ES2249843T3 - Procedimieto para la produccion de trombina con una seguridad viral alta para formar pegamento de fibrina a partir de una mezcla de plasma humano. - Google Patents

Abstract

Un proceso para la producción de trombina que comprende las etapas de: (a) precipitar las proteínas del plasma completo mediante la adición de una primera sal en una cantidad suficiente como para conseguir un efecto de precipitación por adición de la sal y un pH de 7, 5 a 8, 5 a una temperatura comprendida entre 0ºC y 4ºC, o mediante la adición de una segunda sal en una cantidad suficiente como para conseguir una precipitación ácida a un pH de 4, 5 a 5, 5 a una temperatura comprendida entre 40C y 200C, mediante lo cual se precipitan el fibrinógeno, Factor XIII y fibronectina, realizándose dicha precipitación en presencia de una concentración de al menos 50 mM de ácido amino-6-hexanoico, y recuperando el sobrenadante que comprende la pro- trombina; (b) diafiltrar dicho sobrenadante hasta que se obtenga una disolución de pro-trombina con una osmolaridad de 100 mosmoles/kg de peso o menor; (c) diluir dicha disolución de pro-trombina con agua que se añade en una proporción de 4 volúmenes a un 1 volumen de la disolución de pro-trombina (d) precipitar la protrombina mediante la adición de una disolución ácida hasta que se obtenga un pH de 5, 2; (e) solubilizar el precipitado de la etapa d) en una disolución que tiene un pH cercano al neutro; y (f) convertir la protrombina de la etapa e) en trombina en presencia de cloruro de calcio para conseguir una concentración de cloruro de calcio de 20 a 32 mM.

Description

Procedimiento para la producción de trombina con una seguridad viral alta para formar pegamento de fibrina a partir de una mezcla de plasma humano.

La invención se refiere a la producción de concentrado de trombina con una seguridad viral alta a partir de mezcla de plasmas. Especialmente, este proceso comprende tratamiento con disolvente/detergente, nanofiltración y tratamiento con calor.

Los pegamentos biológicos son concentrados de proteínas adhesivos compuestos de fibrina producida a partir de fibrinógeno activado por trombina y factor XIII en presencia de iones calcio. Desde hace tiempo se conoce el poder adhesivo de los coágulos sanguíneos, debido a su entramado de fibrina polimerizada. La fibrina se ha utilizado desde el comienzo de este siglo como un adhesivo y fue descubierta por Bergel: Uber Wirkungen des Fibrins (Dtschr. Med-Wochenschr 1909; 3: 633-665) que descubrió que era un pegamento fisiológico y que, más aún, le atribuyó propiedades cicatrizantes. Este descubrimiento fue seguido de inmediato por Grey: Fibrin as a hemostatic in cerebral surgery: (Surg. Gynecol. Obstet. 1915; 21: 452) que utilizó tampones de fibrina para detener hemorragias cerebrales y hepáticas y en cirugía cerebral. Sin embargo, no fue hasta 1944 cuando Cronkite: Use of thrombin and fibrinogen in skin grafting: (JAMA 1944, 124: 976-978), después R.T. Tidrick y E.D. Warner: Fibrin fixation of skin transplants: (Surgery 1944; 15: 90-95) utilizaron fibrinógeno junto a trombina para asegurar los injertos cutáneos. Sin embargo, la baja concentración de estos productos no permitió una adhesión de calidad ni un efecto duradero. Desde 1946, debido a la importante investigación científica de E.J. Cohn et al.: Preparation and properties of serum plasma proteins. A system for the separation into fractions of the proteins and lipoprotein components of biological tissues and fluids (J. Am. Chem. Soc. 1946; 68: 459-475) sobre el fraccionamiento de proteínas plasmáticas, se han utilizado especialmente las proteínas de la coagulación, y pocos años después se esclareció el mecanismo de la coagulación y las principales proteínas de la coagulación, especialmente el factor XIII. Matras: Topographical anatomy of the total osteotomy of the midface: (J. Maxillofac Surg. 1975; 3(4): 260-262) fue el primero en utilizar las propiedades adhesivas de la fibrina mediante fibrinógeno muy concentrado. Desde entonces, los pegamentos biológicos han sustituido definitivamente a los pegamentos sintéticos y se utilizan cada vez más en la práctica clínica humana.

Los pegamentos biológicos introducen una aproximación nueva a las cirugías y suturas. Los cirujanos han buscado durante mucho tiempo un adhesivo eficaz, fácil de utilizar y, sobre todo, que se tolere bien, que pueda utilizarse junto con o sustituyendo a las suturas. Actualmente, las suturas quirúrgicas son importantes. Sin embargo, surgen numerosos problemas tales como intolerancia o toxicidad. La sangre, mediante sus propiedades coagulantes, siempre ha representado para los cirujanos un modelo ideal de pegamento biológico, pero la utilización de pegamentos biológicos preparados a partir de una fuente humana presenta un problema de transmisión viral. Los peligros de la transmisión viral dependen, en gran medida, de los métodos de purificación de los concentrados de plasma. Para su utilización en seres humanos, los pegamentos biológicos deben prepararse con tratamientos severos para inactivar los virus sin afectar la calidad de los productos. Actualmente, existen investigaciones para desarrollar un adhesivo que combine las propiedades siguientes:

- seguridad viral alta

- suficiente adhesividad

- buena elasticidad

- buen soporte en tejidos adyacentes

- ausencia de toxicidad

- ausencia de acción metabólica

- buena tolerancia

Las patentes de EEUU Nº 5.290.918 y Nº 5.395.923 expedidas a Haemacure Biotech Corp. describen métodos para la preparación y utilización de un concentrado de fibrinógeno, Factor XIII y fibronectina para fines terapéuticos.

Debido a sus propiedades coagulantes, el concentrado rico en fibrinógeno y Factor XIII proporciona a los médicos una herramienta valiosa y eficaz para cirugía, en la que son muy necesarias las propiedades hemostáticas. Las áreas de las aplicaciones clínicas pueden ser: neurocirugía, cirugía cardiovascular, cirugía plástica (injertos cutáneos), cirugía ORL, estomatología, cirugía ortopédica, cirugía general y traumatología.

La proteína principal de este concentrado es el fibrinógeno que, mediante una reacción enzimática en presencia de trombina y iones calcio, produce los fibrinopéptidos A y B lo que permite la formación de monómeros de fibrina. Estos monómeros polimerizan rápidamente y se convierten en fibrina soluble. Después, el factor estabilizador de fibrina (Factor XIII), con la ayuda de iones calcio, forma enlaces covalentes con la fibrina disuelta, lo que la hace estable e insoluble en un medio ácido o en presencia de urea.

