，９．
６及び９−１と命名されたモノクローナル抗体である
が、９−１はＣＤ２上の別のエピトープに結合する。し
かしながら、これらのモノクローナル抗体のうちで、３
５．１（Leukocyte Typing III(A.J.McMichael 編、Oxf
ord University Press, Oxford, 1987); Leukocyte Typ
ing IV (W.Knappら編、Oxford University Press, Oxfo
rd, 1989 ）が最も有効であった。
６及び９−１と命名されたモノクローナル抗体である
が、９−１はＣＤ２上の別のエピトープに結合する。し
かしながら、これらのモノクローナル抗体のうちで、３
５．１（Leukocyte Typing III(A.J.McMichael 編、Oxf
ord University Press, Oxford, 1987); Leukocyte Typ
ing IV (W.Knappら編、Oxford University Press, Oxfo
rd, 1989 ）が最も有効であった。
【００４１】下記の実施例２の中で示す通り、抗ＣＤ２
モノクローナル抗体の阻害効果はヒト単球Ｆｃレセプタ
ーに対する活性化性α−ＣＤ３モノクローナル抗体との
競合によらない。これは、Ｆ（ａｂ′）2 とＦａｂフラ
グメントの両者がＨＩＶ−１生産を阻害するのに有効で
あるとの結果に準ずる。これらのフラグメントは抗体の
Ｆｃ領域を有さず、従って単球Ｆｃレセプターについて
競合することができない。従って、かかるフラグメント
の利用は本発明の範囲に属する。
モノクローナル抗体の阻害効果はヒト単球Ｆｃレセプタ
ーに対する活性化性α−ＣＤ３モノクローナル抗体との
競合によらない。これは、Ｆ（ａｂ′）2 とＦａｂフラ
グメントの両者がＨＩＶ−１生産を阻害するのに有効で
あるとの結果に準ずる。これらのフラグメントは抗体の
Ｆｃ領域を有さず、従って単球Ｆｃレセプターについて
競合することができない。従って、かかるフラグメント
の利用は本発明の範囲に属する。
【００４２】感染Ｔ細胞におけるＨＩＶ−１生産の抑制
にとっての他の有用なＣＤ２特異的モノクローナル抗体
は、ＣＯＳ細胞の中での一過性発現により作られるキメ
ラヒト化抗ＣＤ２モノクローナル抗体であり、そしてそ
れはＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇと命名されている。この組換
モノクローナル抗体は、ネズミモノクローナル抗体のＨ
及びＬ鎖に由来する可変領域と、ヒトＩｇＧ１に由来す
る定常領域とを含む一本鎖ペプチドを含む。ＣＯＳ細胞
の一過性発現に用いたベクターを、１９９３年４月９日
にアメリカン タイプ カルチャー コレクションにＡ
ＴＣＣ No. ６９２７７として寄託したエッシェリヒア
コリの中で増幅させた。
にとっての他の有用なＣＤ２特異的モノクローナル抗体
は、ＣＯＳ細胞の中での一過性発現により作られるキメ
ラヒト化抗ＣＤ２モノクローナル抗体であり、そしてそ
れはＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇと命名されている。この組換
モノクローナル抗体は、ネズミモノクローナル抗体のＨ
及びＬ鎖に由来する可変領域と、ヒトＩｇＧ１に由来す
る定常領域とを含む一本鎖ペプチドを含む。ＣＯＳ細胞
の一過性発現に用いたベクターを、１９９３年４月９日
にアメリカン タイプ カルチャー コレクションにＡ
ＴＣＣ No. ６９２７７として寄託したエッシェリヒア
コリの中で増幅させた。
【００４３】このモノクローナル抗体のプロトマー形態
は一価、即ち、各組換抗体分子は一つのみの抗原結合性
部位を有する。しかしながら、このモノクローナル抗体
の凝集体を作ることができる。このモノクローナル抗体
の製造は下記に詳細する。
は一価、即ち、各組換抗体分子は一つのみの抗原結合性
部位を有する。しかしながら、このモノクローナル抗体
の凝集体を作ることができる。このモノクローナル抗体
の製造は下記に詳細する。
【００４４】ＣＤ２抗原に対する結合親和性を有し、且
つヒト起源の配列の少なくとも一部を有するその他のモ
ノクローナル抗体は本発明の範囲に属すると考えられ
る。これらの抗体には：（１）ＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇの
それと同一の相補性決定領域を有し、且つ少なくとも５
個のヒト起源アミノ酸の少なくとも一配列セグメントを
有するモノクローナル抗体；及び（２）モラーベースで
ＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇの少なくとも約８０％の効率でＣ
Ｄ２抗原に対する結合についてＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇと
競合し、且つ少なくとも５個のヒト起源アミノ酸配列の
少なくとも一配列セグメントを有するモノクローナル抗
体；が含まれる。好ましくは、このモノクローナル抗体
はもう一ベースでＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇの少なくとも約
９０％で競合する。
つヒト起源の配列の少なくとも一部を有するその他のモ
ノクローナル抗体は本発明の範囲に属すると考えられ
る。これらの抗体には：（１）ＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇの
それと同一の相補性決定領域を有し、且つ少なくとも５
個のヒト起源アミノ酸の少なくとも一配列セグメントを
有するモノクローナル抗体；及び（２）モラーベースで
ＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇの少なくとも約８０％の効率でＣ
Ｄ２抗原に対する結合についてＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇと
競合し、且つ少なくとも５個のヒト起源アミノ酸配列の
少なくとも一配列セグメントを有するモノクローナル抗
体；が含まれる。好ましくは、このモノクローナル抗体
はもう一ベースでＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇの少なくとも約
９０％で競合する。
【００４５】ＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇのそれと実質的に相
同の相補性決定領域を有する抗体は、当業界に公知であ
り、且つ例えばJ.Sambrookらの「Molecular Cloning: A
Laboratory Manual」（第２版；Cold Spring Harbor L
aboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 198
9 ）第２巻、第15章「Site-Directed Mutagenesis ofCl
oned DNA 」頁15.1-15.113 （引用することで本明細書
に組入れる））に記載の手順を利用するインビトロ突然
変異誘発によって作り上げることができる。ＣＤ２ Ｓ
Ｆｖ−Ｉｇのそれと同一の相補性決定領域を有する組換
遺伝子操作モノクローナル抗体は、定常領域における、
又は相補性決定領域（ＣＤＲｓ）の部分でない可変領域
の領域における突然変異のみによる、キメラモノクロー
ナル抗体に由来するものである。ＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇ
のそれと実質的に相同な相補性決定領域を有する組換操
作モノクローナル抗体は、定常領域と、ＣＤＲを含む可
変領域との両方における突然変異により、そのモノクロ
ーナル抗体に由来しうる。
同の相補性決定領域を有する抗体は、当業界に公知であ
り、且つ例えばJ.Sambrookらの「Molecular Cloning: A
Laboratory Manual」（第２版；Cold Spring Harbor L
aboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 198
9 ）第２巻、第15章「Site-Directed Mutagenesis ofCl
oned DNA 」頁15.1-15.113 （引用することで本明細書
に組入れる））に記載の手順を利用するインビトロ突然
変異誘発によって作り上げることができる。ＣＤ２ Ｓ
Ｆｖ−Ｉｇのそれと同一の相補性決定領域を有する組換
遺伝子操作モノクローナル抗体は、定常領域における、
又は相補性決定領域（ＣＤＲｓ）の部分でない可変領域
の領域における突然変異のみによる、キメラモノクロー
ナル抗体に由来するものである。ＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇ
のそれと実質的に相同な相補性決定領域を有する組換操
作モノクローナル抗体は、定常領域と、ＣＤＲを含む可
変領域との両方における突然変異により、そのモノクロ
ーナル抗体に由来しうる。
【００４６】親和性及び特異性を実質的に保存せしめる
定常及び可変領域の両方に導入することのできる突然変
異は、保存的アミノ酸置換をもたらす突然変異である。
「保存的アミノ酸置換」と呼ばれる一定のアミノ酸置換
はタンパク質のコンホメーション又は機能のいづれをも
変えることなくタンパク質の中でしばしば行えうるもの
であることが、タンパク質化学のよく確立されている原
理である。かかる変更には、イソロイシン（Ｉ）、バリ
ン（Ｖ）及びロイシン（Ｌ）のいづれかを、任意の別の
これらの疎水性アミノ酸に；アスパラギン酸（Ｄ）をグ
ルタミン酸（Ｅ）に、及びその逆；グルタミン（Ｑ）を
アスパラギンに、及びその逆；そしてセリン（Ｓ）をス
レオニンに、及びその逆；に置換することを含む。その
他の置換も、特定のアミノ酸の環境及びタンパク質の三
次構造におけるその役割に依存して保存的と考えること
もできる。例えばグリシン（Ｇ）とアラニン（Ａ）とは
しばしば、アラニンとバリン（Ｖ）とのように交換し合
える。比較的疎水性であるメチオニン（Ｍ）はしばしば
ロイシン及びイソロイシンと、そして時折りバリンと交
換できうる。リジン（Ｋ）とアルギニン（Ｒ）は、アミ
ノ酸残基の有意義なる特徴がその電荷であり、そしてそ
れら２つのアミノ酸残基のｐｋの差が有意義でない箇所
においてしばしば交換される。更なる他の変更が特定の
環境において「保存的」と考えられうる。タンパク質の
三次元構造又は反応性に影響しない変更はコンピュータ
ーモデル化によって決定できる。
定常及び可変領域の両方に導入することのできる突然変
異は、保存的アミノ酸置換をもたらす突然変異である。
「保存的アミノ酸置換」と呼ばれる一定のアミノ酸置換
はタンパク質のコンホメーション又は機能のいづれをも
変えることなくタンパク質の中でしばしば行えうるもの
であることが、タンパク質化学のよく確立されている原
理である。かかる変更には、イソロイシン（Ｉ）、バリ
ン（Ｖ）及びロイシン（Ｌ）のいづれかを、任意の別の
これらの疎水性アミノ酸に；アスパラギン酸（Ｄ）をグ
ルタミン酸（Ｅ）に、及びその逆；グルタミン（Ｑ）を
アスパラギンに、及びその逆；そしてセリン（Ｓ）をス
レオニンに、及びその逆；に置換することを含む。その
他の置換も、特定のアミノ酸の環境及びタンパク質の三
次構造におけるその役割に依存して保存的と考えること
もできる。例えばグリシン（Ｇ）とアラニン（Ａ）とは
しばしば、アラニンとバリン（Ｖ）とのように交換し合
える。比較的疎水性であるメチオニン（Ｍ）はしばしば
ロイシン及びイソロイシンと、そして時折りバリンと交
換できうる。リジン（Ｋ）とアルギニン（Ｒ）は、アミ
ノ酸残基の有意義なる特徴がその電荷であり、そしてそ
れら２つのアミノ酸残基のｐｋの差が有意義でない箇所
においてしばしば交換される。更なる他の変更が特定の
環境において「保存的」と考えられうる。タンパク質の
三次元構造又は反応性に影響しない変更はコンピュータ
ーモデル化によって決定できる。
【００４７】本発明の範囲に属するキメラモノクローナ
ル抗体は、Ｈ鎖起源の相補性決定領域がＣＤ２ ＳＦｖ
−Ｉｇのそれと配列において同一であるもの、及びＬ鎖
起源のＣＤＲがＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇのそれと配列にお
いて同一であるものである。
ル抗体は、Ｈ鎖起源の相補性決定領域がＣＤ２ ＳＦｖ
−Ｉｇのそれと配列において同一であるもの、及びＬ鎖
起源のＣＤＲがＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇのそれと配列にお
いて同一であるものである。
【００４８】本発明の範囲に属する本発明にかかわる抗
体の追加の改質には、キメラ分子のＩｇ領域の少なくと
も一部が排除され、抗体の相補性決定領域が残っている
変異体が含まれる。これらの変異体には、分子の全Ｉｇ
領域が排除された変異体が含まれる。分子量の小さめの
これらの変異体はインビボ使用においてより所望され、
なぜならこれらはリンパ組織の中により有効に侵入する
からである。これらの変異体は適当な欠失を誘発するこ
とによりインビトロ突然変異誘発によって作られうる。
好ましくは、これらの変異体はＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇに
由来し、そしてそのキメラ抗体の相補性決定領域を保持
している。
体の追加の改質には、キメラ分子のＩｇ領域の少なくと
も一部が排除され、抗体の相補性決定領域が残っている
変異体が含まれる。これらの変異体には、分子の全Ｉｇ
領域が排除された変異体が含まれる。分子量の小さめの
これらの変異体はインビボ使用においてより所望され、
なぜならこれらはリンパ組織の中により有効に侵入する
からである。これらの変異体は適当な欠失を誘発するこ
とによりインビトロ突然変異誘発によって作られうる。
好ましくは、これらの変異体はＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇに
由来し、そしてそのキメラ抗体の相補性決定領域を保持
している。
【００４９】３５．１に加えてＨＩＶ−１の複製を防ぐ
ための本発明の範囲に属するのはＣＤ２上のＬＦＡ−３
結合性部位をブロックする抗ＣＤ２抗体でもあり、これ
はＣＤ２とＬＦＡ−３との相互作用を防ぐ。
ための本発明の範囲に属するのはＣＤ２上のＬＦＡ−３
結合性部位をブロックする抗ＣＤ２抗体でもあり、これ
はＣＤ２とＬＦＡ−３との相互作用を防ぐ。
【００５０】Ｂ．抗ＣＤ１８モノクローナル抗体 ＣＤ４+ Ｔ細胞の中でのＨＩＶ−１生産の抑制において
有効なその他のモノクローナル抗体は抗ＣＤ１８モノク
ローナル抗体である。抗原ＣＤ１８はＬＦＡ−１として
知られる細胞表層レセプターのβ−サブユニットであ
り、そしてこれは単球上のＩＣＡＭ−１，ＩＣＡＭ−２
及びＩＣＡＭ−３と命名されている分子と相互作用す
る。ＣＤ２に対するモノクローナル抗体と同様に、ＣＤ
１８に対するモノクローナル抗体は外因性ＩＬ−２の存
在下又は非存在下でＨＩＶ−１の生産を抑制する。適切
な抗ＣＤ１８モノクローナル抗体は６０．３である。
有効なその他のモノクローナル抗体は抗ＣＤ１８モノク
ローナル抗体である。抗原ＣＤ１８はＬＦＡ−１として
知られる細胞表層レセプターのβ−サブユニットであ
り、そしてこれは単球上のＩＣＡＭ−１，ＩＣＡＭ−２
及びＩＣＡＭ−３と命名されている分子と相互作用す
る。ＣＤ２に対するモノクローナル抗体と同様に、ＣＤ
１８に対するモノクローナル抗体は外因性ＩＬ−２の存
在下又は非存在下でＨＩＶ−１の生産を抑制する。適切
な抗ＣＤ１８モノクローナル抗体は６０．３である。
【００５１】Ｃ．抗−ＬＦＡ−３モノクローナル抗体 感染Ｔ細胞におけるＨＩＶ−１生産の抑制にとって有用
な他の抗体は抗−ＬＦＡ−３モノクローナル抗体であ
る。ＬＦＡ−３は単球の表層上に典型的に見い出せる分
子であり、そしてＴ細胞リンパ球上のＣＤ２と相互作用
する。従って、抗ＬＦＡ−３モノクローナル抗体は活性
化リンパ球の中でのＨＩＶ−１合成に必要なＣＤ２とＬ
ＦＡ−３との間での相互作用を崩壊する。適当な抗−Ｌ
ＦＡ−３モノクローナル抗体はＴｓ ２／９である。
な他の抗体は抗−ＬＦＡ−３モノクローナル抗体であ
る。ＬＦＡ−３は単球の表層上に典型的に見い出せる分
子であり、そしてＴ細胞リンパ球上のＣＤ２と相互作用
する。従って、抗ＬＦＡ−３モノクローナル抗体は活性
化リンパ球の中でのＨＩＶ−１合成に必要なＣＤ２とＬ
ＦＡ−３との間での相互作用を崩壊する。適当な抗−Ｌ
ＦＡ−３モノクローナル抗体はＴｓ ２／９である。
【００５２】Ｄ．抗ＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体 感染Ｔ細胞の中でのＨＩＶ−１生産の抑制にとって有用
なその他の抗体は抗ＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体で
ある。単球上に位置するＩＣＡＭ−１はリンパ球の表層
上のＣＤ１８抗原に結合する。ＣＤ１８はＬＦＡ−１の
β−サブユニットである。適切な抗−ＩＣＡＭ−１モノ
クローナル抗体は８４Ｈ１０である。
なその他の抗体は抗ＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体で
ある。単球上に位置するＩＣＡＭ−１はリンパ球の表層
上のＣＤ１８抗原に結合する。ＣＤ１８はＬＦＡ−１の
β−サブユニットである。適切な抗−ＩＣＡＭ−１モノ
クローナル抗体は８４Ｈ１０である。
【００５３】II．キメラヒト化抗ＣＤ２抗体 ＨＩＶ−１生産及びＣＤ４+ リンパ球の抑制にとって有
用な好ましい抗体はＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇと呼ばれるキ
メラヒト化一本鎖抗体である。キメラモノクローナル抗
体の利用は一般にヒト対象体の処置において好ましく、
その理由はかかるモノクローナル抗体は：（１）抗ネズ
ミ免疫応答をあまり誘発しないことがあり、そして
（２）インビボで長い生存期間を有しうるからである
（G.Haleら、「Remission Induction in Non-Hodgkin L
ymphoma With Reshaped Human Monoclonal Antibody CA
MPATH-1H」Lancet 2: 1394-1399 (1988); D.Yasmeen
ら、「TheStructure and Function of Immunoglobulin
Domains. IV. The Distribution of Some Effector Fun
ctions among the Cγ2Cγ3 Homology Regions of Hum
anImmunoglobulin G1 」J.Immunol. 116: 518-526 (198
6)) 。
用な好ましい抗体はＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇと呼ばれるキ
メラヒト化一本鎖抗体である。キメラモノクローナル抗
体の利用は一般にヒト対象体の処置において好ましく、
その理由はかかるモノクローナル抗体は：（１）抗ネズ
ミ免疫応答をあまり誘発しないことがあり、そして
（２）インビボで長い生存期間を有しうるからである
（G.Haleら、「Remission Induction in Non-Hodgkin L
ymphoma With Reshaped Human Monoclonal Antibody CA
MPATH-1H」Lancet 2: 1394-1399 (1988); D.Yasmeen
ら、「TheStructure and Function of Immunoglobulin
Domains. IV. The Distribution of Some Effector Fun
ctions among the Cγ2Cγ3 Homology Regions of Hum
anImmunoglobulin G1 」J.Immunol. 116: 518-526 (198
6)) 。
【００５４】Ａ．キメラヒト化モノクローナル抗体ＣＤ
２ ＳＦｖ−Ｉｇの生産 キメラヒトモノクローナル抗体ＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇの
生産はネズミハイブリドーマ中のモノクローナル抗体に
ついてコードする遺伝子の単離及び定常領域のヒト定常
領域の対応遺伝子配列による交換を必要とする。最終生
成物はモノクローナル抗体の活性を有する一本鎖分子で
あり、そしてエッシェリヒア コリの中のキメラ抗体に
ついてコードするＤＮＡの増幅後にＣＯＳ細胞の中で発
現させる。
２ ＳＦｖ−Ｉｇの生産 キメラヒトモノクローナル抗体ＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇの
生産はネズミハイブリドーマ中のモノクローナル抗体に
ついてコードする遺伝子の単離及び定常領域のヒト定常
領域の対応遺伝子配列による交換を必要とする。最終生
成物はモノクローナル抗体の活性を有する一本鎖分子で
あり、そしてエッシェリヒア コリの中のキメラ抗体に
ついてコードするＤＮＡの増幅後にＣＯＳ細胞の中で発
現させる。
【００５５】１．ｃＤＮＡ合成及び増幅 ＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇの生産における第一段階は、ハイ
ブリドーマ細胞生産性抗ＣＤ２モノクローナル抗体から
単離したメッセンジャーＲＮＡからのｃＤＮＡの合成で
ある。好ましくは、ネズミハイブリドーマ細胞を使用す
る。
ブリドーマ細胞生産性抗ＣＤ２モノクローナル抗体から
単離したメッセンジャーＲＮＡからのｃＤＮＡの合成で
ある。好ましくは、ネズミハイブリドーマ細胞を使用す
る。
【００５６】典型的には、全ＲＮＡを当業界によく知ら
