ES2264167T3

ES2264167T3 - Proceso de fabricacion para la produccion de transferencia puruficada.

Info

Publication number: ES2264167T3
Application number: ES97928874T
Authority: ES
Inventors: John M. Rolf; Akimasa Ohmizu; Shawn D. Latham; Prabir Bhattacharya
Original assignee: Grifols Shared Services North America Inc
Current assignee: Grifols Shared Services North America Inc
Priority date: 1996-06-26
Filing date: 1997-06-18
Publication date: 2006-12-16
Anticipated expiration: 2017-06-18
Also published as: AU3303397A; JP2002509521A; EP0934072A1; ATE329602T1; AU729682B2; DE69736115D1; CA2258740C; US5744586A; CA2258740A1; DE69736115T2; EP0934072A4; WO1997049414A1; EP0934072B1

Abstract

ESTA INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO QUE PERMITE LA OBTENCION DE LA TRANSFERRINA ALTAMENTE PURIFICADA A PARTIR DE UNA FRACCION DE PLASMA PARCIALMENTE PURIFICADO QUE CONTIENE TRANSFERRINA. SEGUN DICHO PROCEDIMIENTO, LA FRACCION DE SALIDA ESTA CONCENTRADA, SU FUERZA IONICA ES REDUCIDA, Y LUEGO SE ADSORBE LA TRANSFERRINA SOBRE UNA COLUMNA CROMATOGRAFICA. DESPUES DE LA ELUCION, LA TRANSFERRINA PUEDE ESTAR SOMETIDA A OTROS TRATAMIENTOS HASTA SU EMBALAJE EN RECIPIENTES FINALES. EL PRODUCTO FINAL, ES DECIR LA TRANSFERRINA PURIFICADA, ES ESTERIL, PURA EN, POR LO MENOS, UN 95% Y PRACTICAMENTE EXENTA DE VIRUS ENVUELTOS O NO ENVUELTOS.

Description

Proceso de fabricación para la producción de transferrina purificada.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un proceso para la purificación de transferrina que da lugar a un producto adecuado para usos médicos.

Antecedentes de la invención

La transferrina es una glicoproteína susceptible de fijar hierro, que tiene un peso molecular de 76-81 kD. Se hace referencia a la transferrina libre de hierro como "apo-transferrina", mientras que se hace referencia a la transferrina saturada de hierro como "holo-transferrina". Tanto la apo-transferrina como la holo-transferrina se utilizan con objetivos terapéuticos.

En el plasma de la sangre, la transferrina actúa como una proteína transportadora de hierro que secuestra de forma segura hierro trivalente a medida que se libera al citoplasma celular a través de los receptores de transferrina de la superficie celular. Las neuronas del sistema nervioso central (SNC) son deficientes en receptores de transferrina, mientras que las células tumorales tienen habitualmente un exceso. Un conjugado de transferrina y una proteína o una molécula pequeña pueden proporcionar un tratamiento útil para tumores en el SNC mediante la liberación selectiva a las células diana. Entre dichas proteínas se pueden incluir toxinas. Entre dichas moléculas se pueden incluir agentes quimioterapéuticos, radioisótopos y ácidos nucleicos. Por ejemplo, la Patente de Estados Unidos No. 5.352.447 da a conocer un conjugado de transferrina y toxina de la difteria para el tratamiento de lesiones intracraneales.

Otras diversas aplicaciones médicas también implican la utilización de productos de transferrina purificados. Por ejemplo, los productos de transferrina se utilizan como factores de crecimiento celular en medios de cultivo sin suero. Los productos de transferrina purificados también se pueden utilizar como reactivos en equipos de diagnóstico.

Por lo tanto, existe una continua necesidad para productos de transferrina altamente purificados y estériles, que están libres de virus con cubierta y sin cubierta. Además, existe la necesidad de poder realizar estos productos altamente purificados a escala industrial de una manera sencilla y rentable.