La fibrina formada de esta manera es irreversible, estable y cumple con su papel de coagulante. Resiste la fibrinolisis debido a su alta concentración, fibrinógeno sin plasminógeno y mantiene su forma como resultado de la ausencia de exudación. Este concentrado tiene las características siguientes: estabilidad excelente después de disolverse de nuevo en una disolución acuosa, solubilización a temperatura ambiente en pocos minutos, buena elasticidad y, por último, una buena adhesión.

Estas características dependen únicamente del método de preparación a partir del plasma. Éste es un método sencillo, rápido fácilmente adaptable a la producción industrial. Todos los concentrados biológicos y bioquímicos están conservados, y el producto cumple con los requerimientos clínicos.

La utilización de productos de origen sanguíneo siempre plantea problemas de transmisión viral a pesar de los ensayos virológicos disponibles. La manera más segura de proporcionar productos de origen sanguíneo seguros es inactivar de manera sistemática los virus que se sospecha están presentes utilizando técnicas apropiadas sin deteriorar las propiedades bioquímicas de los productos plasmáticos. Actualmente se conocen numerosos métodos de inactivación viral basados en la naturaleza de los virus y en el tipo de proteínas que se quiere aislar, lo que se refleja en el volumen creciente de publicaciones científicas a este respecto.

Los productos plasmáticos más ampliamente utilizados son albúmina, inmunoglobulinas y concentrados de factores de la coagulación. Gellis et al.: Chemical, clinical and immunological studies on products of human plasma fractionation: inactivation of virus of homologous serum albumin by means of heat (J. Clin. Invest. 1948; 27: 239-244) fueron los primeros en utilizar un método para inactivar virus calentando una preparación de albúmina a 60ºC durante diez horas. Este método se utiliza desde esa fecha debido a su eficacia comprobada para reducir los riesgos de transmisión viral. El mismo método se ha aplicado en la preparación de inmunoglobulinas G (IgG) con la misma eficacia. Esta eficacia puede estar relacionada con el método de purificación de estos productos sanguíneos, especialmente con la utilización de un proceso de fraccionamiento completo como describe Cohn (op. cit.), o Kistler y Nitschmann: Large scale production of human plasma fractions (Vox Sanguinis 1962; 7: 414-424).

La utilización de etanol en numerosas etapas del fraccionamiento de la albúmina e IgG permite un reparto de la cantidad de virus en diferentes fracciones. Se sabe que el etanol es un agente desinfectante frente a agentes patógenos, como los virus, como mencionan Hénin et al.: Inactivation and partition of human immunodeficiency virus during Kistler and Nitschmann fractionation of human blood plasma (Vox Sanguinis 1988; 54: 78-83) y Morgenthaler: Effect of ethanol on virus. Virus inactivation in plasma products (Current Studies in Hematology and Blood Transfusion. Basel Karger 1989; 56: 109-121).

La pasteurización de la albúmina e IgG apareció al principio de la década de los años 50. Sin embargo, esta técnica estuvo dirigida a la inactivación del virus de la hepatitis (hepatitis B y no A-no B). Curran et al.: Acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) associated with transfusion (N. Engl. J. Med. 1984; 310: 69-75) plantearon la cuestión de la transmisión viral del tipo VIH mediante transfusión o mediante la utilización de otros derivados sanguíneos, especialmente factores de la coagulación. Desde entonces, los métodos de inactivación viral se centraron en VIH. No se detectó transmisión de VIH en la utilización de albúmina o IgG, atribuyéndose esta ausencia de transmisión viral a la etapa de pasteurización (Mitra et al.: Elimination of infectious retroviruses during preparation of immunoglobulins: (Transfusion 1986; 26: 394-397)). Los factores de la coagulación tales como los factores VIII y IX son utilizados ampliamente por los pacientes hemofílicos. Heimburger et al.: a-Faktor VIII-Konzentrat-hepatitissicher: Fortschritte in der Behandlung der Hämophilie A (Die gelben Hefte 1980; 20: 165-174) y b- A Factor VIII concentrate, high purified and heated in solution (1^{st} International Hemophilia Conference, Bonn. Octubre 3-7, 1980, abstr. 110 y 117) han aplicado a estos productos la misma técnica de pasteurización que la descrita para la albúmina con el fin de inactivar los virus durante la preparación del factor VIII en presencia de glicina y sacarosa, para evitar la desnaturalización proteica bajo desnaturalización térmica a 60ºC durante diez horas. Sus estudios demostraron la eficacia de la inactivación de VIH, hepatitis B y hepatitis no A-no B. Hilfenhaus et al.: a- Safety of human blood products: Inactivation of retroviruses by heat treatment at 60ºC (Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1985; 178: 580-584) b-Inactivation of the AIDS-causing retrovirus and other human viruses in antihemophilic plasma protein preparations by pasteurization (Vox Sanguinis 1986; 50: 208-211) c- Pasteurization as an efficient method to inactivate blood borne viruses in F. VIII concentrates (Drug Res. 1986; 22: 621-625) confirmaron que la pasteurización es un método eficaz para inactivar virus como el VIH durante la preparación de un concentrado del factor VIII. Tabor et al.: Inactivation of hepatitis B virus by heat in antithrombin III stabilized with citrates (Thromb. Res. 1982; 22: 233-238) inactivaron el virus de la hepatitis B calentando antitrombina III en presencia de citrato como agente estabilizador. Hollinger et al.: Reduction in risk of hepatitis transmission by heat treatment of a human factor VIII concentrate (J. Infect. Dis. 1984; 150: 250-262) calentaron un concentrado del factor VIII en estado liofilizado para reducir el riesgo de transmisión de VIH y hepatitis. Piszkiewicz et al.: a- Heat inactivation of human immunodeficiency virus in lyophilized anti-inhibitor coagulant complex (Autoplex) (Thromb. Res. 1986; 44: 701-707) b- Heat inactivation of human immunodeficiency virus in lyophilized factor VIII and factor IX concentrates (Thromb. Res. 1987; 47: 235-241) demostraron que el tratamiento con calor de concentrados liofilizados de los factores de la coagulación no tenía un efecto significativo en la actividad de estos factores. Estos autores recalcaron que no se vio producción de neoantígenos como consecuencia del tratamiento con calor. Los estudios sobre la inactivación viral por tratamiento con calor los llevaron a cabo Piszkiewicz et al.: Virus inactivation by heat treatment of lyophilized coagulation factor concentrates. Virus inactivation in plasma products (Current Studies in Hematology and Blood Transfusion. Basel, Karger 1989; 56: 44-54) en preparaciones de "factores anti-hemofílicos" (Hemofil® T, Hemofil® CT), en los que los últimos se calentaron durante 72 horas a 60ºC, y durante la preparación de complejos de inhibidores anticoagulantes (Autoplex® T), complejo del factor IX (Proplex® SX-T y Proplex® T), en los que los últimos se calentaron durante 144 horas a 60ºC. No existe ninguna publicación sobre la seroconversión de VIH debida a la utilización de cualquiera de los cinco productos de la coagulación tratados con calor. Se ha visto que el concentrado Hemofil® T obtenido a partir de plasma rastreado para encontrar HBsAg y anti-HBc no transmite NANBH en un estudio con simios. Sin embargo, la utilización del mismo producto obtenido a partir de plasma rastreado para encontrar sólo HBsAg transmitió NANBH a los pacientes (Colombo et al.: Transmission of non-A, non-B hepatitis by heat treated factor VIII concentrate (Lancet 1985; ii: 1-4)). Hemofil® T se fabrica actualmente a partir de plasma que no es reactivo frente a HBsAg y tiene niveles normales de ALT.