れる抽出法、例えば酸性pHでのフェノールによる抽出又
はグアニジニウムチオシアネートによる抽出、それに続
く塩化セシウム溶液の中での遠心により単離される。こ
れらの手順及びその他のＲＮＡ抽出は、J.Sambrookら、
「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」（第２
版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spri
ng Harbor, New York, 1989 ）、第７章、「Extractio
n, Purification, and Analysis of Messenger RNA Fro
m Eukaryotic Cells,」頁7.1-7.25に記載されている。
任意的に、ｍＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）でのクロマトグラ
フィーにより全ｍＲＮＡから単離してよいが、しかしこ
の工程は必須ではない。
れる抽出法、例えば酸性pHでのフェノールによる抽出又
はグアニジニウムチオシアネートによる抽出、それに続
く塩化セシウム溶液の中での遠心により単離される。こ
れらの手順及びその他のＲＮＡ抽出は、J.Sambrookら、
「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」（第２
版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spri
ng Harbor, New York, 1989 ）、第７章、「Extractio
n, Purification, and Analysis of Messenger RNA Fro
m Eukaryotic Cells,」頁7.1-7.25に記載されている。
任意的に、ｍＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）でのクロマトグラ
フィーにより全ｍＲＮＡから単離してよいが、しかしこ
の工程は必須ではない。
【００５７】ｃＤＮＡを合成するため、κ又はλ軽鎖定
常領域に、且つγ2a重鎖の定常領域に相補性のプライマ
ーを合成の開始のために好適に利用する。最も好ましく
は、使用するプライマーはκ鎖定常領域中のヌクレオチ
ド１０１−１２４及びγ2a定常領域中のヌクレオチド１
００−１２３に相補性である。あまり好ましくはない
が、その他のプライマーも、それらが完全な可変領域を
含むｃＤＮＡの生産を可能とする限り、利用できうる。
常領域に、且つγ2a重鎖の定常領域に相補性のプライマ
ーを合成の開始のために好適に利用する。最も好ましく
は、使用するプライマーはκ鎖定常領域中のヌクレオチ
ド１０１−１２４及びγ2a定常領域中のヌクレオチド１
００−１２３に相補性である。あまり好ましくはない
が、その他のプライマーも、それらが完全な可変領域を
含むｃＤＮＡの生産を可能とする限り、利用できうる。
【００５８】増幅は、滑り（ｓｌｉｐｐａｇｅ）抜きの
高率増幅を可能とする任意の手順によって実施できう
る。好ましくは、増幅はポリメラーゼ連鎖反応による
（K.B.Mullis F.A.Faloona, 「Specific Synthesis of
DNA in Vitro Via a Polymerase-Catalyzed Chain Reac
tion」Meth. Enzymol. 155: 335-350 (1987); K.Mullis
ら、「Specific Enzymatic Amplification of DNA in V
itro: The Polymerase Chain Reaction 」Cold Spring
Harbor Symp.Quant.Biol. 51: 263-273 (1986); R.K.S
aikiら、「Primer-Directed Enzymatic Amplification
of DNA with a Thermostable DNA Polymerase 」Scienc
e 238: 487-491 (1988)) 。
高率増幅を可能とする任意の手順によって実施できう
る。好ましくは、増幅はポリメラーゼ連鎖反応による
（K.B.Mullis F.A.Faloona, 「Specific Synthesis of
DNA in Vitro Via a Polymerase-Catalyzed Chain Reac
tion」Meth. Enzymol. 155: 335-350 (1987); K.Mullis
ら、「Specific Enzymatic Amplification of DNA in V
itro: The Polymerase Chain Reaction 」Cold Spring
Harbor Symp.Quant.Biol. 51: 263-273 (1986); R.K.S
aikiら、「Primer-Directed Enzymatic Amplification
of DNA with a Thermostable DNA Polymerase 」Scienc
e 238: 487-491 (1988)) 。
【００５９】ある非常に好ましい手順はシングルサイド
型（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｉｄｅｄ）又はアンカー型ＰＣＲ
を利用する（E.Y.Loh ら、「Polymerase Chain Reactio
n with Single-Sided Specifity: Analysis of T-cell
Receptor δ Chain」Science 243: 217-220 (1989))
。この手順は逆転写物の３′末端のホモポリマーテー
リングを利用する；次にＰＣＲ増幅を、特異的な３′−
プライマー、及びアンカーを終結せしめる、常用の制限
部位を有する配列に付加された転写物の３′末端に加え
られているホモポリマーに相補性なホモポリマーテール
より成る第二オリゴヌクレオチドで行う。あるバージョ
ンにおいて、縮重オリゴヌクレオチド（Y.L.Chiangら、
「Direct cDNA Cloning of the Rearranged Immunoglob
ulin Variable Region」Biotechniques 7: 360-366 (1
989)) を標準ＰＣＲによりγ2a重鎖可変領域を増幅する
ために用い、そしてκ鎖可変領域についてのｃＤＮＡへ
のポリ（ｄＧ）テール３′末端の付加の後、アンカー型
ＰＣＲをこのκ鎖の定常領域のヌクレオチド１０１−１
２４に相補性なプライマーを用いて利用する。典型的に
は、約３０周期の増幅を行うが、しかしこの回数は必要
なだけ変えられうる。
型（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｉｄｅｄ）又はアンカー型ＰＣＲ
を利用する（E.Y.Loh ら、「Polymerase Chain Reactio
n with Single-Sided Specifity: Analysis of T-cell
Receptor δ Chain」Science 243: 217-220 (1989))
。この手順は逆転写物の３′末端のホモポリマーテー
リングを利用する；次にＰＣＲ増幅を、特異的な３′−
プライマー、及びアンカーを終結せしめる、常用の制限
部位を有する配列に付加された転写物の３′末端に加え
られているホモポリマーに相補性なホモポリマーテール
より成る第二オリゴヌクレオチドで行う。あるバージョ
ンにおいて、縮重オリゴヌクレオチド（Y.L.Chiangら、
「Direct cDNA Cloning of the Rearranged Immunoglob
ulin Variable Region」Biotechniques 7: 360-366 (1
989)) を標準ＰＣＲによりγ2a重鎖可変領域を増幅する
ために用い、そしてκ鎖可変領域についてのｃＤＮＡへ
のポリ（ｄＧ）テール３′末端の付加の後、アンカー型
ＰＣＲをこのκ鎖の定常領域のヌクレオチド１０１−１
２４に相補性なプライマーを用いて利用する。典型的に
は、約３０周期の増幅を行うが、しかしこの回数は必要
なだけ変えられうる。
【００６０】２．増幅ＤＮＡのクローニング ＰＣＲ生成物を適当な細菌宿主、最も好適には、ＤＮＡ
が組込まれることができ、且つ細菌宿主の中で安定的に
複製されるプラスミドベクターを有するＥ．コリにクロ
ーンする。Ｅ．コリへのクローニングにとって適当な数
多くのクローニングベクターが公知であり、そしてＳａ
ｍｂｒｏｏｋら前掲 第１章「Ｐｌａｓｍｉｄ Ｖｅｃ
ｔｏｒｓ」頁１．１−１．１１０に記載されている。必
要とされる正確なる操作は選んだ特定のクローニングベ
クター及びベクターの中へのクローニングのために利用
する特定制限エンドヌクレアーゼ部位に依存する。
が組込まれることができ、且つ細菌宿主の中で安定的に
複製されるプラスミドベクターを有するＥ．コリにクロ
ーンする。Ｅ．コリへのクローニングにとって適当な数
多くのクローニングベクターが公知であり、そしてＳａ
ｍｂｒｏｏｋら前掲 第１章「Ｐｌａｓｍｉｄ Ｖｅｃ
ｔｏｒｓ」頁１．１−１．１１０に記載されている。必
要とされる正確なる操作は選んだ特定のクローニングベ
クター及びベクターの中へのクローニングのために利用
する特定制限エンドヌクレアーゼ部位に依存する。
【００６１】ある非常に好ましいベクターはｐＵＣ１９
である。ｐＵＣ１９の中へのクローニングのため、ＰＣ
Ｒ生成物をＥ．コリＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフ
ラグメント及び４種のデオキシリボヌクレオシド三リン
酸で処理して、ＤＮＡ鎖の末端にある一本鎖領域をフィ
リングすることによってブラント末端を得る。次に、軽
鎖起源のｃＤＮＡの増幅フラグメント（ＶＬフラグメン
ト）の５′末端及び３末端それぞれにＥｃｏＲＩ及びＢ
ａｍＨＩ制限部位を付加するのにＰＣＲを用いることが
できる。同様に、重鎖起源のｃＤＮＡの増幅フラグメン
ト（ＶＨフラグメント）にＸｂａＩ及びＨｉｎｄIII 制
限部位を加える。これらのフラグメントを適当な制限エ
ンドヌクレアーゼで消化し、次いで（１）ＶＬのために
ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨ；そして（２）ＶＨのためにＸ
ｂａＩ及びＨｉｎｄIII で消化しておいたｐＵＣ１９ベ
クターの中にクローンする。得られる構築体はコンピテ
ントＥ．コリ株、例えばＤＨ５αを形質転換せしめるた
めに用いることができる。
である。ｐＵＣ１９の中へのクローニングのため、ＰＣ
Ｒ生成物をＥ．コリＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフ
ラグメント及び４種のデオキシリボヌクレオシド三リン
酸で処理して、ＤＮＡ鎖の末端にある一本鎖領域をフィ
リングすることによってブラント末端を得る。次に、軽
鎖起源のｃＤＮＡの増幅フラグメント（ＶＬフラグメン
ト）の５′末端及び３末端それぞれにＥｃｏＲＩ及びＢ
ａｍＨＩ制限部位を付加するのにＰＣＲを用いることが
できる。同様に、重鎖起源のｃＤＮＡの増幅フラグメン
ト（ＶＨフラグメント）にＸｂａＩ及びＨｉｎｄIII 制
限部位を加える。これらのフラグメントを適当な制限エ
ンドヌクレアーゼで消化し、次いで（１）ＶＬのために
ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨ；そして（２）ＶＨのためにＸ
ｂａＩ及びＨｉｎｄIII で消化しておいたｐＵＣ１９ベ
クターの中にクローンする。得られる構築体はコンピテ
ントＥ．コリ株、例えばＤＨ５αを形質転換せしめるた
めに用いることができる。
【００６２】ＶＬ及びＶＨを含むクローンは好ましくは
ＤＮＡ配列決定により同定する。適切なＤＮＡ配列決定
手順はＳａｎｇｅｒジデオキシヌクレオチド連鎖停止手
順である。かかる手順は、ポリクローニング部位にフラ
ンクするｐＵＣ１９配列にアニールする前進及び後退プ
ライマーを伴うシーケナーゼ２．０キット（United Sta
tes Biochemical, Cleveland, Ohio）を用いて実施でき
る。好ましくは、ＶＬ及びＶＨに関する共通配列を、多
重クローンを比較し、そしてその配列を対応のネズミＶ
Ｌ及びＶＨ可変領域配列と並べることによって決定する
（E.A.Kabat ら、「Sequences of Protein of Immunolo
gical Interest」（第４版、U.S.Department of Health
and Human Services, Bethesda, Maryland, 1987)) 。
ＤＮＡ配列決定により同定する。適切なＤＮＡ配列決定
手順はＳａｎｇｅｒジデオキシヌクレオチド連鎖停止手
順である。かかる手順は、ポリクローニング部位にフラ
ンクするｐＵＣ１９配列にアニールする前進及び後退プ
ライマーを伴うシーケナーゼ２．０キット（United Sta
tes Biochemical, Cleveland, Ohio）を用いて実施でき
る。好ましくは、ＶＬ及びＶＨに関する共通配列を、多
重クローンを比較し、そしてその配列を対応のネズミＶ
Ｌ及びＶＨ可変領域配列と並べることによって決定する
（E.A.Kabat ら、「Sequences of Protein of Immunolo
gical Interest」（第４版、U.S.Department of Health
and Human Services, Bethesda, Maryland, 1987)) 。
【００６３】3. 発現カセットの調製及び1 本鎖抗体構
築物の生産 次の段階は、リンカーにより分けられたVL及びVH配列を
含む1 本鎖抗体構築物を取り込んだ発現カセットの調製
である。高く好ましい手順においては、5'- リーダー配
列を、VLから除去し、そして生来の蛋白の残基1 に先行
するSal I 部位を含む配列により置換する。3'- 末端か
らの33の定常領域残基を、16- 残基リンカー配列ESGSVS
SEELAFRSL(配列番号1)をコードしている配列に相補的な
配列を添加してプライマーにより置き換える(J.K. Batr
a et al., "Anti-TAc (FV)-PE40,a Single Chain Antib
ody Pseudomonas Fusion Protein Directed at Interle
ukin-2 Receptor-Bearing Cells,"J. Biol. Chem.265:1
5198-15202 (1990)) 。VH配列のために、VHプライマー
を、リンカーをエンコードしている" センス(sense)"配
列、例えば、先に与えた16- 残基のリンカー配列( 配列
番号1)を、成熟蛋白の残基1 に先行するVH 5'-末端に添
加し、そしてBcl I 部位を3'- 末端において定常領域残
基と置換する。
築物の生産 次の段階は、リンカーにより分けられたVL及びVH配列を
含む1 本鎖抗体構築物を取り込んだ発現カセットの調製
である。高く好ましい手順においては、5'- リーダー配
列を、VLから除去し、そして生来の蛋白の残基1 に先行
するSal I 部位を含む配列により置換する。3'- 末端か
らの33の定常領域残基を、16- 残基リンカー配列ESGSVS
SEELAFRSL(配列番号1)をコードしている配列に相補的な
配列を添加してプライマーにより置き換える(J.K. Batr
a et al., "Anti-TAc (FV)-PE40,a Single Chain Antib
ody Pseudomonas Fusion Protein Directed at Interle
ukin-2 Receptor-Bearing Cells,"J. Biol. Chem.265:1
5198-15202 (1990)) 。VH配列のために、VHプライマー
を、リンカーをエンコードしている" センス(sense)"配
列、例えば、先に与えた16- 残基のリンカー配列( 配列
番号1)を、成熟蛋白の残基1 に先行するVH 5'-末端に添
加し、そしてBcl I 部位を3'- 末端において定常領域残
基と置換する。
【００６４】ポリメラーゼ連鎖反応を、次に、鋳型とし
て示したように修飾されたVL cDNAとVH cDNA との混合
と共に、そして4 プライマー(2つのリンカー・プライマ
ー及び2 つのプライマーであって制限部位を含むもの)
の混合と共に、使用することができる。これは、Sal I
及びBcl I 部位に隣接したVL- リインカー-VH 配列を含
む1 本鎖DNA 断片を作り出す。このDNA 構築物を、次
に、好ましくは、dam -Ｅ．コリ細胞、例えば、NEB 208
株を通して継代培養する。この継代培養構築物を、次
に、Sal I 及びBcl I により消化させる。
て示したように修飾されたVL cDNAとVH cDNA との混合
と共に、そして4 プライマー(2つのリンカー・プライマ
ー及び2 つのプライマーであって制限部位を含むもの)
の混合と共に、使用することができる。これは、Sal I
及びBcl I 部位に隣接したVL- リインカー-VH 配列を含
む1 本鎖DNA 断片を作り出す。このDNA 構築物を、次
に、好ましくは、dam -Ｅ．コリ細胞、例えば、NEB 208
株を通して継代培養する。この継代培養構築物を、次
に、Sal I 及びBcl I により消化させる。
【００６５】4. 融合蛋白の調製及び発現 先の段階からの消化DNA を、次に、抗-6κ軽鎖リーダー
配列、その後のSal I部位及びBcl I 、その後のヒトIgG
1尾をエンコードしているcDNAであってその中でヒンジ
領域内のシステインがダイマー化を防ぐためにセリンに
突然変異されているものを、含むpCDM8 ベクター中に、
リゲートする(P.S. Linsley et al., "Binding of the
B Cell Activation Antigen B7 to CD28 Costimulates
T-Cell Proliferation and Interleukin-2 mRNA Accumu
lation," J. Exp. Med. 191:721-730 (1991)) 。
配列、その後のSal I部位及びBcl I 、その後のヒトIgG
1尾をエンコードしているcDNAであってその中でヒンジ
領域内のシステインがダイマー化を防ぐためにセリンに
突然変異されているものを、含むpCDM8 ベクター中に、
リゲートする(P.S. Linsley et al., "Binding of the
B Cell Activation Antigen B7 to CD28 Costimulates
T-Cell Proliferation and Interleukin-2 mRNA Accumu
lation," J. Exp. Med. 191:721-730 (1991)) 。
【００６６】得られた構築物は、哺乳類細胞内でCD2 SF
v-Igキメラ・ヒト化モノクロナール抗体を発現すること
ができる。この構築物は、ネズミの相補性- 決定領域及
びヒト定常領域を含む。この構築物を、好ましくは、コ
ンピテントＥ．コリ内で増幅する。構築物による形質転
換のために高く好ましいＥ．コリの株は、MC1061/63で
ある。この構築物により形質転換されたＥ．コリは、AT
CC寄託番号69277 としてAmerican Type Culture Collec
tionにより寄託されている。
v-Igキメラ・ヒト化モノクロナール抗体を発現すること
ができる。この構築物は、ネズミの相補性- 決定領域及
びヒト定常領域を含む。この構築物を、好ましくは、コ
ンピテントＥ．コリ内で増幅する。構築物による形質転
換のために高く好ましいＥ．コリの株は、MC1061/63で
ある。この構築物により形質転換されたＥ．コリは、AT
CC寄託番号69277 としてAmerican Type Culture Collec
tionにより寄託されている。
【００６７】プラスミドDNA を、次に、例えば、塩化カ
ルシウム密度勾配遠心分離により、単離し、そして精製
する。精製したDNA を、次に、このようにトランスフェ
クトされたDNA を発現することができる真核生物細胞系
にトランスフェクトする。高く好ましい細胞系は、サル
COS 細胞である。DNA を導入する好ましい方法は、DEAE
- デキストランによるが、他の方法を、トタンスフェク
ションのために利用することができ、そして本分野にお
いて知られている。これらの方法は、リン酸カルシウム
とDNA との共沈降によるトランスフェクション、ポリカ
チオン、ポリブレンを使用するトランスフェクション、
及びエレクトロポレーションによるトランスフェクショ
ンを含む。これらの方法は、J. Sambrook et al., "Mol
ecular Cloning: A Laboratory Manual," 前記, vol.
3, pp. 16.30-16.55 中に記載されている。
ルシウム密度勾配遠心分離により、単離し、そして精製
する。精製したDNA を、次に、このようにトランスフェ
クトされたDNA を発現することができる真核生物細胞系
にトランスフェクトする。高く好ましい細胞系は、サル
COS 細胞である。DNA を導入する好ましい方法は、DEAE
- デキストランによるが、他の方法を、トタンスフェク
ションのために利用することができ、そして本分野にお
いて知られている。これらの方法は、リン酸カルシウム
とDNA との共沈降によるトランスフェクション、ポリカ
チオン、ポリブレンを使用するトランスフェクション、
及びエレクトロポレーションによるトランスフェクショ
ンを含む。これらの方法は、J. Sambrook et al., "Mol
ecular Cloning: A Laboratory Manual," 前記, vol.
