ES2249917T3 - Resolucion de trans-2-(alcoxicarboniletil9-lactamas utiles en la sintesis de 1-(4-fluorofenil)-3(r)-3(s)-hidroxi-3-(4-fluorofenil)-propil)-4(s)-(4-hidroxifenil)-2-azetidinona. - Google Patents
Resolucion de trans-2-(alcoxicarboniletil9-lactamas utiles en la sintesis de 1-(4-fluorofenil)-3(r)-3(s)-hidroxi-3-(4-fluorofenil)-propil)-4(s)-(4-hidroxifenil)-2-azetidinona.Info
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Abstract
Un procedimiento para la resolución hidrolítica microbiológica o enzimática de una trans-2- (alcoxicarboniletil)-lactama racémica de la fórmula I en donde R es alquilo C1-C7, 2, 2, 2-trifluoroetilo o metoxietoxietilo y R1 es hidrógeno o un grupo protector seleccionado del grupo que consta de bencilo, trimetilsililo, t-butildimetilsililo y acetilo, que comprende: añadir una lactama racémica de fórmula I a microorganismos en medio, medio y tampón, medio y disolvente, o medio y una mezcla de tampón y disolvente, o a enzimas en tampón, disolvente, o una mezcla de los mismos, para obtener un compuesto ópticamente enriquecido de las fórmulas lb o Ila en donde R y R1 son como se definen anteriormente; e hidrolizar un éster de ácido carboxílico de la fórmula lb para obtener un compuesto de fórmula Ila.
Description
Resolución de
trans-2-(alcoxicarboniletil)-lactamas útiles
en la síntesis de
1-(4-fluorofenil)-3(R)-3(S)-hidroxi-3-(4-fluorofenil)-propil)-4(S)-(4-hidroxifenil)-2-azetidinona.
Las
trans-2-(alcoxicarboniletil)-lactamas y las
trans-2-(carboxi-etil)-lactamas
son productos intermedios en la síntesis de
1-(4-fluorofenil)-3(R)-[3-(S)-hidroxi-3-(4-fluorofenil)-propil)]-4(S)-(4-hidroxifenil)-2-azetidinona,
un agente que disminuye el nivel del colesterol descrito en la
patente de EE.UU. 5.767.115.
La patente de EE.UU. 5.618.707 describe la
reducción microbiana estereoselectiva de un producto intermedio
cetónico (ácido
4-(4-fluoro-benzoil)butírico
o un conjugado de feniloxazolidona del mismo) al producto intermedio
hidroxílico correspondiente usado en la preparación de la
azetidinona. Los microorganismos preferidos usados en el
procedimiento son Zygosaccharomyces bailii o Schizosaccharomyces
octosporus.
Tetrahedron Letters, vol, 38, nº 4, 1997, páginas
643-646 describe el sometimiento de dos clases de
\beta-lactamas 3,4-disustituidas
que tienen respectivamente sustituyentes de
trans-3-carboetoxi y
cis-3-acetoximetilo a hidrólisis enzimática
empleando esterasas de hígado de cerdo (abreviadamente PLE, por la
expresión inglesa pig liver esterases) y lipasa de páncreas
de cerdo (abreviadamente PPL, por la expresión inglesa pig
pancreas liver).
El procedimiento de la presente invención se
refiere a la resolución hidrolítica microbiológica o enzimática de
una
trans-2-(alcoxicarboniletil)-lactama
racémica de fórmula I:
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\vskip1.000000\baselineskip
en donde R es alquilo
C_{1}-C_{7},
2,2,2-trifluoroetilo o metoxietoxietilo y R^{1} es
hidrógeno o un grupo protector seleccionado del grupo que consta de
bencilo, trimetilsililo, t-butildimetilsililo
(TBDMS) y acetilo, para obtener un compuesto ópticamente
enriquecido de las fórmulas Ib ó
IIa:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Cuando se obtiene un éster de ácido carboxílico
de fórmula Ib, el procedimiento comprende además la hidrólisis del
compuesto resultante de fórmula Ib para obtener un ácido de fórmula
IIa. El ácido de 3R,4S-lactama resultante es útil
como producto intermedio en la preparación de
1-(4-fluorofenil)-3(R)-[3(S)-hidroxi-3-(4-fluorofenil)propil)]-4(S)-(4-hidroxifenil)-2-azetidinona.
La resolución comprende el uso de microorganismos
(obtenidos de fuentes ambientales y colecciones de cultivos, por
ejemplo, la American Type Culture Collection (ATCC)) en medio, medio
y tampón, medio y disolvente, o medio y una mezcla de tampón y
disolvente, o el uso de enzimas en tampón, disolvente o una mezcla
de los mismos, a los cuales se les añade
trans-2-(alcoxicarboniletil)-lactama
racémica, de manera que se puede formar, acumular o aislar un
compuesto que tiene un grupo éster o ácido con la estereoquímica
deseada. La resolución es bien directa o bien sustractiva,
dependiendo del microorganismo o enzima que se use.
Se ha hallado que los microorganismos
seleccionados del grupo que consta de los siguientes géneros son
útiles en la resolución directa: Aspergíllus, Bacillus, Candida,
Cunninghamella, Debaryomyces, Mycobacterium, Paecilomyces,
Penicillium, Rhodobacter, Streptomyces y Thrichothecium. Se
prefieren las siguientes especies de los géneros anteriores:
Aspergillus alliaceus, niger, niveus y terreus; Bacillus
sphaericus; Candida parapsilosis y rugosa; Cunninghamella
homothallica; Debaryomyces hansenü; Mycobacterium fortuitum;
Paecilomyces marquanii; Penicillium implicaturn; Rhodobacter
sphaeroides; Streptomyces spectabilis; y Thrichothecium
roseum.