La Fracción IV se considera habitualmente un producto de desecho del proceso de fraccionamiento de Cohn. Sin embargo, también se sabe que la Fracción IV contiene un rango de proteínas del plasma útiles que incluyen albúmina, inhibidor de la alfa-1 proteinasa (también conocido como alfa-1 antitripsina) y transferrina. Por lo tanto, la Fracción IV del proceso de fraccionamiento de Cohn (específicamente las Fracciones IV_{1} y IV_{4}) puede servir como fuente de una preparación líquida que contiene transferrina en la presente invención.

Son conocidos en la técnica los métodos de obtención de fracciones de transferrina parcialmente purificadas.

Por ejemplo, la Patente de Estados Unidos No. 3.850.903 da a conocer un método de preparación de un concentrado de proteína que es rico en albúmina, transferrina y otras moléculas de \alpha- y \beta-globulina. Específicamente, la Patente 3.850.903 da a conocer un precipitado IV_{4} de Cohn que se trata con fosfato cálcico seguido de la precipitación selectiva con copolímeros en bloque de óxido de etileno y polímeros de polioxipropileno. Dado que el producto final contiene una variedad de proteínas del plasma, la descripción de 3.850.903 no proporciona un procedimiento para la obtención de producto de transferrina altamente purificado por sí mismo.

La Patente de Estados Unidos No. 4.841.026 describe un método para preparar una preparación de transferrina estéril, víricamente inactivada, no tóxica para la utilización en sistemas de cultivos celulares. El método descrito en la misma comprende la saturación de una fracción de Cohn que contiene transferrina con un exceso de hierro seguido por la eliminación de radicales libres de hierro y proteínas no deseadas mediante la filtración y la cromatografía de intercambio iónico. Para obtener el producto de transferrina final, el proceso descrito requiere un periodo de pasteurización de 10 horas a 60ºC.

La Patente de Estados Unidos No. 5.041.537 describe un método para preparar transferrina biológicamente activa, que comprende la precipitación de \gamma-globulina de la fracción de Cohn, IV, la ultrafiltración y el ajuste de la concentración iónica/proteína seguido del tratamiento con detergentes específicos. A continuación, la fracción se somete a una cromatografía de intercambio iónico en la que se adsorben todas las proteínas excepto la transferrina, es decir, la transferrina está contenida en la fracción contenida en el flujo. La fracción que contiene transferrina se concentra posteriormente y se filtra de forma estéril.

Los métodos de inactivación de virus asociados con las proteínas del plasma también son conocidos en la técnica. Por ejemplo, en la técnica se conoce que las proteínas del plasma se pueden esterilizar utilizando (1) inactivación por calor en los estados húmedos y secos, (2) detergentes, y (3) una combinación del tratamiento con \beta-propiolactona y radiación ultravioleta. Sin embargo, las proteínas del plasma son sensibles al calor y, por lo tanto, deben inactivarse con el calor junto con los estabilizantes. Ciertos estabilizantes pueden actuar para evitar la esterilización completa. Por consiguiente, los procedimientos de esterilización que utilizan productos químicos y/o radiación se consideran preferibles para aplicaciones que requieren la esterilización completa. Además, es posible que el tratamiento térmico de las preparaciones que contienen transferrina de lugar a la formación de agregados, dificultando potencialmente de esta manera la purificación y la utilización final del producto de transferrina. También se sabe que los virus pueden tener o no cubierta y que los métodos de inactivación vírica pueden ser eficaces para un tipo de virus, pero no para otro.