3, pp. 16.30-16.55 中に記載されている。
【００６８】好ましくは、融合蛋白をコードしている配
列を含む組換えDNA は、A. Aruffo,"Transient Express
ion of proteins Using COS Cells, " in Current Prot
ocols in Molecular Biology (2d ed., F.M. Ausubel e
t al., eds., John Wiley &Sons, New York, 1991), p
p. 16.13.1-16.13.7 中に記載されているように、過渡
的発現により、発現される。
列を含む組換えDNA は、A. Aruffo,"Transient Express
ion of proteins Using COS Cells, " in Current Prot
ocols in Molecular Biology (2d ed., F.M. Ausubel e
t al., eds., John Wiley &Sons, New York, 1991), p
p. 16.13.1-16.13.7 中に記載されているように、過渡
的発現により、発現される。
【００６９】B. キメラ・ヒト化抗体、CD2 SFv-Igの構
造及び特徴 CD2抗原の対するキメラ・ヒト化抗体、CD2 SFv-Igは、
ネズミ起源のH 及びL鎖の両方の可変領域の部分を含む1
本鎖構造物である。この可変領域を、ヒト起源の定常
領域、すなわち、IgG1に結合させる。得られた1 本鎖蛋
白は、CD2 抗原と1 価で結合する; すなわち、IgG 分子
毎に1 つの抗原結合部位が在る。この抗体は、蛍光活性
化セル・ソーティング(fluorescent activated cell so
rting(FACS))により測定されるように、Jurkat T細胞上
のCD2 への結合について、ネズミ抗-CD2モノクロナール
抗体35.1と、特異的に競合する。 III. 抗体の、検出マーカー及び治療剤への結合 CD2 SFv-IgG1を含む、本発明に記載の抗体を、インビボ
及びインビトロの両方における診断における使用のため
の、そして治療における使用のための、検出マーカー及
び治療剤に、結合させることができる。抗体が結合する
ことができるところの検出マーカーの中には、酵素、常
磁性イオン又は化合物、アビジン- ビオチン特異的結合
対のメンバー、蛍光団(fluorophores)、発色団(chromop
hores)、化学発光団(chemiluminophores) 、重金属、及
びラジオアイソトープがある。抗体がそれに結合するこ
とができる治療剤の中には、抗新形成剤、リンホカイ
ン、及び毒素がある。
造及び特徴 CD2抗原の対するキメラ・ヒト化抗体、CD2 SFv-Igは、
ネズミ起源のH 及びL鎖の両方の可変領域の部分を含む1
本鎖構造物である。この可変領域を、ヒト起源の定常
領域、すなわち、IgG1に結合させる。得られた1 本鎖蛋
白は、CD2 抗原と1 価で結合する; すなわち、IgG 分子
毎に1 つの抗原結合部位が在る。この抗体は、蛍光活性
化セル・ソーティング(fluorescent activated cell so
rting(FACS))により測定されるように、Jurkat T細胞上
のCD2 への結合について、ネズミ抗-CD2モノクロナール
抗体35.1と、特異的に競合する。 III. 抗体の、検出マーカー及び治療剤への結合 CD2 SFv-IgG1を含む、本発明に記載の抗体を、インビボ
及びインビトロの両方における診断における使用のため
の、そして治療における使用のための、検出マーカー及
び治療剤に、結合させることができる。抗体が結合する
ことができるところの検出マーカーの中には、酵素、常
磁性イオン又は化合物、アビジン- ビオチン特異的結合
対のメンバー、蛍光団(fluorophores)、発色団(chromop
hores)、化学発光団(chemiluminophores) 、重金属、及
びラジオアイソトープがある。抗体がそれに結合するこ
とができる治療剤の中には、抗新形成剤、リンホカイ
ン、及び毒素がある。
【００７０】検出マーカー及び治療剤、並びに結合方法
は、本分野においてよく知られているが、以下の討議
は、限定というよりもむしろ例示的なものを意図されて
いる。以下の討議の中で特定の検出マーカー、治療剤、
又は標識方法を省略することは、その検出マーカー、治
療剤、又は標識方法が本発明のモノクロナール抗体のい
ずれかによる使用に好適でないということを含意するも
のと翻訳されるべきではない。 A. 結合方法 好適な結合方法は、共有結合、キレートによる結合、及
びコロイド形成による結合を含む。
は、本分野においてよく知られているが、以下の討議
は、限定というよりもむしろ例示的なものを意図されて
いる。以下の討議の中で特定の検出マーカー、治療剤、
又は標識方法を省略することは、その検出マーカー、治
療剤、又は標識方法が本発明のモノクロナール抗体のい
ずれかによる使用に好適でないということを含意するも
のと翻訳されるべきではない。 A. 結合方法 好適な結合方法は、共有結合、キレートによる結合、及
びコロイド形成による結合を含む。
【００７１】1. 共有結合 共有結合は、2 官能価のカップリング剤による結合と酸
化的結合による両方の結合を含む。前者は、そのモノク
ロナール抗体が有機分子に結合するとき、一般的に利用
することができる。後者は、その抗体が放射性ヨウ素に
より標識されるとき、最も一般的に使用される。
化的結合による両方の結合を含む。前者は、そのモノク
ロナール抗体が有機分子に結合するとき、一般的に利用
することができる。後者は、その抗体が放射性ヨウ素に
より標識されるとき、最も一般的に使用される。
【００７２】a. 2 官能価カップリング剤による結合 多くの2 官能価カップリング剤が、様々なタイプの官能
基を有する有機分子を、抗体分子を含む蛋白にカップリ
ングさせるために有用である。有機分子の、抗体特異性
を有する蛋白を含む蛋白への結合体は、本分野において
よく知られており、そして例えば、P. Tijssen, "2 Pra
ctice and Theory of Enzyme Immunoassays" (Elsevie
r, Amsterdam, 1985), pp. 279-296 ( これを、引用に
より本明細書中に取り込む。) 中に記載されている。
基を有する有機分子を、抗体分子を含む蛋白にカップリ
ングさせるために有用である。有機分子の、抗体特異性
を有する蛋白を含む蛋白への結合体は、本分野において
よく知られており、そして例えば、P. Tijssen, "2 Pra
ctice and Theory of Enzyme Immunoassays" (Elsevie
r, Amsterdam, 1985), pp. 279-296 ( これを、引用に
より本明細書中に取り込む。) 中に記載されている。
【００７３】簡単に言えば、カルボキシル基を含む有機
分子又はカルボキシル化されることができるものを、混
合無水物反応により、水溶性カルボジイミドとの反応、
又はN-ヒドロキシスクシンイミドとの反応により、カッ
プリングすることができる。カルボキシル化を、反応、
例えば、酸素又は窒素置換基のハロエステルによるアル
キル化、その後のエステルの加水分解、又はステロイド
のヒドロキシル基又はケトン基上のヘミスクシネート・
エステル又はカルボキシメルオキシムの形成により、行
うことができる。
分子又はカルボキシル化されることができるものを、混
合無水物反応により、水溶性カルボジイミドとの反応、
又はN-ヒドロキシスクシンイミドとの反応により、カッ
プリングすることができる。カルボキシル化を、反応、
例えば、酸素又は窒素置換基のハロエステルによるアル
キル化、その後のエステルの加水分解、又はステロイド
のヒドロキシル基又はケトン基上のヘミスクシネート・
エステル又はカルボキシメルオキシムの形成により、行
うことができる。
【００７４】アミノ基又はアミノ基に還元されることが
できるニトロ基をもつ有機分子を、ジアゾニウム塩に変
換し、そして芳香族アミンのための、わずかにアルカリ
性のpHにおいて蛋白と反応させることができる。脂肪族
アミンをもつ有機分子を、カルボジイミドとの反応、ホ
モ2 官能性試薬トリレン-2,4- ジイソシアネートとの反
応、又はマレイミド(maleimide) 化合物との反応を含む
様々な方法により、蛋白と結合させることができる。ま
た、脂肪族アミンを、p-ニトロベンゾイルクロライドと
の反応、そしてその後のp-アミノベンゾイルアミドへの
還元により、芳香族アミンに変換することができ、これ
を、次に、ジアゾ化(diazotization) 後に蛋白にカップ
リングさせることができる。また、2 官能価イミデート
・エステル、例えば、ジメチルピメリミデート(dimethy
lpimelimidate)、ジメチルアジピミデート(dimethyladi
pimidate) 、又はジメチルスバーミデート(dimethylsub
ermidate) を、アミノ基含有有機分子を蛋白に結合させ
るために使用することができる。
できるニトロ基をもつ有機分子を、ジアゾニウム塩に変
換し、そして芳香族アミンのための、わずかにアルカリ
性のpHにおいて蛋白と反応させることができる。脂肪族
アミンをもつ有機分子を、カルボジイミドとの反応、ホ
モ2 官能性試薬トリレン-2,4- ジイソシアネートとの反
応、又はマレイミド(maleimide) 化合物との反応を含む
様々な方法により、蛋白と結合させることができる。ま
た、脂肪族アミンを、p-ニトロベンゾイルクロライドと
の反応、そしてその後のp-アミノベンゾイルアミドへの
還元により、芳香族アミンに変換することができ、これ
を、次に、ジアゾ化(diazotization) 後に蛋白にカップ
リングさせることができる。また、2 官能価イミデート
・エステル、例えば、ジメチルピメリミデート(dimethy
lpimelimidate)、ジメチルアジピミデート(dimethyladi
pimidate) 、又はジメチルスバーミデート(dimethylsub
ermidate) を、アミノ基含有有機分子を蛋白に結合させ
るために使用することができる。
【００７５】チオール含有有機分子を、マレイミド、例
えば、4-(N- マレイミドメチル)-シクロヘキサン-1- カ
ルボン酸N-ヒドロキシスクシミド・エステルにより蛋白
に結合させることができる。ヒドロキシ基もつ有機分子
のために、アルコール官能基を、結合のために利用でき
るカルボキシル基を導入するヘミスクシネートに変換す
ることができる。あるいは、2 官能価試薬セバコイルジ
クロライド(sebacoyldichloride)は、アルコールを酸ク
ロライドであって次に蛋白と反応するものに変換させ
る。
えば、4-(N- マレイミドメチル)-シクロヘキサン-1- カ
ルボン酸N-ヒドロキシスクシミド・エステルにより蛋白
に結合させることができる。ヒドロキシ基もつ有機分子
のために、アルコール官能基を、結合のために利用でき
るカルボキシル基を導入するヘミスクシネートに変換す
ることができる。あるいは、2 官能価試薬セバコイルジ
クロライド(sebacoyldichloride)は、アルコールを酸ク
ロライドであって次に蛋白と反応するものに変換させ
る。
【００７６】フェノールを、カルボキシル基を導入する
ジアゾ化p-アミノ安息香酸により活性化することがで
き、そして、次に、混合無水物反応により蛋白と反応さ
せることができる。砂糖を、p-ニトロフェニル・グリコ
シドを形成させ、その後のそのニトロ基をアミノ基に還
元し、そしてジアゾ化により結合することにより、活性
化することができる。他の方法は、ペリオデート(perio
date) との反応、その後の水素化ホウ素ナトリウムによ
る還元的アルキル化によるアミンとのカップリングによ
る、砂糖のアルデヒドへのビシナル・グリコールの解裂
を含む。あるいは、ヒドロキシル含有有機分子は、ホス
ゲンとの反応によるクロロカーボネートへの変換後に結
合される。
ジアゾ化p-アミノ安息香酸により活性化することがで
き、そして、次に、混合無水物反応により蛋白と反応さ
せることができる。砂糖を、p-ニトロフェニル・グリコ
シドを形成させ、その後のそのニトロ基をアミノ基に還
元し、そしてジアゾ化により結合することにより、活性
化することができる。他の方法は、ペリオデート(perio
date) との反応、その後の水素化ホウ素ナトリウムによ
る還元的アルキル化によるアミンとのカップリングによ
る、砂糖のアルデヒドへのビシナル・グリコールの解裂
を含む。あるいは、ヒドロキシル含有有機分子は、ホス
ゲンとの反応によるクロロカーボネートへの変換後に結
合される。
【００７７】アルデヒド又はケトン基をもつ有機分子の
ために、カルボキシル基を、O-カルボキシメチルオキシ
ムの形成を通して導入することができる。また、ケトン
基を、カルボキシル基を作るためにp-ヒドラジノ安息香
酸と誘導体化することもできる。アルデヒドを含む有機
分子を、還元剤、例えば、水素化ホウ素ナトリウムによ
る還元により安定化されるSchiff塩基の形成を通して直
接に結合することができる。
ために、カルボキシル基を、O-カルボキシメチルオキシ
ムの形成を通して導入することができる。また、ケトン
基を、カルボキシル基を作るためにp-ヒドラジノ安息香
酸と誘導体化することもできる。アルデヒドを含む有機
分子を、還元剤、例えば、水素化ホウ素ナトリウムによ
る還元により安定化されるSchiff塩基の形成を通して直
接に結合することができる。
【００７８】b. 酸化的結合 酸化的結合は、放射性ヨウ素を抗体にカップリングさせ
るとき、特に有用である。好適な方法は:(1)クロラミン
-Tによる化学的酸化;(2)ヨードゲン(1,3,4,6-テトラク
ロロ-3α,6α- ジフェニルグリコールリル) による化学
的酸化;(3)酵素ラクトペルオキシダーゼによる酸化、を
含む。酸化的な手順ではないが、ヨウ素による標識付け
のための他の有用な方法は、Bolton-Hunter 試薬として
一般的に知られている、[ 125 I] N- スクシンイミジル
-3-(4-ヒドロフェニルプロピオネート) によるものであ
る。これらの技術は、例えば、E. Harlow and D. Lane,
"Antibodies: A Laboratory Manual" (Cold Spring Ha
rbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 198
8), pp. 324-339 中に記載されている。
るとき、特に有用である。好適な方法は:(1)クロラミン
-Tによる化学的酸化;(2)ヨードゲン(1,3,4,6-テトラク
ロロ-3α,6α- ジフェニルグリコールリル) による化学
的酸化;(3)酵素ラクトペルオキシダーゼによる酸化、を
含む。酸化的な手順ではないが、ヨウ素による標識付け
のための他の有用な方法は、Bolton-Hunter 試薬として
一般的に知られている、[ 125 I] N- スクシンイミジル
-3-(4-ヒドロフェニルプロピオネート) によるものであ
る。これらの技術は、例えば、E. Harlow and D. Lane,
"Antibodies: A Laboratory Manual" (Cold Spring Ha
rbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 198
8), pp. 324-339 中に記載されている。
【００７９】2. キレート結合による結合 キレート結合(chelation) による結合は、特に、放射性
であることができる、陽電荷金属イオンに有用である。
キレート結合による抗体に結合することができる好適な
金属イオンの例は、111 In(III) である。好適なキレー
ト剤は、エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)の誘導体、
例えば、キレーター・ジエチレントリアミンペエンタ酢
酸(DTPA)及びその誘導体を、含む。キレート結合による
モノクロナール抗体の標識付けの手順は、例えば、T.G.
Wensel & C.F. Mear, " 'Bifunctional' Chelating Ag
ents for Binding Metal Ions to Proteins," in Radio
immunoimaging and Radioimmunotherapy (S.W. Burchie
l & B.A. Rhodes, eds., Elsevier, Amsterdam, 1983),
pp. 185-196及びA.R. Bradwell et al., "Development
s in Antibody Imaging," in Monoclonal Antibodies f
or Cancer Detection and Therapy (Baldwin et al., e
ds., Academic Press, London, 1985), pp.65-85 中に
記載されている。
であることができる、陽電荷金属イオンに有用である。
キレート結合による抗体に結合することができる好適な
金属イオンの例は、111 In(III) である。好適なキレー
ト剤は、エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)の誘導体、
例えば、キレーター・ジエチレントリアミンペエンタ酢
酸(DTPA)及びその誘導体を、含む。キレート結合による
モノクロナール抗体の標識付けの手順は、例えば、T.G.
Wensel & C.F. Mear, " 'Bifunctional' Chelating Ag
ents for Binding Metal Ions to Proteins," in Radio
immunoimaging and Radioimmunotherapy (S.W. Burchie
l & B.A. Rhodes, eds., Elsevier, Amsterdam, 1983),
pp. 185-196及びA.R. Bradwell et al., "Development
s in Antibody Imaging," in Monoclonal Antibodies f
or Cancer Detection and Therapy (Baldwin et al., e
ds., Academic Press, London, 1985), pp.65-85 中に
記載されている。
【００８０】3. コロイド形成による結合 コロイドを作るための、抗体の金属ゾルへの結合は、特
に、免疫組織化学的又は免疫細胞化学的な技術における
使用のための標識抗体に、有用である。この金属ゲル
は、金、プラチナ、銀、又は他の金属であることができ
る。この技術は、J. DeMey et al., "Gold Probes in L
ight Microscopy," in Immunocytochemistry: Modern M
ethods and Applications (J. M. Polak & S. Van Noor
den, eds.,Wright, Bristol, 1986), pp. 71-88及びJ.
DeMey, "The Preparation and Useof Gold Probes, " i
n Immunnocytochemistry: Modern Methods and Applica
tions, pp. 115-145中に、詳細に記載されている。 B. 検出マーカー 1. 酵素 有用な検出マーカーの中には、検出可能な生成物を作る
酵素がある。ある場合には、これらの生成物は、不溶性
であり、そして容易に検出される着色沈殿物を形成す
る。好適な酵素の中には、β- ガラクトシダーゼ、アル
カリ性ホスファターゼ、及びホースラディッシュ・ペル
オキシダーゼ、並びに本分野においてよく知られている
他の酵素がある。 2. 常磁性材料 常磁性材料は、Mn2+、Cr3+、及び多くの希土類、例え
ば、セシウム、ガドリニウム、テルビウム、ツリウム及
びそれらの化合物を含む。
に、免疫組織化学的又は免疫細胞化学的な技術における
使用のための標識抗体に、有用である。この金属ゲル
は、金、プラチナ、銀、又は他の金属であることができ
る。この技術は、J. DeMey et al., "Gold Probes in L
ight Microscopy," in Immunocytochemistry: Modern M
ethods and Applications (J. M. Polak & S. Van Noor
den, eds.,Wright, Bristol, 1986), pp. 71-88及びJ.