Los virus, así como las proteínas, son más estables y más resistentes al calor cuando están en estado seco (liofilizado). Parece que la temperatura y la duración del calentamiento varían según la naturaleza de las proteínas para minimizar la desnaturalización de éstas. Sin embargo, nunca se ha publicado que la eficacia de la inactivación viral sea perfecta: la transmisión de NANBH la han indicado Colombo et al. (op. cit.), la transmisión de VIH la han publicado White et al. (HTLV-III seroconversion associated with heat-treated factor VIII concentrate (Lancet 1986; i: 611-612)) y Van den Berg et al. (Seroconversion to HTLV-III in hemophiliac given heat-treated factor VIII concentrate (Lancet 1986; i: 803-803)). Debido a estas razones, Winkelman et al. (A new therapeutic factor VIII concentrate of high specific activity and high yield (Thromb. Haemost. 1985; 54: 19-22)) calentaron concentrado del factor VIII (tipo 8Y), factor IX (tipo 9A), factor VII, factor XI y trombina a 80ºC durante 72 horas. Los estudios que se llevaron a cabo en 29 pacientes que habían recibido estos productos tratados con calor mostraron que no hubo seroconversión de VIH de HB y que existía una reducción significativa en la incidencia de la transmisión de NANBH.

Se han desarrollado otros métodos de inactivación viral utilizando fuentes de luz (UV, rayos gamma, y láser) para irradiar los agentes infecciosos en el plasma. Los siguientes se citan como referencias: Oliphant et al.: Homologous serum jaundice: experimental inactivation of etiologic agent in serum by ultraviolet irradiation (Publ. Health Rep. 1946; 61: 598-600), Wolf et al.: Ultraviolet irradiation of human plasma to control homologous serum jaundice (JAMA 1947; 135: 476-477), Blanchard et al.: Methods of protection against homologous serum hepatitis, II. The inactivation of hepatitis virus serum with ultraviolet rays (JAMA 1948; 138: 341), Murray et al.: Effect of ultraviolet radiation on the infectivity of icterogenic plasma (JAMA 1955; 157: 8-14). Gurzadyan et al.: Mechanism of high power picosecond laser UV irradiation of viruses and bacterial plasmids (Photochem. Photobiol. 1981; 3: 835-838), Redfield et al.: Psoralen inactivation of influenza and herpes simplex virus and of viral infected cells (Infect. Immun. 1981; 32: 1216-1226), Heindrich et al.: Clinical evaluation of the hepatitis safety of beta-propiolactone-ultraviolet treated factor IX concentrate (PPBS), (Thromb. Res. 1982; 28: 75), Kitchen et al.: Effect of gamma irradiation of the human immunodeficiency virus and human coagulation proteins (Vox Sang. 1989; 56: 233-229).

Durante más de diez años, uno de los métodos más utilizados para la inactivación viral de virus en productos de origen sanguíneo es un método que combina la utilización de un disolvente y un detergente. Este método ha sido desarrollado por Neurath y Horowitz (patentes de EEUU Nº 4.540.573 expedida en sept. 85, Nº 4.613.501, Nº 4.764.369 expedida en ag. 1988; Nº 4.820.805 expedida en abril 1989; Nº 4.841.023 expedida en junio 1989 y 5.541.294 expedida en jul. 1996). La mezcla de disolvente/detergente (Tri(n-butil)fosfato/detergente) inactiva típicamente los virus con envoltura tales como VIH, HTLV-I, HBV y EBV.

Sin embargo, el método disolvente/detergente no es suficiente para proporcionar productos plasmáticos seguros, debido a la presencia de virus sin envoltura tales como parvovirus y poliovirus que son insensibles al disolvente/detergente. Recientemente, se ha introducido otra técnica para eliminar los virus sin envoltura en los que no tiene efecto el disolvente/detergente. Esta técnica es una nanofiltración. Los nanofiltros están compuestos por fibras microporosas y se han comercializado bajo el nombre de Planova BMM (Asahi Chemical Industries, Tokio, Japón). La porosidad de estos filtros varía de aproximadamente 15 hasta 35 nm. Estos filtros pueden retener determinados tipos de virus que tienen un tamaño mayor de aproximadamente 25 nm. Estos filtros son eficaces para eliminar virus tales como VIH-I (80-100 nm), HBB (42 nm), HCV (< 80 nm), virus de la hepatitis Delta (35 nm), virus de la diarrea bovina viral (60-70 nm), virus Sindbis (60-70 nm), reovirus tipo 3 (60-80 nm), poliovirus Sabin tipo I (25-30 nm), parvovirus humano (20-25 nm); Sekiguchi et al.: Possibility of hepatite B virus (HBV) removal from human plasma using regenerated cellulose hollow fiber (BMM) (Membrane, 1989; 14: 253-261), Hamamoto et al.: A novel method for removal of human immunodeficiency virus: filtration with porous polymeric membranes (Vox sang., 1989; 56: 230-236), Tsurumi et al.: Structure of cuprammonium regenerated cellulose hollow fiber (BMM hollow fiber) for virus removal (Polym. J. 1990; 22: 751-758), Ishikawa et al.: Novel determination method of size of virus in solution using cuprammonium regenerated cellulose membrane (BMM) (Membrane, 1991; 16: 101-111), Tomokiyo et al.: Studies on virus elimination and inactivation efect of highly purified F-VIII concentrate (The clinical report, 1991; 25: 271-275), Manabe: Virus removal and inactivation in process validation (Animal Cell Technology: Basic & Applied Aspects (Murakami, H., Shirahata, S., Tachibana, H. eds., 1992, 15-30), Bumouf-Radosewich et al.: Nanofiltration, a new specific virus elimination method applied to high-purity factor IX and factor VI concentrates (Vox Sanguinis 1994; 67(2): 132-138)).