Se ha hallado que los microorganismos
seleccionados del grupo que consta de los siguientes géneros son
útiles en la resolución sustractiva: Comamonas, Curvularia,
Mucor, Nocardia y Rhodococcus. Se prefieren las siguientes
especies de los géneros anteriores: Comamonas testosteroni;
Curvularia brachyspora y geniculata; Mucor circinelloides y
racemosus; Nocardia corallina; y Rhodococcus erythropolis,
Rhodochrous y otras especies del mismo.
Las enzimas comercialmente obtenibles adecuadas
para su uso en la resolución de esta invención incluyen Lipasa D de
Amano (Rhizopus delemar); Lipasa FAP-15 de
Amano (Rhizopus javanicus); Lipasa MAP-10 de
Amano (Mucor javavicus); Lipasa N de Amano (Rhizopus
niveus); Esterasa/Lipasa bacteriana soportada en BE1 de
Interspex (Pseudomonas mandocino); Lipasa
A-10 de Nagase (Rhizopus javonicus); Novo SP
525 (Candida antarctica, tipo B); Lipasa
LPL-701 y LPL-311, tipo A de Toyobo
Lipoprotein (Pseudomonas sp.); Lipasa de Seikagaki
(Rhízopus delemar); Lipasa WT de Kinzi & Payne
(Rhizopus sp.); Lipasa de Svedas (Rhizopus oryzae);
Lipasa A-10 de Sawa (Rhízopus japonicus);
Sawa LPL-701 y LIP 301 (Pseudomonas sp.);
Chirazyme^{TM} L2 de Boehringer-Mannheim
(Lipasa, tipo B de Candida antarctica); Chirazyme^{TM} L4 y
L6 de Boehringer-Mannheim (Pseudomonas sp.);
Lipasa/Esterasa fúngica
ICS-16-FL1 de Interspex (Rhizopus
oryzae); Lipasa de Fluka (Aspergilius niger);
LIP-300/301 y LIP-321 de
Toyobo (Pseudomonas sp.); Lipasa LPL 311, tipo A de
Toyobo Lipoprotein (Pseudomonas sp.); Novo Lipozyme
IM-60 (Mucor mieheu); y Lipasa tipo XI de
Sigma (Rhizopus arrhizus).
Las enzimas preferidas son hidrolasas de
Pseudomonas sp. (LPL 311, tipo A de Toyobo,
LIP-301/LIP300 de Toyobo, LPL 701 de Toyobo,
Chirazyme^{TM} L6 de Boehringer-Mannheim).
En particular, la presente invención se refiere a
la resolución directa de
trans-1-(4-fluorofenil)-3-(alcoxicarbonile-
til)]-4(S)-(4-hidroxifenil)-2-azetidinona, que comprende añadir dicho compuesto a un microorganismo en medio, medio y tampón, medio y disolvente, o medio y una mezcla de tampón y disolvente, especialmente cuando el microorganismo es Aspergillus terreus o alliaceus, o Candida parapsilosis, incubar la mezcla resultante y aislar un compuesto de fórmula IIa
til)]-4(S)-(4-hidroxifenil)-2-azetidinona, que comprende añadir dicho compuesto a un microorganismo en medio, medio y tampón, medio y disolvente, o medio y una mezcla de tampón y disolvente, especialmente cuando el microorganismo es Aspergillus terreus o alliaceus, o Candida parapsilosis, incubar la mezcla resultante y aislar un compuesto de fórmula IIa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la cual R^{1} es como se
define
anteriormente.
En particular, la presente invención se refiere
también a la resolución sustractiva de
trans-1-(4-fluorofenil)-3-(alcoxicarboniletil)]-4(S)-(4-hidroxifenil)-2-azetidi-nona,
que comprende añadir dicho compuesto a un microorganismo en medio,
medio y tampón, medio y disolvente, o medio y una mezcla de tampón y
disolvente, especialmente cuando el microorganismo es Rhodococcus
rhodochrous u otras especies de Rhodococcus, o a una
enzima en un disolvente, tampón o una mezcla de los mismos,
especialmente cuando la enzima es una hidrolasa de Pseudomonas
sp., incubar la mezcla resultante y aislar un compuesto de
fórmula Ib:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la cual R y R^{1} son como se
definen anteriormente. El compuesto de la fórmula Ib se hidroliza
luego para eliminar el grupo éster de ácido carboxílico, R, para
obtener un compuesto de fórmula
IIa.
La resolución hidrolítica de la presente
invención se resume en el siguiente esquema de reacción:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Este esquema muestra un método para realizar una
hidrólisis directa, usando un microorganismo o una enzima, en donde
se hidroliza un éster de lactama racémica de fórmula I para generar
ácido (3R,4S)-IIa enantioméricamente enriquecido que
se separa fácilmente del éster (3S,4R) de ácido carboxílico de
fórmula Ia que no ha reaccionado. Alternativamente, una resolución
sustractiva del éster de lactama recémica de fórmula I produce el
ácido de fórmula IIb y el éster (3R,4S) de ácido carboxílico de
fórmula Ib enantioméricamente enriquecido que se hidroliza
susiguientemente para generar (3R,4S)-IIa.