DeMey, "The Preparation and Useof Gold Probes, " i
n Immunnocytochemistry: Modern Methods and Applica
tions, pp. 115-145中に、詳細に記載されている。 B. 検出マーカー 1. 酵素 有用な検出マーカーの中には、検出可能な生成物を作る
酵素がある。ある場合には、これらの生成物は、不溶性
であり、そして容易に検出される着色沈殿物を形成す
る。好適な酵素の中には、β- ガラクトシダーゼ、アル
カリ性ホスファターゼ、及びホースラディッシュ・ペル
オキシダーゼ、並びに本分野においてよく知られている
他の酵素がある。 2. 常磁性材料 常磁性材料は、Mn2+、Cr3+、及び多くの希土類、例え
ば、セシウム、ガドリニウム、テルビウム、ツリウム及
びそれらの化合物を含む。
【００８１】3. アビジン- ビオチン特異的結合対のメ
ンバー 抗体を、アビジン- 特異的結合対のメンバーにより標識
することができ、そして特異的結合対の他のメンバー
を、他の検出マーカーにより標識することができる。こ
れは、抗体の間接的標識付けの非常に特異的な手段を提
供し、そしてその標識の増幅を可能にする。好ましく
は、抗体を、ビオチンにより標識し、そして間接標識
を、アビジンに結合させる。ある場合には、このパター
ン、すなわち、抗体をビオチンにより標識し、そしてア
ビジンにその標識を付着させることを、逆にすることが
必要であるかもしれない。ストレプトアビジン、ストレ
プトミセス・アビジニ(Streptomyces avidinii) からの
蛋白は、ビオチンへの同様なアフィニティーをもち、そ
してアビジンの代わりとして使用されることができる。
様々なリンカーを、様々な長さのスペーサーを提供しな
がら、ビオチンを抗体に結合させるために、使用するこ
とができる。
ンバー 抗体を、アビジン- 特異的結合対のメンバーにより標識
することができ、そして特異的結合対の他のメンバー
を、他の検出マーカーにより標識することができる。こ
れは、抗体の間接的標識付けの非常に特異的な手段を提
供し、そしてその標識の増幅を可能にする。好ましく
は、抗体を、ビオチンにより標識し、そして間接標識
を、アビジンに結合させる。ある場合には、このパター
ン、すなわち、抗体をビオチンにより標識し、そしてア
ビジンにその標識を付着させることを、逆にすることが
必要であるかもしれない。ストレプトアビジン、ストレ
プトミセス・アビジニ(Streptomyces avidinii) からの
蛋白は、ビオチンへの同様なアフィニティーをもち、そ
してアビジンの代わりとして使用されることができる。
様々なリンカーを、様々な長さのスペーサーを提供しな
がら、ビオチンを抗体に結合させるために、使用するこ
とができる。
【００８２】4. 蛍光団 しばしば、蛍光標識( 蛍光団) が検出のための抗体を標
識するために使用される。このような蛍光団は、フルオ
ロセイン、ローダミン、フィコエリトリン、及びTexas
Red 、塩化スルホニル誘導体を含む。また、これらの誘
導体を含む他の蛍光団を、抗体を標識するために使用す
ることができる。
識するために使用される。このような蛍光団は、フルオ
ロセイン、ローダミン、フィコエリトリン、及びTexas
Red 、塩化スルホニル誘導体を含む。また、これらの誘
導体を含む他の蛍光団を、抗体を標識するために使用す
ることができる。
【００８３】5. 発色団 多数の染料又は発色団を、標識として使用し、抗体濃度
の可視性指標を与えることができる。但し、他の方法
が、一般的に、より感度が高く、そしてより低い抗体濃
度を検出することができる。実際に、いずれかの染料
を、先に開示したカップリング手順の中の1 つを使用し
て、抗体に結合させることができる。
の可視性指標を与えることができる。但し、他の方法
が、一般的に、より感度が高く、そしてより低い抗体濃
度を検出することができる。実際に、いずれかの染料
を、先に開示したカップリング手順の中の1 つを使用し
て、抗体に結合させることができる。
【００８４】6. 化学発光団 他の蛍光団は、化学発光団( 化学発光標識) である。こ
れらの標識は、数ある中で、ルミノール及びイソルミノ
ール誘導体、アリール・アギザレート、10- メチル- ア
クリジニウム-9- カルボン酸アリール・エステル、及び
5-メチル- フェナンスリジニウム-6- カルボン酸アリー
ル・エステルを、含む。
れらの標識は、数ある中で、ルミノール及びイソルミノ
ール誘導体、アリール・アギザレート、10- メチル- ア
クリジニウム-9- カルボン酸アリール・エステル、及び
5-メチル- フェナンスリジニウム-6- カルボン酸アリー
ル・エステルを、含む。
【００８５】7. 重金属 これらは、電子濃密金属、例えば、金、銀、又は白金を
含む。これらは、典型的には、コロイド形成により抗体
に結合され、そして、電子顕微鏡におけるそれらの高い
電子密度により検出される。コロイド性重金属標識も、
そのコロイドの他の性質より検出されることができる。
含む。これらは、典型的には、コロイド形成により抗体
に結合され、そして、電子顕微鏡におけるそれらの高い
電子密度により検出される。コロイド性重金属標識も、
そのコロイドの他の性質より検出されることができる。
【００８６】8. ラジオアイソトープ ラジオアイソトープは、しばしば使用される標識であっ
て、β- 照射アイソトープのためのシンチレーション計
数又はγ- 照射アイソトープのためのタリウム- 活性化
ヨウ化ナトリウム結晶検出装置を使用したより良好な計
数により、非常に高い感度で検出されることができるも
のである。モノクロナール抗体を標識するのに好適なラ
ジオアイソトープは、3 H 、14C 、35S 、32P 、125 I
、及び13 1 I を含む。これらの中で、たぶん最も一般
的に使用される放射性標識は、γ-照射の125 I であ
り、これは、安価であり、そして高い効率で容易に検出
可能である。 C. 治療剤 本発明に記載のモノクロナール抗体を、治療剤と結合さ
せ、そしてその治療剤をCD2-発現リンパ球に向けるため
に使用することができる。これは、それらの高い全身的
投与量を必要とせずに、より高い濃度のこのような剤の
投与を可能にする。これは、このような剤の使用により
他の点でしばしば見られる副作用の発生を減少させるこ
とができる。治療剤と結合した本発明のモノクロナール
抗体の使用は、AIDSの治療又は軽減に限定される必要は
ないが、自己免疫疾患を含むリンパ球機能に影響を与え
る他の症状において有益であることを証明することがで
きる。
て、β- 照射アイソトープのためのシンチレーション計
数又はγ- 照射アイソトープのためのタリウム- 活性化
ヨウ化ナトリウム結晶検出装置を使用したより良好な計
数により、非常に高い感度で検出されることができるも
のである。モノクロナール抗体を標識するのに好適なラ
ジオアイソトープは、3 H 、14C 、35S 、32P 、125 I
、及び13 1 I を含む。これらの中で、たぶん最も一般
的に使用される放射性標識は、γ-照射の125 I であ
り、これは、安価であり、そして高い効率で容易に検出
可能である。 C. 治療剤 本発明に記載のモノクロナール抗体を、治療剤と結合さ
せ、そしてその治療剤をCD2-発現リンパ球に向けるため
に使用することができる。これは、それらの高い全身的
投与量を必要とせずに、より高い濃度のこのような剤の
投与を可能にする。これは、このような剤の使用により
他の点でしばしば見られる副作用の発生を減少させるこ
とができる。治療剤と結合した本発明のモノクロナール
抗体の使用は、AIDSの治療又は軽減に限定される必要は
ないが、自己免疫疾患を含むリンパ球機能に影響を与え
る他の症状において有益であることを証明することがで
きる。
【００８７】本発明に記載のモノクロナール抗体に結合
されることができる治療剤の中には、抗新形成剤、リン
ホカイン、及び毒素がある。先に記載したようなラジオ
アイソトープに結合された本発明に記載のモノクロナー
ル抗体も、治療のために使用することができる。 1. 抗腫瘍剤 多くの抗腫瘍剤が当業者に知られており、そして、例え
ば、W.O. Foye, ed.,"Principles of Medicinal Chemis
try" (3d ed., Lea & Febiger, Philadelphia, 1989),
pp. 757-783, 中に記載されており、そして、引用によ
り本明細書中に取り込まれている。例示的な抗腫瘍剤
は:(1)代謝阻害剤、例えば、メトトレキサート、6-メル
カプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン(cytarabin
e)、5-フルオロウラシル、及びダカルバジン(dacarbazi
ne);(2) アルキル化剤、例えば、トリエチレンチオホス
ホラミド( " チオテパ(thiotepa)")、クロラムブシル(c
hlorambucil)、メファラン(mephalan)、シクロホスファ
ミド、カルムスチン(carmustine)、ロムスチン(lomusti
ne) 、ブスルファン(busulfan)、マイトマイシンC 、及
びcis-ジクロロジアミン白金;(3)DNA-挿入剤(DNA-inter
calating agents)、例えば、ドクソルビシン(doxorubic
in) 、ダウノルビシン(daunorubicin)、ミトキサントロ
ン(mitoxantrone)、及びビサントレン(bisantrene);(4)
抗生物質活性をもつ医薬; 及び(5) 他の化合物、例え
ば、プロカルバジン(procarbazine)、ヒドロキシウレ
ア、及びアスパラギナーゼ、を含む。
されることができる治療剤の中には、抗新形成剤、リン
ホカイン、及び毒素がある。先に記載したようなラジオ
アイソトープに結合された本発明に記載のモノクロナー
ル抗体も、治療のために使用することができる。 1. 抗腫瘍剤 多くの抗腫瘍剤が当業者に知られており、そして、例え
ば、W.O. Foye, ed.,"Principles of Medicinal Chemis
try" (3d ed., Lea & Febiger, Philadelphia, 1989),
pp. 757-783, 中に記載されており、そして、引用によ
り本明細書中に取り込まれている。例示的な抗腫瘍剤
は:(1)代謝阻害剤、例えば、メトトレキサート、6-メル
カプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン(cytarabin
e)、5-フルオロウラシル、及びダカルバジン(dacarbazi
ne);(2) アルキル化剤、例えば、トリエチレンチオホス
ホラミド( " チオテパ(thiotepa)")、クロラムブシル(c
hlorambucil)、メファラン(mephalan)、シクロホスファ
ミド、カルムスチン(carmustine)、ロムスチン(lomusti
ne) 、ブスルファン(busulfan)、マイトマイシンC 、及
びcis-ジクロロジアミン白金;(3)DNA-挿入剤(DNA-inter
calating agents)、例えば、ドクソルビシン(doxorubic
in) 、ダウノルビシン(daunorubicin)、ミトキサントロ
ン(mitoxantrone)、及びビサントレン(bisantrene);(4)
抗生物質活性をもつ医薬; 及び(5) 他の化合物、例え
ば、プロカルバジン(procarbazine)、ヒドロキシウレ
ア、及びアスパラギナーゼ、を含む。
【００８８】2. リンホカイン モノクロナール抗体への付着に好適なリンホカインは、
インターフェロン、インターロイキン、腫瘍壊死因子、
及び形質転換成長因子を含む。インターロイキンは、IL
-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、
IL-8、IL-9、IL-10 を含む。腫瘍壊死因子は、TNF α及
びTNF βを含む。インターフェロンは、少なくとも20の
サブタイプをもつα- INF 、β-INF及びγ-INFを含む。
形質転換成長因子は、TGF βを含む。これらのリンホカ
インの性質は、E.S. Golub and D.R. Green, "Immunolo
gy: a Synthesis" (2d ed., Sinauer Associates, Inc.
Sunderland, Mass., 1991), pp. 444-461( これを、引
用により本明細書中に取り込む。) 中に簡単に要約され
ている。
インターフェロン、インターロイキン、腫瘍壊死因子、
及び形質転換成長因子を含む。インターロイキンは、IL
-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、
IL-8、IL-9、IL-10 を含む。腫瘍壊死因子は、TNF α及
びTNF βを含む。インターフェロンは、少なくとも20の
サブタイプをもつα- INF 、β-INF及びγ-INFを含む。
形質転換成長因子は、TGF βを含む。これらのリンホカ
インの性質は、E.S. Golub and D.R. Green, "Immunolo
gy: a Synthesis" (2d ed., Sinauer Associates, Inc.
Sunderland, Mass., 1991), pp. 444-461( これを、引
用により本明細書中に取り込む。) 中に簡単に要約され
ている。
【００８９】3. 毒素 免疫療法のために有用な毒素は、ヒマシ油からのリシ
ン、シュードモナス外毒素、及びジフテリア毒素を含
む。他のこのような毒素も、本分野において知られてい
る。 IV. 医薬組成物 本発明の他の態様は、感染患者におけるHIV-1 の増殖を
減少させることにおける使用に好適な医薬組成物であ
る。
ン、シュードモナス外毒素、及びジフテリア毒素を含
む。他のこのような毒素も、本分野において知られてい
る。 IV. 医薬組成物 本発明の他の態様は、感染患者におけるHIV-1 の増殖を
減少させることにおける使用に好適な医薬組成物であ
る。
【００９０】一般的に、本発明の医薬組成物は: (1)HIV-1により感染された患者における感染T 細胞にお
けるHIV-1 ウイルスの生産を阻害するのに十分な量にお
ける本発明に記載のキメラ・ヒト化モノクロナール抗-C
D2抗体; 及び (2) 医薬として許容される担体、を含んで成る。
けるHIV-1 ウイルスの生産を阻害するのに十分な量にお
ける本発明に記載のキメラ・ヒト化モノクロナール抗-C
D2抗体; 及び (2) 医薬として許容される担体、を含んで成る。
【００９１】キメラ・ヒト化モノクロナール抗-CD2抗体
は、好ましくは、CD2 SFv-Igである。但し、本発明の他
の抗体が、医薬組成物において使用されることもでき
る。本分野において知られた慣用の医薬として許容され
る担体は、アルコール、例えば、エチル・アルコール、
血清蛋白、ヒト血清アルブミン、リポソーム、バッファ
ー、例えば、リン酸塩、水、無菌生理食塩水又は他の
塩、電解質、グリセロール、ヒドロキシメチルセルロー
ス、プロピレン・グリコール、ポリエチレン・グリコー
ル、ポリオキシエチレンソルビタン、他の界面活性剤、
植物油、及び慣用の抗- バクテリア又は抗- 菌剤、例え
ば、パラベンズ(parabens)、クロロブタノール、フェノ
ール、ソルビン酸(sorbic acid) 、チメロザール(thime
rosal)、等を含む。本発明の範囲内の医薬として許容さ
れる担体は、無菌性、等張性、安定性、及び非- 発熱性
のための工業標準に適合する。使用される特定の担体
は、免疫防御抑制をブロックすることができる剤の濃度
及び投与の所定の経路に、依存する。典型的には、本発
明に記載の医薬組成物は、多数の慣用の経路、例えば、
静脈内、皮膚内、腹膜内、又は筋肉内の中の1 つによ
り、注射される。 V. HIV-1 感染T-細胞におけるHIV-1 の生産の阻害方法 本発明の他の態様は、HIV-1-感染細胞におけるHIV-1 の
生産の阻害のための方法である。一般的に、この方法
は: (1)HIV-1により感染されたT-細胞を選択し; そして、 (2) その感染されたT 細胞内のHIV-1 の生産を阻害する
ために、その感染されたT 細胞と、CD4 + T リンパ球と
単球(monocytes) との間の細胞表面の相互作用を破壊す
ることができるモノクロナール抗体とを、その細胞をそ
の接触T 細胞内のHIV-1 の生産を阻害するのに十分な量
の抗体により接触させながら、接触させること、を含ん
で成る。
は、好ましくは、CD2 SFv-Igである。但し、本発明の他
の抗体が、医薬組成物において使用されることもでき
る。本分野において知られた慣用の医薬として許容され
る担体は、アルコール、例えば、エチル・アルコール、
血清蛋白、ヒト血清アルブミン、リポソーム、バッファ
ー、例えば、リン酸塩、水、無菌生理食塩水又は他の
塩、電解質、グリセロール、ヒドロキシメチルセルロー
ス、プロピレン・グリコール、ポリエチレン・グリコー
ル、ポリオキシエチレンソルビタン、他の界面活性剤、
植物油、及び慣用の抗- バクテリア又は抗- 菌剤、例え
ば、パラベンズ(parabens)、クロロブタノール、フェノ
ール、ソルビン酸(sorbic acid) 、チメロザール(thime
rosal)、等を含む。本発明の範囲内の医薬として許容さ
れる担体は、無菌性、等張性、安定性、及び非- 発熱性
のための工業標準に適合する。使用される特定の担体
は、免疫防御抑制をブロックすることができる剤の濃度
及び投与の所定の経路に、依存する。典型的には、本発
明に記載の医薬組成物は、多数の慣用の経路、例えば、
静脈内、皮膚内、腹膜内、又は筋肉内の中の1 つによ
り、注射される。 V. HIV-1 感染T-細胞におけるHIV-1 の生産の阻害方法 本発明の他の態様は、HIV-1-感染細胞におけるHIV-1 の
生産の阻害のための方法である。一般的に、この方法
は: (1)HIV-1により感染されたT-細胞を選択し; そして、 (2) その感染されたT 細胞内のHIV-1 の生産を阻害する
ために、その感染されたT 細胞と、CD4 + T リンパ球と
単球(monocytes) との間の細胞表面の相互作用を破壊す
ることができるモノクロナール抗体とを、その細胞をそ
の接触T 細胞内のHIV-1 の生産を阻害するのに十分な量
の抗体により接触させながら、接触させること、を含ん
で成る。
【００９２】先に記載したモノクロナール抗体は、HIV-
1-感染T 細胞内のHIV-1 の生産を阻害するために使用さ
れることができる。一般的には、本発明に記載のキメラ
・ヒト化モノクロナール1 本鎖抗体、特にCD2 SFv-Igを
使用することが好ましい。しかしながら、他のモノクロ
ナール抗体、例えば、CD2 に対する2 価のモノクロナー
ル抗体、CD18に対するモノクロナール抗体、カウンター
- レセプタLFA-3 に対するモノクロナール抗体、及びカ
ウンター- レセプタICAM-1に対するモノクロナール抗体
を、使用することもできる。ある者は、この目的のため
に、可溶性形態における天然のCD2 リガンドLFA-3 、例
えば、細胞外ドメイン融合蛋白を使用することもでき
る。
1-感染T 細胞内のHIV-1 の生産を阻害するために使用さ
れることができる。一般的には、本発明に記載のキメラ
・ヒト化モノクロナール1 本鎖抗体、特にCD2 SFv-Igを
使用することが好ましい。しかしながら、他のモノクロ
ナール抗体、例えば、CD2 に対する2 価のモノクロナー
ル抗体、CD18に対するモノクロナール抗体、カウンター
- レセプタLFA-3 に対するモノクロナール抗体、及びカ
ウンター- レセプタICAM-1に対するモノクロナール抗体
を、使用することもできる。ある者は、この目的のため
に、可溶性形態における天然のCD2 リガンドLFA-3 、例
えば、細胞外ドメイン融合蛋白を使用することもでき
る。
【００９３】0.1 μg/mlと同程度に低い濃度のCD2 SFv-
Igは、50% を超えるウイルスの生産を阻害する。ダイマ
ー・ネズミ・モノクロナール抗体35.1については、0.01
μg/mlと同程度に低い濃度が50% を超えるまで阻害し;
0.10 μg/mlと同程度に低い濃度が90% を超えるまで阻
害する。使用される抗体は、所望により治療剤に結合さ
れることができる。
Igは、50% を超えるウイルスの生産を阻害する。ダイマ
ー・ネズミ・モノクロナール抗体35.1については、0.01
μg/mlと同程度に低い濃度が50% を超えるまで阻害し;
0.10 μg/mlと同程度に低い濃度が90% を超えるまで阻
害する。使用される抗体は、所望により治療剤に結合さ
れることができる。
【００９４】必要とされるより高い濃度の抗体にもかか
わらず、キメラ・ヒト化抗CD2 SFv-Igの使用は、一般的
に、ネズミ抗体から不所望の免疫反応の可能性を避ける
ために好ましい。このような相互作用は、不所望の副作
用を引き起こすだけではなく、投与された抗体それ自体
の活性をも妨害することができる。より高い濃度の抗体
は、幾つかの情況において、例えば、2 価のSFv が作ら
れる場合において、又は結合領域の周りのアミノ酸配列
が結合の効率を増加させるために修飾される場合におい
て、必ずしも必要なものではない。この修飾は、インビ
トロにおける突然変異誘発の標準的な技術により行うこ
とができる。 VI. HIV-1により感染された患者の治療方法 前述の方法は、HIV-1 により感染された患者の治療方法
のための基礎を作る。HIV-1 により感染された患者を、
エクスビボ(ex vivo) 又はインビボ(in vivo)のいずれ
かにおいて本発明の抗体及び組成物により、治療するこ
とができる。
わらず、キメラ・ヒト化抗CD2 SFv-Igの使用は、一般的
に、ネズミ抗体から不所望の免疫反応の可能性を避ける
ために好ましい。このような相互作用は、不所望の副作
用を引き起こすだけではなく、投与された抗体それ自体
の活性をも妨害することができる。より高い濃度の抗体
は、幾つかの情況において、例えば、2 価のSFv が作ら
れる場合において、又は結合領域の周りのアミノ酸配列
が結合の効率を増加させるために修飾される場合におい
て、必ずしも必要なものではない。この修飾は、インビ
トロにおける突然変異誘発の標準的な技術により行うこ
とができる。 VI. HIV-1により感染された患者の治療方法 前述の方法は、HIV-1 により感染された患者の治療方法
のための基礎を作る。HIV-1 により感染された患者を、
エクスビボ(ex vivo) 又はインビボ(in vivo)のいずれ
かにおいて本発明の抗体及び組成物により、治療するこ
とができる。
【００９５】一般的に、エクスビボにおける治療方法
は:(1)HIV-1 により感染されたT 細胞を選択し;(2)先に
記載したように、そのT 細胞を抗体と接触させ; そして
(3) その接触されたT 細胞を患者の中に再注入し、患者
内の機能的な非-HIV-1- 生産T細胞の割合を増加させ、
それにより患者を治療すること、を含んで成る。幾つか
の場合には、それらを再注入する前に、インビトロにお
いてT 細胞を活性化する追加の段階を含むことが好まれ
ることができる。これは、ウイルスの重荷を増加させる
ことなく有効なT 細胞の割合を増加させることができ
る。
は:(1)HIV-1 により感染されたT 細胞を選択し;(2)先に
記載したように、そのT 細胞を抗体と接触させ; そして
(3) その接触されたT 細胞を患者の中に再注入し、患者
内の機能的な非-HIV-1- 生産T細胞の割合を増加させ、
それにより患者を治療すること、を含んで成る。幾つか
の場合には、それらを再注入する前に、インビトロにお
いてT 細胞を活性化する追加の段階を含むことが好まれ
ることができる。これは、ウイルスの重荷を増加させる
ことなく有効なT 細胞の割合を増加させることができ
る。
【００９６】使用される投与量レンジは、特定の抗体の
ために先に特定した最小投与量に従って選ばれることが