Rubinstein et al.: Combined solvent-detergent and 100ºC (boiling) sterilizing dry-heat treatment of Factor VIII concentrates to assure sterility (Vox. Sanguinis 1991; 60: 60) utilizaron una inactivación viral doble del concentrado del factor VIII tratando éste último con disolvente/detergente y calentando el producto final a 100ºC durante 30 minutos. Según estos autores, el tratamiento térmico del producto final permite la inactivación de virus de la hepatitis no A-no B sin envoltura lipídica. El tratamiento con calor del producto final también es una medida de precaución en el caso de contaminación viral accidental durante la manipulación o debido al equipo (Vox Sang., 1991; 60: 60).

Recientemente, Proba (USP 5.506.127) et al. introdujeron una inactivación viral triple durante la preparación de trombina: (1) tratamiento con disolvente/detergente, (2) nanofiltración y (3) tratamiento del producto liofilizado con calor a 100ºC durante una hora (U.S.P. 5.506.127 expedida a Haemacure Biotech Inc.).

El tratamiento de inactivación viral triple confiere una seguridad incrementada en la utilización de productos de origen sanguíneo, especialmente factores de la coagulación o pegamentos biológicos.

Según la presente invención se proporciona un proceso para preparar trombina que combina una recuperación, calidad del producto y seguridad viral altas.

De acuerdo con esto, la invención proporciona un proceso para la producción a gran escala de una composición de trombina de grado terapéutico estable durante el almacenamiento que no contiene sustancialmente virus activos, que comprende las etapas de:

a)

recuperar el sobrenadante obtenido en la etapa a) del método de la reivindicación 1;

b)

diafiltrar dicho sobrenadante frente a una disolución sin sales o con pocas sales intercambiada;

c)

diluir dicho sobrenadante diafiltrado hasta la obtención de una disolución de protrombina de aproximadamente 100 mosmoles/kg de peso o menos;

d)

precipitar la protrombina añadiendo una disolución ácida hasta que se obtenga un pH de aproximadamente 5,2;

e)

solubilizar el precipitado de la etapa d) en una disolución que tenga un pH cercano al neutro;

f)

convertir la protrombina de la etapa e) en trombina en presencia de una disolución diluyente de cloruro de calcio para conseguir una concentración de cloruro de calcio de aproximadamente 20 hasta aproximadamente 32 mM;

g)

incubar dicha trombina con una disolución viricida de disolvente/detergente en una cantidad suficiente como para inactivar los virus que contienen lípidos;

h)

purificar el material incubado mediante cromatografía secuencial de intercambio iónico utilizando un único medio de intercambio catiónico de polisacárido activado con sulfoalquilo seleccionado del grupo que consiste en poliagarosa activada con sulfoalquilo, un polidextrano activado con sulfoalquilo y un medio compuesto no compresible de dextrano activado con sulfoalquilo y partículas de sílice que tiene una selectividad alta para la trombina utilizando como agente eluyente al menos tres concentraciones crecientes de una disolución tampón acuosa; y

i)

recuperar el eluato del pico de trombina de la cromatografía de h) e intercambiar el tampón del eluato con un tampón de formulación estabilizador compatible fisiológicamente para estabilizar la trombina recuperada y recuperar una disolución tampón de la formulación de la trombina.

Las reivindicaciones 1 y 2 proporcionan el proceso correspondiente.

En una realización preferida, la etapa b) comprende intercambiar una disolución acuosa en un volumen equivalente a aproximadamente cuatro veces el volumen del sobrenadante.

En una realización más preferida, la disolución diluyente de la etapa f) es cloruro de calcio 40 mM añadido en un volumen equivalente a aproximadamente cuatro veces el volumen del precipitado solubilizado de la etapa e).

El medio de intercambio catiónico es el mencionado medio compuesto no compresible de dextrano activado con sulfoalquilo y partículas de sílice.

Preferiblemente, el dextrano activado con sulfoalquilo es dextrano activado con sulfopropilo y partículas de sílice. Las concentraciones crecientes de tampón consisten esencialmente en aproximadamente 0,08 M, 0,15 M y 0,4 M de tampón NaCl para la trombina humana.

En otra realización preferida, el método incluye además filtrar la disolución tampón de la formulación de la trombina sobre una membrana de celulosa regenerada con cuproamonio de fibra hueca para eliminar por filtración los viriones presentes en la disolución tampón de la formulación, y recuperar una disolución tampón de la formulación de la trombina sustancialmente sin viriones.

La membrana de celulosa regenerada con cuproamonio de fibra hueca tiene preferiblemente una porosidad de aproximadamente 15 nm.

En otra realización más preferida, el método incluye además liofilización y tratamiento con calor seco de la disolución tampón de la formulación de la trombina después de la filtración para inactivar cualquier virión remanente sin desnaturalizar la trombina.

Preferiblemente, el tratamiento con calor seco se consigue calentando el producto liofilizado durante aproximadamente 1 a aproximadamente 2 horas a aproximadamente 100ºC.

La disolución tampón de la formulación puede comprender una disolución acuosa de sal citrato, cloruro sódico, Tris-HCl, y albúmina sérica a un pH de aproximadamente 7,3, en cantidades suficientes como para estabilizar la trombina frente a la pérdida sustancial de actividad durante el tratamiento con calor.

En una realización específica, la disolución tampón de la formulación comprende una disolución acuosa de aproximadamente 0,25% citrato sódico, 0,45% cloruro sódico, 0,25% Tris-HCl, todos en % p/v; albúmina sérica en una cantidad aproximadamente igual a aproximadamente 20 veces la proteína total en el eluato del pico de trombina y ajustada antes de la liofilización a 2% p/v; y que tiene un pH de aproximadamente 7,3.

La ventaja de la presente invención es cumplir con todos los requerimientos industriales de coste eficacia y seguridad viral.

La invención se describirá más adelante en la presente memoria con referencia a los ejemplos y dibujos específicos siguientes, cuyo propósito es ilustrar la invención y no limitar su alcance.

Las Figuras muestran:

La Figura 1 ilustra las etapas de preparación de un concentrado de fibrinógeno, factor XIII y fibronectina, a partir de una mezcla de plasmas humanos.

La Figura 2 muestra un proceso de preparación de trombina a partir de un sobrenadante de plasma obtenido durante el aislamiento de un concentrado de fibrinógeno, factor XIII y fibronectina, según la presente invención.