Subsiguientemente se usa el (3R,4S) enantioméricamente enriquecido
para sintetizar
1-(4-fluorofenil)-3-(R)-[3-(S)-hidroxifenil)-2-azetidinona,
usando procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo
convirtiendo el ácido de la fórmula IIa en el correspondiente
cloruro de ácido, haciendo reaccionar el cloruro de ácido con un
derivado de 4-fluorofenilo y reduciendo la cetona al
alcohol, como se describe en el método H de la patente de EE.UU.
5.767.115.
La resolución hidrolítica se lleva a cabo
añadiendo una trans-2-(al
coxicarboniletil)-lactama racémica al medio, medio y
tampón, medio y disolvente, o medio y una mezcla de tampón y
disolvente que contiene microorganismos, o a disolvente, tampón, o
una mezcla de los mismos que contiene enzimas. La bioconversión se
puede realizar a temperaturas en el intervalo comprendido entre
aproximadamente 20ºC y aproximadamente 40ºC; la reacción microbiana
se realiza preferiblemente a una temperatura comprendida entre la
ambiente y hasta 30ºC, y la reacción enzimática se realiza
preferiblemente a una temperatura comprendida entre la ambiente y
hasta 37ºC. El valor del pH inicial de la reacción se ajusta para
que esté en el intervalo de entre aproximadamente pH 5,0 y
aproximadamente 9,0, preferiblemente pH 7,0.
La concentración inicial del éster de
trans-lactama racémica de fórmula I en la reacción microbiana
puede variar entre aproximadamente 0,5 g/I y aproximadamente 5 g/l,
y es preferiblemente 0,5 g/l. La duración de la hidrólisis
microbiana puede variar de aproximadamente 18 a aproximadamente 96
horas y es preferiblemente de aproximadamente 48 horas.
La concentración inicial del éster de
trans-lactama de fórmula I en la reacción mediada por enzimas
puede variar entre aproximadamente 5 mg/ml y aproximadamente 200
mg/ml, y es preferiblemente 25 mg/ml. La duración de la hidrólisis
enzimática puede variar de aproximadamente 24 a aproximadamente 192
horas.
Los medios de fermentación, los tampones y los
disolventes adecuados son conocidos por los expertos en la técnica.
Los medios de fermentación contienen típicamente una fuente de
carbono e hidrógeno o sus mezclas, usando ingredientes tales como
extractos de levadura, caldo nutriente, dextrosa (cerelosa),
dextrina de patata blanca, harina de soja, peptona y otros
componentes conocidos en la técnica. Los tampones típicos son tampón
de fosfato (por ejemplo, 0,1 M a pH 7), tampones MES (ácido
2-[N-morfolino]etano-sulfónico),
Bis-Tris(bis[2-hidroxietil]iminotris[hidroximetil]-metano),
PIPES (ácido
1,4-piperazin-dietanosulfónico),
HEPES (ácido
N-[2-hidroxietil]piperazin-N'-[2-etanosulfónico],
TRIS (tris(hidroxi-metil)aminometano)
y MOPS (ácido 3-[N-morfolino]propanosulfónico
(por ejemplo, 0,1 M a pH 7). Los disolventes típicos son
acetonitrilo, acetona, éter etílico, isopropanol,
t-butano, alcohol isoamílico,
p-dioxano, éter isopropílico, dimetilsulfóxido,
terc.butilmetil-éter (TBME), tolueno, tetrahidrofurano y
CH_{2}Cl_{2}. Las resoluciones microbianas se llevan a cabo
preferiblemente en medios de fermentación y las resoluciones
enzimáticas se llevan a cabo preferiblemente en un tampón con un
co-disolvente; un co-disolvente
preferido para resoluciones enzimáticas es TBME.
Al final de la hidrólisis, se pueden extraer
ácidos o ésteres ópticamente enriquecidos, usando disolventes
orgánicos tales como acetato de etilo (EtOAc), TBME,
CH_{2}Cl_{2} y similares. Se puede usar también adsorción a
resinas, cromatografía y otros métodos físicos conocidos en la
técnica, para el aislamiento de ácidos o ésteres ópticamente
enriquecidos.
El éster de ácido carboxílico de la fórmula Ib se
puede hidrolizar al ácido correspondiente de fórmula IIa, usando
métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo por tratamiento
con una base adecuada, por ejemplo, LiOH, como se describe en la
patente de EE.UU. 5.767.115.
Los ejemplos siguientes demuestran la evaluación
de microorganismos y enzimas en la hidrólisis de esta invención y la
preparación de cantidades de miligramos de compuestos de las
fórmulas IIa y Ib.
A continuación se describe el método general para
identificar la hidrólisis microbiana de éster metílico de la
trans-lactama racémica de fórmula I, para su uso en la
generación del ácido IIa.
Se desarrollaron cultivos de siembra de levadura,
hongos filamentosos y bacterias, en matraces de 125 ml o 300 ml que
contenían 25 ml o 50 ml de medios YPD (1% de extracto de levadura,
2% de peptona, 2% de dextrosa; pH 5,5), SIM6 (3,5% de harina de
soja, 5% de dextrina de patata blanca, 0,5% de cerelosa, 2 mg/l de
cloruro de colbato, 0,5% de carbonato de calcio; pH 6,0) y NYC (0,8%
de caldo nutriente, 2% de extracto de levadura, 2% de cerelosa; pH
7,0) respectivamente, durante 72 horas a 30ºC con agitación
(175-250 rpm) antes de la inoculación (4% en v/v) en
fermentaciones en matraces (25 ml de YPD/matraz de 125 ml para
levadura y hongos filamentosos ó 25 ml de NYC/matraz de 125 ml para
bacterias) que se incubaron a 30ºC con agitación (250 rpm). En todas
las fermentaciones, el pH del medio se ajustó antes de la
inoculación, pero no se controló durante la propagación de los
cultivos y la hidrólisis de los sustratos. La resolución microbiana
se inició añadiendo 0,5 g/l de éster metílico de
trans-lactama de fórmula I disuelto en etanol (25 mg/ml),
directamente a los cultivos tras 24 horas de desarrollo. Se
extrajeron muestras del caldo de fermentación con TBME después de
24-72 horas de incubación con sustrato y se
analizaron por HPLC de fase inversa. En la Tabla 1 se resumen los
cultivos preferidos que muestran la hidrólisis selectiva que genera
el ácido de fórmula IIa.