できる。この投与量は、患者の臨床的状態及び応答に従
って治療内科医により、調整されることができる。これ
は、患者のT 細胞の計数値及び特定の日和見感染の存在
の有無を含む。この方法は、中枢神経系組織におけるAI
DSの増殖により引き起こされる日和見感染及び痴呆(dem
entia)の発生を含むHIV-1 の合併症を減少させることが
できる。
ために先に特定した最小投与量に従って選ばれることが
できる。この投与量は、患者の臨床的状態及び応答に従
って治療内科医により、調整されることができる。これ
は、患者のT 細胞の計数値及び特定の日和見感染の存在
の有無を含む。この方法は、中枢神経系組織におけるAI
DSの増殖により引き起こされる日和見感染及び痴呆(dem
entia)の発生を含むHIV-1 の合併症を減少させることが
できる。
【００９７】本方法は、AIDSに関連した日和見感染の治
療のための抗生物質又は他の治療剤の投与と共に、使用
されることができる。このような治療剤の例は、カリニ
(Pneumocystis carinii)肺炎のためのエアロゾル化ペン
タミジン(pentamidine) 、マイコバクテリア感染のため
のイソニアジド(isoniazid) 及び/ 又はリファンピン(r
ifampin)、及びカンジダ症(candidiasis) のためのアン
フォテリシンB(amphotericin B) を含む。
療のための抗生物質又は他の治療剤の投与と共に、使用
されることができる。このような治療剤の例は、カリニ
(Pneumocystis carinii)肺炎のためのエアロゾル化ペン
タミジン(pentamidine) 、マイコバクテリア感染のため
のイソニアジド(isoniazid) 及び/ 又はリファンピン(r
ifampin)、及びカンジダ症(candidiasis) のためのアン
フォテリシンB(amphotericin B) を含む。
【００９８】一般的に、インビボにおける治療方法は、
感染T 細胞内におけるHIV-1 の生産を阻害するために、
CD4 + T リンパ球と単球との間の細胞表面相互作用を破
壊することができるモノクロナール抗体を、そのT 細胞
がHIV-1 により感染されたている患者に、投与すること
を含んで成る。このモノクロナール抗体は、先に記載し
たものである。投与される抗体の量は、先に与えた投与
量のガイダンスに従って、患者において機能的な非-HIV
- 生産T 細胞を増加させるのに、又は、HIV-1感染T 細
胞の生産を阻害するために、十分なものである。インビ
ボにおける抗体の投与は、HIV-1 感染に関連した合併症
を減少させることができ、そしてウイルス血症(viremi
a) の間に行われることができる。
感染T 細胞内におけるHIV-1 の生産を阻害するために、
CD4 + T リンパ球と単球との間の細胞表面相互作用を破
壊することができるモノクロナール抗体を、そのT 細胞
がHIV-1 により感染されたている患者に、投与すること
を含んで成る。このモノクロナール抗体は、先に記載し
たものである。投与される抗体の量は、先に与えた投与
量のガイダンスに従って、患者において機能的な非-HIV
- 生産T 細胞を増加させるのに、又は、HIV-1感染T 細
胞の生産を阻害するために、十分なものである。インビ
ボにおける抗体の投与は、HIV-1 感染に関連した合併症
を減少させることができ、そしてウイルス血症(viremi
a) の間に行われることができる。
【００９９】インビボにおいて投与されるモノクロナー
ル抗体は、先に記載したように、所望により治療剤と結
合されるとができる。本治療方法は、先に記載したよう
に、AIDSと関連した日和見感染を治療するための抗生物
質又は他の特異的な治療剤の投与と組み合わされること
ができる。
ル抗体は、先に記載したように、所望により治療剤と結
合されるとができる。本治療方法は、先に記載したよう
に、AIDSと関連した日和見感染を治療するための抗生物
質又は他の特異的な治療剤の投与と組み合わされること
ができる。
【０１００】
【実施例】本発明を以下の実施例で説明する。これらの
実施例は例示目的にすぎず、本発明を限定するものでは
ない。
実施例は例示目的にすぎず、本発明を限定するものでは
ない。
【０１０１】実施例１ CD2 SFv-Igキメラヒト化抗CD2 組換えモノクローナル抗
体の調製 ヒト定常領域を含むキメラ一本鎖モノクローナル抗体(C
D2 SFv-Ig)を、以下のように組換えDNA 技法によって産
生させた。
体の調製 ヒト定常領域を含むキメラ一本鎖モノクローナル抗体(C
D2 SFv-Ig)を、以下のように組換えDNA 技法によって産
生させた。
【０１０２】cDNAの合成及び増幅 マウス抗ヒトCD2 抗体35.1を発現するハイブリドーマ細
胞(P.J. Martinら、"Functionally Distinct Epitopes
of Human Tp50"、J. Immunol. 、131: 190-195(1983))
を、10% 子ウシ血清(FCS) を補足したIMDMにおいて成長
させ、5 ×107個の細胞を標準的プロトコール(M. Gilma
n、"Current Protocols in MolecularBiology"、John W
iley & Sons 、New York、1990) によって溶解させてす
べての細胞RNA を単離した。35.1免疫グロブリンカッパ
ー軽鎖可変領域(VL)及び35.1 IgG2a重鎖可変領域(VH)の
第一のcDNA鎖を、鳥類骨髄芽球症ウイルス(AMV) 逆転写
酵素(Life Sciences、St. Petersburg、Florida)並びに
ネズミカッパー鎖不変領域(mck-1) 内のヌクレオチド 1
01〜124 及びネズミIgG2a 定常領域(mIgG2a)内のヌクレ
オチド 100〜123 に相補的な特異的プライマーを用いて
合成した。
胞(P.J. Martinら、"Functionally Distinct Epitopes
of Human Tp50"、J. Immunol. 、131: 190-195(1983))
を、10% 子ウシ血清(FCS) を補足したIMDMにおいて成長
させ、5 ×107個の細胞を標準的プロトコール(M. Gilma
n、"Current Protocols in MolecularBiology"、John W
iley & Sons 、New York、1990) によって溶解させてす
べての細胞RNA を単離した。35.1免疫グロブリンカッパ
ー軽鎖可変領域(VL)及び35.1 IgG2a重鎖可変領域(VH)の
第一のcDNA鎖を、鳥類骨髄芽球症ウイルス(AMV) 逆転写
酵素(Life Sciences、St. Petersburg、Florida)並びに
ネズミカッパー鎖不変領域(mck-1) 内のヌクレオチド 1
01〜124 及びネズミIgG2a 定常領域(mIgG2a)内のヌクレ
オチド 100〜123 に相補的な特異的プライマーを用いて
合成した。
【０１０３】ターミナルデオキシヌクレオチジルトラン
スフェラーゼ(Stratagene 、La Jolla、California) と
mck-1 とを用いて、35.1 VL cDNAの 3'-鎖にポリ(dG)尾
部を付加した。第二の鎖を、アンカーポリメラーゼ連鎖
反応法(E.Y. Joh ら、"Polymerase Chain Reaction wit
h Single-Sided Specificity; Analysis of T Cell Rec
eptor δ Chain" 、Science 243: 217-220 (1989))によ
って、mck-1 を特異的3'- プライマーとして用いて調製
した。
スフェラーゼ(Stratagene 、La Jolla、California) と
mck-1 とを用いて、35.1 VL cDNAの 3'-鎖にポリ(dG)尾
部を付加した。第二の鎖を、アンカーポリメラーゼ連鎖
反応法(E.Y. Joh ら、"Polymerase Chain Reaction wit
h Single-Sided Specificity; Analysis of T Cell Rec
eptor δ Chain" 、Science 243: 217-220 (1989))によ
って、mck-1 を特異的3'- プライマーとして用いて調製
した。
【０１０４】縮重オリゴヌクレオチド(Y.L. Chiang
ら、"Direct cDNA Cloning of the Rearranged Immunog
lobulin Variable Region"、Biotechniques 7: 360-366
(1989))を使用して、熱安定性のよいThermus aquaticu
s (Taq) DNA ポリメラーゼ(R.K.Saiki ら、"Primer-Dir
ected Enzymatic Amplification of DNA with a Thermo
stable DNA Polymerase" 、Science 239: 487-491 (198
8))を用いた標準的ポリメラーゼ連鎖反応手順によって3
5.1 VH 配列を増幅した。アンカーPCR 及び標準PCR で
は、全体積 100μl において、cDNA(0.1-1.0μg)と、1.
25mMの各dNTP、10mMトリス-HCl(pH 8.3)、50mM KCl、1.
5mM MgCl2 、それぞれ10〜25 pmol の 5'-及び3'- プラ
イマー、並びに2UのTaq DNA ポリメラーゼ(Stratagene
、La Jolla、California) を混合した。Perkin-Elmer
Cetusサーマルサイクラー(Norwalk、Connecticut)によ
って試料に30回の温度サイクルを施した。得られた増幅
DNA をGeneclean(Bio101、La Jolla、California) によ
って精製した。
ら、"Direct cDNA Cloning of the Rearranged Immunog
lobulin Variable Region"、Biotechniques 7: 360-366
(1989))を使用して、熱安定性のよいThermus aquaticu
s (Taq) DNA ポリメラーゼ(R.K.Saiki ら、"Primer-Dir
ected Enzymatic Amplification of DNA with a Thermo
stable DNA Polymerase" 、Science 239: 487-491 (198
8))を用いた標準的ポリメラーゼ連鎖反応手順によって3
5.1 VH 配列を増幅した。アンカーPCR 及び標準PCR で
は、全体積 100μl において、cDNA(0.1-1.0μg)と、1.
25mMの各dNTP、10mMトリス-HCl(pH 8.3)、50mM KCl、1.
5mM MgCl2 、それぞれ10〜25 pmol の 5'-及び3'- プラ
イマー、並びに2UのTaq DNA ポリメラーゼ(Stratagene
、La Jolla、California) を混合した。Perkin-Elmer
Cetusサーマルサイクラー(Norwalk、Connecticut)によ
って試料に30回の温度サイクルを施した。得られた増幅
DNA をGeneclean(Bio101、La Jolla、California) によ
って精製した。
【０１０５】増幅cDNAのクローニング PCR 生成物を、大腸菌DNA ポリメラーゼI のKlenowフラ
グメント(H. Klenow &I. Henningsen、"Selective Elim
ination of the Exonuclease Activity of the Deoxyri
bonucleic Acid Polymerase from Escherichia coli by
Limited Proteolysis"、Proc. Natl. Acad. Sci. USA
65: 168 (1970))とdNTPとで処理して平滑末端をもった
フラグメントを得た。PCR を利用して、VL cDNA フラグ
メントの5'及び3'末端にEco RI及びBam HIの制限部位を
付加した。同様に、VH cDNA にXba I 及びHind IIIの制
限部位を付加した。得られたフラグメントを適当な酵素
で消化し、Eco RI- 及びBam HI- 消化またはXba I-及び
Hind III- 消化pUC19 ベクター中へクローニングした。
その構築物を用いてコンピテントＥ．コリ(DH5α株) を
形質転換した。
グメント(H. Klenow &I. Henningsen、"Selective Elim
ination of the Exonuclease Activity of the Deoxyri
bonucleic Acid Polymerase from Escherichia coli by
Limited Proteolysis"、Proc. Natl. Acad. Sci. USA
65: 168 (1970))とdNTPとで処理して平滑末端をもった
フラグメントを得た。PCR を利用して、VL cDNA フラグ
メントの5'及び3'末端にEco RI及びBam HIの制限部位を
付加した。同様に、VH cDNA にXba I 及びHind IIIの制
限部位を付加した。得られたフラグメントを適当な酵素
で消化し、Eco RI- 及びBam HI- 消化またはXba I-及び
Hind III- 消化pUC19 ベクター中へクローニングした。
その構築物を用いてコンピテントＥ．コリ(DH5α株) を
形質転換した。
【０１０６】Sequenase 2.0 キット( 米国Biochemical
、Cleveland 、Ohio) 並びにポリクローニングサイト
にフランクするpUC19 配列にアニールする前進及び後退
プライマーを用いて、VL及びVHを含有するクローンを同
定した。多重クローンを比較することによって、また別
のネズミVL及びVH可変領域配列との整合によって 35.1V
L及びVHのコンセンサス配列を決定した(E.A. Kabat
ら、"Sequences of Proteins of Immunological Intere
st"(第４版、U.S. Department of Health and Human Se
rvices、NIH 、Bethesda、Md. 、1987))。
、Cleveland 、Ohio) 並びにポリクローニングサイト
にフランクするpUC19 配列にアニールする前進及び後退
プライマーを用いて、VL及びVHを含有するクローンを同
定した。多重クローンを比較することによって、また別
のネズミVL及びVH可変領域配列との整合によって 35.1V
L及びVHのコンセンサス配列を決定した(E.A. Kabat
ら、"Sequences of Proteins of Immunological Intere
st"(第４版、U.S. Department of Health and Human Se
rvices、NIH 、Bethesda、Md. 、1987))。
【０１０７】発現カセットの調製 VLから5'リーダー配列を除去する新規プライマーを設計
し、成熟タンパクの残基１に先立つ Sal I部位を付加し
た。3'末端から33個の定常領域残基を、16残基のリンカ
ー配列 ESGSVSSEELAFRSLD(配列ID No: 1) をコードする
配列に相補的な配列を付加するプライマーを用いたPCR
法で置換した(J.K. Batra ら、"Anti-Tac(FV)-PE40、a
Single Chain Antibody Pseudomonas Fusion Protein D
irectedat Interleukin 2 Receptor-Bearing Cells"、
J. Biol. Chem. 265: 15198-15202 (1990)) 。
し、成熟タンパクの残基１に先立つ Sal I部位を付加し
た。3'末端から33個の定常領域残基を、16残基のリンカ
ー配列 ESGSVSSEELAFRSLD(配列ID No: 1) をコードする
配列に相補的な配列を付加するプライマーを用いたPCR
法で置換した(J.K. Batra ら、"Anti-Tac(FV)-PE40、a
Single Chain Antibody Pseudomonas Fusion Protein D
irectedat Interleukin 2 Receptor-Bearing Cells"、
J. Biol. Chem. 265: 15198-15202 (1990)) 。
【０１０８】また、成熟タンパクの残基１に先立つVH
5'-末端へ該リンカーをコードする「有意な」配列を付
加し且つ3'末端における定常領域残基をBcl I 部位に置
換するVHプライマーを設計した。ポリメラーゼ連鎖反応
を利用し、VL及びVH cDNA の鋳型混合物と４種のプライ
マー混合物 (それぞれ100 pmole のリンカープライマー
と、制限部位を含むそれぞれ25 pmoleのプライマーと、
前記のその他の試薬) によって、Sal I 及びBcl I 部位
によってフランクされている VL-リンカー-VH 配列を含
む単一 DNAフラグメントを作製した。そのDNA を大腸菌
細胞(NEB208 株)で継代し、Geneclean(Bio101、La Joll
a、California) によって精製し、そしてSal I 及びBcl
I で消化した。
5'-末端へ該リンカーをコードする「有意な」配列を付
加し且つ3'末端における定常領域残基をBcl I 部位に置
換するVHプライマーを設計した。ポリメラーゼ連鎖反応
を利用し、VL及びVH cDNA の鋳型混合物と４種のプライ
マー混合物 (それぞれ100 pmole のリンカープライマー
と、制限部位を含むそれぞれ25 pmoleのプライマーと、
前記のその他の試薬) によって、Sal I 及びBcl I 部位
によってフランクされている VL-リンカー-VH 配列を含
む単一 DNAフラグメントを作製した。そのDNA を大腸菌
細胞(NEB208 株)で継代し、Geneclean(Bio101、La Joll
a、California) によって精製し、そしてSal I 及びBcl
I で消化した。
【０１０９】CD2 SFv-Ig融合タンパクの発現及びタンパ
ク分析 二量体化を防止するためにヒンジ領域内のシステインを
セリンへ変異させたヒトIgG1尾部をコードするcDNAに先
立つSal I 部位及びBcl I 部位が後に続く抗L6免疫グロ
ブリン軽鎖リーダー配列を含むpCDM8 ベクターへ、結合
されたCD2 VL及びVHをコードするDNA を結合させた(P.
S. Linsley ら、"Binding of the B CellActivation An
tigen B7 to CD28 Costimulates T Cell Proliferation
and Interleukin 2 mRNA Accumulation" 、J. Exp. Me
d. 173: 721-730 (1991)("Linsley et al. 1991a")) 。
ク分析 二量体化を防止するためにヒンジ領域内のシステインを
セリンへ変異させたヒトIgG1尾部をコードするcDNAに先
立つSal I 部位及びBcl I 部位が後に続く抗L6免疫グロ
ブリン軽鎖リーダー配列を含むpCDM8 ベクターへ、結合
されたCD2 VL及びVHをコードするDNA を結合させた(P.
S. Linsley ら、"Binding of the B CellActivation An
tigen B7 to CD28 Costimulates T Cell Proliferation
and Interleukin 2 mRNA Accumulation" 、J. Exp. Me
d. 173: 721-730 (1991)("Linsley et al. 1991a")) 。
【０１１０】その構築物をＥ．コリ MC1061/P3株の中で
増幅させ、そしてプラスミドDNA をCsClグラジエントで
精製した。そのDNA を、 DEAE-デキストランで COS細胞
へトランスフェクトする前に配列決定して確認した後、
トランジエントトランスフェクションによって COS細胞
内で発現させた(A. Aruffo、"Transient Expressionof
Proteins Using COS Cells"、in Current Protocols in
Molecular Biology(2nd ed., F.M. Ausubel et al., e
ds., John Wiley & Sons, New York, 1991),pp. 16.13.
1-16.13.7) 。COS 細胞を、10%FCSを補足したDMEM中で
一晩培養し、そして血清を含まないDMEM中でさらに６日
間培養した。血清を含まない上澄液を集め、プロテイン
Ａ−セファロースを含有するカラムで精製した(Replige
n, Cambridge, Massachusetts)。結合タンパクをクエン
酸緩衝液中に溶離させ、PBS 中へ透析した。タンパク濃
度はタンパク検定キット(Biorad, Richmond, Californi
a)によって定量した。
増幅させ、そしてプラスミドDNA をCsClグラジエントで
精製した。そのDNA を、 DEAE-デキストランで COS細胞
へトランスフェクトする前に配列決定して確認した後、
トランジエントトランスフェクションによって COS細胞
内で発現させた(A. Aruffo、"Transient Expressionof
Proteins Using COS Cells"、in Current Protocols in
Molecular Biology(2nd ed., F.M. Ausubel et al., e
ds., John Wiley & Sons, New York, 1991),pp. 16.13.
1-16.13.7) 。COS 細胞を、10%FCSを補足したDMEM中で
一晩培養し、そして血清を含まないDMEM中でさらに６日
間培養した。血清を含まない上澄液を集め、プロテイン
Ａ−セファロースを含有するカラムで精製した(Replige
n, Cambridge, Massachusetts)。結合タンパクをクエン
酸緩衝液中に溶離させ、PBS 中へ透析した。タンパク濃
度はタンパク検定キット(Biorad, Richmond, Californi
a)によって定量した。
【０１１１】実施例２ モノクローナル抗体で処理することによって抑制される
HIV-1感染 CD4+ T 細胞内の HIV-1産生 実施例１のキメラヒト化抗CD2 抗体をはじめとするいく
つかのモノクローナル抗体が HIV-1感染 CD4+ T 細胞内
の HIV-1産生に及ぼす効果を測定するため、各種モノク
ローナル抗体で処理した細胞において HIV-1の p24抗原
の産生を測定した。
HIV-1感染 CD4+ T 細胞内の HIV-1産生 実施例１のキメラヒト化抗CD2 抗体をはじめとするいく
つかのモノクローナル抗体が HIV-1感染 CD4+ T 細胞内
の HIV-1産生に及ぼす効果を測定するため、各種モノク
ローナル抗体で処理した細胞において HIV-1の p24抗原
の産生を測定した。
【０１１２】モノクローナル抗体(mAb) ＡＴＣＣ(Rockville, Maryland) からハイブリドーマ O
KT3(抗CD3)を入手した。その抗体を含む培養上澄液をプ
ロテインＡセファロースクロマトグラフィーで精製し
た。LFA-3(Ts 2/9) 及びICAM-1(84H10) に対する精製済
抗体を、Bristol-Myers Squibb Pharmaceutical Resear
ch Institute (Seattle, Washington)のNitin K. Damle
博士から入手した。精製済の mAb 9.3( 抗CD28) 、35.1
(抗CD2)、G10-1(抗CD8)、60.3 (抗CD18) 、10.2 (抗CD
5)、G3-7 (抗CD7)、FC-1 (抗CD16)、1F5(抗CD20) 、60.