Ejemplo Comparativo 1

Preparación de un concentrado rico en fibrinógeno, factor XIII y fibronectina

Primer fraccionamiento

La mezcla de plasmas se mantiene a una temperatura comprendida entre aproximadamente 16 y aproximadamente 37ºC. Se añade ácido amino-6-hexanoico en agitación para conseguir una concentración mínima de 50 mM. La mezcla se incuba durante al menos 15 minutos a 35 hasta 37ºC. Después, la mezcla se enfría hasta 0ºC \pm 2ºC. Se añade fosfato sódico o potásico monobásico (U.S.P. 5.290.918, expedida a Haemacure Biotech Inc.) o acetato sódico o potásico (U.S.P. 5.395.923, expedida a Haemacure Biotech Inc.) para conseguir una concentración final de 1 M. La mezcla se agita durante aproximadamente 0,5 hasta 1 hora a aproximadamente 0ºC hasta 4ºC \pm 2ºC. También puede llevarse a cabo una precipitación ácida con fosfatos a temperatura ambiente (aproximadamente 20ºC).

Centrifugación

La mezcla se filtra o centrifuga a 4.200 rpm (Beckman J6-MC, rotor tipo 4.2) durante 20 minutos a 4ºC. El sobrenadante se recupera para la preparación de trombina y el precipitado se transfiere a otro vaso de precipitación. El sobrenadante puede utilizarse inmediatamente para un procesamiento adicional o puede conservarse a una temperatura inferior a -30ºC, preferiblemente a -80ºC durante muchos meses o a 2º hasta 4ºC durante aproximadamente 24 horas.

Solubilización

El precipitado obtenido, rico en fibrinógeno, factor XIII y fibronectina, se solubiliza con un tampón que contiene 1% Tris y 1,6% citrato sódico pH: 6,0 \pm 0,1 (un pH 7,3 también funciona). El precipitado se solubiliza a temperatura ambiente, en agitación. El tampón descrito más arriba se añade de manera que se obtenga una concentración de proteínas de aproximadamente 20-22 mg/ml. En este punto, se añade L-Histidina en una proporción de 0,2-0,3 g por gramo de proteína. La disolución de proteínas se centrifuga a 10.000 rpm durante 20 minutos a aproximadamente 4ºC (Beckman J2-MI, rotor tipo JA-10). Se elimina una capa de lípidos que flota en la superficie de la disolución de proteínas. La disolución de proteínas se transfiere con cuidado a un vaso de precipitación y se filtra a través de un filtro encapsulado de 0,2 micrómetros (Gelman SuporCap, producto Nº 12991 ó 12992).

Tratamiento con disolvente/detergente

La disolución de proteínas filtrada de esta manera se somete a tratamiento de inactivación viral mezclándola con un volumen igual de una disolución que contiene 1% Tris, 1,6% citrato sódico, 2% Tween80® (monooleato de sorbitán polioxietilenado) y 0,6% Tris n-butil-fosfato (TriBP), pH: 6,8 \pm 0,1. Esto conduce a una concentración final de aproximadamente 10 mg/ml de proteínas, 1% Tween80® y 0,3% TriBP, el pH final es aproximadamente 7,0 \pm 0,2. La disolución se incuba a 24ºC \pm 1ºC, en agitación constante durante al menos 6 horas.

Eliminación de los virus por nanofiltración

Después del tratamiento de inactivación de los virus, el Tween80® en la proteína se ajusta a una concentración final de 2% hasta 4% con un tampón que contiene 1% Tris, 1,6% citrato sódico, Tween80® 6%, pH: 7,0 \pm 0,1. Después, la mezcla se filtra a través de filtros encapsulados en cascada de 0,2 y 0,1 micrómetros (Gelman CritiCap 0,2 \mum, producto Nº 12995 ó 12996; CritiCap 0,1 \mum, producto Nº 12997 ó 12999) y la disolución filtrada se pasa a través del filtro Planova BMM de 35 nm. La adición de Tween80® es necesaria para facilitar la filtración de una molécula de alto peso molecular como el fibrinógeno y para optimizar su recuperación. En ausencia de Tween80®, el filtro se bloquea rápidamente debido a la carga proteica.

Segundo fraccionamiento

Se añade una cantidad de 50 mM de ácido amino-6-hexanoico al filtrado en agitación y la mezcla se incuba a 35ºC \pm 2ºC durante aproximadamente una hora y después se enfría hasta 0ºC \pm 2ºC. Se añade una cantidad de fosfato sódico o potásico monobásico (U.S.P. Nº 5.290.918 expedida a Haemacure Biotech Inc.); o de acetato sódico o potásico (U.S.P. Nº 5.395.923, expedida a Haemacure Biotech Inc.) equivalente a un mol por litro de mezcla, y el precipitado aparece instantáneamente. La agitación continúa durante una hora a 0ºC \pm 2ºC.

Centrifugación

La mezcla se filtra o centrifuga a 4.200 rpm (Beckman J6-MC, rotor tipo 4.2) durante 20 minutos a 4ºC. El disolvente, el detergente y las proteínas contaminantes se eliminan por centrifugación. El precipitado se recupera y se transfiere a un vaso de precipitación.

Lavado

El precipitado se lava varias veces (al menos 2 veces) con un tampón 0,1% Tris, pH: 7,0 \pm 0,1. Dependiendo de la sal utilizada en la etapa de precipitación previa, el pH y la concentración de la disolución de Tris pueden variar de 4,5-5,0 hasta 9,5-10,5 (concentración de 0,1% hasta 0,5%) para neutralizar la disolución. El precipitado se separa por centrifugación después de cada etapa de lavado. El tampón Tris se enfría previamente a 0ºC \pm 2ºC y las etapas de lavado se llevan a cabo a 0ºC \pm 2ºC. Si se trabaja a temperatura ambiente también se consiguen buenos resultados. El número de las etapas de lavado puede disminuirse realizando una diálisis o una diafiltración después de poner de nuevo el precipitado en el tampón final, utilizando una disolución acuosa basificada hasta pH 7,3.

Solubilización

El precipitado lavado se disuelve en un tampón final que contiene 0,5% Tris, 0,1% NaCl y 0,5% citrato sódico, pH: 6,8 \pm 0,1 (un pH de 7,3 también funciona). El volumen del tampón es aproximadamente 2 hasta 3 ml/g de precipitado pesado. La solubilización del precipitado puede acelerarse calentando a 37ºC. Después de una solubilización completa, se añade una cantidad de L-Histidina correspondiente a 0,2-0,3 g por litro de plasma de partida. Después, la disolución de proteínas se filtra o centrifuga a 10.000 rpm durante 20 minutos a aproximadamente 4ºC (Beckman J2-MI, rotor tipo JA-10).

La Figura 1 muestra las etapas finales de la preparación de un concentrado rico en fibronectina, Factor XIII y fibronectina.

Ajuste de la concentración de proteínas

La concentración final de proteínas se ajusta a aproximadamente 30-40 mg/ml con el mismo tampón. La concentración de proteínas se determina por D.O. 280 nm.