Por ejemplo, la Patente de Estados Unidos No. 4.540.573 ("la patente 5.73") da a conocer un método general para la obtención de derivados de proteína biológicamente activos sustancialmente libres de virus, que están sustancialmente libres de virus con cubierta aunque no se desnaturalizan mediante el proceso de inactivación del virus. Específicamente, se da a conocer un método en el que una composición que contiene proteínas, por ejemplo, sangre completa, se pone en contacto con un disolvente orgánico detergente (proceso "OSD") para inactivar los virus con cubierta contenidos en la misma. El método OSD tiene la ventaja de inactivar los virus de la hepatitis presentes en la composición que contiene las proteínas sin la sustancial desnaturalización de las proteínas de la misma. La patente '5,73 no da a conocer la purificación de una fracción que contiene transferrina.

Además, Soliman y otros, U.A.R.J.CHEM., 1971, vol. 14, No. 2 páginas 177-183, dan a conocer un método a escala media para la purificación de transferrina de suero humano y globulina IgG mediante una técnica cromatográfica y da a conocer la separación de \gamma-globulinas de las \beta-globulinas (transferrina) mediante la utilización de columnas cromatográficas.

En su tratado "Protein Purification Methods: A Practical Approach", NUEVA YORK: OXFORD UNIVERSITY PRESS, 1989, páginas 4-9 y 126-151, Harris y otros dan a conocer concentraciones tampón y el ajuste de la medida de los filtros, entre otros. Sin embargo, no proporcionan una guía sobre cómo fabricar/utilizar una columna que adsorbe transferrina.

Finalmente, la solicitud WO 96 14862 A se refiere a una asociación de transferrinas y da a conocer una composición biológicamente activa eficaz en el control de la reacción inmunológica de un huésped frente a células o tejidos antigénicos de un donante, caracterizada porque un principio activo que consiste en una asociación de transferrinas, obtenidas a partir de un grupo de donantes suficientes para permitir que dicha asociación de transferrinas contengan toda la información de fenotipos requerida para asegurar una inducción no específica de la tolerancia inmunológica específica frente a antígenos de una donante halogénico determinado en un huésped inmunodepresivo injertado con dichos antígenos, después de que al huésped se le administrara una cantidad de dicha asociación de transferrinas eficaces para inducir dicha tolerancia inmunológica específica.

Características de la invención

Un objetivo de la presente invención es proporcionar un método para producir productos de transferrina con un rendimiento elevado y pureza elevada. El método es sencillo y económico para la producción a escala industrial de productos de transferrina de pureza elevada.

Un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar un método de preparación de productos de transferrina altamente purificados que están sustancialmente libres de contaminantes víricos con cubierta y sin cubierta.

Un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar un proceso en el cual el producto de transferrina se puede purificar y esterilizar antes de la colocación en un recipiente final.

La presente invención se refiere a un método de purificación de una preparación líquida que contiene transferrina, de manera que el método comprende el inicio con una preparación líquida con transferrina parcialmente purificada. A continuación, la fracción que contiene transferrina parcialmente purificada se concentra y se disminuye la fuerza iónica de la misma. La fracción que contiene transferrina se trata químicamente para inactivar los virus con cubierta. A continuación, la fracción que contiene transferrina se aplica a un medio de intercambio iónico en el que se adsorbe la transferrina. A continuación, una fracción que comprende transferrina se eluye de la columna de intercambio iónico. En realizaciones preferentes, la transferrina se satura con hierro y se nanofiltra para eliminar los virus sin cubierta y se obtiene un producto estéril antes del empaquetamiento y, si se desea un producto seco, la transferrina se liofiliza en un recipiente final. El producto liofilizado se puede reconstituir en un tiempo posterior.

Descripción detallada de la invención

La fracción de proteínas de partida de la presente invención es una fracción de proteínas que contiene transferrina que ha sido parcialmente purificada, tal como se ha descrito anteriormente. Preferentemente, es una Fracción de Cohn IV_{1} y IV_{4} parcialmente purificada.