1 (抗CD11b)及びBB1(抗B7) は先に記載したとおりとし
た(A.J. McMichael 編、"Leucocyte Typing III"(Oxfor
d University Press, Oxford, England, 1987); W. Kna
ppら編、"Leucocyte Typing IV"(Oxford UniversityPre
ss, Oxford, England, 1989))。先に記載したように、C
TLA-4 Ig cDNA発現遺伝子でトランスフェクトした CHO
細胞によってアフィニティー精製したCTLA-4免疫グロブ
リン(Ig)を産生させた(P.S. Linsley ら、"CTLA-4 Is a
Second Receptor for the B Cell Activation Antigen
B7", J. Exp. Med. 174: 561-569 (1991)(Linsley et
al. 1991b)) 。精製済ヒトマウスキメラmAb(cL6)は、Br
istol-Myers Squibb (Seattle, Washington)の Hellstr
om博士によって提供された。CD2(mAb 35.1 (精製済))に
対するブロッキング抗体及び CD2カウンターレセプター
LFA-3(mAb Ts 2/9 (腹水))に対するブロッキング抗体
は、精製抗体について10μg/mlで使用したか、或いは完
全培地中の最終腹水希釈率1:250 で使用した。ICAM-1(m
Ab 84H10) に対する精製抗体、ICAM-1カウンターレセプ
ターLFA-1(CD18としても知られている)(mAb 60.3) に対
する精製抗体、CD28カウンターレセプターB7(mAb BB1)
に対する精製抗体、並びに対照用mAb CD7 、G3-7及びヒ
トCD6 もまた10μg/mlで使用した。対応するmAb(Ts 2/9
及びKB61) を含有する腹水液は、プリスタンプライミン
グしたBalb/cマウスで産生させ、そして硫酸アンモニウ
ム沈殿で部分精製した。
KT3(抗CD3)を入手した。その抗体を含む培養上澄液をプ
ロテインＡセファロースクロマトグラフィーで精製し
た。LFA-3(Ts 2/9) 及びICAM-1(84H10) に対する精製済
抗体を、Bristol-Myers Squibb Pharmaceutical Resear
ch Institute (Seattle, Washington)のNitin K. Damle
博士から入手した。精製済の mAb 9.3( 抗CD28) 、35.1
(抗CD2)、G10-1(抗CD8)、60.3 (抗CD18) 、10.2 (抗CD
5)、G3-7 (抗CD7)、FC-1 (抗CD16)、1F5(抗CD20) 、60.
1 (抗CD11b)及びBB1(抗B7) は先に記載したとおりとし
た(A.J. McMichael 編、"Leucocyte Typing III"(Oxfor
d University Press, Oxford, England, 1987); W. Kna
ppら編、"Leucocyte Typing IV"(Oxford UniversityPre
ss, Oxford, England, 1989))。先に記載したように、C
TLA-4 Ig cDNA発現遺伝子でトランスフェクトした CHO
細胞によってアフィニティー精製したCTLA-4免疫グロブ
リン(Ig)を産生させた(P.S. Linsley ら、"CTLA-4 Is a
Second Receptor for the B Cell Activation Antigen
B7", J. Exp. Med. 174: 561-569 (1991)(Linsley et
al. 1991b)) 。精製済ヒトマウスキメラmAb(cL6)は、Br
istol-Myers Squibb (Seattle, Washington)の Hellstr
om博士によって提供された。CD2(mAb 35.1 (精製済))に
対するブロッキング抗体及び CD2カウンターレセプター
LFA-3(mAb Ts 2/9 (腹水))に対するブロッキング抗体
は、精製抗体について10μg/mlで使用したか、或いは完
全培地中の最終腹水希釈率1:250 で使用した。ICAM-1(m
Ab 84H10) に対する精製抗体、ICAM-1カウンターレセプ
ターLFA-1(CD18としても知られている)(mAb 60.3) に対
する精製抗体、CD28カウンターレセプターB7(mAb BB1)
に対する精製抗体、並びに対照用mAb CD7 、G3-7及びヒ
トCD6 もまた10μg/mlで使用した。対応するmAb(Ts 2/9
及びKB61) を含有する腹水液は、プリスタンプライミン
グしたBalb/cマウスで産生させ、そして硫酸アンモニウ
ム沈殿で部分精製した。
【０１１３】血液ドナー HIV-1 感染無症候個体及び非感染個体から同意を得てヘ
パリン処理した血液を得た。
パリン処理した血液を得た。
【０１１４】細胞分離 Ficoll-Hypaque濃度勾配遠心分離によって末梢血液単核
細胞(PBMC)を単離した。特に断らない限り、すべての実
験のPBMCを、抗CD8 mAb G10.1 、B 細胞特異的抗CD20 m
Ab IF5、及びNK細胞特異的抗CD16 mAb FC1を用いて４℃
で30分間処理した後、37℃で45分間補体(C' 、低毒性ベ
ビーラビットC'、Pel-Freez 、Brown Deer、Wisconsin)
で処理することによって、 CD8+ 、B 細胞及びNK細胞か
ら除去した。これらの細胞を洗浄し、そして血清陰性ド
ナーからの 10%熱不活化保存正常ヒト血清と、10mM HEP
ESと、2 mM L- グルタミンと、100 U/mlペニシリンと、
100 μg/mlストレプトマイシンとを補足した完全培地(R
PMI 1640培地、Gibco 、Grand Island、New York) に１
×106 細胞/ml で再懸濁させた。
細胞(PBMC)を単離した。特に断らない限り、すべての実
験のPBMCを、抗CD8 mAb G10.1 、B 細胞特異的抗CD20 m
Ab IF5、及びNK細胞特異的抗CD16 mAb FC1を用いて４℃
で30分間処理した後、37℃で45分間補体(C' 、低毒性ベ
ビーラビットC'、Pel-Freez 、Brown Deer、Wisconsin)
で処理することによって、 CD8+ 、B 細胞及びNK細胞か
ら除去した。これらの細胞を洗浄し、そして血清陰性ド
ナーからの 10%熱不活化保存正常ヒト血清と、10mM HEP
ESと、2 mM L- グルタミンと、100 U/mlペニシリンと、
100 μg/mlストレプトマイシンとを補足した完全培地(R
PMI 1640培地、Gibco 、Grand Island、New York) に１
×106 細胞/ml で再懸濁させた。
【０１１５】HIV-1 感染患者からの CD4+ 細胞のPBMC誘
導 ほとんどの実験で、特に断らない限り、丸底96ウェル細
胞培養プレート(Falcon, Lincoln Park, New Jersey)に
おいて、 0.1 ml 中の１×105 個の細胞を可溶性（１μ
g/ml) の抗CD3 mAb 、OKT3(ATCC)またはG19-4 のいずれ
かによって誘導した(H. Kaneoka ら、"Human T Lymphoc
yte Proliferation Induced by a Pan-TMonoclonal Ant
ibody (Anti-Leu 4): Heterogeneity of Response in a
Function of Monocytes", J. Immunol. 131:158-164
(1983); W.J.M. Taxら、"Polymorphism in Mitogenic E
ffect of IgG1 Monoclonal Antibodies Against T3 Ant
igen on Human T Cells" Nature 304:445-447 (1983))
。最終体積0.25mlに対して活性化時に因子(10 μg/ml
のブロッキングまたはコントロール mAb、10μg/mlのCT
LA-4、30U/mlの +/-精製IL-2(Pharmacia))を添加し、次
いで37℃、5%CO2 において７日間以上インキュベート
し、その上澄液を集めてELISA(Genetic Systems,Seattl
e, Washington) でp24 HIV-1 特異的タンパクをアッセ
イした。
導 ほとんどの実験で、特に断らない限り、丸底96ウェル細
胞培養プレート(Falcon, Lincoln Park, New Jersey)に
おいて、 0.1 ml 中の１×105 個の細胞を可溶性（１μ
g/ml) の抗CD3 mAb 、OKT3(ATCC)またはG19-4 のいずれ
かによって誘導した(H. Kaneoka ら、"Human T Lymphoc
yte Proliferation Induced by a Pan-TMonoclonal Ant
ibody (Anti-Leu 4): Heterogeneity of Response in a
Function of Monocytes", J. Immunol. 131:158-164
(1983); W.J.M. Taxら、"Polymorphism in Mitogenic E
ffect of IgG1 Monoclonal Antibodies Against T3 Ant
igen on Human T Cells" Nature 304:445-447 (1983))
。最終体積0.25mlに対して活性化時に因子(10 μg/ml
のブロッキングまたはコントロール mAb、10μg/mlのCT
LA-4、30U/mlの +/-精製IL-2(Pharmacia))を添加し、次
いで37℃、5%CO2 において７日間以上インキュベート
し、その上澄液を集めてELISA(Genetic Systems,Seattl
e, Washington) でp24 HIV-1 特異的タンパクをアッセ
イした。
【０１１６】超抗原(SAg) 実験では、スタフィロコッカ
スエンテロトキシン(Toxin Technology, Sarasota, Flo
rida) を、最終濃度 1.8μg/mlの全抗原を含むカクテル
として添加した。抗CD3 誘導と同様にPBMCをインキュベ
ートし、そして７日間の培養後その上澄液を集めて p24
抗原捕捉アッセイに供した。
スエンテロトキシン(Toxin Technology, Sarasota, Flo
rida) を、最終濃度 1.8μg/mlの全抗原を含むカクテル
として添加した。抗CD3 誘導と同様にPBMCをインキュベ
ートし、そして７日間の培養後その上澄液を集めて p24
抗原捕捉アッセイに供した。
【０１１７】増殖アッセイ 活性化４日後、各ウェルの４倍化 100μl 細胞アリコー
トを96ウェル丸底プレートに移し、そして 1.0μCi/ ウ
ェルの三重水素化チミジン（[3H]TdR, New England Nuc
lear, Boston, Massachusetts)でラベルした後、37℃、
5%CO2 においてインキュベートした。 6〜16時間後にセ
ルハーベスターで細胞を集め、そして液体シンチレーシ
ョンで計数した。誘導指数S.I.は、誘導（未処理）細胞
の平均[3H]TdR 取込量を、未誘導細胞の平均[3H]TdR 取
込量で割り算して算出した。増殖アッセイ用に細胞を抜
き取ったウェルに完全培地を再供給し、そして37℃、5%
CO 2 で再度インキュベートし、以下のように p24抗原の
最終測定を行った。
トを96ウェル丸底プレートに移し、そして 1.0μCi/ ウ
ェルの三重水素化チミジン（[3H]TdR, New England Nuc
lear, Boston, Massachusetts)でラベルした後、37℃、
5%CO2 においてインキュベートした。 6〜16時間後にセ
ルハーベスターで細胞を集め、そして液体シンチレーシ
ョンで計数した。誘導指数S.I.は、誘導（未処理）細胞
の平均[3H]TdR 取込量を、未誘導細胞の平均[3H]TdR 取
込量で割り算して算出した。増殖アッセイ用に細胞を抜
き取ったウェルに完全培地を再供給し、そして37℃、5%
CO 2 で再度インキュベートし、以下のように p24抗原の
最終測定を行った。
【０１１８】p24 抗原捕捉及び ELISAアッセイ ７日目に、特に断らない限り、４倍化したウェルからの
上澄液をPBMC培養液から抜き取り、そしてELISA(Geneti
c Systems, Seattle, Washington) によって p24抗原を
測定した。各アッセイについて標準曲線を作り、それか
ら未知の上澄液の p24値を計算した。p24 阻害率は、抗
CD3 またはSAg のみで誘導した後に誘発された４〜８個
の複製ウェルの平均全p24 に基づいた。
上澄液をPBMC培養液から抜き取り、そしてELISA(Geneti
c Systems, Seattle, Washington) によって p24抗原を
測定した。各アッセイについて標準曲線を作り、それか
ら未知の上澄液の p24値を計算した。p24 阻害率は、抗
CD3 またはSAg のみで誘導した後に誘発された４〜８個
の複製ウェルの平均全p24 に基づいた。
【０１１９】結果 可溶性抗CD3 による患者のPBMCの誘導によって高濃度の
HIV-1産生(10 μg/mlp24以上) が誘発された。対照的
に、固定化抗CD3 による誘導では、非常に低濃度(10 ng
/ml p24 未満) が誘発された。活性化PBMCの上澄液中の
p24 濃度は、PHA ブラストにおける感染力によって測定
された存在する HIV-1濃度に比例するので、HIV-1 増殖
の有用な指標となる。
HIV-1産生(10 μg/mlp24以上) が誘発された。対照的
に、固定化抗CD3 による誘導では、非常に低濃度(10 ng
/ml p24 未満) が誘発された。活性化PBMCの上澄液中の
p24 濃度は、PHA ブラストにおける感染力によって測定
された存在する HIV-1濃度に比例するので、HIV-1 増殖
の有用な指標となる。
【０１２０】可溶性抗CD3 活性化後の HIV-1産生に関与
する細胞−細胞相互作用分子の役割を調べるため、付着
にとって重要であると知られているいくつかの細胞表面
付着分子に対する mAbの効果を試験した( 単球に見られ
る細胞表面分子のＴ細胞に見られる細胞表面分子への結
合) 。
する細胞−細胞相互作用分子の役割を調べるため、付着
にとって重要であると知られているいくつかの細胞表面
付着分子に対する mAbの効果を試験した( 単球に見られ
る細胞表面分子のＴ細胞に見られる細胞表面分子への結
合) 。
【０１２１】図１及び図２は、LFA-3 もしくはそのカウ
ンターレセプターCD2 へのmAb 、またはCD18(LFA-3のβ
サブユニット) もしくはそのカウンターレセプターICAM
-1へのmAb がPBMCによる HIV-1の産生を顕著に阻害した
ことを示し、HIV-1 産生をもたらすモノサイト/T細胞相
互作用にはこれらのレセプター／カウンターレセプター
対の各々の協同的結合が必要であることを示唆してい
る。
ンターレセプターCD2 へのmAb 、またはCD18(LFA-3のβ
サブユニット) もしくはそのカウンターレセプターICAM
-1へのmAb がPBMCによる HIV-1の産生を顕著に阻害した
ことを示し、HIV-1 産生をもたらすモノサイト/T細胞相
互作用にはこれらのレセプター／カウンターレセプター
対の各々の協同的結合が必要であることを示唆してい
る。
【０１２２】CD2 、LFA-3 またはICAM-1へのmAb は、 H
IV-1の産生を80% から99% 以上阻害した。CD2 、LFA-3
、CD18またはICAM-1へのmAb による HIV-1産生の阻害
は、外因性IL-2が存在してもしなくても起こった。しか
しながら、外因性IL-2が無いと、CD2 、CD18、またはLF
A-3 へのmAb で処理した抗CD3 活性化培養において CD4
+ T 細胞の増殖が著しく減少した(ICAM-1 へのmAb はい
くつかのドナーPBMCにおいてより少ない程度で増殖を阻
害した) 。重要なことは、 CD4+ T 細胞の増殖が外因性
IL-2の存在下で維持されても (図１) 、HIV-1 産生は顕
著に減少したことである。このことが重要である理由
は、AIDSの特徴である条件的感染に対する抵抗性を高め
るためには CD4+ T 細胞の増殖が重要だからである。
IV-1の産生を80% から99% 以上阻害した。CD2 、LFA-3
、CD18またはICAM-1へのmAb による HIV-1産生の阻害
は、外因性IL-2が存在してもしなくても起こった。しか
しながら、外因性IL-2が無いと、CD2 、CD18、またはLF
A-3 へのmAb で処理した抗CD3 活性化培養において CD4
+ T 細胞の増殖が著しく減少した(ICAM-1 へのmAb はい
くつかのドナーPBMCにおいてより少ない程度で増殖を阻
害した) 。重要なことは、 CD4+ T 細胞の増殖が外因性
IL-2の存在下で維持されても (図１) 、HIV-1 産生は顕
著に減少したことである。このことが重要である理由
は、AIDSの特徴である条件的感染に対する抵抗性を高め
るためには CD4+ T 細胞の増殖が重要だからである。
【０１２３】抗CD2(mAb 35.1) は、0.1 μg/ml程度の低
い抗体濃度で HIV-1産生を90% 以上阻害した (図３) 。
mAb 35.1で観測された p24産生の顕著な阻害は、１実験
につき二つのドナーからのPBMCを用いた別々の６回の実
験においても矛盾無く観測された。抗CD3 で誘導した後
24時間以内(24 時間を過ぎない) に抗CD2 を添加するこ
とが、HIV-1 産生の阻害には有効であった。
い抗体濃度で HIV-1産生を90% 以上阻害した (図３) 。
mAb 35.1で観測された p24産生の顕著な阻害は、１実験
につき二つのドナーからのPBMCを用いた別々の６回の実
験においても矛盾無く観測された。抗CD3 で誘導した後
24時間以内(24 時間を過ぎない) に抗CD2 を添加するこ
とが、HIV-1 産生の阻害には有効であった。
【０１２４】これらの結果は、活性化後の早い時点で C
D2/LFA-3相互作用を妨害することの方が、遅い時点 (す
なわち、活性化後24時間以降) でＴ細胞／単球相互作用
をブロックすることよりも、HIV-1 の産生を阻害するに
は重要であることを示唆している。
D2/LFA-3相互作用を妨害することの方が、遅い時点 (す
なわち、活性化後24時間以降) でＴ細胞／単球相互作用
をブロックすることよりも、HIV-1 の産生を阻害するに
は重要であることを示唆している。
【０１２５】CD2 へのmAb 35.1によりCD2/LFA-3 の相互
作用をブロックすることは、別のCD2 mAb 9.6 及び9-1
によっても可能であったが、CD2 mAb のエピトープまた
はアフィニティーの差を反映し、35.1が HIV-1産生の阻
害には最も有効であった。いくつかの血清陽性ドナーか
らのPBMCを抗CD3 で活性化した実験では、抗LFA-3 によ
る HIV-1産生の阻害もまた再現性があった。
作用をブロックすることは、別のCD2 mAb 9.6 及び9-1
によっても可能であったが、CD2 mAb のエピトープまた
はアフィニティーの差を反映し、35.1が HIV-1産生の阻
害には最も有効であった。いくつかの血清陽性ドナーか
らのPBMCを抗CD3 で活性化した実験では、抗LFA-3 によ
る HIV-1産生の阻害もまた再現性があった。
【０１２６】CTLA-4 Ig (CD28 ホモログ) もまた抗CD3
誘導 HIV-1産生を阻害する。CTLA-4とＴ細胞上のCD28と
は、どちらの分子もモノサイト上のB7に結合する点で類
似している (前記Linsley et al., 1991b)。CD28及びTC
R の同時誘導 (すなわち、CD28、CD2 、LFA-1 、等のよ
うな細胞表面分子によるＴ細胞レセプター(TCR) 発信の
増強) は、高濃度のIL-2産生(R.A.W. Van Lier et al.,
"Signals Involved in T Cell Activation: T Cell Pr