Formulación

Se ajusta una concentración final de L-Histidina a 0,2-0,4, preferiblemente 0,4 g por gramo de proteínas, determinada por D.O. según la fórmula siguiente:

[0,4 g (L-Histidina) x concentración de proteínas mg/ml (D.O.) x volumen] - [L-Histidina añadida 0,2-0,3 g/L de plasma]

Se añade a la mezcla una cantidad de sacarosa correspondiente a 0,5 g/g de proteínas determinada por D.O.

Se añade a la mezcla una cantidad de albúmina humana (25% en disolución, aprobada para utilizarse en seres humanos Plasbumin 25® de Miles Inc. Pharmaceutical Division, IN 46515 EEUU) correspondiente a 0,2 ml/g de proteínas determinada por D.O.

Se ajusta una cantidad de Tween80® a 17-20 \mug/mg de proteínas determinada por D.O. con el tampón que contiene 0,5% Tris, 0,1% NaCl, 0,5% citrato sódico y 10% Tween80®, pH: 6,8 \pm 0,1. El Tween80® debe verificarse por D.O. 620 nm antes del ajuste según la técnica del New York Blood Center.

Filtración estéril

La disolución final de proteínas se filtra a través de un filtro encapsulado de 0,2 micrómetros (Gelman, CritiCap 0,2 \mum, producto Nº 12995 ó 12996).

Llenado aséptico

La disolución de proteínas se vierte en viales de 10 ml en una proporción de 60 \pm 5 mg de fibrinógeno coagulable por vial.

Liofilización

Los recipientes que contienen 60 \pm 5 mg de fibrinógeno coagulable se someten a liofilización durante 66-72 horas. La temperatura se incrementa progresivamente de -40ºC hasta 22ºC \pm 2ºC (la pendiente del incremento fue 0,02ºC por minuto). Esta etapa de liofilización confiere al producto una humedad residual inferior al 1%, evitando la desnaturalización del producto durante el tratamiento con calor.

Calentamiento seco

Después del ciclo de liofilización, los viales se cierran en vacío con tapones y se sellan con tapas de aluminio. Después, los viales se someten a la tercera inactivación viral por tratamiento con calor seco a aproximadamente 100ºC \pm 1ºC durante 1 a 2 horas según el proceso descrito en U.S.P. 5.506.127 expedida en abril 1996.

Seguridad viral

Se evaluó la seguridad viral. Los virus pequeños sin envoltura tales como parvovirus, poliovirus y virus de la hepatitis A se inactivan durante el tratamiento con calor. Un problema principal que se podía esperar en la recuperación era obtener la mayor cantidad posible de fibrinógeno después de la nanofiltración. Esta dificultad se obvió ajustando apropiadamente la concentración de Tween80® para favorecer el paso del fibrinógeno a través del nanofiltro. Los virus sin envoltura reovirus 3 y SV40 se eliminaron mediante la nanofiltración. Por lo tanto, cada etapa de inactivación viral logró su propósito: eliminar o inactivar virus en cada etapa adecuada, proporcionando un producto seguro desde un punto de vista viral. Esto significa que la combinación de tres etapas asegura la inactivación o captura de virus mediante al menos una de ellas; de otra forma los virus resistentes a una o dos etapas pueden recuperarse en el producto final.

Recuperación

La recuperación global de fibrinógeno, fibronectina y Factor XIII es equivalente a la publicada en U.S.P. 5.290.918 y 5.395.923, lo que significa que se asegura la seguridad viral a la vez que se mantiene la actividad de las proteínas.

Ejemplo 1 Producción de Trombina Reducción del contenido en sal mediante diafiltración

El sobrenadante del plasma obtenido después de una primera centrifugación de una precipitación del plasma por adición de ácido o sal (como en el Ejemplo Comparativo 1) contiene una cantidad importante de sales. La osmolaridad plasmática está comprendida entre aproximadamente 2.200 y 2.500 mosm/kg. Esta cantidad alta de sales debe eliminarse con el fin de aislar la protrombina presente en ese sobrenadante. El aislamiento de la protrombina puede llevarse a cabo sólo cuando el medio plasmático tiene una fuerza iónica baja, especialmente cuando se ha utilizado una precipitación ácida. La eliminación de las sales se realiza mediante la técnica clásica de la diafiltración. El sobrenadante se transfiere a un reservorio de un sistema de diafiltración (sistema Amicon, modelo DC10L con cartucho espiral). La diafiltración se consigue frente a agua pura. Un volumen del sobrenadante del plasma se intercambia durante una media de cuatro volúmenes de agua pura o hasta que la osmolaridad del plasma está por debajo de 50 a
100 mOsm/kg.

Recuperación de la protrombina

El plasma diafiltrado se diluye cinco veces con agua pura. El pH del plasma diluído está comprendido entre aproximadamente 7,4-7,8. El pH se disminuye hasta 5,2 \pm 0,1 mediante la adición gota a gota de una disolución de ácido acético (2 a 5%; Allary et al.: Isolement par chromatographie d'affinité, sur support de silice, de la thrombine humaine en vue de son utilisation dans les préparations de colle biologique (Ann. pharmaceutiques françaises 1990; 48(3): 129-135). La protrombina precipita durante la disminución del pH (a aproximadamente 5,5-6,0) y precipita completamente a un pH comprendido entre 5,1 y 5,3. La protrombina se resolubiliza rápidamente a un pH mayor de 6,0 e incrementando la concentración de las sales. El plasma se incuba sin agitación durante una hora a temperatura ambiente y se vuelve a centrifugar a 4.200 rpm durante 20 minutos a 20ºC (Beckman J6MC, rotor JS 4.2). El precipitado se recupera y solubiliza en una disolución tampón Tris-HCl 2% a pH 7,5 \pm 0,1 (volumen: 120-150 ml por litro de sobrenadante de plasma). La cantidad de protrombina se determina mediante dosificación cronométrica (Fibromètre Stago ST4-
Francia). La recuperación de la protrombina es aproximadamente 90% respecto al sobrenadante del plasma y al plasma de partida, lo que proporciona aproximadamente 750 a 850 unidades de protrombina por litro de plasma.