| Cultivo | Cepa Nº | Sustrato | Producto | % ee | % de |
| (ATCC) | rendtº | ||||
| A. terreus | 10020 | Racemato I protegido | IIa: ácido (3R,4S) | 100 | 9 |
| 20542 | con bencilo | protegido con bencilo | 91 | 23 | |
| 24839 | 91 | 35 | |||
| Penicillium implicatum | SPR | Racemato I protegido | IIa: ácido (3R,4S) | 100 | 6 |
| 938* | con bencilo | protegido con bencilo | |||
| Aspergilus niger | 9029 | Racemato I no protegido | IIa: ácido (3R,4S) | 100 | 14 |
| Aspergilus alliaceus | 1024 | Racemato I no protegido | IIa: ácido (3R,4S) | 100 | 29 |
| Candida parapsilosis | 7330 | Racemato I no protegido | IIa: ácido (3R,4S) | 100 | 29 |
| 16632 | 100 | 26 | |||
| 22019 | 100 | 28 | |||
| 34078 | 100 | 20 | |||
| Candida rugosa | 14830 | Racemato I no protegido | IIa: ácido (3R,4S) | 100 | 20 |
| * Schering-Plough Research: Biotransformations Culture Collection |
Se prepararon cantidades de miligramos de ácido
de fórmula IIa derivadas de la hidrólisis microbiana de éster
metílico de trans-lactama racémica de fórmula I protegida con
bencilo, como se describe a continuación.
La resolución microbiana de éster metílico (0,5
g/I) para generar el ácido de fórmula IIa, se realizó como se ha
descrito en el Ejemplo 1, usando fermentaciones en matraces
múltiples, empleando Aspergillus terreus cepa ATCC nº 24839.
Después de 48 horas de incubación, los caldos de fermentación de
cada uno de los cultivos se reunieron antes de la centrifugación
para separar las células del caldo de fermentación. Se pulverizaron
sedimentos de células en nitrógeno líquido, usando un mortero y su
mano antes de tres extracciones secuenciales con TBME
(1-2 volúmenes/peso húmedo). Se extrajo un caldo de
fermentación separadamente con TBME. Los extractos de TBME contenían
tanto el ácido (3R,4S) como el éster (3S,4R), cada uno en >99% de
exceso de enantiómero. Se añadió MgSO_{4} anhidro a los extractos
de TBME para separar el agua residual, se filtraron los extractos y
el filtrado se concentró por evaporación. El concentrado de extracto
se sometió a purificación por cromatografía de capa delgada
preparativa empleando placas múltiples de sílice
10-20 GF (20 cm x 20 cm x 100 micrómetros) y se
desarrollaron con una solución de EtOAc:hexano (50:50). En cada una
de las placas de sílice se separó por rascado el material que emigra
conjuntamente con el producto deseado, se reunió y se eluyó de la
sílice con TBME. El eluato se evaporó para dar el ácido (3R,4S) IIa.
170 mg, 17% de rendimiento; 86% de exceso de enantiómero;
[\alpha]_{D}^{25} = - 13,0º (c = 0,123, etanol)
A continuación se describe el método general para
identificar la resolución microbiana de éster metílico de
trans-lactama racémica de fórmula I protegida con bencilo
para su uso en la generación de éster de fórmula Ib.
Se desarrollaron cultivos de siembra de levadura,
hongos filamentosos y bacterias, en matraces de 125 ml o 300 ml que
contenían 25 ml o 50 ml de medios de YPD (1% de extracto de
levadura, 2% de peptona, 2% de dextrina; pH 5,5), SIM6 (3,5% de
harina de soja, 5% de dextrosa de patata blanca, 0,5% de cerelosa, 2
mg/l de cloruro de cobalto, 0,5% de carbonato de calcio; pH 6,0) y
NYC (0,8% de caldo nutriente, 2% de extracto de levadura, 2% de
cerelosa; pH 7,0) respectivamente, durante 72 horas a 30ºC con
agitación (175-250 rpm) antes de la inoculación (4%
en v/v) a fermentaciones en matraces (25 ml YPD/125 ml matraz de 125
ml para levadura y hongos filamentosos o 25 ml de NYC/matraz de 125
ml para bacterias) que se incubaron a 30ºC con agitación (250 rpm).