oliferation Induced Through the Synergistic Action
of Anti-CD28 and Anti-CD2 Monoclonal Antibodies",
Eur. J. Immunol., 18:167-172 (1988)) 及びIL-2 mRN
A の蓄積 (前記Linsley et al., 1991a)を誘発すること
が示されている。CD28/B7 経路をブロックすることが H
IV-1産生に対して何の効果を及ぼすかを測定するため、
組換えCTLA-4 Ig 融合タンパク (前記Linsley et al.,
1991b)またはCD28(9.3) もしくはB7(BB1) へのmAb を、
外因性IL-2の存在下または非存在下で抗CD3 活性化PBMC
へ添加した。
誘導 HIV-1産生を阻害する。CTLA-4とＴ細胞上のCD28と
は、どちらの分子もモノサイト上のB7に結合する点で類
似している (前記Linsley et al., 1991b)。CD28及びTC
R の同時誘導 (すなわち、CD28、CD2 、LFA-1 、等のよ
うな細胞表面分子によるＴ細胞レセプター(TCR) 発信の
増強) は、高濃度のIL-2産生(R.A.W. Van Lier et al.,
"Signals Involved in T Cell Activation: T Cell Pr
oliferation Induced Through the Synergistic Action
of Anti-CD28 and Anti-CD2 Monoclonal Antibodies",
Eur. J. Immunol., 18:167-172 (1988)) 及びIL-2 mRN
A の蓄積 (前記Linsley et al., 1991a)を誘発すること
が示されている。CD28/B7 経路をブロックすることが H
IV-1産生に対して何の効果を及ぼすかを測定するため、
組換えCTLA-4 Ig 融合タンパク (前記Linsley et al.,
1991b)またはCD28(9.3) もしくはB7(BB1) へのmAb を、
外因性IL-2の存在下または非存在下で抗CD3 活性化PBMC
へ添加した。
【０１２７】表１の結果は、CTLA-4 Ig が HIV-1産生を
70%以上阻害したことを示している。mAb BB1 及び9.3
、抗B7並びに抗CD28は、それぞれ HIV-1産生を阻害し
なかった。CTLA-4 Ig は、mAb BB1 よりも高いアフィニ
ティーでB7に結合し( 前記Linsley et al., 1991b)、ま
たB7/CD28 結合のインヒビターとしてのポテンシャルが
高い。
70%以上阻害したことを示している。mAb BB1 及び9.3
、抗B7並びに抗CD28は、それぞれ HIV-1産生を阻害し
なかった。CTLA-4 Ig は、mAb BB1 よりも高いアフィニ
ティーでB7に結合し( 前記Linsley et al., 1991b)、ま
たB7/CD28 結合のインヒビターとしてのポテンシャルが
高い。
【０１２８】抗CD28は HIV-1産生に対して余分な効果を
も及ぼすが、この理由は、このmAbがB7/CD28 相互作用
の代わりとなり、またＴ細胞上のCD28レセプターを部分
的に誘導することができるからである。このことは、外
因性IL-2を添加しない抗CD28存在下で抗CD3 を用いた場
合に見られるＴ細胞増殖レベルがはるかに高いことによ
って示唆されている (表１) 。しかしながら、IL-2を抗
CD3 活性化PBMCへ添加した場合には、CTLA-4 Ig による
HIV-1阻害は40% 未満であった。CTLA-4 Ig は、外因性
IL-2の産生を阻害することが示された。それゆえ、HIV-
1 産生のCTLA-4阻害は、外因性IL-2の産生量が減少した
ことに部分的に関係し、 CD4+ T 細胞の増殖の低下と、
多分に HIV-1の産生及び／又は拡散の減少とをもたら
す。
も及ぼすが、この理由は、このmAbがB7/CD28 相互作用
の代わりとなり、またＴ細胞上のCD28レセプターを部分
的に誘導することができるからである。このことは、外
因性IL-2を添加しない抗CD28存在下で抗CD3 を用いた場
合に見られるＴ細胞増殖レベルがはるかに高いことによ
って示唆されている (表１) 。しかしながら、IL-2を抗
CD3 活性化PBMCへ添加した場合には、CTLA-4 Ig による
HIV-1阻害は40% 未満であった。CTLA-4 Ig は、外因性
IL-2の産生を阻害することが示された。それゆえ、HIV-
1 産生のCTLA-4阻害は、外因性IL-2の産生量が減少した
ことに部分的に関係し、 CD4+ T 細胞の増殖の低下と、
多分に HIV-1の産生及び／又は拡散の減少とをもたら
す。
【０１２９】
【表１】
【０１３０】可溶性抗−ＣＤ３（ＯＫＴ３）により刺激
され、そして次に３０Ｕ／mlの外因性ＩＬ−２添加の存
在又は不在下で培養されたＰＢＭＣ．Ｌ６（ｃＬ６）又
はＢ７（ＢＢ１）又はＣＤ２８（９．３）に対するＭＡ
ｂ又は融合タンパク質ＣＴＬＡ−４ Ｉｇを、抗−ＣＤ
３活性化の時点で１０μｇ／mlの最終濃度で添加した。
ｐ２４阻害率は、７個の反復試験ウェルからのＯＫＴ３
誘発性ＨＩＶ−１の平均に基づかれた。Ｓ．Ｉ．＝〔 3
Ｈ〕Ｔｄｒの導入からの刺激指数（刺激されたｃｐｍの
平均／刺激されていないｃｐｍの平均）。
され、そして次に３０Ｕ／mlの外因性ＩＬ−２添加の存
在又は不在下で培養されたＰＢＭＣ．Ｌ６（ｃＬ６）又
はＢ７（ＢＢ１）又はＣＤ２８（９．３）に対するＭＡ
ｂ又は融合タンパク質ＣＴＬＡ−４ Ｉｇを、抗−ＣＤ
３活性化の時点で１０μｇ／mlの最終濃度で添加した。
ｐ２４阻害率は、７個の反復試験ウェルからのＯＫＴ３
誘発性ＨＩＶ−１の平均に基づかれた。Ｓ．Ｉ．＝〔 3
Ｈ〕Ｔｄｒの導入からの刺激指数（刺激されたｃｐｍの
平均／刺激されていないｃｐｍの平均）。
【０１３１】付着分子に対するｍＡｂによるＨＩＶ−１
生成の阻害は、Ｆｃレセプターと抗−ＣＤ３との競争に
はよらなかった。付着分子に対するｍＡｂのウィルス阻
害効果が活性化α−ＣＤ３ ｍＡｂとの単球Ｆｃレセプ
ターのための競争にはならなかったことを確かめるため
に、それぞれＣＤ１８／ＬＦＡ−１（６０．３）及びＣ
Ｄ２（９．６）に対するＦ（ａｂ′）2 又はＦａｂ抗体
が抗−ＣＤ３活性化ＰＢＭＣに添加された。
生成の阻害は、Ｆｃレセプターと抗−ＣＤ３との競争に
はよらなかった。付着分子に対するｍＡｂのウィルス阻
害効果が活性化α−ＣＤ３ ｍＡｂとの単球Ｆｃレセプ
ターのための競争にはならなかったことを確かめるため
に、それぞれＣＤ１８／ＬＦＡ−１（６０．３）及びＣ
Ｄ２（９．６）に対するＦ（ａｂ′）2 又はＦａｂ抗体
が抗−ＣＤ３活性化ＰＢＭＣに添加された。
【０１３２】表２は、ＨＩＶ−１生成の８０％以上の阻
害率がそれらの班−Ｆｃ−結合ｍＡｂによりもたらされ
たことを示す。それらの結果は、付着分子に対するｍＡ
ｂにより介在されたＨＩＶ−１生成の阻害は、ＨＩＶ−
１の効果的生成のために必要な細胞−細胞相互作用の中
断によることを示す。従って、ＨＩＶ−１生成の阻害
は、活性剤、α−ＣＤ３とのＦｃレセプターの競争によ
らなかった。
害率がそれらの班−Ｆｃ−結合ｍＡｂによりもたらされ
たことを示す。それらの結果は、付着分子に対するｍＡ
ｂにより介在されたＨＩＶ−１生成の阻害は、ＨＩＶ−
１の効果的生成のために必要な細胞−細胞相互作用の中
断によることを示す。従って、ＨＩＶ−１生成の阻害
は、活性剤、α−ＣＤ３とのＦｃレセプターの競争によ
らなかった。
【０１３３】
【表２】
【０１３４】Ｆａｂ α−ＣＤ２（９．６）又はＦａ
ｂ′２ α−ＣＤ１８（６０．３）ｍＡｂ（１０μｇ／
ml）及びＩＬ−２（３０Ｕ／ml）が、刺激の時点でＰＢ
ＭＣに添加された。ＰＢＭＣは、活性化後、１１日目で
のｐ２４測定のためにＣＤ２又はＣＤ１８に対するｍＡ
ｂの存在又は不在下で可溶性抗−ＣＤ３（Ｇ１９−４、
１μｇ／ml）により刺激された。Ｚ３１及びＺ３５は非
徴候性ＨＩＶ−１血清陽性患者からのＣＤ８+ 、Ｂ細胞
及びＮＫ細胞を消耗されたＰＢＭＣを示す。Ｓ．Ｉ．＝
〔 3Ｈ〕Ｔｄｒの導入からの刺激指数（刺激されたｃｐ
ｍの平均／刺激されていないｃｐｍの平均）。
ｂ′２ α−ＣＤ１８（６０．３）ｍＡｂ（１０μｇ／
ml）及びＩＬ−２（３０Ｕ／ml）が、刺激の時点でＰＢ
ＭＣに添加された。ＰＢＭＣは、活性化後、１１日目で
のｐ２４測定のためにＣＤ２又はＣＤ１８に対するｍＡ
ｂの存在又は不在下で可溶性抗−ＣＤ３（Ｇ１９−４、
１μｇ／ml）により刺激された。Ｚ３１及びＺ３５は非
徴候性ＨＩＶ−１血清陽性患者からのＣＤ８+ 、Ｂ細胞
及びＮＫ細胞を消耗されたＰＢＭＣを示す。Ｓ．Ｉ．＝
〔 3Ｈ〕Ｔｄｒの導入からの刺激指数（刺激されたｃｐ
ｍの平均／刺激されていないｃｐｍの平均）。
【０１３５】付着分子に対するｍＡｂはまた、スタフィ
ロコーカス腸毒素（ＳＡｇ）により誘発されたＨＩＶ−
１生成を阻害した。可溶性α−ＣＤ３とは異なって、Ｓ
Ａｇは単球主要組織適合性クラスII（ＭＨＣ II）抗原
提供を必要とするが、しかしほとんどのＳＡｇは抗原プ
ロセッシングを必要としない。表３は、抗−ＣＤ３活性
化によるＨＩＶ−１生成のために重要である、Ｂ７／Ｃ
Ｄ２８を除く付着分子のすべてはまた、ＳＡｇによる活
性化に続いて、ＨＩＶ−１生成のためにも重要であるこ
とを示す。しかしながら、可溶性ＣＴＬＡ−４Ｉｇは、
外因性ＩＬ−２の不在下でさえ、ＳＡｇにより誘発され
たＨＩＶ−１生成を阻害しなかった。ＳＡｇ刺激された
ＰＢＭＣにおけるＣＴＬＡ−４ Ｉｇによる阻害の欠乏
はたぶん、内因性ＩＬ−２の生成によるものであった。
ピコモル濃度のＳＡｇは、種々のＴ細胞増殖を誘発し、
そして多量のＩＬ−２，γ−ＩＦＮ及びＴＮＦの開放を
報告し（C.D.Tsoukas など., "Activation of RestingT
Lymphocytes by Anti-CD3 (T3) Antibodies in the Ab
sence of Monocytes",J.Immunol. 135: 1719〜1723 (19
85); H.Fischerなど., "Production of TNF-αand TNF-
β by Staphylococcal Enterotcxin A Activated Huma
n T Cell", J.Immunol. 144: 4663〜4669 (1990))、そ
して従って、ＣＴＬＡ−４ Ｉｇの可能な阻害効果は、
ＳＡｇ刺激に続いて生成される内因性ＩＬ−２により克
服された。
ロコーカス腸毒素（ＳＡｇ）により誘発されたＨＩＶ−
１生成を阻害した。可溶性α−ＣＤ３とは異なって、Ｓ
Ａｇは単球主要組織適合性クラスII（ＭＨＣ II）抗原
提供を必要とするが、しかしほとんどのＳＡｇは抗原プ
ロセッシングを必要としない。表３は、抗−ＣＤ３活性
化によるＨＩＶ−１生成のために重要である、Ｂ７／Ｃ
Ｄ２８を除く付着分子のすべてはまた、ＳＡｇによる活
性化に続いて、ＨＩＶ−１生成のためにも重要であるこ
とを示す。しかしながら、可溶性ＣＴＬＡ−４Ｉｇは、
外因性ＩＬ−２の不在下でさえ、ＳＡｇにより誘発され
たＨＩＶ−１生成を阻害しなかった。ＳＡｇ刺激された
ＰＢＭＣにおけるＣＴＬＡ−４ Ｉｇによる阻害の欠乏
はたぶん、内因性ＩＬ−２の生成によるものであった。
ピコモル濃度のＳＡｇは、種々のＴ細胞増殖を誘発し、
そして多量のＩＬ−２，γ−ＩＦＮ及びＴＮＦの開放を
報告し（C.D.Tsoukas など., "Activation of RestingT
Lymphocytes by Anti-CD3 (T3) Antibodies in the Ab
sence of Monocytes",J.Immunol. 135: 1719〜1723 (19
85); H.Fischerなど., "Production of TNF-αand TNF-
β by Staphylococcal Enterotcxin A Activated Huma
n T Cell", J.Immunol. 144: 4663〜4669 (1990))、そ
して従って、ＣＴＬＡ−４ Ｉｇの可能な阻害効果は、
ＳＡｇ刺激に続いて生成される内因性ＩＬ−２により克
服された。
【０１３６】例１のキメラ性ヒト一本鎖モノクローナル
抗体ＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇは、ＣＤ４+ ＨＩＶ−１感染
化Ｔ細胞におけるＨＩＶ−１増殖のブロッキングにおい
て効果的であった。０．１μｇ／mlほどの低い濃度のＣ
Ｄ２ ＳＦｖ−Ｉｇは、抗−ＣＤ３により誘発されたＨ
ＩＶ−１生成を５０％以上阻害した（図３）。ＣＤ２Ｓ
Ｆｖ−Ｉｇは、ｍＡｂ ３５．１ほど、ＣＤ４+ Ｔ細胞
増殖を阻害しなかった。ＳＡｇ−誘発性ＨＩＶ−１生成
に対するＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇの効果を試験する実験に
おいては、ＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇは、内因性ＩＬ−２が
添加されても又はされなくても、Ｔ−細胞増殖の阻害を
伴わないで、０．１〜１０μｇ／mlで、ＰＢＭＣからの
ＳＡｇ−誘発性ＨＩＶ−１生成を５０〜９６％阻害し
た。
抗体ＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇは、ＣＤ４+ ＨＩＶ−１感染
化Ｔ細胞におけるＨＩＶ−１増殖のブロッキングにおい
て効果的であった。０．１μｇ／mlほどの低い濃度のＣ
Ｄ２ ＳＦｖ−Ｉｇは、抗−ＣＤ３により誘発されたＨ
ＩＶ−１生成を５０％以上阻害した（図３）。ＣＤ２Ｓ
Ｆｖ−Ｉｇは、ｍＡｂ ３５．１ほど、ＣＤ４+ Ｔ細胞
増殖を阻害しなかった。ＳＡｇ−誘発性ＨＩＶ−１生成
に対するＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇの効果を試験する実験に
おいては、ＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇは、内因性ＩＬ−２が
添加されても又はされなくても、Ｔ−細胞増殖の阻害を
伴わないで、０．１〜１０μｇ／mlで、ＰＢＭＣからの
ＳＡｇ−誘発性ＨＩＶ−１生成を５０〜９６％阻害し
た。
【０１３７】ＣＤ６，ＣＤ５，ＣＤ１４，ＣＤ１１Ｃ
（ｐ１８０，９５）及びＣＤ４４に対するＭＡｂは、Ｈ
ＩＶ−１生成を阻害しなかった。また、ＣＤ２８，Ｂ
７，ＣＤ１１ｂ（ＭＡＣ−１）又はＣＤ７に対するｍＡ
ｂは、ＨＩＶ−１生成に対して一定した阻害効果を有さ
なかった（図１、及び表１及び３）。
（ｐ１８０，９５）及びＣＤ４４に対するＭＡｂは、Ｈ
ＩＶ−１生成を阻害しなかった。また、ＣＤ２８，Ｂ
７，ＣＤ１１ｂ（ＭＡＣ−１）又はＣＤ７に対するｍＡ
ｂは、ＨＩＶ−１生成に対して一定した阻害効果を有さ
なかった（図１、及び表１及び３）。
【０１３８】
【表３】
【０１３９】パートａ）ＣＤ８+ 消耗されたＰＢＭＣ、
Ｂ細胞及びＮＫ細胞が、ＳＡｇのカクテルにより活性化
された（ＳＥＥ，ＳＥＣ２、及び剥脱性毒素、それぞれ
０．６μｇ／ml）。ＬＦＡ−３（Ｔｓ ２／９）又はＣ
Ｄ２（３５．１）又はＩＣＡＭ−１（８４Ｈ１０）、又
はＣＤ１８（６０．３）又はＣＤ１８／ＣＤ１１ｂ（６
０．１）に対するＭＡｂは、ＰＢＭＣ ＳＡｇ活性化に
基づいて１０μｇ／mlの最終濃度で３０Ｕ／mlのＩＬ−
２と共に添加された。
Ｂ細胞及びＮＫ細胞が、ＳＡｇのカクテルにより活性化
された（ＳＥＥ，ＳＥＣ２、及び剥脱性毒素、それぞれ
０．６μｇ／ml）。ＬＦＡ−３（Ｔｓ ２／９）又はＣ
Ｄ２（３５．１）又はＩＣＡＭ−１（８４Ｈ１０）、又
はＣＤ１８（６０．３）又はＣＤ１８／ＣＤ１１ｂ（６
０．１）に対するＭＡｂは、ＰＢＭＣ ＳＡｇ活性化に
基づいて１０μｇ／mlの最終濃度で３０Ｕ／mlのＩＬ−
２と共に添加された。
【０１４０】パートｂ）別々の実験において、ＰＢＭＣ
が外因性ＩＬ−２の添加を伴わないで、パートａ）にお
けるのと同じＳＡｇカクテルにより活性化された。ＣＴ
ＬＡ−４ Ｉｇタンパク質又はヒトｃＬ６ ｍＡｂ、対
照が、活性化の時点でＰＢＭＣに添加され（１０μｇ／
ml）、そして上清液が７日後にアッセイされた。Ｓ．
Ｉ．＝〔 3Ｈ〕Ｔｄｒの導入からの刺激指数（刺激され
たｃｐｍの平均／刺激されなかったｃｐｍの平均）。
が外因性ＩＬ−２の添加を伴わないで、パートａ）にお
けるのと同じＳＡｇカクテルにより活性化された。ＣＴ
ＬＡ−４ Ｉｇタンパク質又はヒトｃＬ６ ｍＡｂ、対
照が、活性化の時点でＰＢＭＣに添加され（１０μｇ／
ml）、そして上清液が７日後にアッセイされた。Ｓ．
Ｉ．＝〔 3Ｈ〕Ｔｄｒの導入からの刺激指数（刺激され
たｃｐｍの平均／刺激されなかったｃｐｍの平均）。
【０１４１】それらの結果は、ＨＩＶ−１感染された患
者の治療が、ＨＩＶ−１生成のために重要であることが
示されたＴ細胞−単球相互作用に目標を決定され得るこ
とを示唆する。キメラ性ヒト抗−ＣＤ２抗体、ＣＤ２
ＳＦｖ−Ｉｇは、この治療のために有用である。実施例３ ＣＤ２抗原に結合するためのキメラ性ネズミ抗−ＣＤ２
モノクローナル抗体とのＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇの競争 ＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇキメラ性ヒト抗体がそれが由来す
るネズミモノクローナル抗体３５．１と同じエピトープ
に結合することを確かめるために、ｍＡｂ ３５．１及
びＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇの両者がＦＡＣＳにより測定さ
れるように、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞上のＣＤ２に結合す
るためにラベルされたｍＡｂ ３５．１と競争する競争
試験を行なった。
者の治療が、ＨＩＶ−１生成のために重要であることが
示されたＴ細胞−単球相互作用に目標を決定され得るこ
とを示唆する。キメラ性ヒト抗−ＣＤ２抗体、ＣＤ２
ＳＦｖ−Ｉｇは、この治療のために有用である。実施例３ ＣＤ２抗原に結合するためのキメラ性ネズミ抗−ＣＤ２
モノクローナル抗体とのＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇの競争 ＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇキメラ性ヒト抗体がそれが由来す
るネズミモノクローナル抗体３５．１と同じエピトープ
に結合することを確かめるために、ｍＡｂ ３５．１及
びＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇの両者がＦＡＣＳにより測定さ
れるように、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞上のＣＤ２に結合す
るためにラベルされたｍＡｂ ３５．１と競争する競争
試験を行なった。
【０１４２】Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞（１０6 ）を、合計
体積０．２mlで染色培地（ＲＰＭＩ１６４０培地＋５％
ウシ胎児血清＋０．１％アジ化ナトリウム）において氷
上で９０％間、ラベルされていない抗−ＣＤ２（３５．
１）、ＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇ又はＣＤ５−Ｉｇ対照の１
０倍希釈溶液と共にインキュベトし、その後、染色培地
において１：３０００の希釈度でフルオレセインイソチ
オシアネート（ＦＩＴＣ）ラベルされた３５．１ｍＡｂ
（抗−ＣＤ２）を添加した。細胞を洗浄し、そしてＦＡ
ＣＳにより分析した。
体積０．２mlで染色培地（ＲＰＭＩ１６４０培地＋５％
ウシ胎児血清＋０．１％アジ化ナトリウム）において氷
上で９０％間、ラベルされていない抗−ＣＤ２（３５．
１）、ＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇ又はＣＤ５−Ｉｇ対照の１
０倍希釈溶液と共にインキュベトし、その後、染色培地
において１：３０００の希釈度でフルオレセインイソチ
オシアネート（ＦＩＴＣ）ラベルされた３５．１ｍＡｂ