Las etapas del proceso requeridas y óptimas de la presente invención son las siguientes:

1. Concentración - El material de partida derivado de las fracciones IV_{1} y IV_{4} que comprende una preparación líquida con transferrina parcialmente purificada se concentra, en primer lugar, antes del posterior procesado. En una realización preferente, la preparación líquida con transferrina parcialmente purificada se concentra mediante la ultrafiltración con flujo tangencial, tal como la disponible de FILTRON.

La preparación líquida con transferrina parcialmente purificada se concentra entre 15 mg/ml y 40 mg/ml de transferrina o preferentemente 30 mg/ml. Esta etapa puede ser una etapa opcional cuando el material de partida tiene este nivel de concentración.

2. Diafiltración - Después de concentrar la preparación líquida con transferrina parcialmente purificada, la fuerza iónica de la preparación disminuye por debajo de 5 mS. La fuerza iónica se reduce de forma suficiente, de manera que la transferrina se adsorberá en una columna cromatográfica utilizada durante la posterior etapa de cromatografía. En una realización preferente, la fuerza iónica se disminuye mediante diafiltración, por ejemplo, utilizando un tampón Tris de 22,5 mM a 27,5 mM hasta obtener una conductividad de, aproximadamente, 2 mS. En la realización más preferente, la fuerza iónica se disminuye utilizando tampón Tris 25 mM, pH 7,5.

3. Tratamiento químico de inactivación vírica - La preparación líquida con transferrina se trata con productos químicos para inactivar los virus con cubierta en un punto anterior a la cromatografía de intercambio iónico. En una realización preferente, la preparación se trata con disolventes orgánicos conocidos con o sin tensoactivos para inactivar los virus. En una realización más preferente, la preparación se trata con disolvente orgánico de tri-n-butil fosfato, más preferentemente, la preparación se trata con 0,3 \pm 0,015% de tri-n-butil fosfato y 1,0 \pm 0,05% de Polisorbato 80 para inactivar los virus.

4. Cromatografía de intercambio iónico - A continuación, la preparación se somete a cromatografía de intercambio iónico en la que la transferrina se adsorbe en una resina de intercambio aniónico. En una realización preferente, la resina de la cromatografía de intercambio aniónico es DEAE-650 (Toso Hass) o cualquier otra resina DEAE (DEAE = dietilaminoetilo). En la realización más preferente, la resina de la cromatografía de intercambio aniónico es DEAE-650. En una realización preferente, la transferrina se eluye con un tampón que contiene NaCl, tal como NaCl de 30 a 40 mM en tampón Tris 25 mM. En la realización más preferente, la transferrina se eluye con NaCl 40 mM, tampón Tris 25 mM.

5. Segunda concentración - A continuación, se concentra el eluido que contiene transferrina. En una realización preferente, el eluido se concentra mediante ultrafiltración con flujo tangencial, al igual que en la etapa (1). En una realización preferente, el eluido se concentra hasta 9-11 mg/ml de transferrina. En la realización más preferente, el eluido se concentra hasta, aproximadamente, 10 mg/ml de transferrina, de la que el contenido de proteína total es transferrina al 95%, preferentemente transferrina al 99%, tal como se describe en la descripción del producto en la Tabla 1.

6. Conversión - A continuación, el concentrado que contiene transferrina se puede saturar con hierro (conversión de apo-transferrina a holo-transferrina). En una realización preferente, el concentrado se satura con hierro mediante cloruro férrico o cloruro ferroso. En una realización más preferente, el concentrado se satura con hierro mediante la adición de cloruro férrico, de manera que Hierro/Tf = 1,4 \mug/mg a 5,0 \mug/mg en presencia de bicarbonato sódico de 10 mM a 50 mM, con un mezclado de 2 a 16 horas. En la realización más preferente, el concentrado se satura con hierro mediante la adición de cloruro férrico de manera que Hierro/Tf = 3,0 \mug/mg en presencia de bicarbonato sódico 10 mM, con un mezclado de 2 horas.