En todas las fermentaciones, el pH del medio se ajustó antes de la
inoculación, pero no se controló durante la propagación de los
cultivos y la hidrólisis de los sustratos. La resolución microbiana
se inició añadiendo 0,5 g/l de éster metílico de
trans-lactama racémica de fórmula I disuelta en etanol (25
mg/ml), directamente a los cultivos después de 24 horas de
desarrollo. Se analizaron las muestras del caldo de fermentación
extraído con TBME después de 24-72 horas de
incubación con sustrato, por HPLC de fase inversa. En la Tabla 2 se
resumen los cultivos que produjeron el éster de fórmula Ib
ópticamente enriquecido.
| Cultivo | Cepa nº | Sustrato | Producto | % ee | % rendimiento |
| (ATCC) | (éster metílico) | ||||
| R. erythropolis | 4277 | Racemato I protegido | Ib:(3R,4S) protegido | 100 | 17 |
| 11048 | con bencilo | con bencilo | 100 | 17 | |
| 19369 | 100 | 11 | |||
| R. rodochrus | 29670 | Racemato I protegido | Ib:(3R,4S) protegido | 100 | 30 |
| 19150 | con bencilo | con bencilo | 100 | 22 | |
| 29675 | 100 | 24 | |||
| R. species | 19148 | Racemato I protegido | Ib:(3R,4S) protegido | 100 | 31 |
| 19017 | con bencilo | con bencilo | 100 | 31 | |
| C. testosteroni | 33083 | Racemato I protegido | Ib:(3R,4S) protegido | 100 | 12 |
| con bencilo | con bencilo | ||||
| N. corallina | 31338 | Racemato I protegido | Ib:(3R,4S) protegido | 100 | 11 |
| con bencilo | con bencilo |
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon cantidades de miligramos de éster
metílico de fórmula Ib derivado de la hidrólisis de éster metílico
de trans-lactama racémica de fórmula I (0,5 g/l) protegida
con bencilo, como se describe en el Ejemplo 3, usando fermentaciones
en matraces múltiples, empleando Rhodococcus species ATCC
nº19071. Después de 48 horas de incubación, se reunieron los caldos
de fermentación de cada uno de los matraces, antes de la
centrifugación para separar las células del caldo de fermentación.
Se descompusieron los sedimentos de células por tratamiento con
ultrasonido antes de tres extracciones secuenciales con TBME
(1-2 volúmenes/peso húmedo). Se extrajo el caldo de
fermentación separadamente con TBME. Se añadió MgSO_{4} anhidro a
los extractos de TBME para separar el agua residual, se filtraron
los extractos y el producto filtrado se concentró por evaporación.
El concentrado de extractos se sometió a purificación por
cromatografía de capa delgada preparativa, empleando placas
múltiples de sílice 10-20 GF (20 cm x 20 cm x 100
micrómetros) y se desarrolló con una solución de EtOAc:hexano
(50:50). El material que emigró conjuntamente con el producto
deseado en cada una de las placas de sílice se separó por rascado,
se reunió y se eluyó de la sílice con TBME. El eluato se evaporó
para producir el éster (3R, 4S); 360 mg, 36% de rendimiento; >99%
de exceso de enantiómero; [\alpha]_{D}^{25}= -7,5º (c =
0,133, etanol).
A continuación se describe el método general para
identificar la resolución enzimática de ésteres metílicos o
trifluoroetílicos de trans-lactama racémica de fórmula I
protegidos con bencilo, para su uso en la generación de ácido y
éster óptimamente enriquecidos.
Se realizaron reacciones de escrutinio de
enzimas, usando un sistema de dos fases de 0,6 ml de TBME con 1,0 ml
de tampón de fosfato a 0,1 M (pH 7,0). Se añadió enzima, típicamente
50-200 mg o 100-200 \muL, seguidos
por 14,4 mg de éster metílico. Se agitó la mezcla (350 rpm) a
temperatura ambiente. Se evaluaron algunas desviaciones de estas
condiciones de reacción, como se indica en la Tabla 3. Se recuperó
el material, separando las fases por centrifugación y se analizaron
el producto y el material de partida que no había reaccionado por
HPLC quiral.
En la Tabla 3 se resumen las enzimas que muestran
hidrólisis selectiva del éster metílico de la lactama racémica de
fórmula I, que produce el ácido de fórmula IIb y el éster de fórmula
Ib.
| Enzima | Tiempo | IIb(3S,4R) | IIb(3R,4S) | Conversión | E |
| (horas) | ee_{p} | ee_{s} | |||
| Lipasa D de Amano Rhizopus delemar | 64,5 | 0,71 | 0,67 | 0,485 | 11 |
| Lipasa FAP-15 de Amano Rhizopus javanicus | 44,25 | 0,76 | 0,49 | 0,392 | 12 |
| Lipasa MAP-10 de Amano Mucor javanicus | 64,5 | 0,68 | 0,39 | 0,364 | 8 |
| Lipasa N de Amano Rhizopus niveus | 64,5 | 0,75 | 0,34 | 0,312 | 10 |
| Esterasa/lipasa bacteriana BE1 soportada | 44,25 | 0,11 | >0,95 | 0,897 | n/d |
| de Interspex P. mandocino | |||||