Conversión de protrombina en trombina

Se añaden rápidamente cuatro volúmenes de CaCl_{2} 40 mM a un volumen de disolución de protrombina en agitación durante unos pocos minutos. La mezcla se incuba a temperatura ambiente durante aproximadamente una hora o más y se centrifuga a 4.200 rpm durante 30 minutos a 20ºC (centrífuga Beckman J6MC, rotor JS 4.2). El sobrenadante que contiene la trombina se recupera y se filtra en un filtro de 0,2 micrómetros (Gelman SuporCap, producto Nº 12991 ó 12992). La actividad de la trombina cruda obtenida después de la conversión de la protrombina es aproximadamente 110 a 120 unidades NIH/ml. La actividad específica es aproximadamente 25 a 30 unidades NIH/mg de proteína, ó 80 a 100 unidades NIH de trombina por unidad de protrombina. La recuperación global de la trombina es de aproximadamente 60.000-80.000 unidades NIH por litro de sobrenadante del plasma, por ejemplo, el doble que la recuperación determinada con el proceso descrito en U.S.P. 5.506.127.

La actividad de la trombina se evaluó determinando el tiempo de coagulación en un fibrómetro (Fibromètre Stago ST4-Francia) y se expresó en unidades NIH. La curva estándar se estableció con trombozima (reactivos Stago, Trombozima ref. 00332); la actividad de esta última se determinó a partir de un estándar NIH, lote J (titulación 310 NIH), La mezcla de plasmas se utilizó como una fuente de fibrinógeno para determinar la actividad de la trombina.

Inactivación viral mediante disolvente/detergente

La Figura 2 muestra las etapas de la inactivación viral realizada en una disolución de trombina tratando ésta sucesivamente con una técnica disolvente/detergente, purificando la trombina mediante cromatografía, filtración viral, formulación, liofilización e inactivación viral con calor a 100ºC. La disolución de trombina se transfiere a un tanque de doble pared equipado con un sistema de circulación líquido termostatizado a 24ºC \pm 0,5ºC. La disolución que comprende 11% Tween80® y 3,3% Tri-n-butil-fosfato (TriBP) preparada en Tris 0,5%, pH 7,0 \pm 0,1, se añade a la disolución de trombina con agitación suave. El volumen de disolvente/detergente representa un décimo del volumen de la disolución de trombina. Después de una hora de agitación, la mezcla se transfiere a un segundo tanque similar al primero y la agitación continúa durante un periodo de tiempo adicional de aproximadamente 5 horas. La actividad de la trombina determinada después de la inactivación viral muestra que no se produjo una pérdida significativa de actividad durante el tratamiento con disolvente/detergente (0 a 5%). Es importante indicar que si se añade una cantidad de CaCl_{2} sólido equivalente aproximadamente a la cantidad de CaCl_{2} líquido para convertir la protrombina en trombina, la recuperación disminuye un 20% en el caso del polvo y se produce una pérdida de actividad de aproximadamente 10 a 15% durante el tratamiento con disolvente/detergente. La diferencia global entre la adición de calcio en polvo frente a la disolución de CaCl_{2} representa una pérdida de aproximadamente 30% en la actividad de la trombina en el caso del primero.

Purificación de la trombina mediante cromatografía

La trombina se purifica adicionalmente durante una etapa única de cromatografía de intercambio catiónico. La purificación de proteínas mediante cromatografía es muy conocida y se describe con detalle en muchas referencias. La utilización de diferentes matrices o soportes es función del objetivo de la purificación y de la naturaleza de las proteínas. En el caso presente, el soporte es un gel de agarosa rígido que comprende un resto de sulfopropilo (-CH_{2}-CH_{2}-CH_{2}-SO_{3}) injertado. El gel denominado SP Sepharose Fast Flow™ (Pharmacia, código Nº 17-0729-01) es un intercambiador catiónico fuerte con propiedades excelentes de flujo y una capacidad alta para proteínas con cualquier valor de pI. El grupo de intercambio iónico es sulfopropilo que permanece cargado y mantiene de manera consistente capacidades altas en todo el intervalo de trabajo, a pH 4-13. La disolución proteica que comprende la trombina cruda se pasa a través de una columna que contiene Sefarosa SP. La trombina y las proteínas contaminantes se adsorben en el soporte. Es necesario un lavado concienzudo del gel con una disolución de NaCl 0,08 M antes de eluir las proteínas retenidas en el gel. La elución de la trombina se efectúa en un gradiente de NaCl discontinuo. Primero se pasa a través de la columna una disolución de NaCl 0,15 M para eliminar las proteínas contaminantes. La trombina se desadsorbe completamente y se recupera en NaCl 0,4 M. Después, se eliminan del gel todas las impurezas adsorbidas lavando con una disolución de NaCl 2 M. La purificación de la trombina mediante cromatografía también permite la eliminación del disolvente/detergente utilizado en la etapa previa de inactivación viral. La disolución de trombina purificada se estabiliza añadiendo albúmina humana (disolución de albúmina humana 25%-USP Plasbumin-25, Miles Inc. Pharmaceutical Division, IN 46515 EEUU). La cantidad de albúmina que debe añadirse se calcula según la fórmula siguiente:

\frac{20 \ x \ [c] \ trombina \ (determinada/D.O.) \ x \ volumen \ de \ trombina \ (después \ de \ la \ cromatograf\text{í}a) \ x \ 100 \ ml}{25 \ x \ 1\text{.}000}

La trombina en disolución después de la purificación por cromatografía es muy inestable. Puede producirse una pérdida de actividad importante si la trombina no se conserva rápidamente a temperatura baja o si se llevan a cabo otras etapas tales como diafiltración y concentración sin estabilización. La utilización de un estabilizador como la albúmina es esencial para proteger la actividad de la trombina durante un intercambio de tampón para una formulación final (sistema Amicon CH2PRS o TCF 10 según el volumen). La formulación final es en un tampón que comprende 0,25% Tris-0,25% citrato sódico-0,45% NaCl, pH 7,30 \pm 0,1. Se intercambian aproximadamente 6 volúmenes de tampón de formulación por un volumen de disolución de trombina. La disolución de trombina puede concentrarse numerosas veces antes de la diafiltración para disminuir el volumen a intercambiar y para reducir el tiempo de la diafiltración.

Filtración viral

Según las indicaciones de U.S.P. 5.506.127 expedida el 9 de abril, 1996, la disolución de trombina diafiltrada se filtra en una membrana de fibra hueca como una membrana microporosa Planova BMM (Bemberg microporous membrane BMM Development, Asahi Chemical Industries, Tokio, Japón) que comprende una fibra de celulosa regenerada con cuproamonio que tiene un tamaño de poro de aproximadamente 15 nm. Esta técnica permite la eliminación sustancial de los virus sin envoltura lipídica que no pueden ser inactivados mediante el tratamiento SD del proceso.

Llenado aséptico

La disolución de trombina después de la nanofiltración se diluye hasta aproximadamente 250 unidades NIH/ml y se alicuota en recipientes de vidrio de 5 ml.