（抗−ＣＤ２）を添加した。細胞を洗浄し、そしてＦＡ
ＣＳにより分析した。
【０１４３】結果は図４に示される。ＣＤ２ ＳＦｖ−
Ｉｇは、ＣＤ２抗原への結合のためにＭＡｂ ３５．１
と効果的に競争し、それが同じエピトープに結合したこ
とを示す。本発明の利点 本発明は、感染されたＴ細胞においてのＨＩＶ−１ウィ
ルスの増殖を阻害できる、ＣＤ抗原、ＣＤ２ ＳＦｖ−
Ｉｇに対するキメラ性ヒトモノクローナル抗体を提供す
る。そのモノクローナル抗体は、最少の免疫応答を誘発
し、そして天然のネズミモノクローナル抗体よりも耐性
がある。本発明はまた、インビボ又はエキソビボのいづ
れかで、ＡＩＤＳを処理し又は緩和する方法としてＨＩ
Ｖ−１の増殖を阻害するために、本発明のキメラ性ヒト
モノクローナル抗体を包含するモノクローナル抗体の使
用方法も提供する。この方法は、ＨＩＶ−１複製を抑制
しながら、Ｔ−細胞機能を保持する。それは、頻繁にＡ
ＩＤＳに伴う感染の処置に特に有用であり、そしてその
ような感染のための治療と一緒に使用され得る。
Ｉｇは、ＣＤ２抗原への結合のためにＭＡｂ ３５．１
と効果的に競争し、それが同じエピトープに結合したこ
とを示す。本発明の利点 本発明は、感染されたＴ細胞においてのＨＩＶ−１ウィ
ルスの増殖を阻害できる、ＣＤ抗原、ＣＤ２ ＳＦｖ−
Ｉｇに対するキメラ性ヒトモノクローナル抗体を提供す
る。そのモノクローナル抗体は、最少の免疫応答を誘発
し、そして天然のネズミモノクローナル抗体よりも耐性
がある。本発明はまた、インビボ又はエキソビボのいづ
れかで、ＡＩＤＳを処理し又は緩和する方法としてＨＩ
Ｖ−１の増殖を阻害するために、本発明のキメラ性ヒト
モノクローナル抗体を包含するモノクローナル抗体の使
用方法も提供する。この方法は、ＨＩＶ−１複製を抑制
しながら、Ｔ−細胞機能を保持する。それは、頻繁にＡ
ＩＤＳに伴う感染の処置に特に有用であり、そしてその
ような感染のための治療と一緒に使用され得る。
【０１４４】本発明は一定の好ましい態様に関して相当
に詳細に記載されて来たが、他の態様も可能である。従
って、本発明の特許請求の範囲は、本明細書に包含され
る好ましい態様の記載に制限されるべきではない。
に詳細に記載されて来たが、他の態様も可能である。従
って、本発明の特許請求の範囲は、本明細書に包含され
る好ましい態様の記載に制限されるべきではない。
【０１４５】
【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：１６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド ハイポセティカル：ＮＯ フラグメントの種類：中間部 起源：合成リンカー配列 配列 Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Glu Leu Ala Phe Arg Ser Leu Asp 1 5 10 15
【図１】外因性インターロイキン−２の存在下での、Ｈ
ＩＶ−１感染リンパ球中のＨＩＶ−１抗原２４の生産に
及ぼす、ＬＦＡ−３，ＣＤ１８，ＣＤ１１ｂ，ＣＤ７，
ＣＤ２及びＩＣＡＭ−１に対するモノクローナル抗体に
よる処置の効果を示すグラフ。
ＩＶ−１感染リンパ球中のＨＩＶ−１抗原２４の生産に
及ぼす、ＬＦＡ−３，ＣＤ１８，ＣＤ１１ｂ，ＣＤ７，
ＣＤ２及びＩＣＡＭ−１に対するモノクローナル抗体に
よる処置の効果を示すグラフ。
【図２】インターロイキン−２の非存在下での、図１に
用いたのと同じモノクローナル抗体による処置の効果を
示すグラフ。
用いたのと同じモノクローナル抗体による処置の効果を
示すグラフ。
【図３】ＨＩＶ−１ ｐ２４抗原の生産の阻害に対して
プロットした、キメラヒト化モノクローナル抗体ＣＤ２
ＳＦｖ−Ｉｇ、ネズミ抗ＣＤ２モノクローナル抗体、
及びコントロールとしてのＣＤ５−Ｉｇ融合タンパク質
抗体による感染細胞の処置についての用量−応答曲線を
示すグラフ。
プロットした、キメラヒト化モノクローナル抗体ＣＤ２
ＳＦｖ−Ｉｇ、ネズミ抗ＣＤ２モノクローナル抗体、
及びコントロールとしてのＣＤ５−Ｉｇ融合タンパク質
抗体による感染細胞の処置についての用量−応答曲線を
示すグラフ。
【図４】蛍光活性化細胞選別による、キメラモノクロー
ナル抗体ＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇがネズミ抗−ＣＤ２モノ
クローナル抗体３５．１と、ジャーカットＴ細胞上のＣ
Ｄ２抗原への結合に関して有効に競合することを示すグ
ラフ。
ナル抗体ＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇがネズミ抗−ＣＤ２モノ
クローナル抗体３５．１と、ジャーカットＴ細胞上のＣ
Ｄ２抗原への結合に関して有効に競合することを示すグ
ラフ。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ピーター エス．リンスレイ アメリカ合衆国，ワシントン 98119，シ アトル，ナインス ウエスト 2430 (72)発明者 リサ ケー．ジリランド アメリカ合衆国，ワシントン 98115，シ アトル，ノースイースト エイティエイト ス ストリート 3007 (72)発明者 ジョイス エム．ザーリング アメリカ合衆国，ワシントン 98102，シ アトル，フェアビュー アベニュ イース ト 2301，＃101 (72)発明者 パトリシア エー．モーラン アメリカ合衆国，ワシントン 98126，シ アトル，サウスウエスト アイダ ストリ ート 3555 (72)発明者 ジェフェリー エー．リドベター アメリカ合衆国，ワシントン 98119，シ アトル，ノースウエスト ワンハンドレッ トサーティーンス プレイス 306
Claims (48)
- 【請求項１】 ＣＤ２抗原に対して特異的な結合親和性
を有するモノクローナル抗体であって： （ａ）組換エッシェリヒア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ Ｃｏｌｉ）培養物ＡＴＣＣ No. ６９２７７の中
でクローンされた構築体の発現により生産されたキメラ
モノクローナル抗体ＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇ； （ｂ）ＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇと同一の相補性決定領域を
有するモノクローナル抗体；及び （ｃ）モラーベースでＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇの少なくと
も約８０％の効率で、ＣＤ２抗原に対する結合に関して
ＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇと競合するモノクローナル抗体；
より成る群から選ばれるモノクローナル抗体。 - 【請求項２】 前記モノクローナル抗体がモラーベース
でＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇの少なくとも９０％の効率で、
ＣＤ２抗原に対する結合に関してＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇ
と競合する、請求項１に記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項３】 Ｈ鎖起源の相補性決定領域がＣＤ２ Ｓ
Ｆｖ−Ｉｇのそれらの配列と同一である、請求項１に記
載のモノクローナル抗体。 - 【請求項４】 Ｌ鎖起源の相補性決定領域がＣＤ２ Ｓ
Ｆｖ−Ｉｇのそれらの配列と同一である、請求項１に記
載のモノクローナル抗体。 - 【請求項５】 前記抗体がキメラモノクローナル抗体Ｃ
Ｄ２ ＳＦｖ−Ｉｇである、請求項１に記載のモノクロ
ーナル抗体。 - 【請求項６】 検出可能マーカーでラベルされた請求項
１に記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項７】 前記検出可能マーカーが酵素、常磁性材
料、アジビン−ビオチン特異的結合ペアーのメンバー、
蛍光団、発色団、化学発光団、重金属及びラジオアイソ
トープより成る群から選ばれる、請求項６に記載のモノ
クローナル抗体。 - 【請求項８】 治療剤にコンジュゲートされている請求
項１に記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項９】 前記治療剤が抗腫瘍薬、リンホカイン及
び毒素より成る群から選ばれる、請求項８に記載のモノ
クローナル抗体。 - 【請求項１０】 前記治療剤がリンホカインであり、そ
してこのリンホカインがインターロイキン、インターフ
ェロン及び腫瘍壊死因子より成る群から選ばれる、請求
項９に記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項１１】 前記治療剤がインターロイキン−２で
ある、請求項１０に記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項１２】 前記治療剤がリシン、シュードモナス
エキソトキシン及びジフテリア毒素より選ばれる毒素
である、請求項９に記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項１３】 （ａ）ＨＩＶ−１で感染した患者にお
ける感染Ｔ細胞中でのＨＩＶ−ウィルスの生産を阻害す
るのに十分な量の請求項１に記載のモノクローナル抗
体；及び （ｂ）薬理学的に許容されている担体；を含んで成る薬
理組成物。 - 【請求項１４】 前記モノクローナル抗体がＣＤ２ Ｓ
Ｆｖ−Ｉｇである、請求項１３に記載の薬理組成物。 - 【請求項１５】 Ｉｇ由来アミノ酸配列の少なくとも一
部の欠失により請求項１の抗体から改質された抗体。 - 【請求項１６】 全Ｉｇ由来アミノ酸配列が欠失してい
る、請求項１５に記載の抗体。 - 【請求項１７】 Ｉｇ由来アミノ酸配列の少なくとも一
部の欠失により請求項５の抗体から改質された抗体。 - 【請求項１８】 全Ｉｇ由来アミノ酸配列が欠失してい
る、請求項１７に記載の抗体。 - 【請求項１９】 哺乳動物細胞の中でＣＤ２ ＳＦｖ−
Ｉｇキメラヒト化モノクローナル抗体を発現せしめるこ
との可能な構築体により安定的に形質転換され、且つア
メリカン タイプ カルチャー コミッションにＡＴＣ
Ｃ No. ６９２７７で寄託されている組換エッシェリヒ
ア コリ細胞。 - 【請求項２０】 哺乳動物細胞の中でＣＤ２ ＳＦｖ−
Ｉｇキメラヒト化モノクローナル抗体を発現せしめるこ
とが可能であり、且つネズミ相補性決定領域及びヒト定
常領域を含む、ＤＮＡ構築体。 - 【請求項２１】 ＨＩＶ−１−感染化Ｔ細胞の中でのＨ
ＩＶ−１の生産を阻害する方法であって： （ａ）ＨＩＶ−１で感染したＴ細胞を選別し；そして （ｂ）この感染Ｔ細胞を、ＣＤ４+ Ｔリンパ球と単球と
の間での細胞表層相互作用を崩壊することの可能なモノ
クローナル抗体と接触させて感染Ｔ細胞の中でのＨＩＶ
の生産を阻害すること、 の段階を含んで成り、ここでこの細胞は、接触せしめた
Ｔ細胞中でのＨＩＶ−１の生産を阻害するのに十分な量
のこの抗体と接触させることを特徴とする方法。 - 【請求項２２】 ＨＩＶ感染Ｔ細胞の中でのＨＩＶ−１
の生産を阻害する方法であって： （ａ）ＨＩＶ−１で感染したＴ細胞を選別し；そして （ｂ）この感染Ｔ細胞を、Ｔ細胞の中でのＨＩＶ−１の
生産を阻害せしめるのに十分な量の下記の抗体又はリガ
ンド、 （ｉ）請求項１のモノクローナル抗体、ＣＤ２に対する
モノクローナル抗体、ＣＤ１８に対するモノクローナル
抗体、カウンターレセプターＬＦＡ−３に対するモノク
ローナル抗体、及びカウンターレセプターＩＣＡＭ−１
に対するモノクローナル抗体より成る群から選ばれる抗
体、 （ii）可溶状の、ＬＦＡ−３の細胞外ドメインを含んで
成るＬＦＡ−３リガンド、の少なくとも一方と接触せし
めること、 の段階を含んで成る方法。 - 【請求項２３】 前記抗体がＣＤ２に特異的であり、そ
してＣＤ２抗原のそのカウンターレセプターＬＦＡ−３
との結合を阻止する、請求項２２に記載の方法。 - 【請求項２４】 前記抗体がＣＤ２抗原に対する特異的
な結合親和性を有するモノクローナル抗体であり、この
モノクローナル抗体が： （ｉ）キメラモノクローナル抗体ＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉ
ｇ； （ii）ＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇのそれと同一の相補性決定
領域を有し、且つ少なくとも５個のヒト起源アミノ酸の
少なくとも一配列セグメントを有するモノクローナル抗
体；及び （iii ）モラーベースでＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇの少なく
とも約８０％の効率でＣＤ２抗原に対する結合に関して
ＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇと競合し、且つ少なくとも５個の
ヒト起源アミノ酸の少なくとも一配列セグメントを有す
るモノクローナル抗体；より成る群から選ばれる、請求
項２３に記載の方法。 - 【請求項２５】 前記抗体がキメラモノクローナル抗体
ＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇである、請求項２４に記載の方
法。 - 【請求項２６】 前記抗体が治療剤にコンジュゲートさ
れている、請求項２２に記載の方法。 - 【請求項２７】 前記治療剤が抗腫瘍薬、リンホカイン
及び毒素より成る群から選ばれる、請求項２６に記載の
方法。 - 【請求項２８】 ＨＩＶ−１で感染した対象体を処置す
るための方法であって： （ａ）この対象体からＨＩＶ−１で感染されたＴ細胞を
単離する； （ｂ）この感染されたＴ細胞の中でのＨＩＶ−１の生産
を阻害するために、この感染されたＴ細胞をＣＤ４+ Ｔ
リンパ球と単球との間での細胞表層相互作用を崩壊せし
めることの可能なモノクローナル抗体と接触させる（こ
の細胞は、接触せしめたＴ細胞の中でのＨＩＶ−１の生
産を阻害せしめるのに十分な量のこの抗体と接触させ
る）；次いで （ｃ）この接触せしめたＴ細胞を、対象体の中での機能
的な非ＨＩＶ−１−生産性Ｔ細胞の比率を増やすため、
それ故この対象体を処置するために、その対象体に再導
入する；段階を含んで成る方法。 - 【請求項２９】 ＨＩＶ−１で感染された対象体を処置
する方法であって： （ａ）この対象体からＨＩＶ−１で感染されたＴ細胞を
単離する； （ｂ）このＴ細胞を、その中でのＨＩＶ−１の生産を阻
害するのに十分な量の、請求項１のモノクローナル抗
体、ＣＤ２に対するモノクローナル抗体、ＣＤ１８に対
するモノクローナル抗体及びカウンターレセプターＩＣ
ＡＭ−１に対するモノクローナル抗体より成る群から選
ばれる抗体と接触させる；次いで （ｃ）対象体中の機能性非ＨＩＶ−１−生産性Ｔ細胞の
比率を高めるためにこの対象体の中にこの接触させたＴ
細胞を再導入して、この対象体を処置すること；の段階
を含んで成る方法。 - 【請求項３０】 更に： （ｄ）この対象体への再導入のためにこの接触させたＴ
細胞をインビトロで活性化する段階；を含んで成る、請
求項２９に記載の方法。 - 【請求項３１】 接触させたＴ細胞の患者への再導入が
ＨＩＶ−１感染症に関連する合併症を抑制する、請求項
２９に記載の方法。 - 【請求項３２】 前記抗体がＣＤ２に対して特異的であ
り、そしてＣＤ２抗原のそのカウンターレセプターＬＦ
Ａ−３との結合を阻止する、請求項２９に記載の方法。 - 【請求項３３】 前記抗体がＣＤ２抗原に対して特異的
な結合親和性を有し、そのモノクローナル抗体が： （ｉ）キメラモノクローナル抗体ＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉ
ｇ； （ii）ＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇのそれと同一の相補性決定
領域を有し、そして少なくとも５個のヒト起源アミノ酸
の少なくとも一配列セグメントを有するモノクローナル
抗体；及び （iii ）モラーベースでＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇの少なく
とも約８０％の効率でＣＤ２抗原に対する結合に関して
ＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇと競合し、且つ少なくとも５個の
ヒト起源アミノ酸の少なくとも一配列セグメントを有す
るモノクローナル抗体；より成る群から選ばれる、請求
項３２に記載の方法。 - 【請求項３４】 前記抗体がキメラモノクローナル抗体
ＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇである、請求項３３に記載の方
法。 - 【請求項３５】 前記抗体が治療剤にコンジュゲートさ
れている、請求項２９に記載の方法。 - 【請求項３６】 前記治療剤が抗腫瘍薬、リンホカイン
及び毒素より成る群から選ばれる、請求項３５に記載の
方法。 - 【請求項３７】 更に： （ｄ）対象体を、ＡＩＤＳに関連する日和見感染症に特
異的な少なくとも一種の薬剤で処置すること；を含んで
成る請求項２９に記載の方法。 - 【請求項３８】 前記薬剤がエーロゾル化ペンタミジ
ン、イソニアジド、リファンピン及びアンホテリシンＢ
より成る群から選ばれる、請求項３７に記載の方法。 - 【請求項３９】 ＨＩＶ−１で感染された対象体を処置
する方法であって、Ｔ細胞がＨＩＶ−１で感染されてい
る患者に、その感染Ｔ細胞中でのＨＩＶ−１の生産を阻
害するためにＣＤ４+ Ｔリンパ球と単球との間での細胞
表層相互作用を崩壊することの可能なモノクローナル抗
体を投与し、ここでこの抗体は患者における感染Ｔ細胞
中でのＨＩＶ−１の生産を阻害するのに十分な量で患者
に投与する、方法。 - 【請求項４０】 患者への抗体の投与がＨＩＶ−感染症
に関連する合併症を引き下げる、請求項３９に記載の方
法。 - 【請求項４１】 前記抗体がＣＤ２に対して特異的であ
り、そしてＣＤ２抗原のそのカウンターレセプターＬＦ
Ａ−３との結合を阻止する、請求項３９に記載の方法。 - 【請求項４２】 前記抗体がＣＤ２抗原に対して特異的
な結合親和性を有し、そのモノクローナル抗体が： （ｉ）キメラモノクローナル抗体ＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉ
ｇ； （ii）ＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇのそれと同一の相補性決定
領域を有し、そして少なくとも５個のヒト起源アミノ酸
の少なくとも一配列セグメントを有するモノクローナル
抗体；及び （iii ）モラーベースでＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇの少なく
とも約８０％の効率でＣＤ２抗原に対する結合に関して
ＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇと競合し、且つ少なくとも５個の
ヒト起源アミノ酸の少なくとも一配列セグメントを有す
るモノクローナル抗体；より成る群から選ばれる、請求
項４１に記載の方法。 - 【請求項４３】 前記抗体がキメラモノクローナル抗体
ＣＤ２ ＳＦｖ−Ｉｇである、請求項４２に記載の方
法。 - 【請求項４４】 前記抗体が治療剤にコンジュゲートさ
れている、請求項３９に記載の方法。 - 【請求項４５】 前記治療剤が抗腫瘍薬、リンホカイン
及び毒素より成る群から選ばれる、請求項３５に記載の
方法。 - 【請求項４６】 更に： （ｄ）対象体を、ＡＩＤＳに関連する日和見感染症に特
異的な少なくとも一種の薬剤で処置すること；を含んで
成る請求項３９に記載の方法。 - 【請求項４７】 前記薬剤がエーロゾル化ペンタミジ
ン、イソニアジド、リファンピン及びアンホテリシンＢ
より成る群から選ばれる、請求項３７に記載の方法。 - 【請求項４８】 前記抗体をウィルス血症にかかってい
る患者に投与する、請求項３９に記載の方法。
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