7. Segunda diafiltración - La fuerza iónica del producto saturado se reduce por debajo de 5 mS. En una realización preferente, la fuerza iónica se disminuye mediante diafiltración. En una realización más preferente, la fuerza iónica se disminuye utilizando un tampón Tris de 22,5 mM a 27,5 mM. En la realización más preferente, la fuerza iónica se disminuye utilizando tampón Tris 25 mM.

8. Filtración estéril - El producto saturado se puede esterilizar adicionalmente mediante filtración. En una realización preferente, el producto saturado se filtra a través de un filtro que no es mayor de 0,22 \mum. En la realización más preferente, el producto saturado se filtra a través de un filtro de 0,22 \mum.

9. Filtración vírica - A continuación, el producto saturado se nanofiltra para eliminar los virus. En una realización preferente, el producto saturado se filtra a través de un filtro de 15 nm o inferior. En este punto, en la realización más preferente, el producto saturado se filtra a través de un filtro de 15 nm.

10. Liofilización - El producto en masa final se puede colocar en un recipiente final y liofilizar.

Tal como se reconocerá por los técnicos en la materia, el método descrito en la presente invención proporciona un método sencillo y económico de producción de transferrina altamente purificada. El método sólo requiere dos piezas principales de equipamiento y tres tampones.

Ejemplos

La presente invención se ilustra en los siguientes ejemplos.

A. Ejemplo 1

Una fracción que comprende transferrina se puede obtener utilizando un proceso para purificar el inhibidor de alfa-I-proteinasa (en adelante "\alpha_{1}-PI"). Específicamente, \alpha_{1}-PI se puede purificar a partir de las fracciones de Cohn IV_{1} y IV_{4} siguiendo las etapas descritas a continuación. La etapa inicial de cromatografía de intercambio aniónico de aminas cuaternarias (QAE) genera un flujo a través de la preparación que contiene transferrina. A pesar de que la preparación está sustancialmente libre de albúmina, no es transferrina altamente purificada y habitualmente se descarta como producto de desecho. A continuación, se indica un proceso para purificar \alpha_{1}-PI y obtener, de esta manera, un material de partida para la presente invención:

1.: Fracción de Cohn IV_{1} y IV_{4};

2.: Extracción de agua de las fracciones de Cohn (pH aproximadamente de 8,0);

3.: Fraccionamiento con PEG al 15% y ZnCl_{2} 0,5 mM;

4.: El sobrenadante del fraccionamiento de la etapa (3) se somete a un segundo fraccionamiento utilizando ZnCl_{2} (10 mM);

5.: El precipitado de la etapa (4) se resolubiliza con EDTA;

6.: El precipitado resolubilizado se pasa sobre un medio de adsorción de intercambio iónico para la adsorción de \alpha_{1}-PI;

7.: El flujo a través de la cromatografía de intercambio iónico de la etapa (6) comprende una fracción de transferrina parcialmente purificada.

La fracción de transferrina parcialmente purificada, obtenida tal como se indica anteriormente, se puede purificar adicionalmente utilizando los métodos de la presente invención para obtener un producto de transferrina estéril y sustancialmente libre de virus.

B. Ejemplo 2

A continuación se indica un ejemplo específico de un proceso para la producción de una preparación que contiene transferrina para utilizar como material de partida en la presente invención.

Se resuspendieron 20 kg de precipitado de fracciones de Cohn IV_{1} y IV_{4} en 180 kg de agua para inyección ("WFI") a 3,8ºC y el pH se ajustó a 8,94. Después de resuspender el precipitado, se añadieron 242,3 g de Tris, 6,7 kg de NaCl 1 M y 35,4 kg de polietilenglicol ("PEG"), y la solución se mezcló durante 60 minutos. A continuación, se añadieron 2,2 kg de ZnCl_{2} 100 mM, y la suspensión se ajustó a pH 7,92 y se mezcló durante 60 minutos adicionales a 0-8ºC.