Liofilización

Los recipientes que contienen 1 ml de disolución de trombina se liofilizan durante 66 a 72 horas. La temperatura aumenta progresivamente desde -40 hasta 22 \pm 2ºC con una velocidad de incremento de la temperatura de aproximadamente 0,02ºC por minuto. Esta etapa consigue un contenido de humedad residual inferior al 1%.

Calentamiento seco

Después del ciclo de liofilización, los viales se cierran en vacío con tapones y se sellan con tapas de aluminio. Después, los viales se someten a la tercera inactivación viral mediante tratamiento con calor seco a aproximadamente 100ºC \pm 1ºC durante aproximadamente 1 a 2 horas.

Conclusión

A partir de los métodos indicados en U.S.P. 5.290.918, U.S.P. 5.395.923 y U.S.P. 5.506.127, todas concedidas a Haemacure Biotech Inc, la presente invención ha demostrado que estos métodos pueden mejorarse con el fin de incrementar la recuperación de trombina con un nivel de seguridad mayor.

Claims (15)

1. Un proceso para la producción de trombina que comprende las etapas de:

   (a)

   precipitar las proteínas del plasma completo mediante la adición de una primera sal en una cantidad suficiente como para conseguir un efecto de precipitación por adición de la sal y un pH de 7,5 a 8,5 a una temperatura comprendida entre 0ºC y 4ºC, o mediante la adición de una segunda sal en una cantidad suficiente como para conseguir una precipitación ácida a un pH de 4,5 a 5,5 a una temperatura comprendida entre 4ºC y 20ºC, mediante lo cual se precipitan el fibrinógeno, Factor XIII y fibronectina, realizándose dicha precipitación en presencia de una concentración de al menos 50 mM de ácido amino-6-hexanoico, y recuperando el sobrenadante que comprende la pro-trombina;

   (b)

   diafiltrar dicho sobrenadante hasta que se obtenga una disolución de pro-trombina con una osmolaridad de 100 mosmoles/kg de peso o menor;

   (c)

   diluir dicha disolución de pro-trombina con agua que se añade en una proporción de 4 volúmenes a un 1 volumen de la disolución de pro-trombina;

   (d)

   precipitar la protrombina mediante la adición de una disolución ácida hasta que se obtenga un pH de 5,2;

   (e)

   solubilizar el precipitado de la etapa d) en una disolución que tiene un pH cercano al neutro; y

   (f)

   convertir la protrombina de la etapa e) en trombina en presencia de cloruro de calcio para conseguir una concentración de cloruro de calcio de 20 a 32 mM.

2. 2. El proceso según la reivindicación 1, que comprende además las etapas siguientes:

   (g)

   incubar dicha trombina con una disolución viricida de disolvente/detergente en una cantidad suficiente como para inactivar los virus que contienen lípidos;

   (h)

   purificar la trombina incubada mediante cromatografía de intercambio iónico secuencial utilizando un medio único de intercambio catiónico de polisacárido activado con sulfoalquilo seleccionado del grupo que consiste en una poliagarosa activada con sulfoalquilo, un polidextrano activado con sulfoalquilo y un medio compuesto no compresible de dextrano activado con sulfoalquilo y partículas de sílice con una selectividad alta para la trombina utilizando como agente eluyente al menos tres concentraciones crecientes de una disolución acuosa de sales; y

   (i)

   recuperar un eluato del pico de la trombina a partir de la cromatografía de h) e intercambiar la sal del eluato con un tampón de formulación estabilizador compatible fisiológicamente para estabilizar la trombina recuperada y recuperar una disolución tampón de la formulación de la trombina.

3. 3. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que la etapa de diafiltración b) comprende intercambiar agua en un volumen equivalente a cuatro veces el volumen del sobrenadante.
4. 4. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que, en la etapa f), el cloruro de calcio se añade como una disolución 40 mM en una proporción de 4 volúmenes a 1 volumen del precipitado solubilizado de la etapa e).
5. 5. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 2, 3, ó 4, en el que el medio de intercambio catiónico es un medio compuesto no compresible de dextrano activado con sulfoalquilo y partículas de sílice.
6. 6. El proceso de la reivindicación 5, en el que el medio de intercambio catiónico es un medio compuesto no compresible de dextrano activado con sulfopropilo y partículas de sílice.
7. 7. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 2, 3, 4, 5 y 6, que incluye además la etapa j): filtrar la disolución tampón de la formulación de la trombina sobre una membrana de celulosa regenerada con cuproamonio de fibra hueca para eliminar por filtración los viriones presentes en la disolución tampón de la formulación, y recuperar una disolución tampón de la formulación de la trombina sustancialmente sin viriones.
8. 8. El proceso según la reivindicación 7, en el que dicha membrana de celulosa regenerada con cuproamonio de fibra hueca tiene una porosidad de aproximadamente 15 nm.
9. 9. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8, que incluye además las etapas siguientes:

   (k)

   liofilizar la disolución de trombina obtenida en la etapa j); y

   \newpage

   (l)

   calentar en seco la formulación de trombina liofilizada para inactivar cualquier virión remanente sin desnaturalizar la trombina.

10. 10. El proceso de cualquiera de las reivindicaciones 2, 3, 4, 5 ó 6, que comprende además una etapa final de liofilizar a sequedad la disolución tampón de la formulación de la trombina y tratar esta última con calor para recuperar una trombina sustancialmente sin viriones y no desnaturalizada.
11. 11. El proceso según cualquiera de las reivindicaciones 9 ó 10, en el que dicha etapa de calentamiento en seco se consigue calentando el producto liofilizado durante 1 a 2 horas a aproximadamente 100ºC.
12. 12. El proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 2-11, en el que la disolución tampón de la formulación comprende una disolución acuosa de sal citrato, cloruro sódico, Tris-HCl, y albúmina sérica a un pH de 7,3, en cantidades suficientes como para estabilizar la trombina frente a la pérdida sustancial de actividad durante el tratamiento con calor.
13. 13. El proceso de la reivindicación 12, en el que la disolución tampón de la formulación comprende una disolución acuosa de 0,25% citrato sódico, 0,45% cloruro sódico, 0,25% Tris-HCl, todos en % p/v; albúmina sérica en una cantidad igual a 20 veces las proteínas totales en el eluato del pico de la trombina y ajustada antes de la liofilización a 2% p/v; y con un pH de 7,3.
14. 14. El proceso según una cualquiera de las reivindicaciones 2-13, en el que las mencionadas al menos tres concentraciones crecientes de sal de una disolución acuosa de sales consisten esencialmente en 0,08 M, 0,15 M y 0,4 M de tampón NaCl para la trombina humana.
15. 15. El proceso según una cualquiera de las reivindicaciones 2-14, en el que la etapa de incubación g) se lleva a cabo en presencia de una disolución viricida de disolvente/detergente que no contiene citrato sódico.