| Lipasa A-10 de Nagase R. japonicus | 44,25 | 0,72 | 0,73 | 0,504 | 13 |
| Lipasa SP 525, Tipo B de Novo C. antartica | 122 | 0,77 | 0,18 | 0,191 | 9 |
| Lipasa (LPL-701) de Toyobo Liprotein | 46,5 | 0,95 | 0,62 | 0,395 | 68 |
| Pseudomonas sp. | 90* | 0,957 | 0,486 | 0,337 | 74 |
| Lipasa de Seikagaki Rhizopus delemar | 122 | 0,69 | 0,63 | 0,478 | 10 |
| Lipasa (LPL-311) tipo A de Toyobo | 46,5 | 0,97 | >0,97 | 0,507 | n/d |
| Lipoprotein Pseudomonas sp | 90* | 0,975 | 0,709 | 0,421 | 165 |
| Lipasa WT de Kinzie \textamp Payne Rhizopus sp | 138,25 | 0,72 | 0,41 | 0,359 | 9 |
| Lipasa de Svedas Rhizopus oryzae | 119 | 0,70 | 0,73 | 0,511 | 12 |
| Lipasa A-10 de Sawa Rhizopus japonicus | 47 | 0,68 | 0,82 | 0,547 | 13 |
| LPL-701 de Sawa Pseudomonas sp. | 90* | 0,967 | 0,467 | 0,326 | 93 |
| Lipasa B, Chirazyme^{TM} L2 de Boehringer-Mannheim | 47 | 0,82 | 0,05 | 0,060 | 11 |
| Cándida antártica | |||||
| Chirazyme^{TM} L4 de Boehringer-Mannheim | 119 | 0,94 | 0,24 | 0,206 | 38 |
| Pseudomonas sp. | |||||
| Chirazyme^{TM} L4 de Boehringer-Mannheim | 47 | 0,95 | 0,77 | 0,450 | 86 |
| Pseudomonas sp. | 90* | 0,97 | 0,46 | 0,321 | 103 |
| Lipasa/esterasa ICS-16-FL1 Fúngica de Interspex | 119 | 0,73 | 0,64 | 0,465 | 12 |
| Rhizopus oryzae | |||||
| Lipasa de Fluka Aspergilus niger | 71 | 0,44 | 0,43 | 0,495 | 4 |
| Lipozyme IM-60 de Novo Mucor miechei | 141,5 | 0,49 | 0,15 | 0,235 | 3 |
| Lipasa tipo XI de Sigma Rhizopus arrhizus | 136,5 | 0,75 | 0,35 | 0,316 | 10 |
| *Condiciones: Éster (850 mg), Enzima (50 mg), TEME /tampón de fosfato (pH) (1 ml), 300 rpm, temperatura | |||||
| \, ambiente. | |||||
| #Condiciones: Éster (19 mg), enzima (1 mg) tetrahidrofurano/tampón de MOPS 0,5 M pH 7,0 (0,2/1,0 ml). |
\newpage
Se realizó un método similar usando éster
trifluoroetílico de trans-lactama racémica protegida con
bencilo de fórmula I. Se realizaron reacciones enzimáticas, usando
un sistema de dos fases de 1,0 ml de TBME con 1,0 ml de tampón de
fosfato 0,1 M (pH 7,0). Se añadieron aproximadamente 50 mg de
enzima y 50 mg de éster a la suspensión y se mezclaron con agitación
(300 rpm) a temperatura ambiente durante 186 horas. Se recuperó el
material, separando las fases por centrifugación y se analizaron el
producto y el material de partida que no había reaccionado por HPLC
quiral. En la Tabla 4 se resumen las enzimas que mostraron
hidrólisis selectiva del éster trifluoroetílico de
trans-lactama racémica de fórmula I, produciendo ácido de
fórmula IIb y éster de fórmula Ib.
\vskip1.000000\baselineskip
| Enzima | Tiempo | (3R,4S)Ib | (3S,4R) | Conversión | E |
| (horas) | ee_{s} | IIb ee_{p} | |||
| LIP-301 de Toyobo Pseudomonas sp. | 186 | 0,755 | 0,987 | 0,433 | 360 |
| LIP-701 de Toyobo Pseudomonas sp. | 48 | 0,713 | 0,774 | 0,480 | 16 |
| LIP-311 (tipo A) de Toyobo Pseudomonas sp. | 48 | 0,994 | 0,628 | 0,613 | 23 |
| 24 | 0,991 | 0,788 | 0,557 | 44 | |
| Chirazyme^{TM} L6 de Boehringer-Mannheim | 48 | 0,680 | 0,796 | 0,461 | 18 |
| Pseudomonas sp. |
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon cantidades de miligramos del éster
de fórmula Ib derivadas de la resolución enzimática de éster
metílico de trans-lactama racémica protegida con bencilo,
como se describe a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvió Toyobo LPL-311 (tipo
A) (Pseudomonas sp.) (202 mg) en tampón de fosfato 0,1 M (pH
7) (8 ml) a temperatura ambiente. Se añadió una solución de éster
metílico racémico (199,5 mg, 0,46 mmol) en TBME (8 ml). La mezcla de
dos fases se agitó a 37ºC y a 250 rpm durante 187 h. La mezcla de
reacción se acidificó con H_{2}SO_{4} 0,5 M (1 ml), se diluyó
con agua (15 ml) y se colocó en dos tubos de centrífuga. Se añadió
EtOAc (20 ml) a cada tubo y se agitaron los tubos, se
centrifugaron luego a 3000 rpm durante 0,5 h. La capa orgánica se
separó y se repitió dos veces la extracción/centrifugación. Los
extractos orgánicos reunidos se evaporaron y se colocó el producto
en bruto sobre una columna de gel de sílice (Selecto de malla
32-63; 20 g) y se diluyó con 30% (300 ml) y 50% (400
ml) de EtOAc/heptano, recogiendo fracciones de \sim 20 ml. Se
reunieron las fracciones 4-6 y se evaporaron para
producir el éster (3R, 4S)-metílico: 89 mg, 44,6%;
95,1% de exceso de enatiómero; [a]^{25}_{D} = -14,15º (c
= 0,89, etanol). Las fracciones 11-19 proporcionaron
el ácido (3S,4R): 39 mg, 20,2%; 84,5% de exceso de enantiómero
[a]^{25}_{D} = -14,87º (c = 0,39, etanol).