El precipitado PEG/ZnCl_{2} que se formó se extrajo pasando la suspensión a través de una prensa de filtro a 0-8ºC después de la adición de 977 g de del filtro de Ayuda filtra-Cell BH 20 (suministrado por Celite de Alemania). La prensa de filtro se lavó antes y después de filtrar con 30 kg de NaCl 150 mM, PEG al 15% p/p, ZnCl_{2} 0,5 mM, pH 8,0.

Se añadieron 27,8 kg de ZnCl_{2} 100 mM al sobrenadante y la solución se ajustó a pH 8. El precipitado que se formó en presencia del ZnCl_{2} se recuperó mediante centrifugación en un centrifugador Sharples. El precipitado de ZnCl_{2} se resolubilizó en 20 kg de EDTA 50 mM y se ajustó a una conductividad de 6,48 mS y a un pH de 7,97.

El precipitado de ZnCl_{2} resolubilizado se aplicó a continuación a un medio cromatográfico QAE (suministrado por Toso Hass) empaquetado en una columna de 20 L con un diámetro interno de 250 cm. El medio QAE se equilibró a 4ºC con agua fría para inyección ("CWFI"). A continuación el \alpha_{1}-PI se absorbió en el medio cromatográfico. A continuación, el medio cromatográfico se lavó con 60 L de NaCl 50 mM, fosfato sódico 10 mM, pH 7,92. El producto de transferrina parcialmente purificado está contenido en el flujo y las fracciones de lavado en la etapa de cromatografía descrita anteriormente. A pesar de que se considera frecuentemente como un producto de desecho, este producto de transferrina parcialmente purificado se puede purificar adicionalmente utilizando los métodos de la invención reivindicada.

C. Ejemplo 3

El siguiente ejemplo ilustra los métodos de la presente invención. Una fracción de transferrina parcialmente purificada derivada de fracción de Cohn IV_{1} o IV_{4} se utiliza como un material de partida. Se siguieron las siguientes etapas.

Se concentraron (5x) 2 L del material de partida hasta aproximadamente 400 ml mediante ultrafiltración (UF) con fluido tangencial con una membrana con un tamaño de corte según la masa molecular en base a solutos solubles (NMWC) de 10 a 30 kD. El concentrado se diafiltró con 5 partes en volumen ("p.v.") de tampón Tris 25 mM pH 7,5. Esto redujo su fuerza iónica en la preparación para la cromatografía de intercambio iónico. La solución OSD con tri-n-butil fosfato (TNBP) al 3% y Polisorbato-80 al 10% se añadió al producto siguiendo el protocolo de inactivación vírica descrito en la Patente de Estados Unidos No. 4.450.573 y se incubó a 26ºC durante 6 horas o más. Las concentraciones finales en la preparación son las siguientes: TNBP = 0,3%, Polisorbato 80 = 1,0%.

Se prepararon 500 ml de resina DEAE-650 empaquetada en una columna cromatográfica para utilizar mediante equilibrio con el tampón de producto. Se bombearon a través de la columna 4 volúmenes de columna (c.v.) de tampón Tris 25 mM pH 7,5 (2 L) a una LFR de 0,5 (Operaciones 1 y 2) y 0,8 (Operación 3) ml/cm^{2}/min. Estas velocidades de flujo se mantuvieron durante la totalidad de la etapa cromatográfica para cada operación. Para la operación (1), el proceso de la cromatografía se realizó a 5ºC, el resto de operaciones se realizaron a temperatura ambiente
(23-25ºC).

Se cargaron 330 ml del concentrado de transferrina en la columna. Para eliminar las proteínas contaminantes y la OSD residual, la columna se lavó con 4, 8 y 12 c.v. de tampón Tris 25 mM pH 7,5 para las operaciones 1, 2 y 3, respectivamente. El eluido de lavado de la columna se monitorizó espectrométricamente a 280 nm y se dibujó en un gráfico de registro.