Se prepararon cantidades de miligramos del ácido
de fórmula IIa derivado de la resolución enzimática de éster
trifluorometílico de trans-lactama racémica protegida con
bencilo, seguido esto por hidrólisis del éster trifluorometílico,
como se describe a continuación.
\newpage
Etapa
1
Se disolvió Toyobo LPL-311 (tipo
A) (Pseudomonas sp.) (365) en el tampón de fosfato 0,1 M (pH
7) (16 ml) a temperatura ambiente. Se añadió una solución de éster
trifluoroetílico racémico (428 mg, 0,85 mmol) en TBME (16 ml). Se
agitó la mezcla de dos fases a 37ºC y a 250 rpm durante 7,75 h, se
almacenó luego en un refrigerador durante la noche. La mezcla de
reacción se acidificó con H_{2}SO_{4} 0,5 M (1 ml), se diluyó
con agua (50 ml) y se colocó en cuatro tubos de centrífuga. Se
añadió EtOAc (15 ml) a cada tubo y se agitaron los tubos, se
centrifugaron luego a 3000 rpm durante 0,5 h. Se separó la 5 capa
orgánica y se repitió dos veces la extracción/centrifugación. Se
evaporaron los extractos orgánicos reunidos y el producto en bruto
se colocó sobre una columna de gel de sílice (Selecto de malla
32-63; 35 g) y se eluyó con 30% (450 ml) y 50% (600
ml) de EtOAc/heptano, recogiendo fracciones de \sim 20 ml. Se
reunieron las fracciones 5-7 y se evaporaron para
producir éster (3R, 4S)-trifluoroetílico: 191 mg,
44,6%; 99,0% de exceso de enantiómero; [a]^{25} = -9,31º (c
= 1,88, etanol). Las fracciones 18-36 proporcionaron
el ácido (3S, 4R): 100 mg, 27,9%; 88,3% de exceso de enantiómero
[a]^{25}_{D} = +15,96º (c = 0,99, etanol).
Etapa
2
Se disolvió el éster
(3R,4S)-trifluoroetílico (181 mg, 0,36 mmol) (99,0%
ee) en THF (4 ml) y se enfrió a 0ºC en un baño de hielo. Se añadió
una solución de LiOH (52,5 mg, 1,25 mmol) y la mezcla se agitó a 0ºC
durante 3,25 h, tiempo durante el cual la HPLC indicó hidrólisis
completa. La mezcla de reacción se acidificó con H_{2}SO_{4} 0,5
M (12 ml) y se extrajo con EtOAc (2X15 ml). Se lavaron los extractos
orgánicos reunidos con solución saturada de NaCl (10 ml), se secó
(Na_{2}SO_{4}), se filtró y se evaporó: 146 mg, 96,4%; 98,2% de
exceso de enantiómero.
Se purificó una muestra de producto en bruto por
cromatografía de capa delgada preparativa (Analtech Uniplate Silica
Gel GF; 20 X 20 cm; 1000 \mum) eluyendo con EtOAc al 50% /heptano:
[a]^{25}_{D} = -16,52º (c = 0,66, etanol).
Claims (18)
1. Un procedimiento para la resolución
hidrolítica microbiológica o enzimática de una
trans-2-(alcoxicarboniletil)-lactama racémica
de la fórmula I
en donde R es alquilo
C_{1}-C_{7},
2,2,2-trifluoroetilo o metoxietoxietilo y R^{1} es
hidrógeno o un grupo protector seleccionado del grupo que consta de
bencilo, trimetilsililo, t-butildimetilsililo y
acetilo, que
comprende:
añadir una lactama racémica de fórmula I a
microorganismos en medio, medio y tampón, medio y disolvente, o
medio y una mezcla de tampón y disolvente, o a enzimas en tampón,
disolvente, o una mezcla de los mismos, para obtener un compuesto
ópticamente enriquecido de las fórmulas Ib o IIa
en donde R y R^{1} son como se
definen anteriormente;
e
hidrolizar un éster de ácido carboxílico de la
fórmula Ib para obtener un compuesto de fórmula IIa.
2. Un procedimiento de conformidad con la
reivindicación 1, que usa microorganismos para la resolución de una
trans-lactama racémica de fórmula I para obtener el ácido de
fórmula IIa ópticamente enriquecido.
3. Un procedimiento de conformidad con la
reivindicación 2, en donde R es metilo.
4. Un procedimiento de conformidad con la
reivindicación 2, en donde el microorganismo es de los géneros
seleccionados del grupo que consta de Aspergillus, Bacillus,
Candida, Cunninghamella, Debarymyces, Mycobacterium, Paecilomyces,
Penicillium, Rhodobacter, Streptomyces y Trichothecium.
5. Un procedimiento de conformidad con la
reivindicación 4, en donde el microorganismo es de la especie
seleccionada del grupo que consta de Aspergillus, alliaceus,
niger, niveus y terreus; Bacillus sphaericus; Candida
parapsilosis y rugosa; Cunninghamella homothallica;
Debaryomyces hansenii; Mycobacterium fortuitum; Paecilomyces
marquandii; Penicillium implicatum; Rhodobacter sphaeroides;
Streptomyces spectabillis; y Trichothecium roseum.
6. Un procedimiento de conformidad con la
reivindicación 1, que usa microorganismos para la resolución de una
trans-lactama racémica de fórmula I para obtener el
éster de ácido carboxílico Ib ópticamente enriquecido, seguido por
la hidrólisis para obtener el ácido de fórmula IIa ópticamente
enriquecido.
7. Un procedimiento de conformidad con la
reivindicación 6, en donde R es metilo y R^{1} es bencilo.