La transferrina se eluyó utilizando tampón Tris 25 mM pH 7,5 con NaCl 40 mM. Para recoger el eluido rico en transferrina, el eluido se desvió a un recipiente de recogida en la primera desviación de la aguja en el gráfico de registro. La recogida del eluido se detuvo cuando la aguja regresó a la línea base. Se recogieron, aproximadamente, 1,6 L de eluido rico en transferrina para cada operación. Después de recuperar la transferrina, se lavó la columna con 4 c.v. de tampón Tris 25 mM pH 7,5 que contenía NaCl 2 M.

A continuación, el eluido de transferrina se concentró mediante ultrafiltración de 30 kD hasta, aproximadamente, 300 ml a 10 mg de transferrina/ml. Para convertir el producto a holo-transferrina (hierro saturado), se añadieron una solución de cloruro férrico hexahidratado 7,2 mM pH 2,7 y una solución de bicarbonato sódico 200 mM pH 8,0 al producto para obtener hierro/transferrina = 3 \mug/mg y bicarbonato sódico = 10 mM. A continuación, el producto se incubó a temperatura ambiente (23-25ºC) durante 2 horas.

Se realizó una diafiltración del producto con 6 c.v. de Tris 25 mM pH 7,5 para eliminar el exceso de hierro y la elución de la sal del tampón. A continuación, el producto se filtró a través de un filtro Millipore de 0,22 \mum de área superficial 100 cm^{2} a una velocidad de flujo de 4 ml/min. Esta filtración eliminó las bacterias y otras micropartículas en la preparación para la nanofiltración. El filtro Asahi Planova 15 nm se ajustó para una filtración frontal y el producto se bombeó de 0,5 a 1,0 ml/min. Esto produjo un volumen final de, aproximadamente, 300 ml.

Los recipientes finales del lote se consiguieron rellenando viales de 20 ml con 10 ml (100 mg de transferrina) de la solución con el volumen final, y se liofilizaron. El producto se liofilizó durante un total de 90 horas.

Los datos experimentales de optimización del proceso a partir de las etapas de cromatografía, diafiltración, y conversión han conducido a la definición del siguiente método. El material de partida con una concentración de Tf de 3 mg/ml se concentra mediante UF con una membrana de 30 kD hasta 15 mg/ml. A continuación, éste se diafiltra con 5 p.v. de tampón Tris 25 mM pH 7,5. A continuación, el concentrado se trata con OSD siguiendo el protocolo descrito en la Patente de Estados Unidos No. 4.540.573 y se cargó en una columna de resina DEAE-650. La cromatografía se realiza a temperatura ambiente (23 a 25ºC) a una LFR de 1,0 cm/min. La Tf se eluyó con tampón Tris 25 mM pH 7,5 con NaCl 0,04 M. El eluido se concentra mediante UF hasta una concentración de Tf de 10 mg/ml y se mezcla con soluciones de hierro y bicarbonato sódico hasta una proporción de hierro/Tf de 3 mg/mg, y bicarbonato de 10 mM a temperatura ambiente. A continuación, el producto se diafiltra con 5 p.v. de tampón Tris 25 mM pH 7,5. A continuación, el material se filtra de forma estéril a través de un filtro de 0,22 \mum y se filtran los virus a través de un filtro de 15 nm formando los viales de volumen final. A continuación, se rellenan viales de 20 ml con 5 ml de del volumen final de 10 mg/ml y se liofilizan durante 90 horas siguiendo el método de liofilización para formar el recipiente final.

Las características del producto obtenido utilizando el proceso descrito se indican en la Tabla 1. El producto de transferrina tiene, como mínimo, un 95% de pureza y contiene una proporción molar de 2 \mug/mg hierro/transferrina, con una concentración de Tf de, aproximadamente, 10 mg/ml.

TABLA 1 Características del producto

Apariencia	Sólido rojizo
Solubilidad	< 5 min
Partículas	No visibles
pH	7,5 \pm 0,3
Hierro	1,2 \pm 0,2 \mug/mg Tf
SDS-PAGE	Una banda principal
Transferencia Western	Una banda principal
HPLC	> 95% de área
Zinc	0,8 \mug/mg
PEG	\leq 20 \mug/mg Tf
TNBP	\leq 0,16 \mug/mg Tf
Tween-80	\leq 30 \mug/mg Tf
Endotoxina	< 1 EU/mg Tf
Humedad	< 3%
Transferrina	50 mg/vial 5 mg/ml

Se entiende que la descripción y Ejemplos están destinados a ilustrar la presente invención.

Claims

1. Método de purificación de transferrina, que comprende las etapas de

a) concentrar una preparación de transferrina parcialmente purificada;

b) disminuir la fuerza iónica de la preparación de transferrina suficiente para la posterior adsorción de transferrina en un medio cromatográfico de intercambio iónico;

c) tratar la preparación de transferrina antes de la siguiente etapa (d) con un compuesto orgánico para inactivar los virus con cubierta;

d) someter la preparación a un medio cromatográfico de intercambio iónico, con una fuerza iónica suficiente para asegurar que se adsorbe la transferrina;

e) eluir la transferrina del medio de intercambio iónico de la etapa (d);

f) concentrar el eluido resultante; y

g) filtrar el eluido concentrado para eliminar las partículas de virus para obtener una preparación de transferrina estéril sustancialmente libre de virus con cubierta y sin cubierta.

2. Método, según la reivindicación 1, en el que el eluido concentrado de transferrina de la etapa (e) se satura con hierro.

3. Método, según la reivindicación 2, en el que la fuerza iónica del eluido saturado disminuye.

4. Método, según la reivindicación 1, en el que dicha preparación de transferrina parcialmente purificada de la etapa (a) está 5 veces concentrada.

5. Método, según la reivindicación 1, en el que la fuerza iónica se disminuye mediante diafiltración.

6. Método, según la reivindicación 3, en el que la fuerza iónica se disminuye mediante diafiltración.

7. Método, según la reivindicación 5, en el que la fuerza iónica de la preparación de transferrina se disminuye mediante diafiltración con tampón Tris 25 mM.

8. Método, según la reivindicación 6, en el que la fuerza iónica de la preparación de transferrina se disminuye mediante diafiltración con tampón Tris 25 mM.

9. Método, según la reivindicación 1, en el que el compuesto orgánico para inactivar virus es un disolvente orgánico detergente.

10. Método, según la reivindicación 1, en el que la transferrina se eluye en la etapa (d) utilizando NaCl 0,04 M, tampón Tris 25 mM.

11. Método, según la reivindicación 1, en el que dicha concentración de la etapa (a) se lleva a cabo mediante ultrafiltración con flujo tangencial.

12. Método, según la reivindicación 1, en el que dicho eluido de la reivindicación 1 se concentra hasta 10 mg/ml de proteína en la etapa (e).

13. Método, según la reivindicación 2, en el que se utiliza cloruro férrico para saturar la preparación de transferrina.

14. Método, según la reivindicación 1, en el que dicha filtración de la preparación de transferrina en la etapa (g) se lleva a cabo utilizando un filtro de 0,22 \mum para obtener una preparación de transferrina estéril.

15. Método, según la reivindicación 1, en el que dicha filtración de la preparación de transferrina en la etapa (g) se lleva a cabo utilizando un filtro de 15 nm para obtener una preparación de transferrina que está sustancialmente libre de virus sin cubierta.

16. Método, según la reivindicación 1, en el que dicha concentración en la etapa (f) se lleva a cabo mediante ultrafiltración con flujo tangencial.

17. Método, según la reivindicación 1, en el que dicha concentración en las etapas (a) y (f) se lleva a cabo mediante ultrafiltración con flujo tangencial.