8. Un procedimiento de conformidad con la
reivindicación 6, en donde el microorganismo es de los géneros
seleccionados del grupo que consta de Comamonas, Curvularia,
Mucor, Nocardia y Rhodococcus.
9. Un procedimiento de conformidad con la
reivindicación 8, en donde el microorganismo es de la especie
seleccionada del grupo que consta de Comamonas testosteroni;
Curvularia brachyspora y geniculata; Mucor circinelloides
y racemosus; Nocardia corallina; y Rhodococcus
erythropolis, rhodochrous y otras especies del mismo.
\newpage
10. Un procedimiento de conformidad con la
reivindicación 1, que usa enzimas para la resolución de
trans-lactama racémica protegida con bencilo de
fórmula I para obtener el éster de ácido carboxílico de fórmula Ib
ópticamente enriquecido, seguido por hidrólisis para obtener ácido
de fórmula IIa ópticamente enriquecido.
11. Un procedimiento de conformidad con la
reivindicación 10, en donde R es metilo o trifluoroetilo y R^{1}
es bencilo.
12. Un procedimiento de conformidad con la
reivindicación 10, en donde la enzima se selecciona del grupo que
consta de una hidrolasa de Rhizopus delemar, Rhizopus javanicus,
Mucor javanicus, Rhizopus niveus, Pseudomonas mandocino, Rhizopus
japonicus, Candida antarctica, Pseudomonas sp., Rhizopus sp.,
Rhizopus oryzae, Aspergilius niger, Mucor miehei y Rhizopus
arrhizus.
13. Un procedimiento de conformidad con la
reivindicación 12, en donde la enzima se selecciona del grupo que
consta de una hidrolasa de una especie de Pseudomonas.
14. Un procedimiento para la resolución
hidrolítica de una
trans-2-(alcoxicarboniletil)-lactama
racémica de fórmula I
en donde R es alquilo
C_{1}-C_{7},
2,2,2-trifluoroetilo o metoxietoxietilo y R^{1} es
hidrógeno o un grupo protector seleccionado del grupo que consta de
bencilo, trimetilsililo, t-butildimetilsililo y
acetilo, que
comprende:
añadir una lactama racémica de fórmula I a un
microorganismo de los géneros seleccionados del grupo que consta de
Aspergillus, Bacillus, Candida, Cunninghamella, Debaryomyces,
Mycobacterium, Paecilomyces, Penicillium, Rhodobacter, Streptomyces
y Trichotheciurn en medio, medio y disolvente, medio y
tampón, o medio y una mezcla de tampón y disolvente, para
obtener un compuesto ópticamente enriquecido de fórmula:
en donde R^{1}es como se ha
definido
anteriormente.
15. Un procedimiento de conformidad con la
reivindicación 14, en donde el microorganismo es Aspergillus
alliaceus o terreus, o Candida parapsilosis.
16. Un procedimiento para la resolución
hidrolítica de una
trans-2-(alcoxicarboniletil)-lactama
racémica de fórmula I:
en donde R es alquilo
C_{1}-C_{7},
2,2,2-trifluoroetilo o metoxietoxietilo y R^{1}es
hidrógeno o un grupo protector seleccionado del grupo que consta de
bencilo, trimetilsililo, t-butildimetilsililo y
acetilo, que
comprende:
añadir una lactama racémica de fórmula I a un
microorganismo de los géneros seleccionados del grupo que consta de
Comamonas, Curvularia, Mucor, Nocardia y Rhodococcus
en medio, medio y disolvente, medio y tampón, o medio y una
mezcla de tampón y disolvente, para obtener un compuesto ópticamente
enriquecido de fórmula IIa
en las cuales R y R^{1} son como
se definen anteriormente;
e
hidrolizar un éster de ácido carboxílico de
fórmula Ib para obtener un compuesto de fórmula IIa
en donde R^{1} es como se ha
definido
anteriormente.
17. Un procedimiento de conformidad con la
reivindicación 16, en donde el microorganismo es Rhodococcus
rhodochrous u otra especie del mismo.
18. Un procedimiento para la resolución
hidrolítica de una
trans-2-(alcoxicarboniletil)-lactama
racémica de fórmula I:
en la cual R es alquilo
C_{1}-C_{7},
2,2,2-trifluoroetilo o metoxietoxietilo y R^{1} es
hidrógeno o un grupo protector seleccionado del grupo que consta de
bencilo, trimetilsililo, t-butildimetilsililo y
acetilo, que
comprende:
añadir una lactama racémica de fórmula I a una
enzima seleccionada del grupo que consta de una hidrolasa de
Pseudomonas species en un tampón, disolvente, o una mezcla de
los mismos, para obtener un compuesto ópticamente enriquecido de
fórmula IIa
en donde R y R^{1} son como se
definen anteriormente;
e
hidrolizar un éster de ácido carboxílico de
fórmula Ib para obtener un compuesto de fórmula IIa
en donde R^{1} es como se ha
definido
anteriormente.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US165951 | 1998-10-02 | ||
| US09/165,951 US5919672A (en) | 1998-10-02 | 1998-10-02 | Resolution of trans-2-(alkoxycarbonylethyl)-lactams useful in the synthesis of 1-(4-fluoro-phenyl)-3(R)- (S)-hydroxy-3-(4-fluorophenyl)-propyl!-4(S)-(4-hydroxyphenyl)-2-azetidinone |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2249917T3 true ES2249917T3 (es) | 2006-04-01 |
Family
ID=22601155
Family Applications (1)
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